FI103092B - Liposomien ekstruusiomenetelmä - Google Patents

Description

103092

Liposomien ekstruusiomenetelmä - Extrusionsprocess av liposomer

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää liposomien luokittelemiseksi koon mukaan 5 ja erityisesti luokittelumenetelmää, johon sisältyy liposomien ekstrudointi huokoisen alumiinioksidikalvon, jonka huokostyyppi on haaroittunut, läpi.

Liposomit ovat täydellisesti suljettuja, kaksikerroksisia lipidimembraaneja, jotka sisältävät sisäänsuljetun tilavuuden vettä. Liposomit voivat olla yksilamellisia rakku-10 loita (joissa on yksi ainoa kaksikerroksinen membraani) tai monikerroksisia rakkuloita (sipulin kaltaiset rakenteet, joille moninkertaiset, membraanin muodostamat kaksoiskerrokset, joita kutakin vesikerros erottaa seuraavasta, ovat ominaisia). Kak-soiskerros koostuu kahden yksikerroksisen lipidin, jolla on hydrofobinen "häntä"-alue ja hydrofiilinen "pää"-alue, muodostamasta kaksoiskerroksesta. Membraanin 15 muodostaman kaksoiskerroksen rakenne on sellainen, että yksittäisten lipidikerros-ten hydrofobiset (poolittomat) "hännät" suuntautuvat kaksoiskerroksen keskustaa kohti, kun taas hydrofiilinen "pää" suuntautuu vesijaetta kohti.

Bangham et al.:n (J. Mol. Biol., 1965, 13:238-252) alkuperäiseen liposomivalmis-20 teeseen sisältyy fosfolipidien suspendointi orgaaniseen liuottimeen, joka sitten haihdutetaan kuivaksi, mikä jättää fosfolipidikalvon reaktioastian pinnalle. Seuraavaksi lisätään sopiva määrä vesijaetta, seoksen annetaan "turvota" ja tuloksena olevat liposomit, jotka käsittävät monilamellisia rakkuloita (MLVt), dispergoidaan mekaanisin keinoin. Tämä tekniikka antoi käyttöön perustan pienten, äänikäsiteltyjen, yksila-25 mellisten (SUVt) rakkuloiden kehittämiseksi, mitä Papahadjopoulos et ai. (Biochim. ·:··: Biophys Acta., 1968, 135:624-638) kuvasivat, samoin kuin suuria, yksilamellisia rakkuloita (LUVt). Lisäksi US-patentti 4 235 871, joka ilmestyi marraskuun 25. päi- • · vänä, 1980, Papahadjopouloksen et ai. nimellä, kuvaa "käänteisjaehaihdutusmene-telmää" oligolamellilipidirakkuloiden, jotka tunnetaan myös käänteisjaehaihdutus-30 rakkuloina (REVt), valmistamiseksi.

• · · • · · • · ·

On kehitetty vaihtoehtoisia menetelmiä monilamellisten rakkuloiden parannettujen i luokkien, joilla on osoitettu olevan erityisesti parannettuja ominaisuuksia, kuten esimerkiksi korkeampia aktiivisuuksia ainesosien sisäänsulkemiseksi ja suurempi 35 kuormituskyky, parempi stabiilius, vähäisempi vuotavuus ja helpompi valmistettavuus, muodostamiseksi. Yhtä sellaista liposomien parannettua luokkaa, jota nimitetään stabiileiksi, monilamellirakkuloiksi (SPLVt), kuvataan US-hakemuksessa 4 522 803, joka julkaistiin kesäkuun 11. päivänä, 1985, Lenk et al.:n nimissä. Erästä toista 2 103092 sellaista parannettua luokkaa, jota nimitetään yksifaasisiksi rakkuloiksi (MPVt), kuvataan US-patentissa 4 558 578, joka julkaistiin toukokuun 13. päivänä, 1986, Fountain et al.:n nimellä. Molemmilla näistä liposomiluokista on luonnehdittu olevan oleellisesti samanarvoiset, lamellien väliset liuosjakaumat. Yleinen selonteko, 5 joka koskee erilaisia liposomien valmistusmenetelmiä, sisältäen laajan kirjaluettelon, esitetään artikkelissa, Deamer ja Ulster, "Liposome Preparation: Methods and Mechanisms", kirjassa the Liposomes, toimittanut M. Ostro, s. 27-51 (1983), mikä on liitetty tähän yhteyteen viitteenä.

10 Lääkkeiden, jotka on kapseloitu liposomeihin tai muuten yhdistetty niihin, antamista on useissa lääkkeiden annosteluohjeissa ehdotettu käytettäviksi yhdistettynä vapaiden lääkkeiden antamiseen tai vaihtoehtona vapaiden lääkkeiden antamiselle. Joissakin sovellutuksissa liposomien on havaittu antavan käyttöön lääkkeiden hidastuneen vapautumisen pidennetyiksi ajanjaksoiksi, joilla voi olla erityistä merkitystä 15 pidennetyn kemoterapian hoito-ohjeissa, joita usein vaaditaan syövän erilaisten muotojen tai AIDS:iin liittyvien sairauksien hoidossa. Liposomien eräs toinen ominaisuus on niiden kyky tulla tiettyjen solujen, kuten esimerkiksi fagosyyttien ottamiksi, siten että ne voivat luovuttaa aktiivisen aineosan solujen sisälle. Tämä tekee sellaisen liposomikäsittelyn erityisen käyttökelpoiseksi solunsisäisiä tulehduksia 20 hoidettaessa, kuten esimerkiksi niitä, jotka liittyvät Mycobacteria-, Brucella-, Listeria- ja Salmonella-lajeihin. Täten lääkkeitä, jotka kapseloidaan liposomeihin, voidaan käyttää sellaisten solunsisäisten tautien hoitamiseen, antamatta verivirtaan suuria määriä kapseloimatonta lääkettä. Lisäksi sellaisten lääkkeiden tai muiden biologisesti aktiivisten aineiden pelkän liittämisen liposomien kanssa on havaittu te-25 hostavan tai parantavan sellaisten lääkkeiden tai biologisesti aktiivisten aineiden aktiivisuutta tai vähentävän niiden myrkyllisyyttä.

• · · • · · • · • ·

Liposomit käyttäytyvät kuten partikkelit, ja niitä kuvataan yleisesti keskimääräisen partikkelikoon ja partikkelikokojakauman termein. Liposomien tiettyjä käyttöjä #·;·. 30 varten, erityisesti lääkkeiden parenteraalisessa antamisessa, on tärkeää kalibroida li- • · · l..' posomien koko halutuksi, keskimääräiseksi partikkelikooksi ja pitää yllä säädelty partikkelikokojakauma, erityisesti kalibroimalla liposomit niin, että oleellisesti kaikki liposomit ovat kooltaan pienempiä kuin ennalta määrätty maksimiläpimitta. Liposomeille, jotka on tarkoitettu parenteraaliseen antamiseen, eräs haluttu kokoalue 35 on noin 100 nm:n ja 1000 nm:n välillä, mieluummin noin 100-500 nm. Tässä yhteydessä käytettynä nm tarkoittaa nanometriä (10'9 m) ja pm merkitsee mikrometriä tai mikronia (ΙΟ·6 m). Haluttua, suurinta kokoaluetta rajoittaa usein toivomus steriloida liposomit suodattamalla ne tavanomaisten sterilointisuodattimien, joilla tavallisesti 3 103092 on noin 200 nm:n partikkelikoon erotusraja, läpi. Kuitenkin biologisen tehon ja/tai turvallisuustekijöiden tyhjäksi tekeminen voi sanella tietyn partikkelikoon, joko suuremman tai pienemmän, tarpeen. Liposomien kokoalueen säätäminen voi myös parantaa liposomien tehokkuutta in vivo, samoin kuin liposomien stabiiliutta ja vuota-5 misresistenssiä.

Liposomien erilaiset valmistamismenetelmät yleensä antavat suspension liposomeja, joilla on laajalti vaihtelevat koot ja joista monet ylittävät 1000 nm:n keskimääräisen partikkelikoon. On esitetty joukko menetelmiä liposomien koon ja kokojakautuman 10 pienentämiseksi sellaisissa suspensioissa. Yksinkertaisessa homogenointimenetel-mässä liposomien suspensio pumpataan toistetusti suuren paineen alla pienen suuttunen tai reaktiokammion läpi, kunnes haluttu partikkelikoko saavutetaan. Tämän menetelmän rajoituksena on, että liposomien kokojakauma on tyypillisesti jokseenkin laaja ja vaihteleva homogenointijaksojen lukumäärästä, paineista ja sisäisestä 15 lämpötilasta riippuen.

Pienet, yksilamelliset rakkulat (SUVt), joille yleensä on luonteenomaista, että niiden läpimitat ovat 100 nm:n alapuolella, koostuvat erittäin jännitetyistä, käyristä kak-soiskerroksista. SUVt valmistetaan tyypillisesti pilkkomalla suurempia liposomeja 20 ultraäänikäsittelyllä. On havaittu, että sellaisten liposomien kapea kokojakauma voidaan saavuttaa ainoastaan silloin kun liposomit on pienennetty pienimpään kokoonsa, noin 50 nm:n alapuolelle. Lisäksi tämä menetelmä ei sovellu suuressa mittakaavassa tapahtuvaan tuotantoon, koska se suoritetaan yleensä eräprosessina, suhteellisen pienien tilavuuksien pitkään kestävällä ultraäänikäsittelyllä. Lämmön muodos-25 tuminen äänikäsittelyn aikana voi lisäksi johtaa peroksidatiiviseen hajoamiseen lipi-deiksi, ja äänikäsittelykoettimet voivat levittää titaanipartikkeleita, jotka ovat jok- S seenkin myrkyllisiä in vivo.

• · • · « • · ·

Julkaisussa Szoka, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:4194-8 (1978), esitetään liposo- 30 mien kalibrointimenetelmä suodattamalla ne 200 nm:n Unipore™-polykarbonaatti- . ·: ·. suodattimen läpi. Kokoon perustuvaa käsittelymenetelmää, joka pohjautuu liposomi- « · · *. en ekstruusioon tasaisten, tyypiltään suoria huokosia, noin 1000 nm:stä noin 100 nimiin, sisältävien polykarbonaattimembraanien sarjan läpi, kuvataan US-paten-tissa 4 529 561, joka julkaistiin heinäkuun 16. päivänä, 1985. Tämä menetelmä voi 35 kuitenkin olla suhteellisen hidas, vaatien usein monta suodatusta eri kokoja vastaavien suodattimien läpi halutun partikkelikokojakauman saamiseksi.

„ 103092 4

Rakkuloita voidaan myös koon suhteen pienentää käyttämällä ekstruusiomenetel-mää, jota Cullis et ai. kuvaavat US-patentissa 5 008 050, joka julkaistiin huhtikuun 16. päivänä, 1991, ja joka on tähän yhteyteen liitetty viitteenä. Tällä tekniikalla rakkulat voidaan ekstrudoida paineen alla suodattimen läpi, jonka huokoskoko on 100 5 nm tai vähemmän. Tämä menettelytapa välttää yllä esitettyjen homogenointi- ja äänikäsittelymenetelmien ongelmat, eikä se vaadi monia suodatuksia suodattimien läpi, joilla on pienenevä huokoskoko, kuten yllä mainitussa US-patentissa 4 529 561 esitetään. Sellainen menetelmä voi antaa käyttöön liposomien kokojakauman, joka on jokseenkin kapea, erityisesti antamalla materiaalin jaksoittain läpäistä valitun ko-10 koinen suodatin useita kertoja. Lisäksi uskotaan, että sellaiset ektsruusiot voivat muuttaa monilamellirakkulat oligolamelli- tai vieläpä yksilamellimuotoon, jota saatetaan haluta tiettyjä sovellutuksia varten. Kuitenkin, kuten havainnollistetaan esillä olevassa julkaisussa esitetyin esimerkein, kun sellaiset ekstruusiot suoritetaan 100 nm:n polykarbonaattisuodattimien läpi, kuten esimerkiksi Nuclepore™-suodat-15 timilla, joita käytetään tämän viitteen esimerkeissä, vieläpä suhteellisen korkeilla paineilla virtausnopeudet voivat olla suhteellisen alhaisia.

US-patentti 4 737 323, joka julkaistiin huhtikuun 12. päivänä, 1988, kuvaa liposomien luokittelua koon mukaan ekstrudoimalla ne epäsymmetrisen, keraamisen suo-20 dattimen läpi. Sellaisten suodattimien tarkoituksena on toimia suhteellisen korkeassa paineessa, ja ne voidaan huuhdella vastavirtaan tukkeutumisen estämiseksi. US-patentti 4 927 637, joka julkaistiin toukokuun 23. päivänä, 1990, kuvaa menetelmää liposomien luokittelemiseksi koon mukaan, antamalla niiden läpäistä polymeerisuo-datin, jolla on rainan kaltainen, "mutkitteleva polku" -rakenne.

25 \ Suodatinväliaineen vaihtoehtoista tyyppiä Fumeaux et ai. kuvaavat US-patentissa 4 687 551, joka julkaistiin elokuun 18. päivänä, 1987. Tämä patentti julkaisee uu- : dentyyppisen suodatinlevyn, joka sisältää alumiinioksidikalvon, jossa on haaroittu- « · · : neita huokosia, jotka ulottuvat kalvon yhdeltä pinnalta kalvon toiselle pinnalle. Kal- 30 vo on ainutlaatuinen siinä suhteessa, että se sulkee sisäänsä suurempien huokosten : järjestelmän, joka ulottuu sisään yhdeltä pinnalta, sekä pienempien huokosten järjes- telmän, joka ulottuu sisään toiselta pinnalta. Suurempien huokosten järjestelmä yh- distyy pienempien huokosten järjestelmän kanssa, siten että yhden tai useamman pienemmän huokosen sisäpäät yhdistyvät suuremman huokosten sisäpäähän, eikä 35 ole oleellisesti mitään aukottomia, suurempia huokosia. Tämä patentti sisällytetään viitteenä esillä olevaan hakemukseen tarkoituksena julkaista sellaiset huokoiset alu-miinioksidikalvot, joiden huokostyyppi on haaroittunut, sekä menetelmä niiden muodostamiseksi.

5 103092

Erityisessä sovellutusmuodossa Fumeaux et al.:n alumiinioksidianodikalvoa, jossa on haaroittuneet huokoset, kuvataan seuraavasti:

Alumiinioksidianodikalvo, jossa on huokosia, jotka ulottuvat kalvon yhdeltä pinnal-5 ta kalvon toiselle pinnalle, mukaan luettuna suurempien huokosten järjestelmä, joka ulottuu yhdeltä pinnalta kalvoon ja jossa suurempien huokosten läpimitta on d niiden sisäpäiden lähellä, sekä pienempien huokosten muodostama järjestelmä, joka ulottuu toiselta pinnalta kalvon sisään matkan s ja jossa pienemmillä huokosilla on oleellisesti yhtenäinen vähimmäisläpimitta p, suurempien huokosten järjestelmän 10 yhdistyessä pienempien huokosten järjestelmän kanssa, siten että yhden tai useamman huokosen sisäpäät liittyvät suuremman huokosen sisäpäähän eikä ole oleellisesti mitään aukottomia, suurempia huokosia, edellä esitetyssä d on 10 nm -2 pm, p on vähintään 2 nm, mutta vähemmän kuin 0,5 d, ja s on 10 nm - 1 pm.

15 Sellaisten, haaroittuneita huokosia sisältävien kalvojen kokoluokka on yhtä suuri kuin p, pienempien huokosten oleellisesti yhdenmukainen vähimmäisläpimitta.

Suodatinmembraanit, jotka on valmistettu Fumeaux et al.:n julkaisun mukaisesti, ovat kaupallisesti saatavissa, ja niitä myy Anotec Separations, New York, NY, ni-20 mellä Anopore™ Lisätieto, joka koskee sellaisia membraaneja, joilla on haaroitettu huokostyyppi, esitetään Fumeaux et ai. :n julkaisussa "The Formation of Controlled-Porosity Membranes From Anodically Oxidized Aluminium", Nature 337:147-9 (1989).

<rii 25 Sellaisten Anopore -suodattimien käyttöä, joiden huokoset ovat haaroitetut, Jones • · · *** \ et ai. kuvaavat julkaisussa "Comparison of New Inorganic Membrane Filter (Anopore) with Track-Etched Polycarbonate Membrane Filter (Nucleopore) for Di- • · · : ·* reet Counting of Bacteria", Applied and Environmental Microbiology 55(2):529-30 : (1989). Tämä artikkeli vertailee Anopore™-suodattimen, jonka huokoskoko on 30 200 nm, bakteereita suodattavaa kykyä Nucleopore™-suodattimeen, jonka huokos- koko on 200 nm.

« • · · • · ·

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetaan liposomien populaatio, josta oleellisesti puuttuvat liposomit, joiden koko on ennalta määritellyn maksimikoon yläpuo-35 lella, (1) antamalla käyttöön liposomien populaatio, jonka osa on kooltaan suurempia kuin ennalta määritetty maksimikoko; ja (2) suodattamalla suspensio paineen alla, yhden tai useampia kertoja, huokoisen alumiinioksidikalvon läpi.

103092 6

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Kalvoja, joiden huokoskoko on 1000 nm tai sitä pienempi, voidaan käyttää, jotta saadaan liposomeja, joiden keskimääräinen koko on noin 100-1000 nm:n alueella. 5 Esillä olevan keksinnön erityisessä sovellutusmuodossa käytetään kalvoa, jonka huokoskokoluokka on 200 nm:ä tai vähemmän, jotta saadaan populaatio liposomeja, joiden ennalta määrätty maksimiläpimitta on noin 500 nm:ä tai sitä pienempi. Eräässä toisessa sovellutusmuodossa käytetään kalvoa, jonka huokoskoko on noin 100 nm:ä tai vähemmän, ja liposomisuspension annetaan läpäistä suodatin yhden tai 10 useampia kertoja, kunnes liposomien keskimääräinen partikkelikoko on noin 100-200 nm:ä.

Esillä olevan keksinnön eräässä lisäsovellutusmuodossa liposomien suspensio suodatetaan toistetusti huokoisen kalvon läpi, kunnes saadaan haluttu partikkelikokoja-15 kauma. Erityisessä sovellutusmuodossa liposomit suodatetaan huokoisen kalvon läpi kaksi - kymmenen kertaa. Eräässä lisäsovellutusmuodossa liposomit luokitellaan ennalta koon mukaan suodattamalla ne yhden tai useampia kertoja suodattimen läpi, jonka huokoskoko on 2-10 mikrometriä.

20 Edullinen kalvo esillä olevassa keksinnössä suoritettavaa käyttöä varten on huokoinen alumiinioksidianodikalvo, jonka huokoset ovat haaroitettua tyyppiä. Kuten yllä esitetään, sellainen huokoinen alumiinioksidianodikalvo, jonka huokoset ovat haaroitettua tyyppiä, on alumiinioksidilevy, jolla on kaksi oleellisesti samansuuntaista pääpintaa, joissa on huokosia, jotka ulottuvat levyn yhdeltä pinnalta toiselle, mu-25 kaan luettuna suurempien huokosten järjestelmä, joka ulottuu yhdeltä pinnalta levyn

• « I

·*' sisälle, ja pienempien huokosten järjestelmä, joka ulottuu sisään toiselta pinnalta, .* suurempien huokosten järjestelmän liittyessä pienempien huokosten järjestelmään, • · · : ·’ siten että yhden tai useamman huokosen sisäpäät ovat yhdistetyt suuremman huoko- * sen sisäpäähän eikä oleellisesti ole mitään aukottomia, suurempia huokosia. Sellais- 30 ten kalvojen, joiden huokoset ovat haaroitettua tyyppiä, kokoluokka on sama kuin pienempien huokosten, jotka ovat mieluummin oleellisesti yhdenmukaisia, vähim-mäisläpimitta.

Esillä olevan keksinnön lisäsovellutusmuodossa annetaan käyttöön laite suoritusme-35 netelmän täytäntöön panemiseksi. Laite käsittää yhden tai useampia suodatinsarjoja huokoisten alumiinioksidikalvojen pitämiseksi toiminnallisessa konfiguraatiossa, välineet liposomisuspension syöttämiseksi suodatinsarjoihin ja välineet suodoksen vastaanottamiseksi suodatinsarjoista. Erityisessä sovellutusmuodossa käytetään kah- 7 103092 ta tai useampaa sarjaa samansuuntaisessa konfiguraatiossa liposomisuspension suodattamiseksi suodattamalla se syöttövälineistä vastaanottovälineisiin. Valinnaisesti voidaan myös antaa käyttöön välineet ainakin suodoksen osan kierrätystä varten vastaanottovälineistä syöttövälineisiin, antaen täten käyttöön liposomien moninker-5 täisen suodatuksen suodattimien läpi. Lisäksi voidaan antaa käyttöön sterilointisuo-datin vastaanottolaitteista myötävirtaan, kuten voi olla sopivaa suodoksen valmistamiseksi farmaseuttista käyttöä varten.

Ekstruusio on nopeaa ja edullista eikä se vaadi liuottimien tai muiden kemikaalien, 10 jotka täytyisi poistaa, käyttöä.

Kuva 1 esittää suodatinsarjan, joka on valmistettu esillä olevan keksinnön mukaisesti, yksinkertaistettua kuvaa ylhäältä katsottuna.

15 Kuva 2 esittää esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetun suodatinsarjan yksinkertaistettua poikkileikauksen, joka esitetään kuvassa 1, viivalla 2-2, sivukuvaa, joka ei ole mittakaavassa.

Kuva 3 on esittää esillä olevan keksinnön mukaisen ekstruusiojärjestelmän kaa-20 viokuvaa.

Kuten Fumeaux et al.:n edellä mainituissa viitteissä esitetään, alumiini voidaan käsitellä anodisesti hapossa solujen tai aukkojen, joilla on sylinterimäiset huokoset, jotka mieluummin haarautuvat huokoskooltaan suuremmista aukoista, jotka sijaitsevat 25 kalvon yhdellä pinnalla, huokoskooltaan pienempiin aukkoihin kalvon toisella pin- • · · *“ *. nalla, tasaisen järjestyksen aikaan saamiseksi. Sellaisia suodattimia on saatavissa eri huokoskokoja, ja suodattimet, joiden pienempien huokosten koko on pienempi kuin • · · • ·* noin 1000 nm, ovat edullisia esillä olevan keksinnön mukaista käyttöä varten, vaik- * ka pienempiä tai suurempia huokoskokoja voidaan käyttää liposomien lopullisesta 30 käytöstä riippuen. (Myöhemmin tässä yhteydessä, ellei muuten mainita, sellaisten suodattimien "huokoskoko" tarkoittaa pienempien huokosten vähimmäishuokosko-koa). Anodisesti käsiteltyjä alumiinihuokossuodattimia Anopore™ on tällä hetkellä saatavissa kaupallisesti Anotec Separationsilta, suodattimilla, joiden huokoskoko on 200 nm:n alapuolella, on haaroitettu huokosrakenne, ja niillä suodattimilla, joiden 35 huokoskoko 200 nm:ä tai sitä suurempi, on yhdeltä pinnalta toiselle yhtenäinen huokoskoko. Kun liposomien haluttu, keskimääräinen partikkelikoko on vähemmän kuin noin 200 nm, silloin suodattimen edullinen huokoskoko on vähemmän kuin 8 103092 noin 100 nm. Nämä suodattimet ovat samaten huokosrakenteeltaan edullista, haaroittunutta tyyppiä.

Nämä alumiinioksidisuodattimet ovat hydrofiilisiä; ne eivät turpoa vettä sisältävissä 5 liuottimissa; niillä on hyvä orgaanisen liuottimen vastustuskyky; ja niillä on tasakokoiset huokoset, jotka edistävät suuria läpivirtausominaisuuksia. Sellaisten kalvojen ominaisuuksien vuoksi havaittiin, että liposomit voitiin pursottaa niiden läpi suhteellisen suurella virtausnopeudella suhteellisen alhaisessa paineessa (katso esimerkki 3, jäljempänä). Täten on alumiinioksidisuodattimien osoitettu olevan lipo-10 somien ekstruusioon ylivoimaisia aiemmin tunnettuihin polymeerisuodattimiin verrattuina.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään mieluummin suodattimia, joissa on haaroitetut huokoset, niin että liposomit menevät sisään pinnalta, jossa huokosten koko on pie-15 nempi, ja menevät ulos pinnan kautta, jossa huokosten koko on suurempi. Kuitenkin, kuten esitetään jäljempänä olevissa esimerkeissä, hyvä ekstruusio voidaan myös saada aikaan suodattimella, joka on asennettu ylösalaisessa asennossa siten, että liposomit menevät sisään suurihuokosellisen pinnan kautta.

20 Esillä olevan keksinnön mukaisesti liposomien suspensio, josta oleellisesti puuttuvat liposomit, joilla on ennalta määrätty maksimikoko, valmistetaan liposomien suspensiosta, jonka osa on kooltaan suurempia kuin ennalta määrätty maksimikoko. Menetelmään sisältyy liposomien suspension suodattaminen paineen alla yhden tai useampia kertoja huokoisen alumiinioksidikalvon läpi, esimerkiksi jonkin edellä ku-25 vatun tyyppisen kalvon läpi.

• · · • · * ·♦♦ ♦ « **' ' Sen määrittämiseksi, puuttuvatko liposomien populaatiosta "oleellisesti liposomit, • · · • V joiden koko on ennalta määritetyn maksimikoon yläpuolella", liposomit voidaan • · · : tutkia koon standardiluokittelijaa käyttämällä. Yksi sellainen koon standardi luokit- 30 telija on Malvern Sizer, joka on saatavissa Malvem Instrumentsilta, Malvem, Eng-lanti, ja jota käytetään joissakin alla esitetyissä esimerkeissä. Toinen koon luokitteli- • Tim ja, jota voidaan käyttää partikkelikoon jakauman määrittämiseksi, on Nicomp , partikkelien laserluokittelija, joka on saatavissa Hiac/Royco Instrumentsilta, Menlo Park, CA, jota myös kuvataan ja käytetään joissakin jäljempänä esitetyissä esimer-35 keissä. Esimerkeissä raportoitu, partikkeleiden kokojakaumia koskeva tulos, joka ilmaisee, että 0,0 prosenttia populaatiossa läsnä olevista liposomeista on annetun koon yläpuolella, osoittaa, että populaatiossa "ei oleellisesti ole" sellaisia suurikokoisia liposomeja.

i 9 103092

Vaikka ei vaadita, liposomien partikkelikoko ja erityisesti partikkelikokojakauma voidaan tehdä pienemmäksi ja tasaisemmaksi ekstrudoimalla ensimmäisenä vaiheena suuremman suodattimen läpi. Esimerkiksi esktruusio sopivan, 2-10 mikrometrin huokoskoon, kuten esimerkiksi polytetrafluorietyleenistä valmistetun suodattimen 5 läpi, kuten alalla on hyvin tunnettua, vähentää partikkelikokoa ja partikkelijakaumaa ennen ekstruusiota alumiinioksidisuodattimen läpi, ja se voi siten vähentää ekstruu-sioaikaa.

Ekstruusion aikana paine vaihtelee riippuen käytetyistä liposomeista, niiden partik-10 keliläpimitasta ja partikkelikokojakaumasta sekä halutusta virtausnopeudesta. Ekstruusiopaineet voivat vaihdella noin 1,4 Mpa:sta noin 6,9 MPa:han, mutta paineet, jotka ovat alempia kuin noin 600 Psi:tä (4,2 MPa), ovat edullisia.

Yleisesti sanottuna, tarvitaan vähemmän ekstruusiosuodatuksia, kun käytetään esillä 15 olevan keksinnön mukaisia alumiinioksidisuodattimia, joiden huokostyyppi on haaroittunut, vastakohtana aiemmin tunnetuille polykarbonaattisuodattimille, samanlaisten tulosten suhteen, partikkelikokona, partikkelikokojakaumana ja virtausnopeuksina ilmoitettuina. Kuitenkin voidaan käyttää toistettuja ekstruusiosuodatuksia alumiinioksidisuodattimen läpi, jotta saadaan kapeampi partikkelikokojakauma ja 20 erityisesti madallettua kaikki liposomit ennalta määrätyn maksimikoon alapuolelle. Esimerkiksi on edullista suorittaa 2-10 liposomien ekstruusiota suodattimien läpi partikkelikokojakauman pienentämiseksi, mikä tällöin tuottaa suhteellisen tasaisia li-posomeja suurella kapasiteetilla, nopeasti, tehokkaasti ja halvalla. Moninkertainen ekstruusio voi myös muuttaa monilamellirakkuloita toivotuimmiksi oligolamelli- tai 25 yksilamellimuodoiksi.

M· · m\ ’ Esillä olevan keksinnön mukaisen ekstruusiomenettelyn jälkeen, mikä tahansa kap- • · · • ·* seloimaton, terapeuttinen aine tai muu liuos voidaan poistaa helposti esimerkiksi : dialyysin tai diasuodatuksen avulla, joka jättää jäljelle kooltaan suhteellisen tasaisia, 30 lääkettä pysyvästi kapseloivia liposomeja. Tuloksena olevat liposomit voidaan hel-:*:’*· posti mitata tasaisiksi annoksiksi parenteraalista tai suun kautta suoritettavaa anta- :T: mistä varten.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen seuraavin esimerkein, mutta keksintöä ei 35 ole tarkoitus rajoittaa niissä kuvattuihin yksityiskohtiin.

T03092 10

Esimerkki 1 Liposomien valmistus

Valmistettiin kolme erää liposomeja (nimitetty tässä yhteydessä myöhemmin A.ksi, 5 B:ksi ja C:ksi) seuraavasti: 71,3 mg/ml munan fosfatidyylikoliinia (saatu Princeton Lipidsiltä, Princeton, New Jersey) ja 28,7 mg/ml kolesterolia (J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) liuotettiin 0,15-0,5 ml:aan metyleenikloridia ja lisättiin 300-millimolaariseen sitraattipuskuri-10 liuokseen (pH 4,0) tilavuuden täyttämiseksi 1 ml:aan. Metyleenikloridi poistettiin kuumentamalla seosta noin 40 °C:een. Liuottimen poistamisen auttamiseksi typen annettiin kuplia erien A ja C läpi, kun taas erää B kuumennettiin osittaisen tyhjön alla.

15 Tuloksena olevat liposomit olivat rakkuloita, joilla oli erilaiset koot ja erilaiset koko-jakaumat. Näiden liposomien ensimmäiset kokojakaumat ennen koon vähenemistä mitattiin 63 mm:n linssiä käyttäen, Malvem Sizerillä, tyyppi 3600 E, joka on saatavissa Malvem Instrumentsilta, Malvem, England. Tulokset esitetään taulukossa I, jossa keskimääräiset läpimitat ja kokojakaumat ilmaistaan mikrometreinä (pm). En-20 nen ekstruusiota erä B esiluokiteltiin koon mukaan antamalla sen läpäistä Mitex™:n PTFE-suodatin (Millipore Corp., Bedford, Mass.), jonka huokoskoko oli 5 pm, ja taulukkoon on sisällytetty erän B liposomien esiluokittelun jälkeinen, keskimääräinen läpimitta ja jakauma-alue. Erille A ja C ei suoritettu esiluokittelua. Nämä tulokset osoittavat luokittelemattomien liposomien kokojakauman huomattavaa vaihtelua 25 erien välillä.

• · · • · · ·

Taulukko I

·· · • · · • · • · • · · ; Liposomien koot ennen ekstruusiota

Erä Keskimääräinen läpimitta Jakauma-alue :Y: (pm) (pm) ··· • ♦ · • · · A 23,2 1,5-118 B 14,9 1,5-118 B* 2,5 <1,2-5 C 3,3 <1,2-14 30 * 5 mikrometrin esiluokituksen jälkeen 11 103092

Esimerkki 2 Liposomien ekstruusio

Esimerkin 1 liposomit ekstrudoitiin esillä olevan keksinnön mukaisesti viisi kertaa

Tim 5 paineen alla 90 mm:n läpimittaisen Anopore -suodattimen, jossa oli alumiinioksi-disuodatin, jonka haaroitetut huokoset olivat kooltaan 100 nm:ä (pieniä huokosia) ja jota suodatintyyppiä edellä kuvataan, läpi. Eriä A ja B varten suodatin sijaitsi pieni-huokosisen pinnan läpi tapahtuvan syötön yhteydessä. Hyviä tuloksia saatiin myös erälle C, joka ekstrudoitiin suodattuneita, joka oli käännetty ylösalaisin siten, että 10 syöttö tapahtui suurihuokosisen pinnan läpi. Liposomien keskimääräinen läpimitta ja liposomien partikkelikokojakaumat mitattiin ilmoitettujen suodatusten, jotka suoritettiin suodattimen läpi, jälkeen. Kokojakaumat mitattiin Nicomp™:n, malli 370, partikkelikoon laserluokittelijalla, joka on saatavissa Hiac/Royco Instrumentsilta, Menlo Park, CA. Tulokset, jotka mitattiin jokaisen ekstruusiosuodatuksen jälkeen, 15 esitetään seuraavassa taulukossa II: • » · »·· ♦ • * ·· · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · ··« • · · • · · * 12 103092

Taulukko II

Keskimääräinen läpimitta ja partikkelikokojakauma kunkin ekstruusiosuodatuksen jälkeen

Paine Ekstruusiono- Keskimäärä!- <0,1 pm 0,1-0,45 pm >0,45 pm MPa peus litroja/min nen läpimitta prosenttia prosenttia prosenttia (pm)

Erä A:

2,2 NT NT NT NT NT

0,2 0,188 2,6 94,4 3,0 0,2 0,168 6,7 92,6 0,8 0,2 0,132 7,6 92,3 0,0 0,2 0,123 3,6 96,4 0,0

Erä B: 3,4 0,02 0,180 19,1 78,6 2,2 vaihdettu suodatin 2.1 1,1 0,139 6,3 73,7 0,1 1,2 0,133 20,2 79,8 0,0 1.5 0,126 35,1 64,9 0,0 1.5 0,116 36,1 63,9 0,0

Erä C: (ylösalaisin käännetty suodatin) 2.1 0,7 0,665 1,0 48,3 50,6 0,7 0,162 23,2 76,2 0,6 0,7 0,143 26,5 73,3 0,1 0,3 0,149 22,5 77,5 0,0 2.2 0,5 0,144 23,6 76,3 0,0 . . i 5 NT - ei tutkittu • « !*♦*: Vertailuesimerkki « · • · · • · · • · ·

Vertailun vuoksi esimerkin I erässä C valmistettujen liposomien näyte ekstrudoitiin ...# 10 kaikkiaan kahdeksan suodatuskertaa, ensin viisi kertaa 90 mm:n läpimittaisten, huo- *... koskooltaan 200 nm:n Nucleopore -polykarbonaattisuodattimien läpi, kaksi kertaa 100 nm:n Nucleopore™-suodattimen läpi ja kerran 220 nm:n sterilointisuodattimen läpi. (Nucleopore™-suodattimet ovat kaupallisesti saatavissa Nucleopore Inc.iltä, Pleasanton, CA) toinen näyte ekstrudoitiin neljä kertaa 90 mm:n läpimittaisen, huo-15 koskooltaan 100 nm:n Anopore™-suodattimen läpi esillä olevan keksinnön mukaisesti. Kuten ensimmäinen näyte, tämä näyte suodatettiin 220 nm:n sterilointisuodattimen läpi. Kokoa koskevat mittaustulokset esitetään ensimmäisessä sarakkeessa i 13 103092 suodatusnumeron jälkeen. Kaikki ekstruusiot suoritettiin samassa paineessa (2,8 MPa). Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa III.

Taulukko III

5 Keskimääräinen läpimitta ja partikkelikokojakauma ekstruusion jälkeen

Suodatus Paine Ekstruusio- Keskimaa <0,1 μιη 0,1-0,45 pm >0,45 pm numero MPa nopeus räinen lä- prosentti prosentti prosentti litra/min pimitta (pm) Näyte 1: 200 nm Nucleopore 5 2,8 0,7 0,195 8,5 90,1 1,4 100 nm Nucleopore 6 2,8 0,3 0,168 13,5 86,3 0,3

7 2,8 0,2 NT NT NT NT

220 nm steriili 8 suodatin NT 0,152 4,0 96,1 0,0 Näyte 2: 100 nm Anopore 2 2,8 0,7 0,174 22,0 76,9 1,1 4 2,8 0,8 0,146 17,5 82,5 0,0 200 nm steriili 5 suodatin NT 0,150 12,0 88,0 0,0 NT - ei tutkittu

Samanlaisen partikkelikokojakauman saamiseksi esillä olevan keksinnön alumii- 10 nioksidisuodattimet, joissa on haaroitettu huokostyyppi, vaativat vähemmän suoda- ; tuskertoja suuremmalla suodatusnopeudella kuin polykarbonaattisuodattimet.

• · ·· · 5 ·* Esimerkki 3 • · · • · · • · · • 15 Suoritettiin lisätutkimus anodisesti käsitellyn alumiinioksidikalvon, joka on huokos-:T: tyypiltään haaroitettu, kokoa pienentävän kyvyn suhteen huokoskooltaan samanar- :*·*: voisen polykarbonaattisuodattimen kanssa. Kokeet suoritettiin käyttämällä munan fosfatidyylikoliinia ja kolesteroliliposomeja, jotka on valmistettu esimerkin 1 mukaisesti, liposomien kanssa, jotka olivat vesisuspensiossa konsentraationa 100 mg/ml. 20 Tätä esimerkkiä varten kolesteroli saatiin Croda Chemicalsilta, New York. Alkuperäinen kokojakauma, Malvem Sizerilla määritettynä antoi halkaisijan mediaaniksi 10,9 pm ja halkaisija-alueeksi 2,4-118 pm. Koon mikronia pienemmäksi pienentämisen helpottamiseksi erä käsiteltiin kahdesti 5 pm:n Mitex™ PTFE-suodattimella 14 103092 0,7 MPa:n paineessa. Tämän vaiheen jälkeen liposomien halkaisijan mediaaniksi mitattiin 3,5 pm, ja halkaisija-alue oli 1,9-11 pm.

Erä jaettiin kahteen osaan. Osa nro yksi ekstrudoitiin 0,1 mikrometrin Anopore -

Tlf 5 suodattimen läpi ja osa kaksi ekstrudoitiin 0,1 mikrometrin Nucleopore -polykar-bonaattisuodattimen läpi. Ekstruusion aloituspaine molemmille erille oli 2,1 MPa. Eksruusion virtausnopeus, partikkelikoko ja partikkelikokojakauma mitattiin kullekin suodattimien läpi suoritetulle suodatukselle. Kullekin erälle suoritettiin kaikkiaan viisi suodatusta. Tulokset esitetään taulukossa IV: 10

Taulukko IV

Keskimääräinen halkaisija ja partikkelikokojakauma eksruusion jälkeen

Suodatus Paine Ekstruusio- Keskimaa <0,1 pm 0,1-0,45 pm >0,45 pm numero MPa nopeus räinen present- prosenttia prosenttia 1/min läpimitta tia (pm)

Erä 1 (Anopore 100 nm:m suodatin): 1 2,19 0,6 0,565 0,0 38,6 61,4 2 2,19 0,7 0,212 10,5 85,8 3,7 3 2,19 0,8 0,186 10,5 88,7 0,8 4 2,19 0,8 0,172 3,6 96,4 0,0 5 2,19 0,8 0,165 10,7 89,3 0,0

Erä 2 (Nucleopore 100 nm:n suodatin): 1 2,1- 0,02 1,390 0,0 17,6 82,4 ·:··: 3,4* 2 4,8 0,2 0,215 11,2 84,9 4,0 3 4,8 0,2 0,178 6,5 93,2 0,3 4 4,8 0,2 0,167 7,4 92,6 0,0 5 4,8 0,3 0,158 19,1 80,9 0,0 . ·: ·. * -Paine nousi 2,1 :stä 3,4:ään MPa:han 65 %:n suodatuksen jälkeen • · · 15 Nämä tulokset havainnollistavat sen, että molemmat suodattimet pystyvät tuottamaan samat kokojakaumat suodatusten samoilla lukumäärillä. Kuitenkin ensimmäiselle erälle käytetty alumiinioksidisuodatin tarvitsi alhaisemman paineen ja toimi suuremmalla virtausnopeudella kuin toiselle erälle käytetty polykarbonaattisuodatin. 20 Kaikki suodatukset alumiinioksidisuodattimen läpi suoritettiin 2,1 MPa:ssa, virtaus- i 103092 15 nopeudella 0,6-0,8 litraa/min. Kun ekstruusio toistettiin käyttämällä polykarbonaat-tisuodatinta, alkupaine oli noustettava 2,1 Mpaista 3,4 MPa.han ensimmäisen suodatuksen juuri ja juuri loppuun suorittamiseksi erittäin alhaisella virtausnopeudella 0,02 litraa/min. Suodatuksia 2-5 varten tarvittiin korkeampi 4,8 MPa:n paine vir-5 tausnopeuden 0,2-0,3 litraa/min ylläpitämiseksi.

Esimerkki 4

Suoritettiin lisätesti liposomien ekstruusio-ominaisuuksien tutkimiseksi 100 nm:n 10 Anopore™-suodattimen, jonka huokoset olivat haaroitetut ja jota käytettiin liposomien koon pienentämiseen, suuntauksen suhteen. Kuten yllä esitettiin, 0,1 pm:n Anopore-suodattimella, jossa on haaroitetut huokoset, on pienihuokosellinen puoli, jossa on 100 nm:n suuruisia huokosia, ja suurihuokosellinen puoli, jossa huokosten koko on 200 nm. Tässä kokeessa suoritettiin vertailu saman liposomimateriaalin 15 suodatuserien vaikutusten määrittämiseksi materiaalin läpäistessä 100 nm:n Anopo-re-suodattimet niiden sijaitessa pienihuokosellinen puoli vastavirtaan tai suurihuokosellinen puoli vastavirtaan.

Koe suoritettiin käyttämällä munan fosfatidyylikoliinia ja kolesteroliliposomeja, jot-20 ka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti, liposomien kanssa, jotka olivat vesisuspensiossa konsentraationa 100 mg/ml. Materiaali valmistettiin yhtenä viiden litran suuruisena eränä, sekoitettiin hyvin ja jaettiin 750 ml:n suuruisiksi näytteiksi (A-D). Näytteet A ja B eksrudoitiin käyttämällä 100 nm:ä vastavirtasuuntauksessa, ja näyt-teeet C ja D estrudoitiin käyttämällä 200 nm:ä vastavirtasuuntauksessa. Liposomien 25 ekstruusio suoritettiin antamalla niiden kaksi kertaa läpäistä suodattimet, joissa oli ·:*·: haaroitetut huokoset, 2,8 MPa:n paineessa.

• · · • · · • · • ·

Kustakin koenäytteestä suodatettujen materiaalien partikkelijakaumat mitattiin käyttämällä Nicomp™-kokoluokittelijaa, kuten kuvataan esimerkissä 2, ja niiden 30 havaittiin olevan yleensä samanarvoisia. Kuitenkin aika, joka tarvittiin liposomien • · · koon pienentämiseksi, oli merkittävästi lyhyempi näytteille Aja B, 100 nm:n suo-*. datmpuolen sijaitessa vastavirtaan, vastakohtana näytteille C ja D, joita suodatetta- ':" essa 200 nm:n suodatinpuoli sijaitsi vastavirtaan. Taulukko V esittää keskimääräisen partikkelikoon halkaisijan nanometreinä (nm) ja suodatusajan minuutteina (min): 35 16 103092

Taulukko V

Keskimääräiset halkaisijat ja ekstruusionopeudet suodattimen suuntauksessa

Keskimääräinen halkaisija Suodatusaika (min) (nm) Näyte Alku Suodatus 1 Suodatus 2 Suodatus 1 Suodatus 2 A 199 152 138 0,95 0,85 B 199 151 131 0,52 0,53 C 199 157 139 4,93 1,03 D 199 169 153 3,08 0,97 5 Ekstrudoitu materiaali steriloitiin sitten suodattamalla se 220 nm:n sterilointisuodat-timen, joka oli samantyyppinen kuin käytettiin vertailuesimerkissä, läpi. Tässä kokeessa ja edellä vertailuesimerkissä käytetty sterilointisuodatin on kaupallisesti saatavissa, nimeltään Millipak™-suodatin 200, jota toimittaa Millipore Corp., Bedford, Mass, ja jolla on kuvattu olevan Durapore™:n polyvinylideenidifluoridi (PVDF)-, 10 mutkitteleva polku -membraani. Steriilisuodatuksen katsottiin olevan täydellisen, kun kaikki materiaali oli läpäissyt sterilointisuodattimen tai kun materiaalin jatkuva virta oli katkennut hitaaksi tippumiseksi. Keskimääräinen partikkelikoko (nm), suodattimen läpäisyyn tarvittava aika (min) ja materiaalin prosentuaalinen tilavuus, joka läpäisi sterilointisuodattimen, mitattiin kullekin näytteelle, ja tulokset esitetään seu-15 raavassa taulukossa VI:

Taulukko VI

*:*·: Ekstruusiosuodattimen suuntauksen vaikutus myöhempään sterilointisuodatukseen • · · • · · • « • · Näyte Keskimääräinen Suodatusaika Prosentuaalinen suo- läpimitta (nm) (min) dattimen läpäisy • « · • « · A 133 2,67 96% : B 126 0,68 100% C 131 1,95 47% D 151 1,27 44% Nämä tulokset havainnollistavat, että setrilointisuodatus oli erittäin tehokasta näytteille A ja B, joista lähes kaikki materiaali läpäisi hyvin sterilointisuodattimen. Sitä 20 17 103092 vastoin vain noin puolet näytteiden C ja D tilavuudesta oli mahdollista suodattaa sterilointisuodattimen läpi ennen kuin virtaus pysähtyi.

Esimerkki 5 5

Kuva 1 esittää suodatinsarjan 10, joka on valmistettu esillä olevan keksinnön erityisen sovellutusmuodon mukaisesti ja suunniteltu käytettäväksi läpimitaltaan 90 mm:n suodattimen kanssa, yksinkertaistettua kuvaa ylhäältä päin. On tajuttava, että tätä suodatinsarjaa voidaan käyttää myös yhtä hyvin muiden suodatintyyppien, kuten 10 esimerkiksi Nucleopore™-suodattimien, joita käytettiin yllä esimerkin III vertailu-kokeessa, sijoittamiseen. Kuva 2 on suodatinsarjan 10 kuvassa 1 viivalla 2-2 esitetyn poikkileikkauksen yksinkertaistettu sivukuva, joka ei ole mittakaavassa. Suoda-tinsarja 10 sisältää suodatinkotelon yläpuolikkaan 11 ja alapuolikkaan 12, joita suuri määrä kiinnitysruuveja 13 pitää yhdessä. Kuvaan 2 viitaten, suodatinyksikkö 14 ku-15 vaa 90 mm.n Anopore-suodatinta, joka on asetettu poistolevyn (Nucleoporen luettelo # 231700), leikattu 90 mm:n suuruiseksi, pinnalle, joka puolestaan on asetettu 90mm:n suuruisen, Teflon®:llä päällystetyn, suodattimen verkkomaisen kannattimen (Milliporen luettelo #YY30 090 54) pinnalle. Suodatinyksikkö 14 puolestaan on asetettu ruostumattomasta teräksestä valmistetulle suodattimen tukilaatalle 15, 20 joka on varustettu nesteen läpäisykeinoilla, kuten esimerkiksi poikittaiskanavilla 16. Tukilaatta 11 painuu suodatinkotelon alapuolen 12 tukiosaan 17, joka tukiosa on varustettu säteittäisillä kouruilla (ei esitetty piirroksessa) nesteen, joka läpäiseen suodattimen, kanavoimiseksi nesteen poistoputkeen 18. Suodatinkotelon yläpuoli 11 sisältää rengasosan 19, joka kannattaa suodatinyksikköä 14 paikallaan, kun yläpuoli 25 11 kiristetään ruuveilla 13 alas, alapuolikasta 12 vastaan.

• ·

Toiminnassa, suodatettava neste menee suodatinsarjan sisälle nesteen sisääntuloau- • · kosta 20, se virtaa suodatinyksikön 14 ja suodattimen tukilevyn 15 läpi, ja sitten se kanavoidaan ulos suodattimen poistoputken 18 kautta. Kotelon yläpuolikas varuste- ..... 30 taan mieluummin apupoistoputkella 21, jonka avulla apuventtiili (ei esitetty kuvas- • · · I.. sa) voidaan yhdistää koteloon.

• · · • · · •

Vaikka suodatinsarjaa 10 on kuvattu termein "yläpuolikas" ja "alapuolikas", näiden viittausten tarkoituksena on kuvata rakennetta eikä suodatinkotelon suuntausta toi-35 minnassa. Koska suodatettava neste toimitetaan sarjaan sellaisella, suhteellisen suurella paineella, uskotaan, että kokonaisuutta voidaan käyttää missä tahansa suuntauksessa.

18 103092

Kuva 3 esittää kaaviomaisesti ekstruusiojärjestelmää, joka on valmistettu esillä olevan keksinnön mukaisesti. Suodatettava liposomikoostumus on sisällytetty suurpai-nesyöttöastiaan 31, ja suodos kootaan samanlaiseen vastaanottoastiaan 32. Molemmat näistä astioista näyttävät olevan varustetut sekoittajilla liposomiseosten ylläpi-5 tämiseksi sekä lämpövaipalla lämpötilan säätämiseksi. Neste poistuu syöttöastiasta 31 pohjassa sijaitsevan poistoputken kautta ja siirretään yhden tai useamman suoda-tinsarjan 33, jonka tyyppiä kuvataan edellä ja joka sisältää 90 mm:n Anopore™-suodattimet, kautta. Suodatinsaijat 33 yhdistetään rinnakkain, siten että haluttu ko-konaisvirtaus syöttöastiasta 31 vastaaottoastiaan 32 määrää sellaisten käytettyjen 10 sarjojen lukumäärän. Vastaanottoastiasta 32 suodos pakotetaan sterilointisuodatti-men 35, kuten esimerkiksi Millipak™ 200:n, jota kuvataan edellä esimerkissä 4, läpi, ja sitten se kootaan varastoastiaan 36. Lisäksi voidaan antaa käyttöön kierrätys-linja 34, jotta tehdään mahdolliseksi vastaanottoastian tuotteen osan kierrättäminen syöttöastiaan 31.

15

Termejä ja ilmaisuja, joita esillä olevassa hakemuksessa on käytetty, käytetään kuvauksen termeinä eikä rajoittamaan keksintöä, eikä sellaisten termien tai ilmaisujen käytön tarkoituksena ole jättää esitettyjen ja kuvattujen luoteenomaisten piirteiden kanssa samanarvoisia ominaisuuksia tai niiden osia ulkopuolelle, ja on todettava, 20 että erilaiset muunnokset ovat mahdollisia patenttivaatimuksissa esitetyn keksinnön suoja-alan sisällä.

• · ·· · • · · * · • · ♦ · · • · · ♦ ·» 1 ♦ · · • · · ·· • t · • · ·

Claims (12)

19 103092

1. Menetelmä liposomipopulaation, josta oleellisesti puuttuvat liposomit, joilla on ennalta määrätty maksimikoko, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 A. annetaan käyttöön liposomisuspensio, jonka liposomeista osa on kooltaan suurempia kuin mainittu ennalta määrätty maksimikoko; ja B. suspension annetaan paineen alla läpäistä huokoinen alumiinioksidikalvo yhden tai useampia kertoja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä liposomipopulaation, jolla on en nalta määrätty maksimikoko, joka on vähemmän kuin noin 500 nm, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainitun, huokoisen alumiinioksidikalvon huokoskoko on noin 200 nm tai vähemmän.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suspension annetaan läpäistä kalvo paineen, joka on vähemmän kuin 4,2 MPa, alla.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu huokoinen kalvo on alumiinioksidianodikalvo, jonka huokoset ovat tyypiltään haa- 20 roittuneita.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liposomisus-pension annetaan läpäistä huokoinen kalvo yhden tai useampia kertoja, kunnes liposomipopulaation keskimääräinen partikkelikoko on noin 100-200 nm. 25

*:**: 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että huokoinen :***: alumiinioksidianodikalvo, jonka huokoset ovat tyypiltään haaroittuneita, sisältää: alumiinioksidilevyn, jolla on kaksi oleellisesti samansuuntaista pääpintaa, joissa on huokosia, jotka ulottuvat levyn yhdeltä pinnalta toiselle, sisältäen suurten huokos- . 30 ten, jotka ulottuvat yhdeltä pinnalta levyyn, muodostaman järjestelmän ja pienempi- • · · I... en huokosten, jotka ulottuvat toiselta pinnalta levyyn, järjestelmän, suurempien • · · *. huokosten muodostaman järjestelmän yhdistyessä pienempien huokosten muodos- ' tamaan järjestelmään siten, että yhden tai useamman pienemmän huokosen sisäpäät yhdistyvät suuremman huokosen sisäpäähän, eikä kalvossa ole oleellisesti mitään 35 aukottomia, suurempia huokosia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä liposomien, joilla on ennalta mä-rätty maksimikoko, joka on vähemmän kuin 500 nm, valmistamiseksi, tunnettu sii- 20 103092 tä, että mainitun huokoisen kalvon pienemmillä huokosilla on oleellisesti tasainen vähimmäiskoko, joka on 200 nm tai sitä vähemmän, mieluummin pienempien huokosten mainittu vähimmäiskoko on noin 100 nm tai vähemmän.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liposomisus- pension annetaan läpäistä huokoinen kalvo yhden tai useampia kertoja, kunnes lipo-somipopulaation keskimääräinen partikkelikoko on noin 100-200 nm.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liposomit 10 edelleen lajitellaan ennalta koon mukaan, ennen kuin liposomien suspension annetaan läpäistä mainittu huokoinen kalvo, mainitun koon ennaltalajittelun sisältäessä liposomien suspension läpäisyn yhden tai useampia kertoja suodattimen läpi, jonka huokosten koko on alueella noin 2-10 mikrometriä.

10. Laite patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, joka laite käsittää yhden tai useampia suodatinsarjoja; paineenalaiset syöttövälineet mainitun liposomisuspension syöttämistä varten paineen alla suodatinsarjaan; ja 20 vastaanottovälineet suodoksen vastaanottamista varten mainitusta suodatinsarjasta, tunnettu siitä, että laite lisäksi käsittää huokoisen alumiinioksidikalvon, joka pidetään toiminnallisessa konfiguraatiossa mainitun yhden tai useamman suodatinsarjan avulla.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen laite, tunnettu siitä, että se sisältää kaksi tai ·:**: useampia suodatinsarjoja, jotka järjestetään mainitussa laitteessa toiminnallisesti :*·*: rinnakkaista virtausta varten mainittujen syöttölaitteiden ja mainittujen vastaanotto- • · laitteiden väliin. • · · ..... 30

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen laite, tunnettu siitä, että se sisältää kierrä- ♦ · · ^ tysvälineet suodoksen kierrättämiseksi mainituista vastaanottovälineistä mainittuihin syöttövälineisiin. i 21 103092