FI104723B - Menetelmä immunoaktiivisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä immunoaktiivisten peptidien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104723B FI104723B FI915891A FI915891A FI104723B FI 104723 B FI104723 B FI 104723B FI 915891 A FI915891 A FI 915891A FI 915891 A FI915891 A FI 915891A FI 104723 B FI104723 B FI 104723B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- peptide
- phe
- lys
- terminal end
- gly
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 116
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 claims abstract description 59
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- KLNGALQMFAURPH-NOQNJSOHSA-N kinetensin (1-8) Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 KLNGALQMFAURPH-NOQNJSOHSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical group C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 6
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 claims description 4
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- IPFXYNKCXYGSSV-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N IPFXYNKCXYGSSV-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 23
- 108010089230 histamine-releasing peptide Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 35
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 32
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 27
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 27
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 23
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 18
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 13
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 12
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 10
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 10
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 5
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 5
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- NEPLKJAINOWIJL-DHNNRRLOSA-N dnc014884 Polymers C1C2=CC3=CC=CC=C3N2[C@@]2(C)[C@@H]1[C@@]1(C)CCC(=O)C(C)(C)[C@@H]1CC2 NEPLKJAINOWIJL-DHNNRRLOSA-N 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N melitin Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(OC4C(C(O)C(O)C(COC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)O4)O)=C(C=4C=CC(O)=CC=4)O3)=O)=C(O)C=2)OC(C)C1O OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- LBWHYNPDTSNGQD-NSHCULHESA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]hexanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino] Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 LBWHYNPDTSNGQD-NSHCULHESA-N 0.000 description 1
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102220480405 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit DKC1_F49A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100174574 Mus musculus Pikfyve gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100520533 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) un-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OZJHCMYAXLCFKU-UHFFFAOYSA-N Polyavolensinone Natural products CC1(C)C2CCC3n4c(CC3(C)C2(C)CCC1=O)cc5ccccc45 OZJHCMYAXLCFKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220473731 Ras-related protein Rab-5A_F57A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- HCRMTRJXSDDOIK-ZETCQYMHSA-N phenyl (2s)-2-aminopropanoate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)OC1=CC=CC=C1 HCRMTRJXSDDOIK-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 101150118324 png1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920006122 polyamide resin Polymers 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012439 solid excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- ADNPLDHMAVUMIW-CUZNLEPHSA-N substance P Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 ADNPLDHMAVUMIW-CUZNLEPHSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/807—Hapten conjugated with peptide or protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
104723
Menetelmä immunoaktiivisten peptidien valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö kohdistuu sellaisten vuorovaikutusten 5 inhiboimiseen, jotka aiheuttavat tavallisesti histamiinin ja muiden välittäjien vapautumisen allergeeniin kytkeytyneen soluun sitoutuneen IgG:n ja solun välillä.
Allergiset oireet aiheutuvat vasoaktiivisten amiinien (välit-10 täjien), varsinkin histamiinin, vapautumisesta soluista ympäröivään kudokseen ja verisuonirakenteisiin. Histamiinia säilyy tavallisesti erityisissä soluissa, jotka tiedetään syöttösoluiksi ja emäshakuisiksi leukosyyteiksi. Syöttösolut dis-pergoituvat kaikkialle eläinkudokseen, kun taas basofiilit 15 kiertävät verisuonijärjestelmässä. Nämä solut valmistavat ja varastoivat histamiinia soluihin vaikkakin erikoistunut tapahtumasarja näyttää laukaisevan sen vapautumisen.
Immunoglobuliini E - (IgE) -vasta-aineiden rooli allergisten 20 reaktioiden välittämisessä on hyvin tunnettu. IgE on poly- “ peptidiketjujen kompleksijärjestely, joka, kuten muut immu-noglobuliinit, sisältää kaksi kevyttä ja kaksi raskasta ketjua, jotka disulfidisiltasidokset kytkevät yhteen Y-irtuo- 7 toisena konfiguraationa. Kummassakin kevyessä ketjussa on 7 ; , 25 kaksi domeenia, yksi muuttuva (VL)-domeeni kytkeytyneenä domeeniin, jossa on suhteellisen muuttumaton aminohapposekvenssi, jonka päättää vakio alue (CL) . Sitä vastoin raskaissa ketjuissa on yksi muuttuva domeeni (VH) ja IgE:n olles- 7 sa kyseessä neljä vakiodomeenia (CHl, CH2, Ch3, Ch4, jotka 30 tunnetaan myös Ctl:nä, Cs2:na, Cs3:na, CE4:nä). Vasta- ' aineen kaksi "haaraa" vastaavat antigeenisitoutumisesta ja * - niissä on alueita, joilla polypeptidin rakenne vaihtelee ja 7 ' . „ ne päättyvät Fab'-fragmentteihin (fragmentti-antigeeni- 7 sitoutuminen) tai F(ab')2:een, joka on kaksi Fab'-haaraa, 7 35 jotka ovat disulfidisidosten yhteenkytkemiä. Vasta-aineen r » - 2 104723 "häntä" tai keskiakseli sisältää peptidien kiinteän tai vakiosekvenssin ja päättyy Fc-fragmenttiin (fragmentti-kide). Fc-fragmentti sisältää vasta-aineen biologisesti aktiiviset kohdat, jotka mahdollistavat vasta-aineen olemi-5 sen yhteydessä muiden immuunijärjestelmän molekyylien tai solujen kanssa sitoutumalla niiden Fc-reseptoreihin. Fc-reseptorit voivat olla integraalisia kalvoproteiineja solujen ulommassa plasmakerroksessa tai ne voivat olla vapaita "liukenevia" molekyylejä, jotka kiertävät vapaasti veren 10 plasmassa tai muissa ruumiinnesteissä. Piirrosten kuvio 1 esittää vasta-ainemolekyylin rakenteen ja antigeeniä sitovien kohtien (Fab1-haarojen) sijainnin, Fc-fragmentin ja aktiiviset kohdat, jotka sisältävät soluja sitovan kohdan.
15 Aktiiviset kohdat voivat olla funktiosta riippuen jo paljastuneita ja siten kykeneviä sitoutumaan solureseptorei-hin. Vaihtoehtoisesti ne voivat olla piilossa, kunnes vasta-aine sitoutuu antigeeniin, jolloin vasta-aine voi muuttua rakenteeltaan ja altistua seuraavaksi muille aktiivi-20 sille kohdille, jotka voivat sitten laukaista spesifisen immuunitoiminnan.
Histamiinin allerginen (immunologinen) vapautuminen organismissa syöttösoluista ja basofiileistä voi esiintyä vain 25 seuraavissa olosuhteissa. IgE-molekyylin täytyy lukittua tai kiinnittyä itse Fc-päästään solun FC-reseptorikohtaan kiinnittäen siten IgE-molekyylin syöttösoluun tai basofii-liin (kuvio 2a). Soluun sitoutuneiden IgE-molekyylien Fab'-osien täytyy olla erityisen yhteensopivan antigeenin 30 (allergeeni) ristikytkemiä. Jos esiintyy vuorovaikutusta, syöttösolu tai basofiili laukeaa automaattisesti vapauttamaan histamiinia paikalliseen ympäristöön aiheuttaen esiin-tyviä allergisia oireita.
35 Konventionaaliset lähestymistavat allergianhoidossa käsittävät systeemisen hoidon antihistamiineilla tai yritykset vaimentaa potilaan herkkyys ja ne ovat yrityksiä, jotka eivät itsessään kohdistu IgE-syöttösolu/basofiiliperusvuo-rovaikutukseen.
104723 3
Muu tekniikan taso liittyy itsessään polypeptidiketjujen tuottamiseen, jotka kykenevät estämään IgE-vasta-aineen sitoutumisen solujen pinnoissa oleviin Fc-reseptoreihin ja syrjäyttämään IgE:n sitoutumiskohdista, joihin IgE on jo 5 sitoutunut (kuvio 3).
On suoritettu tutkimuksia IgE FC -alueella olevan "effek-torikohdan" luonteen määrittämiseksi, jotta saataisiin aikaan immunologinen signaali, joka aiheuttaa syöttösolu/ba-10 sofiilihistamiinivapautumisen.
Rakenne-aktiivisuustutkimukset, jotka suoritettiin mallissa histamiinia vapauttavat polypeptidit kortikotrofiini (ACTH) ja melittiini ja niiden analogit, osoittivat, että näissä 15 kummassakin polypeptidissä esiintyvä perusaminohappojen ryhmä oli oleellinen edellytys histamiinin suoralle vapautumiselle rotan vatsakalvon syöttösoluista (Jasani, B. ja Stanforth, D.R., Int. Archs. Allergy Apll. Immun., 45, s.
74-81 (1 973) ja Jasani, B. et ai., Biochem. J., 181 , s.
20 623-632 (1979)). Lisäksi havaittiin, että vieressä olevien
hydrofobisten tähteiden läsnäolo ja C-terminaalisen karbok- I
syylihappotähteen amidointi tehostavat tämän histamiiniva- : pautumisen laukaisua.
25 Näihin havaintoihin perustuen ihmisen IgE:n Fc-alue, jonka : . . . rakenne selvitetty (Bennich, H. ja Bahr-Lindastrom, H. von, r
Prog. Immunol., 1_1_, s. 49-58 (1978)), tutkittiin tällaiset kriteerit täyttävien aminohappojen suhteen. Sekvenssi, joka ulottui alueet 496-506 CM-domeenissa Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-30 Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe (kaikki tässä selityksessä olevat sekvenssit on luettava normaalilla tavalla, so. N-terminaa-„ lista vasemmassa päässä C-terminaaliin oikeassa päässä), näytti todennäköisemmin täyttävän nämä rakenteelliset vaa- i timukset (Stanworth, D.R., et ai., Biochem. J., 180, s.
35 665-668 (1979)). Niin muodoin eripituisia peptideitä, jot- I
ka koostuivat tätä aluetta edustavista sekvensseistä, syn-tetoitiin ja niiden kyky indusoida histamiinin ei-sytolyyt- ΐ ; tista vapautumista rotan vatsakalvon syöttösoluista in vit- ξ ro testattiin. Oktapeptidissä (sekvenssi 497-504), nonapep- - 4 104723 tidissä (sekvenssi 496-504) ja dekapeptidissä (sekvenssi 497-506) esiintyi kaikissa annoksesta riippuvaa histamiinin vapautumista konsentraatioalueella 0,100 μΜ.
5 Näiden systemaattisten tutkimusten tuloksena syntyi kuva syöttösolun suoran laukaisemisen oleellisista systemaattisista edellytyksistä ja soluihin sitoutuneiden IgE-vasta-ainemolekyylien siitä osasta, joka saa aikaan laukaisusig-naalin sen seurauksena, että allergeeni ristisitoo ne. Tämä 10 rakenne käsittää N-terminaalisen (kationisen) polaarisen pään (esim. Lys-Thr-Lys), jota erottaa "tehottomat" tähteet (esim. Gly-Ser-Gly) hydrofobisesta C-terminaalisesta "hännästä" (esim. Phe-Phe-Val-Phe-NH2). (Kuten tavallista koko esitetty NH2~loppuryhmä tarkoittaa koko tässä selityksessä, 15 että C-terminaalinen karboksyylihapporyhmä on amidoitu). On merkittävää, että erittäin samanlaiset primaariset rakenteelliset piirteet havaittiin neuropeptidissä "Substanssi P". Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2, joka vapautuessaan neuroneista, näyttää vaikuttavan suoraan 20 vieressä oleviin syottosoluihin saaden aikaan histamiinin vapautumisen.
Stanworth et ai. ovat ehdottameet, että solun pinnassa on "toinen reseptori", joka osallistuu histamiinin (välittäjä) 25 vapautumisen laukaisuun. On esitetty hypoteesi, että igE:n Fc-alueen aktiiviset kohdat sisältävät "effektorikohdan", v joka on erillään kohdasta, jossa IgE sitoutuu kohdesoluun (solun sitova kohta). Sen jälkeen kun soluun sitoutuva IgE on ristikytkeytynyt antigeeniin (allergeeni), "effektori-30 kohta" (jossa on tarvittava kationisen "pään" laukaususek-venssi, jonka "tehottomat" tähteet erottavat hydrofobisesta hännästä) aktivoi sekundaarisen mekanismin. Esitettiin, • < että kun allergeeni sitoutuu soluun sitoutuneeseen IgE-vas-ta-aineeseen, tapahtuu IgE:n konformaation muutos, joka 35 saattaa IgE-aktiiviset kohdat yhteyteen edellytetyn solun pintakalvossa olevan "toisen reseptorin" kanssa. Spesifisen aminohapposekvenssin ("effektorikohta") aiheuttama hista-: miinin vapautumisen laukaisu aktiivisissa kohdissa ajatel tiin tapahtuvan hydrofobisen "hännän" solukalvolipidikak- l ! i \ 104723 5 soiskerrokseen insertoitumalla, kun taas kationinen "pää" on i vuorovaikutuksessa esitetyn "toisen reseptorin" kanssa solukalvossa (Stanworth, D.R. et ai., Molec. Immunol. 21# s.
243-247 (1984)).
5
Stanworth et ai. yrittivät vielä selvittää tätä mekanismia, mutta he eivät kyenneet löytämään ihmisen IgE-dekapeptidille (sekvenssi 497-506) vasta-aineita, ks. Stanworth, D.R. et. ai. (a) Molecular Immunology 22. s. 1231-1235 (1986) ja (b) 10 Ciba Foundation Symposium 119. s. 226-244 (1986).
Edellä kuvattu histamiinin syöttösoluista vapautumismekanis-mi ei ole universaalisesti hyväksytty. Tekniikan taso on kohdistunut "suojaavien peptidien" kehittämiseen IgE:n syöt-15 tösoluihin ja basofiileihin sitoutumisen estämiseksi. "Sitoutumiskohtien vastaisten vasta-aineiden" kehittäminen on selvittänyt tämän sitoutumiskohdan ja sen jälkeen on kehitetty suojaavia anti-peptideitä (Stanworth, D.R. et ai.
Molecular Immunology 22. s. 1231-1235 (1986) ja Burt, D. et 20 ai., Molecular Immunology, 24, s. 379-389 (1987)). Tiedetään kuitenkin, että IgE-vasta-aine on usein sitoutunut tiukasti syöttösoluun tai basofiiliin (Stanworth, D.R., Nature 223. s. 310-316 (1971)) jopa silloin kun allergeenia ei ole läsnä ~ ja vain silloin, kun allergeeni on läsnä, esitetty "toinen 25 reseptori" laukaistaan ja histamiinia vapautuu.
Siten pelkästään kohdan, jossa IgE sitoutuu syöttösoluihin, suojaaminen inhiboisi vain niiden IgE-molekyylien IgE-funktiota, jotka kiertävät vapaasti ja jotka eivät ole vielä 30 kiinnittyneet syöttösoluihin tai basofiileihin. Tämä lähestymistapa on sopimaton silloin, kun soluihin sitoutunutta I
. IgE:tä on jo läsnä, jollei tällainen suojaava peptidi kykene : myös syrjäyttämään jo sitoutunutta IgE:tä. Hamburger otti 1 tämän lähestymistavan ja raportoi, että ihmisen IgE:n CH2- r 35 domeenista peräisin oleva pentapeptidi kykeni kilpailemaan IgE-spesifisten sitoutumiskohtien kanssa ihmisen ihossa olevissa syöttösoluissa (Hamburger, R.N., Science, 189. s. 389- “ • 390 (1975)). Muut tutkijat eivät kuitenkaan ole voineet vah- β 104723 vistaa tätä tulosta (Bennich, H.H. et ai., Int. Arch. Allergy Appi. Immunol., 51, s. 459-468 (1977)).
Jos otaksutaan, että "toinen reseptori"-hypoteesi toimii, ei 5 ole selvää, kuinka edellytetyn anafylaktisessa (IgE) vasta-ainemolekyylissä olevan "effektorikohdan" ja tämän solun pinnassa olevan "toisen reseptorin" välinen vuorovaikutus estetään. Oletettavasti spesifisen antigeenin (allergeeni) aiheuttama syöttösoluun sitoutuneiden IgE-vasta-aineiden risti-10 kytkeytyminen indusoi konformationaalisen muutoksen niiden FC-alueilla saattaen "effektorikohdan" tiiviiseen rinnakkais-asemaan "toisen reseptorin" kanssa. Tässä tapauksessa kaikki yritykset tämän vuorovaikutuksen estämiseksi aiheuttavat eteerisiä esto-ongelmia esitetyn effektorikohdan alueella.
15
Nyt on yllättäen havaittu, että on mahdollista tuottaa in vitro tai jopa yllättävimmin saada esiin in vivo IgE:n Fc-fragmentin alueella olevan "effektorikohdan" vasta-aine, joka estää histamiinin vapautumisen, kun soluun sitoutunut IgE on 20 ristikytkeytynyt spesifiseen allergeeniinsä jopa silloin kun IgE:tä on läsnä kierrossa jo FC-alueensa syöttösolun tai ba-sofiiliin sitomana.
Vastaavasti keksintö saa aikaan immunogeenin, joka käsittää ; 25 (koostuu tai sisältää) samassa molekyylissä (a) histamiinia vapauttavan peptidiosan, joka käsittää kationisen N-terminaalisen pään ja hydrofobisen C-terminaalisen hännän yhdessä (b) tähteen kanssa, joka kykenee herättämään vasta-aineita sanottua peptidiä vastaan samalla kun sanottu peptidi inhiboi 30 histamiinin vapautumisen. Tämä määrittely kattaa peptidin '· erilaiset polymeeriset ja ristikytkeytyneet muodot ja konju- gaatit, jotka käsittävät peptidiin kytketyn kantoaineen missä tahansa lyhyessä muodossa, joka tekee peptidin "ei-yksinäiseksi" ja vähentää histamiinia vapauttavan toiminnan hyväk-35 syttävän alhaiselle tasolle, edullisesti nollaksi.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
M
7 104723
Keksinnön ensimmäisessä käytössä isäntä immunoidaan aktiivisesti IgE: n Fc-alueen laukaisusekvenssille antamalla isännälle immunogeenisesti tehokas määrä edellä määriteltyä immu-nogeeniä. Vaikkakin peptidit ovat histamiinin vapautumisen 5 laukaisija, on yllättävää, että ne itse voivat esiintyä siten, etteivät ne oleellisesti välitä histamiinin vapautumista.
Tässä hakemuksessa kuvataan myös ligandi, joka käsittää vas-10 ta-ainedomeenin, joka on spesifinen edellä määritellylle histamiinia vapauttavalle peptidille. Tämä määrittely kattaa mono- ja polyklonaaliset vasta-aineet, niiden antigeeniä sitovat fragmentit, esim. Fab' tai F(ab')2, hybridivasta-aineet ja yksiketjuiset domeenivasta-aineet. Lyhyyden takia termiä 15 "vasta-aine" käytetään tämän jälkeen tarkoittamaan sanottua ligandia.
Keksinnön toisessa käytössä isäntä immunoidaan passiivisesti edellä mainitulle ihmisen IgE:n Fc-alueen aminohapposekvens-20 sille antamalla sanotulle isännälle histamiinia vapauttava ja inhibitorisesti tehokas määrä ligandia, joka käsittää vasta-ainedomeenin, joka on spesifinen edellä määritellylle histamiinia vapauttavalle peptidille. Edullisin monoklonaalinen vasta-aine, josta humanisoidut vasta-aineet ja Fab'-fragmen-^ 25 tit voidaan valmistaa, on jäljempänä kuvatun patenttitallen- teen kohteena.
Kuvio 1 esittää vasta-aineen rakennetta ja Fab'- ja Fc-aluei-den sijaintia.
30 ' : Kuvio 2 esittää kohtaa, jossa IgE-vasta-aine sitoutuu syöt- Γ tösoluun tai basofiiliin (2a) ja kuinka soluun sitoutuneet IgE-vasta-aineet ristikytkeytyvät antigeenin kanssa paljastaen "effektorialueen" IgE:n aktiivisissa kohdissa, jotka 35 ovat kykeneviä saavuttamaan "toisen reseptorin" (2b).
Kuvio 3 esittää peptidien kehitysstrategiaa IgE:n solun pinnan Fc-reseptoriin sitoutumisen estämiseksi.
8 104723 Tässä hakemuksessa kuvataan histamiinin (välittäjä) vapautumisen estäminen syöttösoluista tai basofiileistä allergisen reaktion aikana. Tämä laukaisuvaihe tapahtuu, kun syöttösolu tai basofiili, jossa on pintaan sitoutunut IgE, on kosketuk-5 sissa antigeenin (allergeeni) kanssa, jolle IgE on spesifinen. Allergeeni sitoutuu pintaan sitoutuneeseen IgErhen tuottaen siten IgE:n konformationaalisen muutoksen paljastaen "effektorikohdat", jotka ovat vuorovaikutuksessa solun pinnassa olevan "toisen reseptorin" kanssa aiheuttaen histamii-10 nin tai muun soluun varastoituneen välittäjän vapautumisen.
Tämä saadaan aikaan interferoimalla (1) soluun sitoutuneen IgE:n Fc-alueella olevien "aktiivisten kohtien", joka on sitoutunut Fab-alueestaan allergeeniin paljastaen siten "effek-15 torikohdat", ja (2) solun pinnassa olevien "toisten reseptorien" välistä vuorovaikutusta. (Tavallisesti näiden "effek-torikohtien" ja "toisten reseptorien" välinen vuorovaikutus aiheuttaa soluun varastoituneena olevan histamiinin vapautumisen) .
20
Immunointi voi olla passiivista, so. profylaktista hoitoa vähintään anti-IgE-aminohapposekvenssivasta-aineen Fab'-fragmentilla, tai edullisemmin aktiivista, so. isännän indusoimista tuottamaan itse omia vasta-aineita, koska aktiivinen , , 25 immunointi saa aikaan tehokkaamman ja kauemmin kestävän suo- jausmuodon välittäjän IgE:lie herkistä syöttösoluista tai basofiileistä immunologisesti laukaistua vapautumista vastaan. Lisäksi on todisteita esittää, että anti-peptidivasta-aine vähentää IgE-tuotantotasoa allergeenia (ovalbumiini) vastaan 30 kokeellisesti herkistetyissä eläimissä (rotat).
i · * •
Histamiinia vapauttava peptidi käsittää kationisen N-termi-naalisen "pään" ja hydrofobisen C-terminaalisen "hännän". C-terminaalinen pää suojataan edullisesti amidoimalla. N- ja C-35 terminaalit erotetaan tavallisesti sekvenssillä, joka käsittää joukon "tehottomia" aminohappotähteitä, jotka ovat val-'·, litsevasti ei-polaarisia ja ei-hydrofobisia. N- ja C-termi- naalit ovat tavallisesti 2-8 aminohapon, edullisesti 2-6, :1 9 104723 mutta edullisimmin 3 aminohapon, erottamia. N- ja C-terminaalit ovat edullisemmin Gly-Ser-Gly-sekvenssin erottamia.
Proliini ja kysteiini eivät ole edullisia.
5 Pään kationisuuden tulee olla sellainen, että se sopii tarvittavaan vuorovaikutukseen "toisessa reseptorissa" olevan solukalvon kanssa. Siinä on edullisesti kahden erillään olevan kationisen aminohappotähteen "kaksoishuippu", esim. Lys-x-Lys, jossa x on vähintään yksi polaarinen tai neutraali 10 aminohappotähde. "Pää" käsittää tavallisesti ensin yhden, kaksi tai kolme N-terminaalista aminohappoa. Hännän hydrofo-bisuus on sopivaa sen edellytetylle lipidikaksoiskerrokseen pääsylle. Se käsittää tavallisesti vähintään 2 aminohappoa, edullisesti 2-6 aminohappoa. Edullisia hännän aminohappoja 15 ovat fenyylialamiini ja tyrosiini mutta myös aminohappoja, joissa on laajat alifaattiset sivuketjut, kuten väliini, leusiini tai isoleusiini, voidaam pitää hydrofobisina. Pää tai häntä voi sisältää "tehottomia" aminohappoja, jolleivät ne ole vallitsevia ja aiheuta funktion menetystä. Edullisim-20 min N-terminaalinen pää koostuu joko pelkästään Lysrstä tai Lys-Thr-Lys:stä ja edullisimmin C-terminaalinen häntä käsittää Phe-Phe-sekvenssin varsinkin peptidin neljässä viimeisessä aminohapossa.
25 Erityisen edulliset peptidit käsittävät:
Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe (1)
Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe (2)
Lys-Thr-Lys-Gly-S e r-Gly-Phe-Phe-Vai-Phe (3)
Lys -Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Vai-Phe-Ser-Arg (4) 30 Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Vai (5) niiden amidoidut johdannaiset ja niiden amidoidut tai ami-doimattomat histamiinia vapauttavat analogit. Dekapeptidi (3) 1 ' on edullisin ja amidoitua versiota nimitetään tästä lähtien F30:ksi.
Nämä peptidit välittävät histamiinin ei-sytolyyttistä vapau-tumista, mutta tämä vapautuminen inhiboidaan, kun peptidi konjugoidaan immunogeeniseen kantomateriaaliin. Isäntäsolu 35 104723 10 immunoidaan edullisesti "aktiivisesti" antamalla immunogee-ninen määrä peptidiä, joka on oleellisesti kykenemätön välittämään histamiinin vapautumista, konjugoituna immunogee-niseen kantomateriaaliin, tavallisesti proteiiniin. Konju-5 gointi voidaan tehdä lyhyen kytkentätähteen kautta, esim. glutaraldehydin kautta, tai pidemmän tähteen kautta, esim. aminohaposta, jolloin kantoaine erotetaan hyvin peptidistä. Tällainen kytkentätähde ei saa interferoida peptiditähteen B-teminaalisen pään kationisuuden kanssa. Peptidit voidaan 10 konjugoida kantoaineeseen C-terminaalisen tai N-terminaalisen pään kautta.
Vaihtoehtoisesti immunogeeni voi olla syklisen peptidin muodossa, joka sisältää histamiinia vapauttavan peptidin täh-15 teen. Syklisointi heikontaa vakavasti histamiinin vapautumista, kuten on esitetty esimerkeissä, joissa testataan syklistä peptidiä F40. Tämä peptidi syklisoidaan F30:n muotoon, jossa kysteiiniryhmä lisätään amidoimattoman molekyylin kumpaankin päähän. Joitakin kokeita tarvitaan varmistamaan se, 20 että syklinen peptidi säilyttää oleellisen histamiinia vapauttavan peptidin sopivassa muodossa mutta se on yksinkertaista liittämällä tarvittavat välissä olevat aminohapot. Näissä syklisissä peptideissä kysteiini-kysteiini"silta"tähde käsittää vasta-ainetta herättävän tähteen keksinnön mukaisen v 25 immunogeenin laajimmassa määrittelyssä.
Immunogeeni voi olla polymeerisen peptidin muodossa, jossa peptidin yhden molekyylin tähde käsittää "histamiinia vapauttavan peptidin tähteen" immunogeenin laajimmassa määrit-30 telyssä ja loppu immunogeenistä käsittää vasta-ainetta herättävän tähteen mainitun määrittelyn mielessä. Kuten esimerkeissä osoitetaan, dimerointi vaikeuttaa vakavasti histamiinin vapautumista. Joitakin kokeita tarvitaan sopivan po-lymerointitason tai -muodon määrittämiseen tarvittavien vas-35 ta-aineiden stimuloimiseksi.
Vaikkakin keksinnön mukaisesti saadut immunogeenit ovat kyke-'* nemättömiä välittämään ei-sytolyyttistä histamiinin vapautu- i i 11 104723 mistä, ne kykenevät herättämään vasta-aineita suurella serologisella ristireaktiivisuudella IgE:n Fc-alueen kohdeamino-happosekvenssin kanssa.
5 Immunogeenin alkuannos (esim. 0,2-5 mg, edullisesti 1 mg) annetaan lihaksen sisäisesti, mitä seuraa toisto- (tehoste)-an- i nokset 14 ja 28 vuorokauden kuluttua. Annokset riippuvat tietenkin jossain määrin potilaan iästä, painosta ja yleisestä terveydestä kuten hoitoalalla on tunnettua.
10 "Passiiviseen" immunointiin tarkoitetun vasta-aineen valmistaminen suoritetaan antamalla keksinnön mukaisesti saatua im-munogeeniä, edullisesti käyttämällä apuainetta, nisäkkäille ja keräämällä saatu antiseerumi. Parannettuja tiittereitä 15 voidaan saada toistamalla injektiot ajanjakson ajan.
Joskaan vasta-aineiden valmistukseen käytettävien nisäkkäiden suhteen ei ole mitään rajoituksia, on tavallisesti edullista käyttää kaneja tai marsuja mutta myös hevosia, vuohia, siko-20 ja, rottia, lehmiä, lampaita jne. voidaan käyttää. Vasta- aineita tuotettaessa liuotetaan määritetty määrä edellä kuvatusta saatua antigeeniä fysiologiseen suolaliuokseen sopivaan konsentraatioon ja saatuun laimenteeseen sekoitetaan täydellistä Freundin apuainetta suspension valmistamiseksi. Suspen-;, 25 sio annetaan nisäkkäille. Edellä mainittu suspensio annetaan .
esimerkiksi intraperitoneaalisesti (50-2500 μg/aika antigee- : nin määränä) kanille. Sitten suspensiota annetaan joka toinen viikko ajanjaksona, joka kestää noin 2-3 kuukauteen, edullisesti noin 1 kuukauden, immunoinnin aiheuttamiseksi. Vasta- ‘ 30 aineen kerääminen suoritetaan keräämällä veri immunoidusta [ eläimestä 1-2 viikon kuluttua lopullisesta antamisesta : sentrifugoimalla veri ja eristämällä seerumi verestä.
Vasta-aineet voivat sisältää ihmisen ja hiiren monoklonaa-35 lisiä vasta-aineita. Potilasta hoidetaan edullisesti hiiren monoklonaalisesta vasta-aineesta peräisin olevalla Fab'- = \ fragmenttivalmisteella kimeerisen ihminen-hiirivasta-aineen : 12 104723 osalta (käsittää ihmisen Fc-alueen ja hiiren Fab'-alueen), jotta minimoidaan mikä tahansa haitallinen reaktio vieraaseen eläinimmunoglubuliiniin.
5 Hiiren monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valmistaa Köh-lerin ja Milsteinin menetelmällä (Köhler, G. Milstein, C., Nature (London) 256. s. 495 (1975)), esim. fuusioimalla hy-perimmunoidun hiiren pernasolut hiiren myeloomasolulinjaan.
10 Ihmisen monoklonaaliset vasta-aineet ovat hieman vaikeampia herättää, mutta on käytetty monia menetelmiä ihmisen mono-klonaalisten vasta-aineiden herättämiseksi mukaan lukien 1) monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen Epstein-Barr-viruksella (FBV) transformoiduilla B-soluilla, 15 2) B-lymfosyyttihybridisaatioon tarkoitettu solulinja, 3) ihminen-hiiri-hybridoomat, 4) ihminen-ihminen-hybridoomat, ja 5) ihminen x ihminen-hiiri-heterohybridoomat.
20 Ihminen x ihminen-hiiri-heterohybridoomat ovat edullisimpia ja ne yhdistävät sekä ihmisen että hiiren parenteraalisolu-tyyppien edulliset piirteet. Ihminen-hiiri-heterohybridooma-solulinjat on osoitettu sopiviksi B-solufuusioon (Teng, N.N.M., Lam, K.S., Riera, F.C. ja Kaplan, H.S., [Proc. Natl. 25 Acad. Sei. U.S.A., M, s. 7308 (1983)].
Edullinen monoklonaalinen vasta-aine, josta humanisoidut vasta-aineet voidaan valmistaa, on Budapestin sopimuksen patenttitallenteen kohde, joka on talletettu 31. toukokuuta 30 1990 European Collection of Animal Cell Cultures'iin, Port
Down, Salisbury, Wiltshire, Englanti, talletusnumerolla 90053107 ja sitä kutsutaan tästä lähtien DEC 7B:ksi.
Kun vasta-ainetta käytetään tämän keksinnön mukaisessa me-35 netelmässä, se voidaan viedä isäntään tavanomaisemmin lihak-i sensisäisellä injektiolla. Voidaan käyttää mitä tahansa yleisiä nestemäisiä tai kiinteitä apuaineita, jotka ovat * hyväksyttäviä isännälle ja joilla ei ole haitallisia sivu- 13 104723 vaikutuksia isännässä tai mitään haitallisia vaikutuksia rokotteessa. Fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS) fysiologisessa pHrssa, esim. pH 6,8-7,2, edullisesti pH 7,0, voidaan käyttää välitysaineena yksinään tai yhdessä sopivan 5 apuaineen, kuten aluminiumhydroksidiin perustuvan apuaineen kanssa. Immunogeenisen antigeenin konsentraatio voi vaihdella noin 50-500, edullisesti 200-300 μg injektiota kohti liuotintilavuuden ollessa tavallisesti noin 0,25-1, edullisesti 0,5 ml. Alkuinjektion jälkeen tarvitaan useita injek-10 tioita ja ne voidaan antaa vuoden välein.
Aktiivisesta immunoinnista puhuttaessa termi " immunogeeninen kantomateriaali" käsittää tässä ne materiaalit, joiden ominaisuutena on herättää itsenäisesti immunogeeninen reaktio 15 isäntäeläimessä ja jotka voivat kytkeytyä kovalenttisesti polypeptidiin joko suoraan peptidin muodostumisen kautta tai esterisidosten muodostumisen kautta polypeptidissä olevien vapaiden karboksyyli-, amino- tai hydroksyyliryhmien ja im-munogeenisessä kantomateriaalissa olevien vastaavien ryhmien 20 väliin tai vaihtoehtoisesti sitoutumalla konventionaalisen bifunktionaalisen kytkentäryhmän kautta. Esimerkit tällaisista kantoaineista käsittävät eläinseerumin albumiinit, : eläinseerumin globuliinit, eläinten tyroglobuliinit, eläinten hemoglobiinit, eläinten hemosyäniinit (erityisesti Key-25 hole-kotilon hemosyaniini (KLH)), suolinkaisesta uutetut . . . proteiinit (suolinkaisuutteet, kuten sellaiset, jotka on i kuvattu JP-patenttihakemuksessa nro 16414/81, J. Immun., - 111. s. 260-268 (1973), J. Immun., 122, s. 302-308 (1979), J. Immun., s. 893-900 (1967) ja Am. J. Physiol. 199. s.
30 575-578 (1960) tai siitä puhdistetut uutteet), polysiinin, polyglutaamihapon, lysiini-glutaamihappokopolymeerit, lysii- ~ . niä tai ornitiiniä sisältävät kopolymeerit jne. Viime aikoi- ; na on tuotettu rokotteita käyttämällä kurkkumätätoksoidia ».
tai tetanustoksoidia immunogeenisinä kantomateriaaleina ' 35 [Lepow, M.L. et ai., J. Infectious Diseases, 150. s. 402-406 (1984) ja Coen Beuvery, E. et ai., Infection and Immunity, 40. s. 39-45 (1983)] ja näitä toksoidimateriaaleja voidaan * käyttää myös tässä. Muut sopivat kantoaineet on selostettu 104723 14 esimerkiksi US-patentissa 4 575 495 mukaan lukien rokotteet, orgaaniset polymeerit jne. Tuberkuliinin puhdistettu proteiini johdannainen (PPD) on erityisen edullinen käytettäväksi "aktiivisessa" immunointikaavassa, koska (l) se ei indusoi 5 T-soluvastetta itsessään (so. se on vaikutukseltaan "T-solu-hapteeni") ja se käyttäytyy kuten täysin tuotettu antigeeni ja T-solut tunnistavat sen sellaisenaan, (2) sen tiedetään olevan yksi voimakkaimmista hapteeni"kantajista" kytketyssä tunnistustilassa ja (3) kaikkein tärkeintä on, että sitä 10 voidaan käyttää ihmisessä ilman lisätestaamista.
Mitä tulee hapteenikantoaineita sitoviin aineisiin, voidaan käyttää niitä, joita käytetään konventionaalisesti antigeenien valmistuksessa.
15
Peptidin kovalenttinen kytkeminen immunogeeniseen kantoma-teriaaliin voidaan suorittaa tavalla, joka on alalla hyvin tunnettu. Täten esimerkiksi suoraan kovalenttiseen kytkemiseen on mahdollista käyttää karbodi-imidiä, edullisimmin 20 disykloheksyylikarbodi-imidiä tai l-etyyli-3-(3-dimetyyli-aminopropyyli)karbodi-imidiä kytkentäaineena. Myös glutar-aldehydiä voidaan käyttää välineenä peptidin kovalenttiseksi kytkemiseksi immunogeeniseen kantomateriaaliin.
25 Edellä mainitussa hapteenin, hapteeni-kantoainesitomisaineen I ja kantoaineen määrät voidaan määrittää sopivasti mutta on edullista, että kantoainetta käytetään määränä noin 1 - noin 6 kertaa, edullisesti noin 1- noin 5 kertaa hapteenin paino ja hapteeni-kantoainesitomisainetta käytetään määränä noin 30 5 - noin 10 kertaa hapteenin mooli. Edellä mainitussa reak tiossa kantoaine sitoutuu hapteeniin hapteeni-kantoainesitomisaineen kautta halutun peptidi-kantoainekompleksista koostuvan antigeenin saamiseksi. 1 • «
Reaktion päättymisen jälkeen saatu immunogeeni voidaan eristää helposti ja puhdistaa dialyysimenetelmällä, geelisuoda-tusmenetelmällä, fraktionointipresipitointimenetelmällä jne.
15 104723
Esillä olevassa keksinnössä käytetyt peptidit voidaan syn-tetoida helposti alalla hyvin tunnetuilla kiintofaasimene-telmillä. Sopivat synteesit voidaan suorittaa käyttämällä T-boc- tai F-moc-menettelyjä.
5
Sykliset peptidit syntetoidaan kiintofaasimenetelmällä käyttäen hyvin tunnettua F-moc-menettelyä ja polyamidihartsia täysin automatisoidussa LKB Biolynx -laitteessa.
10 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.
Tween on rekisteröity tavaramerkki.
Esimerkki 1 15 Peptidi (F30) - KLH -konjugaatin eristetyissä rotan syöttö-soluissa histamiinia vapauttavan kyvyn määrittäminen
Rotan vatsakalvon syöttösolut valmistettiin pesemällä vatsakalvo kylmällä Ca++-vapaalla HBT-puskurilla (Hepes-pusku-20 roitu Tyrode-suola-liuos).
Hepes-puskuroitu Tyrode-suolaliuos (X10 konsentroitu)
NaCl 137 mM
KC1 2,7 mM
25 NaH2P04.2H20 0,4 mM
. glukoosi 5,6 mM
MgCl2.61^0 0,5 mM
CaCl2.2H20 1 mM (ei ole Ca++-vapaassa HBT:ssä)
Hepes 10 mM
30 gelatiini 1 mg ml"1
Edellä mainittu resepti tehtiin 1 litraan tislattua vettä ja sitä varastoitiin -20 °C:ssa käyttöön saakka, jolloin se [ laimennettiin 1:10 ja säädettiin pH:hon 7,4 20 °C:ssa lisää-35 mällä 0,2 M NaOH tai 0,1 M HC1.
Solususpensiota sentrifugoitiin 5 minuuttia 1200 rpm-.ssä ja : ----- se suspendoitiin uudelleen HBT-Ca++-puskuriin ja pestiin ~ 16 104723 uudelleen ennen kuin se lopullisesti suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan HBT-Ca++-puskuria. Pieni alikvootti värjättiin
Alcian Blue:11a ja laskettiin. Soluja käytettiin puhdista-mattomina.
5
Synteettinen ihmisen ε-ketjun dekapeptidi (nimetty F30:ksi) Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH2 kytkettiin glu-taraldehydin kanssa kantajaproteiinin (Keyhole-kotilon he-mosyaniini (KLH), Sigma Chemical Co., Poole, Dorset). Ase-10 tettiin sarja putkia, jotka sisälsivät 100 μΐ F30-KLH-kon-jugaatin sarjaliuoksia, 10^-10-4 M (F30 konsentraatio) , sitten kuhunkin putkeen lisättiin alikvootti (100 μΐ), joka sisälsi 105 syöttösolua/ml. Samanlaiset laimennussarjät tehtiin konjugoimattomalla F30-peptidillä verrokkina.
15
Putkia inkuboitiin 30 min 37 °C:ssa, sitten jokaiseen putkeen lisättiin kylmää HBT-Ca++-vapaata puskuria ja niitä sentrifugoitiin 2000 rpm:ssä 5 minuuttia reaktion pysäyttämiseksi. Supernatantit dekantoitiin putkien sovitussarjaan, 20 jotka sisälsivät 0,25 ml 2 M HC104 ja 1,25 ml 0,4 M HC104 lisättiin solupelletteihin niiden lysoimiseksi.
Syöttösoluista vapautunut histamiiniprosentti mitattiin käyttämällä spektrofluorometristä testiä. Peptidin maksimaa-25 linen vapautumiskyky väheni suuresti, kun se konjugoitiin KLH:hon, verrattuna vapaan peptidin vapautumiskykyyn.
Tulokset on annettu taulukossa 1.
30 Taulukko 1
Histamiinin rotan syöttö-soluista vapautumis-%, joka on aiheutettu
Peptidi-(F30)-konsentraatio F30:llä_F30-KLH:11a 35 0 M <10 <10 10'8 M 15 <10 = 10'7 M 10 <10 10'6 M 15 10 ” 10'5 M 50 15 40 10“* M 70 22 i 1 17 104723
Esimerkki 2
Peptidien F30, F40 ja F67 histamiinia vapauttavan kyvyn määrittäminen eristetyissä rotan syöttösoluissa j 5 Kolmesta synteettisestä ihmisen ε-ketjun peptidistä, amidoi-dusta lineaarisesta-konjugoimattomasta muodosta (F30), sen amidoidusta dimeroidusta muodosta (F67) ja amidoimattomasta kysteiinisilloitetusta syklisestä muodosta (F40) , testattiin j niiden kyky indusoida histamiinin vapautumista eristetyistä 10 rotan syöttösoluista esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Kuten taulukon 2 tuloksista voidaan nähdä, sekä syklisessä (F40) että dimeroidussa muodossa esiintyy huomattavasti vähemmän histamiinin vapautumista kuin lineaarisessa muodossa (F30) vaikkakin suurimmassa testausannoksessa 15 (10‘3 M) F40-peptidi oli yhtä aktiivista kuin F30-peptidi.
Taulukko 2
Histamiinin rotan syöttö-soluista vapautumis-%, 20 joka on aiheutettu
Peptidi-(F30)-konsentraatio F30;llä F40;llä F67:llä OM 20 20 20 10'6 M 20 20 22 ΙΟ'5 M 20 20 20 25 10-4 M 40 20 20 _
• V - 10‘3 M 70 70 40 I
Esimerkki 3
Ihmisen e-ketjun dekapeptidiä (F30) vastaan olevan polyklo-30 naalisen (kanin) antiseerumin tuottaminen ·* F30 kytkettiin KLH:hon tai tuberkuliinin puhdistettuun pro- : teiinijohdannaiseen (PPD) (Ministry of Agriculture, Fishe- ^ ries and Food, Central Veterinary Labs., Weybridge) käyttäen 35 glutaraldehydiä kytkentäaineena. Kantajaproteiinia (5 mg) ja ^
synteettistä peptidiä (3 mg) inkuboitiin 21 mM:ssa glutaral- L
dehydiä (1 ml) 2-3 tuntia 4 °C:ssa.
»i 18 104723
Naaraspuoliset Uuden Seelannin valkoiset kanit (3,5 kg, Bux-ter Rabbit Co.) immunoitiin ihonalaisella injektiolla pep-tidi-kantoainekonjugaattia (250 μg) täydellisessä Freundin apuaineessa. Ihonalaiset injektiot epätäydellisessä Freundin 5 apuaineessa suoritettiin 14:nä ja 28:na vuorokautena.
Testiveret otettiin 14 vuorokauden kuluttua jokaisesta injektiosta ja saadun seerumin anti-peptidivasta-aineaktiivi-suus määritettiin suoralla ja inhibointi-ELISA:11a (Burt, 10 D.S., Hastings, G.Z. ja Stanworth, D.R., Molecular Immuno logy, 23., s. 181-191 (1986)) käyttäen 96-koloisia taipuisia mikrotiitterilevyjä (Falcon, Cowley, Oxford). Jokaisen kolon optinen tiheys mitattiin 492 nm:ssä (OD492) automaattisessa levylukijassa (Multiskan MC, Flow Laboratories, Irvine, 15 Skotlanti), joka oli kytketty BBC-mikrotietokoneeseen.
Kanin polyklonaalisessa anti-peptidi-(F30)-antiseerumissa esiintyvät näyte-ELISA-titrauspäätepisteet on annettu taulukossa 3 .
20
Taulukko 3
Seerumin ELISA-lukema OD492 laimennos_EES_ganUL_Kani 2_Kani 3_Kani 4 25 Laimenta- ; maton 0,805 1,673 1,804 1,710 1,675 1:5 0,434 1,751 1,894 1,865 1,700 1:25 0,108 1,805 1,944 0,894 1,652 1:125 0,023 1,367 0,859 0,164 0,404 30 1:625 0,000 0,306 0,110 0,042 0,069 1:3125 0,000 0,054 0,003 0,013 0,005 NRS = normaali kanin seerumi
Kanit 1 ja 2 immunoitiin peptidi (F30) - KHL -konjugaatilla. 35 Kanit 3 ja 4 immunoitiin peptidi (F30) - PPD -konjugaatilla.
< j 19 104723
Esimerkki 4
Kanin anti-peptidi-(F30)-antiseerumin allergian vastaisen vaikutuksen arvioiminen 5 (a) in vitro -testit - Rotan vatsakalvon syöttösolui dries - telmä
Suoritettiin in vitro -testejä määrittämällä polyklonaalisen anti-peptidiantiseerumin (F30) kyky inhiboida ihmisen £-ket-10 jun dekapeptidin (F30) Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH2 suoraa vapautumistoimintaa rotan syöttösoluissa, kun sitä esiintyy yhdessä dekapeptidin kanssa.
Rotan vatsakalvon syöttösolualikvootteja (150 μΐ, jotka si-15 sälsivät suunnilleen 104 solua) Hepes-puskuroidussa Tyrode-liuoksessa (HBT), johon oli lisätty Ca++, inkuboitiin 37 °C:ssa 15 minuuttia seoksen läsnäollessa, jossa seoksessa oli yhtä suuret tilavuudet (100 μΐ) dekapeptidiliuosta (10-4 M) ja kanin antiseerumia (peptidiä F30 vastaan) laimennettu-20 na 1:4, 1:8 tai 1:16. Jälkeenpäin lisättiin 650 μΐ Ca++-va-paata HBT-puskuria ja suspensio sentrifugoitiin (suunnilleen 500 g 10 minuuttia) , supernatant ti in vapautuneen histamiinin määrä määritettiin standardilla automatisoidulla spektro- : fluorometrimenettelyllä.
25 .· Peptidin (10‘5 M) indusoima maksimaalinen histamiinin vapau- e tumisen inhibointi (so. 90 %) saatiin aikaan käyttämällä kanin polyklonaalisen anti-F30-seerumin 1:4-laimennosta (esitetty taulukossa 4) .
30 20 104723
Taulukko 4 F30:llä indusoidun histamiinin vapautumisen inhibointi po-lyklonaalisella anti-F30-antiseerumilla in vitro 5 Vapautunut histamiini-% Iphjbointi-fr
Normaali kanin seerumi 29,4 0 10 Polyklonaalinen anti-peptidianti -seerumi laimennettuna 1:4 7,3 75 15 1:8 8,3 72 1:16 18,4 38 (b) in vivo -testit - Rotan passiivisen kutaanianafvlaksian (PCA) inhibointitutkimukset 20 (i) Kanin anti-peptidi-(F30)-antiseerumin antaminen herkistävän alleraiaseerumin kanssa
Valmistettiin seos yhtä suurista määristä kanin anti-peptidi- (F30)-antiseerumia ja rotan kokeellisesti albumiinille 25 herkistettyä seerumia. Seoksen erilaisten laimennosten ali-kvootit (so. laimentamat on, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ja 1:32) injektoitiin ihonsisäisesti 3 urospuoliseen Wistar-rottaan. 48 tunnin kuluttua niitä stimuloitiin intrapenaalisella injektiolla seosta (0,25 ml kutakin), jossa oli ovalbumiini-30 liuoksia (20 μ^/πιΐ) ja Evansin sininen -liuosta (1 %) . Eläimet tapettiin 1,5-2,0 tunnissa ja ne nyljettiin ja nahan alapuoli tutkittiin.
Sinistymisreaktiot (PCA) mitattiin ja niitä verrattiin nii-35 hin, jotka tuotettiin kahdessa verrokkieläimessä, joihin oli samalla tavalla injektoitu seosta, jossa oli herkistettyä rotan seerumia ja tavallista kanin seerumia. Sinistymisreak-: tiot vähenivät huomattavasti, kuten taulukon 5 PCA-määrityk- :j . set osoittavat.
104723 21
Taulukko 5 PCA-määritys_
Seerumi, jota on annettu herkistävän (anti-ovalbumiini)seerumin 5 kanssa
Annetun seerumi- Anti-peptidi- Normaali kanin seoksen laimennus antiseerumi_seerumi_ |
Laimentamaton 23 10 1:2 0 3 1:4 0 1 1:8 0 0,5 ii) Kanin anti-peptidi-(F30)-antiseerumin antaminen 15 (a) stimuloivan allergeenin (ovalbumiini) kanssa b) kaksi minuuttia ennen sitä tai c) kaksi minuuttia sen jälkeen Rottiin (Wistar) injektoitiin ihonsisäisesti erilaisia laimennoksia (laimentamaton, 1:2, 1:4, 1:8 tai 1:16) seerumia, joka oli kokeellisesti albumiinille herkistetystä rotasta 20 peräisin. 48 tunnin kuluttua yhteen ryhmään (a) injektoitiin intrapenaalisesti seosta (1:1), jossa oli yhtä suuret määrät (0,25 ml) ovalbumiinia (20 /xg/ml) Evansin sinisessä (2 %) ja " kanin anti-peptidi-(F30)-antiseerumia, ja toiseen ryhmään (b) injektoitiin suonensisäisesti kanin antipeptidi-(F30)-25 antiseerumia (0,25 ml) kaksi minuuttia ennen suonensisäistä : . . injektiota 0,25 ml:11a seosta (1:1), jossa oli albumiinia (20 μg) Evansin sinisessä (2 %) . Kolmanteen rottaryhmään (c) injektoitiin suonensisäisesti kanin anti-peptidi-(F30)-antiseerumia (0,25 ml) kaksi minuuttia suonensisäisen injekti-30 on jälkeen, jossa oli 0,25 ml seosta (1:1), jossa oli ovalbumiinia (20 μ9/πι1) ja Evansin sinistä (2 %) . Eläimet tapet- t • tiin 1,5-2,0 tunnin aikana ja ne nyljettiin ja nahka tutkit- = tiin alapuolelta. - 1 #
Saadut tulokset on lueteltu taulukossa 6, jossa havaittu .
sinistymisintensiteettireaktio (PCA) kussakin kohdassa on i "määritetty" +/- -järjestelmällä.
104723 22
Taulukko 6 PCA-reaktio nahan kohdassa, johon on injektoitu ovalbumiinille herkistettyä rotan seerumia laimennettuna 5 Laimenta-
Koeiäriestys maton_1:2_1:4_1: 8_1:16 a 5,00 3,00 0,75 0,25 0,00 b 5,30 4,00 0,75 0,00 0,00 C 6,00 4,75 2,25 0,75 0,00 10 verrokki 6,00 4,25 3,00 1,75 0,25
Verrokkina oli polyklonaalisen anti-F02- (τ-ketjun) peptidin antaminen anti-F30*peptidin sijasta.
15 Kuten kuvioista huomataan, kanin anti-peptidiantiseerumin antaminen (normaalin kanin seerumin vastakohtana) vähensi sinistymisreaktiota kohdissa, joihin injektoitiin erilaisia laimennoksia herkistävää seerumia ja inhibointi oli merkittävämpää niissä passiivisesti herkistetyissä rotissa, jotka 20 saivat kanin anti-peptidiantiseerumia samanaikaisesti stimuloivan antigeenin (ryhmä a) kanssa kuin niissä (ryhmä b) , jotka saivat anti-peptidiantiseerumia etukäteen tai ryhmässä (c), joka sai anti-peptidiantiseerumia stimuloivan antigeenin jälkeen.
25
Esimerkki 5
Aktiivinen immunointi ihmisen e-ketjun dekapeptidillä (F30) käyttäen CFA:ta ja IFArta apuaineina ja sen vaikutus kokeellisesti herkistettyjen rottien hypersensitiivisyystilaan 30 (a) Herkistämismenettelv
Ryhmä rottia (urospuolisia, Wistar) tehtiin hypersensitii-visiksi injektoimalla subkutaanisti seosta (0,5 ml)·, jossa on 0,5 ml kananmunan valkuaista (200 mg proteiinia) ja 2,5 35 ml Bordetella pertussista (40 x 1010 organismia/ml) vakaalla koemenettelyllä (Jasani, B. ja Stanworth, D.R., Journal of Immunological Methods, 30., s. 55-68 (1919)). Tämä sai aikaan • IgE-vasta-aineen aiheuttaman kudossyöttosolujen herkistämi- i 23 104723 sen ja suurten ovalbumiinille spesifisten igE-vasta-ainetasojen ilmestymisen niiden verenkiertoon.
(b) Peptidi-immunointimenetelmä
5 Joukko rottia immunoitiin synteeettisellä peptidi-F30-kan-toaineproteiinikonjugaatilla (KLH tai PPD) ennen niiden kokeellista herkistämistä tai sen jälkeen (kuten edellä esi- I
merkissä 3(a) kuvattiin) seuraavan järjestyksen mukaisesti: ensin eläimet injektoitiin subkutaanisti seoksella (200 μΐ) 10 peptidi-kantoaineproteiinikonjugaattia (lmg/ml) emulgoituna yhtä suurella tilavuudella täydellistä Freundin apuainetta (CFA) . Toistetut subkutaanit injektiot peptidi-kantoaineproteiinikonjugaatt ia sekoitettuna epätäydelliseen Freundin apuaineeseen (IFA) annettiin 14. ja 21. vuorokautena.
15 (c) Immunoitu-ien rottien seerumien testit (i) Anti-peptidi-(F30)-vaste Pääimmunoglobuliini-isotyyppeihin ja IgG-alaluokkiin liittyvä anti-peptidi-(F20)-vasta-aineaktiivisuus määritettiin 20 ELISA:11a (entsyymikytketty immuunitesti).
96-koloiset taipuisat testilevyt päällystettiin F30-pepti-dillä. Peptidin 2,5 μΜ liuoksen alikvootteja inkuboitiin yksi tunti 37 °C:ssa. Sitten levyt pestiin 0,05 % PBS (fos-25 faattipuskuroitu suolaliuos) / Tween®-puskuri 11a. Testirotan ' . . seerumien alikvootit (100 μΐ) aloittaen 1:4-laimennoksesta ja sen jälkeisestä kaksoislaimennuksesta lisättiin F30-peptidillä päällystetyille levyille. Levyjä inkuboitiin yksi tunti 37 °C:ssa. Normaalia rotan seerumia käytettiin verrok- = 30 kina. Levyt pestiin 0,05 % PBS/Tween®-puskurilla. 100 μΐ vuohen anti-rotta-IgG:tä, -IgM:ää, -IgA:ta ja -IgE:tä lisät-• tiin laimennoksena 1:1000.. Vasta-aineet laimennettiin 0,05 % PBS/Tween®-puskuriin. Levyjä inkuboitiin yksi tunti 37 °C:s- «.
sa ennen kuin ne pestiin kuten edellä. Levyihin lisättiin 35 piparjuuriperoksidaasilla merkittyjen kanin anti-vuohi-IgG: -iden alikvootit (100 μΐ) laimennettuna 1:1000 PBS/Tween®:llä ja niitä inkuboitiin yksi tunti 37 °C:ssa. Levyt pestiin » ' kuten aiemmin ja 100 μ1:η alikvootit substraattia, joka kä
sitti 20 mg o-fenyylialaniinia, 250 μΐ H202 ja 50 ml 0,15 M
104723 24 sitraattifosfaattipuskuria, pH 5, lisättiin. Värin annettiin kehittyä 5-15 minuuttia ennen kuin entsymaattinen värireak-tio pysäytettiin lisäämällä 25 μΐ 4 N H2S04 jokaiseen koloon. Kunkin kolon sisällön optinen tiheys luettiin 429 nm:ssä 5 (OD492) automaattisessa Titerek-levynlukijassa.
Tyypilliset tulokset on annettu taulukossa 7.
Taulukko 7 10
Kokonais-anti-F30- Histamiinin vapautuminen IgG ng/ml rokotetuissa rotissa
Maksimi ELISA stimuloitaessa in vivo OP (OD492)_ bumiinilla_ 15 CA 89 0,06 330 A 89 0,75 70 CB 89 0,03 2110 B 89 0,33 200 20 A 89 : Peptidi-KLH-konjugaateilla ennen kokeellista herkistämistä immunoitujen rottien ryhmä B 89: Kokeellisen herkistämisen jälkeen immunoitujen rottien ryhmä 25 CA 89 ja CB 89 ovat vastaavien immunoimat torni en rottien ver-. rokkiryhmä.
(ii) IaE-antiovalbumiinivaste
Rottien IgE-anti-ovalbumiinivaste (so. allergeenivaste) mää-30 ritettiin myös ELISA:11a.
• 96-koloiset taipuisat testilevyt päällystettiin ovalbumii- nilla inkuboimalla 37 °C:ssa yksi tunti ovalbumiinin 5 μg/ml-liuosten alikvooteilla (120 μΐ) PBS:ssä. Sen jälkeen. I 35 kun levyt oli pesty 0,05 % PBS/Tween®:ä, 100 μΐ testirotan j seerumia alkaen 1:4-laimennoksesta ja sen jälkeisestä kak- 1 soislaimennuksesta lisättiin ovalbumiinilla päällystetyille | ’ ; levyille. Sitten levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa yksi tunti.
,j Normaalia rotan seerumia käytettiin verrokkina. 0,05 % PBS/- i 25 104723
Tween®:ä pesemisen jälkeen levyille lisättiin 100 μΐ vuohen anti-rotta/IgG(Fc):tä laimennoksena 1:1000 PBS/Tween®. Sitten levyjä inkuboitiin yksi tunti 37 °C:ssa. 0,05 % PBS/-Tween®:ä pesemisen jälkeen lisättiin kanin anti-vuohi/IgG/-5 piparjuuriperoksidaasialikvootit laimennoksena 1:1000 PBS/-Tween® ja levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa yksi tunti. Inkuboin-nin jälkeen levyt pestiin kuten aiemmin. Substraattialikvoo-tit (100 μΐ) lisättiin substraatin käsittäessä 20 mg o-fe-nyylidiamiinia, 250 μΐ H202 ja 50 ml 0,15 M sitraattifosfaat-10 tipuskuria (pH 5,0). Värin annettiin kehittyä 5-15 minuuttia ja sitten entsymaattinen värireaktio pysäytettiin lisäämällä 25 μΐ 4 N H2S04 jokaiseen koloon.
Jokaisen kolon sisällön optinen tiheys luettiin 492 nmrssä 15 (OD492) automatisoidussa Titemark-levylukijassa.
Taulukossa 8 on esitetty tavanomaiset tulokset, jotka osoittavat ihmisen e-ketjun dekapeptidillä (F30) esi- tai jälki-herkistysimmunoinnin vaikutuksen ovalbumiinilla kokeellises-20 ti herkistettyjen rottien verenkierron IgE-antiovalbumiini-tasoihin verrattuna verrokkeina (ei-peptidillä immunoitu) kokeellisesti herkistettyjen rottien IgE-anti-ovalbumiini-tasoihin.
25 Taulukko 8 • - . 1:32 IgE-laimennos OD492 CA 89 0,548 A 89 0,274 30 CB 89 0,777 - B 80 0,644 A 89: Ennen kokeellista herkistämistä F30-KLH-konjugaatilla f immunoidut rottaryhmät, 35 CA 89: immunoimattomat verrokit, B 89: Kokeellisen herkistämisen jälkeen immunoidut rottaryh- = mät, CB 89: immunoimattomat verrokit 26 104723 (d) Anti-Oeptidi- (F30) -vasta-ainetuotannon vaikutuksen arviointi rotissa, jotka ovat hypersensitiivisessä tilassa Peptidillä esi- tai jälkiherkistysimmunoinnin vaikutus (kuvattu edellä osassa (b)) rottien hypersensitiivisyystilaan, 5 rottien ollessa kokeellisesti ovalbumiinille herkistettyjä (esimerkin (5a) mukaisesti) määritettiin seuraavalla menettelyllä; samanlaiset tutkimukset suoritettiin immunoimatto-malle rottaryhmälle verrokkina.
10 Sekä immunoiduista että verrokkiryhmän eläimistä otettiin verta (häntälaskimosta) ennen systeemistä allergeenistimu-lointia, joka suoritettiin injektoimalla intrapenaalisesti ovalbumiinia (5 mg) . Eläimet tapettiin 10 minuutin kuluttua, jolloin niiden sydämistä saatiin lisäverinäyte. Sekä esi-15 että jälkiallergeenistimulointiverinäytteistä peräisin olevat seerumin histamiinitasot määritettiin standardilla automatisoidulla spektrofluorometrisellä menetelmällä ja seerumien vasta-aineprofiilit määritettiin ELISA:11a (esimerkin 5(c) mukaisesti.
20 i. Ihmisen e-ketjun peptidillä (F30) esi- tai iälkiherkis-tysimmunoinnin vaikutus
Rottaryhmän (6) peptidi-KLH-konjugaatilla esiherkistysimmu-nointi saa aikaan allergeenillä indusoidun seerumin hista-25 miinin keskitason oleellisen vähenemisen, kuten havaitaan taulukon 7 näytetiedoista, joissa koe-eläinten seerumista mitatut histamiinin keskitasot olivat 70 ng/ml verrattuna 330 ng/ml keskitasoon, joka esiintyi verrokkiryhmässä vasteena allergeeni-(ovalbumiini)-stimulointiin.
30
Rottaryhmän (6) peptidi-KLH-konjugaatilla jälkiherkistysim-munointi toi esiin allergeenillä indusoidun histamiinitason dramaattisemman vähenemisen: verrokkieläimien keskiarvosta 2100 ng/ml koe-eläinten keskiarvoon 200 ng/ml; tämä on esi-35 tetty myös taulukossa 7.
Rotat, jotka immunoitiin peptidillä ennen herkistämistä tai « • sen jälkeen tuottivat voimakkaat IgM- ja IgG-anti-peptidi- vasta- ainevas teet (katso taulukko 5) verrattuna verrokkirot- 27 104723 taryhmiin, mutteivät merkittäviä IgE-anti-peptidivasta-aine-vasteita. Viidessä kuudesta jälki-immunoidusta rotasta, joissa ei ollut merkkejä mistään haitallisesta reaktiosta systeemiseen allergeeni- (ovalbumiini-) stimulointiin eikä 5 mitää merkittävää peruslinjan seerumin histamiinitasojen lisäystä, oli korkeita IgG- ja IgM-anti-peptidi-(F30)-vasta-ainetiittereitä seerumissa. Kuudennessa immunoidussa rotassa, jonka seerumin histamiinitaso nousi jälkiallergeenisti-muloinnin jälkeen, ei ollut mitään merkittävää anti-peptidi-10 vasta-aineen määrää verenkierrossa. Yllättäen sitä vastoin kaksi verrokkina (ei-peptidillä immunoiduista) herkistetyistä rotista kuoli fataaliseen anafylaktiseen shokkiin kaksi minuuttia systeemisen allergeenistimuloinnin jälkeen.
15 Myös esi- ja jälki-immunoitujen rottien IgE-vasta-ainevas-teiden ovalalbumiinia vastaan mittaukset verrattuna verrokkiryhmiin toivat esiin merkittävän verenkierrossa olevien IgE-anti-ovalbumiinitasojen vähentymisen, joka johtuu pep- / tidillä esi-immunoinnista (kuten taulukossa 8 esitetään).
20
ii. Rotan £-ketjun dodekapeptidillä (F49) esi- tai iälkiher-kistysimmunoinnin vaikutus ei-histamiinia vapauttavaan ana- I
loCTiin (F47)
Kokeellisesti herkistetyillä rotilla suoritettiin samanlai-25 set esi- ja jälkiherkistyspeptidi-immunointitutkimukset kuin : edellä kuvattiin käyttämällä immunogeeninä rotan e-ketjun dodekapeptidiäF49 (Lys-Tyr-Asn-Gly-Ser-Asn-Gln-Arg-Phe-Phe-Ile-Phe-NH2) tai analogia (F57) , jossa N-terminaalinen lysii- : nitähde on korvattu glysiinillä.
30 “
Esiherkistysimmunointi peptidi-(F49)-PPD-konjugaatilla sai f aikaan allergeenilla indusoidun seerumin histamiinitason : vähenemisen nollaan verrattuna keskitasoon 300 ng/ml, joka : esiintyi verrokkiryhmän (ei-peptidillä immunisoiduissa) ro- Γ 35 tissa, kuten taulukossa 9 on esitetty, kun taas jälkiherkis- l
tysimmunointi peptidi-PPD-konjugaatilla sai aikaan allergeenillä indusoidun seerumin histamiinitason laskun 50 I
t _ * ng/ml:aan verrokkieläimien 950 ng/ml:sta. Sen sijaan rotan e-ketjun dodekapeptidin analogilla (F47) kokeellisesti her- 28 104723 kiistettyjen rottien esi- tai jälki-immunoinnilla ei ollut merkittäväää vaikutusta allergeenilla indusoituun histamiinin vapautumiseen (kuten ilmenee myös taulukosta 7).
5 Taulukko 9
Histamiinin vapautuminen ησ/ml Verrokki A 300 F49A 0 F57A 606 10
Verrokki B 950 F49B 50 F47B 1159 15 A = Ennen kokeellista herkistämistä peptideillä immunoi-dut.
B - Kokeellisen herkistämisen jälkeen peptideillä immunoi-dut F49 = Histamiinia vapauttava rotan dodekapeptidi 20 F57 - Ei-histamiinia vapauttava rotan dodekapeptidi F49-ana logi
Esimerkki 6
Aktiivinen immunointi peptidillä (F30) käyttäen Al(0H)3:a ja 25 CP-20961:ä apuaineina « (a) Herkistysmenetelmä
Rottaryhmät herkistettiin kuten esimerkissä 5(a) kuvataan.
30 (b) Peptidi-immunointimenettely - Al(OH)3 käytetään apuainee na
Herkistetyt rottaryhmät immunoitiin synteettinen peptidi (F30) - kantoaineproteiini -konjugaatilla (PPD:tä käytettiin konjugaattina) . Eläimet injektoitiin subkutaanisti seoksella 35 (200 μΐ) , jossa on peptidi-PPD:tä (1 mg/ml) emulgoituna yhtä suureen tilavuuteen AI (OH)3-apuainetta. Tämä menettely toistettiin 14. vuorokautena. 35. vuorokautena otettiin häntäve-ri ja kokonais-anti-peptidivasta-aine mitattiin ELISA:11a esimerkissä 5(c) kuvatusti.
29 104723
Tulokset on esitetty taulukossa 10.
Taulukko 10 5 OD492
Rotta Seerumin laimennos flTQ 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1 0,10 0,20 0,40 0,50 0,55 0,50 0,45 0,30 2 0,45 0,55 0,70 1,00 1,10 1,10 1,00 0,79 10 3 0,60 0,65 0,85 0,90 0,95 0,75 0,65 0,40 4 0,65 0,95 1,00 1,00 1,00 1,00 0,80 0,40 5 0,75 0,90 0,95 1,05 1,40 1,45 1,50 1,20 (c) Peptidi-immunointimenetelma - CP20961 (lipidiamiinia 15 käytetty apuaineena)
Rottien immunointi suoritettiin edellä olevan kohdan (b) mukaisesti. 2 subkutaania injektiota peptidi-PPD-konjugaattia I
(500 μΐ) emulgoituma CP 206919 -lipidiamiiniapuaineeseen vuorokausina 0 ja 4. 35. vuorokautena otettiin veri ja anti-20 peptidivasta-aineen kokonaismäärä määritettiin ELISA:11a.
Tulokset on esitetty taulukossa 11.
Taulukko 11 - 25 OD492 ,« Rotta Seerumin laimennos • _ nTQ 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1 0,08 0,36 0,70 0,80 0,80 0,90 0,80 0,70
2 0,40 0,75 0,90 0,90 1,00 0,90 0,80 0,70 I
30 3 0,45 0,80 0,85 0,90 0,85 0,80 0,80 0,70 !
4 0,70 0,80 0,95 1,10 1,15 1,10 0,85 0,80 I
5 0,70 0,85 1,00 1,20 1,50 1,30 1,20 0,80 Γ , Esimerkki 7
35 Hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen I
(A) Immunointi : BALB/c-hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (i.p.) ” vapaata peptidiä F30 (100 /ig) tai peptidiä F30 konjugoituna Ξ 104723 30 glutaraldehydikäsittelyllä proteiinikantoaineeseen (PPD) emulgoituna yhtä suuriin tilavuuksiin Freundin täydellistä apuainetta. Injektoinnit toistettiin 14. ja 28. vuorokausina peptidillä tai peptidikonjugaatilla emulgoituna Freundin 5 epätäydelliseen apuaineeseen. Testaushäntäveret otettiin 28. vuorokautena tai myöhemmin ja niistä testattiin anti-pepti-divasta-aineiden läsnäolo epäsuoralla ELISA:11a. Kolme päivää ennen fuusiota hiiret, joissa esiintyi heränneitä seerumin vasta-ainetiittereitä, saivat lisätehosteinjektion 10 (i.p.) 100 μg peptidiä tai peptidikonjugaattia (100 ml) yhtä suuressa tilavuudessa PBS:ää, pH 7,2.
(B) Fuusio
Hyperimmunoidut hiiret tapettiin siirtämällä kohdunkaula, 15 niiden pernat poistettiin ja solut eristettiin ja pestiin. Pernasolut fuusioitiin hiiren myeloomasolulinjaan (Ag 8,653 tai NSO/1) viljelmästä logaritmisena kasvuna). Perna- ja myeloomasolut fuusioitiin Köhlerin ja Milsteinin menetelmän modifioinnilla (Köhler, G. ja Milstein, C., Nature (London) 20 246. s. 495 (1975)) suhteessa 2:1 vastaavasti käyttäen 40 % PEG (polyetyleeniglykoli, moolipaino 1450). Fuusiosuspensio jaettiin 96-koloisiin levyihin ja niitä viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi HAT (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini).
25 10 vuorokauden kuluttua levyt tutkittiin hybridoomien kasvun osalta. Näistä soluista poistetut supernatantit seulottiin anti-peptidivasta-aineiden läsnäolon osalta epäsuoralla ELISA: 11a.
30 (C) Kloonaus
Kun positiiviset kolot identifioitiin haluttua vasta-ainetta tuottaviksi, hybridisolut kloonattiin rajoittavalla laimennoksella ja kloonit tutkittiin uudelleen. Hybridoomia voi-35 daan viljellä pulloissa tai kasvattaa hiirissä. Vesivatsa-neste herätettiin BALB/c-hiirissä pristaaniila (0,5 ml in-" jektoituna i.p.) käynnistettynä muutama päivä ennen injek- ! · toimista 106-107 hybridisolulla. Kasvainten muodostuminen pitäisi syntyä 2-4 viikon kuluttua ja akkumuloitunut vesi- i 31 104723 vatsaneste poistaa insertoimalla hepoderminen neula hiiren vatsaonteloon. Monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatio vesivatsanesteessä määritettiin jokaisessa kasvainkohdassa ja se voi olla alueella 5-15 mg/ml.
5 (D) Testi
Viljelmä ja vesivatsanesteet seulottiin monoklonaalisen anti-peptidi- (F30) -vasta-aineaktiivisuuden suhteen epäsuoralla ELISA: 11a käyttäen mikrotiitterilevyjä, jotka on päällystet-10 ty kuten aiemmin esimerkissä 5(c) kuvattiin (rotan anti-pep-tidivasta-aineiden havaitsemiseksi) . Toiseen vaiheeseen kuuluu levyjen inkubointi yhden tunnin 37 °C:ssa 1:1000-laimennoksella vuohen anti-hiiri-IgG (kokonaismäärä) merkittynä peroksidaasilla, mitä seuraa niiden kehittyminen ja lukemi-15 nen tavallisella tavalla.
Näyte-ELISA-tiedot on esitetty taulukossa 12.
Taulukko 12 20
Vesivatsa- ELISA-luenta (OD492) neste_DEC IB DEC 5A DEC 6F DEC 7 B DEC 4E ' 1:40 1,597 1,322 1,693 1,068 1,305 1:80 1,567 1,327 1,473 1,102 1,235 25 1:160 1,557 1,395 1,329 1,087 1,092 1:320 1,475 1,295 1,218 0,994 0,922 ^ 1:640 1,266 1,192 1,025 0,642 0,713 1:1280 1,015 0,808 0,948 0,234 0,511 - 1:2560 0,630 0,681 0,910 0,140 0,300 ΐ 30 _
Hybridooma- superna-
tantti 1,342 0,923 1,020 1,355 1,079 I
(1:4-laimennos) 104723 32
International Application MICROORGANISMS ' Ομμη«ι SM«t « mih «*· μΙ«μ·4 la an f*t* ^ ***** ·! UM tTirfi#l Tn i _____f" Png- 1 ? 1 i r\t» Λ___ A. IDf NTiriCATION OF OlFOSIT · , F»«**·* r*HHi *·« WrniiM ·* an irrrttii·) *·** [ I *
Nun #1 #····*Μ*7 ImMwIlfii *
European Collection of Animal Cell Cultures AM··»· «I iiNMiry miMuUoa (tMlulMif MIUI CM· **4 cmmi)) ♦
Porton Down, Salisbury. Wiltshire, England
Oil· #1 *····* 1 ACCIHifA · 31 May 1990 90053107
I. AOOITIONAL INOICATIOkS 1 (U·*· M·*· il mi «t»liubU|. TKi· ·α(·μι·ιϊ·α w coaUavM «n « ····»!· «tUcAM Him! Q
C. DESIGNATED STATES EOR WHICH INDICATIONS ARC MADE » (if lh« ind.Ctl.on» ·»· not lor »II 4·«ι«α·ι·4 Suma) D. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS 1 41··«· blank II not Applicable)
Th· MAiClllAM ΚΐΙ·4 b*IOW will ·« (UlAtnid I· III· ImifAllMMl lurtiu Ul·' * (SptCity |h« 9·ΜΙ·Ι ΛΙΙ«»· ·Ι th· lAAkllllAI t.Q.,
Aeeuikn Num»«f of 0#PA»lt") --Z-- I. O] Tw· «η··ι »·· »·«·”·« »in th............ application »haa r.lap (to b. chackad bf Iha i.c.l.lno OfT.c·) ------------ (AwIMorlied Offl/·') I J Th· dal· «I Ι·<·'ΡΙ ΙΙ,βΛ Ib· ••Iitani) »y ΙΚ· lAlafftali»nal *·
(ΑμΙΑ·ηι·4 OfflctO
« ! i - — — - - - - - -- j *; r.,m FCTjuOfii» υ·«<*·>τ ···’>
Claims (13)
1. Menetelmä immunogeenin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vasta-ainetta herättävä immunogeeninen kantajatähde kon- 5 jugoidaan peptiditähteeseen tai peptidi syntetisoidaan ren-gasmuodossa, ja valinnaisesti sen jälkeen saatu konjugaatti formuloidaan adjuvantin kanssa tai vasta-aine herätetään saadulla konjugaatilla, jolloin peptidi on histamiinia vapauttava ja käsittää kationisen N-terminaalisen pään ja hydrofobi-10 sen C-terminaalisen hännän ja immunogeeninen kantaja inhiboi peptidin aiheuttamaa histamiinin vapautumista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin C-terminaalinen häntä on suojattu amidoi- 15 maila.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin C-terminaalinen häntä käsittää Phe-Phe-sekvenssin. 20
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin N-terminaalinen pää käsittää Lys-Thr-Lys- sekvens s in.
5. Patenttivaatimuksen l, 2, 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 2-6 vallitsevasti ei-polaarista ja ei-hydrofobista aminohappotähdettä erottaa peptidin N-terminaalisen pään C-terminaalisesta hännästä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ' T tä, että histamiinia vapauttavan peptidin tähteessä on sekvenssi: Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe. -
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ^ 35 tä, että peptidin N-terminaalinen pää käsittää Lys-tähteen ja i 2-8 vallitsevasti ei-polaarista ja ei-hydrofobista amino- I happotähdettä erottaa sen C-terminaalisesta päästä. 34 104723
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että C-terminaalinen häntä käsittää Phe-Phe-sekvenssin.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että peptidin N-terminaalinen pää käsittää Lys-tähteen, 2-8 vallitsevasti ei-polaarista ja ei-hydrofobista aminohappotähdettä erottaa N-terminaalisen pään peptidin C-terminaalisesta päästä ja että C-terminaalinen pää käsittää Phe-Phe-sekvenssin ja siinä on 2-6 aminohappoa. 10
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidin N-terminaalinen pää käsittää Lys-Thr-Lys-sekvenssin, 2-8 vallitsevasti ei-polaarista ja ei-hydrofo-bista aminohappotähdettä erottaa N-terminaalisen pään pep- 15 tidin C-terminaalisesta päästä ja että C-terminaalinen pää käsittää Phe-Phe-sekvenssin.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että histamiinia vapauttavan peptidin tähteessä on sek- 20 venssi: Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Vai-Phe-Ser-Arg tai Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Vai, 25 tai niiden amidoitu tai amidoimaton histamiinia vapauttava analogi.
12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herätetään monoklonaalinen vasta-aine. 30
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on vasta-aine, joka on tuotettu hybridoomasolulinjalla DEC 7B, ECACC 90053107. « i 35 104723
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8913737 | 1989-06-15 | ||
| GB898913737A GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | A novel anti-allergy treatment |
| PCT/GB1990/000926 WO1990015878A1 (en) | 1989-06-15 | 1990-06-15 | Immunoactive peptides and antibodies and their use in anti-allergy treatment |
| GB9000926 | 1990-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI915891A0 FI915891A0 (fi) | 1991-12-13 |
| FI104723B true FI104723B (fi) | 2000-03-31 |
Family
ID=10658467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI915891A FI104723B (fi) | 1989-06-15 | 1991-12-13 | Menetelmä immunoaktiivisten peptidien valmistamiseksi |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5601821A (fi) |
| EP (2) | EP0477231B1 (fi) |
| JP (2) | JPH04505922A (fi) |
| KR (1) | KR0181313B1 (fi) |
| AT (1) | ATE122401T1 (fi) |
| CA (1) | CA2057860C (fi) |
| DE (1) | DE69019348T2 (fi) |
| DK (1) | DK0477231T3 (fi) |
| ES (1) | ES2073028T3 (fi) |
| FI (1) | FI104723B (fi) |
| GB (2) | GB8913737D0 (fi) |
| IE (1) | IE71677B1 (fi) |
| NO (1) | NO914937L (fi) |
| NZ (1) | NZ234085A (fi) |
| PH (1) | PH30233A (fi) |
| PT (1) | PT94381B (fi) |
| WO (1) | WO1990015878A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA904670B (fi) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5955076A (en) * | 1989-06-15 | 1999-09-21 | Peptide Therapeutics Limited | Immunoactive peptides and antibodies and their use in anti-allergy treatment |
| SE9102808L (sv) * | 1991-09-26 | 1993-03-27 | Lars T Hellman Inst F Immunolo | Vaccin, foer humant bruk, vars avsedda effekt aer att lindra symptomen eller foerhindra uppkomsten av ige-medierade allergiska reaktioner |
| JP3156237B2 (ja) * | 1991-12-24 | 2001-04-16 | 雪印乳業株式会社 | 抗ヒトＩｇＥ モノクローナル抗体 |
| US6066718A (en) * | 1992-09-25 | 2000-05-23 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
| US5958708A (en) * | 1992-09-25 | 1999-09-28 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
| JPH06113881A (ja) * | 1992-10-07 | 1994-04-26 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ |
| AU5957794A (en) * | 1992-12-21 | 1994-07-19 | Uab Research Foundation, The | Compositions and method for the inhibition of phagocytes |
| US5759551A (en) * | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| ES2180576T3 (es) * | 1993-04-27 | 2003-02-16 | United Biomedical Inc | Construcciones peptidicas de lhrh inmunogenicas y estimuladores de inmunidad universales sinteticos para vacunas. |
| WO1995026365A1 (en) * | 1994-03-28 | 1995-10-05 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide based immunogens for the treatment of allergy |
| GB9412714D0 (en) * | 1994-06-24 | 1994-08-17 | Lewin Ian V | T cill epitopes |
| GB9416321D0 (en) * | 1994-08-12 | 1994-10-05 | Peptide Therapeutics Ltd | Peptides and antibodies and their use in treatment of carcinomas |
| GB9417086D0 (en) * | 1994-08-24 | 1994-10-12 | Peptide Therapeutrics Limited | Screen for potential therapeutic compounds |
| GB9422294D0 (en) * | 1994-11-04 | 1994-12-21 | Peptide Therapeutics Ltd | Peptides for anti-allergy treatment |
| GB2304347A (en) | 1995-08-11 | 1997-03-19 | Boeringer Ingelheim Vetmedica | Antigenic preparations |
| RU2193413C2 (ru) | 1996-03-01 | 2002-11-27 | Новартис Аг | Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии |
| EP0904031A4 (en) * | 1996-05-29 | 2002-05-02 | Cell Genesys Inc | CATIONIC POLYMERS / LIPIDS AS VEHICLES FOR PROVIDING NUCLEIC ACID |
| GB9724531D0 (en) | 1997-11-19 | 1998-01-21 | Smithkline Biolog | Novel compounds |
| US6913749B2 (en) * | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| US6573372B2 (en) | 1999-01-07 | 2003-06-03 | Heska Corporation | Feline immunoglobulin E molecules and compositions there of |
| EP2361635A3 (en) | 2000-08-30 | 2011-09-14 | Pfizer Products Inc. | Anti IgE vaccines |
| US7264810B2 (en) * | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| GB0109297D0 (en) | 2001-04-12 | 2001-05-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| JP2003047482A (ja) * | 2001-05-22 | 2003-02-18 | Pfizer Prod Inc | 非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥワクチン |
| ATE447967T1 (de) | 2001-09-14 | 2009-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Verpackung von immunstimulierendem cpg in virusähnlichen partikeln: herstellungsverfahren und verwendung |
| NZ537688A (en) | 2002-07-19 | 2007-01-26 | Cytos Biotechnology Ag | Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays for treating and/or attenuating Alzheimer's disease |
| US7425620B2 (en) | 2002-08-14 | 2008-09-16 | Scott Koenig | FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof |
| US20070218086A1 (en) | 2004-04-26 | 2007-09-20 | Innate Pharma, S.A. | Adjuvant Composition and Methods for Its Use |
| GB0424563D0 (en) | 2004-11-05 | 2004-12-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| DK2032592T3 (da) | 2006-06-12 | 2013-09-02 | Cytos Biotechnology Ag | Fremgangsmåder til pakning af oligonukleotider til virus-lignende partikler af rna-bakteriofager |
| ES2599319T3 (es) | 2006-06-26 | 2017-02-01 | Macrogenics, Inc. | Anticuerpos específicos de Fc RIIB y métodos de uso de éstos |
| AU2010217100B2 (en) * | 2009-02-25 | 2014-03-27 | Academia Sinica | Anti-CepsilonmX antibodies capable of binding to human mIgE on B lymphocytes |
| CN104603150A (zh) | 2012-04-20 | 2015-05-06 | 中央研究院 | 与CH4和CεmX结构域之间的连接处结合的抗mIgE抗体 |
| CA3018114A1 (en) * | 2016-03-18 | 2017-09-21 | Genclis | Molecular origin of allergy |
| EP3703753A4 (en) | 2017-10-31 | 2021-08-18 | Oneness Biotech Co., Ltd. | TREATMENT OF IGE-MEDIATED ALLERGIC DISEASES |
| JP7503857B2 (ja) * | 2022-04-11 | 2024-06-21 | 緑茵生技股▲ふん▼有限公司 | 抗アレルギー性ペプチド及びその免疫調節と抗アレルギーに用いられる用途 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171299A (en) * | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
| DE2602443A1 (de) * | 1975-04-04 | 1976-10-21 | Univ California | Biologisch aktive polypeptide |
| EP0000252B1 (en) * | 1977-06-29 | 1982-02-03 | Beecham Group Plc | Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides |
| US4579840A (en) * | 1983-08-12 | 1986-04-01 | Immunetech Pharmaceuticals | Method of blocking immune complex binding to immunoglobulin Fc receptors |
| US4683292A (en) * | 1983-08-12 | 1987-07-28 | Immunetech, Inc. | Immunotherapeutic polypeptide agents which bind to lymphocyte immunoglobulin FC receptors |
| AU1484688A (en) * | 1987-02-20 | 1988-09-14 | Imclone Systems, Inc. | Monoclonal antibodies in vaccine formulations |
| CA1336818C (en) * | 1987-04-16 | 1995-08-29 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy and composition thereof |
| GB8727045D0 (en) * | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| JPH0742313B2 (ja) * | 1988-03-28 | 1995-05-10 | 日立化成工業株式会社 | 新規ペプチド、その塩及びペプチド性抗アレルギー剤 |
| GB2246780B (en) * | 1990-05-25 | 1994-04-27 | Nat Res Dev | Immunodiagnostic assay for rheumatoid arthritis |
| DE4037426A1 (de) * | 1990-11-24 | 1992-05-27 | Kali Chemie Pharma Gmbh | Piperidinoalkylbenzoxazin- und -thiazin-verbindungen sowie verfahren zu ihrer herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel |
-
1989
- 1989-06-15 GB GB898913737A patent/GB8913737D0/en active Pending
-
1990
- 1990-06-14 IE IE215490A patent/IE71677B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-06-15 ZA ZA904670A patent/ZA904670B/xx unknown
- 1990-06-15 ES ES90909180T patent/ES2073028T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-15 EP EP90909180A patent/EP0477231B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-15 KR KR1019910701875A patent/KR0181313B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-06-15 PT PT94381A patent/PT94381B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-06-15 GB GB909013478A patent/GB9013478D0/en active Pending
- 1990-06-15 WO PCT/GB1990/000926 patent/WO1990015878A1/en active IP Right Grant
- 1990-06-15 JP JP2508657A patent/JPH04505922A/ja active Pending
- 1990-06-15 CA CA002057860A patent/CA2057860C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-15 DK DK90909180.3T patent/DK0477231T3/da active
- 1990-06-15 NZ NZ234085A patent/NZ234085A/xx unknown
- 1990-06-15 DE DE69019348T patent/DE69019348T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-15 EP EP90306583A patent/EP0403312A1/en active Pending
- 1990-06-15 AT AT90909180T patent/ATE122401T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-18 PH PH40691A patent/PH30233A/en unknown
-
1991
- 1991-12-13 FI FI915891A patent/FI104723B/fi active
- 1991-12-13 NO NO91914937A patent/NO914937L/no not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,505 patent/US5601821A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-10-27 JP JP11343746A patent/JP2000152783A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1990015878A1 (en) | 1990-12-27 |
| ATE122401T1 (de) | 1995-05-15 |
| KR920702723A (ko) | 1992-10-06 |
| JPH04505922A (ja) | 1992-10-15 |
| EP0477231B1 (en) | 1995-05-10 |
| NZ234085A (en) | 1991-09-25 |
| CA2057860C (en) | 2000-05-09 |
| EP0477231A1 (en) | 1992-04-01 |
| IE902154L (en) | 1990-12-15 |
| EP0403312A1 (en) | 1990-12-19 |
| US5601821A (en) | 1997-02-11 |
| DE69019348D1 (de) | 1995-06-14 |
| NO914937L (no) | 1991-12-19 |
| ZA904670B (en) | 1992-02-26 |
| IE902154A1 (en) | 1991-01-02 |
| GB9013478D0 (en) | 1990-08-08 |
| IE71677B1 (en) | 1997-02-26 |
| GB8913737D0 (en) | 1989-08-02 |
| NO914937D0 (no) | 1991-12-13 |
| ES2073028T3 (es) | 1995-08-01 |
| JP2000152783A (ja) | 2000-06-06 |
| PT94381B (pt) | 1996-11-29 |
| AU5814890A (en) | 1991-01-08 |
| PT94381A (pt) | 1991-02-08 |
| CA2057860A1 (en) | 1990-12-16 |
| KR0181313B1 (ko) | 1999-04-01 |
| DE69019348T2 (de) | 1995-09-21 |
| AU646808B2 (en) | 1994-03-10 |
| FI915891A0 (fi) | 1991-12-13 |
| PH30233A (en) | 1997-02-05 |
| DK0477231T3 (da) | 1995-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104723B (fi) | Menetelmä immunoaktiivisten peptidien valmistamiseksi | |
| KR100584051B1 (ko) | 알레르기에 대한 백신 접종 및 치료를 위한 펩티드임뮤노겐 | |
| SK11295A3 (en) | Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them | |
| CZ20013081A3 (cs) | Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití | |
| EP0709455A1 (en) | Monoclonal antibody to human glicentin, hybridoma for producing said antibody and assay method for human glicentin using said antibody | |
| US5955076A (en) | Immunoactive peptides and antibodies and their use in anti-allergy treatment | |
| AU646808C (en) | Immunoactive peptides and antibodies and their use in anti-allergy treatment | |
| US20050152892A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutics uses | |
| US20030170229A1 (en) | Vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED |
|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED |