ES3068089T3 - Composiciones inmunogénicas contra la gripe - Google Patents

Abstract

En este documento se describen composiciones y métodos relacionados con virus mutantes, en particular, virus de la gripe mutantes. Los virus mutantes descritos incluyen secuencias mutantes M2 y BM2, y son útiles en composiciones inmunogénicas, por ejemplo, como vacunas tetravalentes. Asimismo, se describen métodos, composiciones y células para la propagación de los virus mutantes, así como métodos, dispositivos y composiciones relacionados con la vacunación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones inmunogénicas contra la gripe

[0003] Referencia cruzada a solicitud relacionada

[0004] La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud de EE. UU. N.º 62/464.019, presentada el 27 de febrero de 2017.

[0005] Antecedentes

[0006] La gripe es una de las causas principales de muerte entre los adultos estadounidenses. Cada año, aproximadamente 36.000 personas mueren a causa de la gripe y más de 200.000 personas son hospitalizadas. La gripe es una enfermedad muy contagiosa que se transmite al toser, estornudar y por contacto físico directo con objetos, tales como pomos de puertas y teléfonos, que portan el virus. Los síntomas de la gripe incluyen fiebre, cansancio extremo, cefalea, escalofríos y dolores corporales; aproximadamente el 50 por ciento de las personas infectadas no presentan síntomas, pero siguen siendo contagiosas. La inmunización tiene una eficacia del 50 al 60 por ciento para prevenir la gripe en personas sanas menores de 65 años, siempre que las antigenicidades de la cepa del virus en circulación coincidan con las de la vacuna.

[0007] La vacunación es el método principal para prevenir la gripe y actualmente se encuentran disponibles vacunas de virus vivos atenuados e inactivados (muertos). Las vacunas de virus vivos, administradas normalmente por vía intranasal, activan todas las fases del sistema inmunitario y pueden estimular una respuesta inmunitaria a múltiples antígenos víricos. Por tanto, el uso de virus vivos supera el problema de la destrucción de antígenos víricos que puede producirse durante la preparación de vacunas víricas inactivadas. Además, la inmunidad producida por vacunas de virus vivos es generalmente más duradera, más eficaz y con mayor reactividad cruzada que la inducida por las vacunas inactivadas, y las vacunas de virus vivos son menos costosas de producir que las vacunas de virus inactivados. Sin embargo, las mutaciones en virus atenuados con frecuencia están mal definidas y la reversión es una preocupación.

[0008] Sumario

[0009] En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica, en donde la composición es una composición multivalente que comprende virus recombinantes de al menos dos cepas de gripe.

[0010] En particular, la presente invención proporciona una composición inmunogénica, en donde la composición es una composición multivalente que comprende virus recombinantes de al menos dos cepas de gripe, en donde la composición multivalente comprende:

[0011] a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe A genomodificado comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y

[0012] b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, al menos un virus de la gripe A se selecciona del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, y el al menos un virus de la gripe B se selecciona del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria.

[0013] En algunas realizaciones, la composición multivalente comprende virus recombinantes seleccionados del grupo que consiste en: a) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; b) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; c) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; y d) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la composición multivalente es una composición tetravalente que comprende: a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en: i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y b) dos virus de la gripe B atenuados genomodificados que consisten en: i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

[0014] En algunas realizaciones, la composición multivalente es una composición tetravalente que comprende: a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en: i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y b) un virus de la gripe B atenuado genomodificado seleccionado del grupo que consiste en: i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

[0015] En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación comprenden además un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente tecnología se formulan para administración intranasal o intracutánea. La presente invención proporciona además una composición inmunogénica multivalente para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria contra la gripe A y la gripe B, comprendiendo el método administrar la composición a un sujeto que lo necesite y comprendiendo la composición inmunogénica multivalente:

[0016] a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe A genomodificado comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y

[0017] b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

[0018] En algunas realizaciones, al menos un virus de la gripe A se selecciona del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, y el al menos un virus de la gripe B se selecciona del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria.

[0019] En algunas realizaciones, la composición inmunogénica multivalente comprende virus recombinantes seleccionados del grupo que consiste en: a) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; b) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; c) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; y d) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

[0020] En algunas realizaciones, la composición inmunogénica multivalente es una composición tetravalente que comprende: a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en: i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y b) dos virus de la gripe B atenuados genomodificados que consisten en: i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

[0021] En algunas realizaciones, la composición inmunogénica multivalente es una composición tetravalente que comprende: a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en: i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y b) un virus de la gripe B atenuado genomodificado seleccionado del grupo que consiste en: i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

[0022] En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación comprenden además un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación se formulan para administración intranasal o intracutánea.

[0023] Breve descripción de los dibujos

[0024] La FIGURA 1 es un gráfico que representa el papel del canal iónico M2 en el ciclo de vida de un virus de la gripe, en donde (1) el virus de la gripe se une a los receptores de ácido siálico en una superficie celular; (2) el virus se internaliza en la célula; (3) el canal iónico M2 se expresa en la superficie vírica; (4) el canal iónico M2 se abre para permitir la entrada de protones, lo que conduce a una liberación de ARN vírico que entra en el núcleo, se replica y da lugar a la síntesis de proteínas víricas; y (5) los componentes víricos se empaquetan en viriones y se liberan (6).

[0025] La FIGURA 2 es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpos IgG anti-HA provocada por los virus BM2SR en una formulación de vacuna tetravalente.

[0026] Las FIGURAS 3 A-3D son gráficos que muestran las respuestas de anticuerpos IgG anti-HA provocadas por los virus BM2SR y M2SR en formulaciones multivalentes. Mono/B WI01 = monovalente B/WI01 (que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11); mono B/Bris60 = B/Bris60 monovalente (que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11); mono CA07 = CA07 monovalente (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1); mono Bris10 = Bris 10 monovalente (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1); BIV H1H3 = H1H3 bivalente (que comprende mutantes M2SR-1 que comprenden la SEQ ID NO: 1); TIV H3VY = H3VY trivalente (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1 y los mutantes BM2SR-0 que comprenden la SEQ ID NO: 11); TIV H1VY = H1VY trivalente (que comprende los mutantes M2SR-1 que comprenden la SEQ ID NO: 1 y un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11); TIV H1H3V = H1H3V trivalente (que comprende los mutantes M2SR-1 que comprenden la SEQ ID NO: 1 y un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11); TIV H1H3Y = H1H3Y trivalente (que comprende los mutantes M2SR-1 que comprenden la SEQ ID NO: 1 y un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11); Tetravalente (que comprende los mutantes M2SR-1 que comprenden la SEQ ID NO: 1 y los mutantes BM2SR-0 que comprenden la SEQ ID NO: 11).

[0027] La FIGURA 4A es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal del ratón después de la exposición a la gripe B, después de la inoculación con vacunas BM2SR monovalentes, M2SR monovalentes y tetravalentes.

[0028] La FIGURA 4B es un gráfico que muestra la supervivencia del ratón después de la exposición a la gripe B, después de la inoculación con vacunas BM2SR monovalentes, M2SR monovalentes y tetravalentes.

[0029] La FIGURA 4C es un gráfico que muestra los títulos víricos de ratones de diferentes grupos de vacunación en el Día 4 después de la exposición a la gripe B.

[0030] La FIGURA 5A es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal del ratón después de la exposición a la gripe A, después de la inoculación con vacunas BM2SR monovalentes, M2SR monovalentes y tetravalentes.

[0031] La FIGURA 5B es un gráfico que muestra la supervivencia del ratón después de la exposición a la gripe A, después de la inoculación con vacunas BM2SR monovalentes, M2SR monovalentes y tetravalentes.

[0032] La FIGURA 5C es un gráfico que muestra los títulos víricos de ratones de diferentes grupos de vacunación en el día 4 después de la exposición a la gripe A.

[0033] Las FIGURAS 6A-6B son gráficos que muestran los títulos de anticuerpos IgG anti-HA provocados contra el virus de la gripe B después de la inoculación con una formulación BM2SR monovalente y tetravalente. Construcciones de BM2SR representativas: B/CA12 es B Yamagata BM2SR; B/Bris46 es B Victoria BM2SR. La formulación tetravalente es una mezcla de ambos BM2SR y H1N1 y H3N2 y M2SR.

[0034] Las FIGURAS 7A-7D son gráficos que muestran que los mutantes M2SR y BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra los virus de la gripe A y la gripe B en formulaciones multivalentes. Construcciones de M2SR y BM2SR representativas: A/MA15 es H1N1 M2SR; A/HK4801 es H3N2 M2SR; B/CA12 es B Yamagata BM2SR-4; B/Bris46 es B Victoria BM2SR-4. La formulación tetravalente ("tetra") es una mezcla de los cuatro. La trivalente ("tri") es una formulación de los tres virus indicados.

[0035] Las FIGURAS 8A-8B son gráficos que muestran el cambio en el peso corporal y la supervivencia del ratón, respectivamente, después de una exposición a una dosis letal de la gripe B, después de la inoculación con formulaciones BM2SR monovalentes, trivalentes y tetravalentes.

[0036] Las FIGURAS 9A-9B son gráficos que muestran el cambio en el peso corporal y la supervivencia del ratón, respectivamente, después de una exposición a una dosis letal de la gripe A, después de la inoculación con la formulación M2SR trivalente (que comprende H1N1 que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), H3N2 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), y B/Yamagata (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9)) o una formulación de M2SR tetravalente (que comprende H1N1 (que comprende H1N1 (que comprende un mutante M2SR-l que comprende la SEQ ID NO: 1), H3N2 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), linaje B/Victoria (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9, y B/Yamagata [que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9]).

[0037] La FIGURA 10 es un gráfico que muestra los títulos del ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) provocados contra cada componente de una vacuna tetravalente.

[0038] La FIGURA 11A es un gráfico que muestra los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) provocados contra cada componente de una vacuna tetravalente.

[0039] La FIGURA 11B es una tabla que muestra los títulos de HAI provocados contra cada componente de una vacuna tetravalente en sueros agrupados el día 35 después de la inoculación.

[0040] La FIGURA 12 es un gráfico que muestra los títulos víricos de lavado nasal en los días 1, 3, 5 y 7 después de la exposición a la gripe A.

[0041] La FIGURA 13A es un gráfico que muestra el título vírico en el tejido del cornete nasal el día 3 después de la exposición a la gripe A.

[0042] La FIGURA 13B es un gráfico que muestra el título vírico en el tejido traqueal el día 3 después de la exposición a la gripe A.

[0043] La FIGURA 13C es un gráfico que muestra el título vírico en el tejido pulmonar el día 3 después de la exposición a la gripe A.

[0044] Descripción detallada

[0045] I. Definiciones

[0046] En el presente documento se usan las siguientes expresiones, cuyas definiciones se proporcionan a modo de orientación.

[0047] Como se utiliza en el presente documento, las formas en singular "un/uno", "una", y "el/la" designan tanto el singular como el plural, a menos que se indique expresamente que designan solamente el singular.

[0048] El término "aproximadamente" y el uso de intervalos en general, independientemente de que estén modificados o no por el término "aproximadamente", significa que el número comprendido no está limitado al número exacto establecido en el presente documento y se entiende que hace referencia a intervalos sustancialmente dentro del intervalo citado sin alejarse del alcance de la invención. Como se utiliza en el presente documento, "aproximadamente" será entendido por personas expertas en la materia y variará en cierta medida en función del contexto en el que se use. Si hay usos del término que no estén claros para un experto habitual en la materia, dado el contexto en el que se use, "aproximadamente" significará hasta más o menos el 10 % del término particular.

[0049] Como se utiliza en el presente documento, el término "atenuado", como se usa junto con un virus, se refiere a un virus que tiene una virulencia o patogenicidad reducida en comparación con un homólogo no atenuado, pero aún es viable o está vivo. Típicamente, la atenuación hace a un agente infeccioso, tal como un virus, menos perjudicial o virulento para un sujeto infectado en comparación con un virus no atenuado. Esto contrasta con el virus destruido o completamente inactivado.

[0050] Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, p. ej., una cantidad que dé lugar a la prevención de, enfermedad, afección y/o síntoma o síntomas de las mismas. En el contexto de aplicaciones terapéuticas o profilácticas, la cantidad de una composición administrada al sujeto dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos de composición. También dependerá del grado, la gravedad y el tipo de enfermedad o afección. El experto podrá determinar las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores. En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, se administran múltiples composiciones o compuestos terapéuticos (p. ej., composiciones inmunogénicas, tales como vacunas). La referencia en el presente documento a métodos de tratamiento aplicados en el cuerpo humano o animal no indica que la presente invención proporcione tales métodos, más bien la presente invención proporciona la composición inmunogénica de la presente invención para su uso en tales métodos.

[0052] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula en la que un patógeno, tal como un virus, puede replicarse. En algunas realizaciones, células hospedadoras son células cultivadasin vitro. Los ejemplos no limitativos de dichas células hospedadoras incluyen, pero sin limitación, células CHO, células Vero y células MDCK. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, las células hospedadoras sonin vivo(p. ej., células de un vertebrado infectado, tal como un ave o un mamífero). En algunas realizaciones, las células hospedadoras pueden modificarse, p. ej., para mejorar la producción vírica, tal como mediante la mejora de la infección vírica de la célula hospedadora y/o la mejora de la velocidad de crecimiento vírico. A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, las modificaciones ilustrativas de la célula hospedadora incluyen la expresión recombinante de receptores de ácido siálico con enlaces 2-6 en la superficie celular de la célula hospedadora y/o la expresión recombinante de una proteína en las células hospedadoras que se ha vuelto ausente o ineficaz en el patógeno o virus.

[0053] La expresión "composición inmunogénica" se utiliza en el presente documento para referirse a una composición que provocará una respuesta inmunitaria en un mamífero que ha estado expuesto a la composición. Una composición inmunogénica de la presente invención es una composición multivalente que comprende virus recombinantes de al menos dos cepas de gripe, en donde la composición multivalente comprende: a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe A genomodificado comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende al menos una cepa M2SR mutante de gripe A deficiente en M2 (p. ej., A/California/07/2009 (H1N1) (que comprende un mutante M2SR que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (que comprende un mutante M2SR que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende al menos una cepa BM2SR mutante de gripe B deficiente en BM2 (p. ej., B/Brisbane/60/2008 (Victoria) (que comprende un mutante BM2SR que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11), B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata) (que comprende un mutante BM2SR que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende A/California/07/2009 (H1N1) (que comprende un mutante M2SR que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (que comprende un mutante M2SR que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3), B/Brisbane/60/2008 (Victoria) (que comprende un mutante BM2SR que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11), y B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata) (que comprende un mutante BM2SR que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11) formulada como una vacuna tetravalente.

[0055] En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas del presente documento descritas pueden formularse para administración (es decir, formularse para "exposición" al mamífero) en diversas formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas se preparan para administración oral, pulmonar, intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, nasal o tópica. También se pueden formular composiciones para formas farmacéuticas específicas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición inmunogénica puede formularse como un líquido, gel, aerosol, pomada, crema, formulación liofilizada, polvo, torta, comprimido o cápsula. En otras realizaciones, la composición inmunogénica se formula como una formulación de liberación controlada, formulación de liberación retardada, formulación de liberación lenta, formulación de liberación pulsátil y formulación mixta de liberación inmediata. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica se proporciona en forma de líquido. En otras realizaciones, la composición inmunogénica se proporciona en forma liofilizada.

[0057] Como se utiliza en el presente documento, el término "infectado" se refiere a albergar una enfermedad o patógeno, tal como un virus. Una infección puede ser intencionada, tal como por la administración de un virus o patógeno (p. ej., por vacunación), o no intencionada, tal como por transferencia natural del patógeno de un organismo a otro, o de una superficie contaminada al organismo.

[0059] Como se utiliza en el presente documento, los términos "aislado" y/o "purificado" se refieren a preparaciónin vitro, aislamiento y/o purificación de un ácido nucleico (p. ej., un vector o plásmido), polipéptido, virus o célula de modo que no esté asociado con sustancias no deseadasin vivoo se purifique sustancialmente de sustancias no deseadasin vivocon las que se produce normalmente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se obtiene una preparación de virus aislado mediante cultivoin vitroy propagación, y está sustancialmente libre de otros agentes infecciosos. Como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente libre" significa por debajo del nivel de detección de un compuesto en particular, tales como ácidos nucleicos no deseados, proteínas, células, virus, agentes infecciosos, etc., usando métodos de detección convencionales para ese compuesto o agente.

[0060] Como se utiliza en el presente documento, los términos "mutante", "mutación", y "variante" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico o polipéptido que difiere de una secuencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, las secuencias mutantes o variantes se producen de forma natural. En otras realizaciones, las secuencias mutantes o variantes se introducen de forma recombinante y/o química. En algunas realizaciones, las mutaciones de ácido nucleico incluyen modificaciones (p. ej., adiciones, supresiones, sustituciones) de secuencias de ARN y/o ADN. En algunas realizaciones, las modificaciones incluyen modificación química (p. ej., metilación) y también pueden incluir la sustitución o adición de nucleótidos naturales y/o no naturales. Las mutaciones de ácidos nucleicos pueden ser mutaciones silenciosas (p. ej., uno o más cambios de ácidos nucleicos que codifican el mismo aminoácido que la secuencia de tipo silvestre) o pueden dar lugar a un cambio en el aminoácido codificado, dar lugar a un codón de terminación o pueden introducir defectos de corte y empalme o alteraciones de corte y empalme. Las mutaciones de ácidos nucleicos en secuencias codificantes también pueden dar lugar a cambios de aminoácidos conservadores o no conservadores.

[0061] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "virus recombinante" se refiere a un virus que se ha manipuladoin vitro, p. ej., usando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, para introducir cambios en el genoma vírico y/o introducir cambios en las proteínas víricas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los virus recombinantes pueden incluir tanto secuencias de ácido nucleico endógenas de tipo silvestre y secuencias de ácido nucleico mutantes y/o exógenas. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, los virus recombinantes pueden incluir componentes proteicos modificados, tales como matriz mutante o variante, hemaglutinina, neuraminidasa, nucleoproteína, proteínas no estructurales y/o polimerasas.

[0062] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula recombinante" o "célula modificada" se refiere a una célula que se ha manipuladoin vitro, p. ej., usando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, para introducir ácido nucleico en la célula y/o modificar ácidos nucleicos celulares. Los ejemplos de células recombinantes incluyen células procariotas o eucariotas que portan plásmidos exógenos, vectores de expresión y similares, y/o células que incluyen modificaciones en su ácido nucleico celular (p. ej., sustituciones, mutaciones, inserciones, supresiones, etc., en el genoma celular). Una célula recombinante ilustrativa es una que se ha manipuladoin vitropara expresar de forma estable una proteína exógena, tal como una proteína M2 vírica.

[0063] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "virus de replicación única (SR, por sus siglas en inglés)" se refiere a un virus que es defectuoso en una proteína viriónica que funciona en la entrada vírica de una célula hospedadora o en la liberación de una célula hospedadora. Por ejemplo, M2SR, como se describe en el presente documento, pertenece a la nueva clase de vacunas de virus de replicación única (SR), a diferencia de las vacunas de la gripe atenuada viva clásicas. Los virus SR son defectuosos en una proteína viriónica que funciona en la entrada o liberación vírica, tal como la proteína del canal iónico M2 de la gripe que no afecta a la replicación del genoma vírico pero es indispensable para la proliferación del virus. Por el contrario, las vacunas de virus vivos atenuados tradicionales contienen múltiples mutaciones en la maquinaria de replicación vírica que dan lugar a un fenotipo muy atenuado. Por lo tanto, los mecanismos del virus de la vacuna SR no afectan a la cinética de infección vírica ni a la producción de antígenos, a diferencia de las vacunas vivas atenuadas.

[0064] Como se utiliza en el presente documento, "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a un animal, por ejemplo, un miembro de cualquier especie de vertebrado. Los métodos y composiciones de la materia objeto desvelada en la presente son particularmente útiles para vertebrados homeotermos, incluyendo mamíferos y aves. Los sujetos ilustrativos pueden incluir mamíferos tales como seres humanos, así como mamíferos y aves de importancia por estar en peligro de extinción, de importancia económica (animales criados en granjas para consumo humano) y/o de importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoológicos) para los seres humanos. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto no es humano.

[0065] Como se utiliza en el presente documento, el término "tipo" y "cepa", como se usan junto con un virus, se usan indistintamente y se usan para hacer referencia en general a virus que tienen características diferentes. Por ejemplo, el virus de la gripe A es un tipo de virus diferente al virus de la gripe B. Asimismo, la gripe A H1N1 es un tipo de virus diferente al de la gripe A H2N1, H2N2 y H3N2. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, diferentes tipos de virus tales como los de la gripe A H2N1, H2N2 y H3N2 pueden denominarse "subtipos".

[0066] El término "vacuna" se usa en el presente documento para referirse a una composición que se administra a un sujeto para producir o aumentar la inmunidad a una enfermedad particular. En algunas realizaciones, las vacunas incluyen un adyuvante farmacéuticamente aceptable y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0067] Como se utiliza en el presente documento, el término "ARNv" se refiere al ARN que comprende un genoma vírico, incluyendo genomas víricos segmentados o no segmentados, así como genomas víricos de hebra positiva y negativa. El ARNv puede ser completamente endógeno y de "tipo silvestre" y/o puede incluir secuencias recombinantes y/o mutantes.

[0068] El término "virulencia" se usa en el presente documento para referirse a la capacidad relativa de un patógeno para causar una enfermedad.

[0069] La expresión "virulencia atenuada" o "virulencia reducida" se usa en el presente documento para referirse a una capacidad relativa reducida de un patógeno para causar una enfermedad. Por ejemplo, la virulencia atenuada o virulencia reducida puede describir virus que se han debilitado para producir inmunidad cuando se exponen a un sujeto, pero no causan enfermedad, o causan una forma, duración, aparición o aparición tardía de la enfermedad menos grave.

[0070] Como se utiliza en el presente documento, "M2SR" se refiere a un virus de la gripe recombinante deficiente en M2 de replicación única (SR). Los virus de la gripe M2SR ilustrativos descritos en el presente documento comprenden la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3, un virus que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3, o una vacuna que comprende un virus que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3, dependiendo del contexto en el que se use. Por ejemplo, al describir las mutaciones del gen M2 demostradas en el presente documento, "M2SR" se refiere a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3. En particular, "M2SR-1" se refiere a la SEQ ID NO: 1; "M2SR-2" se refiere a la SEQ ID NO: 2; y "M2SR-3" se refiere a la SEQ ID NO: 3. Al describir el componente vírico de una vacuna, "M2SR" se refiere a un virus de la gripe recombinante que no expresa la proteína M2 funcional. Al describir una vacuna, "M2SR" se refiere a una vacuna que comprende el virus recombinante M2SR.

[0071] Como se utiliza en el presente documento, "virus M2SR" engloba un virus de la gripe recombinante que no expresa la proteína M2 funcional. En algunas realizaciones, el virus M2SR comprende genes de otros virus de la gripe. En algunas realizaciones, el virus comprende los genes HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007(H3N2) similar a A/Brisbane/10/2007. En algunas realizaciones, el virus M2SR comprende los genes HA y NA del virus A/California/07/2009 (CA07) (HIN1pdm).

[0072] Como se utiliza en el presente documento, "BM2SR" se refiere a un virus de la gripe recombinante deficiente en BM2 de replicación única (SR). Los virus de la gripe BM2SR ilustrativos descritos en el presente documento comprenden la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 11, un virus que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 11, o una vacuna que comprende un virus que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 11, dependiendo del contexto en el que se use. Por ejemplo, al describir las mutaciones del gen BM2 demostradas en el presente documento, "BM2SR" se refiere a la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 11. En particular, "BM2SR-1" se refiere a la SEQ ID NO: 6; "BM2SR-2" se refiere a la SEQ ID NO: 7; "BM2SR-3" se refiere a la SEQ ID NO: 8; "BM2SR-4" se refiere a la SEQ ID NO: 9; "BM2SR-5" se refiere a la SEQ ID NO: 10; y "BM2SR-0" se refiere a la SEQ ID NO: 11. Al describir el componente vírico de una vacuna, "BM2SR" se refiere a un virus de la gripe recombinante que a modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, posee genes internos de B/Lee/40 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, PB2), no estructural (NS1 y NS2), NB, matriz (BM1)), pero que no expresa la proteína BM2 funcional. Al describir una vacuna, "BM2SR" se refiere a una vacuna que comprende el virus recombinante BM2SR.

[0073] Como se utiliza en el presente documento, "virus BM2SR" abarca un virus de la gripe recombinante que posee genes internos de B/Lee/40 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, PB2), no estructural (NS1 y NS2), matriz (BM1)), pero que no expresa la proteína BM2 funcional, individualmente o junto con otros componentes víricos y/o genes que codifican otros componentes víricos. En algunas realizaciones, el virus BM2SR comprende genes de otros virus de la gripe. En algunas realizaciones, el virus comprende los genes HA y NA de la gripe B/Brisbane/60/2008 (linaje B Victoria) similar a B/Brisbane/60/2008. En algunas realizaciones, el virus M2SR comprende los genes HA y NA del virus similar a B/Wisconsin/1/2010 (linaje B Yamagata). En algunas realizaciones, el virus BM2SR posee genes internos (NP, PA, PB1, PB2, NS1 y NS2, BM1) de virus recientes de la gripe B.

[0074] II. Virus de la gripe A y virus de la gripe B

[0075] A. General

[0076] La gripe es una de las causas principales de muerte entre los adultos estadounidenses. El agente causante de la gripe son los virus de la familiaOrthomyxoviridae, incluyendo el virus de la gripe A, virus de la gripe B y virus de la gripe C. El virus de la gripe A es un virus encapsulado de ARN de cadena negativa. El genoma del virus de la gripe A está contenido en ocho cadenas de ARN individuales (no emparejadas) cuyos complementos codifican once proteínas (HA, ND, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2). El tamaño total del genoma es de aproximadamente 14.000 bases. La naturaleza segmentada del genoma permite el intercambio de genes completos entre diferentes cepas víricas durante la cohabitación celular. Los ocho segmentos de ARN son los siguientes.1) HA codifica hemaglutinina (se necesitan aproximadamente 500 moléculas de hemaglutinina para producir un virión); 2) NA codifica neuraminidasa (se necesitan aproximadamente 100 moléculas de neuraminidasa para producir un virión); 3) NP codifica una nucleoproteína; 4) M codifica dos proteínas (la M1 y la M2) usando diferentes marcos de lectura del mismo segmento de ARN (se necesitan aproximadamente 3000 moléculas de M1 para producir un virión); 5) NS codifica dos proteínas (NS1 y NEP) usando diferentes marcos de lectura del mismo segmento de ARN; 6) PA codifica una ARN polimerasa; 7) PB1 codifica una ARN polimerasa y una proteína PB1-F2 (induce apoptosis) usando diferentes marcos de lectura del mismo segmento de ARN; 8) PB2 codifica una ARN polimerasa.

[0077] El virus de la gripe B es también un virus encapsulado de ARN de cadena negativa. El genoma del virus de la gripe B está contenido en ocho cadenas de ARN individuales (no emparejadas) cuyos complementos codifican once proteínas. De estas proteínas, nueve se encuentran también en el virus de la gripe A: tres subunidades de la ARN polimerasa dependientes de ARN (PB1, PB2 y PA), hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA), proteína de la matriz (M1 o BM1), y dos proteínas no estructurales (NS1 y NS2, también conocidas como NEP). Dos proteínas, NB y BM2, son exclusivas del virus de la gripe B. El tamaño total del genoma es de aproximadamente 14.500 bases. La naturaleza segmentada del genoma permite el intercambio de genes completos entre diferentes cepas víricas durante la cohabitación celular, un proceso conocido como redistribución. Los ocho segmentos de ARN, numerados en orden de longitud decreciente, son los siguientes. Los segmentos 1, 2 y 3 codifican PB1, PB2, y PA, respectivamente, que son subunidades de la ARN polimerasa. El segmento 4 codifica la HA (hemaglutinina). El segmento 5 codifica la NP (nucleoproteína). El segmento 6 codifica tanto la NB (proteína NB, cuya función se desconoce) como la NA (neuraminidasa). El segmento 7 codifica tanto BM1 (proteína de la matriz) como BM2 (canal iónico) mediante un ARNm bicistrónico, cuya estrategia de traducción es única. El codón de iniciación de BM2 se superpone con el codón de terminación de BM1 (TAATG, un motivo pentanucleotídico de finalización-iniciación). La proteína BM2 se traduce mediante este mecanismo de traducción de finalización-iniciación, a diferencia de la proteína M2 del virus de la gripe A, que se traduce a partir de un ARNm cortado y empalmado. El segmento 8 codifica tanto NS1 como NEP usando marcos de lectura diferentes del mismo segmento de ARN.

[0078] Tanto la gripe A como la B evolucionan antigénicamente con el tiempo mediante el proceso de deriva antigénica, en el que las mutaciones en la proteína hemaglutinina (HA) permiten que los virus escapen a la inmunidad humana existente y persistan en la población humana. Hay varios subtipos de gripe A, nombradas según un número H (para el tipo de hemaglutinina) y un número N (para el tipo de neuraminidasa). En la actualidad, hay 16 antígenos H diferentes conocidos (H1 a H16) y nueve antígenos N diferentes conocidos (N1 a N9). Cada subtipo de virus ha mutado en diversas cepas con diferentes perfiles patógenos; algunos patógenos para una especie pero no para otras, algunos patógenos para múltiples especies. Los subtipos de virus de la gripe A ilustrativos que se han confirmado en seres humanos, incluyen, pero sin limitación, H1N1 que causó la "gripe española" y el brote de gripe porcina de 2009; H2N2 que causó la "gripe asiática" a finales de la década de 1950; H3N2 que causó la gripe de Hong Kong a finales de la década de 1960; H5N1, considerada una amenaza de pandemia de gripe mundial debido a su propagación a mediados de la década de 2000; H7N7; H1N2 que actualmente es endémico en seres humanos y cerdos; y H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, H10N7.

[0079] Dos linajes antigénica y genéticamente distintos del virus de la gripe B han cocirculado y causado enfermedades en humanos desde al menos 1988. Los virus de la gripe del linaje Victoria fueron las cepas de tipo B predominantes que circulaban por todo el mundo en la década de 1980, con el linaje Yamagata convirtiéndose en el virus de tipo B dominante a principios de la década de 1990. Desde el año 1991, los virus del linaje Victoria se han aislado con poca frecuencia y se han limitado casi por completo a Asia oriental. Los virus Victoria reaparecieron en 2002 y tanto los linajes Yamagata como Victoria han coexistido desde entonces.

[0080] Las relaciones evolutivas de los virus de la gripe B aislados de 1940 a 2016 indican que las proteínas BM1 y BM2 de los aislados modernos están más estrechamente relacionadas entre sí que con B/Lee/40.

[0081] Los virus de la gripe tienen una nomenclatura convencional que incluye el tipo de virus; las especies de las que se aisló (si no es humano); lugar en el que se aisló; número de aislado; año de aislado; y, sólo para los virus de la gripe A, subtipo HA y NA. Por tanto, B/Yamagata/16/88 era el aislado número 16 de un virus de la gripe humana B tomado en Yamagata (Japón) en 1988.

[0082] Algunas variantes de la gripe A se identifican y nombran según el aislado conocido al que son más similares y, por tanto, se supone que comparten el linaje (p. ej., tipo virus de la gripe de Fujian); según su hospedador habitual (ejemplo virus de la gripe humana); según su subtipo (ejemplo H3N2); y según su patogenia (ejemplo LP, baja patogenia). Por tanto, una gripe de un virus similar al aislado A/Fujian/411/2002(H3N2) se puede denominar gripe de Fujian, gripe humana y gripe H3N2.

[0083] Además, las variantes de la gripe se nombran en ocasiones según la especie (hospedador) para la que la cepa es endémica o está adaptada. Las principales variantes nombradas que usan esta convención son: gripe aviar, gripe humana, gripe porcina, gripe equina y gripe canina. También se han nombrado variantes según su patogenia en aves de corral, especialmente pollos, p. ej., gripe aviar de baja patogenia (LPAI) y gripe aviar de alta patogenia (HPAI). B. Ciclo de vida y estructura

[0084] El ciclo de vida de los virus de la gripe implica en general la unión a receptores de la superficie celular, entrada en la célula y descubrimiento del ácido nucleico vírico, seguido de la replicación de los genes víricos dentro de la célula. Después de la síntesis de nuevas copias de proteínas y genes víricos, estos componentes se ensamblan en partículas de virus descendientes, que a continuación salen de la célula. Diferentes proteínas víricas desempeñan una función en cada una de estas etapas.

[0085] La partícula de gripe A está formada por una envoltura lipídica que encapsula el núcleo vírico. El lado interior de la envoltura está revestido por la proteína de la matriz (M1), mientras que la superficie exterior se caracteriza por dos tipos de espículas de glucoproteína: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). M2, una proteína de canal iónico transmembrana, también forma parte de la envoltura lipídica. Véase, por ejemplo, laFigura 1. La partícula de gripe B comprende una estructura similar.

[0086] La proteína HA, una proteína de membrana trimérica de tipo I, es responsable de la unión a sialiloligosacáridos (oligosacáridos que contienen ácido siálico terminal unido a galactosa) en las glucoproteínas o glucolípidos de la superficie de la célula hospedadora. Esta proteína también es responsable de la fusión entre las membranas vírica y de la célula hospedadora, después de la internalización del virión por endocitosis.

[0087] La neuraminidasa (NA), una proteína de membrana tetramérica de tipo II, es una sialidasa que escinde restos de ácido siálico terminales de los glucoconjugados de las células hospedadoras y la HA y NA, y por tanto se reconoce como enzima destructora de receptores. Esta actividad sialidasa es necesaria para la liberación eficiente de viriones descendientes de la superficie de la célula hospedadora, así como la prevención de la agregación de la descendencia debido a la actividad de unión de las HA víricas con otras glucoproteínas. Por tanto, la actividad de unión al receptor de la HA y la actividad destructora de receptores de la NA probablemente actúen como contrapesos, permitiendo la replicación eficiente de la gripe.

[0088] Los segmentos del genoma están empaquetados en el núcleo de la partícula vírica. El RNP (ARN más nucleoproteína, NP) está en forma helicoidal con tres polipéptidos de polimerasa vírica asociados con cada segmento.

[0089] El ciclo de vida del virus de la gripe comienza con la unión de la HA a los receptores que contienen ácido siálico en la superficie de la célula hospedadora, seguido de endocitosis mediada por receptores (Figura 1). El pH bajo en los endosomas tardíos desencadena un cambio conformacional en la HA, exponiendo de este modo el extremo N de la subunidad HA2 (el denominado péptido de fusión). El péptido de fusión inicia la fusión de la membrana vírica y endosómica, y la proteína de la matriz (M1) y los complejos de RNP se liberan en el citoplasma. Los RNP consisten en la nucleoproteína (NP), que encapsida ARNv, y el complejo de polimerasa vírica, que está formado por las proteínas PA, PB1 y PB2. Los RNP se transportan al núcleo, donde tienen lugar la transcripción y la replicación. El complejo de ARN polimerasa cataliza tres reacciones diferentes: (1) síntesis de un ARNm con una caperuza 5' y una estructura poliA 3', (2) un ARN complementario (ARNc) de longitud completa y (3) ARNv genómico que usa el ADNc como molde. Los ARNv recién sintetizados, NP y proteínas de polimerasa se ensamblan a continuación en RNP, se exportan desde el núcleo y se transportan a la membrana plasmática, donde se produce la gemación de las partículas víricas descendientes. La proteína neuraminidasa (NA) desempeña una función tardía en la infección al eliminar el ácido siálico de los sialiloligosacáridos, liberando de este modo viriones recién ensamblados de la superficie celular y evitando la autoagregación de partículas víricas. Aunque el ensamblaje del virus implica interacciones proteínaproteína y proteína-ARNv, la naturaleza de estas interacciones sigue siendo en gran parte desconocida.

[0090] C. Papel de la proteína M2 y BM2

[0091] Como se ha descrito anteriormente, a lo largo de la membrana vírica de la gripe A se encuentran tres proteínas: hemaglutinina (HA), neuramimidasa (NA) y M2. Los dominios extracelulares (ectodominios) de HA y NA son bastante variables, mientras que el dominio ectodominio de M2 es esencialmente invariante entre los virus de la gripe A. La proteína del canal iónico M2 no afecta a la replicación del genoma vírico, pero es indispensable para la proliferación del virus. Los virus de replicación única (SR) son defectuosos en una proteína viriónica que funciona en la entrada o liberación vírica, tal como la proteína del canal iónico de la gripe A M2 o BM2. Por el contrario, las vacunas de virus vivos atenuados tradicionales contienen múltiples mutaciones en la maquinaria de replicación vírica que dan lugar a un fenotipo muy atenuado. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, en los virus de la gripe A, la proteína M2, que posee actividad de canal iónico, se cree que funciona en un estado temprano en el ciclo de vida vírico entre la penetración en la célula hospedadora y la eliminación de la cubierta del ARN vírico. Una vez que los viriones han experimentado endocitosis, se cree que el canal iónico M2 asociado al virión, un haz de hélices homotetraméricas, permite que los protones fluyan desde el endosoma al interior del virión para alterar las interacciones del complejo de proteína M1-ribonucleoproteína (RNP) lábil al ácido, promoviendo de este modo la liberación de RNP en el citoplasma. Además, entre algunas cepas de gripe cuyas HA se escinden intracelularmente (p. ej., A/peste aviar/Rostock/34), se cree que el canal iónico M2 eleva el pH de la red trans-Golgi, previniendo cambios conformacionales en la HA debido a condiciones de pH bajo en este compartimento. También se ha mostrado que el dominio transmembrana M2 en sí mismo puede actuar como un canal iónico. Se cree que la actividad de canal iónico de la proteína M2 es esencial en el ciclo de vida de los virus de la gripe, porque se ha demostrado que el clorhidrato de amantadina, que bloquea la actividad del canal iónico M2, inhibe la replicación vírica. Sin embargo, no se ha demostrado directamente un requisito para esta actividad en la replicación de los virus de la gripe A. El homólogo funcional de la proteína M2 del virus de la gripe A en los virus de la gripe B es la proteína transmembrana tipo III conocida como BM2.

[0092] D. Mutantes víricos M2 y BM2 como vacunas

[0093] M2SR pertenece a la nueva clase de vacunas contra el virus de replicación única (SR). Los virus SR son defectuosos en una proteína viriónica que funciona en la entrada o liberación vírica, tal como la proteína del canal iónico M2 de la gripe, que no afectan a la replicación del genoma vírico pero son indispensables para la proliferación del virus. Por el contrario, las vacunas tradicionales vivas atenuadas contienen múltiples mutaciones en la maquinaria de replicación vírica que dan lugar a un fenotipo muy atenuado. Por lo tanto, los dos mecanismos diferentes del virus de la vacuna afectan a la cinética de la infección vírica y a la producción de antígenos, que afectan a la protección y a la inducción de las respuestas inmunitarias. Los virus con deficiencia de replicación proporcionan formas únicas de vacunas víricas que combinan la seguridad de una vacuna de virus inactivado y la inmunogenicidad de una vacuna de virus vivos mediante la expresión de productos génicos víricos dentro de las células para que los antígenos se presenten eficientemente por las vías de MHC de clase I y clase II. Los virus de replicación única también pueden activar receptores tipo Toll y otras vías de respuestas inmunitarias innatas, sirviendo de este modo como sus propios adyuvantes. Además, estos virus se pueden usar como herramientas para sondear la función del sistema inmunitario. Estos virus mutantes son defectuosos en una proteína viriónica que funciona después del ensamblaje vírico. Los virus se propagan en células complementarias que expresan el producto génico que falta. En células normales, el ciclo de replicación se produce normalmente y se produce la descendencia de viriones. Sin embargo, estos viriones no son infecciosos, por lo que la infección no se propaga a una segunda ronda de células.

[0095] III. Mutantes víricos M2 y BM2

[0097] En un aspecto, se divulgan virus de la gripe A que albergan una secuencia de ARNv de M2 mutante. Típicamente, dichos mutantes no tienen actividad de canal iónico M2, presentan propiedades de crecimiento atenuadasin vivo, no pueden producir descendencia infecciosa y no son patógenos o muestran una patogenia reducida en sujetos infectados. En otro aspecto, se divulgan virus de la gripe B que albergan una secuencia de ARNv de BM2 mutante. Típicamente, dichos mutantes no tienen actividad de canal iónico BM2, presentan propiedades de crecimiento atenuadasin vivo, no pueden producir descendencia infecciosa y no son patógenos o muestran una patogenia reducida en sujetos infectados. Los virus mutantes son inmunogénicos y, cuando se usan como vacuna, proporcionan protección contra la infección con un virus homólogo de tipo silvestre y/u otro virus patógeno. Adicionalmente, los mutantes M2 y BM2 divulgados en el presente documento son estables y no mutan para expresar un polipéptido M2 o BM2 funcional, independientemente de la célula hospedadora usada. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, la proteína M1 de estos mutantes se produce sin alteración detectable de su función. En algunas realizaciones, los virus que albergan las secuencias de ácidos nucleicos de M2 o BM2 mutantes no pueden replicarse en una célula hospedadora en la que podría propagarse un virus de tipo silvestre correspondiente. A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, en algunas realizaciones, el virus de tipo silvestre se puede cultivar, propagar y replicar en el cultivo de células MDCK, células CHO y/o células Vero, mientras que el virus correspondiente que alberga una secuencia M2 o BM2 mutante no puede crecer, replicarse o propagarse en el mismo tipo de células.

[0099] Como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, el virus mutante M2 o BM2 es estable y no muta ni revierte a una secuencia de tipo silvestre o de tipo no silvestre que codifica para una proteína M2 o BM2 funcional en una célula hospedadora. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el virus mutante M2 o BM2 es estable para 2 pases, 3 pases, 5 pases, 10 pases, 12 pases, 15 pases, 20 pases, 25 pases o más de 25 pases en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula hospedadora sin modificar. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es cualquier célula de mamífero que proporcione M2 de forma estable entrans.En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula huésped modificada, tal como una célula MDCK o Vero que expresa la proteína M2 o BM2.

[0101] En algunas realizaciones, los mutantes M2 o BM2 incluyen una o más sustituciones y/o supresiones de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, las mutaciones se localizan en ácidos nucleicos que codifican uno o más del dominio extracelular de la proteína M2 o BM2, el dominio transmembrana de las proteínas M2 o BM2 y/o la cola citoplasmática de la proteína M2 o BM2. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, una o más mutaciones de ácido nucleico dan lugar a una variante de corte y empalme, uno o más codones de terminación y/o una o más supresiones de aminoácidos del péptido M2 o BM2. En algunas realizaciones, los virus que portan el ácido nucleico M2 o BM2 mutante producen un polipéptido M2 o BM2 no funcional. En algunas realizaciones, los virus que portan el ácido nucleico M2 o BM2 mutante no producen un polipéptido M2 o BM2. En algunas realizaciones, los virus que portan el ácido nucleico M2 o BM2 mutante producen un polipéptido M2 o BM2 truncado.

[0103] A continuación se proporcionan tres mutantes víricos M2 (M2SR-1, M2SR-2 y M2SR-3) en lasTablas 1-3. En las tablas, las letras minúsculas corresponden a la secuencia M2; las letras mayúsculas corresponden a la secuencia M1 y a regiones no codificantes; la secuencia mutante (p. ej., codones de terminación, defecto de corte y empalme) está en negrita, subrayada. Las bases subrayadas (minúsculas) en el mutante M2SR-2 indican la región suprimida en los mutantes M2SR-1 y M2SR-3. Las bases en cursiva minúsculas incluyen regiones de superposición M y M2.

[0104]

[0106] La secuencia del polipéptido M2 producida a partir de este mutante es la siguiente:

[0107]

[0109] No se produce ninguna secuencia de polipéptido M2 a partir de este mutante.

[0110]

[0112] No se produce ninguna secuencia de polipéptido M2 a partir de este mutante.

[0113] En la siguienteTabla 4se proporciona la secuencia de codificación M1 y M2 de tipo silvestre.

[0114]

[0116] A continuación se proporcionan mutantes víricos BM2SR (BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, BM2SR-5, y BM2SR-0) en laTabla 5.

[0117]

[0118] (continuación)

[0119]

[0120] (continuación)

[0121]

[0122] (continuación)

[0123]

[0124] (continuación)

[0126]

[0129] El segmento genómico 7 de la gripe B expresa dos principales polipéptidos que son requeridos por el virus para su replicación, la proteína de matriz BM1 y el canal de protones BM2. La expresión de los polipéptidos BM1 y BM2 está regulada, en parte, por un sitio de desfase de traducción del motivo pentanucleotídico que está entre la unión entre los ORF de BM1 y BM2. El motivo pentanucleotídico, TAATG, contiene tanto un codón de terminación TAA para la interrupción de la traducción de M1 como un codón de iniciación ATG para el inicio de M2 en un marco de lectura alternativo 1. Se ha demostrado que este motivo pentanucleotídico y secuencias flanqueadoras son importantes para la regulación de la expresión de la proteína M1.

[0131] En laTabla 6se proporciona el segmento 7 de la gripe B de tipo silvestre que muestra las secuencias de codificación BM1 y BM2 y el motivo pentanucleotídico en negrita y subrayado.

[0132]

[0134] IV. Sistema de producción de virus basado en células

[0135] A. Producción de virus mutantes de "primera generación"

[0136] El virus mutante, tales como los que portan el ácido nucleico M2 mutante, puede ser generado por genética inversa basada en plásmidos como se describe en Neumannet al.,Generation of influenza A viruses entirely from clone cDNAs,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350 (1999). El virus mutante, tal como los que portan el ácido nucleico BM2 mutante, puede generarse por medios similares. En resumen, las células hospedadoras eucariotas se transfectan con uno o más plásmidos que codifican los ocho ARN víricos. Cada secuencia de ARN vírico está flanqueada por un promotor de ARN polimerasa I y un terminador de ARN polimerasa I. Cabe destacar que, el ARN vírico que codifica la proteína M2 incluye la secuencia de ácido nucleico M2 mutante. La célula hospedadora se transfecta adicionalmente con uno o más plásmidos de expresión que codifican las proteínas víricas (p. ej., polimerasas, nucleoproteínas y proteínas estructurales), incluyendo una proteína M2 de tipo silvestre. La transfección de la célula hospedadora con los plásmidos de ARN vírico da lugar a la síntesis de los ocho ARN víricos de la gripe, uno de los cuales alberga la secuencia M2 mutante. Las polimerasas y nucleoproteínas víricas cotransfectadas ensamblan los ARN víricos en RNPv funcionales que se replican y transcriben, formando en última instancia el virus de la gripe infecciosa que tiene una secuencia de ácido nucleico M2 mutante, teniendo aún un polipéptido M2 funcional incorporado en la envoltura lipídica vírica.

[0137] Los métodos alternativos para producir un virus mutante de "primera generación" incluyen un sistema de transfección de ribonucleoproteína (RNP) que permite el reemplazo de genes del virus de la gripe con moléculas de ARN recombinante generadasin vitro, como se describe en Enami y Palese,High-efficiency formation of influenza virus transfectants,J. Virol.65(5):2711-2713.

[0138] Se sintetiza el ARN víricoin vitroy los transcritos de ARN están recubiertos con nucleoproteína (NP) vírica y proteínas de polimerasa que actúan como RNP biológicamente activos en la célula transfectada como se demostró en Luytjeset al.,Amplification, expression, and packaging of a foreign gene by influenza virus,Cell 59:1107-1113.

[0139] El método de transfección de RNP se puede dividir en cuatro etapas: 1) Preparación de ARN: el ADN plasmídico que codifica un segmento del virus de la gripe se transcribe en ARN de sentido negativo en una reacción de transcripciónin vitro; 2) Encapsidación del ARN: el ARN transcrito se mezcla después con NP purificada en gradiente y proteínas de polimerasa aisladas del virus de la gripe interrumpido para formar un complejo de RNP biológicamente activo; 3) Transfección y rescate del ARN encapsidado: la ribonucleocápsida artificial se transfecta a las células previamente infectadas con un virus auxiliar de la gripe que contiene un gen diferente del que se está rescatando; el virus auxiliar amplificará el ARN transfectado; 4) Selección del gen transfectado: debido a que tanto el virus auxiliar como el transfectante que contiene el gen rescatado están en el sobrenadante del cultivo, es necesario un sistema de selección adecuado que use anticuerpos para aislar el virus que porta el gen transfectado.

[0141] El sistema de selección permite la generación de nuevos virus de gripe transfectantes con características biológicas y moleculares específicas. La selección de anticuerpos contra una proteína de la superficie diana puede usarse a continuación para la selección positiva o negativa.

[0143] Por ejemplo, un virus transfectante o mutante que contiene un gen M2 que no expresa una proteína M2 puede cultivarse en una línea celular de mamífero adecuada que se ha modificado para expresar de manera estable la proteína M2 funcional de tipo silvestre. Para prevenir o inhibir la replicación del virus auxiliar que expresa el gen M2 de tipo silvestre y, por lo tanto, la proteína M2e en la superficie de la membrana, pueden usarse anticuerpos contra M2e. Dichos anticuerpos están disponibles en el mercado e inhibirían la replicación del virus auxiliar y permitirían que el virus transfectante/mutante que contiene el M2 mutante crezca y se enriquezca en el sobrenadante. La inhibición de la replicación del virus de la gripe por los anticuerpos de M2e se ha descrito previamente enInfluenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions,J Virol 62:2762-2772 (1988) y Treanoret al,Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice,J. Virol.64:1375-1377 (1990).

[0145] Adicionalmente o como alternativa, se pueden usar los mismos anticuerpos para "capturar" el virus auxiliar y permitir el enriquecimiento del transfectante. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para revestir el fondo de una placa de cultivo tisular o se pueden usar en una matriz de columna para permitir el enriquecimiento del transfectante en el sobrenadante o eluido.

[0147] El virus transfectante puede cultivarse en células que expresan M2 en placas de pocillos múltiples mediante dilución límite y a continuación identificarse y clonarse, por ejemplo, creando placas de réplica. Por ejemplo, la mitad de una alícuota de un pocillo dado de la placa de múltiples pocillos que contiene el virus cultivado se puede usar para infectar células MDCK y la otra mitad para infectar células MDCK que expresan la proteína M2. Tanto el virus transfectante como el virus auxiliar crecerán en células MDCK que expresan la proteína M2. Sin embargo, solo el virus auxiliar crecerá en células MDCK convencionales, lo que permitirá identificar el pocillo en la placa de múltiples pocillos que contiene el transfectante. El virus transfectante se puede purificar adicionalmente en placa en las células que expresan la proteína M2.

[0149] B. Propagación de mutantes víricos

[0151] En algunas realizaciones, los mutantes víricos descritos en el presente documento se mantienen y pasan en células hospedadoras. A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, las células hospedadoras ilustrativas adecuadas para el crecimiento de mutantes víricos de la gripe, tales como mutantes víricos de la gripe A incluyen cualquier cantidad de células eucariotas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, células renales caninas Madin-Darby (MDCK), células de simio tales como células de mono verde africano (p. ej., células Vero), células CV-1 y células de riñón de macaco de la India (p. ej., células LLcomk.2), células bovinas (p. ej., células MDBK), células de cerdo, células de hurón (p. ej., células pulmonares de visón), células BK-1, células de roedores (p. ej., células de ovario de hámster chino), células humanas, p. ej., células retinianas humanas embrionarias (p. ej., PER-C6®), células renales embrionarias humanas 293T y células aviares que incluyen fibroblastos embrionarios.

[0153] Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, la célula hospedadora eucariota se modifica para mejorar la producción vírica,p. ej.,mejorando la infección vírica de la célula hospedadora y/o mejorando la tasa de crecimiento vírico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula hospedadora se modifica para expresar, o tener mayor expresión, de ácido siálico con enlaces 2,6 en la superficie celular, permitiendo una infección más eficiente y eficaz de estas células por virus de la gripe A mutantes o de tipo silvestre. Véanse, por ejemplo, publicación de patente de EE.UU. N.º 2010-0021499 y patente de EE.UU. N.º 7.176.021. Por tanto, en algunas realizaciones ilustrativas, se usan células de ovario de hámster chino (células CHO) y/o células Vero modificadas para expresar al menos una copia de un gen de 2,6-sialiltransferasa (ST6GAL 1). A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, la secuencia génica de beta-galatosamida alfa-2,6-sialiltransferasa ST6 deHomo sapiensindicada por el número de referencia BC040009.1, es un ejemplo de un gen de ST6Gal que puede integrarse y expresarse en una célula CHO. Una o más copias de un polinucleótido que codifica un producto génico de ST6Gal I funcional se pueden introducir por ingeniería genética en una célula. Es decir, se pueden usar células que se han transformado de manera estable para expresar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 copias de un gen de ST6Gal I. Un solo casete de expresión puede incluir una o más copias del gen de ST6Gal I a expresar, que está ligado operativamente a elementos reguladores, tales como promotores, potenciadores y secuencias terminadoras y de señal de poliadenilación, para facilitar la expresión del gen de ST6Gal I o sus copias. Alternativamente, se puede diseñar por ingeniería genética un único casete de expresión para expresar una copia de un gen de ST6Gal I e integrarse múltiples casetes de expresión en el genoma de una célula hospedadora. En consecuencia, en algunas realizaciones, se incorpora al menos un gen de ST6Gal I en el genoma de una célula hospedadora, de manera que la célula exprese el gen de ST6Gal I y su producto proteico enzimático. Dependiendo del número de copias, una sola célula hospedadora puede expresar muchas proteínas del gen de ST6Gal I funcionales.

[0155] Los vectores adecuados para clonar, transfectar y producir líneas celulares modificadas estables bien son conocidos en la técnica. Un ejemplo no limitante incluye los vectores pcDNA3.1 (Invitrogen).

[0157] Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, la célula hospedadora eucariota se modifica para producir una versión de tipo silvestre de un gen vírico mutante, proporcionando de este modo el gen al virus entrans. Por ejemplo, una cepa vírica que alberga una proteína M2 mutante puede presentar una tasa de crecimiento mejorada (p. ej., mayor producción vírica) cuando se pasa a células hospedadoras que producen la proteína M2 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la cepa vírica a que alberga una proteína M2 mutante puede no crecer o replicarse en una célula que no expresa un gen M2 de tipo silvestre. Además, dichas células hospedadoras pueden ralentizar o prevenir la reversión vírica a una secuencia de M2 funcional, porque, por ejemplo, no existe una presión selectiva para la reversión en dicho hospedador.

[0159] Se conocen bien en la técnica métodos para producir tanto vectores de expresión como células hospedadoras modificadas. Por ejemplo, se puede preparar un vector de expresión de M2 situando la secuencia de ácido nucleico M2 (secuencia de ORF de M2; este es el codón de inicio de M2 "de tipo silvestre" para el codón de terminación (Tabla 7)) a continuación en un vector de expresión eucariota. Se pueden emplear métodos similares para BM2, cuya secuencia se proporciona a continuación en laTabla 7.

[0162]

[0165]

[0168] Las células hospedadoras (p. ej., células MDCK) se pueden transfectar después mediante métodos conocidos en la técnica, p. ej., usando reactivos y equipos disponibles en el mercado, tales como TransIT® LT1 (Mirus Bio, Madison, WI). A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, las células pueden seleccionarse y probarse para la expresión de M2 mediante cotransfección con un marcador detectable o un marcador seleccionable (p. ej., resistencia a higromicina) y/o mediante cribado, por ejemplo, con inmunotinción indirecta usando un anticuerpo de M2. La expresión de M2 se puede determinar mediante inmunotinción indirecta, citometría de flujo o ELISA.

[0170] A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, las células de riñón embrionario humano 293T y las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10 % y en medio esencial mínimo (MEM) que contenía suero de ternero neonato al 5 %, respectivamente. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en un CO<2>al 5 %. Se establecieron células MDCK resistentes a higromicina que expresan de manera estable la proteína M2 de A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) mediante cotransfección con el plásmido pRHyg, que contiene el gen de resistencia a higromicina y el plásmido pCAGGS/M2, expresando la proteína M2 de longitud completa, en una relación de 1:1. El clon de células MDCK estable (M2CK) que expresa M2 se seleccionó en medio que contenía 0,15 mg/ml de higromicina (Roche, Mannheim, Alemania) mediante el cribado con inmunotinción indirecta usando un anticuerpo monoclonal anti-M2 (14C2) (Iwatsukiet al., JVI, 2006, vol.80, N.º 1, págs. 5233-5240). Las células M2CK se cultivaron en MEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y 0,15 mg/ml de higromicina. En las células M2CK, los niveles de expresión y localización de M2 fueron similares a los de las células infectadas por virus (datos no mostrados). Las células BM2CK que expresan BM2 se pueden fabricar de manera similar, y las células Vero que expresan M2 o BM2 se pueden fabricar de manera similar.

[0171] En algunas realizaciones, las células y los mutantes víricos se cultivan y propagan mediante métodos bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, en algunas realizaciones, se cultivan células hospedadoras en presencia de MEM complementado con suero bovino fetal al 10 %. Las células que expresan M2 o BM2 se infectan a un MOI de 0,001 mediante lavado con PBS seguido de adsorción de virus a 37 °C. En algunas realizaciones, se añaden medios de crecimiento vírico que contienen tripsina/TPCK y las células se incuban durante 2-3 días hasta que se observa un efecto citopático.

[0172] A este respecto, se han desarrollado sistemas de biorreactores desechables para células de mamíferos, con o sin virus, cuyos beneficios incluyen una preparación más rápida de las instalaciones y un riesgo reducido de contaminación cruzada. Las células descritas en el presente documento, por ejemplo, se pueden cultivar en bolsas desechables tales como las de Stedim, bolsas Bioeaze de SAFC Biosciences, HybridBagTM de Cellexus Biosytems o biorreactores de un solo uso de HyClone o Celltainer de Lonza. Los biorreactores pueden tener formatos de tamaño de 1 l, 10 l, 50 l, 250 l, 1000 l. En algunas realizaciones, las células se mantienen en suspensión en medio optimizado sin suero, exento de productos animales. El sistema puede ser un sistema semicontinuo donde un cultivo se puede expandir en una sola bolsa de 1 l a 10 l, por ejemplo, o un sistema de perfusión que permite el aporte constante de nutrientes evitando al mismo tiempo la acumulación de subproductos potencialmente tóxicos en el medio de cultivo. Para el almacenamiento a largo plazo, el virus mutante se puede almacenar como reservas congeladas.

[0173] V. Vacunas y método de administración

[0174] A. Composiciones inmunogénicas y vacunas

[0175] Hay diversos tipos diferentes de vacunas que se pueden preparar a partir del sistema de producción de virus basado en células desvelado en el presente documento. La presente divulgación incluye, aunque no de forma limitativa, la fabricación y producción de vacunas de virus vivos atenuados, vacunas de replicación única, vacunas de replicación defectuosa, vacunas de vectores víricos, vacunas de virus inactivados, vacunas de virus completos, vacunas de virus divididos, vacunas de virus virosómicos, vacunas de antígeno de superficie vírica y combinaciones de las mismas. Por tanto, existen numerosas vacunas capaces de producir una respuesta inmunitaria protectora específica para diferentes virus de la gripe donde las formulaciones adecuadas de cualquiera de estos tipos de vacunas son capaces de producir una respuesta inmunitaria, p. ej., una respuesta inmunitaria sistémica. Las vacunas de virus vivos atenuados tienen la ventaja de que también pueden estimular la inmunidad mucosa local en las vías respiratorias.

[0176] En algunas realizaciones, los antígenos de vacuna usados en las composiciones descritas en el presente documento son antígenos "directos", es decir,no se administran como ADN, sino que son los propios antígenos. Dichas vacunas pueden incluir un virus completo o solo parte del virus, tales como, pero sin limitación, polisacáridos víricos, ya sea que estén solos o conjugados con elementos transportadores, tales como proteínas transportadoras, microorganismos completos vivos atenuados, microorganismos inactivados, péptidos y proteínas recombinantes, glucoproteínas, glucolípidos, lipopéptidos, péptidos sintéticos o microorganismos rotos en el caso de las vacunas denominadas vacunas "divididas".

[0177] En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna de virión completa. Una vacuna de virión completa puede concentrarse por ultrafiltración y después purificarse por centrifugación zonal o por cromatografía. Típicamente, el virión se inactiva antes o después de la purificación usando formalina o beta-propiolactona, por ejemplo.

[0178] En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna subunitaria, que comprende glucoproteínas purificadas. Dicha vacuna se puede preparar de la siguiente manera: usando suspensiones víricas fragmentadas por tratamiento con detergente, se purifican los antígenos de superficie, por ejemplo, mediante ultracentrifugación. Por tanto, las vacunas subunitarias contienen principalmente proteína HA y también NA. El detergente usado puede ser un detergente catiónico, por ejemplo, tal como bromuro de hexadecil trimetil amonio, un detergente aniónico tal como desoxicolato de amonio; o un detergente no iónico tal como el comercializado con el nombre TRITON X100. La hemaglutinina también se puede aislar después del tratamiento de los viriones con una proteasa tal como bromelina, y después purificarse por métodos convencionales.

[0179] En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna dividida, que comprende viriones que se han sometido a tratamiento con agentes que disuelven los lípidos. Se puede preparar una vacuna dividida de la siguiente manera: una suspensión acuosa del virus purificado obtenido como anteriormente, inactivado o no, se trata, con agitación, mediante disolventes lipídicos tales como éter etílico o cloroformo, asociados con detergentes. La disolución de los lípidos de la envoltura vírica da lugar a la fragmentación de las partículas víricas. Se recupera la fase acuosa que contiene la vacuna dividida, constituida principalmente por hemaglutinina y neuraminidasa con su entorno lipídico original eliminado, y el núcleo o sus productos de degradación. A continuación, las partículas infecciosas residuales se inactivan si aún no se ha hecho.

[0180] En algunas realizaciones, se proporcionan vacunas inactivadas contra el virus de la gripe. En algunas realizaciones, las vacunas inactivadas se preparan mediante inactivación del virus usando métodos conocidos, tales como, aunque no de forma limitativa, tratamiento con formalina o β-propiolactona. Los tipos de vacunas inactivadas que se pueden usar en la invención pueden incluir vacunas de virus completo (WV) o vacunas subviriónicas (SV) (divididas). La vacuna WV contiene virus inactivados e intactos, mientras que la vacuna SV contiene virus purificado alterado con detergentes que solubilizan la envoltura vírica que contiene lípidos, seguido de inactivación química del virus residual. Adicionalmente o como alternativa, en algunas realizaciones, se proporcionan vacunas de virus de la gripe atenuados vivos. Dichas vacunas pueden usarse para prevenir o tratar la infección por el virus de la gripe, según las etapas del método conocidas.

[0181] En algunas realizaciones, la atenuación se logra en una sola etapa mediante la transferencia de genes atenuados de un virus donante atenuado a un virus aislado o reordenado según métodos conocidos (véase, p. ej., Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2, 174 (1993)). En algunas realizaciones, un virus se atenúa mediante la mutación de una o más secuencias de ácido nucleico víricas, lo que da lugar a un virus mutante. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico vírico mutante codifica un producto proteico defectuoso. En algunas realizaciones, el producto proteico tiene una función disminuida o no tiene función. En otras realizaciones, no se produce ningún producto proteico a partir del ácido nucleico vírico mutante.

[0182] El virus de replicación única descrito en el presente documento puede formularse y administrarse según métodos conocidos, como una composición inmunogénica (p. ej., como una vacuna) para inducir una respuesta inmunitaria en un animal, p. ej., un ave y/o un mamífero. Se conocen bien en la técnica métodos para determinar si dichas vacunas atenuadas o inactivadas han mantenido una antigenicidad similar a la del aislado clínico o una cepa de alto crecimiento procedente del mismo. Dichos métodos conocidos incluyen el uso de antisueros o anticuerpos para eliminar virus que expresan determinantes antigénicos del virus donante; selección química (p. ej., amantadina o rimantidina); actividad e inhibición de HA y NA; y análisis de ADN (tal como hibridación de sonda o PCR) para confirmar que los genes donantes que codifican los determinantes antigénicos (p. Ej., genes HA o NA) u otras secuencias mutantes (p. ej., M2) no están presentes en los virus atenuados. Véanse,p. ej., Robertsonet al.,Giomale di Igiene e Medicina Preventiva, 29, 4 (1988); Kilbourne, Bull. M2 World Health Org., 41, 643 (1969); y Robertsonet al., Biologicals, 20, 213 (1992). En algunas realizaciones, la vacuna incluye un virus de la gripe de replicación única que carece de expresión de una proteína M2 funcional. En algunas realizaciones, el virus mutante se replica bien en células que expresan proteínas M2, pero en las células de tipo silvestre correspondientes, expresa proteínas víricas sin generar viriones descendientes infecciosos.

[0183] Las composiciones farmacéuticas de la presente tecnología, adecuadas para administración intranasal, administración intradérmica, inoculación o para administración parenteral u oral, comprenden virus de la gripe atenuados o inactivados, y opcionalmente pueden comprender además soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Las composiciones pueden comprender además agentes auxiliares o excipientes, como es conocido en la técnica. Véanse,p. ej., Berkowet al., The Merck Manual, 15ª edición, Merck and Co., Rahway, N.J. (1987); Goodmanet al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Octava edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y. (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Tercera edición, ADIS Press, LTD., Williams y Wilkins, Baltimore, Md. (1987); y Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, Quinta edición, Appleton y Lange, Norwalk, Conn. (1992).

[0184] En algunas realizaciones, las preparaciones líquidas para suministro intranasal pueden adoptar la forma de soluciones o suspensiones y pueden contener excipientes convencionales tales como agentes de ajuste de tonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio, dextrosa o manitol; conservantes, por ejemplo, cloruro de benzalconio, tiomersal, alcohol feniletílico; y otros agentes de formulación tales como agentes de suspensión, tamponamiento, estabilizantes y/o dispersantes. En algunas realizaciones, las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y/o emulsiones acuosas o no acuosas estériles, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la técnica. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Pueden usarse vehículos o vendajes oclusivos para aumentar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorción de antígenos. Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden comprender en general una solución de liposomas que contienen la forma de dosificación líquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica, tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, dichas composiciones también pueden incluir adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes o perfumantes.

[0185] Cuando se usa una composición de la presente invención para la administración a un individuo, puede comprender además sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia de la composición. Para vacunas, se pueden usar adyuvantes (sustancias que aumentan una respuesta inmunitaria específica). Normalmente, el adyuvante y la composición se mezclan antes de la presentación al sistema inmunitario, o se presentan por separado, pero en el mismo sitio del organismo que se inmuniza.

[0186] En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica multivalente que comprende virus de al menos dos cepas de gripe. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica multivalente comprende: (a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde los virus de la gripe A genomodificados comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y (b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

[0187] En algunas realizaciones, los virus de la gripe A se seleccionan del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, y los virus de la gripe B se seleccionan del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria.

[0188] En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica tetravalente que comprende: dos virus M2SR de la gripe A deficientes en M2: A/California/07/2009 (H1N1) y A/Brisbane/10/2007 (H3N2), ambos de los cuales comprenden un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1; y dos virus de la gripe B BM2SR deficientes en BM2: B/Brisbane/60/2008 (Victoria) y B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata), ambos de los cuales comprenden un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, esta composición inmunogénica se formula como una vacuna tetravalente contra la gripe.

[0189] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria contra la gripe A y la gripe B, que comprende administrar la composición a un sujeto que lo necesite, una composición inmunogénica multivalente que comprende: (a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde los virus de la gripe A genomodificados comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y (b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

[0190] En algunas realizaciones, los virus de la gripe A se seleccionan del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, y los virus de la gripe B se seleccionan del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria.

[0191] En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica de la presente invención para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria contra la gripe A y la gripe B, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite la composición inmunogénica que comprende: dos virus M2SR de la gripe A deficientes en M2: A/California/07/2009 (H1N1) que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1 y A/Brisbane/10/2007 (H3N2) que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1; y dos virus de la gripe B BM2SR deficientes en BM2: B/Brisbane/60/2008 (Victoria) que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11 y B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata) que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, esta composición inmunogénica se formula como una vacuna tetravalente contra la gripe.

[0192] En algunas realizaciones, la composición inmunogénica formulada como vacuna contra la gripe tetravalente como se describe en el presente documento presenta una virulencia atenuada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ratones infectados con la vacuna tetravalente tienen una esperanza de vida promedio aumentada después de la infección tras la exposición a la gripe A en comparación con los ratones infectados con vacunas monovalentes de gripe B solo. En algunas realizaciones, los ratones infectados con la vacuna tetravalente tienen una esperanza de vida promedio aumentada después de la infección tras la exposición a la gripe B en comparación con los ratones infectados con vacunas monovalentes de gripe A solo.

[0193] Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender además o adicionalmente al menos un compuesto quimioterapéutico, p. ej., para terapia génica, un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio o un agente inmunoestimulante, o agentes antivíricos incluyendo, aunque no de forma limitativa, gammaglobulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol, interferón-α, interferón-β, interferón-γ, factor de necrosis tumoral α, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampina, ribavirina, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxinucleósidos, un inhibidor de la proteasa o ganciclovir.

[0194] La composición también puede contener cantidades variables pero pequeñas de formaldehído sin endotoxinas y conservantes, que se ha descubierto que son seguros y no contribuyen a efectos indeseables en el organismo al que se administra la composición de la invención.

[0195] B. Administración

[0196] Una composición inmunogénica (p. ej., una vacuna) como se describe en el presente documento puede destinarse para su uso en un método en el que se administre por cualquiera de las vías que se usan o recomiendan habitualmente para las vacunas: vía parenteral, vía mucosa, y puede estar en diversas formas: líquido inyectable o pulverizable, formulación liofilizada o secada por atomización o secada al aire,etc.Las vacunas pueden administrarse mediante jeringa o mediante un inyector sin aguja para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. Las vacunas también se pueden administrar por medio de un nebulizador capaz de suministrar un polvo seco o un aerosol líquido a las membranas mucosas, ya sean nasales, pulmonar, vaginales o rectales.

[0198] Una vacuna como se desvela en el presente documento puede conferir resistencia a una o más cepas de la gripe mediante inmunización pasiva o inmunización activa. En inmunización activa, una composición de vacuna viva inactivada o atenuada se administra de forma profiláctica a un hospedador (p. ej., un mamífero) y la respuesta inmunitaria del hospedador a la administración protege contra infecciones y/o enfermedades. Para la inmunización pasiva, los antisueros inducidos pueden recuperarse y administrarse a un receptor sospechoso de tener una infección causada por al menos una cepa del virus de la gripe.

[0200] La presente invención incluye, por tanto, una composición inmunogénica de la presente invención para su uso en métodos de prevención o atenuación de una enfermedad o trastorno, p. ej., infección por al menos una cepa del virus de la gripe. Como se utiliza en el presente documento, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si su administración da lugar a la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un síntoma o afección de la infección o la inmunidad total o parcial del individuo a la enfermedad.

[0202] Al menos un virus de la gripe inactivado o atenuado, o composición del mismo, de la presente invención se puede administrar por cualquier medio que logre los fines previstos, usando una composición farmacéutica como se ha descrito previamente. Por ejemplo, la administración de tal composición puede ser mediante diversas vías parenterales tales como vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral o transdérmica. La administración parenteral puede ser mediante inyección en embolada o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica como se describe en el presente documento está destinada para su uso en un método en el que se administra por aplicación intramuscular o subcutánea.

[0204] En algunas realizaciones, se proporciona una composición inmunogénica de la presente invención para su uso en una pauta terapéutica para impedir, suprimir o tratar una patología relacionada con el virus de la gripe, que comprende la administración de una cantidad eficaz de la composición inmunogénica como composición de vacuna, administrada como un único tratamiento o repetida como dosificaciones de mejora o refuerzo, durante un periodo de hasta e incluyendo entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, una vacuna contra la gripe como se describe en el presente documento está destinada para su uso en un método en el que se administra anualmente.

[0206] De acuerdo con la presente tecnología, una "cantidad eficaz" de una composición de vacuna es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Se entiende que, en algunas realizaciones, la dosis efectiva dependerá de la edad, el sexo, el estado de salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. No se pretende que los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación sean limitantes y representan intervalos de dosis ilustrativos. Por tanto, en algunas realizaciones, la dosificación se puede adaptar al sujeto individual, tal como entiende y puede determinar un experto en la materia. La dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<1>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<2>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<3>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<4>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<5>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<6>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<7>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<8>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<9>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 10<9>-10<10>unidades formadoras de placas (UFP)/kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. En algunas realizaciones, la dosis de una vacuna de virus atenuado para un adulto mamífero (p. ej., humano) puede ser superior a 10<10>unidades formadoras de placa (UFP)/kg. La dosis de vacuna inactivada puede variar de aproximadamente 0,1 a 200, p. ej., 50 µg de proteína hemaglutinina. Sin embargo, la dosis debería ser una cantidad segura y eficaz determinada por métodos convencionales, usando las vacunas existentes como punto de partida.

[0207] C. Suministro intracutáneo

[0209] Las vacunas vivas contra la gripe se suministran tradicionalmente por vía intranasal para imitar la vía natural de infección y promover una respuesta inmunitaria similar a la de la infección por virus natural. Como alternativa, se divulgan en el presente documento métodos de suministro intradérmico que implican el uso de un dispositivo de microagujas novedoso para aprovechar los beneficios inmunológicos del suministro intradérmico. En algunas realizaciones, un virus atenuado (p. ej., un mutante vírico M2 y/o BM2) está destinado para su uso en un método donde se usa en una composición de vacuna para administración intradérmica. En algunas realizaciones, los mutantes víricos M2 y BM2, que no producen virus descendientes infecciosos, se proporcionan en una vacuna tetravalente. Por tanto, prácticamente se elimina cualquier potencial de reordenamiento con virus de la gripe de tipo silvestre en circulación.

[0210] En realizaciones divulgadas en el presente documento, la composición inmunogénica de la presente invención está destinada para su uso en un método que comprende el suministro intradérmico (intracutánea) de la vacuna en la piel. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica de la presente invención está destinada para su uso en un método en donde el suministro intradérmico se realiza mediante un dispositivo de suministro de microagujas. Como se divulga en el presente documento, el suministro intracutáneo tiene numerosas ventajas. Por ejemplo, la inmunogenicidad de la vacuna aumenta al desencadenar el potencial inmunológico del sistema inmunitario de la piel. La vacuna tiene acceso directo a las potentes células dendríticas presentadoras de antígenos de la piel, es decir,células de Langerhans epidérmicas y células dendríticas dérmicas. Las células cutáneas producen señales proinflamatorias que mejoran la respuesta inmunitaria a los antígenos introducidos a través de la piel. Además, el sistema inmunitario de la piel produce anticuerpos específicos de antígeno y respuestas inmunitarias celulares. El suministro intradérmico permite ahorrar dosis de vacuna, es decir,pueden ser eficaces dosis menores de antígeno, a la luz de los factores anteriores, cuando se suministra por vía intracutánea.

[0212] Y, debido a que la vacuna se suministra a la piel a través de la matriz de microagujas del dispositivo, se reduce el riesgo de pinchazos accidentales con la aguja y el suministro de la vacuna intracutánea a través de una matriz de microagujas es relativamente indolora en comparación con las inyecciones intramusculares con aguja y jeringa convencionales.

[0214] Los dispositivos de microagujas son conocidos en la técnica, son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los descritos en las solicitudes de patente de los Estados Unidos publicadas 2012/0109066, 2011/0172645, 2011/0172639, 2011/0172638, 2011/0172637 y 2011/0172609. Se pueden elaborar dispositivos de microagujas, por ejemplo, mediante fabricación a partir de láminas de acero inoxidable (p. ej., Trinity Brand Industries, Georgia; SS 304; 50 µm de espesor) mediante grabado en húmedo. En algunas realizaciones, las microagujas individuales tienen una longitud de entre 500 µm y 1000 µm, p. ej., aproximadamente 750 µm, y una anchura de entre aproximadamente 100 µm y 500 µm, p. ej., aproximadamente 200 µm. A continuación, se puede aplicar la vacuna a las microagujas como recubrimiento. A modo de ejemplo, aunque no de forma excluyente, una solución de recubrimiento puede incluir sal sódica de carboximetilcelulosa al 1 % (p/v) (de baja viscosidad, grado USP; Carbo-Mer, San Diego CA), Lutrol F-68 NF al 0,5 % (p/v) (BASF, Mt. Olive, NJ) y el antígeno (p. ej., proteína HA soluble a 5 ng/ml; virus vivos atenuados tales como los virus mutantes M2 y BM2 descritos en el presente documento,etc.).Para alcanzar una concentración de vacuna mayor, la solución de recubrimiento se puede evaporar durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente (~23 °C). El recubrimiento se puede realizar mediante un proceso de recubrimiento por inmersión. La cantidad de vacuna por fila de microagujas se puede determinar sumergiendo las microagujas en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos y analizando el antígeno mediante métodos conocidos en la técnica.

[0215] En algunas realizaciones, se usa un dispositivo de microagujas que está hecho principalmente de polipropileno y piezas de primer corte de acero inoxidable que encajan entre sí con ajustes por presión sencillos y sellos térmicos. En algunas realizaciones, el dispositivo es completamente independiente e incluye la vacuna, un mecanismo de bomba, un mecanismo de activación y una unidad de microagujas. Estos componentes están ocultos dentro de una cubierta de plástico. Con el dispositivo, la infusión de la vacuna se inicia presionando un botón de activación. Al presionar el botón se insertan simultáneamente las microagujas en la piel y se inicia el mecanismo de bombeo que ejerce presión sobre el recipiente principal del fármaco. Cuando un mecanismo de muelle ejerce suficiente presión sobre el depósito de la vacuna, la vacuna comienza a fluir a través de la matriz de microagujas y hacia la piel. En algunas realizaciones, el suministro de la dosis de la vacuna se completa en aproximadamente 2 minutos después de la activación del dispositivo. Una vez completada la infusión, el dispositivo se retira suavemente de la piel.

[0217] En algunas realizaciones, la composición inmunogénica de la presente invención está destinada para su uso en un método en donde la administración intracutánea de una composición inmunogénica (p. ej., vacuna tetravalente) se proporciona usando un dispositivo de microagujas. En algunas realizaciones, el dispositivo de microagujas comprende un mecanismo de punción y una capa de composición inmunogénica que comprende una pluralidad de microagujas capaces de perforar la piel y permitir la administración intracutánea de una composición inmunogénica. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica de la presente invención está destinada para su uso en un método que comprende presionar el mecanismo de punción. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica (p. ej., vacuna tetravalente) comprende un virus que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína M2 y BM2 mutante que es expresada o una proteína mutante M2 y BM2 que no es expresada; en donde la proteína M2 mutante expresada comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y la proteína BM2 comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la matriz de microagujas se sitúa inicialmente dentro de la carcasa de un dispositivo y, al accionar una palanca, permite que las microagujas se extiendan a través del fondo del dispositivo y se inserten en la piel, permitiendo de este modo la infusión del líquido de vacuna en la piel.

[0218] El dispositivo de suministro descrito en el presente documento se puede utilizar para suministrar cualquier sustancia que se pueda desear. En una realización, la sustancia para suministrar es un fármaco y el dispositivo de suministro es un dispositivo de suministro de fármacos configurado para suministrar el fármaco a un sujeto. Como se utiliza en el presente documento, se entiende que el término "fármaco" incluye cualquier sustancia suministrada a un sujeto para cualquier fin terapéutico, preventivo o medicinal (p. ej., vacunas, productos farmacéuticos, nutrientes, nutracéuticos, etc.). En una realización de este tipo, el dispositivo de suministro de fármacos es un dispositivo de suministro de vacunas configurado para suministrar una dosis de vacuna a un sujeto. En una realización, el dispositivo de suministro se configura para suministrar una vacuna contra la gripe. Las realizaciones analizadas en el presente documento se refieren principalmente a un dispositivo configurado para suministrar una sustancia por vía transcutánea. En algunas realizaciones, el dispositivo se puede configurar para suministrar una sustancia directamente a un órgano distinto de la piel.

[0219] Ejemplos

[0220] Como se ha descrito anteriormente, la presente solicitud proporciona una composición inmunogénica tetravalente novedosa que comprende cepas mutantes de la gripe A y la gripe B útiles para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra la gripe A y la gripe B. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar métodos para provocar una respuesta inmunitaria con los mutantes formulados como vacunas multivalentes y métodos para evaluar la virulencia atenuada de las formulaciones multivalentes.

[0221] Los siguientes ejemplos se proporcionan solo como ilustración y no como limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente iguales o similares. No se deberá interpretar que los ejemplos limitan el ámbito de la presente tecnología, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

[0222] Ejemplo 1: Los mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra el virus de la gripe B formulado como vacuna tetravalente

[0223] Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos cuando se formulan como una vacuna tetravalente. Las cuatro vacunas monovalentes siguientes se formularon juntas: A/California/07/2009 (H1N1) que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1, A/Brisbane/10/2007 (H3N2) que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1, B/Brisbane/60/2008 (Victoria) que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11, y B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata) que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11. Se mezcla 1x10<6>TCID<50>de cada monovalente conjuntamente de tal manera que cada dosis tetravalente sea de 4x10<6>TCID<50>por ratón. La secuencia de cada una de las construcciones mutantes M2SR-1 y BM2SR-0 se proporciona en lasTablas 1y5.

[0224] Se inoculó intranasalmente a ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad la formulación tetravalente a una dosis de 4x10<6>TCID<50>por ratón. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se tomaron muestras de suero los días 7, 14 y 21 tras la primera inoculación y los días 35, 42 y 49 tras la segunda inmunización en el día 28. Los títulos de anticuerpos IgG anti-HA de las muestras de suero se determinaron mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) frente a B/Wisconsin/01/2010 y B/Brisbane/60/2008. La respuesta humoral se muestra en laFigura 2, que muestra que la vacuna tetravalente M2SR y BM2SR elevó más los anticuerpos contra el virus de la gripe que el grupo de PBS de control con respecto a ambos antígenos de la gripe B que representan los dos linajes de la gripe B (B/Bris/60 y B/Wisc/01). Los ratones reforzados con la vacuna tetravalente tuvieron un nivel más elevado de anticuerpos HA anti-gripe después de la segunda inmunización que después de la primera dosis.

[0225] Estos resultados demuestran que cada vacuna monovalente de BM2SR es capaz de inducir respuestas específicas de antígeno en una formulación tetravalente.

[0226] Ejemplo 2: Los mutantes M2SR y BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra los virus de la gripe A y la gripe B formulados en vacunas multivalentes

[0227] A. Los mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra el virus de la gripe B formulado en vacunas multivalentes

[0228] Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos cuando se formulan como una vacuna monovalente, bivalente, trivalente o tetravalente con las vacunas M2SR contra la gripe A H1N1 o H3N2. La Tabla A muestra como las diferentes formulaciones de las siguientes cuatro vacunas M2SR y BM2SR monovalentes se formularon conjuntamente: A/California/07/2009 (H1N1) (que comprende un mutante M2SR1 que comprende la SEQ ID NO: 1, A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (que comprende un mutante M2SR-1 con la SEQ ID NO: 1), B/Brisbane/60/2008 (Victoria) (que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11), B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata) (que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11).

[0229] Tabla A. Formulaciones multivalentes de M2SR BM2SR

[0231]

[0233] X = componente presente en la fórmula

[0234] Se inoculó por vía intranasal a ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad con vacunas monovalentes, bivalentes, trivalentes o tetravalentes a las dosis mostradas en laTabla A. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se tomaron muestras de suero los días 7, 14 y 21 tras la primera inoculación y los días 35, 42 y 49 tras la segunda inmunización en el día 28. Los títulos de anticuerpos IgG anti-HA de las muestras de suero se determinaron mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) frente a B/Wisconsin/01/2010 y B/Brisbane/60/2008. La respuesta humoral se muestra en lasFiguras 3A-3B, que muestran que ambos componentes de la vacuna BM2SR (Bris60 y WI01) elevaron los anticuerpos contra el virus de la gripe a un nivel mayor que el del grupo de control con PBS frente a los dos antígenos de la gripe B que representan los dos linajes de la gripe B en las formulaciones multivalentes.

[0235] Estos resultados demuestran que no hay interferencia entre los componentes monovalentes cuando se formulan en vacunas multivalentes.

[0236] B. Los mutantes M2SR provocan respuestas de anticuerpos contra el virus de la gripe A formulado en vacunas multivalentes

[0237] Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes M2SR provocan respuestas de anticuerpos cuando se formulan como una vacuna monovalente, bivalente, trivalente o tetravalente con las vacunas BM2SR contra la gripe B de linaje Yamagata o Victoria. La Tabla A muestra como las diferentes formulaciones de las siguientes cuatro vacunas M2SR y BM2SR monovalentes se formularon conjuntamente: A/California/07/2009 (H1N1) (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1) A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), B/Brisbane/60/2008 (Victoria) (que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11), B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata) (que comprende un mutante BM2SR que comprende la SEQ ID NO: 11).

[0238] Se inoculó por vía intranasal a ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad con vacunas monovalentes, bivalente, trivalentes o tetravalentes a las dosis mostradas en laTabla A. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se tomaron muestras de suero los días 7, 14 y 21 tras la primera inoculación y los días 35, 42 y 49 tras la segunda inmunización en el día 28. Los títulos de anticuerpos IgG anti-HA de las muestras de suero se determinaron mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) frente a A/California/07/2009 (H1N1) y A/Brisbane/10/2007 (H3N2). La respuesta humoral se muestra en lasFiguras 3C-3D, que muestran que ambos componentes de la vacuna M2SR contra la gripe A (H1N1 y H3N2) elevaron los anticuerpos contra el virus de la gripe a un nivel mayor que el del grupo de control con PBS frente a los antígenos de la gripe A que representan los subtipos H1N1 y H3N2 en las formulaciones multivalentes.

[0239] Estos resultados demuestran que no hay interferencia entre los componentes monovalentes cuando se formulan en vacunas multivalentes.

[0240] Ejemplo 3: Los mutantes BM2SR protegen a los ratones de la exposición letal al virus de la gripe B como formulaciones monovalentes o tetravalentes

[0241] Los ratones hembra BALB/c (N = 8) se expusieron a una dosis letal del virus B/Malasia/2506/2004 (20 ratones con una dosis letal al 50 % (MLD<50>)) 49 días después de la primera inoculación (3 semanas después del refuerzo). Como se muestra en lasFiguras 4Ay4B, todos los ratones vacunados con BM2SR y vacunas tetravalentes sobrevivieron a la exposición y no perdieron peso. Los ratones de control que recibieron solo PBS, sin embargo, perdieron peso corporal y no sobrevivieron 9 días después de la fecha de exposición. El día 4 después de la exposición, se obtuvieron pulmones y se determinaron los títulos de virus en células MDCK mediante ensayo de placa. Como se representa en laFigura 4C, los títulos víricos pulmonares en ratones vacunados con BM2SR y vacunas tetravalentes estuvieron por debajo del límite de detección, mientras que los ratones de control con PBS sin tratamiento previo tuvieron elevados títulos víricos lo que indica que las vacunas BM2SR y tetravalentes confieren protección cruzada y limitan la replicación del virus de la exposición.

[0242] Ejemplo 4: La vacuna M2SR tetravalente protege a los ratones de la exposición letal al virus de la gripe A

[0243] Los ratones hembra BALB/c (N = 8) se expusieron a una dosis letal del virus A/Aichi/02/1968 (H3N2) (40 ratones con una dosis letal al 50 % (MLD<50>)) 49 días después de la primera inoculación (3 semanas después del refuerzo). Como se muestra en lasFiguras 5Ay5B, todos los ratones vacunados con las vacunas monovalentes M2SR contra H1N1 o H3N2 y M2SR tetravalentes sobrevivieron a la exposición y perdieron peso transitoriamente pero se recuperaron completamente. Los ratones de control que recibieron solo PBS, sin embargo, perdieron peso corporal y no sobrevivieron 8 días después de la fecha de exposición. El día 4 después de la exposición, se obtuvieron pulmones y se determinaron los títulos de virus en células MDCK mediante ensayo de placa. Como se representa en laFigura 5C, los títulos víricos pulmonares en ratones con vacunas M2SR monovalentes y tetravalentes fueron al menos un registro menor que los ratones de control con PBS sin tratamiento previo, lo que indica que las vacunas M2SR monovalentes y M2SR tetravalentes confieren protección cruzada y limitan la replicación del virus de exposición que no coincida con ningún componente de vacuna.

[0244] Ejemplo 5: Los mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra el virus de la gripe B formulado como vacuna tetravalente

[0245] Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos cuando se formulan como una vacuna tetravalente. Las cuatro vacunas monovalentes siguientes se formularon juntas: un virus de la gripe A H1N1 que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1, un virus de la gripe A H3N2 que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1, un virus de la gripe B de linaje Victoria que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9, y un virus de la gripe B de linaje Yamagata que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9. Se mezcló 0,2-1x10<6>TCID<50>de cada monovalente conjuntamente de tal manera que cada dosis tetravalente fuese de ~3x10<6>TCID<50>por ratón. La secuencia de cada una de las construcciones mutantes M2SR-1 y BM2SR-4 se proporciona en lasTablas 1y5.

[0246] Se inoculó intranasalmente a ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad la formulación tetravalente a una dosis de ~3x10<6>TCID<50>por ratón. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se tomaron muestras de suero el día 14 después de la primera inoculación. Los títulos de anticuerpos IgG anti-HA de las muestras de suero se determinaron mediante ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) contra antígenos de la gripe (linajes B/Victoria y B/Yamagata). Como se muestra en lasFiguras 6 Ay6 B, la vacuna M2SR y BM2SR tetravalente elevó los anticuerpos contra el virus de la gripe a mayores niveles que el grupo de control con PBS contra ambos antígenos de la gripe B que representan los dos linajes de la gripe B.

[0247] Estos resultados demuestran que cada vacuna monovalente de BM2SR es capaz de inducir respuestas específicas de antígeno en una formulación tetravalente.

[0248] Ejemplo 6: Los mutantes M2SR y BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra los virus de la gripe A y la gripe B formulados en vacunas multivalentes

[0249] A. Los mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos contra el virus de la gripe B formulado en vacunas multivalentes

[0250] Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes BM2SR provocan respuestas de anticuerpos cuando se formulan como una vacuna monovalente, trivalente o tetravalente con las vacunas M2SR contra la gripe A H1N1 o H3N2. Las siguientes cuatro vacunas M2SR y BM2SR monovalentes se formulan conjuntamente: H1N1 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1, H3N2 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), linaje B/Victoria (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9), B/Yamagata (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9).

[0251] Se inocula por vía intranasal a ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad con vacunas monovalentes, trivalentes o tetravalentes. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se tomaron muestras de suero el día 14 después de la primera inoculación. Los títulos de anticuerpos lgG anti-HA de las muestras séricas se determinaron mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) con respecto a ambos antígenos de la gripe B. Como se muestra en lasFiguras 7Cy7D, ambos componentes de la vacuna BM2SR fueron mayores que en el grupo de control con PBS contra antígenos de la gripe B que representan los dos linajes de la gripe B en formulaciones multivalentes.

[0252] Estos resultados demuestran que no hay interferencia entre los componentes monovalentes cuando se formulan en vacunas multivalentes.

[0253] B. Los mutantes M2SR provocan respuestas de anticuerpos contra el virus de la gripe A formulado en vacunas multivalentes

[0254] Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes M2SR provocan respuestas de anticuerpos cuando se formulan como una vacuna monovalente, trivalente o tetravalente con las vacunas BM2SR de la gripe B de linaje Yamagata o Victoria. Las siguientes cuatro vacunas M2SR y BM2SR monovalentes se formularon conjuntamente: H1N1 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), H3N2 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), linaje B/Victoria (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9), B/Yamagata (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9).

[0255] Se inoculó por vía intranasal a ratones hembra BALB/c de seis semanas de edad con vacunas monovalentes, trivalentes o tetravalentes. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se tomaron muestras de suero el día 14 después de la primera inoculación. Se determinaron los títulos de anticuerpos IgG anti-HA de las muestras de suero mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) frente a los virus de la gripe A H1N1 y H3N2. Como se muestra en lasFiguras 7Ay7B, ambos componentes de la vacuna M2SR contra la gripe A (H1N1 y H3N2) elevaron los anticuerpos contra el virus de la gripe a un nivel mayor que el del grupo de control con PBS frente a ambos antígenos de la gripe A que representan los subtipos H1N1 y H3N2 en formulaciones multivalentes.

[0256] Estos resultados demuestran que no hay interferencia entre los componentes monovalentes cuando se formulan en vacunas multivalentes.

[0257] Ejemplo 7: Los mutantes BM2SR-4 protegen a los ratones de la exposición letal al virus de la gripe B como formulaciones monovalentes, trivalentes o tetravalentes

[0258] Los ratones hembra BALB/c (N = 4) se expusieron a una dosis letal de un virus de la gripe B heterosubtípico, virus B/Malaysia/2506/2004 (20 ratones con 50 % de dosis letal (MLD<50>)), 22 días después de la inoculación. Todos los ratones vacunados con las vacunas BM2SR-4 monovalentes, trivalentes y tetravalentes sobrevivieron a la exposición (Figura 8B) y no perdieron peso (Figura 8A). Los ratones de control que recibieron solo PBS, sin embargo, perdieron peso corporal y no sobrevivieron a la exposición. Estos resultados indican que las vacunas BM2SR-4 monovalentes (cada una diferente del virus de exposición), las vacunas trivalentes y tetravalentes confieren protección cruzada contra el virus de exposición. Estos resultados demuestran que no hay interferencia entre los componentes monovalentes en las formulaciones multivalentes.

[0259] Ejemplo 8: La vacuna M2SR tetravalente protege a los ratones de la exposición letal al virus de la gripe A

[0260] Los ratones hembra BALB/c (N = 4) se expusieron a una dosis letal de un virus de la gripe B heterólogo, tal como el virus A/Aichi/02/1968 (H3N2) (40 ratones con dosis letal al 50 % (MLD<50>)), 22 días después de la inoculación. Todos los ratones vacunados con la trivalente (que comprende H1N1 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), H3N2 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), y B/Yamagata (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9)) o vacunas M2SR tetravalentes (que comprenden H1N1 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), H3N2 (que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1), el linaje B/Victoria (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9), y B/Yamagata (que comprende un mutante BM2SR-4 que comprende la SEQ ID NO: 9)) tuvieron más supervivientes tras la exposición (Figura 9B) y perdieron peso transitoriamente, pero empezaron a recuperarse el día 7 (Figura 9A). A los ratones de control sólo se les administró PBS, sin embargo, perdieron peso corporal y no sobrevivieron 7 días después de la fecha de exposición. Estos resultados demuestran que las vacunas M2SR/BM2SR trivalentes y tetravalentes confieren protección cruzada contra el virus de exposición que no coincide con ningún componente de la vacuna.

[0261] Ejemplo 9: Respuestas inmunitarias provocadas como respuesta a las vacunas M2SR y BM2SR monovalentes y M2SR tetravalentes y eficacia protectora en el modelo de hurón

[0262] A. Sumario

[0263] Este ejemplo demuestra que las respuestas inmunitarias provocadas por la vacuna M2SR tetravalente son similares a cada una de las vacunas M2SR y BM2SR monovalentes en el modelo de hurón. Es decir, la M2SR tetravalente no muestra interferencia y provoca respuestas inmunitarias protectoras contra cada uno de los componentes. Cada uno de los virus M2SR y BM2SR candidatos se administró por vía intranasal a 12 hurones machos a un nivel de dosis de 1x10<7>TCID50 (monovalentes) o 4x10<7>TCID50 (tetravalentes). Como control, a un grupo de hurones se le administró OPTI-MEM™ como control de placebo. Para cada grupo de tratamiento se utilizó un régimen de vacunación de sensibilización-refuerzo. A los hurones se les administró la primera vacuna (día 0) y la vacunación de refuerzo 28 días después (día 28). Después de cada vacunación, se observó a los hurones durante 14 días tras la inoculación para determinar la mortalidad, con pesos corporales, temperatura corporal y signos clínicos medidos diariamente. Se extrajo suero de todos los hurones los días 21, 35 y 56 después de la vacunación para evaluar los niveles de anticuerpos a lo largo del tiempo.

[0264] Todos los animales se expusieron por vía intranasal el día 70 a 1x10<6>UFP de A/California/07/2009 (HIN1pdm). Después de la exposición, los hurones se supervisaron durante 14 días tras la inoculación para determinar la mortalidad, con pesos corporales, temperatura corporal y signos clínicos medidos diariamente. Se recogieron lavados nasales los días 1, 3, 5 y 7 después de la exposición de los hurones (N = 8) en cada grupo para los títulos víricos. Adicionalmente, se recogió suero después de la exposición (día 82) de los hurones supervivientes para su análisis. La necropsia se realizó en 4 hurones por grupo 3 días (día 73) después de la exposición. Se recogieron órganos para la determinación de la carga vírica (títulos) después de la exposición.

[0265] No se observaron acontecimientos adversos relacionados con la vacuna entre los 5 grupos. Tras la exposición, el grupo de control con placebo presentó una reducción (-15 %) en peso. También se observó una reducción de peso en los grupos vacunados con M2SR y BM2SR H3N2 monovalentes antigénicamente con emparejamiento incorrecto; sin embargo, la reducción (~5-8 %) fue menor que la observada en el grupo con placebo. La M2SR y M2SR H1N1pdm tetravalentes no mostraron ninguna pérdida de peso significativa después de la exposición.

[0266] B. Materiales y métodos

[0267] Inoculación del virus de la vacuna.Los hurones se inocularon por vía intranasal con dos dosis de una vacuna M2SR o BM2SR monovalente a una dosis de 1 x 10<7>TCID<50>o se inocularon por vía intranasal con dos dosis de una vacuna M2SR tetravalente a una dosis de 4 x 10<7>TCID<50>como se muestra en laTabla B. Un vial de material congelado se descongeló a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos y a continuación se almacenó refrigerado (o en hielo húmedo) hasta su uso. Los hurones se anestesiaron con ketamina/xilazina y la dosis de virus se administró por vía intranasal en un volumen de 500 µl (250 µl por fosa nasal). Se observó a los animales diariamente durante 7 días después de cada vacunación. Los pesos corporales, la temperatura corporal y los signos clínicos se monitorizaron durante 7 días.

[0268] Tabla B:Programa de vacunación y recogida de muestras

[0269] Órganos

[0270] Grup Virus de Dosis Vacunació Exposició Lavados

[0271] 3 Extraccione o Vacuna<N>(TCID50) n n Nasales

[0272] 2

[0273] 1 = 3 s de (días) (día) n

[0274] (días) (día) suero<4>Vehícul

[0275] 1 o 1 3, 21, 35, (Control<2>N/D 0, 28 70 71, 7

[0276] 75, 77<73>56, 82 )

[0278] 2<H1N1>1 73, 21, 35,

[0279] <M2SR 2>10<7>0, 28 70 71,

[0280] 75, 77<73>56, 82

[0281] 3<H3N2>1 21, 35,

[0282] <M2SR 2>10<7>0, 28 70 71, 73,

[0283] 75, 77<73>56, 82 4<B/Bris>1 21, 35,<BM2SR 2>10<7>0, 28 70 71, 73,

[0284] 75, 77<73>56, 82 5<B/Wisc>1 1, 35,

[0285] <BM2SR 2>10<7>0, 28 70 71, 73, 2

[0286] 75, 77<73>56, 82 6<Tetra>1 21, 35,<M2SR 2>4 x 10<7>0, 28 70 71, 73,

[0287] 75, 77<73>56, 82 1 Inoculado por vía intranasal

[0288] 2Lavados nasales recogidos de animales no asignados para necropsia.

[0289] 3 Órganos (cornete nasal, tráquea, pulmón (lóbulos craneales y caudales izquierdo y derecho) extraídos a partir de 4 hurones por grupo para el análisis de título vírico.

[0290] 4Recogidas de suero después de la vacunación

[0291] El virus M2SR es un virus recombinante de la gripe A que no expresa una proteína M2 funcional, que comprende un mutante M2SR-1 que comprende la SEQ ID NO: 1, que codifica los genes HA y NA de la gripe A/Uruguay/716/2007(H3N2) o A/California/07/2009 (H1N1pdm) similar a A/Brisbane/10/2007. El virus BM2SR es un virus recombinante de la gripe B que no expresa una proteína BM2 funcional, que comprende un mutante BM2SR-0 que comprende la SEQ ID NO: 11, que codifica HA y NA de B/Brisbane/60/2008 (Victoria) o B/Wisconsin/01/2010 (Yamagata). La M2SR tetravalente está compuesta por 2 virus M2SR y 2 BM2SR que codifican HA y NA H1N1, H3N2, B/Victoria, B/Yamagata.

[0293] Animales y cuidado de los animales.Se compraron ocho hurones machos de Triple F Farms y 72 de los hurones se pusieron en estudio. Los animales tenían aproximadamente 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. El proveedor certificó que los animales estaban sanos y exentos de anticuerpos contra enfermedades infecciosas. A su llegada, los animales se alojaron individualmente en jaulas de alambre suspendidas con fondos de listones, suspendidas sobre bandejas de residuos revestidas de papel. La habitación de los animales y las jaulas se limpiaron y desinfectaron antes de la recepción de los animales, de acuerdo con las prácticas aceptadas de cuidado de los animales y los procedimientos operativos convencionales relevantes. Se proporcionaron a voluntad dieta certificada para hurones Teklad Global n.º 2072 (Teklad Diets, Madison WI) y agua del grifo de la ciudad de Chicago y se renovaron al menos tres veces a la semana. Se mantuvo iluminación fluorescente en las habitaciones de los animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La temperatura y la humedad relativa de las habitaciones de los animales estuvieron dentro de los límites respectivos del protocolo y variaron de 20,0 a 25,0 °C y de 30 a 63 %, respectivamente, durante el estudio.

[0295] Cuarentena animal y aleatorización.Los hurones se mantuvieron en cuarentena durante siete días antes de la aleatorización y se observaron diariamente. Basándose en las observaciones diarias que indican una buena salud general de los animales, los hurones se liberaron de la cuarentena para su aleatorización y prueba. Después de la cuarentena, los hurones se pesaron y se asignaron a grupos de tratamiento usando un procedimiento de aleatorización computarizado basado en pesos corporales que produjeron valores medios de grupos similares [ToxData® versión 2.1.E.11 (PDS Pathology Data Systems, Inc., Basilea, Suiza)]. Dentro de un grupo, todos los pesos corporales estaban en un intervalo del 20 % de su media. Los animales seleccionados para el estudio reciben un número de identificación permanente mediante una etiqueta en la oreja y un transpondedor, y las tarjetas de jaula individuales también identifican a los animales del estudio por números individuales y grupo. Los números de identificación asignados fueron únicos dentro del estudio.

[0297] Diseño experimental.Para evaluar la eficacia de la vacuna, se inmunizaron hurones con cada virus M2SR, BM2SR o M2SR tetravalente o fueron inmunizados en falso por un medio (OPTI-MEM™). El peso corporal, la temperatura corporal y los síntomas clínicos del hurón se monitorizaron y se evaluaron las respuestas inmunológicas. Se utilizaron 72 hurones machos (Triple F Farms, Sayre PA), de 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio, para el estudio. Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación de nivel 2 de bioseguridad animal de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de uso y cuidado de los animales del Instituto de Investigación IIT. Antes de la inoculación, los hurones se supervisaron durante 3 días para medir el peso corporal y establecer las temperaturas corporales de referencia. Las lecturas de temperatura se registraron diariamente a través de un transpondedor (BioMedic data systems, Seaford, DE) implantado por vía subcutánea en cada hurón. Se extrajo sangre antes del inicio del estudio y se analizó el suero para detectar anticuerpos contra la gripe. Las muestras de suero antes de la vacunación se sometieron a tratamiento con enzima destructora del receptor (RDE, por sus siglas in inglés) para eliminar inhibidores no específicos, a continuación se diluyeron en serie, se analizaron con respecto a una cantidad definida de virus de la gripe A/Califomia/07/2009 similar (H1N1pdm), A/Suiza/9715293/2013 (H3N2), virus de la gripe B, B/Brisbane/60/2008 (linaje Victoria) y B/Wisconsin/01/2010 (linaje Yamagata) y se mezclaron con 0,5 % de eritrocitos de pavo o con 0,75-1,0 % de eritrocitos de conejillo de indias. Los títulos de anticuerpos se definen por la dilución sérica más baja que provoca la inhibición de la aglutinación de eritrocitos. Sólo los hurones con títulos de HAI (inhibición de la hemaglutinación) inferiores a 40 se consideraron seronegativos y se usaron en este estudio. Los animales del estudio se aleatorizaron y se dividieron en 6 grupos (12 hurones/grupo) como se muestra en laTabla B.

[0299] Los hurones se inocularon por vía intranasal con una dosis única de 1x10<7>TCID50 de virus M2SR o BM2SR en los días 0 y 28, o una dosis única de 4x10<7>TCID50 de M2SR tetravalente en los días 0 y 28. Al grupo de control se le inoculó por vía intranasal OPTI-MEM™ en los días 0 y 28. La temperatura corporal, el peso y los síntomas clínicos de los hurones se monitorizaron durante 14 días después de las inoculaciones. Las muestras de lavado nasal se mantuvieron a -65 °C. Se extrajo sangre antes de la inoculación (día -3 a -5) y los días 21, 35 y 56 y el suero se mantuvo a -65 °C hasta la medición del título de anticuerpos mediante ELISA y ensayo HAI.

[0301] C. Resultados

[0303] Los títulos de anticuerpos IgG anti-HA de las muestras de suero se determinaron mediante ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) con respecto a A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/California/07/2009 (HIN1pdm), B/Wisconsin/01/2010 (linaje Yamagata), y B/Brisbane/60/2008 (linaje Victoria). En resumen, las placas de ELISA se recubrieron con proteína HA recombinante de cada cepa, se bloquearon mediante albúmina de suero bovino (BSA) y se aplicaron muestras. Se detectaron anticuerpos lgG de hurón mediante anticuerpos lgG de cabra anti-hurón marcados con peroxidasa de rábano (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) y sustrato SureBlue TMB (KPL, Inc.).

[0304] Como se esperaba, los hurones en cada uno de los grupos inmunizados mostraron una elevación significativa del anticuerpo anti-HA en suero respecto a su antígeno respectivo. Lo que es más importante, los grupos M2SR tetravalentes demostraron una elevación significativa del anticuerpo anti-HA en suero contra los cuatro antígenos (Figura 10) lo que indica que no hay interferencia entre los componentes de la formulación multivalente. Estos datos sugieren que los virus M2SR, BM2SR y M2SR tetravalentes provocan respuestas inmunitarias significativas en hurones.

[0305] Las muestras de suero se analizaron mediante ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI, por sus siglas en inglés) para demostrar la actividad funcional de los anticuerpos detectados por ELISA. Las muestras de suero se trataron con enzima destructora de receptores (RDE) (Denka Seiken, Tokio, Japón) para eliminar los inhibidores de la hemaglutinación inespecífica. RDE se reconstituyó según las instrucciones del fabricante. El suero se diluyó 1:3 en RDE y se incubó de 18-20 horas en un baño de agua a 37 °C ± 2 °C. Después de la adición de un volumen igual de citrato de sodio al 2,5 % (v/v), las muestras se incubaron en un baño de agua a 56 ± 2 °C durante 30 ± 5 minutos. Se añadió NaCl al 0,85 % a cada muestra hasta una dilución de suero final de 1:10 después del tratamiento con RDE. Las muestras diluidas se diluyeron después en cuatro diluciones dobles (de 1:10 a 1:80) por duplicado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubaron con 4 unidades hemaglutinantes del virus de los virus de la gripe A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/California/07/2009 (HIN1pdm), B/Wisconsin/01/2010 (linaje Yamagata) y B/Brisbane/60/2008 (linaje Victoria). Después de la incubación, se añadieron 0,5 % de eritrocitos aviares a cada muestra y se incubaron durante 30 ± 5 minutos. A continuación, se puntuó la presencia o ausencia de hemaglutinación. Como se muestra en lasFiguras 11 Ay11 B, todos los hurones inmunizados con M2SR demostraron títulos de anticuerpos de HAI significativos contra sus respectivos virus de prueba. El M2SR tetravalente demostró títulos significativos de HAl contra los cuatro virus de las pruebas. El grupo placebo (sin tratamiento previo) no provocó ningún anticuerpo específico contra la gripe. Los CDC establecen que los títulos de anticuerpos de HAI séricos de 40 se asocian con al menos una reducción del 50 % en riesgo de infección o enfermedad por gripe en las poblaciones. Por lo tanto, estos resultados sugieren que los virus M2SR y BM2SR provocan respuestas inmunitarias protectoras que se mantienen cuando los virus se formulan conjuntamente como una vacuna tetravalente.

[0306] Después de la exposición con A/California/09/2009 (HIN1pdm), se observó una pérdida de peso corporal del 5-8 % el día 6 después de la exposición en todos los animales. Durante el periodo de observación de 14 días, los pesos corporales de los animales permanecieron por debajo de su peso inicial, excepto que los hurones administrados con OPTI-MEM™ (grupo placebo) perdieron más peso (15 %). La pérdida de peso entre los hurones vacunados dependió de la antigenicidad de la vacuna. Los hurones que recibieron M2SR H1N1pdm coincidente o M2SR tetravalente (que contiene M2SR H1N1pdm) no mostraron ninguna pérdida de peso significativa. Los hurones que recibieron una vacuna heteróloga M2SR H3N2 o cualquiera de las vacunas BM2SR mostraron -5-8 % de pérdida de peso.

[0307] Las muestras de lavado nasal se recogieron de todos los hurones los días 1, 3, 5, 7 después de la exposición y se evaluaron para detectar la presencia del virus de exposición mediante ensayo en placas en células MDCK. LaFigura 12muestra que la M2SR tetravalente controló la replicación del virus de exposición de una manera similar al homólogo M2SR H1N1pdm monovalente. Las vacunas BM2SR monovalentes y el placebo no controlaron el virus de exposición con al menos 5 registros de virus que se detectaron hasta 5 días después de la infección. El grupo con M2SR H3N2 heterólogo no eliminó el virus de exposición como H1N1 homólogo y M2SR tetravalente, pero controló parcialmente la replicación del virus con respecto al grupo con placebo.

[0308] Los órganos respiratorios recogidos el día 3 después de la infección de 4 hurones demostraron el control del virus de exposición. M2SR H1N1 y M2SR tetravalente no permitieron que el virus de exposición se replicara en absoluto en los tejidos respiratorios superior e inferior (cornete nasal, tráquea, pulmón) como se muestra en lasFiguras 13A, 13B, y13C). Por el contrario, el virus de exposición proliferó hasta elevados títulos en los tejidos respiratorios superiores (cornete nasal y tráquea) de los otros grupos. En las vías respiratorias inferiores (pulmón), las vacunas M2SR monovalentes controlaron el virus de exposición en relación con el grupo con placebo. Estos resultados sugieren que M2SR homólogo y tetravalente impide que la infección por gripe se establezca y que las vacunas M2SR no relacionadas reduzcan la gravedad de la infección.

[0309] D. Conclusión

[0310] Este ejemplo muestra que la administración intranasal del virus de la vacuna M2SR tetravalente no se asoció con ningún acontecimiento adverso relacionado con la vacuna (p. ej., temperatura corporal elevada, pérdida de peso o signos clínicos). Estos resultados muestran que el virus M2SR tetravalente provoca respuestas inmunitarias protectoras contra cada cepa contenida en la formulación multivalente y es útil como vacuna contra la gripe intranasal.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica, en donde la composición es una composición multivalente que comprende virus recombinantes de al menos dos cepas de gripe, en donde la composición multivalente comprende:

a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe A genomodificado comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y

b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde el al menos un virus de la gripe A se selecciona del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, y el al menos un virus de la gripe B se selecciona del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde la composición multivalente comprende virus recombinantes seleccionados del grupo que consiste en:

a) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11;

b) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; c) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; y d) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

4. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde la composición multivalente es una composición tetravalente que comprende:

a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en:

i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y

ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y

b) dos virus de la gripe B atenuados genomodificados que consisten en:

i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y

ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

5. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde la composición multivalente es una composición tetravalente que comprende:

a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en:

i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y

ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y

b) un virus de la gripe B atenuado genomodificado que se selecciona del grupo que consiste en:

i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y

ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

6. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable o un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

7. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la composición está formulada para administración intranasal o intracutánea.

8. Una composición inmunogénica multivalente para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria contra la gripe A y la gripe B, comprendiendo el método administrar la composición a un sujeto que lo necesite y comprendiendo la composición inmunogénica multivalente:

a) al menos un virus recombinante de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe A genomodificado comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; y

b) al menos un virus recombinante de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado, en donde el virus de la gripe B genomodificado comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

9. La composición inmunogénica multivalente para su uso de la reivindicación 8, en donde el al menos un virus de la gripe A se selecciona del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, y el al menos un virus de la gripe B se selecciona del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria.

10. La composición inmunogénica multivalente para su uso de la reivindicación 8, en donde la composición inmunogénica multivalente comprende virus recombinantes seleccionados del grupo que consiste en:

a) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11;

b) dos virus de la gripe A deficientes en M2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde los virus A deficientes en M2 comprenden un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; c) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y dos virus de la gripe deficientes en BM2 atenuados genomodificados seleccionados del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde los virus deficientes en BM2 comprenden un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11; y d) un virus de la gripe A deficiente en M2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los subtipos H1N1 y H3N2, en donde el virus A deficiente en M2 comprende un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y un virus de la gripe deficiente en BM2 atenuado genomodificado seleccionado del grupo de los linajes B/Yamagata y B/Victoria, en donde el virus deficiente en BM2 comprende un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

11. La composición inmunogénica multivalente para su uso de la reivindicación 8, en donde la composición inmunogénica multivalente es una composición tetravalente que comprende: a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en:

i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y

ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y

b) dos virus de la gripe B atenuados genomodificados que consisten en:

i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y

ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

12. La composición inmunogénica multivalente para su uso de la reivindicación 8, en donde la composición inmunogénica multivalente es una composición tetravalente que comprende:

a) dos virus de la gripe A atenuados genomodificados que consisten en:

i) H1N1 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1, y

ii) H3N2 que tiene un gen M2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 1; y

b) un virus de la gripe B atenuado genomodificado que se selecciona del grupo que consiste en:

i) B/Victoria que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, y

ii) B/Yamagata que tiene un gen BM2 mutante que comprende la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11.

13. La composición inmunogénica multivalente para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde la composición inmunogénica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable o un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

14. La composición inmunogénica multivalente para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en donde la composición inmunogénica está formulada para administración intranasal o intracutánea.