JPH02504362A - 粒子のサイズによる分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 粒　のサイズによる 対゛米国　　の−一ター この出願は１９８７年７月２９日に出願された共係属米国比願第０７９，３０９ 号の一部継続出願である。

え匪生ｉ見 本発明は、接線流動ろ過を用いたサイズに従った。リポソームおよび脂質粒子の ような粒子の分離方法に関する。記載されているようにこのろ過方法は、これら の粒子を選択されたサイズ範囲に大量に分離することを可能にするものであり、 このサイズは使用されるフィルターの孔サイズによって決められる。中空繊維も しくはチューブ、あるいは平板なもしくはひだに折られた薄板もしくはフィルム のような、既知の接線流動ろ過装置および材料がいずれも用いることができる。

不発明において、「接線流動ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｆｉｌｔ ｒａｔｉｏｎ　）Ｊおよび「交叉流動ろ過（ｃｒｏｓｓ　ｆｌｏ＆ｆｉｌｔｒａ ｔｉｏｎ　）Ｊという語は相互に交換して用いられ、濃縮された固体を膜に対し 連続的に流しつづけることにより、膜表面に対して平行もしくは接して試料を通 過もしくは循環させ、水溶液もしくは有機溶液もしくは混合溶液から懸濁された 固体を分離するものとして定義される。このろ過器の孔サイズは、どの粒子がろ 液中に除去されるか、どれが供給残渣中に残されるかを決定する。例えば５．Ｏ ｕｍの孔サイズのフィルターを有す接線流動ろ過装置に試料供給貯蔵物を流すと 、５．０ｕｍより小さい粒子はろ液中に流出される。５゜０ｕｍより大の粒子は 残留物中に残る。

押出しやセラミックろ過装置を包含する従来のろ過方法（マーチンら、１９８８ 年６月２１日発行、米国特許第４，７５２，４２５号、およびマーチンら、１９ ８８年４月１２日発行、米国特許第４，７３７，３２３号）と異なり１本発明の 方法はろ送部表面上にろ過ケーキが形成されることを妨・げろ、またその液体は 膜表面を横切って流されるので、圧力によるより大きな粒子の行止りの（ｃｌｅ ａｄ　ｅｎｄ）押出が行われることはない。この液体の流動速度は従ってそれが 膜を通過する際のものと同じに保たれる。

本発明は接ｍ流動ろ過技術を使用したサイズによる粒子の分離に関し、特にリポ ソームおよび脂質粒子のような粒子のサイズ粒子の分離に関する。当技術分野に おけるいずれの方法で製造されたリポソームおよび脂質粒子も、本発明の技術に よって分離することができる。

リポソームは取り込まれた水性容量を有する完全に閉鎖された二分子膜層である 。リポソームはユニラメラ小胞体（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ ）　（単−膜二分子層を有す）もしくはマルチラメラ小胞体（多数の膜二分子層 によって特徴づけられる玉葱様構造をもち、各層は水性層によって次の層と分け られている）であることもできる、この二分子層は疎水性゛′尾尾部領領域親水 性゛頭部′″領域を有する２つの脂質モルイヤー（一分子層）から成っている。

膜二分子層の構造は、単分子膜の疎水性（無極性）の脂質モルイヤの”尾部”が 二分子層の中心に向かっており、一方親水性（極性）の”頭部”が水性層に向か うといったものとなっている。パンガム（Ｂａｎｇｈａ＋ｎ）等の、初期のリポ ソーム製造〔ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、）、１２，２３８−２５２゜１９６５）は有機溶媒中にリン脂質を懸濁させ、 次いでこの溶媒を蒸発乾燥させ、反応容器上にリン脂質の膜を残留させるもので ある。

続いて適当量の水性相を添加し、この混合物を７膨潤（ｓｗｅｌｌ）”させ、そ して得られたマルチラメラ（功ｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞体（ＭＬＶＳ） からなるリポソームを機械的手段で分散させる。この技術が、ババハジョポウロ ス（Ｐａｐａｈａｄｊｉｏｐｏｕｌｏｓ）らによって記載された〔バイオヒミカ エトバオオフィジカ　ラント　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）１３５，６２４−６３８．１９６８）音波処理さ れた小さなユニラメラおよび大きなユニラメラ小胞体の開発のための基礎を提供 している。

ユニラメラ少胞体は、ここに参照のために引用さ九ているクリス（Ｃｕ１ｌｉｓ ）ら、ＰＣＴ公開番号８７１００２３８．１９８６年１月１６日、名称゛′ユニ ラメラ小胞体製造のための押し圧し手法″に記載されている方法により押出機を 用いて作ることができる。この手法によって作られた小胞体は、ＬＵＶＥＴＳと 呼ばれ。

加圧下で膜フィルターを通して押し出される。小胞体は、２００ｎｍのフィルタ ーから押し出す技術によって作られてもよい、このような小胞体は、ＶＥ丁、。

、Ｓとして知られている。

使用することのできる他の種類のリポソームに、実質的に均一なラメラ溶質分布 を有することを特徴とするものがある。この種のリポソーム類は、レンダ（Ｌｅ ｎｋ）ら米国特許第４，５２２，８０３で定義されているように、安定複ラメラ 小胞（ＳＰＬＶ）、ファウンテイン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ）ら、米国特許第４．５ ８８，５７９号に記載されているような隼相性小胞体及び上記のような凍結融解 した多重ラメラ小胞（ＦＡＴＭＬＶ）、と呼ばれるものである。

ここで、凍結融解した多重ラメラ小胞体は少なくとも１回の凍結融解サイクルに さらされるものであり；この方法はバリー（Ｂａｌｌｙ）らのＰＣＴ公開８７／ ○００４３号、１９８７年１月１５日、名称“改善された取り込み効率を有する マルチラメラリポソーム”に記載されている。

／Ｊ％胞体を製造するために使用される他の技術としては、ババハジョポウロス （Ｐａｐａｈａｄｊｉｏｐｏｕｌｏｓ）らの１９８０年１１月２５日発行の米国 特許第４，２３５，８７１号の逆相蒸発／ｌＸ胞体（ＲＥＶｓ）をつくるものが ある、・ 各種ステロール及びそれらの水溶性誘導体を、リポソーム形成のために用いるこ とができる。特に、ジヤンプ（Ｊａｎｏｆｆ）ら、ＰＣＴ公開番号８５１０４５ ７８号、１９８５年１０月２４日公開、名称”ステロイド性リポソーム”参照、 メイヒュー（Ｍａｙｈｅｖ）ら、ｐ　ＣＴ　公Ｈ番号ＷＯ８５１００９６８−１ ９８５年３月１４日公開には、アルファートコフェロールある種のその誘導体を 含むリポソームで薬剤をカプセル化することによって、薬の毒性を低減させる方 法が記載されている。また、各種トコフェロール及びそれらの水溶性誘導体が、 リポソーム形成に用いられている。ジヤンプ（Ｊａｎｏｆｆ）ら、ＰＣＴ公開番 号８７１０２２１１１９８７年４月２３日公開、名称”アルファトコフニロール をベースにした／Ｉ為胞体”参照。

リポソーム−薬搬送系において、薬のような生物活性剤をリポソーム中に取り込 み或いはリポソームと会合させ、次いで治療すべき患者に投与する１例えば、ラ ーマン（Ｒａｈｍａｎ）ら、米国特許第３，９９３，７５４号；シアーズ（Ｓｅ ａｒｓ）　、米国特許第４．１４５，４１０号；ババハジ１ポラス（Ｐａｐｈａ ｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）ら、米国特許第４，２３５，８７１号；シニナイダー（ｓ ：ｈｎｅｉｄｅｒ）　、米国特許第４，１１４，１７９号；レンダ（Ｌｅｎｋ） ら、米国特許第４，５２２，８０３号；及びファウンテイン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ ）ら、米国特許第４，５８８，５７８号参照。

本発明においては、共有された共係属出願、ジヤンプらの米国特許出１１！第０ ２２，０２７号、１９８７年３月５日８５願；１０６９．９０８号、１９８７年 ７月６日出願；および第１６４，５８０号、１９８８年３月７日出願５発明の名 称“低毒佐薬−詣質系”、これらの関連ある部分は参考のためにここに引用され ているが。

これらに記載されている脂質粒子も又分離することができる。このような脂質粒 子は裏薬−脂質複合体（ＨＤＬＣｓ）としても知られているが、リポソーム製造 のための技術と実質的に同じ技術によってつくられ、遊離の形で投与された薬よ りも低い毒性を有するものである。このような複合体は１もしくはそれ以上の脂 質と共に比較的高いモル比で薬を含有するのである。更に、共係属の米国特許出 願第７４９，１６１号、１９８５年６月２６日、バリー（Ｂａｌｌｙ）ら、発明 の名称［リポソーム中への抗新生腫瘍剤の取り込み」　；および共係属出願第１ ６４，５５７号、１９８８年３月７日出願、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、発明の 名称［リポソーム性抗新生腫瘍化剤の裏薬−脂質製剤」、この両者はここに参考 のために引用しているが、これらの方法に従った膜透過性ｐＨ勾配（ｔｒａｎｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐＨｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いてつくられたリポソームが、 接線流動ろ過の技術によりサイズで分離することもできる。

更に特定すれば、上記のバリー（Ｂａｌｌｙ）らの発明にしたがって、リポソー ムにイオン化し得る生物活性剤を装薬し、ここではリポソームの二分子膜層（ｂ ｉｌａｙｅｒ）を貫通して膜透過性ＰＨ勾配が形成されているが、この剤はこの 勾配によって装薬される。このイオン勾配は、リポソーム膜を貫通して１もしく はそれ以上の荷電された種（例えばＨ＋イオン）に対し濃度勾配を作り出すこと によってつくられる。このような勾配は続いて１例えばドキソルビシン、ヴイン クリスチン、エビルビシン、もしくはダウノルビシンのような抗新生腫瘍剤とい ったイオン化し得る生物活性剤をリポソーム中に累積することを促進する。

より特定的に、濃度勾配を形成するためにリポソームは第１の水性媒体の存在下 で調製され、この媒体はリポソームに取り込まれるものであり、またリポソーム を囲むものでもある。これらのリポソームの外部媒体は続いて、肩囲媒体を交換 することなどによって、より酸性もしくは塩基性のＰＨに調整される。このよう な方法が膜透過性濃度勾配を形成する。第２の外部媒体がイオン化し得る抗腫瘍 剤のようなイオン化し得る生物活性剤を含有するならば、Ｈ◆勾配は装薬を、遊 離小胞体−緒合生物活性剤比が〔Ｈｅ）　！ｌｉ／　（Ｈヰ〕外比を反映するよ うな形で、リポソーム中に区画分割するであろう、上で挙げたメイヤー（Ｍａｙ ｅｒ）らに記載されているように、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エビルビ シン、およびビインクリスチンのような抗新生腫瘍剤はこの方法、これは「遠隔 装薬」法としても引用されるが、それにより高薬剤：脂質比でリポソーム中に堆 積されることができる。このようなリポソームが接線流動ろ過装置を貫通して通 されそのサイズに応じて分離される。

ここまで述べてきたようにリポソームもしくは脂質粒子を分離する方法に使用さ れるとき、接線流動ろ過は公知のいずれの方法によってつくられたリポソームも しくは脂質の粒子にも使用することができる。上で挙げた方法に加えて、剪断も しくは音波処理のような追加のもしくは択一的な方法によって、リポソームもし くは脂質粒子の両者を形成することができる０本発明の１つの態様では、それら はホモジナイズ化、コロイドミルもしくはサイズ減少化押出し工程装置を採用す るホモジナイズ技術によって形成される。これらの装置のいずれが採用される場 合にも、このホモジナイズ化装置を接線流動ろ過装置に直接に（連続して）連結 させることができる。さもなければ、このホモジナイズ化工程はろ過装置とは独 立して行うことができる。

物質の大ざっばな分離のための接線流動もしくは交叉流動ろ過の使用は知られて いる。マリナラチオ（Ｍａｒｉｎａｃｃｉｏ）ら（ｖＯ／　８５１０３０１１． １９８５年７月１８日公開）は血漿搬出法（プラズマフェレーゼ）のための血液 成分のような生物学的液体の分離に使用する方法を開示している。この方法にお いては、血液は有機高分子細孔ろ過膜に接して（すなわち貫通して）通過させら れ、微粒子物質は除去される。他の使用においては、接線流動ろ過はビールのろ 適用に開示されており〔シャックルトン（Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ）　、ヨーロッ パ特許第０．２０８，４５０号、１９８７年１月１４日公開）、これは特に酵母 細胞および他の懸濁固体のような微粒子物の除去のために使用されている。コー ス（Ｋｏｔｈｅ）ら（米国特許第４゜６４４．０５６号、１９８７年２月１７日 発行）は乳もしくは初乳からのイムノグロブリンの精製におけるこの方法の使用 を開示しており、そしてカスチーノ（米国特許第４，４２０，３９８号。

１９８３年１２月１３日発行）はインターフェロンのような抗ウイルス性物質の ウィルス粒子および細胞と同様に該物質を含有する汁からの分離にそれを使用す ることを記載している。

接線流動ろ過装置は培養媒体中に懸濁している細胞の濃縮に使用されている。用 いられる膜のサイズは工程および細胞分離の効率および速度に照らして選択され る。ラドレット（Ｒａｄｌｅｔｔ）　（１９７２、ジャーナル　オブ　アプライ ド　ケミ刀ル　バイオテクノロジー（Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、）、　２２：４９５：ｌは、遠心分離および通常のろ過のようなより普 通に用いられているｉａ胞全分離法代わるものとして接線流動ろ過を用いている 。

同様にこの技術は細胞破片から細菌２素の分離に用いられてきている〔クアーク （Ｑｕｉｒｋ）ら、　１９８４．エンザイム　マイクロバイアル　テクノロジー （Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、）＋６（５）：２０１）−こ の技術を用いてクアーク（Ｑｕｉｒｋ）らは酵素を遠心分離という従来法を用い た場合より高い収率でまたより少ない時間で単離することができた。薬学の分野 での、注射のための滅菌水のろ過、溶媒系の浄化、および汁および細菌培養液か らの酵素のろ過を含む、いくつかの応用に対する接１／ｉＡ′７Ｌ動ろ過の使用 がジニノヴエシ（Ｇｅｎｏｖｅｓｉ）により検討されている（１９８３．ジャー ナルオブペアレンテラルアシテクノロジー（Ｊ、Ｐａｒｅｎｎｔｅｒ、Ａｃｉ、 Ｔｅｃｈｎｏｌ、）３７（３）：８１〕。

集団における粒子サイズの制御は難しく、一般的には成功していない。サイズに 応じてリポソームもしくは脂質粒子の分離において接線流動ろ過を使用する本発 明は商業的に重要な方法である、選択されたサイズのフィルターの使用、そして 更に、異なったサイズの複数のフィルターの連続的使用もしくは連続的取り付け （すなわちろ過系）が、特に希望されるサイズ範囲の粒子を得るために粒子の分 離のために開示されている。

サイズに応じてリポソームを選択するこれまでの試みはいくつかの開運がある２ 例えば、ツーアン（Ｈｕａｎｇ）　（１９６９、バイオケミストリーＣＢｉ：＝ ？、ｅｍｉｓｔｏｒｙ）、　８：３４４）は超音波処理、遠心分離、○。

１ｕｒｎの袋／Ｊ、　ｌ＆の（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）フィルターを通しての集団の ろ過を包含し、最終的にこのろ過物をセファロース４Ｂカラム上分子篩クロマト グラフィーにかけて大きいリポソーノ、を除去するという、小さなユニラメラ／ Ｊ＼胞体（ＳＵＶｓ）を製造するための多段階技術を記載している。バレンホル ッ（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ）ら［１９７７、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｏｒｙ）、１６：２８０６）は超音波処理、遠心分離技術を用いて大きな リポソームを除去する技術を発展させて。

その後に続けて１−４時間高速遠心分離を行った。ワット（Ｗａｔｔ）ら０９７ ８．バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）−１フ：１９７２）は 超音波処理に続＜　１０５，０ＯＯＸ　ｇでの遠心分離によりシミリストイルホ スファチジルコリン（ＤＭＰＣ）の均一なＳＵＶ集団を製造した。

Ｓ　Ｕ　Ｖ　ｓの均一な集団を得ようとする努力に加えて、より大きなリポソー ム、却ちＭ　Ｌ　Ｖ　ｓの均一な集団を得るための非常に多くの試みがなされて きた。これらの努力の殆どが押出し工程において一連の膜フィルターを使用する ことを包含するものである。

このように押出し技術は、種々の孔サイズを有するフィルターを通してのＭ　Ｌ 　Ｖ　ｓの連続的押出しを包含する［０１ｓｏｎ　ら、１９７９゜バイオヒミカ バイオフィジカ　ラントアクタ（Ｂユ。ｃｈｉｍｃ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ 、）、５５７：９；およびシャレリー（Ｓｃｈｕｌｌｅｒｙ）ら、　１９７３． ケミカルアンド　フィジカルリビッズ（Ｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓ、Ｌｉｐｉｄｓ）、 １２ニア５）。

このような工程ではＭ　Ｌ　Ｖ　ｓと５ＵＶｓの混合集合体を形成する。

これらのリポソームはサイズに関して均質で単一形態の分布は有せず、実際に多 数の大きかったり小さかったりするリポソームが混在している。単一形態分布は 粒子サイズのガウスの分布のカイ二乗値が２．０より小さいか２．０であるよう なものである。更に加えてこれらの技術はリポソーム形成技術であり、異質のサ イズ集団から特定のサイズｇｉｌ囲のリポソームを選択するという本発明に対立 している。

マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら〔米国特許第４，７５２，４２５号、１９８８年６ 月２１日発行〕は溶媒および剤を含有する脂質の水溶液中への注入を採用した高 カプセル封入効率のリポソーム形成法を開示した。この方法は更に得られたり、 ｄソームをセラミックフィルターを通すという押出し法を包含している。この注 入工程の間、このｌ！！濁液は完全にろ過されて０．ｌｕｍおよびそれ以下のリ ポソームろ過物を形成する。

特定のより高いおよびより低いサイズ範囲を有するリポソームの均質集団を得る 技術には問題点が残っている。本発明は、異質のサイズ集団から均質の特定のサ イズ分布のリポソームの選択を可能にすることによってこの問題を解決している ８選択されたサイズのフィルターの使用が特定のサイズ粒子の分離のために開示 されている。粒子の均質な分布というのは、本質的にあるサイズより大きい粒子 はないし、またあるサイズより小さい粒子はない、公知のよく特定されたサイズ 分布を有する粒子の集団である１本発明で使用される言葉として、「本質的に」 という言葉は約１０％より多くない粒子、好ましくは５％より多くない粒子が、 接線流動フィルターサイズによって決められる特定のサイズより大きかったり小 さかったりするものと理解されるべきである。この分野において、このような分 布は例えば３，４，５．ユＯもしくは１００ミクロンの本質的に最大のものと、 本質的に最小の粒子サイズの間の相違が一般的には知られておらず、本発明にお いて決まった操作により得られるものである。ある場合には、得られたリポソー ムもしくは脂質粒子の均質分布は単一形態である。

粒子サイズの均一性が得られる度合いは試料の物理的および化学的特性およびろ 過条件によって影響を受ける、例えば試料もしくは！Ｉ！！濁溶液の粘度および 組成（電荷）、およびフィルターの孔サイズおよび構成（厚さ；フィルター上の 非対称性の皮の存在；電荷、それは試料のフィルターへの結合もしくは反発に影 響をあたえる；等）もまた、ろ過工程の効率および最終生成物の均質性を決定す る。

リポソームもしくは脂質粒子のサイズを揃える応用においては、このようなフィ ルターは均質化もしくは粉砕装置の下流に（連結して）付けることができ；この ような装置は試料をフィルターもしくはろ過系（２台のフィルター、より上およ びより下のサイズを切り捨てて粒子の特定化を可能にする）に取り出す。さもな ければ、この均質化装置は独立して使用することができ、そして得られた均質化 物質はろ過装置に手動でもしくは別個の工程で適用される。どちらの場合も得ら れたろ過物（もしくは残留物、必要とされる生成物に依るが）が最終生成物とし て回収される。その大きなサイズの故にそのフィルターを通過しなかった物質（ 残留物）は次いで捨てることができるし、さもなければ再サイズ調整のために均 質化もしくは粉砕装置へ、ついでろ過装置へと再循環され得る。各々を完全に循 環させるにことによりろ液の総数率は一般に増加する。

また一方、２もしくはそれ以上の接線流動ろ過ＨＭは均質化もしくは粉砕装置に 平行に結合することができるゎこのような場合、ろ過装置は異なったサイズのフ ィルターをいくつか有することができ、それによって同一の供給試料を異なった サイズの生成物へと分離ができる。この場合、試料がリポソーム、脂質粒子もし くはサイズ調整のための他の物質であるならば、残留物は均質化もしくは粉砕装 置へと循環して戻して更にサイズ調整を受けさせることができる。

より上とより下のサイズ限界を有する別々のサイズの粒子が必要とされる場合、 均質化もしくは粉砕装置は、連続して設けられている少なくとも２つのろ過装置 に連結することができる。この２台のろ過装置の１つは希望されるより上の粒子 サイズ限界のフィルタ一孔サイズを有し、２つ目のものはより下の粒子サイズ限 界のフィルタ一孔サイズを有するものである。試料が第１のフィルターを通過す るとき、該孔サイズの限界より下の粒子はる液中に通過して入ってくる。残留物 は続いて、更にサイズ調整を行うために均質化もしくは粉砕装置を通して再循環 して戻すことができる。ろ液は次いでより低い限界の孔サイズを有する次のフィ ルターを通じて循環される。このサイズより小さい粒子はる液中に通過し、この ろ液は捨てることができる。このようにしてその残留物はより上とより下の特定 されたサイズ限界の間の全ての粒子を含有することになる。

この技術は少量のバッチの試料供給の分離に有用であるけれども、このものはリ ポソームもしくは脂質粒子の大量のサイズ分離に特に有用であり、この様な分離 は大量の物質について脂質のろ過に通常付随する問題なしに容易に達成すること ができる。このような問題はリポソームもしくは脂質粒子が従来の「行き正まり の」ろ過工程に付されるときに生ずるものであり、いくらかのリポソームもしく は粒子はそれらのフィルターを通過させるのに必要な圧力によって変形させられ る可能性がある。これらの粒子が変形させられろ時、それらは実際の粒子サイズ よりも小さい孔サイズを通して通過することができ、そのフィルターの下流側部 上で再構成される。すなわち、このろ液は希望される範囲外のサイズの粒子で汚 染される恐れがある。生成物の分離の為の通常のろ過の使用における第２の問題 は、該フィルター表面上への生成物の堆積および膜孔の場合によっては起こり得 る目詰まりである。

フィルター表面に接している物質の一掃、これが本発明の技術であるが、この堆 積を阻止するのである。更に、本発明の記載中に示唆されている脂質への応用で は接線流動法で採用される圧力より低い圧力（５０ｐｓｉより低いものが典型的 である）はリポソームもしくは脂質粒子に物理的損傷（すなわち剪断）を起こし 難いものである１行き止まりのろ過に対する本発明の他の利点は試料の連続的循 環および残留物からの不純物を洗い流す能力である。

この試料はまた試料から懸濁溶液を除去することによって濃縮することができ、 それによって望ましい効力を有す生成物となる。

本発明の他の特徴においては、この接線流動ろ過装置はリポソームもしくは脂質 粒子を形成するために用いることが−できる。このような工程においては、脂質 のような両親媒性物質および水溶液中ｉｔｓ濁された生物活性剤は接線流動フィ ルターのＳ表面を横切って互いに接触させられることになる。ポンプによって与 えられる制御された圧力および膜表面で８会う剪断力は脂質および水性成分の相 互作用を起こさしめ、１つの層を他の層へ流入せしめるように制御できる。この ２相混合の制御は、２イルターの孔サイズおよびポンプ圧で決められる、望まれ る特定サイズ笥囲のリポソームの製造を可能にする。更に特定すれば、脂質懸濁 液を含有する溶液は接線流動フィルターの第１の側面に接触させられ。

一方、薬剤のような生物活性剤を含有する二とができる水性溶液はこのフィルタ ーの第２の側面の周囲の領域に流入もしくは注入される。ポンプを介してフィル ターの水性側に与えられる圧力は水性溶液をフィルターを横切って通過せしめ孔 を通って脂質含有側へと通過せしめる。このフィルターの脂質側でリポソームが 生成される。

特に、有機溶媒中に懸濁された脂質１．・例えば約１００−１０００　ｍ　ｇ　 ／　ｍ　１１での卵ホスファチジルコリンのエタノール溶液を。

例えば中空繊維接線流動フィルターの超毛細管空間中に通過させ；および例えば 緩衝液もしくはサツカライド溶液のような水性溶液をフィルターの内腔を通過さ せる。適用されたポンプ圧に応じて。

この水性溶液は接線流動フィルターの孔を通って通過し、起毛細管側上で脂質溶 液中にリポソームを形成する。このような系は連続的流動系であり、これは大容 量のリポソームの形成を可能にする。ｔＥた別の方法では、動的回転流動ろ過（ ｄｙｎａｍｉｃ　ｒｏｔａｒｙ　ｆｌｏｖｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　）がリポソー ム形成のための同様の技術において採用し得る。このようなろ過工程はペンチマ ーク　ロータリー　フィルトレージョン装置（Ｔｈｅ　Ｂｅｕｅｈｍａｒｋ　Ｒ ｏｔａｒｙ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｕｎｉｌ）　　（メンブレックスインコー ポレーション、ガーフィールド。

ニューシャーシー州〕、この方法においては、脂質！！１濁液はフィルターの内 腔を通って通過させられ、水性溶液は起毛細管空間を通って通過させられる。こ の平な円筒フィルターは回転軸に取り付けられ、回転されると渦を形成し、この 渦が該水溶液をフィルターを通じて内腔中に通過せしめる。フィルター表面と内 腔の間の相互表面において、該水溶液は内腔中を循環している脂質と共にリポソ ームを形成る。このリポソーム生成物は続いて内腔から除去される。

接線流動ろ過をまた採用する本発明のもう１つの特徴は、溶媒から、あるいは製 剤中の遊離の（取り込まれていない、もしくは会合していない）剤からリポソー ムもしくは脂質粒子の分離である。このようなリポソーム外もしくは脂質粒子爵 物質はその能力により１例えば膜孔を通過することによって除去され、一方リポ ソームもしくは粒子が残留物中に循環して残留している。望まれるリポソームも しくは粒子サイズよりも小さなフィルターサイズを使用することにより、フィル タ一孔からのこれらのより小さな溶媒もしくは遊離の剤分子の通過が生じ、−右 目的生成物を残存させる。上記の使用により、徹底的な回転蒸発あるいは溶媒除 去のための関連技術の必要性を最小限にするかあるいは排除することができる。

これは又、最終製剤から遊ｌ１ｍ薬剤のような遊離の微粒子物のクロマトグラフ による分離の必要を排除するものである。

これらの両方法は本発明のサイズ分離機能と共に同時に行われる。

一方または、リポソームもしくは粒子の集団はサイズ分ｍ！（ろ過）工程に先立 って溶媒−もしくは遊離の薬−除去工程にさらすことができる。しかしながら全 ての工程は希望される機能に特定の好適なフィルターサイズを選択することによ って、同一の装置で行うことができる。選ばれるフィルターサイズは除去される べき分子もしくは粒子のサイズに依っている。

接線流動ろ過装置のためのもう１つの使用が、マイクロカプセル、懸濁液、乳化 液および異なった細胞の混合物のような他のｉＪｓさな粒子系のサイズに応じた 分離およびクラス分けにおいて更に行われる。

本発明の更に追加される利点は１分離を無菌的に行うことができるというもので ある。規定されたサイズ分布のリポソームもしくは脂質粒子を無菌的に調整する ことは進行中の問題である。

至１し医果１− この発明は、液体間に懸濁された粒子の混合物からサイズに応じて粒子を分離す る方法に関し、この混合物を男１の孔サイズの第１のフィルターを有す接線流動 ろ過に付し、そして次いでこのろ液を第２のよりホさな孔サイズの第２のフィル ターを有す接線流動ろ過に付すことを包含する。この工程はリポソームもしくは 脂質粒子を含有する粒子で行うことができる。これらのリポソームもしくは脂質 粒子は更に、アンホテシリンＢのようなポリエン抗真菌剤のような生物活性剤を 含有することができる９この場合。

リポソームもしくは脂質粒子の脂質に対するアンホテリシンＢのモル比は約１モ ル％から約６０モル％、より好ましくは約１６ないし約５０モル％、最も好まし くは約３３モル％である。

接線流動ろ過工程は約１０および約０．２ｕｍの間、好ましくは約５ｕｍの第１ の孔サイズの第１のフィルターを使用し、このものは規定された限界を越える粒 子を排除し、そして分子量約２，０００で約２ミクロン、好ましくは約１．Ｏｕ 　ｍの第２の孔サイズの第２のフィルターを使用する、 粒子が脂質粒子である場合、それらは好ましくは、約７：３のモル比のシミリス トイルホスファチジルコリンおよびシミリストイルホスファチジル−グリセロー ルと約３３モル％のアンホテリシンＢを含有する。

また一方、この生物活性剤はゲンタマイシンのようなアミノグリコシドを含有す ることができ、そしてこの粒子は５ＰＬＶのようなリポソームであることができ る。これら５ＰＬＶｓはホスファチジルコリンを含有することができる。これら リポソームは約５ｕｍの第１の孔サイズおよび約１ｕｍの第２の孔サイズを通す る過によりサイズ選択されることができる。この粒子はコロイドミルのような均 質化に上り粉砕してそのサイズを減少させることができる。得られた粒子は均質 なサイズ分布を有すことができ、そしてマルチラメラもしくはユニラメラである ことカーできる。

不発明のもう１つの態様においては、この接線流動ろ過法は液体中に懸濁してい るリポソームもしくは脂質粒子を含有する混合物からリポソーム外もしくは脂質 粒子爵物質を除去するために使用することができる。このような場合、この超リ ポソーム性もしくは超脂質粒子物質はＤＭＳＯのような有機溶媒中に在る可能性 がある。また一方、この方法は取り込まれていない、或いは会合されていない生 物活性剤を除去するために使用することができる。

本発明の又別の態様においては、この接！！流動ろ過法はリポソームもしくは脂 質粒子を製造するために使用することができ、その際、脂質を含有する溶液は接 ＆！流動ろ過装置におけるフィルターの第１側部に接触させられ、一方、水溶液 はこの接線流動ろ過装置のフィルターの第２側部に流入もしくは注入される。こ の方法は、動的回転フィルターもしくは中空繊維フィルターを用いて行なうこと ができる。

日の　細な　Ｈ 粒子の分離、特にリポソームおよび脂質粒子の接ｗ＆流動ろ過技術を用いての分 離が記載されている。更に特定すれば、この分離はリポソームおよび脂質粒子の サイズによる分離という結果になる。このリポソームもしくは脂質粒子は、生物 活性剤、即ち生物学的活性を有する剤１例えば薬、ホルモン、蛋白質、染料、ビ タミンもしくは造影剤を取り込むか、あるいは会合することができる。

例えば、ここに参考のため引用さ九ている１９８８年３月７日に出願された係属 中の米国特許出願に記載されている裏薬：脂質複合体（ＨＤＬＣｓ）のような脂 質粒子、このものはアンホテリシンＢを含有しており、この粒子は約１ミクロン から約５ミクロン（ｕ　ｍ）のサイズ範囲にあるが、このものを得るために、初 めの約０．１から約５０ｕｍの材料の粒子サイズ範囲を有する不均質なサイズの 試料を約５．Ｏｕｍの孔サイズのフィルターを用いて接線的にろ過する。このろ 液は約５．Ｏｕｍよりも小さい粒子を含有しており、残留物は約５．０ｕｍより も大なる粒子を含有している。このろ液を次いで、約１．２ｕ　ｍの孔サイズの ようなより小さな孔サイズを使用してろ過する。この第２のフィルターの孔サイ ズは決して限定されないが、有効な範囲で小さいものであることができ。

例えば分子量約２，０００である。本発明では約１．２ｕ　ｍおよび約０．２ｕ ｍのフィルターが好ましい。約５．Ｏｕｍのフィルターに続いて約１．２ｕｍの フィルターが用いられるとき、ろ液は微粒子（ｆｉｎｅ）のような約１．２ｕ　 ｍより小さな全粒子を含有し、そして残留物は必要とされる約１．２から約５． Ｏｕｍのサイズ範囲の最終生成物である。もしより大きなサイズが必要あるいは 受容し得るならば、例えば約１０ｕｍのフィルターを、より上のサイズの限界値 を得るために使用することができる。

本発明の接線流動ろ過装置で使用されるフィルターは広い範囲の有機高分子フィ ルターから選ぶことができる。このようなフィルターとしては、ナイロン、ポリ ビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、セルロースアセテート／ナイトレート、 ポリスルホン、ポリプロピレンおよびポリアミドの細孔膜が挙げられるが、これ らに限定されることはない、セラミックフィルターおよび金属フィルターのよう な他のフィルターを使用することもできる。

荷電された表面を有する膜、例えばカルボキシルもしくはスルホンアニオン性機 能置換基を有するもの、もしくはナイロン荷電膜もまた使用できる。このような 荷電された膜は製剤が荷電された脂質を含有するとき効率よく用いることができ る。非対称構造を有する膜、例えば逆浸透、透析および超ろ過工程で用いら九る ようなものもまた使用できる。上で述べた構成の内、好ましい膜は、膜を横切っ て対称構造を有する細孔タイプのものである。このような膜を含有する好適なフ ィルター組立部品としては、例えば中空管もしくは中空繊維を有するカートリッ ジ、または板状フレーム上に設けられた巻きフラットもしくは折りたたまれたシ ートのようなものがあるが、これらに限定されることはない、１！どう細胞装置 もまた接ｖｋ流動ろ過装置として使用することができる（アミンコーポレーショ ン、デンバース、マサチューセッツ市販されている）。このような系においては 、振動する椙が膜表面に対し接線的な動きの中で供給試料を循環させる。

ここに記載されているように適用のために、最も適している膜は溶媒に対し抵抗 性があり、そして、衛生的にするもしくは滅菌化に服し易いものである：後者の 場合、圧力消毒、蒸気噴射（ｓｔｅａｍ　ｆｌｕｓｈｉｎｇ）、潅注もしくはエ チレンオキシド露出などによっている。それらは、試料から水性溶媒もしくは有 機溶媒の除去をさせるために十分に親水性もしくは疎水性であるべきである。上 で名を挙げられたフィルムは、それらが行うべき特定の機能（いくつかを挙げれ ば、溶媒除去、遊離の薬の除去および／またはサイズによる分離等）に応じて選 択されるであろう。例えばポリプロピレンおよびセラミック膜は有機溶媒に十分 耐性であり、一方、ポリスルホンやセルロースアセテート／ナイトレート膜＋ニ ーａに耐性ではない、上で述べた膜はいずれも水性溶媒の除去あるいはリポソー ムもしくは脂質粒子のサイズ分離のために使用することができる。このような膜 の使用は目的とする生成物の直径および適当な孔サイズの利用によってのみ限定 される。

ポリプロピレンおよびナイロン（疎水性）膜が使用されるとき、この膜が使用前 にエタノールのような水混合可能有機溶媒でぬらされているときに最もよい効果 が得られる。このぬらす工程は膜を通してこの溶媒を再循環することにより数分 間で行われる。この溶媒は次いで脱イオン水もしくは０．９％生理食塩水のよう な水性溶液で膜を洗い流すことにより除去される。

このろ過はいずれの温度でも行うことができ、使用される脂質もしくは薬の温度 制限により決定されるべきである１例えば、この方法は約４℃から約２５℃の寒 い中で行うことができる。試料はポンプにより提供される力によってろ過装置を １ｉ環させられる。

使用できるポンプは次のようなタイプを包含する：積極的置換回転ローブ（ｐｏ ｓｉｔｉｖｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｒｏｔａｒｙ　１ｏｂｅ）、ギア、 遠心分離型、振動板式（ｄｉａｐｈｒａｍ）もしくは嬬動性タイプである１本発 明においては回転ローブポンプが好ましい、操作圧力（導入圧、このものがろ過 速度に影響を与える）は、容積、粘度、試料の組成、また使用される膜の構成お よび表面積のような多数の変数に依存している。この操作圧はフィルターを横切 って圧力が差別されるのでフィルターの各側部で一般的に低い。一般的に１分Ｈ 率を上げるために流量割合を増加する。試料の粘度が増加するに従って、もしく は試料粒子のサイズが級別するフィルタ一孔のサイズに近づくにしたがって、適 用される圧力は少なくすることができる；圧力関数はまた使用されるフィルター 材および試料組成にも依存している。結局、フィルターが荷電されて−る場合、 通過する試料の電荷（同じ電荷、もしくは反対の電荷）が、フィルターを通って 流れる速度を決めることができ（各々、より遅く、もしくはより速く）、その結 果、適用されるポンプ圧を決める。フィルターの形態（中空繊維もしくは管、あ るいは平らなシート）が圧力設定に対する更に追加される変数である。同様に試 料の置換基による膜細孔の吸着および／または閉塞（ｏｃｃｕｌｓｉｏｎ）のよ うな更なる考慮がろ過の最大の効率のよい速度を規定し得るのである。例えば、 このような閉塞が、ある試料容量の操作を行なったのちフィルターの交換を必要 とし得る。圧力関数は低圧ろ過の業界で働いている当業者によって決定される。

一般的に１本発明で用いられる場合、中空縁輯フィルムフィルター（ポリプロピ レン、ポリスルホンなど）の最大ｐｓｉは約５０ｐｓｉであり、セラミック中空 繊維フィルムフィルターは約１５０ｐｓｉ、一方平らなシート膜は同様の圧力に 耐えることができる。好適な圧力の選択は、脂質生成物および接線流動ろ過の業 界の当業者が決定するのが最もよい。圧力が高すぎると、リポソームもしくは粒 子の押出し、ケーキ生成または剪断力によるリポソームの破壊を起こすことにな る恐れがある。

試料は何回も再′４環されるのが好ましく、循環の回数は試料の容量、粘度およ び電荷によって決められる。例えば試料の容量および／または粘度が増大するに つれて再循環の時間も増大する。

脂質濃度もまたフィルターを通しての再循環の時間およびろ過速度を決定するの である９例えば高度に粘性の製剤においては、よ、り小さな粒子がフィルター表 面に届くことができず、ろ液中に排出される。このような場合、供給貯蔵物の希 釈および／又は再循環速度の低減が必要とされ得る。更に試料の再循環の時間も 増加されるかもしれない。

操作期間は、必要とされるサイズの粒子の収率が最高になるとき、そして試料が 通則反応を起こさないとき、そして多くの微細物を含有するときが１選ばれるで あろう、操作をする人は１反応操作中に試料の一定量を取ってそのサイズを試験 することができ。

その試験は例えば視覚マイクロメーターを有する光学顕微鏡で、あるいは連弾性 光散乱法（ＱＥＬＳ）もしくはマルヴエーンの粒子サイズ測定技術を用いてその サイズを試験し、集団の一般的サイズを測定し次いでろ過を続けるか中止するか を決めることができる。

流出物（ろ液）がフィルターから回収されるとき、水性もしくは有機溶液（例え ば滅菌緩衝液もしくは０．９％生理食塩水）が。

全容量を一定に保つためにろ液が除去されるのと同じ速度で残留物に添加するこ とができる。この透析ろ過工程が得られる粒子収率を高める。原則的に、フィル ターを通じて自由に通過し得る（即ち、ゼロ拒絶係数）種（例えばリポソームや 脂質粒子のような粒子）の約９０％を除去するために残留物の約２．３倍容量の 緩衝液で洗浄して残留物の容量を維持することができる。目的とする種の約９９ ％を除去するために、フィルターを通す洗浄液の容量は残留物容量の２Ｘ２．３ 倍である。特に述べれば、１．０ｍΩの洗浄液が該系から除去される１、０ｍｕ のる液に代わるのである。この透析ろ過操作により得られる希釈ろ液は接線流動 ろ過を用いて後から濃縮することができる。また一方、一連の希釈および濃縮が 目的種のる液への通過を増大させるために用いることができる。さもなければ、 全試料が、水性溶液の追加を要求しないフィルターを通して再循環されるわこれ まで述べてきたように、２もしくはそれ以上の接線流動ろ過装置は一連のものと して連結させることができ、例えばこの複数のろ過装置の間に、１台のポンプを 置いて第２のろ過のために十分な流量を供給し、より上およびより下のサイズ限 界を有する特定サイズに分離された生成物を得る。一方、択一的にあるｔｌは付 加的に均質化装置をろ過装置に連結させることができ、均質化された試料がこの 装置から直接ろ通糸に通される。ポンプは均質化装置（ホモジナイザー）とフィ ルターの間に接続してフィルター中への供給流動速度を保持することができる。

ろ過生成物は該フィルターから貯蔵タンクへと通すことができ、一方十分均質化 されていない残留物はホモジナイザーへポンプで戻され、フィルター中でさらに 処理を受ける前に更なるサイズ調整を受けることができる。

本発明のリポソームもしくは脂質複合体は各々の薬のようないずれの生物活性剤 をも取り込みもしくは複合化することができる。

リポソームの場合、薬はリポソームに取り込まれるか会合し、その例としてはネ オマイシンＢ、バロモマイシン、リボスタマイシン、リヴイドマイシン、カナマ イシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ネ オマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンおよびシソマイ シンのようなアミノグリコンド類がある０本発明のリポソームに取り込まれるか 会合され得る他の生物活性剤としては抗新生腫瘍剤がある。抗新生腫瘍剤として は１例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、もしくはエビルビシンのようなア ントラサイクリン、ヴインブラスチンもしくはヴインクリスチンのようなヴイン カアルカロイド、５−フルオロウラシルのようなプリンもしくはピリミジン誘導 体、ミトキサンスロン、メクロルエタアミン塩諺塩もしくはシクロフォスフアミ ドのようなアルキル化剤、マイトマイシンもしくはプレオマイシンのような抗新 往腫瘍抗生物質がある８本発明の方法によってろ過することのできる脂質粒子を 形成する脂質と複合化される他の生物活性剤としては、ナイスタチン、ピマリシ ン、カンジシジン、フィリピンおよび好ましくはアンホテリシンＢのようなポリ エン抗真菌剤がある。

上記したように１本発明のリポソームもしくは脂質粒子はその形成のための技術 分野で知られているいずれの技術によってもつくることができる。本発明の一態 様においては、均質化装置がリポソームもしくは粒子の処理に用いられる。この ような均質化装置としてはガラリンタイプもしくはマイクロフルイダイザ−（マ イクロフルイディクス　インコーボレーシ＝ン）タイプホモジナイザー、コロイ ドミルもしくは同様の粉砕装置、またはリポソームもしくは脂質粒子を押出し装 置を通してつくるサイズ低減装置〔クリスら、ＰＣＴ公開８７１０　Ｏ２３８， １９８６年１月１６日、名称：ユニラメラ小胞体を製造するための押出し技術〕 などがあるが、これらに限定されることはない。

本発明の均質化の点においては、ホモジナイザーもしくはコロイドミルが、約１ ０ないし約１５ｐｓｉの支持圧力（ｂａｃｋ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）で約１ないし ４リットル／分でミルへと運ぶポンプのセットに連結され、供給試料は粉砕され 、生成物はタンク中に回収される６リポソームもし、くは粒子の目積とするサイ ズが、このミルを通すことによって得ることのできるものより小さい場合はこの 原料を２（ないし数）回このコロイドミルを通して再処理することができる。ろ 過技術の場合と同様に、最終点に到達したかどうかの決定は光学顕微鏡、ＱＥＬ Ｓ、マルヴニルンもしくは同様の技術で粉砕された試料の一定量を検査すること によって行うことができる。理想的には、この粉砕工程の最終点には殆どの粒子 もしくはリポソームが最終生成物のサイズ節目に入ったとき到達する。

この粉砕生成物のサイズによる分離は次いで接線流動フィルターを使用して処理 し、目的とする特定のサイズを選ぶことができる。

上記のようにアンホテリシンＢを含有する脂質粒子ＩＳリットルの処理に当って ミルを通しての１８サイクルがろ過工程の前に必要とされる。この数値は上記条 件によって変わることが期待できる。用いられる脂質濃度は必要とされる処理サ イクル数を更に決定するということになる。高度に粘性の試料は効率的にろ過さ れることは期待されないというように、薬の量およびタイプも又、必要とされる 粉砕時間を決定するであろう。

ろ過処理が溶媒を除去するために使用できる場合には、最終点の達成（例えば約 ９９％の溶媒が除去される）はガスクロマトグラフィーの標準技術によって決定 される。製剤から遊離の薬剤が除去されることが希望される場合には、約９９％ より少ない遊離の薬が残っているＪ１点（上記のように透析ろ過が用いられたと き）に到達したという決定は例えば比色分析によって行われる。

本発明のもう１つの態様においては、リポソームもしくは脂質粒子が接線流動ろ 過処理を用いて形成される。この処理では１例えばアンホテリシンＢのような薬 剤が例えばＤＭＳＯのような溶媒に懸濁されて、貯蔵器から中空繊維フィルター の起毛管空間へと提供される。メチレンクロライドのような溶媒中の脂質が、チ ューブを経由して中空ａｍフィルターの内腔へと供給される。ＤＭＳＯ中のアン ホテリシンＢは、ろ液側に維持されているより高い圧力に応じてフィルターの孔 を通して内腔中へと入り、そこで脂質と複合化し粒子を形成する。この溶媒はこ の同じ処理の間に生理食塩水溶液、緩衝水溶液、水もしくはエタノールのような 好適なＩＩｉ換溶媒を用いる透析ろ過により除去される。脂質および生物活性剤 の濃度は、もしそれが含まれているならば、他の方法によりリポソームもしくは 脂質粒子を製造する際に採用されるようなものであることができる。

接線流動ろ過処理を用いるリポソーム形成の他の実施例においては、規定された サイズのリポソームはイオン化し得る生物活性剤で、遠隔的に（ｒｅｍｅｏｔｅ ）装薬されている。このリポソーム形成方法においては水溶液、例えば比較的に 酸性もしくは塩基性ＰＨのマルトース水溶液を、中空繊維ろ過装置１例えばＯ， ｌｕｍのポリポロピレンの内腔中に約２．０ｐｓｉの圧力で循環させる。

脂質例えば卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）は同様にチューブを通じてフィル ターの起毛管空間に供給される。このマルトース溶液は内腔側に維持されたより 高い圧力に応じて孔を通じて起毛管空間へ排出され、そこで脂質と接触しリポソ ームを形成する。

形成されたおよびサイズ選択されたリポソームの溶液は続いて比較的に塩基性も しくは酸性ｐＨに調整され、そしてイオン化し得る生物活性剤がこのリポソーム と混合される。

上記の方法にしたがってイオン化し得る生物活性剤を遠隔的に装薬されたリポソ ーム、そして特にドキソルビシンのようなイオン化し得る抗新生腫瘍剤をこれら の方法で装薬したリポソームのサイズ選択において、その操作は次のようにして 行われる。酸性緩衝液、特に約３００ｍＭクエン艷、約ｐＨ４，０中の卵ホスフ ァチジルコリンおよびコレステロール（３：１重量比）を用いてリポソームを形 成する。得られたリポソームは例えばガラリンもしくはマイクロフルイタイザー ホモジナイザーのような均質化、もしくは押出しのような該技術分野で知られて いるいずれかの方法を用いてサイズを減少させることができる、これらのリポソ ームは接ｍ流動ろ過払によりＰＨ約４．○の緩衝液中でろ過し、まず第一に例え ば約０．２ｕｍの孔サイズを有するフィルターを通し１次いでろ液を例えば約０ ．１ｕｍの孔サイズを有する第二の接ＩＩＡ流動フィルターを通過させる。この 残留物は約０．１−０゜２ｕｍの間のサイズのリポソームを有する最終生成物で ある。このリポソームを次いで約０．２０ｕｍの孔サイズの滅菌フィルターを通 す。炭酸ナトリウムのような適当な緩衝液を用いてＰＨを約７．５に調整した後 、ドキソルビシンが添加され、そしてこのものは膜透過ｐＨ勾配の結果リポソー ム中に堆積される。一方また、この残留物は凍結乾燥して使用するまで貯蔵する ことができる。使用に当って、この凍結乾燥物は比較的に塩基性ＰＨ１例えば約 ｐＨ７，５の緩衝液を用いて再構築することができる。更に加えて、この残留物 （約０．２０ｕｍ接ｍｆｔ動ろ過から）はガラリンホモジナイザーのようなこの 目的のために知られているいずれかの装置を用いて均質化することができる。こ の場合、試料が第一の接線流動フィルターを通過した後、目的とする生成物の上 限のサイズ限界より上の残留物は更に処理を行うためにホモジナイザー中に戻し て再循環することができる。

本発明のリポソームもしくは脂質粒子のために、いずれの好適な脂質も用いるこ とができる。ここで用いられる脂質という語は。

脂質物質の疎水性部分が二分子膜層（ｂＮａｙｅｒ）の方向へ向き、−方親木性 部分が水性相へ向かうような二分子膜層になるいずれの好適な物質をも意味する ものである。脂質としてはトリグリセライドのような高度に疎水性成分、コレス テロールのようなステロール類および両親媒性脂質が挙げられる０本発明のリポ ソーム形成に用いることのできる脂質としては、例えばホスファチジルコリン（ ｐｃ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（Ｐ Ｓ）、ホスファチジルジグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジンｍ（ＰＡ）、ホ スファチジルイノシトール（Ｐｌ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）および同様 のもののようなリン脂質を単独で、もしくは組合せたものが用いられる。このリ ン脂質は合成のものでもよいし、また卵もしくは大豆のような天然品から得られ たものであることもできる。シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ） およびシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）のような合成リ ン脂質もまた用いることができる。

好ましい実施態様においては、リン脂質卯ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）が用 いられる。このリポソームはまた。コレステロール（Ｐ　Ｅ　Ｇ−コレステロー ル類）、コブ口スタノール、コレスタノールもしくはコレスタンのポリエングリ コール誘導体、およびＥＰＣとコレステロールの組合せのような他のステロイド 成分を含有することもできる。これらはまたコレステロールヘミサクシネート（ ＣＨ３）等のステロールの有機酸誘導体も含有することができる。トコフェロー ルの有機酸誘導体１例えばアルファトコフニロールへミクサンネーｈ（ＴＨ５） が、リポソーム形成成分として用いることができる。ＣＨ３−およびτＨ５−含 有の両リポソームおよびそれらのトリ塩形態は一般に、これらのステロール類を 含有するリポソーム形成のための技術分野で知られているいずれの方法によって も製造することができる、特に、ジャノフら、ＰＣＴ　’ｔ２Ｈ１１４８５１０ ４Ｂ７８号、　１９８Ｓ年】０月２４８　出Ｉ１ｍ　−発明０）名８　ｒ　ステ ロイド性リポソーム」　；およびジャノフら、ＰＣＴ公開第８７１０２２１９号 、１９８７年４月２３日、発明の名称「アルファートコフェロールを基体とする 小胞体」を参照されたい、このリポソームはまたグリコリピドを含有することも できる。

リポソームもしくは脂質粒子の製造の間、有機溶媒が脂質を溶解するために使用 することができる。好適な有機溶媒としては種々の極性および誘電特性を有する ものが挙げられ、このものが脂質を溶解するのであり１例えばクロロホルム、メ タノール、エタノールおよびメチレンクロライドが挙げられるが、これらに限定 されるものではない、その結果、Ｎ質を含有する溶液（脂質および他の成分が均 一に全体に分布した混合物）が形成される。′ａ媒は生物活性剤（薬剤）を溶解 するために使用でき、そして必要な場合にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） を包含した上で名を挙げた溶媒のいずれもが使用できる。溶媒は一般に、生物適 合性、低毒性および溶解能力を基にして選択される。

本発明のリポソームもしくは脂質粒子は、薬のような生物活性剤を取り込むか、 もしくは会合することができる。この薬剤はサイズによる選択の態様もしくは接 線流動ろ過処理のリポソームの形成態様の両者において使用することができる。

これらの使用のための好適な生物活性剤としてはナイスタチン、ピマリシン、カ ンジシジン、フィリピンおよび好ましくはアンホテリシンＢのようなポリエン抗 真菌剤が挙げられるが、これらに限定されることはない、使用することのできる 他の生物活性剤としては、上述のようにアミノグリコシド、例えばゲンタマイシ ンのような抗菌性化合物、リフ７ンパシンもしくはアジドチミジン（ＡＺＴ）の ような抗ウィルス化合物；アカチモン誘導体のような抗寄生虫化合物、ヴインブ ラスチン、ヴインクリステン、マイトマイシンＣ。

ドキンルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセートおよびとりわけシスプラチ ンのような抗新生腫瘍化合物；アルブミンのような蛋白質、ジフテリア毒素のよ うな毒素、カタラーゼのような酵素、エストロゲンのようなホルモン、アセチル コリンのような神経伝達物質、アルファーリボプロティンのようなリポプロティ ン。

ヒアルロン酸のようなグリコプロティン、ＩｇＧのような免疫グロブリン、イン ターフェロンもしくはインターロイキンのような免疫調節剤、アルゼナゾｍのよ うな染料、”Ｃのような放射能標識剤、”Ｔｅのような放射線不透化合物、カル ボキシフルオロセインのような螢光物質、グリコーゲンのようなポリサン力ロイ ド。

エストロゲン受容体蛍白質のような細胞受容体結合分子、インドメタシン、サリ チル酸アセテート、イブプロフェン、サリンダック、ピロキシカム、およびナプ ロキセンのような非ステロイド性抗炎症剤；デキサメサゾンのような抗炎症剤； チモロールもしくはピロカルビンのような抗緑内障剤、ジブカインのような麻酔 剤、チミンのような核酸、ＲＮＡポリマーのようなポリヌクレオチド、アルファ 遮断剤、ベータ遮断剤、カルシウム経路遮断剤、ＡＣＥ阻害剤等のような心臓血 管剤およびＣＮ　Ｓ剤のようなものが例として挙げられるが、これらに限定され ることはない。

リポソームもしくは脂質粒子水和工程において、蒸留水（例えば注射用ｔＪｓＰ 水）、生理食塩水（０，９％）のような水性溶液もしくは水性緩衝液を用いるこ とができる。使用できる水性緩衝液としてはＰＨ約７．０から７．５、好ましく は７．２のリン散塩１ａＷＩ生理食塩水ｒＰＢＳＪ、）−リス−（ヒドロキシメ チル）−アミノメタン塩酸塩「トリスｊ緩衝液もしくはグリシン緩衝液が挙げら れるが、これらに限定されることはない。

本発明のリポソームは脱水（あるいは凍結乾り　Ｌ、て、使用時まで長い期間貯 庵可能とすることができる。標準的な凍結乾燥装置もしくは同様の装置がリポソ ームを凍結乾燥するために用いられ得、る、リポソームは単にそれらを減圧下に 置き、この懸濁溶液を蒸発させるだけで脱水することができる。さもなければ、 リポソームおよびそれを取り囲む媒体を脱水の前に液体窒素中で凍結させること もできる。このような脱水はジャノフら、ＰＣＴ８６１０１１０３．１９８６年 ２月２７日公開、参考のためにここに引用されている方法にしたがい、保護糖の ような１もしくはそれ以上の保護剤の存在下で行うことができる０本発明におい ては。

脱水は接線流動ろ過（サイズ分離）工程の前もしくは後のいずれかで行うことが できる。

本発明の製剤は、（１）繰返しの投与；　（２）抑制された搬送；もしくは（３ ）問題となっている遊離の薬剤と実質的に同一もしくはそれより大の効力を有し た上で毒性が低減されていることを必要とする病気もしくは状態の多くの治療に おいて、動物（人間を含めて）に対して治療的に用いることができる。このよう な状態としては、真菌感染症、ナイスタチンおよびアンホテリシンＢのような抗 真菌剤で処理できるような局所的および全身的症状および抗性物質化学治療剤に 反応する１ｆｉＢＮ感染症が挙げられるが、これらに限定されることはない。

製剤の投与形態が、この化合物が搬送される生物↓二おける部位および細胞を法 定することができる９本発明のリポソームおよび脂質粒子は単独で投与すること ができるが、−機には投与の意図した経路および標準的な薬剤的慣習にしたがっ て選ばれた薬剤担体と混合して投与されるであろう。例えば、特定の部位への搬 送は局部的な適用により最も容易に達成することができる（感染症が外部のもの である場合、例えば目、皮膚、耳における領域または傷もしくはやけどのような 痛い部分（ａｆｆｉｉｃｔｉｏｎ　））　、このような局部的適用はクリーム、 軟こう、ゲル、乳化剤もしくはペーストの形で、傷められた領域に直接適用され る。また一方、これらの製剤は非経口的に、例えば静脈内に、筋肉内にもしくは 皮下に注射することができる。非経口投与に対しては、それらは例えば滅菌水性 溶液の形態で使用することができ、このものは他の溶質１例えば溶液を等張性と するのに充分な塩もしくはグルコースを含有することができる。他の使用は製剤 の特別の特性に依存しているが、当業者によって想像され得る。

真菌性もしくは細菌性病気の治療もしくは予防処理における人間への投与につい ては、投与される人間に対して適当な投与量を処方医が最終的に決めるであろう 、そしてこれは年齢、体重、病人の病気の性質および重さと同様、個人の反応に より、変わることが予測される。リポソームもしくは脂質粒子の形態における薬 の投与量は一般的に、大体遊離の薬に対して採用されるものであろう、しかしな がら、ある場合にはこれらの限度の範囲外の投与量を投与することが必要となる かもしれない。

次の実施例は説明のためにのみ与えられるものであり２本発明の範囲を限定する ためのものではない。

鼠聚 アンホテリシンＢ粒子（ＨＤＬＣｓ）は以下の方法によって形成された：アンホ テリシンＢ　（７８，０３ｍｇ）を５リツトルの圧力かん中で８６７ｍＱのＤ　 Ｍ　Ｓ　Ｏに添加し、溶解するために２５℃で３時間撹拌した。この溶液を２５ ℃で第２の５リツトルの圧力かん中に滅菌的にろ過した。

シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（６０ｇ）および２６．４ｇ のシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）（７：３モル比）を ５０リツトルの圧力容器中で２１リツトルのメチレンクロライドと一緒にし、完 全に熔解するまで混合した。次いでこのものを０．２２ｕｍのテフロンフィルタ ーを通して無菌的に５０リツトル三頚丸底フラスコ中に無菌的にろ過した。この アンホテリシンＢ　／　Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ混合物を丸底フラスコ中の脂質溶液に添 加し、（３３モル％アンホテリシンＢｍ液のために）次いでこの丸底フラスコＬ ：４．３２リットルの０．９％滅菌生理食塩水を添加した。この懸濁液をバナナ 型櫂で混合した。

メチレンクロライドを４０℃における２０時間の真空蒸留工程（７５０ｍｍＨｇ ）で除去した。この時間経過後、５リツトルが製剤の脂質／アンホテリシンＢ粒 子５Ｌに０．９％ｔｉ菌生理食塩水５Ｌを加えた。この溶液４リツトル（４，０ ４ｍｇ／ｍｕアンホテリシンＢ）を再生セルロースのフィルター膜を備えた中空 繊維接線流動ろ過透析ユニットバクスター　トラベノール（Ｂａｘｔｅｒ　丁ｒ ａｖｅｎｏｌ　）　　（モデル１５．１１）の入口および出口の出入口に、この 溶液を含有する貯Ｎ器から、シリコン螺動管を通して。

接続した。ワトソンマルロウ蝙動ポンプをその接ｌｌ！流動装置へ２５０ｍΩ／ 分で配送するためにＥ２　Ｗ　Ｌ、、た。

同様に滅菌０．９％生理食塩水４Ｌ浴を取り付け、透析ユニットの毛管外スペー スに導くそのバクスター　トラベノール装置の出入口にポンプで押し出した。同 様に螺動ポンプを、各貯蔵器中に一定の容量を保持するような速度でそのユニッ トに生理食塩水を配送するために配置した。その生理食塩水管を脂質粒子に対し て生理食塩水の向流が達成されるようにその装置に取付けた。その溶液を１時間 向流的に循環し、次いでその生理食塩水溶液を新しい生理食塩水に変えた。この 工程はその溶液からＤＭＳＯを除くものであった。

前−および後−透析ＤＭＳＯの分析をテトロヒドロフラン（ＴＨＥ）を用いる標 準ガスクロマトグラフ技術を用いて行った。前−透析ＤＭＳＯは７．７５％であ り、後−透析Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏは０．０５％であると決定された。得られた容量は ４．３Ｌであった。

１１檻主 上記実施例１の透析分離された粒子３リツトルを以下の技術に従ってサイズによ り選択した。２つのフィルターパック〔ポリプロピレン導管（ｃｈａｎｎｅｌｓ ）で分離された各１／２ｆｔ２）中に５Ｌｍ孔サイズを有する１　ｆ　ｔ”のデ ュラポール（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）の平坦なシート膜を備えたペリコン（Ｐｅｌｌ ｉｃｏｎ）接線流・動ろ過装置をその粒子の大きさに従って分けるのに用いた。

その３Ｌの試料を含有する貯′Ｒ器を、４Ｌ／分で配送するために配置されたワ トソンマルロウ（モデル６０３０／Ｒ）　螺動ポンプにシリコン螺動管と共に接 続し、次いでペリコン装置の入口に接続した。その入口の圧力を３ｐｓｉに調製 した。そのペリコン出口（残留物）レニおけるｐｓｉは１ｐｓｉであり、このろ 液口（ｐｏｒｔｓ）におけるそれは１．６ｐｓｉであったやそのろ液の流動速度 は約３２ｍＱ／分であり、ワトソンマルロウ（モデル６０３ＴＪ／Ｒ）を用いて ペリコン装置からポンプで押出した。

ろ液２５００ｍＡを集めた後、その試料を、その貯蔵器に滅菌０．０９％生理的 食塩水を３２ｍＱ／分で添加して透析ろ過した。

付加的に１５３０ｍＲのろ液がろ液／透析ろ液（ｄｉａｆｌｉｔｒａｔｅ）の全 量４０３０ｍΩに対して集められるまでこの工程を続けた。樟−準ガスクロマト グラフ法により測定されたＤＭＳＯの得られた濃度は０．０１％であった。マル ベルン（Ｍａｌｖｅｒｎ）粒子サイズ技術により測定されたその粒子のサイズは １．Ｑｕｍ以下から４．７１．０ｕｍ以下から５０ｕｍのサイズ領域の脂質粒子 を実施例１の方法により調製し１次いで５ｕｍフィルターサイズを用いる実施例 ２の方法によってろ過し、４．５ｕｍまでのサイズの粒子を得た。これらの粒子 ３リツトルを貯蔵器中に置き、この貯蔵器を、ゲルマン１．２ｕｍ　（アクロフ ラックス、ひだのある平坦シート構造、９００ｄ）接線流動フィルター装置の入 口にシリコン螺動管（ポンプ付）で接続し、その流動速度を４Ｌ／分に調整した やそのろ液（１，２ｕｍまでの粒子サイズ）をそのろ液口を通して集め、その残 留物をその貯蔵器に再循環した。残留物（４１０ｍｆｌ）を集めた。

叉１匹土 水性生理食塩水溶液の容量（１５，１Ｌ）に対して０．９重量％で溶解されたゲ ンタマイシン（２８６ｇ）およびメチレンクロライド（２４，５Ｌ）中に溶解さ れた卵ホスファチジルコリン（４９０ｇ）を用いて、５ＰＬＶ法〔レンダ（Ｌｅ ｎｋ）らの米国特許明細書第４，５２２，８０３号、１９８５年７月１１日発行 の操作によるもの、それはここに参照゛の為に引用されている〕の手段により、 ゲンタマイシンを含有するリポソームを作った。この５ＰＬＶリポソームを０． ９％水性先理食塩水溶液で希釈した。サイズ約１゜Ｏｕｍ以下−５ｕｍのこれら のリポソームを、実施例２の方法によりマイクロボンクロスフロ−（Ｍｉｃｒｏ ｇｏｎ　）ｔｒｏｓｆｌｏｖ）ＩＩ　（マイクロボンインコーホレイチット、ラ グナフィルカナダ）接ＷｉＡ流動ろ通糸統を用いて容量８．２リツトルから濃縮 した。このフィルターの孔サイズは０．２ｕｍであり、その表面積はＬｏｆｔ” であった、そのゲンタマイシンリポソーム８．２Ｌを含有する貯蔵器をシリコン 螺動管を用いてそのクロスフローフィルターの入口に接続した。フィルターの出 口に接続されているシリコン配管は残留物を貯蔵器へ戻せしめる。ワトソンマー ローの螺動ポンプが生成物をフィルター中へ注入するために使用された（流量率 約４リツトル／分、入口圧３−１０ｐｓｉ、ろ液流量速度約７５ｍ　Ｑ　／分） 。

この濃縮工程が終了した後、該ろ液のゲンタマイシン濃度を標準的な比色技術を 用いて測定し、７．９２ｍｇゲンタマイシン／ｍ０の濃度を有することが見出さ れた。透析ろ過工程は次いで実施例２に従って行われた。ポンプで注入する条件 は上のものと同じであったが、約９リツトルの生理食塩水が透析ろ過のための系 に添加された。このろ液をゲンタマイシンについてチェックしたところ、最後の ５０ｍｎは０　、１０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑの濃度であった。

このことは濃縮物中の遊離のゲンタマイシンが透析ろ過の前の時点から９９％減 少していることを示した。

ゲンタマイシンは０．２ｕｍフィルターの孔を自由に流れ、従ってろ液中に見出 される濃度は′ａ縮物（残留物）中のＮ離ゲンタマイシンを示唆している。

ヌ」Ｌ瀬ｊ− アンホテリシンＢ粒子（ＨＤＬＣｓ）が次の方法に従って形成された：アンホテ リシンＢ　（３３７，５ｇ）を３３７５．○ｍｆｌのＤＭＳＯに添加し、そして ２５℃で５．５時間撹拌して溶解しまた。この溶液を２５℃で５リツトルの圧力 かん中に滅菌ろ過した。

シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１０９．９ｇのシミリ ストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）（７：３モル比）を４０リツ トルの圧力容器中で３５．２リツトルのメチレンクロライドと一緒にし、混合し て完全に溶解した。この溶液を次いで０．２２ｕｍのテフロンフィルターを通し て１４０リツトルの処理タンク中に滅菌ろ過した。メチレンクロリド（３９，１ リツトル）を０．２２ｕｍテフロンフィルターを通して滅菌ろ過し、上記１４０ ルツトタンク中に添加した。このアンホテリシンＢ／ＤＭＳＯ混合物を脂質溶液 に添加し、（３３モル％アンホテリシンＢｍ液に対し）次いで１６．５リツトル の０．９％減苗生理食塩水をタンクに添加した。このＳ濁液を船舶用プロペラで 混合した。このメチレンクロリドを滅菌チッ素ガス浄化（ｐｕｒｇｉｎｇ）によ り除去した。約１３時間後、最終温度は４゜℃より低かった。滅菌生理食塩水（ ７，０リツトル）をバッチに添加し、処理容器中の総容量が約２フルツトルであ るようにした。

この生成物を約５時間ギフオードウッドコロイドミルを通して循環し、該脂質粒 子の平均サイズを約５．Ｏｕｍにまで低減させた。粉砕後、生成物をアルファレ ーバル回転丸型ポンプを用いて２４　ｇｐｍの平均流動速度でロミコン５．０ｕ ｍセラミック接線流動フィルター（２ｆ　ｔ”）を通して総時間として１０時間 循環した。滅菌生理食塩水（４１０リツトル）を１４０リツトルの容器の頂部入 口から３０リツトルの一定量中に添加した。平均ろ過速度は約５００ｍＡ／分で あった。このろ液を次いで貯蔵器に通し、アルファレーバル回転丸型ポンプ睨動 の１．２ｕｍレミコン２ｆｔ”セラミックフィルターを、流量割合的３６ｇｐｍ で通過させることによって、濃縮した；　（約１４．５時間）ろ過速度は約５０ ０−６００ｍｆｆｉ／分であった。このろ過がろ液中の１．２ｕｍおよびそれ以 下の粒子を除去した。二の１．２ｕｍ歿留物を最終物として回収した。

１鳳五立 ゲンタマイシンを含有するリポソームを実施例４の方法にしたがって５ＰＬＶ法 によりつくった。これらのリポソーム（１００リツトル）を０．２２ｕｍ孔サイ ズの２台の２ｆｔ”マイクロボン中空繊維フィルター（平行型）を通すことによ って接線流動ろ過をした。アルファレーパル回転丸型ポンプが、各フィルターの 平均流量割合１５ガロン／分でフィルターを通して生成物のろ過を行うために使 用された。ろ過圧は次のようであった：Ｐｉｎ＝１０ｐｓｉｇ；Ｐｏｕｔ＝２． ５ｐｓｉｇ、膜を横切っての圧は５．５−６．○ｐｓｉｇであった１元来ユＯＯ リットルの試料を最終的２０リツトルの生成物となるまで濃縮することになるこ のろ過は２．２５時間、０．６リツトル／分の流量速度で行われた。

この生成物を次いで透析ろ過して、平行型の４台のマイクロボンフルターを通し たろ過により遊離の（取り込まれていない）ゲンタマイシンを除去した。生理食 塩水（２０リツトル）を０．２２ｕｍの接線流動ろ過工程からの残留物を含有す る貯蔵タンクに添加し、該残留物を回収した。この工程を６回繰返し、その後、 この生成物は２０リツトルの生成物中に５．６ｍｇ／ｍＡの取り込まれていない ゲンタマイシンを含有した。

竺　陥　婚　答　≦　牛

Claims (72)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の（ａ）および（ｂ）工程を含有する液体中に懸濁された粒子を含有す る混合物からサイズに従って粒子を分離する方法：（ａ）その混合物を第１の孔 サイズを有する第１フィルターを用いて接線流動ろ過せしめる工程；および、（ ｂ）そのろ液をより小さい孔サイズを有する第２フィルターを用いて接線流動ろ 過せしめる工程。
2. ２．その粒子がリボソームまたは脂質粒子を含有する請求の範囲１記載の方法。
3. ３．そのリポソームもしくは脂質粒子が付加的に生物活性剤を含有する請求の範 囲２記載の方法。
4. ４．その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有する請求の範囲３記載の方法。
5. ５．そのポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢを含有する請求の範囲４記載の方 法。
6. ６．そのリポソームもしくは脂質粒子の脂質に対するアンホテリシンＢのモル比 が約１モル％から約６０モル％である請求の範囲５記載の方法。
7. ７．そのアンホテリシンＢのモル比が約１６から約５０モル％である請求の範囲 ６記載の方法。
8. ８．そのアンホテリシンＢのモル比が約３３モル％である請求の範囲７記載の方 法。
9. ９．その第１の孔サイズが約１０と約０．２ｕｍの間である請求の範囲８記載の 方法。
10. １０．その第１の孔サイズが約５ｕｍである請求の範囲８記載の方法。
11. １１．その第２の孔サイズが約２０００分子量と約２ミクロンの間にある請求の 範囲８記載の方法。
12. １２．その第２の孔サイズが約１．０ｕｍである請求の範囲１１記載の方法。
13. １３．その粒子が７：３のモル比のジミリストイルホスファチジルコリンおよび ジミリストイルホスファチジルグリセロール、および３３モル％アンホテリシン Ｂを含有する請求の範囲１２記載の方法。
14. １４．その生物活性剤がアミノグリコシドを含有する請求の範囲１３記載の方法 。
15. １５．そのアミノグリコシド剤がゲンタマイシンである請求の範囲１４記載の方 法。
16. １６．そのリポソームがＳＰＬＶである請求の範囲１５記載の方法。
17. １７．そのリポソームがホスファチジルコリンを含有する請求の範囲１６記載の 方法。
18. １８．その粒子がリポソームを含有し、その生物活性剤がアミノグリコシドを含 有し、その際第１の孔サイズが約５ｕｍおよび第２の孔サイズが約１ｕｍである 請求の範囲３記載の方法。
19. １９．そのアミノグリコシドがゲンタマイシンを含有する請求の範囲１８記載の 方法。
20. ２０．それらのサイズを減少させるため、その粒子を粉砕する工程を含有する請 求の範囲１８記載の方法。
21. ２１．それらのサイズを減少させるため、その粒子を粉砕する工程を含有する請 求の範囲１記載の方法。
22. ２２．請求の範囲１記載の方法によって調製された均一のサイズの分布を有する リポソームもしくは脂質粒子の母集団。
23. ２３．そのリポソームがマルチラメラである請求の範囲２２記載の母集団。
24. ２４．そのリポソームがユニラメラである請求の範囲２２記載の母集団。
25. ２５．請求の範囲１記載の方法によって得られた均一のサイズ分布を有するリポ ソームもしくは脂質粒子の母集団。
26. ２６．その脂質粒子が脂質および生物活性剤を含有する請求の範囲２５記載の母 集団。
27. ２７．その脂質粒子がＨＤＬＣ５である請求の範囲２６記載の母集団。
28. ２８．その脂質がモル比約７：３でジミリストイルホスファチジルコリンおよび ジミリストイルホスファチジルグリセロールを含有する請求の範囲２７記載の母 集団。
29. ２９．その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有する請求の範囲２７記載の母集 団。
30. ３０．そのポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢを含有する請求の範囲２９記載 の母集団。
31. ３１．そのアンホテリシンＢのモル比が約５−５０モル％である請求の範囲３０ 記載の母集団。
32. ３２．その粒子のサイズが約０．２ｕｍと約１０ｕｍとの間である請求の範囲３ １記載の脂質粒子。
33. ３３．その粒子のサイズが約１から５ｕｍである請求の範囲２２記載の脂質粒子 。
34. ３４．そのアンホテリシンＢのモル比が約１６−５０モル％である請求の範囲３ １記載の脂質粒子。
35. ３５．そのアンホテリシンＢのモル比が約３３モル％である請求の範囲３４記載 の母集団。
36. ３６．そのリポソームが脂質および生物活性剤を含有する請求の範囲２５記載の 母集団。
37. ３７．その生物活性剤がアミノグリコシドである請求の範囲３６記載の母集団。
38. ３８．そのアミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲３７記載の母集 団。
39. ３９．そのリポソームのサイズが約０．２ｕｍと約１０ｕｍとの間である請求の 範囲３８記載の母集団。
40. ４０．そのリポソームがＳＰＬＶである請求の範囲３９記載の母集団。
41. ４１．その脂質がホスファチジルコリンを含有する請求の範囲４０記載の母集団 。
42. ４２．その生物活性剤が抗新生腫瘍剤である請求の範囲３６記載の母集団。
43. ４３．その抗新生腫瘍剤がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンもし くはピンクリスチンである請求の範囲４２記載の母集団。
44. ４４．そのリポソームのサイズが約５．０ｕｍと約１．２ｕｍとの間である請求 の範囲４３記載の母集団。
45. ４５．混合物を接線流動ろ過せしめる工程を含有する液体中に懸濁されたリポソ ームもしくは脂質粒子を含有する混合物からリポソーム外もしくは脂質外粒子を 除去する方法。
46. ４６．そのリポソーム外もしくは脂質外粒子物質が有機溶媒である請求の範囲４ ５記載の方法。
47. ４７．その有機溶媒がＤＭＳＯを含有する請求の範囲４６記載の方法。
48. ４８．そのリポソーム外文は脂質外粒子物質が取り込まれていないかもしくは結 合されていない生物活性剤である請求の範囲４５記載の方法。
49. ４９．以下の（ａ），（ｂ）工程を含有する限定された切り捨て（ｃｕｔ　ｏｆ ｆ）以下のサイズの粒子の製造方法：（ａ）その粒子を均一にする工程および（ ｂ）限定された切り捨て以上の粒子を除外する孔サイズの第１のフィルターでそ の粒子を接線流動ろ過せしめる工程。
50. ５０．その均一化が粉砕することにより行われる請求の範囲４９記載の方法。
51. ５１．その粒子がリポソームもしくは脂質粒子を含有する請求の範囲４９記載の 方法。
52. ５２．そのリポソームもしくは脂質粒子が生物活性剤を付加的に含有する請求の 範囲５１記載の方法。
53. ５３．その生物活性剤がポリエン抗真菌剤を含有する請求の範囲５２記載の方法 。
54. ５４．ポリエン抗真菌剤がアンホテリシンＢを含有する請求の範囲５３記載の方 法。
55. ５５．リポソームもしくは脂質粒子の脂質に対するアンホテリシンＢのモル比が 約１モル％から約６０モル％である請求の範囲５４記載の方法。
56. ５６．アンホテリシンＢのモル比が約１６から約５０モル％である請求の範囲５ ５記載の方法。
57. ５７．アンホテリシンＢのモル比が約３３モル％である請求の範囲５６記載の方 法。
58. ５８．そのフィルター孔サイズが約１０と約０．２ｕｍとの間である請求の範囲 ５７記載の方法。
59. ５９．そのフィルター孔サイズが約５ｕｍである請求の範囲５８記載の方法。
60. ６０．その粒子が約７：３のモル％のジミリストイルホスファチジルコリンおよ びジミリストイルホスファチジルグリセロール、および約３３モル％のアンホテ リシンＢを含有する請求の範囲５９記載の方法。
61. ６１．その生物活性剤がアミノグリコシドを含有する請求の範囲５２記載の方法 。
62. ６２．そのアミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲６１記載の方法 。
63. ６３．そのリポソームがＳＰＬＶである請求の範囲６２記載の方法。
64. ６４．そのリポソームがリン脂質を含有する請求の範囲６３記載の方法。
65. ６５．そのリン脂質がホスファチジルコリンを含有する請求の範囲６４記載の方 法。
66. ６６．次の付加的工程を含有する請求の範囲４９記載の方法：（ｃ）工程（ｂ） のろ液をより小さい孔サイズの第２のフィルターで接線流動ろ過を行う工程。
67. ６７．請求の範囲６６に記載に従って調製された均一のサイズ分布を有するリポ ソームもしくは脂質粒子の母集団。
68. ６８．そのリポソームがマルチラメラである請求の範囲６６記載の母集団。
69. ６９．そのリポソームがユニラメラである請求の範囲６６記載の母集団。
70. ７０．その粒子がゲンタマイシンおよびホスファチジルコリンを含有するリポソ ームを含有し、その際第１の孔サイズが約５ｕｍおよび第２の孔サイズが約１ｕ ｍである請求の範囲６６記載の方法。
71. ７１．接線流動ろ過装置中のフィルターの第１の側部に脂質含有溶液を接触させ る一方、その接線流動ろ適装置中のフィルターの第２の側部に水溶液を注入もし くは注射する工程を含有するリポソームもしくは脂質粒子を製造する方法。
72. ７２．用いられる接線流動ろ過系統が動的回転ろ過もしくは中空繊維ろ過である 請求の範囲７１記載の方法。