ES3046010T3 - Method for analysing a biological sample containing biological cells, and analysing device for implementing the analysing method - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas y a un dispositivo de análisis para implementar dicho método. El método comprende: medir los parámetros citométricos de cada célula biológica de la muestra; determinar, para cada célula biológica de la muestra, un punto en el espacio de N dimensiones, cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros citométricos medidos para la célula biológica correspondiente, donde N es un número entero mayor o igual a 3; agrupar automáticamente los puntos en diferentes grupos de células en función de los parámetros citométricos medidos para definir un archivo de clústeres de muestra; y comparar el archivo de clústeres de muestra con archivos de clústeres de referencia, cada uno de los cuales se define en función de los parámetros citométricos de la respectiva muestra biológica patológica o anormal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas y aparato de análisis para implementar el método de análisis

[0003] La presente invención se refiere a un método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas y, en particular, células sanguíneas, y a un aparato de análisis adecuado para implementar dicho método de análisis.

[0004] Las células que circulan en la sangre comprenden células no nucleadas, como glóbulos rojos o eritrocitos (aproximadamente 5 millones por mm3 de sangre normal), plaquetas (aproximadamente 300 000 por mm3) y comprenden células nucleadas y leucocitos (aproximadamente 10 000 por mm3). La sangre puede contener otras células nucleadas, como los eritroblastos, que son glóbulos rojos inmaduros, u otras células más raras. Cada tipo de célula constituye lo que también se denomina población.

[0005] Otros fluidos biológicos contienen células sanguíneas, como el líquido cefalorraquídeo o la orina. Posteriormente, se habla de muestra biológica, pero esta no se limita a una muestra de sangre sino a todos los fluidos biológicos que contienen células sanguíneas.

[0006] Los analizadores hematológicos clásicos, en que se utiliza citometría de flujo o no, están diseñados para realizar el hemograma y proporcionar información cualitativa cuando se detectan anomalías cuantitativas por tipo de célula.

[0007] Los equipos de citometría especializados en inmunohematología permiten, gracias a técnicas más sofisticadas y a la implementación de reactivos específicos, atacar las patologías hematológicas que pueden afectar a todo tipo de células.

[0008] Cabe señalar que la citometría de flujo consiste en realizar al menos un foco hidrodinámico y en hacer que las células sanguíneas pasen una a una a un dispositivo de medición que, según lo que se implemente, produce un cierto número de mediciones físicas para cada célula. Para que las mediciones se hagan de forma distinta, las células deben estar separadas y desplazarse a velocidades que permitan las mediciones y su adquisición. Es más, los recuentos deben ser suficientes para permitir evaluaciones estadísticas correctas de cada población. Para ello, la muestra de sangre no se analiza pura sino diluida. Es más, teniendo en cuenta las cantidades de glóbulos rojos que son mil veces más elevadas que las de los leucocitos, la muestra, para realizar un análisis estadísticamente representativo de las poblaciones de leucocitos, debe pasar por el citómetro durante varios minutos. La otra solución, disminuir en un factor de diez el tiempo que tarda la muestra en pasar por el citómetro, consiste en realizar, además de diluir la muestra, una lisis que destruya selectivamente los glóbulos rojos para tener una muestra suficientemente concentrada en leucocitos y así tener recuentos estadísticamente correctos para estas poblaciones.

[0009] Los parámetros de citometría de flujo producidos son de dos clases:

[0010] - o de naturaleza física o morfológica: medición del volumen de las células mediante impedancia (efecto Coulter), mediciones de la absorción óptica y la difracción en varios ángulos generadas por el paso de cada célula a través de un rayo láser y medición de la fluorescencia de los ácidos nucleicos que se vuelven fluorescentes por uno o más fluorocromos previamente puestos en presencia de las células. Estos datos permiten caracterizar cada célula por su volumen, por su absorción óptica, que depende de su superficie y su contenido, por su complejidad interna, por la naturaleza de su superficie, su composición y por su actividad nucleica para las células nucleadas;

[0011] - o de naturaleza inmunológica (inmunohematología): la muestra se coloca en presencia de reactivos que contienen anticuerpos conjugados con un fluorocromo y específicos para los receptores expresados en la superficie de ciertas células. El paso de las células a través de uno o más rayos láser genera señales proporcionales a los marcadores de la superficie celular y, así, permite caracterizar las células.

[0012] Un método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas comprende, de manera conocida, las siguientes etapas:

[0013] - paso de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar a una celda de medición de un citómetro de flujo,

[0014] - medición de los N parámetros de citometría, tales como los parámetros de citometría morfológica o inmunológica, para cada célula biológica contenida en la muestra biológica que se va a analizar, - determinación, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, de un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para la célula biológica correspondiente, donde N es un número entero mayor o igual que 2,

[0016] - en el caso de los equipos cuya función se limita al hemograma, reagrupamiento de los puntos en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos, a fin de definir un archivo de grupos de muestras, y la etapa de reagrupamiento se realiza utilizando métodos automáticos de zonificación, métodos estadísticos o incluso métodos de densidad de puntos,

[0018] - para equipos más sofisticados que efectúan mediciones hematoinmunológicas,

[0020] • bien el análisis visual de un operador, como un hematólogo o un especialista en citometría, de las representaciones de los puntos determinados en dos ejes de medición y la reagrupación de los puntos en diferentes grupos de células según los criterios de reagrupación por umbrales o por zonas elegidas por el operador,

[0022] • bien la reagrupación automática de los puntos en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos, con el fin de definir un archivo de grupos de muestras, y el análisis informático del archivo de grupos de muestras y, en especial, de los diferentes grupos de células, cuya etapa de análisis tenía como objetivo calificar y cuantificar los grupos de células que tenían características comunes,

[0024] - identificación por parte del operador de una o más anomalías en el archivo de grupos de muestras en comparación con las muestras normales.

[0026] A partir de las anomalías identificadas, por ejemplo, al cruzar los umbrales numéricos (número anómalamente bajo o anómalamente alto de un tipo de célula), y a partir de su experiencia en citometría médica, el operador puede determinar directamente la patología del paciente cuya muestra biológica se analizó y el tratamiento asociado, o emitir un pronóstico sobre la posible patología del paciente cuya muestra biológica se analizó y considerar los análisis de sangre complementarios para confirmar su pronóstico.

[0028] Sin embargo, las etapas de reagrupamiento, análisis e identificación son bastante subjetivas y dependen en gran medida de la experiencia en citometría del operador, por lo que el diagnóstico o pronóstico establecido para un paciente por parte de un operador depende de la cualificación y la experiencia de este último. En cualquier caso, estas etapas son laboriosas y requieren mucho tiempo. Las tasas de tratamiento de estos equipos son bajas en comparación con las de los contadores de hematología.

[0030] Es más, en la citometría en inmunohematología en que se utilizan anticuerpos para caracterizar las células de una manera muy específica se utilizan productos caros, lo que dificulta el establecimiento de la citometría como un método rutinario.

[0032] Finalmente, este tipo de análisis destinado a reagrupar células con características comunes tiene como objeto contar y calificar las poblaciones para calificar las anomalías por tipo de población. Por lo tanto, este tipo de análisis no interesa tanto en todos los datos como en una imagen global de la muestra del paciente.

[0034] En el documento US5605805 se divulga un método para determinar la estirpe celular de leucemia aguda en una muestra mediante citometría de flujo, método que comprende, en especial, etapas que consisten en identificar poblaciones celulares normales comparando un perfil inmunológico y un perfil de dispersión de cada población celular con un perfil de dispersión y con un perfil inmunológico esperado para las células normales; en restar el perfil de dispersión de la población celular normal del perfil de dispersión de cada grupo que contiene células que pertenecen a población celular normal; y determinar la estirpe de las poblaciones celulares anómalas restantes comparando los perfiles de dispersión y los perfiles inmunológicos de las poblaciones celulares anómalas con los perfiles de dispersión y los perfiles inmunológicos esperados para las poblaciones de células leucémicas conocidas.

[0036] La presente invención tiene como objetivo subsanar estos inconvenientes e introducir un nuevo paradigma mediante la utilización de los datos recopilados por el citómetro de flujo para caracterizar las células biológicas, reagruparlas automáticamente por grupo, identificar y calificar las poblaciones de grupos, pero también tener en cuenta todos los datos como una representación de imagen de la muestra biológica y también tratar esta imagen en relación con las imágenes de referencia.

[0038] El problema técnico en la base de la invención consiste, en especial, en suministrar un método para analizar una muestra biológica que contenga células biológicas que optimice el tratamiento de los datos de las mediciones, lo que garantizará la reproducibilidad de los resultados obtenidos, al tiempo que garantizará que este método sea compatible con equipos de alta tasa y no requiera habilidades o tiempo particulares por parte del operador.

[0040] Para este fin, la presente invención se refiere a un método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas, incluidas las células sanguíneas, comprendiendo el método de análisis las siguientes etapas:

[0041] - paso de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar a una celda de medición de un citómetro de flujo,

[0043] - medición de los N parámetros de citometría de las células biológicas contenidas en una muestra biológica que se va a analizar,

[0045] - determinación, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, de un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para la célula biológica correspondiente de la muestra biológica que se va a analizar, donde N es un número entero mayor o igual que 3,

[0047] - reagrupamiento automático de los puntos determinados en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, con el fin de definir un archivo de grupos de muestras, siendo el archivo de grupos de muestras ventajosamente un archivo informático que describe numéricamente la muestra biológica que va a analizarse y, preferiblemente, está escrito de acuerdo con un estándar,

[0049] - identificación de las poblaciones de células definidas por los diferentes grupos de células del archivo de grupos de muestra,

[0051] - recuento de los puntos de cada grupo de células en el archivo de grupos de muestra,

[0053] - comparación del archivo de grupos de muestras con los archivos de grupos de referencia, definiéndose cada uno de los archivos de grupos de referencia a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica patológica o anómala respectiva.

[0055] Tal configuración del método de análisis según la presente invención permite identificar automáticamente cualquier parecido entre el archivo de grupos de muestras, que describe numéricamente la muestra biológica que se va a analizar, y uno o más archivos de grupos de referencia y, por lo tanto, mejorar la relevancia de las indicaciones dadas a un operador (mediante, por ejemplo, indicaciones o alarmas específicas añadidas a las mediciones hechas) al final de la etapa de comparación y, así, contribuir a dar las recomendaciones más relevantes posibles al operador con el fin de acelerar los diagnósticos. En particular, el método de análisis según la presente invención permite al laboratorio ahorrar tiempo en las decisiones que haya que tomar, precisar el campo de las investigaciones posteriores y dirigir, si es necesario, a los hematólogos más rápidamente a los análisis complementarios, que pueden ser frotis de sangre seguidos de análisis microscópicos o análisis inmunológicos, y esto con medios sencillos, muy económicos y robustos. No se trata de sustituir este método por el análisis de una imagen de un frotis de sangre, sino de extraer la mayor cantidad de información posible del hemograma digital sin sobrecostes ni de material ni de tiempo.

[0057] El método de análisis según la presente invención consiste más particularmente en realizar, sobre la base de mediciones citométricas, un análisis morfológico comparativo de la muestra biológica tenida en cuenta, con muestras biológicas de referencia, y más precisamente un análisis morfológico comparativo del archivo de grupos de muestras, que se establece a partir de la muestra biológica analizada, con archivos de grupos de referencia establecidos a partir de muestras biológicas patológicas o anómalas cuyos datos clínicos son conocidos.

[0059] El método de análisis según la presente invención se fundamenta, por lo tanto, en la realización de archivos de referencia obtenidos a partir de muestras cuya patología es conocida. De hecho, es un proceso de aprendizaje que se realiza mediante la compilación de ensayos clínicos y que puede progresar en función de los nuevos archivos de referencia correspondientes a nuevas anomalías o patologías.

[0061] Cada versión de aprendizaje no es específica para cada máquina, pero está validada y se aplica a todas las máquinas del mismo tipo que funcionan con reactivos de composición idéntica para las preparaciones (dilución, lisis, etiquetado fluorescente).

[0063] Las células que circulan en la sangre son el resultado de lo que se produce por la hematopoyesis, por el desprendimiento de las células endoteliales y por las infecciones por agentes alogénicos como las bacterias o parásitos como el plasmodio. La hematopoyesis produce en la médula ósea, por una parte, leucocitos, es decir, células polinucleares o granulocitos de neutrófilos, eosinófilos y basófilos, monocitos y linfocitos, y, por otra parte, eritrocitos y plaquetas. Cada tipo de célula puede verse afectada por diferentes tipos de patologías que pueden ser la causa de células inmaduras en la sangre, como, por ejemplo, los eritroblastos, que son eritrocitos que aún tienen su núcleo, o los reticulocitos que ya no tienen núcleo, pero que aún tienen actividad ribosómica y mitocondrial.

[0065] Según una implementación de la invención, los parámetros de citometría medidos son mediciones físicas tales como el volumen de cada célula biomédica, la absorción óptica, la difracción en ángulos grandes, la difracción en ángulos pequeños.

[0067] El método de análisis puede presentar, además, una o varias de las siguientes características, tomadas solas o en combinación.

[0069] Según una implementación de la invención, las células biológicas que se van a analizar pueden ser células sanguíneas y, más particularmente, células sanguíneas que han sido objeto de una preparación o de una dilución isotónica para preservar las células y poder espaciarlas lo suficiente en el citómetro y medir, en las mejores condiciones, cada parámetro de citometría, o una operación de lisis selectiva que eliminará los glóbulos rojos, células que son aproximadamente mil veces más numerosas que los glóbulos blancos, teniendo esta operación de lisis el efecto de permitir identificar y contar los leucocitos en un tiempo más corto, pero esto también tiene la consecuencia de modificar, según el tipo de lisis, el volumen y la respuesta óptica de las células no lisadas observadas.

[0071] De hecho, en el modo preferido de implementación de la invención se utilizan dos citómetros en paralelo, un primero en el que la muestra biológica solo se diluye y el segundo, en que se trata la muestra biológica lisada, más particularmente para observar las células nucleadas. Esto permite recoger datos en espacios con dimensiones N > 3 tanto para la muestra biológica lisada como para la muestra biológica no lisada. Esto significa que las células no nucleadas, como los eritrocitos y las plaquetas, se tratan mediante los mismos tipos de algoritmos que las células nucleadas.

[0073] Según una implementación de la invención, la etapa de reagrupar por grupos se realiza mediante un tratamiento automático, según algoritmos específicos, de los puntos determinados por los N parámetros de citometría correspondientes a cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar. Los diferentes puntos pueden reagruparse, por ejemplo, en diferentes grupos de puntos según criterios estadísticos o criterios para la densidad de estos puntos en un espacio N-dimensional, para definir un archivo que describa numéricamente la muestra biológica que se va a analizar mediante puntos que representan cada célula, reagrupados en grupos posicionados en el espacio N-dimensional.

[0075] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende una etapa de muestreo y digitalización de un conjunto de señales analógicas generadas durante la etapa de medición para definir un primer archivo de datos brutos análogo a un oscilograma digitalizado para cada uno de los N canales de medición, y una etapa de sincronización y reagrupamiento de las N señales digitalizadas para cada célula biológica de la muestra que se va a analizar mediante un primer nivel de tratamiento informático.

[0077] Según una implementación de la invención, la etapa de reagrupamiento consiste en reagrupar los puntos determinados en diferentes grupos de células utilizando métodos estadísticos o permitiendo aislar los grupos mediante el análisis de la densidad espacial de los puntos que representan las células en un espacio N-dimensional.

[0079] Según una implementación de la invención, cada eje de coordenadas del espacio N-dimensional corresponde a un parámetro de citometría respectivo.

[0081] Según una implementación de la invención, N es un número entero mayor o igual que 4, y puede ser, por ejemplo, igual a 5.

[0083] Según una implementación de la invención, el archivo de grupos de muestras está en formato FCS (estándar de citometría de flujo, por sus siglas en inglés).

[0085] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende además una etapa de emisión de un mensaje de alarma cuando el archivo de grupos de muestras es al menos parcialmente idéntico o similar a un archivo de grupos de referencia y, por ejemplo, cuando los grupos de células predeterminados del archivo de grupos de muestras son idénticos o similares a los grupos de células predeterminados del archivo de grupos de referencia.

[0087] Según una implementación de la invención, el mensaje de alarma emitido contiene indicaciones relacionadas con una patología o una anomalía asociada con el archivo de grupos de referencia con el que el archivo de grupos de muestras es al menos parcialmente idéntico o similar. Estas disposiciones permiten comunicar al operador una probabilidad de patología asociada a la muestra biológica analizada, pero en ningún caso constituyen un diagnóstico de la patología que pueda afectar al paciente del que se tomó la muestra biológica analizada.

[0088] Según una implementación de la invención, el método de análisis también comprende una etapa de análisis del archivo de grupos de muestras para detectar al menos una posible anomalía en el archivo de grupos de muestras.

[0089] En un ejemplo que no forma parte de la invención reivindicada, la etapa de comparación se realiza solo cuando se detecta al menos una anomalía durante la etapa de análisis.

[0090] Según una implementación de la invención, cuando se detecta al menos una anomalía durante la etapa de análisis, el mensaje de alarma emitido durante la etapa de emisión también contiene información relacionada con al menos una anomalía detectada.

[0091] Según una implementación de la invención, la etapa de análisis comprende una etapa de análisis, para cada grupo de células en el archivo de grupos de muestras, de al menos un parámetro morfológico de dicho grupo de células.

[0092] Según una implementación de la invención, al menos un parámetro morfológico de cada grupo de células del archivo de grupos de muestras puede comprender el posicionamiento de dicho grupo de células, la distribución de puntos en dicho grupo de células, el número de puntos en dicho grupo de células, y/o la presencia o ausencia de dicho grupo de células. Así, la detección de un contaje anómalo de un grupo de células, de un posicionamiento relativo anómalo entre diferentes grupos de células o incluso de la presencia de un grupo de células en relación con una población de células anómalas permite detectar una anomalía en el archivo de grupo de muestras.

[0093] Según una implementación de la invención, la etapa de análisis comprende una etapa de detección de una anomalía si al menos un parámetro morfológico de al menos un grupo de células en el archivo de grupos de muestras supera un valor umbral predeterminado respectivo.

[0094] Según un modo de implementación de la invención, la etapa de análisis comprende las etapas siguientes: - comparación, para cada grupo de células en el archivo de grupos de muestras, del número de puntos reagrupados en dicho grupo de células con al menos un valor umbral predeterminado respectivo, - detección de una anomalía si el número de puntos reagrupados en al menos uno de los grupos de células es menor y/o mayor que al menos un valor umbral predeterminado respectivo.

[0095] - Según un modo de implementación de la invención, la etapa de análisis comprende las etapas siguientes: - comparación, para cada grupo de células del archivo de grupos de muestras, del número de puntos reagrupados en dicho grupo de células con un valor umbral menor predeterminado respectivo o con un valor umbral mayor predeterminado respectivo,

[0096] - detección de una anomalía si el número de puntos reagrupados en al menos uno de los grupos de células es menor que el valor umbral menor predeterminado respectivo o mayor que el valor umbral mayor predeterminado respectivo.

[0097] Según un modo de implementación de la invención, la etapa de análisis comprende las etapas siguientes: - análisis de la distribución de puntos en cada grupo de células del archivo de grupos de muestra, - detección de una anomalía si la distribución de los puntos en al menos uno de los grupos de células no es gaussiana.

[0098] Según un modo de implementación de la invención, la etapa de análisis comprende las etapas siguientes: - análisis de la posición de los grupos de células del archivo de grupos de muestra,

[0099] - detección de una anomalía si al menos dos grupos de células del archivo de grupos de muestra se combinan al menos parcialmente.

[0100] Según un modo de implementación de la invención, la etapa de análisis comprende las etapas siguientes: - análisis de los grupos de células del archivo de grupos de muestra,

[0101] - detección de una anomalía si se detecta la presencia o ausencia de al menos un grupo predeterminado de células.

[0103] Según un modo de implementación de la invención, la etapa de análisis comprende las etapas siguientes:

[0104] - análisis del archivo de grupos de muestra,

[0106] - detección de una anomalía si el número de grupos de células es mayor o menor que un valor de referencia predeterminado.

[0108] Según una implementación de la invención, la etapa de análisis comprende una etapa de búsqueda de grupos de células anómalos o atípicos, es decir, situados fuera de los grupos de células normales, correspondiendo posiblemente los grupos de células anómalos o atípicos, por ejemplo, a células inmaduras o a parásitos. El método de análisis también puede comprender una etapa de comparación de estos grupos de células anómalos o atípicos con los archivos de referencia.

[0110] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende al menos una etapa de medición de los parámetros de citometría representativos de la morfología y/o de la estructura de las células biológicas de la muestra biológica que va a analizarse.

[0112] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende al menos una etapa de medición, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, de al menos una propiedad óptica de dicha célula biológica.

[0114] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende al menos una etapa de medición, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, de al menos una propiedad eléctrica y/o electromagnética de dicha célula biológica.

[0116] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende una etapa de medición de una cantidad de luz absorbida o reemitida por cada célula biológica de la muestra biológica que va a analizarse.

[0118] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende:

[0119] - una etapa para medir la intensidad de un haz de luz dispersado en ángulos pequeños por cada célula biológica, y/o

[0121] - una etapa para medir la intensidad de un haz de luz dispersado 90° por cada célula biológica, y/o

[0122] - una etapa para medir la intensidad de un haz de luz dispersado según una trayectoria óptica del haz de luz incidente por cada célula biológica.

[0124] La luz difundida por cada célula biológica ofrece información sobre la morfología y la estructura de dicha célula biológica. En particular, la intensidad de un haz de luz dispersado en ángulos pequeños, por ejemplo, en ángulos menores que 15°, ventajosamente iguales a 4° y/o 9°, por cada célula biológica es sustancialmente proporcional al tamaño de dicha célula biológica, mientras que la intensidad de un haz de luz dispersado a 90° por cada célula biológica es proporcional a la forma, a la estructura interna y a la granularidad de dicha célula biológica. Además, la intensidad de un haz de luz en el eje óptico del haz de luz incidente por cada célula biológica es proporcional al tamaño y la viabilidad de dicha célula biológica. Tal medición de la difusión a lo largo de la trayectoria óptica del haz de luz incidente corresponde a una medición de la intensidad de la absorción de luz de cada célula biológica.

[0126] Así, la utilización simultánea de estos dos o tres parámetros anteriormente mencionados (medición de impedancia, medición de absorción óptica, mediciones de difusión en varios ángulos) permite distinguir, en una muestra biológica, por ejemplo, plaquetas, eritrocitos, linfocitos, monocitos y las diferentes poblaciones de células polinucleares.

[0128] Los valores de ángulo que se indican a continuación se refieren a la trayectoria óptica del haz de luz incidente.

[0129] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende una etapa de medición de la intensidad de al menos un haz fluorescente emitido por cada célula biológica, por ejemplo, a 90°.

[0130] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría también comprende una etapa de medición de la variación en la impedancia eléctrica generada por el paso de células biológicas a través de una cámara de medición.

[0132] Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría consta de las etapas siguientes:

[0134] - emisión de un haz de luz incidente en la dirección de las células biológicas que pasan a la cámara de medición de tal manera que el haz de luz incidente cruza el trayecto de las células biológicas,

[0136] - detección de al menos un haz de luz procedente de cada célula biológica que pasa a la cámara de medición.

[0138] Según una implementación de la invención, la etapa de paso consta de al menos una etapa de revestimiento hidrodinámico de las células biológicas que pasan a la cámara de medición.

[0140] Según una implementación de la invención, la etapa de detección comprende una etapa de detección simultánea de al menos un haz de luz dispersado por cada célula biológica que pasa a la cámara de medición y de al menos un haz fluorescente emitido por cada célula biológica que pasa a la cámara de medición.

[0141] Según una implementación de la invención, la etapa de detección comprende una etapa de detección simultánea de haces de luz dispersados en al menos dos direcciones diferentes por cada célula biológica que pasa a la cámara de medición y de al menos dos haces fluorescentes emitidos por cada célula biológica que pasa a través de la cámara de medición en al menos dos longitudes de onda diferentes.

[0143] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende una etapa de determinación de la estructura y/o la forma de dichas células biológicas.

[0145] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende una etapa de determinación de la concentración de células biológicas y/o la distribución de las células biológicas en los grupos de células respectivos.

[0147] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende además las etapas siguientes:

[0148] - paso de las células biológicas de una muestra biológica de referencia a una celda de medición de un citómetro de flujo,

[0150] - medición de los N parámetros de citometría para cada célula biológica contenida en la muestra biológica de referencia,

[0152] - determinación, para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, de un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para dicha célula biológica de la muestra biológica de referencia, donde N es un número entero mayor o igual que 3,

[0154] - reagrupamiento automático de los puntos determinados relacionados con la muestra biológica de referencia en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, para definir un archivo de grupos de referencia,

[0155] - repetición de dichas etapas de paso, medición, determinación y reagrupamiento para una pluralidad de muestras biológicas de referencia con el fin de definir una pluralidad de archivos de grupos de referencia.

[0156] Según una implementación de la invención, el método de análisis consta, antes de la etapa de paso de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar, de una etapa de preparación de la muestra biológica que se va a analizar. La etapa de preparación consta, por ejemplo, de una etapa de dilución de la muestra biológica que se va a analizar, por ejemplo, usando un diluyente isotónico. La etapa de preparación también puede comprender, además de la etapa de dilución, una etapa de lisis selectiva de al menos algunas células biológicas contenidas en la muestra biológica que se va a analizar y, por ejemplo, eritrocitos.

[0158] Según una implementación de la invención, la etapa de preparación comprende una etapa de marcado de al menos algunas células biológicas contenidas en la muestra biológica que se va a analizar, y más particularmente los ácidos nucleicos de al menos algunas células biológicas contenidas en la muestra biológica que se va a analizar, con un fluorocromo, tal como un colorante fluorescente.

[0159] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende una etapa de integración del archivo de grupos de muestras como un archivo de grupos de referencia. Dicha etapa de integración se realiza, en especial, después de que un hematólogo haya identificado la patología relacionada con la muestra biológica que se va a analizar y haya asociado las indicaciones relacionadas con dicha patología al archivo de grupos de muestras.

[0161] Según una implementación de la invención, el método de análisis, y, en especial, la etapa de análisis, comprende una etapa de comparación del archivo de grupos de muestras con los archivos de grupos normales, definiéndose cada uno de los archivos de grupos normales a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica normal respectiva. En la presente descripción, el término muestra biológica «normal» significa una muestra biológica que no es patológica y que no es anómala.

[0163] Según una implementación de la invención, la etapa de preparación comprende la adición, a la muestra biológica que se va a analizar, de uno o más reactivos que contienen anticuerpos específicos para los receptores que se encuentran en las membranas de las células biológicas. Estos anticuerpos se conjugan con trazadores fluorescentes o con partículas que permiten generar una o más señales específicas en cada célula. Así, el método de análisis según la invención permite añadir, a las cantidades físicas básicas convertidas numéricamente en parámetros de citometría, mediciones inmunohematológicas bajo demanda para poder precisar o confirmar mejor un diagnóstico.

[0165] La presente invención también se refiere a un aparato de análisis que comprende:

[0167] - un citómetro de flujo que comprende una célula de medición destinada al paso de células biológicas de una muestra biológica que se va a analizar y medios de medición configurados para medir los parámetros de citometría de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar, y

[0169] - unidad de tratamiento configurada para:

[0171] - determinar, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para la célula biológica correspondiente de la muestra biológica que se va a analizar, donde N es un número entero mayor o igual que 3,

[0173] - reagrupar puntos en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, para definir un archivo de grupos de muestras,

[0175] - comparar el archivo de grupos de muestras con los archivos de grupos de referencia, definiéndose cada uno de los archivos de grupos de referencia a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica patológica o anómala respectiva.

[0177] Según una implementación de la invención, el aparato de análisis es un aparato de análisis para el diagnósticoin vitro,tal como un aparato de hematología.

[0179] Según una implementación de la invención, la celda de medición del citómetro de flujo está inclinada con respecto a la horizontal y, por ejemplo, en un ángulo de aproximadamente 45°.

[0181] En cualquier caso, la invención se entenderá bien con la ayuda de la siguiente descripción con referencia a los dibujos esquemáticos adjuntos que representan, a modo de ejemplo no limitativo, una forma de ejecución de este citómetro de flujo.

[0183] Las figuras 1 y 2 son vistas en perspectiva de un citómetro de flujo que pertenece a un citómetro de flujo según la presente invención.

[0185] La figura 3 es una vista en sección transversal del citómetro de flujo de la figura 1.

[0187] La figura 4 es una vista ampliada de un detalle de la figura 3.

[0189] La figura 5 es una vista en sección transversal del citómetro de flujo de la figura 1.

[0191] La figura 6 es una vista en sección según la línea VI-VI de la figura 2.

[0193] Las figuras 6 y 7 son vistas en una escala ampliada de detalles de la figura 3.

[0194] La figura 8 es una vista desde arriba de un aparato de análisis que comprende el citómetro de flujo según la presente invención.

[0196] Las figuras 1 a 7 representan un citómetro de flujo 3, también denominado cabezal de medición citométrico, que pertenece a un aparato de análisis 2 según la presente invención.

[0198] El citómetro de flujo 3 comprende un soporte 4 monobloque que, por ejemplo, puede ser metálico. El soporte 4 es paralelepipédico y delimita una carcasa receptora 5 interna. El soporte 4 consta, en especial, de seis aberturas de paso dispuestas respectivamente en las seis caras externas del soporte 4.

[0200] El citómetro de flujo 3 también comprende una celda de medición 6 (mostrada más particularmente en la figura 4) que delimita al menos en parte una cámara de medición 7, un dispositivo de inyección 8 dispuesto para inyectar un flujo de células biológicas F en la cámara de medición 7, y un dispositivo de evacuación 9 dispuesto para evacuar fuera del citómetro de flujo 3 el flujo de células biológicas F inyectado en la cámara de medición 7.

[0202] Como se muestra en la figura 4, la celda de medición 6 es anular y está interpuesta de manera sellada entre los dispositivos de inyección y evacuación 8, 9. La celda de medición 6 está alojada en la carcasa receptora 5 delimitada por el soporte 4, y está aislada de forma fluida de la carcasa receptora 5. La celda de medición 6 está realizada ventajosamente de un material que es eléctricamente aislante y transparente a la luz y, por ejemplo, está hecha de polimetacrilato de metilo, vidrio o cuarzo para evitar la autofluorescencia.

[0204] Los dispositivos de inyección y evacuación 8, 9 están fijados, respectivamente, a dos caras externas opuestas del soporte 4 y, por ejemplo, a las caras externas laterales opuestas del soporte 4. Sin embargo, los dispositivos de inyección y evacuación 8, 9 también podrían fijarse respectivamente a las dos caras externas superior e inferior del soporte 4.

[0206] Como se muestra más particularmente en las figuras 3 y 6, el dispositivo de inyección 8 comprende una boquilla de inyección 11 que delimita una cámara interna 12. La boquilla de inyección 11 está provista de un puerto de inyección 13 que se abre hacia la cámara de medición 7 y está dispuesto para conectarse de manera fluida a la cámara interna 12 a la cámara de medición 7.

[0208] El dispositivo de inyección 8 también comprende un primer conducto de alimentación 14 tubular destinado a alimentar a la cámara interna 12 una muestra biológica que se va a analizar que contiene, en suspensión, células biológicas que se van a analizar.

[0210] Como se muestra en la figura 1, el dispositivo de inyección 8 también consta de un conducto de descarga 15 conectado de manera fluida a la cámara interna 12 y destinado a descargar el contenido de la cámara interna 12 al exterior del citómetro de flujo 3. Más particularmente, el conducto de descarga 15 está destinado a descargar fuera del citómetro de flujo 3 un fluido de enjuague introducido en la cámara interna 12 a través del primer conducto de alimentación 14.

[0212] El dispositivo de inyección 8 también comprende un segundo conducto de alimentación 16 destinado a alimentar a la cámara interna 12 un fluido de revestimiento. La boquilla de inyección 11 y el segundo conducto de alimentación 16 están configurados de tal manera que el fluido de revestimiento introducido en la cámara interna 12 a través del segundo conducto de alimentación 16 puede envolver hidrodinámicamente la muestra biológica introducida en la cámara interna 12 antes de que la muestra biológica pase a través del puerto de inyección 13.

[0214] Como se muestra en la figura 7, el dispositivo de evacuación 9 delimita una cámara interna 17 que se abre hacia la cámara de medición 7 y también comprende un conducto de evacuación 18 tubular conectado de manera fluida a la cámara de medición 7 y destinado a evacuar el flujo de células biológicas F inyectadas en la cámara de medición 7 hacia el exterior del citómetro de flujo 3. El conducto de evacuación 18 se extiende en parte hacia una cámara interna 17 y desemboca en la cámara de medición 7 opuesta al puerto de inyección 13.

[0215] El dispositivo de evacuación 9 también comprende un tercer conducto de alimentación 19 conectado de manera fluida a la cámara de medición 7 y destinado a alimentar a la cámara de medición 7 un fluido de revestimiento. La cámara de medición 7 y el tercer conducto de alimentación 19 están configurados de tal manera que el fluido de revestimiento introducido en la cámara de medición 7 a través del tercer conducto de alimentación 19 es capaz de envolver hidrodinámicamente el flujo de células biológicas F que fluyen a través de la cámara de medición 7.

[0217] Como se muestra en las figuras 1 y 7, el dispositivo de evacuación 9 también consta de un conducto de descarga 21 conectado de manera fluida a la cámara de medición 7 y destinado a descargar el contenido de la cámara de medición 7 al exterior del citómetro de flujo 3. El conducto de descarga 21 está destinado más particularmente a descargar fuera del citómetro de flujo 3 un fluido de enjuague introducido en la cámara de medición 7 a través del tercer conducto de alimentación 19.

[0219] El citómetro de flujo 3 también comprende medios de medición configurados para medir los parámetros de citometría de las células biológicas que se van a analizar y, en especial, para medir las propiedades ópticas y eléctricas de las células biológicas que se van a analizar.

[0221] Según la realización representada en las figuras 1 a 7, los medios de medición constan de un dispositivo de emisión 22 dispuesto para emitir un haz de luz incidente en la dirección de la cámara de medición 7 y capaz de cruzar, es decir, intersecar, el flujo de células biológicas F introducido en la cámara de medición 7, y varios dispositivos de recogida 23a, 23b, 23c desplazados angularmente con respecto al flujo de las células biológicas F y dispuestos para recoger los haces de luz de las células biológicas que pasan a través de la cámara de medición 7. No obstante, los medios de medición podrían constar, por ejemplo, de varios dispositivos de emisión desplazados angularmente con respecto al flujo de células biológicas, y también solo uno o varios dispositivos de recogida.

[0223] Los dispositivos de emisión y recogida están montados en las caras externas superior e inferior del soporte 4 y se extienden en un plano sustancialmente perpendicular a la dirección del flujo de células biológicas F. El dispositivo de recogida 23a está dispuesto, por ejemplo, opuesto al dispositivo de emisión 22 con respecto a la celda de medición 6, mientras que los dispositivos de recogida 23b y 23c están dispuestos perpendiculares al dispositivo de emisión 22 con respecto a la celda de medición 6. No obstante, según una variante de implementación de la invención, el dispositivo de emisión 22 y el dispositivo de recogida 23a podrían montarse en las caras externas laterales del soporte 4.

[0225] El dispositivo de emisión 22 comprende una fuente de luz 24 dispuesta para generar el haz de luz incidente. La fuente de luz 24 puede ser, por ejemplo, una fuente láser dispuesta para generar un haz láser.

[0227] Según la realización representada en las figuras 1 a 7 y como se deduce más particularmente de la figura 1, el dispositivo de recogida 23a comprende una pluralidad de elementos de recogida ópticos y, más particularmente, una fibra óptica de recogida central 25a y una o más fibras ópticas de recogida periféricas 25b. Por ejemplo, la fibra óptica de recogida central 25a está destinada a recoger los haces de luz procedentes de la cámara de medición 7 según la trayectoria óptica del haz de luz incidente, es decir, a 0°, y las fibras ópticas de recogida periféricas 25b están destinadas a que algunas recojan los haces de luz que provienen de la cámara de medición 7 en un ángulo del orden de 4° y para que otras recojan los haces de luz que provienen de la cámara de medición 7 en un ángulo del orden de 9°. Sin embargo, el dispositivo de recogida 23a podría comprender una única fibra óptica de recogida periférica 25b.

[0229] Por ejemplo, el dispositivo de recogida 23b podría comprender un único elemento óptico de recogida, tal como una fibra óptica de recogida central, y el dispositivo de recogida 23c también podría comprender, por ejemplo, un único elemento óptico de recogida, tal como una fibra óptica de recogida central.

[0231] Los medios de medición también comprenden una pluralidad de elementos de detección (no representados en las figuras), cada uno asociado a un dispositivo de recogida 23a-23c respectivo. Cada elemento de detección está dispuesto para suministrar una señal de medición determinada en función de los haces de luz recogidos por el dispositivo de recogida respectivo. A medida que cada célula biológica atraviesa el haz de luz incidente, cada señal de medición suministrada en la salida por cada elemento de detección es, por ejemplo, proporcional a la cantidad de luz absorbida o reemitida por dicha célula biológica. Por ejemplo, cada elemento de detección puede ser un fotodetector, tal como un fotodiodo, o también un fotomultiplicador.

[0233] Los medios de medición también comprenden ventajosamente un dispositivo para medir la variación en la impedancia eléctrica dispuesto para medir la variación en la impedancia eléctrica generada por el paso de células biológicas a través del puerto de inyección 13. El dispositivo para medir la variación en la impedancia eléctrica comprende, por ejemplo, un primer y un segundo electrodo (no representados en las figuras) dispuestos respectivamente a cada lado del puerto de inyección 13. Los electrodos primero y segundo están destinados a estar en contacto eléctrico con el flujo de las células biológicas F para establecer un campo eléctrico a través del puerto de inyección 13. Según una variante de realización del dispositivo para medir la variación de la impedancia eléctrica, este último podría comprender un único electrodo dispuesto al menos en parte en la cámara interna 17, y el potencial de la cámara interna 12 podría estar conectado a tierra, de modo que el dispositivo para medir la variación en la impedancia eléctrica esté configurado para medir una variación en la impedancia eléctrica entre la cámara interna 12 y el electrodo colocado en la cámara interna 17.

[0235] Un dispositivo de este tipo para medir la variación en la impedancia eléctrica permite contar el número de células biológicas que pasan a través del puerto de inyección 13 y también determinar el tamaño y, más precisamente, el volumen de las células biológicas. El funcionamiento de un dispositivo de este tipo para medir la variación de la impedancia eléctrica es conocido por los expertos en la materia y, por lo tanto, no se describe en detalle. Ahora bien, cabe señalar que el paso de cada célula biológica a través del puerto de inyección 13 provoca un impulso eléctrico proporcional al tamaño o volumen de dicha célula biológica.

[0236] Como se muestra en la figura 8, el aparato de análisis 2 también comprende una unidad de tratamiento 32 configurada para analizar los parámetros de citometría medidos por los medios de medición del citómetro de flujo 3 y, en especial, para analizar las señales de medición suministradas por cada elemento de detección. La unidad de tratamiento 32 está configurada más particularmente para diferenciar e identificar las células biológicas de una muestra biológica que se va a analizar y, en especial, para determinar la estructura y la forma de las células biológicas a partir de los parámetros de citometría medidos por los medios de medición. Más particularmente, la unidad de tratamiento 32 consta de al menos una tarjeta electrónica de tratamiento equipada con un microprocesador.

[0238] Como se muestra en la figura 8, el aparato de análisis 2 puede comprender dos citómetros de flujo 3 y también un módulo de carga 33 dispuesto para mover al menos una gradilla en una primera dirección de movimiento D1, un módulo de descarga 34 dispuesto para mover al menos una gradilla en una segunda dirección de movimiento D2, un módulo de agitación (no visible en la figura 8) dispuesto para mover al menos una gradilla entre el módulo de carga y el módulo de descarga, el módulo de agitación y los módulos de carga y descarga que definen una trayectoria de transporte de gradillas en forma general de U. Ventajosamente, el aparato de análisis 2 también consta de un módulo de muestreo 36 dispuesto para tomar muestras de fluido biológico de los recipientes recibidos en una gradilla colocada en el módulo de agitación.

[0240] El aparato de análisis 2 también puede comprender:

[0242] - un rotor de carga 37 dispuesto entre los módulos de carga y descarga y con un eje de rotación sustancialmente vertical, comprendiendo el rotor de carga 37 una pluralidad de carcasas 38 capaces de recibir recipientes que contienen muestras de fluido biológico que se va a analizar o productos reactivos y, en especial, capaz de recibir cartuchos para realizar pruebas configurables, por lo tanto, de inmunohematología, pero también de inmunología, en sangre total, estando dispuesto el módulo de toma de muestras 36 para tomar muestras o productos reactivos en recipientes recibidos en el rotor de carga 37,

[0244] - medios de accionamiento de rotación asociados con el rotor de carga 37 y dispuestos para accionar el rotor de carga 37 en rotación alrededor de su eje de rotación,

[0246] - un rotor de preparación 39 con un eje de rotación sustancialmente vertical, comprendiendo el rotor de preparación 39 una pluralidad de cubetas de preparación 41, estando dispuesto el módulo de muestreo 36 para alimentar a las cubetas de preparación 41 muestras de fluido biológico o de productos reactivos previamente recolectados, y

[0248] - medios de accionamiento de rotación asociados con el rotor de preparación 39 y dispuestos para accionar el rotor de preparación 39 en rotación alrededor de su eje de rotación.

[0250] La presencia de cartuchos en el rotor de carga 37 permite añadir reactivos de preparación adicionales y, por lo tanto, añadir, a las mediciones de los parámetros de citometría física o morfológica, mediciones de parámetros de citometría de naturaleza inmunohematológica.

[0252] Además, el aparato de análisis 2 puede estar provisto, a nivel del rotor de preparación 39, de un dispositivo magnético que permita capturar partículas magnéticas en solución. Estas partículas magnéticas están recubiertas con anticuerpos que permiten capturar selectivamente un cierto tipo de célula, por ejemplo, todos los leucocitos. Así, después de la resuspensión en un diluyente isotónico, la muestra biológica preparada contiene solo leucocitos sin recurrir a la lisis para destruir los glóbulos rojos que son mil veces más numerosos. Por lo tanto, los leucocitos están intactos y entonces es posible adaptar las tasas de dilución para poder efectuar las mediciones de los N parámetros de citometría en un número significativo de células con la posibilidad de identificar pocas células o raras. Además, los leucocitos también pueden marcarse selectivamente para la identificación inmunológica clásica (por ejemplo, los linfocitos T).

[0254] Ahora se describirá un método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas usando un citómetro de flujo 2 según la presente invención.

[0256] Un método de análisis de este tipo comprende las etapas siguientes:

[0258] - preparar la muestra biológica que se va a analizar, comprendiendo la etapa de preparación, por ejemplo, una etapa de dilución de la muestra biológica que se va a analizar, por ejemplo, usando un diluyente isotónico, y/o una etapa de lisis selectiva de al menos algunas células biológicas contenidas en la muestra biológica que se va a analizar, tales como los eritrocitos, y/o una etapa de marcado de al menos algunas células biológicas contenidas en la muestra biológica que se va a analizar con un fluorocromo, - hacer pasar las células biológicas contenidas en la muestra biológica que se va a analizar a la cámara de medición 7 del citómetro de flujo 3,

[0260] - medir los N parámetros de citometría para cada célula biológica contenida en la muestra biológica que se va a analizar, tales como los parámetros de citometría representativos de la morfología y/o estructura de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar, usando el citómetro de flujo 3,

[0261] - determinar, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para dicha célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, correspondiendo cada eje de coordenadas del espacio N-dimensional a un parámetro de citometría medido respectivo o a un valor calculado a partir de dicho parámetro de citometría medido respectivo,

[0263] - reagrupar de manera automática los puntos relacionados con la muestra biológica que se va a analizar en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, con el fin de definir un archivo de grupos de muestras, estando el archivo de grupos de muestras, por ejemplo, en formato FCS (estándar de citometría de flujo),

[0265] - identificar de manera automática las poblaciones de células definidas por los distintos grupos de células del archivo de grupos de muestra,

[0267] - contar de manera automática los puntos de cada grupo de células en el archivo de grupos de muestra,

[0268] - comparar el archivo de grupos de muestras con los archivos de grupos de referencia, definiéndose cada uno de los archivos de grupos de referencia a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica patológica o anómala respectiva,

[0270] - emitir un mensaje de alarma cuando el archivo de grupos de muestras es al menos parcialmente idéntico o similar a un archivo de grupos de referencia y, en particular, cuando los grupos de células predeterminadas del archivo de grupos de muestras son idénticos o similares a los grupos de células predeterminadas del archivo de grupos de referencia, el mensaje de alarma emitido contiene ventajosamente indicaciones relacionadas con una patología o una anomalía asociada con el archivo de grupos de referencia al que el archivo de grupos de muestras es al menos parcialmente idéntico o similar, las etapas de determinación, reagrupación, comparación y emisión que realiza la unidad de tratamiento 32.

[0272] Tal etapa de reagrupamiento automático se puede realizar de diferentes maneras conocidas por los expertos en la materia y, por lo tanto, no se describe en detalle en la presente descripción.

[0274] Según una implementación de la invención, el método de análisis comprende una etapa de muestreo y digitalización de un conjunto de señales analógicas generadas durante la etapa de medición para definir un primer archivo de datos brutos digitalizado para cada uno de los N canales de medición, y una etapa de sincronización y reagrupamiento de las N señales digitalizadas para cada célula biológica de la muestra que se va a analizar mediante un primer nivel de tratamiento informático. Dicha etapa de muestreo y digitalización la realiza la unidad de tratamiento 32 que transmite los archivos mediante un enlace Ethernet a una unidad informática de tipo PC (no representada en la figura 8) que los analiza.

[0276] Según una implementación del método de análisis, este último también comprende una etapa de análisis del archivo de grupo de muestras para detectar al menos una posible anomalía en el archivo de grupos de muestras, realizándose la etapa de análisis por la unidad de tratamiento 32. En un ejemplo que no forma parte de la invención reivindicada, la etapa de comparación se realiza solo cuando se detecta al menos una anomalía durante la etapa de análisis y el mensaje de alarma emitido durante la etapa de emisión también contiene información relacionada con al menos una anomalía detectada. Estas disposiciones permiten, por una parte, evitar realizar la etapa de comparación si la muestra biológica que se va a analizar es normal y no patológica y, por lo tanto, disminuir el tiempo de ejecución de los cálculos y suministrar los resultados del análisis más rápidamente al operador, y, por otra parte, comunicar al operador un mensaje de alarma lo más detallado posible cuando la muestra biológica que se va a analizar es patológica o anómala.

[0278] La etapa de análisis comprende ventajosamente las siguientes etapas:

[0280] - analizar, para cada grupo de células en el archivo de grupos de muestras, al menos un parámetro morfológico de dicho grupo de células, tal como la posición de dicho grupo de células, la distribución de los puntos en dicho grupo de células, el número de puntos en dicho grupo de células y/o la presencia o ausencia de dicho grupo de células,

[0281] - detectar una anomalía si al menos un parámetro morfológico de al menos un grupo de células en el archivo de grupos de muestras supera un valor umbral predeterminado respectivo.

[0282] Según una implementación de la invención, la etapa de análisis comprende más particularmente las etapas siguientes:

[0283] - comparar, para cada grupo de células en el archivo de grupos de muestras, el número de puntos reagrupados en dicho grupo de células con al menos un valor umbral predeterminado respectivo, - analizar la distribución de puntos en cada grupo de células del archivo de grupos de muestra,

[0284] - analizar la posición de los grupos de células en el archivo de grupos de muestra,

[0285] - analizar la presencia y/o ausencia de al menos ciertos grupos de células predeterminadas,

[0286] - detectar una anomalía si la distribución de los puntos en al menos uno de los grupos de células no es gaussiana,

[0287] - detectar una anomalía si al menos dos grupos de células del archivo de grupos de muestra se combinan al menos parcialmente,

[0288] - detectar una anomalía si se detecta la presencia o ausencia de al menos un grupo predeterminado de células,

[0289] - detectar una anomalía si el número de grupos de células es mayor o menor que un valor de referencia predeterminado,

[0290] - detectar una anomalía si el número de puntos reagrupados en al menos uno de los grupos de células es menor y/o mayor que al menos un valor umbral predeterminado respectivo.

[0291] Según una implementación de la invención, la etapa de análisis comprende una etapa de comparación del archivo de grupos de muestras con los archivos de grupos normales, definiéndose cada uno de los archivos de grupos normales a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica normal respectiva. En especial, estas disposiciones permiten facilitar la detección de anomalías en el archivo de grupos de muestras. Según una implementación de la invención, la etapa de medición de los parámetros de citometría consta de las etapas siguientes:

[0292] - emisión, usando un dispositivo de emisión 22, de un haz de luz incidente en la dirección de las células biológicas que pasan a la cámara de medición 7 de tal manera que el haz de luz incidente cruce el trayecto de las células biológicas,

[0293] - detección, usando los dispositivos de recogida 23a-23c, de diversos haces de luz de cada célula biológica que pasa a la cámara de medición 7.

[0294] Teniendo en cuenta la configuración y la disposición de los diferentes dispositivos de recogida 23a-23c, la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende, en especial, las siguientes etapas:

[0295] - medición de la intensidad de los haces de luz dispersados en ángulos pequeños por cada célula biológica usando las fibras ópticas de recogida 25b, 25c del dispositivo de recogida 23a,

[0296] - medición de la intensidad de un haz de luz dispersado a lo largo de la trayectoria óptica del haz de luz incidente por cada célula biológica usando la fibra óptica de recogida central 25a del dispositivo de recogida 23a,

[0297] - medición de la intensidad de un haz de luz dispersado a 90° por cada célula biológica usando el dispositivo de recogida 23b, y

[0298] - medición de la intensidad de un haz fluorescente emitido a 90° por cada célula biológica usando el dispositivo de recogida 23c.

[0299] Ventajosamente, la etapa de medición de los parámetros de citometría también comprende una etapa de medición de la variación en la impedancia eléctrica generada por el paso de células biológicas a través de la cámara de medición 7, usando el dispositivo para medir la variación en la impedancia eléctrica.

[0301] Ventajosamente, el método de análisis comprende las siguientes etapas iniciales:

[0303] - medición de los parámetros de citometría para cada célula biológica contenida en una muestra biológica de referencia usando el citómetro de flujo 3,

[0305] - determinación, para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, de un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, correspondiendo cada eje de coordenadas del espacio N-dimensional correspondiente a un parámetro de citometría medido respectivo,

[0307] - reagrupamiento de manera automática de los puntos relacionados con la muestra biológica de referencia en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, para definir un archivo de grupos de referencia, estando cada archivo de grupos de referencia, por ejemplo, en formato FCS (citometría de flujo estándar), por ejemplo, realizando las etapas de determinación y reagrupamiento la unidad de tratamiento 32,

[0308] repetición de dichas etapas iniciales de medición, determinación y reagrupamiento para una pluralidad de muestras biológicas de referencia con el fin de definir una pluralidad de archivos de grupos de referencia.

[0309] Como es evidente, la invención no se limita a la única forma de ejecución del citómetro de flujo y a las únicas implementaciones del método de análisis, descritos antes a modo de ejemplos; por el contrario, abarca todas las variantes de implementación.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

1. Método para analizar una muestra biológica que contiene células biológicas, incluidas las células sanguíneas, comprendiendo el método de análisis las siguientes etapas:

- paso de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar a una celda de medición (6) de un citómetro de flujo (3),

- medición de los N parámetros de citometría para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar,

- determinación, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, de un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para la célula biológica correspondiente, donde N es un número entero mayor o igual que 3,

- reagrupamiento automático de los puntos determinados en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos, a fin de definir un archivo de grupos de muestras,

- identificación de las poblaciones de células definidas por los diferentes grupos de células del archivo de grupos de muestra definidos en la etapa de reagrupamiento,

- recuento de los puntos de cada grupo de células en el archivo de grupos de muestra definido en la etapa de reagrupamiento, caracterizándose el método por la etapa siguiente:

- comparación del archivo de grupos de muestras definidos en la etapa de reagrupamiento con los archivos de grupos de referencia, definiéndose cada uno de los archivos de grupos de referencia a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica patológica o anómala respectiva.

2. Método de análisis según la reivindicación 1, que también comprende una etapa de emisión de un mensaje de alarma cuando el archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento es al menos parcialmente idéntico o similar a un archivo de grupos de referencia.

3. Método de análisis según la reivindicación 2, en el que el mensaje de alarma emitido contiene indicaciones relacionadas con una patología o una anomalía asociada con el archivo de grupos de referencia al que el archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento es al menos parcialmente idéntico o similar.

4. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que también comprende una etapa de análisis del archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento para detectar al menos una posible anomalía en el archivo de grupos de muestras.

5. Método de análisis según la reivindicación 4, en el que la etapa de análisis comprende las etapas siguientes: - análisis, para cada grupo de células en el archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento, de al menos un parámetro morfológico de dicho grupo de células,

- detección de una anomalía si al menos un parámetro morfológico de al menos un grupo de células del archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento supera un valor umbral predeterminado respectivo.

6. Método de análisis según la reivindicación 4 o 5, en el que la etapa de análisis comprende las etapas siguientes:

- comparación, para cada grupo de células en el archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento, del número de puntos reagrupados en dicho grupo de células con al menos un valor umbral predeterminado respectivo,

- detección de una anomalía si el número de puntos reagrupados en al menos uno de los grupos de células es menor y/o mayor que al menos un valor umbral predeterminado respectivo.

7. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la etapa de análisis comprende las etapas siguientes:

- análisis de la distribución de puntos en cada grupo de células del archivo de grupos de muestra definido en la etapa de reagrupamiento,

- detección de una anomalía si la distribución de los puntos en al menos uno de los grupos de células no es gaussiana.

8. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la etapa de análisis comprende las etapas siguientes:

- análisis de la posición de los grupos de células en el archivo de grupos de muestra definido en la etapa de reagrupamiento,

- detección de una anomalía si al menos dos grupos de células del archivo de grupos de muestra definido en la etapa de reagrupamiento se combinan al menos parcialmente.

9. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la etapa de análisis comprende las etapas siguientes:

- análisis de los grupos de células en el archivo de grupos de muestra definido en la etapa de reagrupamiento,

- detección de una anomalía si se detecta la presencia o ausencia de al menos un grupo predeterminado de células.

10. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende al menos una etapa de medición de los parámetros de citometría representativos de la morfología y/o de la estructura de las células biológicas de la muestra biológica que va a analizarse.

11. Método de análisis según la reivindicación 10, en el que la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende al menos una etapa de medición, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, de al menos una propiedad óptica de dicha célula biológica.

12. Método de análisis según la reivindicación 11, en el que la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende:

- una etapa para medir la intensidad de un haz de luz dispersado en ángulos pequeños por cada célula biológica, y/o

- una etapa para medir la intensidad de un haz de luz dispersado 90° por cada célula biológica, y/o - una etapa para medir la intensidad de un haz de luz dispersado según una trayectoria óptica del haz de luz incidente por cada célula biológica.

13. Método de análisis según la reivindicación 11 o 12, en el que la etapa de medición de los parámetros de citometría comprende una etapa de medición de la intensidad de al menos un haz fluorescente emitido por cada célula biológica, por ejemplo, a 90°.

14. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la etapa de medición de los parámetros de citometría consta de las siguientes etapas:

- emisión de un haz de luz incidente en la dirección de las células biológicas que pasan a la cámara de medición de tal manera que el haz de luz incidente cruza el trayecto de las células biológicas,

- detección de al menos un haz de luz procedente de cada célula biológica que pasa a la cámara de medición.

15. Método de análisis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además las siguientes etapas:

- paso de las células biológicas de la muestra biológica de referencia a una célula de medición (6) de un citómetro de flujo (3),

- medición de los N parámetros de citometría para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia,

- determinación, para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, de un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para dicha célula biológica de la muestra biológica de referencia, donde N es un número entero mayor o igual

que 3,

- reagrupamiento automático de los puntos determinados relacionados con la muestra biológica de referencia en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica de referencia, para definir un archivo de grupos de referencia, - repetición de dichas etapas de paso, medición, determinación y reagrupamiento para una pluralidad de muestras biológicas de referencia con el fin de definir una pluralidad de archivos de grupos de referencia.

16. Aparato de análisis que comprende:

- un citómetro de flujo (3) que comprende una celda de medición (6) destinada al paso de células biológicas de una muestra biológica que se va a analizar y medios de medición (22, 23a, 23b, 23c) configurados para medir los parámetros de citometría de las células biológicas de la muestra biológica que se va a analizar, y - unidad de tratamiento (32) configurada para:

- determinar, para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, un punto en un espacio N-dimensional cuyas coordenadas se definen en función de los parámetros de citometría medidos para la célula biológica correspondiente de la muestra biológica que se va a analizar, donde N es un número entero mayor o igual que 3,

- reagrupar puntos en diferentes grupos de células en función de los parámetros de citometría medidos para cada célula biológica de la muestra biológica que se va a analizar, para definir un archivo de grupos de muestras, caracterizado por que la unidad de tratamiento está además configurada para lo siguiente: - comparar el archivo de grupos de muestras definido en la etapa de reagrupamiento con los archivos de grupos de referencia, definiéndose cada uno de los archivos de grupos de referencia a partir de los parámetros de citometría de una muestra biológica patológica o anómala respectiva.