ES3040934T3

ES3040934T3 - Modified capsid proteins for enhanced delivery of parvovirus vectors

Info

Publication number: ES3040934T3
Application number: ES16876517T
Authority: ES
Inventors: Richard Jude Samulski; Jayme Warischalk
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2025-11-05
Anticipated expiration: 2036-12-14
Also published as: EP4659816A2; BR112018011881A2; US12319715B2; RU2751953C2; CN108602859B; EP3390429B1; AU2016371779B2; RU2018125937A3; NZ743916A; JP2019506445A; MX2022006652A; MX2018007237A; US20250333453A1; JP2024045227A; RU2018125937A; AU2016371779C1; CA3008013A1; US11124546B2; JP2022065003A; CN108602859A

Abstract

Esta invención se refiere a proteínas de la cápside del parvovirus modificadas con una eficiencia de transducción mejorada, vectores virales que comprenden las mismas y métodos para utilizarlas para la administración de ácidos nucleicos a una célula o a un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de cápside modificadas para administración mejorada de vectores de parvovirus

Campo de la invención

Esta invención se refiere a proteínas de cápside de parvovirus modificadas con eficiencia de transducción mejorada, vectores virales que comprenden las mismas y métodos para usar las mismas para administración de ácidos nucleicos a una célula o un sujeto.

Antecedentes de la invención

Actualmente se están utilizando diferentes serotipos de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) en ensayos clínicos (por ejemplo, rAAV1 para deficiencia de lipoproteína lipasa, rAAV2 para amaurosis congénita de Leber, rAAV8 para hemofilia). De estos, rAAV1 se considera el mejor para administración intramuscular (i.m.), ya sea para tratar trastornos musculares directamente (por ejemplo, distrofia muscular) o para condiciones que pueden beneficiarse de la secreción de una proteína terapéutica en el torrente sanguíneo (por ejemplo, deficiencia de a-1 antitripsina (AAT)). Una limitación importante de este enfoque ha sido los niveles subterapéuticos de expresión transgénica, a pesar de la administración de dosis altas de rAAV. Por ejemplo, en tanto que los resultados de los ensayos clínicos de rAAV-AAT demuestran incrementos dependientes de la dosis en los niveles séricos de AAT después de la inyección i.m., en cohortes de dosis altas solo se logró ~3 % de la expresión de AAT objetivo. Como esta cohorte requirió 100 inyecciones intramusculares de 1,35 ml cada una, incrementar la dosis hasta el grado necesario para la corrección de la enfermedad puede no ser factible. Se han documentado observaciones similares para el producto farmacéutico basado en rAAV1 recientemente aprobado, Glybera. Para que la terapia de aumento génico de rAAV se convierta en una opción práctica en casos como estos, es esencial mejorar la eficiencia de transducción en el tejido muscular.

Los esfuerzos para incrementar la expresión transgénica se pueden dividir en enfoques endógenos, en donde la cápside de rAAV y el transgén en sí se modifican para mejorar la transducción, y/o enfoques exógenos, en donde se administran productos terapéuticos complementarios concurrentes con la administración de rAAV. En tanto que los enfoques exógenos, tal como supresión inmunitaria, han mejorado la transducción, el proceso de integración de nuevos descubrimientos de la biología de rAAV en el diseño de ensayos clínicos ha sido la táctica más exitosa. Esto se ilustra mejor con el desarrollo de numerosos serotipos de AAV que se presentan de manera natural y sus perfiles de transducción de tejido preferenciales. Esto permite el emparejamiento correcto del serotipo de AAV con el órgano diana (por ejemplo, los ensayos clínicos que utilizan administración i.m. de rAAV se volvieron demostrablemente más exitosos cuando se empleó rAAV1, en oposición al rAAV2 históricamente utilizado). Adicionalmente, los análisis biológicos y estructurales comparativos de serotipos han facilitado la evolución dirigida y la modificación racional de rAAV, lo que conduce al desarrollo de vectores de traducción de próxima generación.

Se ha resuelto la estructura de cápside de los serotipos de rAAV más comunes. Cada uno contiene 60 monómeros de repetición, compuestos por un núcleo de barril p conservado intercalado con bucles grandes que forman la topología de la superficie de cápside. Al comparar las estructuras de rAAV2 y rAAV4, los serotipos menos homólogos, se definieron un total de nueve regiones variables (VR; VRI a VRIX). El contenido de aminoácidos de las VR contribuye con fenotipos distintos a cada serotipo, tal como unión al receptor, reactividad antigénica y eficiencia de transducción. La comparación de las VR de rAAV2 (el rAAV prototípico) con transductores musculares más eficientes, tal como rAAV1, condujo a la primera cápside de rAAV modificada para ingresar al ensayo clínico. rAAV2.5 consiste en una cápside de rAAV2 injertada con cinco aminoácidos de rAAV1, aislados por su contribución a la eficiencia de rAAV1 en el músculo. Los estudios de seguimiento revelaron que solo se necesitaba un cambio de aminoácido individual para mejorar notablemente la eficiencia de rAAV2 en el músculo; específicamente, inserción de diferentes aminoácidos después de la posición 264, creando de este modo una posición de novo 265. Los estudios preclínicos continuos han sugerido que la traducibilidad de rAAV2 se limita por la eficiencia superior de serotipos tal como rAAV1 y rAAV6, así como la alta prevalencia de anticuerpos neutralizantes de rAAV2 dentro de la población. Estos serotipos de “próxima generación” se han aumentado adicionalmente para una transducción eficiente por modulación de aminoácidos de superficie en la cadena principal de cápside.

Puesto que rAAV1 se ha convertido en la principal opción para la aplicación musculoesquelética, que se usa en 67 % de los ensayos clínicos basados en i.m. en general y en 86 % en los últimos 5 años, mejorar la eficiencia de rAAV1 es oportuno para la traducción clínica. La presente invención proporciona proteínas de cápside modificadas que tienen características mejoradas y son adecuadas para generar vectores con una amplia variedad de usos, incluida terapia génica.

Sumario de la invención

Este estudio diseccionó la arquitectura de cápside de rAAV para desarrollar una estrategia de modificación diseñada para mejorar la transducción muscular. Contrariamente a los mutantes de inserción de rAAV2 265, la deleción de la posición 265 de la cápside de rAAV1 proporcionó el nivel más alto de mejora tanto para administración de transgén como para expresión en tejido muscular. Además, a través del modelado de homología y análisis mutacional, se identificaron dos regiones de la cápside que parecen trabajar juntas alostéricamente para controlar la eficiencia de transducción en rAAV6 y rAAV2. Los resultados proporcionan un mecanismo de desestabilización regional en el bucle VR1 debido a la destrucción de patrones de enlace de hidrógeno. Este descubrimiento permitió la mutación racional de estos serotipos adicionales a fin de mejorar la eficiencia de transducción por al menos un orden de magnitud en cada caso. Además, la expresión del transgén AAT clínico en los serotipos de rAAV quiméricos incrementó la expresión hasta 12,5 veces sobre rAAV1 parental, apoyando el uso de estas construcciones en ensayos clínicos. Este estudio valida un enfoque de diseño racional que usa modelado estructural y disección molecular de la cápside de rAAV para reactivos de administración mejorados más adecuados para estudios traslacionales.

Un aspecto de la invención se refiere a una proteína de cápside de parvovirus que comprende una secuencia de aminoácidos de proteína de cápside de un serotipo de AAV o cualquier otro parvovirus con una estructura de cápside icosaédrica de T=1, en donde el bucle de región variable 1 (VR1) que comprende los residuos de aminoácidos 258 a 272 de proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus se modifica por deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos para provocar desestabilización regional dentro del bucle debido a la destrucción dirigida de patrones de enlace de hidrógeno orquestada por los residuos, en donde la proteína de cápside que comprende la modificación proporciona, a un vector de virus que comprende la proteína de cápside, eficiencia de transducción incrementada con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a la proteína de cápside de la invención, en donde la proteína de cápside comprende una secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV u otro parvovirus que se une a sulfato de heparina, en donde uno o más residuos de aminoácidos que median la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se sustituyen y/o eliminan, en donde la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se reduce sustancialmente.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una proteína de cápside de AAV que comprende una secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV3a, AAV3b, AAV6 o AAV8, en donde uno o más residuos de aminoácidos que median la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se sustituyen y/o eliminan, en donde la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se reduce sustancialmente.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una proteína de cápside de AAV que comprende una secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV2, AAV3a o AAV3b, en donde la proteína de cápside comprende una inserción de uno o más residuos de aminoácidos inmediatamente después del residuo 264 de proteína de cápside de AAV2 o el residuo correspondiente de proteína de cápside de AAV3a o AAV3b, y uno o más residuos de aminoácidos que median la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se sustituyen y/o eliminan, en donde la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se reduce sustancialmente; en donde la proteína de cápside proporciona a un vector de virus que comprende la proteína de cápside eficiencia de transducción incrementada con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside no modificada.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un polinucleótido que codifica para la proteína de cápside de la invención, una cápside de parvovirus que comprende la proteína de cápside de la invención, un vector de virus que comprende la proteína de cápside de la invención y una composición farmacéutica que comprende el vector de virus de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para administrar un ácido nucleico a una célula, el método que comprende poner en contacto la célula con el vector de virus o la composición farmacéutica de la invención bajo condiciones suficientes para que el ácido nucleico ingrese a la célula.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para administrar un ácido nucleico a un sujeto, el método que comprende administrar al sujeto el vector de virus o la composición farmacéutica de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para administrar un ácido nucleico a un sujeto, el método que comprende administrar al sujeto una célula que se ha puesto en contacto con el vector de virus o la composición farmacéutica de la invención bajo condiciones suficientes para que el ácido nucleico ingrese a la célula.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para producir una partícula de parvovirus recombinante, que comprende proporcionar a una célula permisiva para replicación de parvovirus: (a) una plantilla de parvovirus recombinante que comprende (i) un ácido nucleico heterólogo, y (ii) al menos una repetición terminal invertida; y (b) un polinucleótido que comprende secuencia codificadoras de proteína de replicación y secuencias que codifican para la proteína de cápside de la invención; bajo condiciones suficientes para la replicación y empaquetamiento de la plantilla de parvovirus recombinante; por lo que las partículas de parvovirus recombinante se producen en la célula.

Estos y otros aspectos de la invención se exponen con más detalle en la descripción de la invención más adelante.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1D muestran la caracterizaciónin vivode mutantes de posición 265 de rAAV1 después de la inyección i.m. (A) A los ratones se les administró 1e10 vg en el GC. La expresión de transgén de luciferasa se visualizó y cuantificó usando imagenología bioluminiscente de animales vivos a 7 dpi. Las unidades mostradas son conteos por minuto sobre la región de interés (CPM/ROI). Para propósitos de visualización, rAAV1 se muestra en una escala diferente a los 265 mutantes. Esto no afecta la cuantificación de imágenes. Para la cuantificaciónex vivodel fenotipo de transducción (B), el músculo inyectado se cosechó y se lisó, y el ensayo de luciferasa se realizó en producto lisado de tejido. Mediciones representadas como unidades de luz relativas normalizadas a mg de proteína total (RLU/mg de proteína). (C) Los números de copias de transgén viral por célula (vg/cg) se midieron usando qPCR. (D) Se realizó un curso de tiempo de la cinética de expresión en rAAV1 y rAAV1/T265del después de la inyección de 1e10vg. Todos los datos representan n=4 por grupo; en el panel (A) se muestra una imagen representativa por grupo.

Las figuras 2A-2C muestran el fenotipo del mutante de deleción 265 en rAAV6. (A) Expresión de transgén de luciferasa 7 dpi de 1e10 vg de rAAV6 o rAAV6/T265del. (B) Alineación de la región de cápside VR1 de rAAV1 (gris claro) y rAAV6 (gris oscuro). El residuo 265 se resalta en azul oscuro en rAAV1 y en amarillo en rAAV6. Imagen generada en PyMol usando coordenadas cristalográficas disponibles para estas cápsides. (C) Expresión transgénica después de la inyección de mutantes puntuales de rAAV1- >rAAV6 en GC de ratón. Los datos representados como veces de diferencia con respecto a la expresión medida de rAAV6. Todos los datos representan n=4 por grupo.

Las figuras 3A-3D muestran la visualización de las posiciones de aminoácidos 265 y 531 en la cápside de rAAV6. Representación de Pymol de las coordenadas cristalográficas de la cápside de rAAV6 (A), con cada eje icosaédrico de simetría etiquetado. (B) Acercamiento del eje de simetría de 3 veces, con residuos 265 y 531 de color púrpura y naranja, y denotados por flechas. (C) Acercamiento del eje de simetría de 5 veces, con residuos 265 y 531 de color púrpura y naranja, y denotados por flechas. (D) Acercamiento del eje de simetría de 2 veces, con residuos 265 y 531 de color púrpura y naranja, y denotado por flechas.

Las figuras 4A-4C muestran el efecto de las interacciones de cápside:heparina en el fenotipo de transducción de la mutación 265. (A) Expresión transgénica 7 dpi de mutantes de cápside de rAAV2 en el GC. (B) Representación de Pymol de la cápside de rAAV6 con residuos T265 (púrpura), K531 (naranja) y R585 (azul) indicados, en el contexto del eje de simetría de 3 veces. El círculo discontinuo representa el contorno general de la huella de unión a heparina. (C) Expresión del gen trans de construcciones de rAAV2 y rAAV1 inyectadas en GC después de la preincubación en una solución salina o solución de sulfato de heparina. Todos los datos representan n=4 por grupo.

Las figuras 5A-5D muestran perfiles de elución de cromatografía de afinidad de heparina de construcciones de rAAV2 y rAAV6 usadas en este estudio. Las construcciones de rAAV2 (A, B) y rAAV6 (C, D) usadas en este estudio se incubaron con perlas de agarosa conjugadas con heparina y entonces se eluyeron de perlas usando lavados de NaCl cada vez más rigurosos. Los perfiles de elución se recolectaron al cuantificar el número de genomas virales presentes en cada fracción eluida usando RT-qPCR. Los experimentos se repitieron por triplicado; se muestra un cromatograma representativo por grupo.

La figura 6 muestra la expresión transgénica de mutantes de escaneo de deleción de VR1 en la cápside de rAAV1. Se crearon mutaciones de deleción individual en el bucle VR1 de la cápside de rAAV1, y las construcciones se inyectaron en GC de ratón a una dosis de 1e10vg. La expresión transgénica se representa como las veces de diferencia con respecto a la medida después de la inyección de rAAV1. La gráfica anterior de dibujos representa residuos que se mutaron para este estudio en gris claro, con la posición 265 representada en gris oscuro. También se muestra la ubicación de las láminas beta N- y C-terminales que rodean VR1. Los datos son representativos de n=4 por grupo.

La figura 7 muestra la concentración en suero de hAAT después de la inyección i.m. de construcciones de rAAV1 y rAAV6. La cápside de rAAV1 y rAAV6 que empaqueta un transgén de hAAT se inyectaron en el músculo GC a una dosis de 1e10vg. 5 semanas después de la inyección, se recolectó suero y se usó ELISA para determinar las cantidades de proteína hAAT dentro de la sangre. Los datos representan n=4 por grupo.

La figura 8 muestra enlaces de hidrógeno en la región VR1 de las cápsides de rAAV1 y rAAV6. Los pares de átomos implicados en la formación de enlaces de hidrógeno se calcularon para las coordenadas cristalográficas de rAAV1 y rAAV6 usando el análisis de contacto de todos los átomos de MolProbity y se visualizaron usando el programa de gráficos KiNG. Los residuos que comprenden el bucle VR1 se etiquetan. Los enlaces de hidrógeno generados a partir del residuo 265 se visualizan usando puntos verdes y se indican por flechas. Las cadenas laterales de VR1 son de color naranja y la cadena principal de proteína es de color amarillo.

La figura 9 muestra la expresión transgénica después de la inyección de las construcciones de rAAV1 y rAAV6 en el ojo.

La figura 10 muestra la expresión transgénica después de la inyección de las construcciones de rAAVI y rAAV6 en el ojo.

Las Figuras 11A-11H muestran redes de enlace de hidrógeno VR1 visualizadas por software de visualización KiNG (A). Las cadenas principales de proteínas se representan en naranja, las cadenas laterales en verde claro. Los enlaces de hidrógeno se muestran como nubes de color verde oscuro, con flechas que indican enlaces de hidrógeno presentes en VR1. Los residuos de VR1 se etiquetan. En el panel (B), se resaltan los siguientes enlaces para rAAVI: HG1 T265 a O S262; O A263 a HG1 T265; OG S264 a H T265. En el panel (C), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV2: OG S264 a H G265; H A266 a O Q263. En el panel (D), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV3b: O Q263 a H A266; O Q263 a H G265. En el panel (E), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV4: O L258 a H N261. En el panel (F), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV5: H S258 a O V255; O S258 a H N261. En el panel (G), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV6: O S264 A a HG S264 A; HG1 T265 a O S262; OG S262 a Hd 1 H272. En el panel (H), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV8: HG1 T265 a O T265. En el panel (I), se resaltan los siguientes enlaces para rAAV9: HG S265 a O S265; H G267 a O S263.

Las figuras 12A-12H muestran redes de enlaces de hidrógeno VR1 en diferentes serotipos de rAAV. Las imágenes de Pymol se centran en el bucle de cápside VR1. Las líneas discontinuas representan enlaces de hidrógeno presentes en las estructuras cristalinas de rAAV1 (PDB ID, 3NG9), rAAV2 (PDB<i>D, 1LP3), rAAV3b (PDB ID, 3KIC), rAAV4 (PDB ID, 2G8G), rAAV5 (PDB ID, 3NTT), rAAV6 (PDB ID, 30AH), rAAV8 (PDB ID, 2QAO) y rAAV9 (PDB ID, 3UX1). Los aminoácidos VR1 que participan en redes de enlaces de hidrógeno se representan como barras y de color verde. Los aminoácidos que se mutaron para este estudio son de color cian. En rAAV1 (A), se muestran enlaces entre los residuos T265 y S262, T265 y A263, T265 y S264, y S264 y G266. En rAAV2 (B), se muestran enlaces entre los residuos S264 y G265, y Q263 y A266. En rAAV3b (C), se muestran enlaces entre los residuos Q263 y A266, y Q263 y G265. En rAAV4 (D), se muestran enlaces entre los residuos L258 y N261. En rAAV5 (E), se muestran enlaces entre los residuos S258 y V255, y S258 y N261. En rAAV6 (F), se muestran enlaces entre los residuos T265 y S262, y S262 y H272. En rAAV8 (G), se muestran enlaces entre los residuos T265 y T265 (enlaces de hidrógeno de residuo a sí mismo). En rAAV9 (H), se muestran enlaces entre los residuos S263 y G267, y S265 y S265 (enlaces de hidrógeno de residuo a sí mismo).

Las figuras 13A-13F muestran la biodistribución de cápsides de rAAV 1 y rAAV6 que portan mutaciones de eliminación de VRf. Imagenología bioluminiscente de animales vivos de las cápsides de rAAV1 (A) y rAAV6 (D) a los 9 días después de las inyecciones en la vena de la cola de genomas de vector de caída por construcción. A 10 dpi, los órganos indicados se cosecharon, lisaron y homogeneizaron, y se cuantificó la expresión de luciferasa y el contenido de proteína total del producto lisado (B, E). Los valores se muestran en unidades de luz relativas por miligramo de proteína total (RLU/mg). Un subconjunto indicado de órganos se procesó adicionalmente mediante qPCR (C, F) para determinar el número de genomas de vector por genomas celulares (vg/cg). Cada punto de datos representa n=3; las imágenes son de un ratón representativo por grupo. Las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las figuras 14A-14I muestran la biodistribución de cápsides de rAAV7, rAAV8 y rAAV9 que portan mutaciones de deleción de VR1. Imagenología bioluminiscente de animales vivos de las cápsides de rAAV7 (A), rAAV8 (D) y rAAV9 (G) a los 9 días después de las inyecciones en la vena de la cola de 1e11 genomas de vector por construcción. A 10 dpi, los órganos indicados se cosecharon, lisaron y homogeneizaron, y se cuantificó la expresión de luciferasa y el contenido de proteína total del producto lisado (B, E, H). Los valores se muestran en unidades de luz relativas por miligramo de proteína total (RLU/mg). Un subconjunto indicado de órganos se procesó adicionalmente mediante qPCR (C, F, I) para determinar el número de genomas de vector por genomas de célula (vg/cg). Cada punto de datos representa n=3; las imágenes son de un ratón representativo por grupo. Las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las figuras 15A-15D muestran la biodistribución cualitativa de cápsides mutantes de deleción de VR1 en los serotipos rAAV2 y rAAV3b. En los paneles (A) y (B), 1e11vg de cada una de las construcciones indicadas se administró mediante la vena de la cola. Se tomaron imágenes de los ratones a 10 dpi. En los paneles (C) y (D), se administraron 5e11vg de cada una de las construcciones indicadas mediante la vena de la cola. Se tomaron imágenes de los ratones a 10 dpi. En todos los casos se evaluó N=3; se muestra un ratón representativo de cada grupo.

Las figuras 16A-16C muestran la biodistribución cuantitativa para las cápsides de rAAV1 y rAAV6 mutantes de deleción de VR1. Los paneles (A) y (B) representan la expresión de luciferasa mediante RLU/mg de proteína promedio para órganos viscerales después de la inyección en la vena de la cola de 1e11vg de las construcciones indicadas. El panel (C) compara la expresión de luciferasa mediante RLU/mg de proteína promedio entre rAAV6/T262del y rAAV6/T265del en corazón, hígado y GC. N=3; las barras de error representan la desviación estándar.

Las figuras 17A-17D muestran biodistribución cuantitativa y cualitativa de cápsides de rAAV7, rAAV8 y rAAV9 mutantes de deleción de VR1. Los paneles (A), (B) y (C) representan la expresión de luciferasa mediante RLU/mg de proteína promedio para órganos viscerales después de la inyección en la vena de la cola de 1e11vg de las construcciones indicadas. En el panel (D), los ratones se inyectaron mediante la vena de la cola con 1e11vg por construcción indicada y se obtuvieron imágenes a 10 dpi. N=3 para todos los experimentos; las barras de error representan la desviación estándar. En el panel (D) se muestra un ratón representativo de cada grupo.

Las figuras 18A-18L muestran la biodistribución de cápsides de rAAV1, rAAV2, rAAV3b y rAAV6 que portan mutaciones de inserción/sustitución de VR1. Imagenología bioluminiscente de animales vivos de cápsides de rAAV2 (A), rAAV3b (D), rAAV1 (G) y rAAV6 (J) a los 9 días después de las inyecciones en la vena de la cola de genomas de vector lei 1 por construcción. A 10 dpi, los órganos indicados se cosecharon, lisaron y homogeneizaron, y se cuantificó la expresión de luciferasa y el contenido de proteína total del producto lisado (B, E, H, K). Los valores se muestran en unidades de luz relativas por miligramo de proteína total (RLU/mg). Un subconjunto indicado de órganos se procesó adicionalmente mediante qPCR (C, F, I, L) para determinar el número de genomas de vector por genomas de célula (vg/cg). Cada punto de datos representa n=3; las imágenes son de un ratón representativo por grupo. Las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las figuras 19A-19D muestran la biodistribución cuantitativa para las cápsides rAAV1, rAAV2, rAAV3b y rAAV6 mutantes de VR1 265D. Los paneles (A), (B), (C) y (D) representan la expresión de luciferasa mediante RLU/mg de proteína promedio para órganos viscerales después de la inyección en la vena de la cola de 1e11vg de las construcciones indicadas. N=3; las barras de error representan la desviación estándar.

Las figuras 20A-20B muestran la biodistribución cualitativa de las cápsides de rAAV8 y rAAV9 mutantes 265D. En los paneles (A) y (B), 1e11vg de cada una de las construcciones indicadas se administró mediante la vena de la cola. Se tomaron imágenes de los ratones a 10 dpi. En todos los casos se evaluó N=3; se muestra un ratón representativo de cada grupo.

Las figuras 21A-21D muestran el impacto de la capacidad de unión a heparina de cápside en la eficiencia de transducción de cápsides que portan mutaciones de inserción/subestación de VR1. Resultados del ensayo de luciferasaex vivoen muestras de hígado tomadas 10 dpi de ratones inyectados con 1e11vg de un subconjunto de cápside de rAAV2 (A) que incluye mutantes de combinación 265D, heparina nula y heparina nula 265D; un subconjunto de cápside de rAAV3b (B) que incluye mutantes de combinación 265D, heparina nula y heparina nula 265D; y un subconjunto de cápside de rAAV6 (C) que incluye mutantes de combinación 265D, heparina nula y heparina nula 265D. Resultados de ensayo de luciferasaex vivoen muestras de corazón, hígado y GC tomadas 10 dpi de ratones inyectados con 1e11vg de un subconjunto de cápside de rAAV6 (D) que incluye mutantes de combinación T265del, heparina nula y T265del heparina nula. Los datos representan unidades de luz relativas normalizadas por mg de proteína analizada (RLU/mg). Cada punto de datos representa n=3; las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las figuras 22A-22D muestran la comparación de la eficiencia de transducción de cápside de VR1 mutante a tipo silvestre en tejidos cardíacos y hepáticos. Resultados de ensayo de luciferasaex vivoen muestras de tejido tomadas del corazón (A) e hígado (B) a 10 dpi de 1e11vg de un panel de cápsides mutantes de deleción de VR1. Los datos representados como cambio múltiplo con respecto a los valores obtenidos para rAAV9, después de medir las unidades de luz relativas por mg de proteína analizada. Relación de transducción de corazón a hígado (C) de órganos analizados en A y B. Resultados del ensayo de luciferasaex vivoen muestras de tejido hepático (D) tomadas a 10 dpi de 1e11vg de un panel de cápsides mutantes 265D. Los datos representados como cambio múltiplo con respecto a los valores obtenidos para rAAV8, después de medir las unidades de luz relativas por mg de proteína analizada. Cada punto de datos representa n=3; las barras de error reflejan la desviación estándar.

Las figuras 23A-23B muestran la eficiencia de transducción de cápsides de rAAV1 y rAAV6 que portan mutaciones de VR1 junto con mutaciones de tirosina a fenilalanina. Resultados de ensayo de luciferasaex vivoen un panel de tejidos de corazón, hígado y GC tomados de un panel de cápsides de rAAV1 (A) que portan mutaciones de deleción de VR1 solas y junto con mutaciones de Y445F, y de un panel de cápsides de rAAV6 (B) con las mutaciones equivalentes. Los datos representan unidades de luz relativas normalizadas por mg de proteína analizada (RLU/mg). Las muestras de tejido se tomaron a 10 dpi de 1e11vg por construcción. Cada punto de datos representa n=3; las barras de error reflejan la desviación estándar.

La figura 24 muestra biodistribución cualitativa de cápsides de rAAV8 y rAAV8/S266del, 1e11vg de cada una de las construcciones indicadas se administró mediante la vena de la cola. Se tomaron imágenes de los ratones a 10 dpi. En todos los casos se evaluó N=3; se muestra un ratón representativo de cada grupo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con referencia a los dibujos anexos, en los cuales se muestran realizaciones preferidas de la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual pertenece esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente es para el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no se propone que sea limitante de la invención.

Las secuencias de nucleótidos se presentan en la presente solo por hebra individual, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, a menos que se indique específicamente de otro modo. Los nucleótidos y aminoácidos se representan en la presente de la manera recomendada por la comisión de nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB, o (para aminoácidos) ya sea por el código de una letra, o el código de tres letras, ambos de acuerdo con 37 CFR §1.822 y uso establecido. Ver, por ejemplo,Patentin User Manual,99-102 (Nov. 1990) (Oficina de Patentes y Marcas de Estados Unidos).

Salvo que se indique de otro modo, los métodos estándar conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden usar para la construcción de construcciones de parvovirus recombinante y de AAV (rAAV), vectores de empaquetamiento que expresan las secuencias de Rep y/o Cap de parvovirus, y células de empaquetamiento transfectadas de manera transitoria y estable. Dichas técnicas se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, SAMBROOKetal.,MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York).

Para ilustrar adicionalmente, si, por ejemplo, la especificación indica que un aminoácido particular se puede seleccionar de A, G, I, L y/o V, este lenguaje también indica que el aminoácido se puede seleccionar de cualquier subconjunto de estos aminoácidos, por ejemplo, A, G, I o L; A, G, I o V; A o G; solo L; etc. como si cada subcombinación se estableciera expresamente en la presente. Además, este lenguaje también indica que uno o más de los aminoácidos especificados se pueden descartar. Por ejemplo, en realizaciones particulares, el aminoácido no es A, G o I; no es A; no es G o V; etc. como si cada uno de estos posibles descargos de responsabilidad se estableciera expresamente en la presente.

Definiciones

Los siguientes términos se usan en la descripción en la presente y las reivindicaciones anexas.

Las formas singulares “un” y “una” se propone que incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Además, el término “aproximadamente”, como se usa en la presente cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de la longitud de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, dosis, tiempo, temperatura y similares, pretende abarcar variaciones de 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 % o incluso 0,1 % de la cantidad especificada.

También, como se usa en la presente, “y/o” se refiere a y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los artículos listados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpretan en la alternativa (“o”).

Como se usa en la presente, la frase de transición “que consiste esencialmente en” se va a interpretar como que abarca los materiales o pasos citados “y aquellos que no afectan materialmente la o las características básicas y novedosas” de la invención reivindicada (por ejemplo, replicación de rAAV). Ver,In re Herz,537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); ver también MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el término “que consiste esencialmente en” como se usa en la presente no se debe interpretar como equivalente a “que comprende”.

El término “consiste esencialmente en” (y variantes gramaticales), como se aplica a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención, significa un polinucleótido o polipéptido que consiste tanto en la secuencia mencionada (por ejemplo, SEQ ID NO) como en un total de diez o menos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) nucleótidos o aminoácidos adicionales en los extremos 5’ y/o 3’ o N-terminal y/o C-terminal de la secuencia mencionada de modo que la función del polinucleótido o polipéptido no se altera materialmente. El total de diez o menos nucleótidos o aminoácidos adicionales incluye el número total de nucleótidos o aminoácidos adicionales en ambos extremos sumados. El término “materialmente alterado”, como se aplica a polinucleótidos de la invención, se refiere a un incremento o disminución en la capacidad para expresar el polipéptido codificado de al menos aproximadamente 50 % o más en comparación con el nivel de expresión de un polinucleótido que consiste en la secuencia mencionada. El término “materialmente alterado”, como se aplica a polipéptidos de la invención, se refiere a un incremento o disminución en la actividad de transducción de al menos aproximadamente 50 % o más en comparación con la actividad de un polipéptido que consiste en la secuencia mencionada.

El término “parvovirus”, como se usa en la presente, abarca la familiaParvoviridae,incluido parvovirus y dependovirus de replicación autónoma. Los parvovirus autónomos incluyen miembros de los génerosParvovirus, Eritrovirus, Densovirus, IteravirusyContravirus.Los parvovirus autónomos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, virus diminutos de ratón, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus de pollo, virus de panleucopenia felina, parvovirus felino, parvovirus de ganso, parvovirus Hl, parvovirus de pato moscovita, parvovirus de serpiente y virus B19. Otros parvovirus autónomos se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, CAMPOSet a l,VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).

El géneroDependoviruscontiene los virus adenoasociados (AAV), incluidos, pero no limitado a, AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluidos los tipos 3A y 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV tipo 12, AAV tipo 13, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV de cabra, AAV de serpiente, AAV equino y AAV ovino. Ver, por ejemplo, FIELDSet al.,VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers); y tabla 1.

Como se usa en la presente, el término “virus adenoasociado” (AAV), incluye, pero no se limita a, AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluidos los tipos 3A y 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV tipo 12, AAV tipo 13, AAV de serpiente, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, a Av equino, AAV ovino, AAV de cabra, AAV de camarón y cualquier otro AAV ahora conocido o descubierto posteriormente. Ver, por ejemplo, FIELDSet al.,VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers). Se han identificado varios serotipos y clados de AAV relativamente nuevos (ver, por ejemplo, Gaoet al.,(2004)J. Virol.78:6381; Moriset al.,(2004)Virol.33-:375; y tabla 1).

Las partículas de parvovirus y genomas divulgados en la presente pueden ser de, pero no se limitan a, AAV. Las secuencias genómicas de diferentes serotipos de AAV y los parvovirus autónomos, así como las secuencias de las ITR nativas, proteínas Rep y subunidades de cápside se conocen en la técnica. Estas secuencias se pueden encontrar en la literatura o en bases de datos públicas tal como GenBank. Ver, por ejemplo, los números de acceso de GenBank NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 y AY530579 para enseñar secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de parvovirus y AAV. Ver también, por ejemplo, Bantel-Schaalet al.,(1999) J.Virol.73: 939; Chioriniet a l,(1997) J.Virol.71:6823; Chioriniet a l,(1999) J.Virol.73:1309; Gaoet a l, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA99:11854; Moriset a l,(2004)Virol.33-:375-383; Moriet a l,(2004)Virol.330:375; Muramatsuet al,(1996)Virol.221:208; Ruffinget al.,(1994) J.Gen. Virol.75:3385; Rutledgeet al.,(1998) J.Virol.72:309; Schmidtet al.,(2008) J.Virol.82:8911; Shadeet a l,(1986) J.Virol.58:921; Srivastavaet a l,(1983) J.Virol.45:555; Xiaoet al.,(1999)J. Virol.73:3994; publicaciones de patente internacional WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; y patente de Estados Unidos No. 6,156,303; para enseñar secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de parvovirus y AAV. Ver también tabla 1. Una descripción temprana de las secuencias ITR de AAV1, AAV2 y AAV3 se proporciona por Xiao, X., (1996), “Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration,” Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA (incorporada en la presente en su totalidad).

Tabla 1

El término “tropismo”, como se usa en la presente, se refiere a la entrada del virus en la célula, opcional y preferentemente seguida de expresión (por ejemplo, transcripción y, opcionalmente, traducción) de secuencias portadas por el genoma viral en la célula, por ejemplo, para un virus recombinante, expresión de la o las secuencias de nucleótidos heterólogas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la transcripción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga del genoma viral puede no iniciarse en ausencia de factores que actúan en trans, por ejemplo, para un promotor inducible o secuencia de ácido nucleico regulada de otra manera. En el caso de AAV, la expresión génica del genoma viral puede ser de un provirus integrado de forma estable, de un episoma no integrado, así como cualquier otra forma en la que el virus pueda tomar dentro de la célula.

Como se usa en la presente, “transducción” de una célula por parvovirus o AAV se refiere a transferencia mediada por parvovirus/AAV de material genético en la célula. Ver, por ejemplo, CAMPOSet al.,VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers).

Los términos “porción 5’” y “porción 3’” son términos relativos para definir una relación espacial entre dos o más elementos. Por lo tanto, por ejemplo, una “porción 3’” de un polinucleótido indica un segmento del polinucleótido que está en la dirección 3’ de otro segmento. El término “porción 3’” no se propone que indique que el segmento está necesariamente en el extremo 3’ del polinucleótido, o incluso que está necesariamente en la mitad 3’ del polinucleótido, aunque puede. De manera similar, una “porción 5’” de un polinucleótido indica un segmento del polinucleótido que está en la dirección 5’ de otro segmento. El término “porción 5’” no se propone que indique que el segmento está necesariamente en el extremo 5’ del polinucleótido, o incluso que está necesariamente en la mitad 5’ del polinucleótido, aunque puede.

Como se usa en la presente, el término “polipéptido” abarca tanto péptidos como proteínas, a menos que se indique de otro modo.

Un “polinucleótido” es una secuencia de bases de nucleótidos, y puede ser secuencias híbridas de ARN, ADN o ADN-ARN (que incluyen tanto nucleótidos que se presentan de manera natural como que no se presentan de manera natural), y puede ser secuencias de ADN de hebra individual o de doble hebra.

El término “identidad de secuencia”, como se usa en la presente, tiene el significado estándar en la técnica. Como se conoce en la técnica, se pueden usar varios programas diferentes para identificar si un polinucleótido o polipéptido tiene identidad o similitud de secuencia con una secuencia conocida. La identidad o similitud de secuencia se puede determinar usando técnicas estándar conocidas en la técnica, incluido, pero no limitado a, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith & Waterman,Adv. Appl. Math.2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de identidad de secuencia de Needleman & Wunsch,J. Mol. Biol.45:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA55:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereuxet al., Nucí. Acid Res. 12:381(1984), preferentemente usando los ajustes predeterminados, o por inspección.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas por pares. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng & Doolittle,J. Mol. Evol.35:351 (1987); el método es similar al descrito por Higgins & Sharp,CABIOS5:151 (1989).

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en Altschulet al., J. Mol. Biol. 215:403(1990) y Karlinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873(1993). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschulet al. Meth. Enzymol., 266:460(1996); blast.wustl/edu/blast/README.html. WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, que se establecen preferentemente en los valores predeterminados. Los parámetros son valores dinámicos y se establecen por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular contra la cual se está buscando la secuencia de interés; sin embargo, los valores se pueden ajustar para incrementar la sensibilidad.

Un algoritmo útil adicional es Gapped BLAST como se reporta por Altschulet al., Nucleic Acids Res. 25:3389(1997).

Un porcentaje de valor de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por el número de residuos idénticos coincidentes dividido por el número total de residuos de la secuencia “más larga” en la región alineada. La secuencia “más larga” es la que tiene los residuos más reales en la región alineada (se ignoran las separaciones introducidas por WU-Blast-2 para incrementar al máximo la puntuación de alineación).

De manera similar, el por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en la secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en el polinucleótido específicamente descrito en la presente.

La alineación puede incluir la introducción de separaciones en las secuencias que se van a alinear. Además, para secuencias que contienen más o menos nucleótidos que los polinucleótidos específicamente divulgados en la presente, se entiende que en una realización, el porcentaje de identidad de secuencia se determinará con base en el número de nucleótidos idénticos en relación con el número total de nucleótidos. Por lo tanto, por ejemplo, la identidad de secuencia de las secuencias más cortas que una secuencia específicamente divulgada en la presente, se determinará usando el número de nucleótidos en la secuencia más corta, en una realización. En los cálculos de por ciento de identidad, la ponderación relativa no se asigna a diferentes manifestaciones de variación de secuencia, tal como inserciones, deleciones, sustituciones, etc.

En una realización, solo las identidades se califican positivamente (+1) y a todas las formas de variación de secuencia que incluyen separaciones se les asigna un valor de “0”, lo que obvia la necesidad de una escala ponderada o parámetros como se describe más adelante para los cálculos de similitud de secuencia. El por ciento de identidad de secuencia se puede calcular, por ejemplo, al dividir el número de residuos idénticos coincidentes por el número total de residuos de la secuencia “más corta” en la región alineada y al multiplicar por 100. La secuencia "más larga" es la que tiene los residuos más reales en la región alineada.

Como se usa en la presente, un polinucleótido “aislado” (por ejemplo, un “ADN aislado” o un “ARN aislado”) significa un polinucleótido separado o sustancialmente libre de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus que se presenta de manera natural, por ejemplo, la célula o componentes estructurales virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos encontrados comúnmente asociados con el polinucleótido.

Del mismo modo, un polipéptido “aislado” significa un polipéptido que está separado o sustancialmente libre de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus que se presenta de manera natural, por ejemplo, la célula o componentes estructurales virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos comúnmente encontrados asociados con el polipéptido.

Un “polipéptido terapéutico” es un polipéptido que puede aliviar o reducir los síntomas que resultan de una ausencia o defecto en una proteína en una célula o sujeto. De manera alternativa, un “polipéptido terapéutico” es uno que de otra manera confiere un beneficio a un sujeto, por ejemplo, efectos anti-cáncer o mejora en la capacidad de supervivencia de trasplante.

Como se usa en la presente, el término “modificado”, como se aplica a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, se refiere a una secuencia que difiere de una secuencia tipo silvestre debido a una o más deleciones, adiciones, sustituciones o cualquier combinación de las mismas.

Como se usa en la presente, por “aislar” o “purificar” (o equivalentes gramaticales) un vector de virus, se entiende que el vector de virus está al menos parcialmente separado de al menos algunos de los otros componentes en el material de partida.

Por los términos “tratar”, “que trata” o “tratamiento de” (y variaciones gramaticales de los mismos) se entiende que la severidad de la condición del sujeto se reduce, al menos parcialmente se mejora o estabiliza y/o que se logra algún alivio, mitigación, disminución o estabilización en al menos un síntoma clínico y/o hay un retraso en la progresión de la enfermedad o trastorno.

Los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención” (y variaciones gramaticales de los mismos) se refieren a la prevención y/o retraso del inicio de una enfermedad, trastorno y/o uno o más síntomas clínicos en un sujeto y/o una reducción en la severidad del inicio de la enfermedad, trastorno y/o uno o más síntomas clínicos con respecto a lo que se presentaría en ausencia de los métodos de la invención. La prevención puede ser completa, por ejemplo, la ausencia total de la enfermedad, trastorno y/o síntomas clínicos. La prevención también puede ser parcial, de modo que la aparición de la enfermedad, trastorno y/o síntomas clínicos en el sujeto y/o la severidad del inicio es menor que lo que se presentaría en la ausencia divulgada en la presente.

Una cantidad “efectiva para tratamiento” como se usa en la presente es una cantidad que es suficiente para proporcionar alguna mejora o beneficio al sujeto. De manera alternativa, una cantidad “efectiva paraa tratamiento” es una cantidad que proporcionará algún alivio, mitigación, disminución o estabilización en al menos un síntoma clínico en el sujeto. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los efectos terapéuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre que se proporcione algún beneficio al sujeto.

Una cantidad “efectiva para prevención” como se usa en la presente es una cantidad que es suficiente para prevenir y/o retrasar el comienzo de una enfermedad, trastorno y/o síntomas clínicos en un sujeto y/o para reducir y/o retrasar la severidad del comienzo de una enfermedad, trastorno y/o síntomas clínicos en un sujeto con respecto a lo que se presentaría en ausencia de los métodos de la invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el nivel de prevención no necesita ser completo, siempre que se proporcione algún beneficio al sujeto.

Los términos “secuencia de nucleótidos heteróloga” y “ácido nucleico heterólogo” se usan indistintamente en la presente y se refieren a una secuencia que no se presenta de manera natural en el virus. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo comprende un marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido o ARN no traducido de interés (por ejemplo, para administración a una célula o sujeto).

Como se usa en la presente, los términos “vector de virus”, “vector” o “vector de administración de genes” se refieren a una partícula de virus (por ejemplo, AAV) que funciona como un vehículo de administración de ácido nucleico y que comprende el genoma de vector (por ejemplo, ADN viral [ADNv]) empaquetado dentro de un virión. De manera alternativa, en algunos contextos, el término “vector” se puede usar para referirse al genoma de vector/ANDv solo o un plásmido.

Los vectores de virus de la invención pueden ser además partículas de parvovirus dúplex como se describe en la publicación de patente internacional WO 01/92551. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los genomas de doble hebra (dúplex) se pueden empaquetar.

Un “genoma de vector de rAAV” o “genoma de rAAV” es un genoma de AAV (es decir, ANDv) que comprende una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas. Los vectores de rAAV en general requieren solo la ITR de 145 bases encispara generar el virus. Todas las demás secuencias virales se pueden dispensar y se pueden suministrar entrans(Muzyczka (1992)Curr. Topics Microbiol. Immunol.158:97). Habitualmente, el genoma de vector rAAV solo retendrá la una o más secuencias ITR para incrementar al máximo el tamaño del transgén que se puede empaquetar de manera eficiente por el vector. Las secuencias codificadoras de proteínas estructurales y no estructurales se pueden proporcionar en trans (por ejemplo, de un vector, tal como un plásmido, o por la integración estable de las secuencias en una célula de empaquetamiento). En realizaciones de la invención, el genoma de vector rAAV comprende al menos una secuencia ITR (por ejemplo, secuencia ITR de AAV), opcionalmente dos ITR (por ejemplo, dos ITR de AAV), que habitualmente estarán en los extremos 5’ y 3’ del genoma de vector y flanquearán el ácido nucleico heterólogo, pero no es necesario que sean contiguas a la misma. Las ITR pueden ser las mismas o diferentes entre sí.

El término “repetición terminal” o “TR” incluye cualquier repetición terminal viral o secuencia sintética que forma una estructura de horquilla y funciona como una repetición terminal invertida (es decir, media las funciones deseadas tal como replicación, empaquetamiento de virus, integración y/o rescate de provirus y similares). La ITR puede ser una ITR de AAV o una ITR no de AAV. Por ejemplo, una secuencia ITR no AAV tal como aquellas de otros parvovirus (por ejemplo, parvovirus canino, parvovirus bovino, parvovirus de ratón, parvovirus porcino, parvovirus humano B-19) o la horquilla SV40 que sirve como el origen de la replicación de SV40 se puede usar como una ITR, que además se puede modificar por truncamiento, sustitución, deleción, inserción y/o adición. Además, la ITR puede ser parcial o completamente sintética, tal como la “secuencia doble-D” como se describe en la patente de Estados Unidos No. 5,478,745 de Samulskietal.La figura 24 proporciona ejemplos de ITR sintéticas contempladas por la presente invención.

Los genomas de parvovirus tienen secuencias palindrómicas tanto en sus extremos 5’ como 3’. La naturaleza palindrómica de las secuencias conduce a la formación de una estructura de horquilla que se estabiliza por la formación de enlaces de hidrógeno entre los pares de bases complementarias. Se cree que esta estructura de horquilla adopta una forma de “Y” o “T”. Ver, por ejemplo, FIELDSet al.,VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).

Una “repetición terminal invertida de AAV” o “ITR de AAV” puede ser de cualquier AAV, incluido pero no limitado a los serotipos 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 13, AAV de serpiente, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino, AAV de cabra, AAV de camarón o cualquier otro AAV ahora conocido o descubierto posteriormente (ver, por ejemplo, tabla 1). Una ITR de AAV no necesita tener la secuencia de repetición terminal nativa (por ejemplo, una secuencia de ITR de AAV nativa se puede alterar por inserción, deleción, truncamiento y/o mutaciones sin sentido), siempre que la repetición terminal media las funciones deseadas, por ejemplo, replicación, empaquetamiento de virus, persistencia y/o rescate de provirus y similares.

Los vectores de virus de la invención pueden ser además vectores de virus “dirigidos” (por ejemplo, que tienen un tropismo dirigido) y/o un parvovirus “híbrido” (es decir, en el que las ITR virales y la cápside viral son de diferentes parvovirus) como se describe en la publicación de patente internacional WO 00/28004 y Chaoet al., (2000) Mol. Therapy2:619.

Además, la cápside viral o los elementos genómicos pueden contener otras modificaciones, incluidas inserciones, deleciones y/o sustituciones.

Como se usa en la presente, el término “aminoácido” abarca cualquier aminoácido que se presenta de manera natural, formas modificadas de los mismos y aminoácidos sintéticos.

Los aminoácidos levorrotatorios (L-) que se presentan de manera natural se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

De manera alternativa, el aminoácido puede ser un residuo de aminoácido modificado (los ejemplos no limitantes se muestran en la tabla 3) o puede ser un aminoácido que se modifica por modificación postraducción (por ejemplo, acetilación, amidación, formilación, hidroxilación, metilación, fosforilación o sulfatación).

Tabla 3: Derivados de residuos de aminoácidos

Además, el aminoácido que no se presenta de manera natural puede ser un aminoácido “no natural” como se describe por Wanget al., (2006) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:225-49.Estos aminoácidos no naturales se pueden usar de manera ventajosa para enlazar químicamente moléculas de interés a la proteína de cápside de AAV.

El término “plantilla” o “sustrato” se usa en la presente para referirse a una secuencia de polinucleótidos que se puede replicar para producir el ADN viral de parvovirus. Para el propósito de la producción de vector, la plantilla habitualmente se incrustará dentro de una secuencia o construcción de nucleótidos más grande, que incluye pero no se limita a un plásmido, vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o un vector viral (por ejemplo, adenovirus, herpesvirus, virus Epstein-Barr, AAV, baculoviral, vectores retrovirales y similares). De manera alternativa, la plantilla se puede incorporar de manera estable en el cromosoma de una célula de empaquetamiento.

Como se usa en la presente, las “secuencias codificadoras de Rep” de parvovirus o AAV indican las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas no estructurales de parvovirus o AAV que median la replicación viral y la producción de nuevas partículas de virus. Los genes y proteínas de replicación de parvovirus y AAV se han descrito en, por ejemplo, Fieldset al.,Virology, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).

Las “secuencias codificadoras de Rep” no necesitan codificar para todas las proteínas Rep parvovirales o de AAV. Por ejemplo, con respecto a AAV, las secuencias codificadoras de Rep no necesitan codificar para las cuatro proteínas Rep de AAV (Rep78, Rep 68, Rep52 y Rep40), de hecho, se cree que AAV5 solo expresa las proteínas Rep68 y Rep40 empalmadas. En realizaciones representativas, las secuencias codificadoras de Rep codifican para al menos aquellas proteínas de replicación que son necesarias para la replicación y empaquetamiento del genoma viral en nuevos viriones. Las secuencias codificadoras de Rep en general codificarán para al menos una proteína Rep grande (es decir, Rep78/68) y una proteína Rep pequeña (es decir, Rep52/40). En realizaciones particulares, las secuencias codificadoras de Rep codifican para la proteína Rep78 de AAV y las proteínas Rep52 y/o Rep40 de AAV. En otras realizaciones, las secuencias codificadoras de Rep codifican para las proteínas Rep68 y Rep52 y/o Rep40. En aun una realización adicional, las secuencias codificadoras de Rep codifican para las proteínas Rep68 y Rep52, proteínas Rep68 y Rep40, proteínas Rep78 y Rep52, o proteínas Rep78 y Rep40.

Como se usa en la presente, el término “proteína Rep grande” se refiere a Rep68 y/o Rep78. Las proteínas Rep grandes de la invención reivindicada pueden ser tipo silvestre o sintéticas. Una proteína Rep grande tipo silvestre puede ser de cualquier parvovirus o AAV, que incluye pero no se limita a los serotipos 1,2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 13, o cualquier otro AAV ahora conocido o descubierto posteriormente (ver, por ejemplo, tabla 1). Una proteína Rep grande sintética se puede alterar por inserción, deleción, truncamiento y/o mutaciones sin sentido.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán además que no es necesario que las proteínas de replicación se codifiquen por el mismo polinucleótido. Por ejemplo, para MVM, las proteínas NS-1 y NS-2 (que son variantes de empalme) se pueden expresar independientemente entre sí. Del mismo modo, para AAV, el promotor p19 se puede inactivar y la o las proteínas Rep grandes se pueden expresar a partir de un polinucleótido y la o las proteínas Rep pequeñas se pueden expresar a partir de un polinucleótido diferente. Habitualmente, sin embargo, será más conveniente expresar las proteínas de replicación a partir de una construcción individual. En algunos sistemas, los promotores virales (por ejemplo, el promotor p19 de AAV) pueden no ser reconocidos por la célula y por lo tanto, es necesario expresar las proteínas Rep grandes y pequeñas de casetes de expresión separados. En otros casos, puede ser deseable expresar las proteínas Rep grandes y Rep pequeñas por separado, es decir, bajo el control de elementos de control transcripcionales y/o traduccionales separados. Por ejemplo, puede ser deseable controlar la expresión de las proteínas Rep grandes, para disminuir la relación de proteínas Rep grandes a pequeñas. En el caso de células de insecto, puede ser ventajoso disminuir de forma regulada la expresión de las proteínas Rep grandes (por ejemplo, Rep78/68) para evitar toxicidad para las células (ver, por ejemplo., Urabeet al.,(2002)Human Gene Therapy13:1935).

Como se usa en la presente, las “secuencias codificadoras de cap” de parvovirus o AAV codifican para las proteínas estructurales que forman una cápside de parvovirus o AAV funcional (es decir, pueden empaquetar ADN e infectar células diana). Habitualmente, las secuencias codificadoras de cap codificarán para todas las subunidades de cápside de parvovirus o AAV, pero menos que todas las subunidades de cápside se pueden codificar siempre y cuando se produzca una cápside funcional. Habitualmente, pero no necesariamente, las secuencias codificadoras de cap estarán presentes en una molécula de ácido nucleico individual.

La estructura de cápside de parvovirus autónomos y AAV se describen con más detalle en BERNARD N. FIELDSet al.,VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).

Proteínas de cápside de parvovirus modificadas

La invención se define en las reivindicaciones anexas. Cualquier referencia a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal se propone como ejemplos solamente, y no define una invención reivindicada. La presente divulgación proporciona proteínas de cápside de parvovirus modificadas que proporcionan capacidades de transducción de tejido mejoradas y/o especificidades de tejido modificadas y se pueden usar para preparar vectores de parvovirus para administración eficiente de ácidos nucleicos a células. Los inventores han descubierto que la desestabilización del bucle de región variable 1 (VR1) de la proteína de cápside por interrupción de enlace de hidrógeno entre residuos de aminoácidos da por resultado transducción celular mejorada y/o especificidades de tejido modificadas.

Un aspecto se refiere a una proteína de cápside de parvovirus que comprende una secuencia de aminoácidos de proteína de cápside de un serotipo de AAV o cualquier otro parvovirus con una estructura de cápside icosaédrica de T=1, en donde el bucle de región variable 1 (VR1) que comprende los residuos de aminoácidos 258 a 272 de proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus se modifica por deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos para provocar desestabilización regional dentro del bucle debido a la destrucción dirigida de patrones de enlace de hidrógeno orquestada por los residuos, en donde la proteína de cápside que comprende la modificación proporciona, a un vector de virus que comprende la proteína de cápside, eficiencia de transducción incrementada y/o especificidad tisular modificada con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación.

Los serotipos de AAV se conocen bien en la técnica y se describen anteriormente en la tabla 1. Los serotipos de AAV tienen una estructura de cápside icosaédrica de T=1.

Hay 8 géneros bajo la subfamiliaParvoviridaeque son capaces de infectar vertebrados, y todos se distinguen por cápsides que tienen simetría icosaédrica T=1.Parvoviridaeincluyen, sin limitación, los siguientes virus.

1. )Amdoparvovirus(las especies incluyen:Virus de la enfermedad del visón aleutiano, amdovirus del zorro gris)2. )Aveparvovirus(las especies incluyen:Aveparvovirus)

3. )Bocaparvovirus(las especies incluyen:Bocaparvovirus carnívoro 1-3; bocaparvovirus pinnípedo 1 y 2; bocaparvovirus de primate 1 y 2; bocaparvovirus ungulado1 -5)

4. )Copiparvovirus(las especies incluyen:Copiparvovirus)

5. )Dependoparvovirus(las especiesincluyen: Dependoparvovirus A adenoasociado; dependoparvovirus B adenoasociado; dependoparvovirus 1 anseriforme; dependoparvovirus 1 aviar; dependoparvovirus 1 de Chiropteran; dependoparvovirus 1 de Pinniped; dependoparvovirus de Squamate 1)

6. )Eritroparvovirus(las especies incluyen:Eritroparvovirus de primates 1-4; Eritroparvovirus de roedores 1; Eritroparvovirus ungulado 1)

7. )Protoparvovirus(Las especies incluyen:Protoparvovirus carnívoro 1; Protoparvovirus de roedor 1 y 2; Parvovirus ungulado 1)

8. )Tetraparvovirus(Las especies incluyen:Tetraparvovirus de quirópteros 1; tetraparvovirus de primate 1; tetraparvovirus ungulado 1-4)

Las secuencias de proteína de cápside se conocen en la técnica y están disponibles en bases de datos de secuencias tal como GenBank. Los números de residuos de aminoácidos usados en la presente con respecto a la proteína de cápside de AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9 se refieren a las secuencias como se divulga en los números de Acceso de GenBank como se lista en la tabla 1.

La región VR1 es una porción reconocida en la técnica de la secuencia de proteínas de cápside de serotipos de AAV y parvovirus con una estructura de cápside icosaédrica de T=1. El bucle que conforma la región VR1 consiste esencialmente en los residuos de aminoácidos 258 a 272 de AAV1 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otro AAV o parvovirus. Debido a que el bucle VR1 es una estructura bien reconocida, los residuos de aminoácidos correspondientes se pueden identificar fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, las listas de la tabla 4 incluyen una lista de residuos de aminoácidos de VR1 de ejemplo. En tanto que se listan residuos específicos, se entenderá por un experto en la técnica que los límites de la región VR1 son aproximados y pueden variar en uno o dos residuos.

Tabla 4

La región VR1 de parvovirus y AAV se caracteriza por varios enlaces de hidrógeno que estabilizan la región. Por ejemplo, la cápside de AAV1 contiene cuatro enlaces de hidrógeno en la región VR1 y la cápside de AAV6 contiene dos enlaces de hidrógeno en la región BRI (ver figura 8). La estabilidad del bucle VR1 se puede reducir al eliminar uno o más de los enlaces de hidrógeno en la región, por ejemplo, al eliminar un residuo de aminoácido implicado en el enlace de hidrógeno o al sustituir el residuo de aminoácido con un residuo que no forma un enlace de hidrógeno. En algunas realizaciones, al menos 1,2, 3 o 4 o más enlaces de hidrógeno se interrumpen dentro del bucle VR1.

Los enlaces de hidrógeno formados por residuos de aminoácidos en el bucle VR1 se pueden identificar por métodos conocidos en la técnica, incluido el análisis computacional de estructuras cristalinas de proteína de cápside, estructuras de resonancia magnética nuclear de proteína de cápside, comparaciones de homología de secuencia, etc. Los ejemplos de residuos de aminoácidos directamente implicados en enlaces de hidrógeno en el bucle VR1 se listan en la tabla 5.

Tabla 5

Por ejemplo, las estructuras cristalinas se pueden descargar de bases de datos públicas, por ejemplo, el Banco de Datos de Proteínas RCSB (www.rcsb.org), un repositorio de acceso público para todas las estructuras que se generaron usando fondos de los NIH. Los archivos pdb individuales se pueden ejecutar a través de un programa de validez estructural, tal como el programa de validación estructural MolProbity4 públicamente disponible (www.molprobidity.biochem.duke.edu), que analiza las relaciones geométricas entre moléculas individuales dentro de una estructura cristalina, así como sus posiciones de nube de electrones para proporcionar información visual sobre la ubicación de enlaces de hidrógeno en una estructura/archivo pdb dado. El resultado de MolProbity es un Kinemage, que es una representación gráfica de la estructura cristalina con enlaces de hidrógeno incluidos, y que se puede visualizar usando el programa de software públicamente disponible KiNG (www.kinemage.biochem.duke.edu).

En algunas realizaciones, la eficiencia de transducción de un vector de virus que comprende la proteína de cápside modificada se incrementa al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 % o más. La proteína de cápside que no contiene la modificación puede ser una proteína de cápside tipo silvestre o puede ser una proteína de cápside sintética siempre y cuando no contenga las modificaciones divulgadas en la presente. La eficiencia de transducción se puede medir por técnicas bien conocidas en la técnica y como se describe en la presente.

En algunas realizaciones, la especificidad de tejido de un vector de virus que comprende la proteína de cápside modificada se altera. En ciertas realizaciones, la transducción de músculo, por ejemplo, músculo esquelético y/o cardíaco, se incrementa al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 % o más. En ciertas realizaciones, la transducción de hígado se disminuye al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 % o más. En algunas realizaciones, la transducción de músculo se incrementa y la transducción de hígado se disminuye con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación. En ciertas realizaciones, la transducción de hígado se incrementa al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 % o más.

En algunas realizaciones, la cápside se modifica al eliminar o sustituir uno o más residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 258 a 272 de la proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más residuos se eliminan o sustituyen. El residuo eliminado o sustituido puede ser cualquier residuo en el VR1 que da por resultado un cambio en el estado de rotámero para residuos que participan en redes de enlace de hidrógeno. En otra realización, la cápside se modifica al eliminar o sustituir uno o más residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 261 a 269 de la proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus. En una realización adicional, la cápside se modifica al eliminar o sustituir el residuo de aminoácido 265 de la proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácido correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus.

En ciertas realizaciones, la modificación se realiza a una cápside de AAV1 o AAV6, dando por resultado un incremento en la transducción muscular y una disminución en la transducción hepática. En ciertas realizaciones, la modificación se realiza a una cápside de AAV7, AAV8 o AAV9, dando como resultado una disminución en la transducción hepática en tanto que se mantiene la transducción muscular. En algunas realizaciones, la modificación es una o más de las modificaciones mostradas en la tabla 6. En ciertas realizaciones, la cápside modificada no es de AAV2, AAV3b, AAV4 o AAV5.

Tabla 6. Mutaciones de deleción de región variable 1.

En algunas realizaciones, la cápside se modifica al insertar uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, un ácido aspártico) después del residuo de aminoácido 264 de la proteína de cápside de AAV2 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus. En otra realización, la cápside se modifica al sustituir un residuo de aminoácido del residuo de aminoácido 265 (por ejemplo, con un ácido aspártico) de proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácido correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus.

En ciertas realizaciones, la modificación se realiza a una cápside de AAV1, AAV2 o AAV3b, dando por resultado un incremento en la transducción hepática. En ciertas realizaciones, la modificación se realiza a una cápside de AAV6, dando por resultado un incremento en la transducción hepática y transducción muscular. En ciertas realizaciones, la transducción de hígado se incrementa al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 % o más. En otras realizaciones, la modificación es una o más de las modificaciones que se muestran en la tabla 7.

Tabla 7. Mutaciones de inserción y sustitu i n i ri r ión variable 1.

Un aspecto adicional se refiere al efecto de reducir la capacidad de unión a sulfato de heparina de proteínas de cápside sobre la eficiencia de transducción. Los ejemplos en la presente demuestran que reducir sustancialmente la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina mejora la eficiencia de transducción. Se demuestra además que, en algunos casos, la reducción sustancial de la capacidad de unión de sulfato de heparina interactúa alostéricamente con la desestabilización del bucle VR1 para proporcionar un incremento sustancial en la eficiencia de transducción en comparación con cualquiera de las modificaciones solas.

En un aspecto, la proteína de cápside que comprende una modificación en el bucle VR1 es de un serotipo de AAV u otro parvovirus que se une a sulfato de heparina, en donde uno o más residuos de aminoácidos que median la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se sustituyen y/o eliminan, en donde la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se reduce sustancialmente. El término “sustancialmente reducido”, como se usa en la presente, se refiere a una reducción en la capacidad de unión a sulfato de heparina de al menos aproximadamente 80 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, o más. La unión de proteínas de cápside a sulfato de heparina se puede medir por técnicas bien conocidas en la técnica y como se describe en la presente.

En algunas realizaciones, la proteína de cápside que se une a sulfato de heparina es de un serotipo AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV6 o AAV8. En algunas realizaciones, la proteína de cápside que se une a sulfato de heparina es de un serotipo AAV3a, AAV3b, AAV6 o AAV8. El o los residuos de aminoácidos implicados en la unión de sulfato de heparina en cada uno de estos serotipos se conocen bien en la técnica. Los ejemplos incluyen, sin limitación, R484, R487, K532, R585 y R588 en a Av 2, K531 en AAV6 y R594 en AAV3b. En algunas realizaciones, la proteína de cápside que se une a sulfato de heparina incluye cualquier proteína de cápside de AAV o parvovirus sintética que se ha modificado para proporcionar capacidad de unión a sulfato de heparina.

En una realización, la proteína de cápside comprende la secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV6, en donde el residuo de aminoácido 531 se ha sustituido para reducir sustancialmente la unión a sulfato de heparina, por ejemplo, por sustitución con ácido glutámico. En otra realización, la proteína de cápside comprende la secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV2, en donde el residuo de aminoácido 585 se ha sustituido para reducir sustancialmente la unión a sulfato de heparina, por ejemplo, por sustitución con ácido glutámico. En otra realización, la proteína de cápside comprende la secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV3b, en donde el residuo de aminoácido 594 se ha sustituido para reducir sustancialmente la unión a sulfato de heparina, por ejemplo, por sustitución con alanina.

Otro aspecto se refiere a proteínas de cápside en las que uno o más residuos de aminoácidos que median la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se sustituyen y/o eliminan, en donde la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se reduce sustancialmente. En algunas realizaciones, estas proteínas de cápside no tienen una modificación en el bucle VR1. En algunas realizaciones, la proteína de cápside comprende una secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV3a, AAV3b, AAV6 o AAV8. En una realización, la proteína de cápside comprende la secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV6, en donde el residuo de aminoácido 531 se ha sustituido para reducir sustancialmente la unión a sulfato de heparina, por ejemplo, por sustitución con ácido glutámico.

Un aspecto adicional se refiere a una proteína de cápside de AAV que comprende una secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV2, AAV3a o AAV3b, en donde la proteína de cápside comprende una inserción de uno o más residuos de aminoácidos inmediatamente después del residuo 264 de proteína de cápside de AAV2 o el residuo correspondiente de proteína de cápside de AAV3a o AAV3b, y uno o más residuos de aminoácidos que median la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se sustituyen y/o eliminan, en donde la unión de la proteína de cápside a sulfato de heparina se reduce sustancialmente; en donde la proteína de cápside proporciona a un vector de virus que comprende la proteína de cápside eficiencia de transducción incrementada con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside no modificada.

Se ha demostrado que la inserción de uno o más residuos de aminoácidos inmediatamente después del residuo 264 de la proteína de cápside de AAV2 mejora la eficiencia de transducción (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos No. 7,892,809). En una realización, la inserción inmediatamente después del residuo 264 de proteína de cápside de AAV2 o el residuo correspondiente de proteína de cápside de AAV3a o AAV3b es de un residuo de ácido aspártico, ácido glutámico o fenilalanina. En una realización, la proteína de cápside comprende una secuencia de aminoácidos de un serotipo de AAV2, en donde el residuo de aminoácido 585 se ha sustituido para reducir sustancialmente la unión a sulfato de heparina, por ejemplo, con ácido glutámico.

Un aspecto adicional se refiere a una proteína de cápside de AAV que comprende una deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 258 a 272 de proteína de cápside de AAV1 o los residuos de aminoácidos correspondientes de otra proteína de cápside de AAV o parvovirus y que comprende además una sustitución de un residuo de tirosina, por ejemplo, para mejorar la eficiencia de transducción cardíaca. Se ha mostrado que la mutación de residuos de tirosina seleccionados en la superficie de la cápside de rAAV mejora la eficiencia de transducción de rAAV al evitar la fosforilación y la degradación proteasómica final de las cápsides intracelulares antes de que puedan alcanzar el núcleo (Zhonget al., Virology 381(2).194 (2008)). En algunas realizaciones, la sustitución de tirosina es Y445F en AAV1 o AAV6.

Un aspecto se refiere a un polinucleótido que codifica para la proteína de cápside de la invención. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de cápside de la invención, por ejemplo, una de las secuencias descritas en la presente. En otras realizaciones, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de cápside que es al menos 80 % idéntica, por ejemplo, al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una de las secuencias de proteína de cápside descritas en la presente.

Otro aspecto adicional se refiere a una cápside de parvovirus que comprende la proteína de cápside de la invención. En algunas realizaciones, todas las proteínas de cápside en la cápside son proteínas de cápside de la invención. En otras realizaciones, algunas pero no todas las proteínas de cápside en la cápside son proteínas de cápside de la invención.

La invención también proporciona un vector viral que comprende la cápside de parvovirus de la invención. El vector viral puede ser un vector de parvovirus, por ejemplo, un vector de AAV. El vector viral puede comprender además un ácido nucleico que comprende una plantilla viral recombinante, en donde el ácido nucleico se encapsida por la cápside de parvovirus. La invención proporciona además una partícula de parvovirus recombinante (por ejemplo, una partícula de AAV recombinante) que comprende la proteína de cápside de la invención. Los vectores virales y las partículas virales se analizan adicionalmente más adelante.

En ciertas realizaciones, el vector viral exhibe un tropismo modificado debido a la presencia de la proteína de cápside de la invención. En una realización, el vector de parvovirus exhibe tropismo sistémico para músculo esquelético, músculo cardíaco y/o músculo de diafragma, por ejemplo, para músculo esquelético. En otras realizaciones, el vector de parvovirus tiene tropismo reducido para el hígado en comparación con un vector de virus que comprende una proteína de cápside tipo silvestre.

Métodos para producir vectores de virus

La presente divulgación proporciona además métodos para producir vectores de virus. En una realización particular, la presente divulgación proporciona un método para producir una partícula de parvovirus recombinante, que comprende proporcionar a una célula permisiva para la replicación de parvovirus: (a) una plantilla de parvovirus recombinante que comprende (i) una secuencia de nucleótidos heteróloga, y (ii) una ITR de parvovirus; (b) un polinucleótido que comprende secuencias codificadoras de Rep y las secuencias codificadoras de Cap de la invención; bajo condiciones suficientes para la replicación y empaquetamiento de la plantilla de parvovirus recombinante; por lo que las partículas de parvovirus recombinante se producen en la célula. Las condiciones suficientes para la replicación y empaquetamiento de la plantilla de parvovirus recombinante pueden ser, por ejemplo, la presencia de secuencias de AAV suficientes para la replicación de la plantilla de parvovirus y encapsidación en cápsides de parvovirus (por ejemplo, secuenciasrepde parvovirus y secuenciascapde parvovirus) y secuencias auxiliares de adenovirus y/o herpesvirus. En realizaciones particulares, la plantilla de parvovirus comprende dos secuencias ITR de parvovirus, que se ubican 5’ y 3’ con respecto a la secuencia de ácido nucleico heteróloga, aunque no es necesario que sean directamente contiguas a la misma.

En algunas realizaciones, la plantilla de parvovirus recombinante comprende una ITR que no es resuelta por Rep para hacer vectores de AAV duplexados como se describe en la publicación de patente internacional WO 01/92551.

La plantilla de parvovirus y las secuenciasrepycapde parvovirus se proporcionan bajo condiciones de modo que el vector de virus que comprende la plantilla de parvovirus empaquetada dentro de la cápside de parvovirus se produce en la célula. El método puede comprender además el paso de recolectar el vector de virus de la célula. El vector de virus se puede recolectar del medio y/o por lisis de las células.

La célula puede ser una célula que es permisiva para la replicación viral parvoviral. Se puede emplear cualquier celda adecuada conocida en la técnica. En realizaciones particulares, la célula es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de primate o humana). Como otra opción, la célula puede ser una línea de células de empaquetamieinto de trans-complemento que proporciona funciones eliminadas de un virus auxiliar de replicación defectuosa, por ejemplo, células 293 u otras células de trans-complemento de E1 a.

Las secuencias de replicación y cápside de parvovirus se pueden proporcionar por cualquier método conocido en la técnica. Los protocolos actuales habitualmente expresan los genesrep/capde parvovirus en un plásmido individual. Las secuencias de replicación y empaquetamiento de parvovirus no se necesitan proporcionar juntas, aunque puede ser conveniente hacerlo. Las secuencias derepy/ocapde parvovirus se pueden proporcionar por cualquier vector viral o no viral. Por ejemplo, las secuenciasrep/capse pueden proporcionar por un adenovirus híbrido o vector de herpesvirus(porejemplo, insertado en las regiones E1a o E3 de un vector de adenovirus eliminado). Los vectores de EBV también se pueden emplear para expresar los genesrepycapde parvovirus. Una ventaja de este método es que los vectores EBV son episómicos, pero mantendrán un alto número de copias a lo largo de divisiones celulares sucesivas (es decir, se integran de manera estable en la célula como elementos extra-cromosómicos, designados como un “episoma nuclear basado en EBV”, ver Margolski, (1992)Curr. Top. Microbio!. Immun.158:67).

Como una alternativa adicional, las secuenciasrep/capse pueden incorporar de forma estable en una célula.

Habitualmente, las secuenciasrep/capde parvovirus no estarán flanqueadas por las TR, para evitar el rescate y/o empaquetamiento de estas secuencias.

La plantilla de parvovirus se puede proporcionar a la célula usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la plantilla se puede suministrar por un vector no viral (por ejemplo, plásmido) o viral. En realizaciones particulares, la plantilla de parvovirus se suministra por un herpesvirus o vector de adenovirus (por ejemplo, insertado en las regiones E1a o E3 de un adenovirus eliminado). Como otra ilustración, Palomboet al.,(1998)J. Virology 72:5025,describe un vector de baculovirus que porta un gen indicador flanqueado por las TR de AAV. Los vectores de EBV también se pueden emplear para administrar la plantilla, como se describió anteriormente con respecto a los genesrep/cap.

En otra realización representativa, la plantilla de parvovirus se proporciona por un virus rAAV replicante. En aun otras realizaciones, un provirus AAV que comprende la plantilla de parvovirus se integra de manera estable en el cromosoma de la célula.

Para mejorar los títulos de virus, se pueden proporcionar a la célula funciones de virus auxiliares (por ejemplo, adenovirus o herpesvirus) que promueven una infección de parvovirus productiva. Las secuencias de virus auxiliares necesarias para la replicación de parvovirus se conocen en la técnica. Habitualmente, estas secuencias se proporcionarán por un adenovirus auxiliar o vector de herpesvirus. De manera alternativa, las secuencias de adenovirus o herpesvirus se pueden proporcionar por otro vector no viral o viral, por ejemplo, como miniplásmido de adenovirus no infeccioso que porta todos los genes auxiliares que promueven la producción eficiente de parvovirus como se describe por Ferrariet al., (1997) Nature Med.3:1295, y patente de Estados Unidos No.

6,040,183 y 6,093,570.

Además, las funciones de virus auxiliares se pueden proporcionar por una célula de empaquetamiento con las secuencias auxiliares incrustadas en el cromosoma o mantenidas como un elemento extracromosómico estable. En general, las secuencias de virus auxiliares no se pueden empaquetar en viriones de AAV, por ejemplo, no se flanquean por ITR.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que puede ser ventajoso proporcionar la replicación de parvovirus y secuencias de cápside y las secuencias de virus auxiliar (por ejemplo, secuencias de adenovirus) en una construcción auxiliar individual. Esta construcción auxiliar puede ser una construcción no viral o viral. Como una ilustración no limitante, la construcción auxiliar puede ser un adenovirus híbrido o herpesvirus híbrido que comprende los genesrep/capde AAV.

En una realización particular, las secuenciasrep/capde parvovirus y las secuencias auxiliares de adenovirus se suministran por un vector auxiliar de adenovirus individual. Este vector puede comprender además la plantilla de parvovirus. Las secuenciasrep/capde parvovirus y/o la plantilla de parvovirus se pueden insertar en una región eliminada (por ejemplo, las regiones E1a o E3) del adenovirus.

En una realización adicional, las secuenciasrep/capde parvovirus y las secuencias auxiliares de adenovirus se suministran por un vector auxiliar de adenovirus individual. De acuerdo con esta realización, la plantilla de parvovirus se puede proporcionar como una plantilla de plásmido.

En otra realización ilustrativa, las secuenciasrep/capde parvovirus y secuencias auxiliares de adenovirus se proporcionan por un vector auxiliar de adenovirus individual, y la plantilla de parvovirus se integra en la célula como un provirus. De manera alternativa, la plantilla de parvovirus se proporciona por un vector EBV que se mantiene dentro de la célula como un elemento extracromosómico (por ejemplo, como un episoma nuclear basado en EBV).

En una realización ejemplar adicional, las secuenciasrep/capde parvovirus y las secuencias auxiliares de adenovirus se proporcionan por un auxiliar de adenovirus individual. La plantilla de parvovirus se puede proporcionar como un vector viral de replicación separado. Por ejemplo, la plantilla de parvovirus se puede proporcionar por una partícula de parvovirus o una segunda partícula de adenovirus recombinante.

De acuerdo con los métodos anteriores, el vector de adenovirus híbrido habitualmente comprende las secuenciascis5’ y 3’ de adenovirus suficientes para replicación y empaquetamiento de adenovirus (es decir, las repeticiones terminales de adenovirus y la secuencia PAC). Las secuenciasrep/capde parvovirus y, si están presentes, la plantilla de AAV se incrustan en la cadena principal de adenovirus y se flanquean por las secuenciascis5' y 3', de modo que estas secuencias se pueden empaquetar en cápsides de adenovirus. Como se describió anteriormente, las secuencias auxiliares de adenovirus y las secuenciasrep/capde parvovirus en general no se flanquean por ITR, de modo que estas secuencias no se empaquetan en los viriones de parvovirus.

Zhanget al.,((2001)Gene Ther.18:704-12) describen un auxiliar quimérico que comprende tanto adenovirus como los genesrepycapde AAV.

El herpesvirus también se puede usar como un virus auxiliar en los métodos de empaquetamiento de parvovirus. Los virus de herpes híbridos que codifican para la o las proteínas Rep de parvovirus pueden facilitar de manera ventajosa esquemas de producción de vectores de parvovirus escalables. Se ha descrito un vector híbrido de virus de herpes simple tipo I (HSV-1) que expresa los genesrepycapde AAV-2 (Conwayet al.,(1999)Gene Ther.6:986 y WO 00/17377.

Como una alternativa adicional, los vectores de virus de la invención se pueden producir en células de insecto usando vectores de baculovirus para administrar los genesrep/capy la plantilla de parvovirus como se describe, por ejemplo, por Urabeet al.,(2002)Human Gene Ther.13:1935-43.

Las existencias de vectores de parvovirus libres de virus auxiliares contaminantes se pueden obtener por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el parvovirus y virus auxiliar se pueden diferenciar fácilmente en función del tamaño. El parvovirus también se puede separar del virus auxiliar con base en la afinidad por un sustrato de heparina (Zolotukhinet al.,(1999)Gene Therapy6:973). Los virus auxiliares de replicación defectuosa eliminados se pueden usar para que cualquier virus auxiliar contaminante no sea competente para la replicación. Como una alternativa adicional, se puede emplear un auxiliar de adenovirus que carece de expresión génica tardía, ya que solo se requiere expresión génica temprana de adenovirus para mediar el empaquetamiento de parvovirus. Los mutantes de adenovirus defectuosos para la expresión génica tardía se conocen en la técnica (por ejemplo, mutantes de adenovirus ts100K y ts149).

Vectores de virus recombinantes

Los vectores de virus divulgados en la presente son útiles para la administración de ácidos nucleicos a célulasin vitro.En particular, los vectores de virus se pueden emplear de manera ventajosa para administrar o transferir ácidos nucleicos a células de animales, que incluyen de mamíferos.

Cualquier secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés se puede administrar en los vectores de virus divulgados en la presente. Los ácidos nucleicos de interés incluyen ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos, incluidos polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, para usos médicos o veterinarios), inmunogénicos (por ejemplo, para vacunas) o de diagnóstico.

Los polipéptidos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, proteína reguladora transmembrana de fibrosis quística (CFTR), distrofina (que incluye mini- y microdistrofinas (ver, por ejemplo, Vincentet al.,(1993)Nature Genetics5:130; publicación de patente de Estados Unidos No. 2003/017131; publicación internacional WO/2008/088895, Wanget al., Proc. Nati Acad. Sci. USA97:13714-13719 (2000); y Gregorevicet ai,Mol. Ther.16:657-64 (2008)), propéptido de miostatina, folistatina, receptor soluble de activina tipo II, IGF-1, polipéptidos antiinflamatorios tal como el mutante dominante de Ikappa B, sarcospan, utrofina (Tinsleyet al., (1996) Nature384:349), mini-utrofina, factores de coagulación (por ejemplo, factor VIII, factor IX, factor X,etc.),eritropoyetina, angiostatina, endostatina, catalasa, tirosina hidroxilasa, superóxido dismutasa, leptina, el receptor de LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, p-globina, a-globina, espectrina, a1-antitripsina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, p-glucocerebrosidasa, esfingelinasa, hexosaminidasa lisosomal A, cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, proteína RP65, citocinas (por ejemplo, a-inferón, p-interferón, interferón-Y, interleucina-2, interleucina-4, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina y similares), factores de crecimiento peptídicos, factores neurotróficos y hormonas (por ejemplo, somatotropina, insulina, factores de crecimiento tipo insulina 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico -3 y -4, factor neurotrófico derivado de cerebro, proteínas morfogénicas óseas [que incluyen RANKL y VEGF], factor de crecimiento derivado de glía, factor de crecimiento transformante -a y -p, y similares), a-glucosidasa de ácido lisosómico, a-galactosidasa A,receptores (por ejemplo, el receptor soluble de factora de crecimiento de necrosis tumoral), S100A1, parvalbúmina, adenilil ciclasa tipo 6, una molécula que afecta el silenciamiento génico de cinasa tipo 2 de receptor acoplado a proteína G tal como un bARKct constitutivamente activo truncado, factores antiinflamatorios tal como IRAP, proteínas anti-miostatina, aspartoacilasa y anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de cadena individual; un Mab de ejemplo es el Mab Herceptin®). Otras secuencias de ácido nucleico heterólogas ilustrativas codifican para productos génicos suicidas (por ejemplo, timidina cinasa, citosina desaminasa, toxina diftérica y factor de necrosis tumoral), proteínas que confieren resistencia a un fármaco usado en terapia contra cáncer, productos génicos supresores de tumores (por ejemplo, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, ligando FAS y cualquier otro polipéptido que tenga un efecto terapéutico en un sujeto en necesidad del mismo. Los vectores de parvovirus también se pueden usar para administrar anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra miostatina (ver, por ejemplo, Fanget al., Nature Biotechnol.23:584-590 (2005)).

Las secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican para polipéptidos incluyen aquellas que codifican para polipéptidos indicadores (por ejemplo, una enzima). Los polipéptidos indicadores se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa y gen de cloranfenicol acetiltransferasa.

De manera alternativa, el ácido nucleico heterólogo puede codificar para un ácido nucleico antisentido, una ribozima (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 5,877,022), ARN que efectúan empalmetransmediado por espliceosoma (ver, Puttarajuet al.,(1999)Nature Biotech.17:246; patente de Estados Unidos No. 6,013,487; patente de Estados Unidos No. 6,083,702), ARN de interferencia (A<r>NÍ) que incluyen ARNsi, ARNsi o miARN que median el silenciamiento génico (ver, Sharpet al., (2000) Science287:2431), y otros ARN no traducidos, tal como ARN “guía” (Gormanet al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA95:4929; patente de Estados Unidos No. 5,869,248 de Yuanet al.),y similares. Los ARN no traducidos de ejemplo incluyen ARNi contra un producto génico de resistencia a múltiples fármacos (MDR) (por ejemplo, para tratar y/o prevenir tumores y/o para administración al corazón para prevenir daño por quimioterapia), ARNi contra miostatina (por ejemplo, para distrofia muscular de Duchenne), ARNi contra VEGF (por ejemplo, para tratar y/o prevenir tumores), ARNi contra fosfolamban (por ejemplo, para tratar enfermedad cardiovascular, ver, por ejemplo, Andinoet al., J. Gene Med.

10:132-142 (2008) y Liet al., Acta Pharmacol Sin.26:51-55 (2005)); moléculas inhibidoras o dominantes negativas de fosfolamban tal como fosfolamban S16E (por ejemplo, para tratar enfermedades cardiovasculares, ver, por ejemplo, Hoshijimaet al., Nat. Med.8:864-871 (2002)), ARNi contra adenosina cinasa (por ejemplo, para epilepsia), ARNi contra un sarcoglucano [por ejemplo, a, p,<y>], ARNi contra miostatina, propéptido de miostatina, folistatina o receptor soluble de activina tipo II, ARNi contra polipéptidos antiinflamatorios tal como el mutante dominante Ikappa B y ARNi dirigido contra organismos y virus patógenos (por ejemplo, virus de hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana, CMV, virus de herpes simple, virus de papiloma humano, etc.).

De manera alternativa, el ácido nucleico heterólogo puede codificar para inhibidor de proteína fosfatasa I (1-1), serca2a, proteínas de dedos de zinc que regulan el gen de fosfolambano, Barkct, receptor p2-adrenérgico, cinasa de receptor p2-adrenérgico (BARK), cinasa de fosfoinosítido-3 (cinasa PI3), una molécula que efectúa la inactivación de cinasa de receptor tipo 2 acoplada a proteína G tal como un bARKct constitutivamente activo truncado; calsarcina, ARNi contra fosfolambano; moléculas inhibidoras o dominantes negativas de fosfolambano tal como fosfolambano S16E, enos, inos, o proteínas morfogénicas óseas (incluido BNP 2, 7, etc., RANKL y/o VEGF).

El vector de virus también puede comprender un ácido nucleico heterólogo que comparte homología con y se recombina con un locus en un cromosoma hospedador. Este enfoque se puede utilizar, por ejemplo, para corregir un defecto genético en la célula hospedadora.

La presente divulgación también proporciona vectores de virus que expresan un polipéptido inmunogénico, por ejemplo, para vacunación. El ácido nucleico puede codificar para cualquier inmunógeno de interés conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, inmunógenos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de inmunodeficiencia de simio (SIV), virus de influenza, VIH o proteínas gag de SIV, antígenos tumorales, antígenos de cáncer, antígenos bacterianos, antígenos virales y similares.

El uso de parvovirus como vectores de vacuna se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Miyamuraet al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA91:8507; patente de Estados Unidos No. 5,916,563 de Younget al.,patente de Estados Unidos No. 5,905,040 de Mazzaraet al.,patente de Estados Unidos No. 5,882,652, patente de Estados Unidos No. 5,863,541 de Samulskiet al.).El antígeno se puede presentar en la cápside de parvovirus. De manera alternativa, el antígeno se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo introducido en un genoma de vector recombinante. Cualquier inmunógeno de interés como se describe en la presente y/o como se conoce en la técnica se puede proporcionar por el vector de virus descrito en la presente divulgación.

Un polipéptido inmunogénico puede ser cualquier polipéptido adecuado para provocar una respuesta inmunitaria y/o proteger al sujeto contra una infección y/o enfermedad, incluido, pero no limitado a, infecciones y enfermedades microbianas, bacterianas, protozoarias, parasitarias, fúngicas y/o virales. Por ejemplo, el polipéptido inmunogénico puede ser un inmunógeno de ortomixovirus (por ejemplo, un inmunógeno de virus de influenza, tal como la proteína de superficie de hemaglutinina (HA) de virus de influenza o la nucleoproteína de virus de influenza, o un inmunógeno de virus de influenza equina) o un inmunógeno de lentivirus (por ejemplo, un inmunógeno de virus de anemia infecciosa equina, un inmunógeno de virus de inmunodeficiencia de simio (SIV), o un inmunógeno de virus de inmunodeficiencia humana (VIH), tal como la proteína GP160 de envoltura de VIH o SIV, las proteínas de matriz/cápside de VIH o SIV, y los productos de genesgag, p o lyenvde VIH o SIV). El polipéptido inmunogénico también puede ser un inmunógeno de arenavirus (por ejemplo, inmunógeno de virus de fiebre de Lassa, tal como la proteína de nucleocápside de virus de fiebre de Lassa y la glucoproteína de envoltura de fiebre de Lassa), un inmunógeno de poxvirus (por ejemplo, un inmunógeno de virus de vaccinia, tal como los productos génicos de vaccinia LI o L8), un inmunógeno de flavivirus (por ejemplo, un inmunógeno de virus de fiebre amarilla o un inmunógeno de virus de encefalitis japonesa), un inmunógeno de filovirus (por ejemplo, un inmunógeno de virus de Ébola, o un inmunógeno de virus de Marburg, tal como productos génicos de NP y GP), un inmunógeno de bunyavirus (por ejemplo, inmunógenos de virus de RVFV, CCHF y/o SFS), o un inmunógeno de coronavirus (por ejemplo, un inmunógeno de coronavirus humano infeccioso, tal como la glucoproteína de envoltura de coronavirus humano, o un inmunógeno de virus de gastroenteritis transmisible porcina, o un inmunógeno de virus de bronquitis infecciosa aviar). El polipéptido inmunogénico puede ser además un inmunógeno de polio, un inmunógeno de herpes (por ejemplo, inmunógenos de CMV, EBV, HSV), un inmunógeno de paperas, un inmunógeno de sarampión, un inmunógeno de rubéola, una toxina de difteria u otro inmunógeno de difteria, un antígeno de tos ferina, un inmunógeno de hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, etc.) y/o cualquier otro inmunógeno de vacuna ahora conocido en la técnica o identificado posteriormente como un inmunógeno.

De manera alternativa, el polipéptido inmunogénico puede ser cualquier antígeno de célula cancerosa o tumoral. Opcionalmente, el antígeno de tumor o cáncer se expresa en la superficie de la célula cancerosa. Los antígenos de células tumorales y cancerosas de ejemplo se describen en S.A. Rosenberg(Immunity10:281 (1991)). Otros antígenos de cáncer y tumor ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: Producto génico BRCA1, producto génico BRCA2, gp100, tirosinasa, GAGE-1/2, BAGE, Ra Ge , LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, p-catenina, Mu M-1, Caspasa-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, antígenos tumorales de melanoma (Kawakamiet al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:3515; Kawakamiet al.,(1994) JExp. Med.,180:347; Kawakamiet al.,(1994)Cancer Res.

54:3124), MART-1, gp100 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, tirosinasa (Brichardet al.,(1993)J. Exp. Med.178:489); producto génico de HER-2/neu (patente de Estados Unidos No. 4,968,603), CA 125, LK26, FB5 (endosialina), TAG 72, AFP, CA19- 9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN (antígeno de sialil Tn), proteínas c-erbB-2, PSA, L-CanAg, receptor de estrógeno, globulina de grasa de leche, proteína supresora de tumores p53 (Levine,(1993) Ann. Rev. Biochem.62:623); antígenos de mucina (publicación de patente Internacional No. WO 90/05142); telomerasas; proteínas de matriz nuclear; fosfatasa ácida prostética; antígenos del virus del papiloma; y/o antígenos que ahora se conocen o se descubren posteriormente que se asocian con los siguientes cánceres: melanoma, adenocarcinoma, timoma, linfoma (por ejemplo, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin), sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de colon, leucemia, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro y cualquier otro cáncer o condición maligna ahora conocida o identificada posteriormente (ver, por ejemplo, Rosenberg,(1996) Ann. Rev. Med.47:481-91).

Como una alternativa adicional, el ácido nucleico heterólogo puede codificar para cualquier polipéptido que se produce deseablemente en una célulain vitro, ex vivooin vivo.Por ejemplo, los vectores de virus se pueden introducir en células cultivadas y el producto génico expresado se puede aislar de las mismas.

Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que el o los ácidos nucleicos heterólogos de interés se pueden asociar de manera operativa con secuencias de control apropiadas. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo se puede asociar de manera operativa con elementos de control de expresión, tal como señales de control de transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), promotores y/o intensificadores, y similares.

Los expertos en la técnica apreciarán que se puede usar una variedad de elementos promotores/intensificadores dependiendo del nivel y expresión específica de tejido deseada. El promotor/intensificador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor/intensificador puede ser nativo o extranjero y puede ser una secuencia natural o sintética. Por extranjero, se propone que la región de iniciación transcripcional no se encuentre en el hospedador tipo silvestre en el cual se introduce la región de iniciación transcripcional.

En realizaciones particulares, los elementos promotores/intensificadores pueden ser nativos de la célula diana o sujetos que se va a tratar. En realizaciones representativas, el elemento promotor/intensificador puede ser nativo para la secuencia de ácido nucleico heteróloga. El elemento promotor/intensificador se elige en general de tal forma que funciona en la o las células diana de interés. Además, en realizaciones particulares, el elemento promotor/intensificador es un elemento promotor/intensificador de mamífero. El elemento promotor/intensificador puede ser constitutivo o inducible.

Los elementos de control de expresión inducibles son habitualmente ventajosos en aquellas aplicaciones en las que es deseable proporcionar regulación sobre la expresión de la o las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas. Los elementos promotores/intensificadores inducibles para la administración de genes pueden ser elementos promotores/intensificadores específicos de tejido o preferidos, e incluyen específicos o preferidos de músculo (que incluyen específicos o preferidos de músculo cardíaco, esquelético y/o músculo liso), específicos o preferidos de tejido neural (que incluyen específicos o preferidos de cerebro), específicos o preferidos de ojo (que incluyen específicos y específicos de retina), específicos o preferidos de hígado, específicos o preferidos de médula ósea, específicos o preferidos de páncreas, específicos o preferidos de bazo, y elementos promotores/intensificadores específicos o preferidos de pulmón. Otros elementos promotores/intensificadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Los promotores/elementos intensificadores inducibles de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un elemento Tet encendido/apagado, un promotor inducible por RU486, un promotor inducible por ecdisona, un promotor inducible por rapamicina y un promotor de metalotioneína.

En realizaciones donde la o las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas se transcriben y entonces se traducen en las células diana, en general se incluyen señales de iniciación específicas para traducción eficiente de secuencias codificadoras de proteínas insertadas. Estas secuencias de control translacionales exógenas, que pueden incluir el codón de iniciación de ATG y secuencias adyacentes, pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos.

Los vectores de virus descritos en la presente proporcionan un medio para administrar ácidos nucleicos heterólogos en una amplia gama de células, que incluyen células divisoras y no divisoras. Los vectores de virus se pueden emplear para administrar un ácido nucleico de interés a una célulain vitro,por ejemplo, para producir un polipéptidoin vitroo para terapia génicaex vivo.Los vectores de virus son adicionalmente útiles en un método para administrar un ácido nucleico a un sujeto en necesidad del mismo, por ejemplo, para expresar un polipéptido inmunogénico o terapéutico o un ARN funcional. De esta manera, el polipéptido o ARN funcional se puede producirin vivoen el sujeto. El sujeto puede necesitar el polipéptido debido a que el sujeto tiene una deficiencia del polipéptido. Además, el método se puede practicar debido a que la producción del polipéptido o ARN funcional en el sujeto puede impartir algún efecto beneficioso.

Los vectores de virus también se pueden usar para producir un polipéptido de interés o ARN funcional en células cultivadas o en un sujeto (por ejemplo, usando el sujeto como un biorreactor para producir el polipéptido o para observar los efectos del ARN funcional en el sujeto, por ejemplo, en relación con métodos de selección).

En general, los vectores de virus divulgados en la presente se pueden emplear para administrar un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido o ARN funcional para tratar y/o prevenir cualquier estado de enfermedad para el cual es beneficioso administrar un polipéptido terapéutico o ARN funcional. Los estados de enfermedad ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: fibrosis quística (proteína reguladora transmembrana de fibrosis quística) y otras enfermedades del pulmón, hemofilia A (factor VIII), hemofilia B (factor IX), talasemia (pglobina), anemia (eritropoyetina) y otros trastornos sanguíneos, enfermedad de Alzheimer (GDF; neprilisina), esclerosis múltiple (p-interferón), enfermedad de Parkinson (factor neurotrófico derivado de línea de células gliales [GDNF]), enfermedad de Huntington (ARNi para remover repeticiones), esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia (galanina, factores neurotróficos) y otros trastornos neurológicos, cáncer (endostatina, angiostatina, TRAIL, ligando FAS, citocinas que incluyen interferones; ARNi que incluye ARNi contra VEGF o el producto génico de resistencia a múltiples fármacos), diabetes mellitus (insulina), distrofias musculares que incluyen Duchenne (distrofina, minidistrofina, factor de crecimiento tipo insulina I, un sarcoglucano [por ejemplo, a, p,<y>], ARNi contra miostatina, propéptido de miostatina, folistatina, receptor soluble de activina tipo II, polipéptidos antiinflamatorios tal como el mutante dominante Ikappa B, sarcospan, utrofina, mini-utrofina, ARNi contra uniones de empalme en el gen de distrofina para inducir omisión de exones [ver, por ejemplo, WO/2003/095647], antisentido contra ARNsn U7 para inducir omisión de exones [ver, por ejemplo, WO/2006/021724], y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra miostatina o propéptido de miostatina) y Becker, enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa), enfermedad de Hurler (a-L-iduronidasa), deficiencia de adenosina desaminasa (adenosina desaminasa), enfermedades de almacenamiento de glucógeno (por ejemplo, enfermedad de Fabry [a-galactosidasa] y enfermedad de Pompe [aglucosidasa ácida lisosomal]) y otros defectos metabólicos, enfisema congénito (a1-antitripsina), síndrome de Lesch-Nyhan (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa), enfermedad de Niemann-Pick (esfingomielinasa), enfermedad de Tays-Sachs (hexosaminidasa A lisosomal), Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (deshidrogenasa de cetoácido de cadena ramificada), enfermedades degenerativas de la retina (y otras enfermedades del ojo y la retina; por ejemplo, PDGF para la degeneración macular), enfermedades de órganos sólidos como el cerebro (incluida la enfermedad de Parkinson [GDNF], astrocitomas [endostatina, angiostatina y/o ARNi contra VEGF], glioblastomas [endostatina, angiostatina y/o ARNi contra VEGF]), hígado, riñón, corazón, incluida la insuficiencia cardíaca congestiva o la enfermedad arterial periférica (EAP) (por ejemplo, mediante la administración del inhibidor de la proteína fosfatasa I (1-1), serca2a, proteínas de dedos de zinc que regulan el gen del fosfolamban, Barkct (receptor p2-adrenérgico, cinasa del receptor p2-adrenérgico (BARK), cinasa de fosfoinosítido-3 (cinasa PI3), S100A1, parvalbúmina, adenilil ciclasa tipo 6, una molécula que efectúa la supresión de la cinasa de receptor acoplado a proteína G tipo 2, como un bARKct truncado constitutivamente activo; calsarcina, ARNi contra fosfolamban; moléculas inhibidoras o dominantes negativas del fosfolamban, tal como fosfolamban S16E, etc.), artritis (factores de crecimiento tipo insulina), trastornos articulares (factor de crecimiento tipo insulina 1 y/o 2), hiperplasia íntima (por ejemplo, mediante la administración de enos, inos), mejorar la supervivencia de los trasplantes de corazón (superóxido dismutasa), SIDA (CD4 soluble), desgaste muscular (factor de crecimiento tipo insulina I), deficiencia renal (eritropoyetina), anemia (eritropoyetina), artritis (factores antiinflamatorios tal como IRAP y receptor soluble TNFa), hepatitis (a-interferón), deficiencia del receptor LDL (receptor LDL), hiperamonemia (ornitina transcarbamilasa), enfermedad de Krabbe (galactocerebrosidasa), enfermedad de Batten, ataxias cerebrales espinales incluido SCA1, SCA2 y SCA3, fenilcetonuria (fenilalanina hidroxilasa), enfermedades autoinmunes y similares. Los vectores de virus se pueden usar además después del trasplante de órganos para incrementar el éxito del trasplante y/o para reducir los efectos secundarios negativos del trasplante de órganos o terapias adjuntas (por ejemplo, por administración de agentes inmunosupresores o ácidos nucleicos inhibidores para bloquear la producción de citocinas). Como otro ejemplo, las proteínas morfogénicas óseas (incluidas BNP 2, 7, etc., RANKL y/o VEGF) se puede administrar con un aloinjerto óseo, por ejemplo, después de una ruptura o extirpación quirúrgica en un paciente con cáncer.

La transferencia génica tiene un uso potencial sustancial para comprender y proporcionar terapia para estados de enfermedad. Hay varias enfermedades hereditarias en las que se conocen genes defectuosos y se han clonado. En general, los estados de enfermedad anteriores se dividen en dos clases: estados de deficiencia, usualmente de enzimas, que en general se heredan de manera recesiva, y estados desequilibrados, que pueden implican proteínas reguladoras o estructurales, y que habitualmente se heredan de manera dominante. Para enfermedades de estado de deficiencia, la transferencia de genes se puede usar para llevar un gen normal a los tejidos afectados para terapia de reemplazo, así como para crear modelos animales para la enfermedad usando mutaciones antisentido. Para estados de enfermedad desequilibrados, la transferencia de genes se puede usar para crear un estado de enfermedad en un sistema modelo, que entonces se puede usar en esfuerzos para contrarrestar el estado de enfermedad. Por lo tanto, los vectores de virus descritos en la presente permiten el tratamiento y/o prevención de enfermedades genéticas.

Los vectores de virus de acuerdo con la presente invención también se pueden emplear para proporcionar un ARN funcional a una célulain vitrooin vivo.La expresión del ARN funcional en la célula, por ejemplo, puede disminuir la expresión de una proteína diana particular por la célula. Por consiguiente, el ARN funcional se puede administrar para disminuir la expresión de una proteína particular en un sujeto en necesidad del mismo. El ARN funcional también se puede administrar a célulasin vitropara regular la expresión génica y/o fisiología celular, por ejemplo, para optimizar sistemas de cultivo celular o tisular o en métodos de selección.

Los vectores de virus divulgados en la presente encuentran uso en métodos de diagnóstico y examenin vitro,por lo que un ácido nucleico de interés se expresa de manera transitoria o estable en un sistema de cultivo celular.

Los vectores de virus divulgados en la presente también se pueden usar para diferentes propósitos no terapéuticos, incluido pero no limitado a uso en protocolos para valorar el direccionamiento de genes, depuración, transcripción, traducción, etc., como sería evidente para un experto en la técnica. Los vectores de virus también se pueden usar para el propósito de evaluar la seguridad (propagación, toxicidad, inmunogenicidad, etc.). Estos datos, por ejemplo, se consideran por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos como parte del proceso de aprobación reglamentaria antes de la evaluación de la eficacia clínica.

Como un aspecto adicional, los vectores de virus divulgados en la presente se pueden usar para producir una respuesta inmunitaria en un sujeto. De acuerdo con esta realización, un vector de virus que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica para un polipéptido inmunogénico se puede administrar a un sujeto, y el sujeto monta una respuesta inmunitaria activa contra el polipéptido inmunogénico. Los polipéptidos inmunogénicos son como se describió anteriormente en la presente. En algunas realizaciones, se provoca una respuesta inmunitaria protectora.

De manera alternativa, el vector de virus se puede administrar a una célulaex vivoy la célula alterada se administra al sujeto. El vector de virus que comprende el ácido nucleico heterólogo se introduce en la célula, y la célula se administra al sujeto, donde el ácido nucleico heterólogo que codifica para el inmunógeno se puede expresar e inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto contra el inmunógeno. En realizaciones particulares, la célula es una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una célula dendrítica).

Una “respuesta inmunitaria activa” o “inmunidad activa” se caracteriza por “participación de tejidos y células hospedadoras después de un encuentro con el inmunógeno. Implica la diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes en tejidos linforreticulares, que conducen a la síntesis de anticuerpos o al desarrollo de reactividad mediada por células, o ambos ". Herbert B. Herscowitz,Inmunofisiología: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, inIMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Indicado de manera alternativa, una respuesta inmunitaria activa se monta por el hospedador después de la exposición a un inmunógeno por infección o por vacunación. La inmunidad activa se puede contrastar con la inmunidad pasiva, que se adquiere a través de la “transferencia de sustancias preformadas (anticuerpo, factor de transferencia, injerto tímico, interleucina-2) de un hospedador inmunizado activamente a un hospedador no inmunitario”.Id.

Una respuesta inmunitaria “protectora” o inmunidad “protectora” como se usa en la presente indica que la respuesta inmunitaria confiere algún beneficio al sujeto en que previene o reduce la incidencia de enfermedad. De manera alternativa, una respuesta inmunitaria protectora o inmunidad protectora puede ser útil en el tratamiento y/o prevención de enfermedad, en particular cáncer o tumores (por ejemplo, al prevenir cáncer o formación de tumor, al provocar regresión de un cáncer o tumor y/o al prevenir metástasis y/o al prevenir crecimiento de nódulos metastásicos). Los efectos protectores pueden ser completos o parciales, siempre y cuando los beneficios del tratamiento superen cualquier desventaja del mismo.

En realizaciones particulares, el vector de virus o célula que comprende el ácido nucleico heterólogo se puede administrar en una cantidad inmunogénicamente efectiva, como se describe más adelante.

Los vectores de virus divulgados en la presente también se pueden administrar para inmunoterapia contra cáncer por administración de un vector de virus que expresa uno o más antígenos de células cancerosas (o una molécula inmunológicamente similar) o cualquier otro inmunógeno que produce una respuesta inmunitaria contra una célula cancerosa. Para ilustrar, se puede producir una respuesta inmunitaria contra un antígeno de célula cancerosa en un sujeto al administrar un vector de virus que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para el antígeno de célula cancerosa, por ejemplo, para tratar a un paciente con cáncer y/o para prevenir que el cáncer se desarrolle en el sujeto. El vector de virus se puede administrar a un sujetoin vivoo al usar métodosex vivo,como se describe en la presente. De manera alternativa, el antígeno de cáncer se puede expresar como parte de la cápside de virus o se puede asociar de otra manera con la cápside de virus como se describió anteriormente.

Como otra alternativa, cualquier otro ácido nucleico terapéutico (por ejemplo, ARNi) o polipéptido (por ejemplo, citocina) conocido en la técnica se puede administrar para tratar y/o prevenir el cáncer.

Como se usa en la presente, el término “cáncer” abarca cánceres que forman tumores. Del mismo modo, el término “tejido canceroso” abarca tumores. Un “antígeno de célula cancerosa” abarca antígenos tumorales.

El término “cáncer” tiene su significado entendido en la técnica, por ejemplo, un crecimiento incontrolado de tejido que tiene el potencial de diseminarse a sitios distantes del cuerpo (es decir, metastatizar). Los cánceres de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, melanoma, adenocarcinoma, timoma, linfoma (por ejemplo, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin), sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de colon, leucemia, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro y cualquier otro cáncer o condición maligna ahora conocida o identificada posteriormente.

El término “tumor” también se entiende en la técnica, por ejemplo, como una masa anormal de células indiferenciadas dentro de un organismo multicelular. Los tumores pueden ser malignos o benignos. En realizaciones representativas, los métodos divulgados en la presente se usan para prevenir y tratar tumores malignos.

Por los términos “tratar cáncer”, “tratamiento de cáncer” y términos equivalentes se propone que la severidad del cáncer se reduzca o al menos se elimine parcialmente y/o la progresión de la enfermedad se ralentice y/o controle y/o la enfermedad se estabilice. En realizaciones particulares, estos términos indican que la metástasis del cáncer se previene o reduce o al menos parcialmente se elimina y/o que el crecimiento de nódulos metastásicos se previene o reduce o al menos parcialmente se elimina.

Por los términos “prevención de cáncer” o “prevenir cáncer” y términos equivalentes se propone que los métodos eliminen o reduzcan al menos parcialmente y/o retrasen la incidencia y/o severidad del inicio del cáncer. De manera alternativa, la aparición de cáncer en el sujeto se puede reducir en posibilidad o probabilidad y/o retrasarse.

En realizaciones particulares, no cubiertas por las reivindicaciones, las células se pueden remover de un sujeto con cáncer y ponerse en contacto con un vector de virus de acuerdo con la presente invención. Entonces, la célula modificada se administra al sujeto, por lo que se provoca una respuesta inmunitaria contra el antígeno de célula cancerosa. Este método se puede emplear de manera ventajosa con sujetos inmunocomprometidos que no pueden montar una respuesta inmunitaria suficientein vivo(es decir, no pueden producir anticuerpos intensificadores en cantidades suficientes).

Se conoce en la técnica que las respuestas inmunitarias se pueden mejorar por citocinas inmunomoduladoras (por ejemplo, a-interferón, p-interferón, Y-interferón, w-interferón, T-interferón, interleucina-1a, interleucina-1 p, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina 5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-11, interleucina 12, interleucina-13, interleucina-14, interleucina-18, factor de crecimiento de células B, ligando CD40, factor de necrosis tumoral-a, factor de necrosis tumoral-p, proteína 1 quimiotractante de monocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y linfotoxina). Por consiguiente, las citocinas inmunomoduladoras (preferentemente, citocinas inductivas de CTL) se pueden administrar a un sujeto junto con el vector de virus.

Las citocinas se pueden administrar por cualquier método conocido en la técnica. Las citocinas exógenas se pueden administrar al sujeto, o de manera alternativa, un ácido nucleico que codifica para una citocina se puede administrar al sujeto usando un vector adecuado, y la citocina producidain vivo.

Sujetos, formulaciones farmacéuticas y modos de administración

Los vectores de virus y cápsides divulgados en la presente encuentran uso tanto en aplicaciones veterinarias como médicas. Los sujetos adecuados incluyen tanto aves como mamíferos. El término “aviar”, como se usa en la presente, incluye, pero no se limita a, pollos, patos, gansos, codornices, pavos, faisanes, loros, periquitos y similares. El término “mamífero”, como se usa en la presente, incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los sujetos humanos incluyen neonatos, bebés, jóvenes y adultos.

En realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de virus y/o cápside de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, agentes estabilizantes, amortiguadores, portadores, adyuvantes, diluyentes, etc. Para la inyección, el portador será habitualmente un líquido. Para otros métodos de administración, el portador puede ser ya sea sólido o líquido. Para la administración por inhalación, el portador será respirable y opcionalmente puede estar en forma de partículas sólidas o líquidas.

Por “farmacéuticamente aceptable” se entiende un material que no es tóxico o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un sujeto sin provocar ningún efecto biológico indeseable.

Un aspecto divulgado en la presente es un método para transferir un ácido nucleico a una célulain vitro.El vector de virus se puede introducir en las células en la multiplicidad apropiada de infección de acuerdo con métodos de transducción estándar adecuados para las células diana particulares. Los títulos de vector de virus a administrar pueden variar, dependiendo del tipo y número de células diana, y el vector de virus particular, y se pueden determinar por aquellos expertos en la técnica sin experimentación indebida. En realizaciones representativas, al menos aproximadamente 103 unidades infecciosas, más preferentemente al menos aproximadamente 105 unidades infecciosas se introducen a la célula.

La o las células en las que se introduce el vector de virus pueden ser de cualquier tipo, incluido, pero no limitado a, células neurales (incluidas células del sistema nervioso periférico y central, en particular, células cerebrales tal como neuronas y oligodendrocitos), células pulmonares, células del ojo (incluidas células retinianas, epitelio pigmentario retiniano y células córneas), células de vasos sanguíneos (por ejemplo, células endoteliales, células íntimas), células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales y respiratorias), células musculares (por ejemplo, células de músculo esquelético, células de músculo cardiaco, células de músculo liso y/o células musculares de diafragma), células dendríticas, células pancreáticas (incluidas células de islotes), células hepáticas, células renales, células miocárdicas, células óseas (por ejemplo, células madre de médula ósea), células madre hematopoyéticas, células de bazo, queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, células de próstata, células germinales y similares. En realizaciones representativas, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como una posibilidad adicional, la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, célula madre neural, célula madre hepática). Como aún una alternativa adicional, la célula puede ser una célula cancerosa o tumoral. Además, la célula puede ser de cualquier especie de origen, como se indicó anteriormente.

El vector de virus se puede introducir en célulasin vitrocon el propósito de administrar la célula modificada a un sujeto. En realizaciones particulares, las células se han removido de un sujeto, el vector de virus se introduce allí y las células entonces se administran nuevamente al sujeto. Los métodos para remover células del sujeto para la manipulaciónex vivo,seguido de la introducción de nuevo en el sujeto se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos No. 5,399,346). De manera alternativa, el vector de virus recombinante se puede introducir en células de un sujeto donante, en células cultivadas o en células de cualquier otra fuente adecuada, y las células se administran a un sujeto en necesidad del mismo (es decir, un sujeto “receptor”).

Las células adecuadas para administración génicaex vivoson como se describió anteriormente. Las dosis de las células para administrar a un sujeto variarán según la edad, condición y especie del sujeto, el tipo de célula, el ácido nucleico que se expresa por la célula, el modo de administración y similares. Habitualmente, al menos aproximadamente 102 a aproximadamente 108 células o al menos aproximadamente 103 a aproximadamente 106 células se administrarán por dosis en un portador farmacéuticamente aceptable. En realizaciones particulares, las células transducidas con el vector de virus se administran al sujeto en una cantidad efectiva de tratamiento o efectiva de prevención en combinación con un portador farmacéutico.

En algunas realizaciones, el vector de virus se introduce en una célula y la célula se puede administrar a un sujeto para provocar una respuesta inmunogénica contra el polipéptido administrado (por ejemplo, expresado como un transgén o en la cápside). Habitualmente, se administra una cantidad de células que expresan una cantidad inmunogénicamente efectiva del polipéptido en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Una “cantidad inmunogénicamente efectiva” es una cantidad del polipéptido expresado que es suficiente para evocar una respuesta inmunitaria activa contra el polipéptido en el sujeto al cual se administra la formulación farmacéutica. En realizaciones particulares, la dosis es suficiente para producir una respuesta inmunitaria protectora (como se definió anteriormente). El grado de protección conferido no necesita ser completo o permanente, siempre y cuando los beneficios de administrar el polipéptido inmunogénico superen cualquier desventaja del mismo.

Un aspecto adicional, no reivindicado, es un método para administrar el vector de virus a sujetos. La administración de los vectores de virus y/o cápsides de acuerdo con la presente invención a un sujeto humano o un animal que lo necesite puede ser por cualquier medio conocido en la técnica. Opcionalmente, el vector de virus y/o cápside se administra en una dosis efectiva de tratamiento o efectiva de prevención en un portador farmacéuticamente aceptable.

Los vectores de virus y/o cápsides se pueden administrar además para provocar una respuesta inmunogénica (por ejemplo, como una vacuna). Habitualmente, las composiciones inmunogénicas divulgadas en la presente comprenden una cantidad inmunogénicamente efectiva de vector de virus y/o cápside en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la dosis es suficiente para producir una respuesta inmunitaria protectora (como se definió anteriormente). El grado de protección conferido no necesita ser completo o permanente, siempre y cuando los beneficios de administrar el polipéptido inmunogénico superen cualquier desventaja del mismo. Los sujetos e inmunógenos son como se describió anteriormente.

Las dosis del vector de virus y/o cápside que se van a administrar a un sujeto dependen del modo de administración, la enfermedad o condición que se va a tratar y/o prevenir, la condición del sujeto individual, el vector de virus o cápside particular y el ácido nucleico que se va a administrar, y similares, y se pueden determinar de manera rutinaria. Dosis de ejemplo para lograr efectos terapéuticos son títulos de al menos aproximadamente 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 unidades de transducción, opcionalmente aproximadamente 108 - 1013 unidades de transducción.

En realizaciones particulares, se puede emplear más de una administración (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más administraciones) para lograr el nivel deseado de expresión génica durante un período de diferentes intervalos, por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.

Los modos de administración de ejemplo incluyen oral, rectal, transmucosa, intranasal, inhalación (por ejemplo, mediante un aerosol), bucal (por ejemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, intraendotelial,in utero(oin ovo),parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intracraneal, intramuscular [incluyendo administración a músculo esquelético, diafragma y/o cardíaco], intrapleural, intracerebral e intraarticular), tópica (por ejemplo, a ambas superficies de piel y mucosas, incluidas superficies de vías respiratorias y administración transdérmica), intralinfática y similares, así como inyección directa de tejido u órgano (por ejemplo, a hígado, ojo [incluido intravítreo y subretinal], músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo diafragma o cerebro).

La administración puede ser a cualquier sitio en un sujeto, incluido, sin limitación, un sitio seleccionado del grupo que consiste en el cerebro, un músculo esquelético, un músculo liso, el corazón, el diafragma, el epitelio de las vías respiratorias, el hígado, el riñón, el bazo, el páncreas, la piel y el ojo.

La administración también puede ser a un tumor (por ejemplo, en o cerca de un tumor o un ganglio linfático). La vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata y/o previene y de la naturaleza del vector particular que se usa.

La administración al músculo esquelético incluye pero no se limita a la administración al músculo esquelético en las extremidades (por ejemplo, parte superior del brazo, parte inferior del brazo, parte superior de la pierna y/o parte inferior de la pierna), espalda, cuello, cabeza (por ejemplo, lengua), tórax, abdomen, pelvis/perineo y/o dedos. Los músculos esqueléticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, abductor digiti minimi (en la mano), abductor digiti minimi (en el pie), abductor hallucis, abductor ossis metatarsi quinti, abductor pollicis brevis, abductor pollicis longus, aductor brevis, aductor hallucis, aductor longus, aductor magnus, aductor pollicis, anconeus, escaleno anterior, género articularis, bíceps braquial, bíceps femoral, braquial, braquiorradial, buccinador, coracobraquial, corrugador supercilii, deltoides, depresor del ángulo de la boca, depresor del labio inferior, digástrico, interóseo dorsal (en la mano), interóseo dorsal (en el pie), extensor radial corto del carpo, extensor radial largo del carpo, extensor del carpo cubital, extensor de los dedos mínimo, extensor de los dedos, extensor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, extensor corto del dedo gordo, extensor largo del dedo gordo, extensor del índice, extensor corto del pulgar, extensor largo del pulgar, flexor radial del carpo, flexor cubital del carpo, flexor corto de los dedos (en la mano), flexor corto de los dedos (en el pie), flexor corto de los dedos, flexor largo de los dedos, flexor profundo de los dedos, flexor superficial de los dedos, flexor corto del dedo gordo, flexor largo del dedo gordo, flexor del pulgar brevis, flexor largo del pulgar, frontal, gastrocnemio, geniohioideo, glúteo mayor, glúteo medio, glúteo menor, gracilis, iliocostalis cervicis, iliocostalis lumbar, iliocostalis thoracis, illiacus, gemellus inferior, oblicuo inferior, recto inferior, infraespinoso, interespinoso, intertransversi, pterigoideo lateral, recto lateral, dorsal ancho, elevador del ángulo de la boca, elevador de los labios superiores, elevador de los labios superiores alaeque nasi, elevador del párpado superior, elevador de la escápula, rotadores largos, longissimus capitis, longissimus cervicis, longissimus tórax, largo de la cabeza, largo del cuello, lumbricales (en la mano), lumbricales (en el pie), masetero, pterigoideo medial, recto medial, escaleno medio, multífido, milohioideo, obliquus capitis inferior, obliquus capitis superior, obturador extemus, obturador intemus, occipitalis, omohioideo, oponentes digiti minimi, oponentes pollicis, orbicularis óculos, orbicular de los labios, palmar interóseo, palmar corto, palmar largo, pectíneo, pectoral mayor, pectoral menor, peroneo corto, peroneo largo, peroneo tercio, piriforme, interóseo plantar, plantar, platisma, poplíteo, escaleno posterior, pronador cuadrado, pronador redondo, psoas mayor, cuadrado femoral, cuadrado planta, recto de la cabeza anterior, recto de la cabeza lateral, recto de la cabeza posterior mayor, recto de la cabeza posterior menor, recto femoral, romboide mayor, romboide menor, risorio, sartorio, escaleno menor, semimembranoso, semiespinoso de la cabeza, semiespinoso del cuello, semiespinoso del tórax, semitendinoso, serrato anterior, rotadores cortos, sóleo, espinal de la cabeza, espinal del cuello, espinal del tórax, esplenio de la cabeza, esplenio del cuello, esternocleidomastoideo, esternohioideo, esternotiroideo, estilohioideo, subclavio, subescapular, gemelo superior, oblicuo superior, recto superior, supinador, supraespinoso, temporal, tensor de la fascia lata, redondo mayor, redondo menor, tórax, tirohioideo, tibial anterior, tibial posterior, trapecio, tríceps braquial, vasto intermedio, vasto lateral, vasto medial, cigomático mayor y cigomático menor, y cualquier otro músculo esquelético adecuado conocido en la técnica.

El vector de virus se puede administrar al músculo esquelético por administración intravenosa, administración intraarterial, administración intraperitoneal, perfusión de extremidades, (opcionalmente, perfusión de extremidades aisladas de una pierna y/o brazo; ver, por ejemplo, Arrudaet al.,(2005)Blood105: 3458-3464), y/o inyección intramuscular directa. En realizaciones particulares, el vector de virus y/o cápside se administra a una extremidad (brazo y/o pierna) de un sujeto (por ejemplo, un sujeto con distrofia muscular tal como DMD) por perfusión de extremidad, perfusión de extremidad opcionalmente aislada (por ejemplo, por administración intravenosa o intraarticular. En realizaciones no cubiertas por las reivindicaciones, los vectores de virus y/o cápsides de la invención se pueden administrar de manera ventajosa sin emplear técnicas “hidrodinámicas”. La administración de tejido (por ejemplo, al músculo) de vectores de la técnica anterior frecuentemente se mejora por técnicas hidrodinámicas (por ejemplo, administración intravenosa/intravenosa en un gran volumen), que incrementan la presión en la vasculatura y facilitan la capacidad del vector para cruzar la barrera de células endoteliales. En realizaciones particulares, no cubiertas por las reivindicaciones, los vectores virales y/o cápsides de la invención se pueden administrar en ausencia de técnicas hidrodinámicas tal como infusiones de alto volumen y/o presión intravascular elevada (por ejemplo, mayor que la presión sistólica normal, por ejemplo, menor o igual a un incremento de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % en la presión intravascular sobre la presión sistólica normal). Estos métodos pueden reducir o evitar los efectos secundarios asociados con técnicas hidrodinámicas tal como edema, daño nervioso y/o síndrome compartimental.

La administración al músculo cardíaco incluye la administración a la aurícula izquierda, aurícula derecha, ventrículo izquierdo, ventrículo derecho y/o tabique. El vector de virus y/o cápside se puede administrar al músculo cardíaco por administración intravenosa, administración intraarterial tal como administración intraaórtica, inyección cardíaca directa (por ejemplo, en aurícula izquierda, aurícula derecha, ventrículo izquierdo, ventrículo derecho) y/o perfusión de arteria coronaria.

La administración al músculo del diafragma puede ser por cualquier método adecuado que incluye administración intravenosa, administración intraarterial y/o administración intraperitoneal.

La administración al músculo liso puede ser por cualquier método adecuado que incluye administración intravenosa, administración intraarterial y/o administración intraperitoneal. En una realización, la administración puede ser a células endoteliales presentes en, cerca y/o en el músculo liso.

La administración a un tejido diana también se puede lograr al administrar un depósito que comprende el vector de virus y/o cápside. En realizaciones representativas, un depósito que comprende el vector de virus y/o cápside se implanta en tejido muscular esquelético, liso, cardíaco y/o de diafragma o el tejido se puede poner en contacto con una película u otra matriz que comprende el vector de virus y/o cápside. Estas matrices o sustratos implantables se describen en la patente de Estados Unidos No. 7,201,898.

En realizaciones particulares, no cubiertas por las reivindicaciones, un vector de virus de acuerdo con la presente invención se administra a músculo esquelético, músculo de diafragma y/o músculo cardíaco (por ejemplo, para tratar y/o prevenir distrofia muscular o enfermedad cardíaca [por ejemplo, PAD o insuficiencia cardíaca congestiva]).

En realizaciones representativas, no cubiertas por las reivindicaciones, la invención se usa para tratar y/o prevenir trastornos del músculo esquelético, cardíaco y/o de diafragma.

En una realización representativa, no cubierta por las reivindicaciones, la divulgación proporciona un método para tratar y/o prevenir distrofia muscular en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: administrar una cantidad efectiva de tratamiento o prevención de un vector de virus de la invención a un sujeto mamífero, en donde el vector de virus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para distrofina, una minidistrofina, una micro-distrofina, propéptido de miostatina, folistatina, receptor soluble de activina tipo II, IGF-1, polipéptidos antiinflamatorios tal como el mutante dominante Ikappa B, sarcospano, utrofina, una micro-distrofina, laminina-a2, a-sarcoglucano, p-sarcoglucano, Y-sarcoglucano, 5-sarcoglucano, IGF-1, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra miostatina o propéptido de miostatina, y/o ARNi contra miostatina. En realizaciones particulares, el vector de virus se puede administrar a músculo esquelético, diafragma y/o cardíaco como se describe en otra parte de la presente.

La invención también se puede poner en práctica para producir ARN antisentido, ARNi u otro ARN funcional (por ejemplo, una ribozima) para administración sistémica.

La invención también proporciona un método para tratar y/o prevenir insuficiencia cardíaca congénita o PAD en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar una cantidad efectiva de tratamiento o prevención de un vector de virus de la invención a un sujeto mamífero, en donde el vector de virus comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica, por ejemplo, para un endorreticulo sarcoplásmico Ca2+-ATPasa (SERCA2a), un factor angiogénico, inhibidor de fosfatasa I (1-1), ARNi contra fosfolamban; una molécula inhibidora o dominante negativa de fosfolamban tal como fosfolamban S16E, una proteína de dedo de zinc que regula el gen de fosfolamban, receptor p2-adrenérgico, cinasa del receptor p2-adrenérgico (BARK), cinasa PI3, calsarcan, un inhibidor de cinasa del receptor p-adrenérgico (pARKct), inhibidor 1 de proteína fosfatasa 1, S100A1, parvalbúmina, adenilil ciclasa tipo 6, una molécula que afecta la inactivación de cinasa del receptor acoplado a proteína G tipo 2 tal como un bARKct constitutivamente activo truncado, Pim-1, PGC-la, SOD-1, S<o>D-2, EC-SOD, calicreína, HIF, timosina-p4, mir-1, mir-133, mir-206 y/o mir-208.

Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. De manera alternativa, se puede administrar el vector de virus y/o cápsides de virus de la invención de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, en una formulación de depósito o de liberación sostenida. Además, el vector de virus y/o cápside de virus se pueden administrar adheridos a una matriz quirúrgicamente implantable (por ejemplo, como se describe en publicación de patente de Estados Unidos No. 2004-0013645).

Los vectores de virus divulgados en la presente se pueden administrar a los pulmones de un sujeto por cualquier medio adecuado, opcionalmente al administrar una suspensión de aerosol de partículas respirables que comprenden los vectores de virus y/o cápsides de virus, que el sujeto inhala. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden los vectores de virus y/o cápsides de virus se pueden producir por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de aerosol accionado por presión o un nebulizador ultrasónico, como se conoce por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos No. 4,501,729. Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden los vectores de virus y/o cápsides se pueden producir de manera similar con cualquier generador de aerosol de medicamento en partículas sólido, por técnicas conocidas en la técnica farmacéutica.

Los vectores de virus se pueden administrar a tejidos del CNS (por ejemplo, cerebro, ojo) y pueden dar por resultado de manera ventajosa una distribución más amplia del vector de virus o cápside de lo que se observaría en la ausencia descrita en la presente.

En realizaciones particulares, los vectores de administración de la invención se pueden administrar para tratar enfermedades del CNS, incluidos trastornos genéticos, trastornos neurodegenerativos, trastornos psiquiátricos y tumores. Las enfermedades ilustrativas del CNS incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Canavan, enfermedad de Leigh, enfermedad de Refsum, síndrome de Tourette, esclerosis lateral primaria, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular progresiva, enfermedad de Pick, distrofia muscular, esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Binswanger, traumatismo debido a lesión de médula espinal o cabeza, enfermedad de Tay Sachs, enfermedad de Lesch-Nyan, epilepsia, infartos cerebrales, trastornos psiquiátricos, incluidos trastornos del estado de ánimo (por ejemplo, depresión, trastorno afectivo bipolar, trastorno afectivo persistente, trastorno del estado de ánimo secundario), esquizofrenia, dependencia de drogas (por ejemplo, alcoholismo y otras dependencias de sustancias), neurosis (por ejemplo, ansiedad, trastorno obsesivo, trastorno somatoforme, trastorno disociativo, duelo, depresión posparto), psicosis (por ejemplo, alucinaciones y delirios), demencia, paranoia, trastorno por déficit de atención, trastornos psicosexuales, trastornos del sueño, trastornos del dolor, trastornos alimentarios o de peso (por ejemplo, obesidad, caquexia, anorexia nerviosa y bulimia) y cánceres y tumores (por ejemplo, tumores pituitarios) del CNS.

Los trastornos del CNS incluyen trastornos oftálmicos que implican la retina, tracto posterior y nervio óptico (por ejemplo, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética y otras enfermedades degenerativas de la retina, uveítis, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma).

La mayoría, si no todas, las enfermedades y trastornos oftálmicos se asocian con uno o más de tres tipos de indicaciones: (1) angiogénesis, (2) inflamación y (3) degeneración. Los vectores de administración divulgados en la presente se pueden emplear para administrar factores antiangiogénicos; factores antiinflamatorios; factores que retrasan la degeneración celular, promueven el ahorro de células o promueven el crecimiento celular y combinaciones de los anteriores.

La retinopatía diabética, por ejemplo, se caracteriza por angiogénesis. La retinopatía diabética se puede tratar al administrar uno o más factores antiangiogénicos ya sea de manera intraocular (por ejemplo, en el vítreo) o de manera periocular (por ejemplo, en la región sub-Tenon). Uno o más factores neurotróficos también se pueden administrar conjuntamente, ya sea de manera intraocular (por ejemplo, de manera intravítrea o de manera subretinal) o de manera periocular.

La uveítis implica inflamación. Uno o más factores antiinflamatorios se pueden administrar mediante administración intraocular (por ejemplo, vítreo o cámara anterior) de un vector de administración de la invención.

La retinitis pigmentosa, en comparación, se caracteriza por degeneración retiniana. En realizaciones representativas, la retinitis pigmentosa se puede tratar por administración intraocular (por ejemplo, vítrea) de un vector de administración que codifica para uno o más factores neurotróficos.

La degeneración macular relacionada con la edad implica tanto la angiogénesis como degeneración de retina. Este trastorno se puede tratar al administrar los vectores de administración inventivos que codifican para uno o más factores neurotróficos de manera intraocular (por ejemplo, vítreo) y/o uno o más factores antiangiogénicos de manera intraocular o periocular (por ejemplo, en la región de subTenon).

El glaucoma se caracteriza presión ocular incrementada y pérdida de células ganglionares de la retina. Los tratamientos para el glaucoma incluyen la administración de uno o más agentes neuroprotectores que protegen a las células del daño excitotóxico usando los vectores de administración inventivos. Estos agentes incluyen antagonistas de N-metil-D-aspartato (NMDA), citocinas y factores neurotróficos, administrados de manera intraocular, opcionalmente de manera intravítrea.

En otras realizaciones, la presente invención se puede usar para tratar convulsiones, por ejemplo, para reducir el inicio, incidencia o severidad de las convulsiones. La eficacia de un tratamiento terapéutico para las convulsiones se puede valorar por medios conductuales (por ejemplo, agitación, tics del ojo o boca) y/o electrográficos (la mayoría de las convulsiones tienen anormalidades electrográficas distintivas). Por lo tanto, la invención también se puede usar para tratar la epilepsia, que se marca por múltiples convulsiones con el paso del tiempo.

En una realización representativa, la somatostatina (o un fragmento activo de la misma) se administra al cerebro usando un vector de administración de la invención para tratar un tumor hipofisario. De acuerdo con esta realización, el vector de administración que codifica para somatostatina (o un fragmento activo de la misma) se administra por microinfusión en la pituitaria. Del mismo modo, este tratamiento se puede usar para tratar acromegalia (secreción anormal de hormona de crecimiento de la pituitaria). El ácido nucleico (por ejemplo, No. de acceso GenBank J00306) y aminoácido (por ejemplo, No. de acceso GenBank P01166; contiene péptidos activos procesados somatostatina-28 y somatostatina-14) secuencias de somatostatinas como se conocen en la técnica.

En realizaciones particulares, el vector puede comprender una señal secretora como se describe en la patente de Estados Unidos No. 7,071,172.

En realizaciones representativas de la invención, el vector de virus y/o cápside de virus se administra al CNS (por ejemplo, al cerebro o al ojo). El vector de virus y/o cápside se puede introducir en la médula espinal, tronco encefálico (médula oblonga, protuberancia), mesencéfalo (hipotálamo, tálamo, epitálamo, glándula pituitaria, sustancia negra, glándula pineal), cerebelo, telencéfalo (cuerpo estriado, cerebro que incluye los lóbulos occipital, temporal, parietal y frontal, corteza, ganglios basales, hipocampo y portaamila), sistema límbico, neocórtex, cuerpo estriado, cerebro y colículo inferior. El vector de virus y/o cápside también se puede administrar a diferentes regiones del ojo tal como la retina, córnea y/o nervio óptico.

El vector de virus y/o cápside se puede administrar en el líquido cefalorraquídeo (por ejemplo, por punción lumbar) para administración más dispersa del vector de administración. El vector de virus y/o cápside se puede administrar además de manera intravascular al CNS en situaciones en las que la barrera hematoencefálica se ha perturbado (por ejemplo, tumor cerebral o infarto cerebral).

El vector de virus y/o cápside se puede administrar a la o las regiones deseadas del CNS por cualquier vía conocida en la técnica, incluido, pero no limitado a, administración intratecal, intraocular, intracerebral, intraventricular, intravenosa (por ejemplo, en la presencia de un azúcar tal como manitol), intranasal, intra-aural, intra-ocular (por ejemplo, intravitrea, subretiniana, cámara anterior) y peri-ocular (por ejemplo, región sub-Tenon), así como administración intramuscular con administración retrógrada a neuronas motoras.

En realizaciones particulares, el vector de virus y/o cápside se administra en una formulación líquida por inyección directa (por ejemplo, inyección estereotáctica) a la región o compartimiento deseado en el CNS. En otras realizaciones, el vector de virus y/o cápside se pueden proporcionar por aplicación tópica a la región deseada o por administración intranasal de una formulación en aerosol. La administración al ojo, puede ser por aplicación tópica de gotas líquidas. Como una alternativa adicional, el vector de virus y/o cápside se puede administrar como una formulación sólida de liberación lenta (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 7,201,898).

En aún realizaciones adicionales, el vector de virus puede usarse para transporte retrógrado para tratar y/o prevenir enfermedades y trastornos que involucran neuronas motoras (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ALS); atrofia muscular espinal (SMA), etc.). Por ejemplo, el vector de virus se puede administrar al tejido muscular desde el cual puede migrar a las neuronas.

Habiendo descrito la presente invención, la misma se explicará con mayor detalle en los siguientes ejemplos, que se incluyen en la presente para propósitos ilustrativos solamente, y que no se propone que sean limitantes para la invención.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Plásmidos y virus. Todos los plásmidos se obtuvieron de las instalaciones de North Carolina Gene Therapy Center Vector Core. El virus se generó a través de triple transfección de células HEK293 y se purificó por ultracentrifugación de densidad de cloruro de cesio. El título viral se obtuvo usando análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), usando el siguiente conjunto de cebadores diseñado para reconocer el transgén de luciferasa: (directo) 5'-AAA AGC ACT CTG ATT GAC AAA TAC-3' (SEQ ID NO: 9) e (inverso) 5'-CCT TCG CTT CAA AAA ATG GAA C-3' (SEQ ID NO: 10); o el siguiente conjunto de cebadores diseñado para reconocer el gen antitripsina humano: (directo) 5'-GAA Gt C AAG GAC ACC GAG GA-3' (SEQ ID NO:11) e (inverso) 5-CCC AGC TGG ACA GTC TCT TA-3' (SEQ ID NO:12). Para todos los grupos experimentales, las construcciones virales relevantes se titularon juntas en la misma placa de qPCR antes de usarse. Se usó mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene QuikChange) para deleción o sustitución de nucleótidos. La tabla 8 lista las secuencias de cebadores usadas para todos los mutantes de VR1 examinados en este estudio. Los mutantes puntuales de rAAV1 -> rAAV6 (por ejemplo, rAAV6.1, etc.) ya formaban parte de las existencias de laboratorio generales. La secuenciación de ADN se realizó en cada plásmido usado en este trabajo para verificar la identidad de secuencia antes de hacer el virus.

Tabla 8. Cebador r ^ m n i iri i l ii m n VR1.

* el cebador rAAV1/T265del exacto se usó para crear mutantes rAAV6/T265del. ;;Estudios con animales vivos. Todos los animales se mantuvieron y trataron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud, bajo protocolos aprobados por el IACUC en la University of North Carolina, Chapel Hill. Las variantes de rAAV que empaquetan el transgén CBA-luciferasa o CBA-hAAT se inyectaron en el GC de ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratories) en las cantidades indicadas. Todas las inyecciones se realizaron en 50 pl de volumen total por inyección. Los ratones se anestesiaron usando gas isoflurano antes de la inyección. La expresión de transgén de luciferasa se monitoreó en los puntos de tiempo indicados usando un sistema de imagenología Xenogen IVIS Lumina (Perkin Elmer/Caliper Life Sciences) después de la inyección intraperitoneal de sustrato de D-luciferina (Nanolight) a 120 mg/kg de peso corporal. El análisis de imagen bioluminiscente se realizó usando el software Living Image (Perkin Elmer/Caliper Life Sciences), y la expresión de luciferasa se reporta en CPM/ROI (conteos por minuto sobre una región de interés seleccionada). ;Cuantificaciónex vivode la expresión transgénica y número de copias. Para el ensayo de luciferasaex vivo,los ratones se sacrificaron a 7 dpi de 1e10vg y se cosechó tejido muscular inyectado. Aproximadamente 50 mg de cada tejido se picaron en hielo. Cada alícuota de tejido entonces se homogeneizó en 150 pl de amortiguador de lisis pasiva 2X (Promega) usando un desgarrador de tejidos (Cole-Parmer). 35 pl de productos lisados y 100 pl de sustrato de D-luciferina (Promega) se transfirieron a placas de 96 pozos para análisis luminométrico usando un luminómetro Victor2 (Perkin Elmer). La concentración de proteína total en productos lisados de tejido se determinó mediante ensayo de Bradford (Bio-Rad). A 3 dpi de 1e10vg, GC inyectado se cosechó/homogeneizó y se lisó como anteriormente, y una alícuota de tejido de ~25 mg se procesó usando un kit DNeasy (Qiagen) para extraer ADN genómico de hospedador y vector. El número de células se determinó mediante qPCR con los siguientes cebadores diseñados específicamente para el Lamin de ratón (un gen de mantenimiento): (directo) 5’-GGA CCC AAG GAC TAC CTC AAG GG-3’ (SEQ ID NO: 25) e (inverso) 5-AGG GCA CCT CCA TCT CGG AAA C-3’ (SEQ ID NO: 26). La cantidad de genomas virales por célula se determinó mediante qPCR con cebadores diseñados específicos para el transgén de luciferasa, como se describió anteriormente. ;;Competencia de heparina. Las construcciones indicadas se incubaron en una solución de 250 pg/ml de sal de sodio de sulfato de heparina porcina (Sigma-Aldrich) disuelta en solución salina de Ringer (RSS), o solución salina de Ringer sola, durante la noche a 4 °C con rotación. 1e10vg de cada grupo se inyectó por GC en un volumen total de 50 pl por inyección. A 7 dpi, se realizó imagenología bioluminiscente de animales vivos. ;;Modelado molecular. Las estructuras tridimensionales de rAAV1, rAAV2 o rAAV6 se mostraron como cápsides completas (un amable regalo del Dr. Mavis Agbandje-McKenna) usando coordenadas publicadas previamente en PyMol (www.pymol.org). El comando PyMol align se usó para alinear diferentes estructuras. Los pares de átomos implicados en el enlace de hidrógeno se calcularon en coordenadas de estructura cristalina usando MolProbity y se visualizaron usando software gráfico KiNG (kinemage.biochem.duke.edu). ;;Cromatografía de afinidad de heparina. Las construcciones indicadas se incubaron con perlas de agarosa conjugadas con sulfato de heparina (Sigma-Aldrich) durante la noche a 4 °C con rotación. La suspensión se transfirió a una columna de microcromatografía (Bio-Rad) y se lavó 3 veces con RSS, seguido de lavados de NaCl cada vez más rigurosos. Las soluciones se prepararon al disolver la cantidad adecuada de NaCl en RSS, después de ajustar la cantidad de NaCl ya presente en la solución. Se recolectaron todas las fracciones de lavado. El por ciento de virus contenido en cada fracción se determinó por cuantificación por qPCR de partículas virales contenidas dentro de cada lavado, usando cebadores diseñados contra el transgén de luciferasa, descrito anteriormente. ;;Detección ELISA de AAT humana. Se recolectó sangre de ratón mediante sangrado retroorbital usando tubos capilares heparinizados (Sigma-Aldrich). Inmediatamente después de la recolección, las muestras se sedimentaron y el suero se recolectó y se almacenó a -80 °C para uso futuro. Los ratones se anestesiaron con gas isoflurano antes del sangrado. Una placa de 96 pozos se recubrió con anticuerpo de AAT anti-humano de conejo (Sigma-Aldrich) a 10 mg/ml durante la noche a 4 °C. Entonces, la placa se lavó y se bloqueó con solución de dilución de suero (PBS con albúmina bovina al 2,5 % y Tween al 0,05 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las diluciones de suero indicadas (100 pl total por cada muestra) se adicionaron a la placa y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar 4 veces con PBS, se adicionaron 100 pl de anticuerpo de cabra anti-AAT humano conjugado con HRP (10 ug/ml; Abcam) a la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, el color se desarrolló por adición del sustrato TMB (Pierce) y se detuvo con H<2>SO<4>al 10 %. La densidad óptica se leyó usando un lector de microplacas iMark (Bio-Rad). La AAT murina no fue detectable con este ensayo. ;;Ejemplo 2;La mutación de la posición 265 en la cápside de rAAVI mejora la transducción del músculo esquelético ;Como las inserciones de ácido aspártico, ácido glutámico o fenilalanina después de la posición 264 en la cápside de rAAV2 (creando una posición de novo 265) mejoraron la transducción de músculo esquelético por un orden de magnitud, se planteó la hipótesis de que la sustitución de la treonina naturalmente presente en la posición 265 en rAAV1 con D, E o F mejoraría la transducción de músculo esquelético en este serotipo (rAAV1 es un aminoácido más largo que rAAV2 en este bucle de cápside). Como control, T265 se eliminó de rAAV1, para parecerse a rAAV2 no modificado. Se inyectaron rAAV1, rAAV1/T265D, rAAV1/T265E, rAAV1/T265F y cápsides de rAAV1/T265del que empaquetan el gen trans de luciferasa de luciérnaga impulsado por el promotor de P-actina de pollo (CBA-luc) en músculo gastrocnemio murino (GC) a una dosis de 1e10 genomas virales (vg). La imagenología bioluminiscente de animales vivos se realizó 7 días después de la inyección (dpi) para cuantificar la expresión transgénica mediante la medición de la luz emitida (figura 1A). rAAV1/T265D, rAAV1/T265E y rAAV1/T265F mejoraron la expresión transgénica con respecto a rAAV1 por 28, 34 y 36 veces, respectivamente, lo que respalda el análisis previo en la estructura de la cápside de rAAV2. Sorprendentemente, rAAV1/T265del mejoró la transducción por aproximadamente 200 veces sobre rAAV1. En un esfuerzo por comprender mejor este fenómeno, el mutante de deleción 265 se usó en la mayoría de los análisis restantes dentro de este estudio. ;;Para confirmar que el método de cuantificación de imágenes usado para generar los datos anteriores era una representación precisa de los niveles de expresión transgénica dentro del tejido muscular inyectado, los GC inyectados se removieron, se homogeneizaron/lisaron y el ensayo de luciferasaex vivose realizó en producto lisado de tejido. En este ensayo, la eficiencia de transducción con rAAV1/T265del se mejoró 137 veces sobre rAAV1, cuando se normalizó para unidades de luz relativas emitidas por mg de tejido analizado (figura 1B). La expresión incrementada del gen indicador rAAV1/T265del se correlacionó con la administración mejorada del transgén al músculo: Se detectaron 14,5 veces más copias de genoma viral por célula muscular con respecto a rAAV1 por análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) (figura 1C). Todos los resultados se confirmaron en múltiples experimentos usando preparaciones independientes de vectores purificados por varios métodos (por ejemplo, ultracentrifugación de densidad, cromatografía de afinidad) para asegurar que los efectos medidos no fueran específicos para el lote o método de purificación. ;;Para asegurar que se examinó un punto de tiempo apropiado, se realizó un curso de tiempo de expresión transgénica de rAAV1 y rAAV1/T265del, con mediciones recolectadas a 7, 14, 21 y 42 dpi (figura 1D). La cinética de expresión apareció igual, con expresión robusta observada a 7 dpi, incrementando por 7,5 veces entre los días 7 y 42 después de la inyección de rAAV1 y por 12 veces durante el mismo período de tiempo después de la inyección de rAAV1/T265del. En todos los puntos de tiempo, rAAV1/T265del superó a rAAV1 por aproximadamente dos órdenes de magnitud (100 veces en el día 7, 176 veces en el día 14, 81 veces en el día 21 y 159 veces en el día 42). Tomados conjuntamente, estos datos demuestran que la deleción del aminoácido 265 en la cadena principal de cápside de rAAV1 es una estrategia altamente efectiva para mejorar tanto la administración de transgén como la expresión en tejido muscular esquelético. Más importante aún, esta mejora se mantiene durante un período de tiempo sostenido que respalda la observación de números de copias incrementados del genoma del vector como se documenta por análisis de qPCR. ;;Ejemplo 3;;Los residuos distales trabajan en conjunto con 265 para modular la eficiencia de transducción ;;rAAV6 se considera otro candidato principal para aplicaciones de terapia génica musculoesquelética, y es el serotipo con la mayor homología de secuencia de cápside (99,2 %) con rAAV1. Para determinar si el fenotipo de transducción mejorado obtenido por la deleción de la posición 265 en la cápside de rAAV1 se conservaría en el contexto de rAAV6, rAAV6 y se generaron cápsides de rAAV6/T265del que empaquetan CBA-luc. Siete días después de la inyección de cada uno en GC murina a una dosis de 1e10vg, se cuantificó la expresión transgénica. Curiosamente, la expresión de transgén después de la inyección de rAAV6/T265del fue solo 82 % de la medida cuando se usó rAAV6 (figura 2A). Esto fue sorprendente considerando los efectos dramáticos sobre la transducción que la deleción de la posición 265 producida en rAAV1, y la de los únicos 6 aminoácidos por los cuales rAAV1 y rAAV6 difieren, ninguno se ubica dentro de una proximidad espacial suficiente a la posición 265 para formar interacciones directas. Además, cualquier residuo que difiere entre rAAV1 y rAAV6 se ubica al menos a 22 Á de distancia de la posición 265. A fin de formar interacciones directas tal como enlaces de hidrógeno, los residuos deben estar dentro de ~3 Á entre sí. A pesar de esto, hay diferencias conformacionales dentro de la estructura de rAAV1 y rAAV6 alrededor de la posición 265 (figura 2B), como se visualiza por alineación de datos cristalográficos disponibles para cada uno. ;;Para resolver qué residuos dentro de la cápside de rAAV6 podrían inhibir la efectividad que tiene la deleción de la posición 265 para mejorar la eficiencia de transducción, se empleó una versión del experimento de rescate de marcadores, en donde la cápside de rAAV6 se mutó en cada residuo que difiere entre rAAV1 y rAAV6 al aminoácido presente en rAAV1, junto con la deleción de 265. Los mutantes se designaron rAAV6.1 (rAAV6 con el primer residuo no conservado (F129L) mutado al aminoácido equivalente en rAAV1), rAAV6.2 (D418E), rAAV6.3 (K531E), rAAV6.4 (L584F), rAAV6.5 (V598A) y rAAV6.6 (H642N), respectivamente. La mayoría de los cambios en la cápside de rAAV6 produjeron un cambio mínimo en la transducción (figura 2C). La expresión transgénica disminuyó <2 veces con las construcciones rAAV6.1, rAAV6.1/T265del, rAAV6.2, rAAV6.2/T265del y rAAV6.3, respectivamente. La expresión de transgén se incrementó por aproximadamente 2 veces tanto en rAAV6.4 como en rAAV6.4/T265del. Las mutaciones en la posición 598 y 642 (rAAV6.5 y rAAV6.6) redujeron la expresión transgénica con respecto a rAAV6 más dramáticamente que otras mutaciones, disminuyéndola por 3,4 y 13,1 veces, respectivamente. La deleción de la posición 265 junto con rAAV6.5 y rAAV6.6 produjo pocos cambios en el rendimiento de estas construcciones, disminuyendo la expresión transgénica por 4,8 y 8,7 veces en rAAV6.4/T265del y rAAV6.5/T265del, respectivamente. Sorprendentemente, solo se requirió un cambio de aminoácido individual, en la posición 531 (rAAV6.3), para rescatar el fenotipo 265 observado con rAAV1, con rAAV6.3/T265del mejorando la eficiencia de transducción por 23 veces con respecto a rAAV6 (figura 2C). ;;Se examinó la relación espacial entre los residuos 531 y 265 en el contexto de la estructura cristalina de rAAV6 (figuras 3A-3D). Los aminoácidos 265 y 531 no están suficientemente cerca para formar interacciones directas en cualquiera de los ejes icosaédricos de simetría. En el eje de 2 veces, las posiciones 265 y 531 están ~ 26,7 Á separadas, en tanto que en el eje de 5 veces, están ~ 42,6 Á separadas. Sin embargo, en el eje de simetría de 3 veces, a pesar de estar ubicados a ~ 22,8 Á de distancia, ambos residuos están expuestos a la superficie en el mismo plano (figura 3B). El residuo 531 se asienta en la base de cada “espícula” de 3 veces y 265 se asienta en una ligera protuberancia entre las espículas. Tomados en conjunto, en este momento, los datos anteriores sugieren que el contexto más probable en el que las posiciones 265 y 531 pueden modular juntas la eficiencia de transducción es a través de las protuberancias que forman el eje de simetría de 3 veces. ;;Ejemplo 4;;La capacidad de unión a heparina de la cápside afecta el fenotipo 265, y viceversa ;;rAAV1 y rAAV6 se acoplan a ácido siálico N-enlazado como receptor primario; sin embargo, rAAV6 también se une a porciones de sulfato de heparina. Anteriormente, los resultados han mostrado que K531 es el único residuo requerido para que rAAV6 interactúe con sulfato de heparina. K531 también es el único residuo requerido para rescatar el fenotipo de deleción 265 observado en rAAV1. Para explorar más a fondo la relación funcional entre la unión a heparina de cápside y la transducción mejorada resultante de la mutación de la posición 265, se examinó rAAV2, el serotipo prototípico conocido por utilizar proteoglucanos de sulfato de heparina como receptores primarios para la infección. rAAV2 se mutó en la posición 585 (una mutación conocida por atenuar la unión a heparina de rAAV2) junto con la inserción de ácido aspártico para crear una posición de novo 265 como se describió anteriormente. rAAV2, rAAV2/265D, rAAV2/K585E y rAAV2/265D, K585E se inyectaron en GC murino a una dosis de 1e10vg. De acuerdo con reportes previos, la ablación de la unión a heparina mejoró la transducción de rAAV2 del músculo esquelético. Sin embargo, la mutación concomitante de la posición 265 y la eliminación de la capacidad de unión a heparina produjeron la mejora más fuerte de la eficiencia de transducción (figura 4A), incrementando la transducción por 96 veces sobre rAAV2 y 7 veces sobre rAAV2/265D y de acuerdo con los resultados anteriores observados para rAAV6 (figura 2C). Es notable que el residuo 531 se mutó para extirpar la unión de heparina en rAAV6 y el residuo 585 se mutó para extirpar la unión de heparina en rAAV2. Aunque los residuos 531 y 585 no están cerca entre sí en secuencia lineal, ambos caen dentro de un parche básico superpuesto en la superficie de cápside que es la huella para la unión de heparina (figura 4B). ;;Para resolver si la inhibición directa de la unión a heparina mejora la transducción de 265 mutantes, la competencia de heparina se realizó antes de la inyección de 265 construcciones mutantes en ratones. rAAV2 se une a heparina con una afinidad más fuerte que rAAV6, y es el único serotipo que históricamente ha demostrado tener una disminución efectiva de la transducción después de la incubación en una solución de sulfato de heparina, por lo que esta pregunta se examinó en el contexto de rAAV2. rAAV2 y las cápsides de rAAV2/265D se incubaron en una solución salina o una solución de sulfato de heparina de 250 pg/ml durante la noche. rAAV1 se incluyó como un control. Los virus se inyectaron en GC murino a una dosis de 1e10vg, y los ratones se sometieron a imágenes de 7 dpi. La incubación con sulfato de heparina redujo la eficiencia de transducción en aproximadamente 3 veces tanto en rAAV2 como en rAAV2/265D y prácticamente no tuvo efecto sobre rAAV1, reduciendo la transducción en 0,3 veces (figura 4C). Estos resultados sugieren que la necesidad de extirpar la unión de sulfato de heparina para que la mutación de la posición 265 sea efectiva para mejorar la transducción se debe al cambio estructural dentro de la cápside y no a la inhibición de la unión de heparina, per se. ;;La cromatografía de afinidad de heparina verificó que todas las mutaciones de cápside de rAAV2 y rAAV6 realizadas para disminuir la unión de heparina se realizaron como se esperaba (figuras 5A-5D). Las construcciones relevantes se incubaron con agarosa conjugada con heparina y se eluyeron con un gradiente de NaCl creciente. Curiosamente, en las cápsides con la posición 265 mutada, la unión a heparina se atenuó con respecto a las cápsides parentales. Por ejemplo, 20 % más de rAAV2/265D que rAAV2 eluyó durante el primer paso de lavado después de la carga de virus en la columna. De manera similar, 20 % menos de rAAV2/265D eluyó en la fracción de NaCl 300 mM que rAAV2. Del mismo modo, 37 % más de rAAV6/T265del eluyó durante el lavado de la columna que rAAV6, en tanto que 25 % menos de rAAV6/T265del eluyó en el lavado de NaCl 200 mM que rAAV6, lo que respalda la hipótesis de interacción entre estos dos motivos de proteína (la elución de rAAV6 durante una fracción de lavado menos rigurosa que rAAV2 está de acuerdo con el trabajo previo). En tanto que rAAV2/K585E atenuó la unión a heparina de rAAV2, rAAV2/265D, K585E promovió este efecto. 75 % de rAAV2/K585E y 96,5 % de rAAV2/265D,K585E se eluyó durante los pasos de lavado iniciales. 10 % menos de rAAV2/265D,K585E que rAAV2/K585E se eluyó a NaCl 200 mM. Combinados con los datos presentados en las figuras 3 y 4, estos resultados agregan evidencia de que los cambios en la región de cápside que alberga la posición 265 afectan la conformación estructural de esa región que alberga el sitio de unión a heparina, y viceversa. ;;Ejemplo 5;;Las múltiples interrupciones en la estructura de VR1 mejoran la transducción del músculo esquelético ;;Los datos presentados hasta ahora sugieren que los cambios en la conformación estructural de VR1 solo es la fuerza impulsora detrás de la transducción mejorada después de la mutación de la posición 265. Por lo tanto, se busca determinar si la interrupción adicional a la estructura de VR1 puede producir un fenotipo de transducción mejorado similar. rAAV1 se mutó por lo tanto para generar S261del, S262del, A263del, S264del, G266del, A267del, S268del y N269del, como se ilustra en la figura 6A. Estas construcciones se inyectaron en GC murino a 1e10vg, junto con rAAV1 y rAAV1/T265del. La expresión transgénica se cuantificó 7 dpi (figura 6B). Cada mutante mejoró la eficiencia de transducción en grados variables con respecto a rAAV1. La transducción se mejoró <3 veces en las construcciones de deleción S261, S262 y N269. Las construcciones de deleción G266 y S268 mejoraron la transducción por ~5 veces y las A263del y A267del por ~10 veces con respecto a rAAV1. Las construcciones de deleción S264 y T265 mejoraron la transducción de manera más robusta sobre rAAV1, incrementando la expresión del gen trans por 25 y 100 veces, respectivamente. Estos datos indican que cualquier interrupción realizada en el bucle VR1 a través de la deleción de un aminoácido mejorará la transducción en rAAV1, con este pico de mejora mediante la deleción de la posición 265 y disminuyendo a medida que las mutaciones se alejan de la posición 265 (figura 6b). ;;Ejemplo 6;;265 mutantes de deleción mejoran la expresión de un transgén terapéutico ;;Para comparar la eficacia relativa del panel de deleción de 265, se empaquetaron seis cápsides con el casete de expresión de hAAT actualmente en uso en ensayos clínicos. Se inyectaron cápsides de rAAV1, rAAV1/T265del, rAAV6, rAAV6/T265del, rAAV6.3 y rAAV6.3/T265del en GC murino a 1e10vg. Las concentraciones séricas de hAAT se midieron mediante ELISA 5 semanas después de la inyección (figura 7). De acuerdo con lo anterior, la expresión transgénica se mejoró por la deleción de la posición 265; sin embargo, el grado de mejora no alcanzó los niveles medidos por el ensayo de luciferasa (por ejemplo, por ELISA hubo un incremento de 9 veces en la expresión de rAAV1/T265del sobre rAAV1, en tanto que el promedio medido por el ensayo de luciferasa fue >100 veces). No obstante, los 265 mutantes superaron a los serotipos parentales, con rAAV6.3/T265del produciendo la mayor concentración en suero de hAAT. ;;Ejemplo 7;;Eficiencia de transducción mejorada en el ojo ;;Las construcciones de AAV se inyectaron de manera subretiniana (SRI) o de manera intravítrea (IV) en ratones anestesiados con un cóctel de ketamina/xilazina. Todas las cápsides de AAV empaquetaron el gen indicador luciferasa bajo el promotor de beta actina de pollo (CBh). Las construcciones que se examinaron incluyeron AAV1 (1-CBh), AAV1/T265del (1.1-CBh), AAV6/T265del (6.1-CBh), AAV6/K531E (6.3-CBh), AAV6/T265del_K531E (6.3.1-CBh) y una variante de AAV2 previamente caracterizada en nuestro laboratorio, AAV2.5 (2.5 - CBh) (Bowleset al., Mol. Ther.20(2):443(2012)). La expresión del transgén se midió como actividad de luciferasa en los puntos de tiempo indicados después de la inyección, usando el sistema de imagenología de animales vivos IVIS Lumina. Se tomaron imágenes de los ratones después de la inyección intraperitoneal de sustrato de D- luciferina (Nanolight) a 120 mg/kg de peso corporal, y las imágenes se cuantificaron al medir fotones dentro de una región de interés dada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante de IVIS. Los resultados se muestran en las figuras 9 y 10. ;El éxito en la traducción de la terapia génica de rAAV se ha visto desafiado por la baja eficiencia de transducciónin vivo.Este estudio empleó análisis estructural de la cápside de rAAV para desarrollar una estrategia de modificación racional que pueda producir claramente nuevas variantes de cápside con fenotipos de transducción mejorados en el músculo esquelético. El enfoque general fue posible gracias a reportes anteriores del laboratorio, que descubrieron VR1 como un determinante clave de la eficiencia de transducción en rAAV2. Como se habían descubierto previamente en rAAV2, se observó una mejora de la transducción con subestaciones de varios aminoácidos en la posición 265 en rAAV1. Sorprendentemente, sin embargo, la interrupción de VR1 mediante la deleción de aminoácidos individuales en el rAAV1 más clínicamente relevante produjo vectores novedosos con transducción mejorada por órdenes de magnitud (figura 1). Esta observación por sí sola tiene implicaciones significativas para los protocolos de dosificación de pacientes que actualmente utilizan rAAV1 y puede conducir a servidumbre de producción de vectores en el futuro. Se señaló que en la cápside de rAAV6 se obtuvo un resultado similar, pero solo después de que se crearon mutaciones secundarias para interrumpir el parche de aminoácidos transducción de rAAV2 en el tejido hepático por aproximadamente 10 veces cuando se mide mediante ensayo de luciferasa, esa mejora disminuye a menos de 2 veces cuando se mide el suero para la expresión del Factor IX secretado. Es probable que medir la expresión transgénica directamente a partir de tejido cosechado sea una técnica más sensible que la recolección y medición posterior de factores secretados debido a diferencias tal como semivida de proteína dentro de un entorno intracelular versus suero, así como eficiencia general de secreción de proteína con respecto a expresión de proteína. Estos descubrimientos resaltan el incremento exquisito en la transducción que se necesita lograr para la aplicabilidad traducible cuando se diseñan vectores de rAAV destinados a administrar transgenes que codifican para proteínas secretadas. ;;El objetivo de estos esfuerzos es la mejora continua de la tecnología de vector de rAAV para que la terapia génica se convierta en una opción clínica más práctica y efectiva, tal como a través de la reducción de la dosificación de vector requerida para lograr niveles de transgén terapéuticamente beneficiosos. Estos esfuerzos pueden disipar las preocupaciones clínicas sobre la toxicidad dependiente de la dosis del vector y facilitar los esfuerzos de producción de vectores de grado clínico. Aquí se presenta una estrategia simple y efectiva para mejorar el rendimiento de los serotipos de rAAV que se usan actualmente en ensayos clínicos dirigidos al músculo esquelético por inyección directa. Como esta estrategia utiliza una región de la cápside única para otros avances importantes en el desarrollo del vector rAAV (por ejemplo, los mutantes de cápside Tyr a Phe), será interesante determinar si se puede integrar sinérgicamente con los avances tecnológicos para optimizar aún más los vectores rAAV para terapia génica. Conforme se continúa evaluando el potencial del panel mutante 265 para dirigirse y mejorar la expresión transgénica en el tejido cardíaco, así como en el músculo esquelético de todo el cuerpo después de la administración sistémica, el trabajo contenido en la presente proporciona una base de partida para el desarrollo de vectores de rAAV traduccionales de próxima generación. Además, se ha producido una recolección de reactivos de cápside de rAAV disponibles para un análisis más detallado (por ejemplo, cristalográfico) que eventualmente conducirá a una comprensión más completa del papel único y significativo que desempeñan los aminoácidos individuales en la biología del vector de rAAV. ;;Ejemplo 8;;Materiales y métodos ;;Plásmidos y virus: Todos los plásmidos se obtuvieron de las instalaciones de North Carolina Gene Therapy Center Vector Core. El virus se hizo por medio de triple transfección de células HEK293 y se purificó por ultracentrifugación de densidad de cloruro de cesio, como se describió previamente (Griegeret al., Nat. Protoc.7(3)/1412 (2006)). La titulación viral se midió usando análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), con el siguiente conjunto de cebadores diseñado para reconocer el transgén de luciferasa: (directo) 5'-AAA AGC ACT CTG ATT GAC a Aa TAC-3' (SEQ ID NO: 10) e (inverso) 5'-CCT TCG CTT CAA AAA ATG GAA C-3' (SEQ ID NO: 11). Para cada grupo experimental, las construcciones virales relevantes se titularon juntas en la misma placa de qPCR antes de usarse. Se usó mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene QuikChange) para crear deleciones o sustituciones de nucleótidos. La tabla 9 lista las secuencias de cebadores usadas para todos los mutantes de VR1 creados en este estudio. Antes de hacer el virus, se realizó la secuenciación de ADN para verificar que la identidad de secuencia de cada plásmido usado en este trabajo fuera correcta. ;;Tabla 9. r m n i iri i l ii n i . ;;; ;; *indica que se usó la misma secuencia de cebadores para las construcciones pXR1 y pXR6 Análisis estructural y modelación molecular: Los archivos pdb indicados se procesaron a través del software de validación estructural MolProbity (molprobity.biochem.duke.edu) para agregar enlaces de hidrógeno basados en longitudes de enlace x-H de nube de electrones, usando optimización de enlace H mediante la inclusión de vueltas Asn/Gln/His cuando sea necesario. Los archivos entonces se analizaron para los contactos de todos los átomos y la geometría, y se visualizaron en KiNG (kinemage.biochem.duke.edu) para determinar los átomos de VR1 que participan en los enlaces de hidrógeno. Entonces, los PDB se abrieron en PyMol (pymol.org), se mostraron como diagramas de barras con hidrógenos visualizados, y los enlaces de hidrógeno identificados en KiNG se tradujeron en líneas discontinuas utilizando la medida.

Estudios con animales vivos: Los animales se mantuvieron y manipularon de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud, bajo protocolos aprobados por el IACUC en la University of North Carolina, Chapel Hill. Las variantes de rAAV que empaquetan el transgén de CBA-luciferasa se inyectaron en la vena de la cola de ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratories) en las cantidades indicadas. Todas las inyecciones se realizaron en un volumen total de 200 pl por inyección (el volumen se llevó a 200 pl usando 1XPBS). La expresión del transgén de luciferasa se visualizó usando un sistema de imagenología Xenogen IVIS Lumina (Perkin Elmer/Caliper Life Sciences) después de la inyección intraperitoneal de sustrato de D-luciferina (Nanolight) a 120 mg/kg de peso corporal. El análisis de imagen bioluminiscente se realizó usando el software Living Image (Perkin Elmer/Caliper Life Sciences).

Cuantificaciónex vivode la expresión transgénica y número de copias: Para obtener muestras de tejido para análisis mediante ensayo de luciferasaex vivo,los ratones se sacrificaron a 10 dpi y los órganos indicados se cosecharon y se congelaron instantáneamente. El tejido se homogeneizó en hielo usando una cuchilla de afeitar, y entonces se suspendieron aproximadamente 50 mg de cada homogeneizado de tejido en 250 pl de amortiguador de lisis pasiva 2X (Promega) y se lisaron mecánicamente usando un desgarrador de tejidos (Cole-Parmer). Entonces se transfirieron 35 pl de cada producto lisado de tejido a una placa de 96 pozos y se mezclaron con 100 pl de sustrato de D-luciferina (Promega) inmediatamente antes de realizar el análisis luminométrico usando un luminómetro Victor2 (Perkin Elmer). La concentración de proteína total de cada producto lisado de tejido se determinó por ensayo de Bradford (Bio-Rad). Adicionalmente, una alícuota de ~25 mg del homogeneizado de tejido generado anteriormente se procesó usando un kit DNeasy (Qiagen) para extraer ADN genómico de hospedador y vector. El número de células se determinó usando qPCR con los siguientes cebadores diseñados específicos para Lamin de ratón (un gen de mantenimiento): (directo) 5’-GGA CCC AAG GAC TAC CTC AAG GG-3’ (SEQ ID NO: 45) e (inverso) 5’-AGG GCA CCT CCA T<c>T C<g>G<a>A<a>C-3’ (SEQ ID NO: 46). La cantidad de genomas virales por célula también se determinó usando qPCR con cebadores diseñados específicos para el transgén de luciferasa, como se describió anteriormente.

Ejemplo 9

Análisis estructural de la cápside de rAAV para identificar redes de enlaces de hidrógeno en VR1

Se ha demostrado previamente que la deleción de aminoácidos seleccionados dentro de VR1 de la cápside de rAAV1 conduce a incrementas de orden logarítmico en la eficiencia de transducción después de la inyección intramuscular en ratones (Warischalk etal., Mol. Ther.2015). El análisis de la estructura cristalina de rAAV1 reveló que las mutaciones de deleción de VR1 más eficientes correspondieron a aminoácidos que participan en redes de enlace de hidrógeno intrabucle, que sugiere que la desestabilización de elementos estructurales de VR1 conduce a fenotipos de transducción mejorados. El objetivo del presente estudio fue determinar: 1) si las cápsides mutantes de VR1 de rAAV1 pueden dirigirse eficientemente al tejido muscular después de la inyección intravenosa (versus simplemente tener un fenotipo de transducción mejorada), y 2) si la desestabilización dirigida de elementos estructurales de VR1 es un método conservado para mejorar la transducción en serotipos de rAAV adicionales. Para abordar estas preguntas, se analizó una recolección de cápsides de rAAV que incluyen rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8 y rAAV9 con el software de validación estructural de código abierto MolProbity (Daviset al., Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue)W375 (2007)) y patrones de enlace de hidrógeno VR1 visualizados en KiNG (Chenet al., Protein Sci. 18(11)2403 (2009))(figura 11A-11H). Estos serotipos se eligieron para el análisis con base en la disponibilidad de ambos datos de estructura de cristal de cápside (Govindasamyet al, J. Virol. 80(23)11556(2006); Milleret al, Acta Crystallogr. Sect. FStruct. Biol. Cryst. Commun. 62(Pt 12)1271(2006); Xieet a l, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(16)10405 (2002);Lerchet al, Virology 403(1)26(2010); Govindasamyet al., J. Virol. 87(20)11187(2013); Xieet al., Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun.

64(Pt 11)1074 (2008); Nam et al., J. Virol. 81(22)12260 (2007);Mitchellet al., Acta Crystallogr. Sect. FStruct. Biol. Cryst. Commun. 65 (Pt 7)215(2009)) y el conocimiento preexistente de sus fenotipos de transducciónin vivo(Zincarelliet al., Mol. Ther. 16(6)1073(2008)). No hay información estructural disponible públicamente para rAAV7; sin embargo, este serotipo se incluyó para el propósito de integridad. Para facilitar la visualización, los patrones de enlaces de hidrógeno identificados se tradujeron entonces en imágenes PyMol (figura 12A-12H).

Con base en estos análisis, se seleccionaron para deleción los aminoácidos de cada serotipo que se encontró que participan en redes de enlace de hidrógeno VR1 intrabucle. La tabla 10 lista la secuencia de aminoácidos de VR1 para los serotipos rAAV1-rAAV9 y los aminoácidos elegidos para la mutación en este estudio, así como cuántos enlaces de hidrógeno se supone que se rompen con cada mutación. En el caso de rAAV7, la mutación de la treonina en la posición 265 se eligió con base en resultados previos obtenidos para rAAVI (Warischalket al., Mol. Ther.2015). En el caso de rAAV9, la estructura de VR1 parece estar estabilizada por enlaces de hidrógeno en dos ubicaciones, la primera principalmente orquestada por enlaces que se originan alrededor del residuo S263, y la segunda por enlaces que se originan alrededor del residuo S265. Por lo tanto, se crearon cápsides mutantes que comprenden rAAV9/S263del y rAAV9/S265del, además del rAAV9/S263del_S265del doble mutante. Sin embargo, el mutante de deleción doble no pudo producir partículas virales intactas, lo que condujo a la estrategia alternativa de mutar la posición S263 a una alanina junto con la deleción de la posición S265, para crear rAAV9/S263A_S265del. Para descripciones atómicas detalladas de las relaciones de enlace de hidrógeno observadas para todos los serotipos incluidos dentro de este estudio, consultar la leyenda de la figura 11.

Tabla 10. n i min i l r i n v ri l 1 m i n l i n r liz n rAAV1 -rAAV9.

+ indica el número de enlaces de hidrógeno que se supone que se rompen después de la mutación

Ejemplo 10

Biodistribución de cápsides de rAAV mutadas para desestabilizar redes de enlaces de hidrógeno en VR1

Para visualizar la distribución tisular y la eficiencia de transducción de las cápsides tipo silvestre y mutante de VR1 detalladas anteriormente, cada miembro de la colección se empaquetó con el transgén indicador de luciferasa de luciérnaga impulsado por el promotor de P-actina de pollo (CBA-luc) y se inyectó en ratones a través de la vena de la cola a una dosis de 1e11 genomas virales (vg) por inyección. La imagenología bioluminiscente de animales vivos se realizó a los 9 días después de la inyección (dpi). A 10 dpi, los ratones se sacrificaron y los órganos seleccionados se retiraron, homogeneizaron y lisaron. Entonces se cuantificó la biodistribución de vector al someter productos lisados de tejido a ensayos de luciferasaex vivopara medir la expresión de transgén y análisis de qPCR para cuantificar los números de copias de genoma viral por célula. La deleción de aminoácidos VR1 dio como resultado cuatro fenotipos: 1) direccionamiento selectivo y robusto de músculo cardíaco y/o esquelético, como se observa para rAAVI y rAAV6 (figura 13); 2) mantenimiento de la eficiencia de transducción de músculo cardíaco y/o esquelético innato, junto con una reducción sustancial en la transducción del hígado, como se ve en rAAV7, rAAV8 y rAAV9 (figura 14); 3) una ausencia generalizada de transducción, como en rAAV2 y rAAV3 (figura 15A-15B); y, 4) la incapacidad para producir partículas virales intactas, como en el caso de rAAV4 y rAAV5.

Las mutaciones de VR1 en las cápsides de rAAV1 y rAAV6 condujeron a ganancias sustanciales en la eficiencia de transducción en tejidos de músculo cardíaco y esquelético (figura 13). La expresión transgénica se midió 21 veces más en muestras de tejido cardíaco y 26 veces más en muestras de tejido de gastrocnemio (GC) tomadas de ratones tratados con rAAV1/T265del versus rAAV1. La eficiencia de transducción de rAAV1/T265del también se mejoró en varios otros tipos de tejido, que incluyen el diafragma (26 veces), el bazo (3,5 veces), el riñón (5 veces), el páncreas (6 veces) y el pulmón (8 veces), (figura 16A). Sorprendentemente, hubo una disminución de 3,5 veces en la transducción hepática con respecto a rAAV1 (figura 13B). De manera similar, las cápsides rAAV6/T265del transdujeron músculo cardíaco y GC a niveles 14 veces y 3 veces más altos que rAAV6 tipo silvestre, concomitante con una disminución de 28 veces en la transducción del hígado (figura 13E). No hubo diferencias notables en la expresión transgénica medida entre las cápsides de rAAV6 y rAAV6/T265del en ningún otro tejido probado (figura 16B). rAAV6/S262del produjo un fenotipo similar a rAAV6/T265del, transduciendo a niveles 3,5 veces más bajos y 6 veces más altos que rAAV6/T265del en músculo cardíaco y GC, respectivamente, y dentro de 1 vez de rAAV6/T265del en el hígado (figura 16C). Estos resultados sugieren que las construcciones mutantes de rAAV1 y rAAV6 VR1 transducen preferentemente tejido muscular cuando se administran sistémicamente a ratones.

Las cantidades de genomas de vector presentes por célula hospedadora se cuantificaron mediante qPCR en un subconjunto de órganos que incluyen el corazón, GC e hígado (figura 13C, 13F). En muestras de tejido obtenidas de ratones tratados con cápsides de rAAV1/T265del y rAAV6/T265del, los cambios en las poblaciones de transgén de células hospedadoras medidas por qPCR tuvieron una tendencia similar a los observados para la expresión de transgén medida por ensayo de luciferasa (es decir, más genomas de vector correlacionados con expresión incrementada de transgén, y viceversa). Sin embargo, las diferencias entre las mediciones de población transgénica fueron más sutiles que las obtenidas para la eficiencia de transducción. Por ejemplo, en ratones tratados con rAAV6/T265del hubo 4 veces más genomas de vector por célula de corazón que en ratones tratados con rAAV6, mientras que hubo un incremento de 14 veces en la transducción cardíaca con la cápside mutante (figura 13F). Del mismo modo, hubo 4 veces menos genomas de rAAV6/T265del por célula hepática, versus una disminución de 28 veces en la transducción. Curiosamente, los genomas de vector por célula cardíaca fueron sustancialmente menores que los medidos por célula hepática en el caso de rAAV1 y rAAV1/T265del, a pesar de que la transducción del corazón fue mucho mayor que la del hígado en ambas construcciones. Colectivamente, estos datos indican que la capacidad reducida de las cápsides mutantes de rAAV1 y rAAV6 VR1 para transducir el hígado se corresponde con una incapacidad de estas cápsides para administrar un transgén persistente a células hepáticas. Adicionalmente, los transgenes administrados por cápsides mutantes de VR1 a tejidos musculares parecen expresarse de manera más efectiva que los administrados por sus contrapartes de tipo silvestre. Finalmente, parecería que alguna faceta del microambiente del hígado impone un obstáculo hacia la capacidad de la cápside de rAAV1 para ingresar al núcleo o desenvolverse una vez allí.

La deleción de aminoácidos de VR1 de cápsides de rAAV7, rAAV8 y rAAV9 creó perfiles de biodistribución con fenotipos sorprendentemente similares (figura 14A, 14B, 14G). La característica principal observada para cada uno fue una reducción aguda en la transducción hepática (427 veces en rAAV7, 23 veces en rAAV8 y 107 veces en rAAV9 con respecto a las cápsides tipo silvestre), en tanto que se mantuvieron los niveles de transducción de músculo cardíaco y esquelético nativos. La eficiencia de transducción en tejido muscular no cambió notablemente entre rAAV7 y rAAV7/T265del; sin embargo, rAAV8/T265del mejoró la eficiencia de transducción en tejido GC en aproximadamente 8 veces con respecto a rAAV8 (figura 14E). rAAV9/S263del_S265del produjo efectos variables en el tejido muscular, transduciendo tejido cardíaco 3 veces más bajo y tejido GC 2 veces más alto que rAAV9 (figura 14H). No hubo diferencias de transducción prominentes entre las cápsides mutantes de VR1 y tipo silvestre de este subconjunto en cualquier otro tipo de tejido muestreado (figura 17A-17C). Es notable que se requirieron mutaciones simultáneas en las posiciones S263 y S265 para producir un perfil de biodistribución dirigido al músculo en rAAV9, y que las deleciones individuales en cualquiera de estas posiciones redujeron sustancialmente la eficiencia de transducción general (figura 14D)

Los números de copias de genoma de vector presentes por células hospedadoras se cuantificaron en muestras de tejido cardíaco, GC y hepático. En todas las cápsides mutantes de VR1 de este subconjunto, la expresión transgénica hepática reducida correspondió a poblaciones transgénicas reducidas dentro de células hepáticas (85 veces menos genomas de vector por célula hepática para rAAV7/T265del, 27 veces menos para rAAV8/T265del y 7 veces menos para rAAV9/S263del_S265del; figura 14C, 14F, 14I). La relación entre la población transgénica y la eficiencia de transducción fue menos clara en muestras de tejido muscular. Por ejemplo, hubo una reducción de 22 veces en las copias de transgén por célula cardíaca cuando se comparó rAAV7/T265del con rAAV7, sin embargo, la eficiencia de transducción entre las cápsides fue prácticamente la misma. Estos datos sugieren que las cápsides mutantes de VR1 de este subconjunto son deficientes en la capacidad de administrar una población transgénica estable a células hepáticas, en tanto que los transgenes administrados por estas cápsides a tejidos musculares se expresan de manera más efectiva que los administrados por sus contrapartes de tipo silvestre.

La deleción de aminoácidos de VR1 produjo efectos perjudiciales en cápsides de rAAV2, rAAV3b, rAAV4 y rAAV5. En rAAV4 y rAAV5, las deleciones de aminoácidos de VR1 condujeron a una incapacidad para producir viriones intactos. Se intentó la producción de vectores varias veces con ambas construcciones para verificar la repetibilidad de este resultado. En rAAV2 y rAAV3b, las deleciones de aminoácidos de VR1 no tuvieron un impacto medible en la producción de vector; sin embargo, en ambos de estos serotipos las mutaciones de deleción de VR1 dieron como resultado la eliminación de la transducción medible en ratones después de la inyección intravenosa (figura 15A-15B). De nuevo, para verificar la repetibilidad de estos resultados, estos experimentos se duplicaron con soluciones madre frescas de vector en una segunda cohorte de ratones a una dosis 5 veces mayor (5e11vg/inyección) de rAAV2 y rAAV2/S264del (figura 15C). En general, los efectos dramáticos observados en estos serotipos en respuesta a mutaciones de deleción de VR1 sugieren que mantener una estructura de VR1 definida es fundamental para las capacidades de estas cápsides para completar un ciclo de vida viral productivo.

Ejemplo 11

Identificación de un motivo de cápside que permite una transducción hepática altamente eficiente

Estudios previos han demostrado que las cápsides de rAAV2 que albergan mutaciones de inserción de aminoácidos después de la posición 264 en la proteína de cápside (creando una posiciónde novo265) exhiben una eficiencia de transducción notablemente mejorada en el músculo esquelético después de la inyección intramuscular (Bowleset al., Mol. Ther. 20(2):443(2012); Liet al., J. Virol. 2012. 86(15):7752(2012)). Se ha encontrado que la inserción de ácido aspártico en particular (rAAV2/265D) mejora la transducción por órdenes de magnitud (Liet al., J. Virol. 2012. 86(15):7752(2012)). Conforme la deleción de aminoácidos de VR1 hizo que las cápsides de rAAV2 fueran incapaces de transducción, a continuación se examinó si la alternativa - la inserción de aminoácidos en VR1 - podría mejorar el fenotipo de biodistribución de rAAV2. Se inyectaron CBA-luc de empaquetamiento de cápsides de rAAV2 y rAAV2/265D en la vena de cola de ratones y se realizó imagenología bioluminiscente de animales vivos a 9 dpi (figura 18A). A 10 dpi, los órganos se recolectaron y cuantificaron para la expresión transgénica, como se describió anteriormente. Curiosamente, en tanto que las deleciones de aminoácidos de VR1 en otros serotipos condujeron a reducciones bruscas en la transducción hepática, la inserción de aminoácidos adicionales en VR1 condujo a un fenotipo opuesto. La transducción hepática incrementó 10 veces en rAAV2/265D con respecto a rAAV2 (figura 14B), en tanto que las diferencias de transducción entre las dos cápsides difirieron en <2 veces en todos los demás tejidos estudiados (figura 14B y figura 15A). Las copias de genoma de vector por célula hospedadora difirieron en menos de 1 vez entre las dos cápsides en tejidos de corazón y GC; sin embargo, hubo un incremento de 10 veces en copias de genoma de vector por célula de hígado en ratones a los que se administró rAAV2/265D versus rAAV2 (figura 18C). Por lo tanto, las cápsides de rAAV2/265D son más capaces de dirigirse a y entrar en las células hepáticas que las cápsides de rAAV2, o los genomas administrados por estas cápsides mutantes son más capaces de persistir dentro de estas células (o ambas).

Para determinar si la presencia de un ácido aspártico en VR1 podría mejorar la transducción hepática en serotipos adicionales, se realizaron mutaciones de sustitución (tabla 11) en rAAV1 (rAAV1/T265D) y rAAV6 (rAAV6/T265D), y se realizó una mutación de inserción en rAAV3b (rAAV3b/265D). En todos los casos, se observó una fuerte preferencia de transducción por el hígado: rAAV1/T265D transdujo el hígado aproximadamente 212,5 veces más alto que rAAV1 (figura 18H), rAAV6/T265D por 28 veces con respecto a rAAV6 (figura 18K) y rAAV3b/265D por 9 veces con respecto a rAAV3b (figura 18E). En el caso de rAAV1 y rAAV1/T265D, las diferencias de transducción entre las dos construcciones difirieron por 2,5 veces o menos en todos los otros tejidos examinados (figura 18H y figura 19C). rAAV6/T265D mejoró la transducción de músculo cardíaco y GC con respecto a rAAV6 por 32 y 4,5 veces, respectivamente (figura 18 %). En todos los tejidos restantes, las eficiencias de transducción de las dos construcciones fueron prácticamente idénticas (figura 19D). Finalmente, cuando se compara la biodistribución de rAAV3b y rAAV3b/265D, la construcción mutante mejoró la transducción por aproximadamente 3 veces en tejidos cardíacos y de diafragma, mientras que no se observaron diferencias de transducción notables entre las dos construcciones en ningún tejido restante (figura 18E y figura 19B). En conjunto, los datos muestran que la inserción o sustitución de ácido aspártico en VR1 mejora preferentemente la transducción hepática después de la administración intravenosa de rAAV.

Tabla 11. Secuencias de aminoácidos de la región variable 1 y mutaciones de inserción y sustitución de ácido aspártico realizadas en cápsides de rAAV seleccionadas.__________________________

Serotipo Región variable 1 Mutaciones rAAV1 261SSASDGASNDNHY273 (SEQ ID NO: 1) T265D

rAAV2 261SSQSDGAS268 (SEQ ID NO: 2) 265D

rAAV3b 261SSQSDGASNDNHY273 (SEQ ID NO: 3) 265D

rAAV6 261SSASDGASNDNHY273 (SEQ ID NO: 6) T265D

rAAV8 263NGDSGGAT270 (SEQ ID NO: 7) T265D

rAAV9 261SNSDSGGSS269 (SEQ ID NO: 8) T265D

El texto en negrita indica secuencia de aminoácidos primaria conservada; los asteriscos resaltan mutaciones de ácido aspártico.

Para determinar si la eficiencia de transducción se correlacionaba con el número de copias de genoma dentro de cada tejido, se cuantificaron copias de genoma de vector por célula hospedadora para muestras de tejido de corazón, hígado y GC. Hubo números incrementados de genomas de vector presentes en los hígados de ratones tratados con rAAV1/T265D y rAAV3b/265D con respecto a contrapartes de tipo silvestre (4,5 veces y 182 veces, respectivamente; figura 18F, 18I). En el caso de rAAV6, las copias del genoma del vector por célula hepática fueron virtualmente idénticas entre cápsides tipo silvestre y mutantes (figura 181). Las mutaciones de ácido aspártico de VR1 también mejoraron sustancialmente el número de copias de genoma de vector por célula de GC en ratones tratados con rAAV1/T265D o rAAV3b/T265D (60 veces y 51 veces más genomas que tipo silvestre, respectivamente; figura 18F, 18I, 18L), aunque las eficiencias de transducción entre construcciones mutantes y tipo silvestre en este tipo de tejido fueron idénticas (en cualquier caso, los valores medidos dentro de 2 veces de los obtenidos para cápsides tipo silvestre). La falta de correlación consistente entre los números de copias del genoma del vector y las eficiencias de transducción sugiere fuertemente que el procesamiento posterior a la entrada de cápsides virales es al menos parcialmente responsable de impulsar las eficiencias de transducción hepática mejoradas de estas cápsides mutantes.

En tanto que las cápsides de rAAV1, rAAV2, rAAV3b y rAAV6 se hicieron para que contuvieran la misma secuencia de aminoácidos de SSXSDGAS (SeQ ID NO:47) VR1 después de la mutación 265D, rAAV8 y rAAV9 tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente diferentes en esta región de la cápside (tabla 11). Por lo tanto, para aclarar si la transducción hepática preferencial mejorada producida por cápsides que portan una mutación 265D se debió a la secuencia de aminoácidos primaria versus algún efecto electrostático o estructural impartido por el propio ácido aspártico, se realizaron mutaciones 265D en las cápsides de rAAV8 y rAAV9. rAAV8/T265D y rAAV9/T265D que empaquetan las cápsides CBA-luc se produjeron en tándem con rAAV8 y rAAV9, y todos se inyectaron de manera intravenosa en ratones. La imagenología bioluminiscente se realizó a 10 dpi. En las cápsides de rAAV8 y rAAV9, la mutación T265D redujo sustancialmente la eficiencia de transducción general con respecto a las cápsides tipo silvestre (figura 20). Estos resultados sugieren que la secuencia de aminoácidos de SSXSDGAS (SEQ ID NO: 48) VR1 es la fuerza impulsora detrás de la eficiencia de transducción hepática mejorada en las cápsides de rAAV relevantes, y no una característica estructural impartida por el propio ácido aspártico.

Ejemplo 12

Impacto de la capacidad de unión a heparina de cápside en la eficiencia de transducción de cápsides mutantes de VR1

Se ha demostrado previamente que la capacidad de una cápside dada para unirse a sulfato de heparina impide el fenotipo de transducción mejorado producido por la mutación VR1 en cápsides administradas mediante inyección intramuscular (Warischalket al., Mol. Ther.2015). Se ha mostrado previamente que la unión a heparina se puede interrumpir en rAAV2, rAAV3b y rAAV6 a través de mutaciones puntuales únicas en cada cápside (Kemet al., J. ViroI.77(20): 11072 (2003); Opieet al., J. Virol.77(72/6995 (2003); Lerchet al., Virology, 423(1):6 (2012) Wu et al., J. Virol. 80(22):11393 (2006)). Por lo tanto, para determinar si la eficiencia de transducción de cápside mutante de VR1 se puede mejorar aún más, estas mutaciones se incorporaron en rAAV2, rAAV3b y rAAV6 para crear rAAV2/R585E, rAAV3b/R594A y rAAV6/K531 E. La incapacidad de estas cápsides mutantes para interactuar con heparina se verificó usando cromatografía de afinidad de heparina. Las cápsides anteriores se empaquetaron con CBA-luc y se administraron de manera intravenosa a ratones en tándem con rAAV2/265D_R585E, rAAV3b/265D_594A y rAAV6/T265D_K531 E y sus contrapartes mutantes individuales y de tipo silvestre. A 10 dpi, los ratones se sacrificaron y los hígados se removieron para cuantificación de la expresión transgénica. Como se ha demostrado previamente (Asokanet al., Nat. Biotechnol. 28(1):79(2010); Kemet al., J. Virol.77(20): 11072 (2003)), la alteración de la unión a heparina de la cápside de rAAV2 disminuyó la transducción hepática en ratones en aproximadamente 6,5 veces (figura 21A). Sin embargo, cuando se combina esta cápside de rAAV2 nula para heparina con la mutación de VR1 265D, el rAAV2/265D_R585E resultante superó tanto a rAAV2 como a rAAV2/265D en el hígado por 132 y 11 veces, respectivamente (figura 21A). El deterioro de la capacidad de unión a heparina de cápside en rAAV3b y rAAV6 en combinación con la mutación VR1 265D también mejoró la transducción en comparación con las cápsides originales respectivas. rAAV3b/265D_R594A transdujo el hígado por 53 veces sobre rAAV3b y 2,5 veces sobre rAAV3b.265D, en tanto que rAAV6/T265D_K531 E fue respectivamente 46 veces y 4 veces más eficiente que rAAV6 y rAAV6/T265D (figura 21B, 21C). Finalmente, debido a que las mutaciones de deleción de VR1 aplicadas a las cápsides de rAAV6 mejoraron la eficiencia de transducción en el tejido muscular (a diferencia de mutaciones similares en rAAV2 y rAAV3b que se volvieron deficientes de transducción después de las deleciones de aminoácidos de VR1), también se buscó determinar si la anulación de la unión de heparina de rAAV6 serviría para incrementar aún más la transducción dentro de este contexto. A los ratones individuales se les administró 1e11vg de rAAV6, rAAV6/T265del, rAAV6/K531E o rAAV6/T265del_K531E. A 10 dpi, los ratones se sacrificaron y se extrajeron muestras de corazón y GC para determinar la expresión de luciferasaex vivo. Al igual que con rAAV6/T265D, anteriormente, la anulación de la capacidad de unión a heparina de la cápside de rAAV6 mejoró adicionalmente la eficiencia de transducción de rAAV6/T265del. rAAV6/T265del_K531E fue 170 veces y 13 veces más eficiente en la transducción de tejido cardíaco que rAAV6 y rAAV6/T265del, respectivamente, 9027 veces y 2795 veces más eficiente que cada uno en tejido GC (Figura 21D). En conjunto, estos estudios indican que para optimizar la eficiencia de transducción de cápsides mutantes de VR1, es necesario asegurar que las capacidades de unión a heparina de cápside se eliminen de los serotipos aplicables.

Ejemplo 13

Transducción de cápsides mutantes de VR1 con respecto a los serotipos tipo silvestre más eficientes

Cuando se administran de manera intravenosa a ratones, rAAV8 y rAAV9 en general se consideran los serotipos más eficientes para transducir tejido hepático y cardíaco, respectivamente (Bishet al., Hum. Gene Ther.

19(12).1359(2008); Davidoffet al, Mol. Ther. 11(6):875(2005)). Por lo tanto, para valorar adecuadamente el rendimientoin vivode la colección de cápsides mutantes de VR1 dentro del contexto de reactivos existentes, las cápsides que portan mutaciones de deleción de VR1 y aquellas que portan mutaciones de inserción de VR1 se evaluaron en tándem con rAAV9 y rAAV8, respectivamente. rAAV1/T265del, rAAV6/T265del, rAAV6/T265del_K531 E, rAAV7/T265del, rAAV8/T265del, rAAV9/S264del_S266del y las cápsides de rAAV9 que empaquetan CBA-luc se produjeron simultáneamente y se titularon juntas en la misma placa de reacción a través de qPCR. Los ratones se inyectaron individualmente con 1e11vg de cada construcción, y se sacrificaron a 10 dpi para recolectar muestras de tejido de corazón e hígado para análisis cuantitativo. Se recolectó tejido hepático además de corazón como una medida de especificidad de vector. rAAV1/T265del, rAAV6/T265del, rAAV6/T265del_K531 E y rAAV7/T265del transdujeron cada uno el corazón a niveles idénticos a rAAV9, mientras que rAAV8/T265del fue aproximadamente 5 veces más eficiente que rAAV9 y rAAV9/S263A_S265del aproximadamente 3 veces menos eficiente (figura 22A). Después, se quiso determinar si nuestros mutantes transdujeron preferentemente tejido cardíaco sobre otros órganos como el hígado. Todas las cápsides mutantes de VR1 exhibieron mayor cardiotropismo que rAAV9 (figura 22B, 22C), con la excepción de rAAV8/T265del, que transdujo el hígado a un nivel equivalente como rAAV9. rAAV6/T265del produjo el perfil cardiotrópico más prometedor, transduciendo el corazón aproximadamente 582 veces más eficientemente que el hígado (figura 22C) versus rAAV9, que transdujo el corazón solo 2 veces más eficientemente que el hígado. En conjunto, estos datos presentan seis nuevos reactivos con un cardiotropismo más favorable que rAAV9.

Para valorar la capacidad del panel de cápside mutante 265D para transducir el hígado con respecto a rAAV8, rAAV1/T265D, rAAV2/265D_R585E, rAAV3b/265D_R594A y rAAV6/T265D_K531 E, los vectores que empaquetan CBA-luc se produjeron en tándem con rAAV8. Todas las construcciones se titularon en la misma placa de qPCR y se inyectaron en ratones a una dosis de 1e11vg. Los ratones se sacrificaron a 10 dpi y se extrajeron muestras de tejido hepático para análisis. Ninguna de las cápsides mutantes 265D alcanzó la eficiencia de transducción de rAAV8, aunque rAAV2/265D_R585E estuvo dentro de <3 veces (figura 22D). rAAV1/T265D y rAAV6/T265D_K531 E transdujeron cada uno el hígado aproximadamente 8 veces menos eficientemente que rAAV8 y rAAV3b/265D_R594A aproximadamente 17 veces menos eficiencia (figura 22D). En conjunto, estos resultados muestran que en tanto que la inserción o sustitución de un residuo de ácido aspártico en VR1 puede mejorar sustancialmente la eficiencia de transducción hepática en numerosos serotipos, rAAV8 sigue siendo superior en transducción del hígado en este modelo de ratón.

Ejemplo 14

El cardiotropismo de las cápsides mutantes de VR1 se mejora por la incorporación de mutaciones Y->F

Se ha mostrado que la mutación de residuos de tirosina seleccionados en la superficie de la cápside de rAAV mejora la eficiencia de transducción de rAAV al evitar la fosforilación y la degradación proteasómica final de las cápsides intracelulares antes de que puedan alcanzar el núcleo (Zhongetal., Virology381(2):194(2008)). Se quiso determinar si estas mutaciones pueden sinergizar con las cápsides mutantes de VR1 para mejorar la eficiencia de transducción en tanto que se mantienen los fenotipos biodistributivos impartidos por la mutación de VR1. Como rAAV1 ha sido el serotipo más utilizado para estudios traslacionales en humanos dirigidos a corregir enfermedades cardíacas y del músculo esquelético (Flotteet al., Hum. Gene Ther. 22(10)1239(2011); Greenberget al., JACC Heart Fail. 2(1):84(2014)), se creó una cápside de rAAV1 para incluir mutaciones tanto Y445F como T265del. Aunque las mutaciones de tirosina a fenilalanina no se han evaluado previamente en el contexto de rAAV1, se ha demostrado que Y445F mejora la eficiencia de transducción en rAAV6 después de la inyección intramuscular (Qiaoet at., Hum. Gene Ther. 21(10):1343(2010)). rAAV1 y rAAV6 tienen >99 % de homología en la secuencia de proteína de cápside (Wuet al., J. Virol. 80(22)1393 (2006)), por lo tanto, era razonable esperar que esta mutación pueda funcionar de manera similar en el contexto de rAAV1. Sin embargo, rAAV6 también se incluyó en este análisis. Las cápsides de rAAV1 y rAAV6 tipo silvestre que empaquetan CBA-luc se produjeron simultáneamente con cápsides mutantes T265del e Y445F simples y dobles. Se inyectaron ratones mediante la vena de la cola con 1e11vg de cada uno, y se removieron muestras de tejido de corazón, hígado y GC a 10 dpi para análisis. En ambos serotipos, las cápsides mutantes T265del_Y445F dobles mejoraron aún más la eficiencia de transducción cardíaca: rAAV1/T265del_Y445F transdujo el corazón 66 veces y 9 veces más que rAAV1 y rAAV1/T265del (figura 23A), respectivamente, en tanto que rAAV6/T265del_Y445F transdujo 30 veces y 3 veces más que rAAV6 y rAAV6/T265del. La mutación doble T265del_Y445F condujo a efectos variables en el tejido de GC, en donde la transducción se potenció 3,5 veces en rAAV6/T265del_Y445F versus rAAV6/T265del (figura 23B), y fue prácticamente el mismo entre los contrapuntos de rAAV1 a estos mutantes. En ambos serotipos, la desdirección hepática impartida por las cápsides mutantes de VR1 se mantuvo completamente en el contexto de la mutación Y445F. Curiosamente, el mutante Y445F solo no pudo mejorar la eficiencia de transducción de rAAV1 o rAAV6 después de la administración intravenosa, a pesar del hecho de que en experimentos de cultivo celular el mutante mejoró la transducción notablemente sobre las cápsides de tipo silvestre. Hasta donde se sabe, estos mutantes no se han evaluado previamente después de la inyección intravenosa en ratones y por lo tanto, es difícil especular por qué no superarían a sus contrapartes parentales a través de esta ruta de administración. Tal vez se requiere un residuo de tirosina en la posición 445 para el tráfico exitoso a través de barreras impuestas por la vasculatura sanguínea. En conjunto, estos datos sugieren que la incorporación de Y445F en cápsides mutantes de VR1 puede mejorar aún más la transducción cardíaca en tanto que se mantiene un perfil de biodistribución dirigido al hígado.

Aquí se presenta un nuevo método de modificación de cápside que se puede usar para mejorar el direccionamiento y la transducción de tejido muscular en rAAV administrado sistémicamente. Observaciones anteriores han demostrado que interrumpir la estabilidad del bucle de cápside VR1 de rAAV1 a través de la deleción de aminoácidos seleccionados mejoró significativamente la transducción del músculo esquelético después de la inyección intramuscular (Warischalk, J.K.a.S.,Mol. Ther.2015). Las mutaciones más eficientes para mejorar la transducción se correlacionaron con aquellas que fueron más disruptivas para las redes de enlaces de hidrógeno intrabucle VR1. Estas observaciones llevaron a investigar si la desestabilización dirigida de VR1 en rAAV1 puede inducir el direccionamiento preferencial del tejido muscular después de la administración intravenosa, y si este enfoque se puede usar para diseñar serotipos de rAAV adicionales para producir un resultado similar. La estrategia fue efectiva para mejorar las propiedades biodistributivas de cinco de los nueve serotipos estudiados. En las cápsides de rAAV1 y rAAV6, se observó una ganancia robusta de función en la transducción de tejidos musculares cardíacos y/o esqueléticos, en tanto que en las cápsides de rAAV7, rAAV8 y rAAV9, los niveles de transducción nativos se mantuvieron en el tejido muscular en tanto que la eficiencia de transducción hepática disminuyó drásticamente. Se observaron efectos perjudiciales significativos después de la mutación de VR1 en los serotipos restantes, incluida la incapacidad de producir viriones intactos en rAAV4 y rAAV5 y deficiencias de transducción graves en rAAV2 y rAAV3b. Por lo tanto, el método proporciona información funcional sobre la topología de la cápside que se puede incorporar sistemáticamente o evitar al diseñar vectores novedosos.

Las redes de enlaces de hidrógeno intraproteínas regulan la funcionalidad y la dinámica estructural en prácticamente todas las clases de proteínas, incluidas numerosas especies virales (por ejemplo, ver Worthet al.,BMC Evol. Biol. 10:161(2010)). Sin embargo, salvo la adquisición de datos estructurales empíricos, solo la evidencia correlativa actualmente respalda que la desestabilización del enlace de hidrógeno es la fuerza impulsora detrás de los fenotipos mejorados de las cápsides mutantes de VR1 creadas en este estudio. Sin embargo, la evidencia proporciona un apoyo razonable de la hipótesis. En primer lugar, la estrategia funcionó según lo previsto en la mayoría de los serotipos probados. En segundo lugar, los residuos de rAAV6 S262 y T265 forman un par de enlaces de hidrógeno que trabajan juntos para estabilizar el resto de VR1 (figura 11F) y la deleción individual de cualquiera de estos residuos dio como resultado fenotipos biodistributivos equivalentes (figura 16C). En tercer lugar, la estabilidad de VR1 parece depender de dos conjuntos diferentes de compañeros de enlace de hidrógeno en rAAV9 (figura 11H) y el fenotipo de biodistribución músculo-trópico deseado solo se pudo obtener después de la mutación de ambos (figura 14G); las mutaciones individuales de cualquiera de los residuos fueron ineficaces (figura 17D). Finalmente, en rAAV8 solo existe un enlace de hidrógeno simple en VR1: el de la posición T265 cadena lateral de aminoácidos que se une a sí mismo (figura 11G) en tanto que que la deleción de T265 dio como resultado una desdirección sustancial del hígado (figura 14E), la remoción de S266 vecino no (figura 24). Junto con los efectos destructivos que la desestabilización de VR1 tiene sobre rAAV2, rAAV3b, rAAV4 y rAAV5, la evidencia sugiere que una estructura definida con precisión para este bucle de cápside es altamente influyente para el avance productivo de rAAV a través de su ciclo de vida.

En tanto que las interrupciones en la estructura de VR1 claramente dan como resultado vectores con propiedades sistémicas mejoradas, los detalles adicionales detrás del mecanismo que rige estos nuevos fenotipos siguen siendo difíciles de alcanzar. Se ha encontrado que los pares de enlaces de hidrógeno individuales controlan la estabilidad de la cápside y la eficiencia infecciosa en diversas especies virales (Tipperet al., J. Virol. 88(18):10289 (2014) ; Tsoet al., J. Mol. Biol. 426(10)2112(2014); Rueet al., J. Virol. 77(14)8009(2003); Speiret at., J. Virol.

80(7):3582(2006)) y además se ha planteado la hipótesis de modular el ensamble de rAAV (Griegeret al., J. Virol.

80(11):5199 (2006)). Sin embargo, un protocolo de disociación por calor establecido diseñado para medir la estabilidad de la cápside de rAAV (Horowitzet al, J. Virol. 87(6)2994(2013)) no reveló diferencias entre las cápsides tipo silvestre y mutantes de VR1. Además, parece poco probable que un simple incremento en la disociabilidad de la cápside dé por resultado cambios amplios en la biodistribución del vector. El bucle VR1 de rAAV se encuentra en una interfaz entre subunidades monoméricas en la superficie de cápside expuesta y, por lo tanto, puede interactuar potencialmente con proteínas adicionales. Se conoce que las redes de enlaces de hidrógeno intracápside modulan las interacciones de la cápside con compañeros de unión, tal como durante la catálisis de glicano por neuraminidasa de influenza (von Grafensteinet al., J. Biomol. Struct. Dyn. 33(1):104(2015) ), el compromiso del receptor por el poliomavirus humano (Khanet al., J. Virol.88(11)6100(2014)), y evasión del factor antiviral TRIM5a por VIH-2 (Miyamotoet al., PLoS One 6(7):e22779(2011)). Por lo tanto, la mutación VR1 puede alterar la estabilidad de la cápside para evitar interacciones de la cápside con un receptor de superficie celular preferido, lo que permite una vía de entrada alternativa al núcleo. La reducción consistente en las poblaciones de genoma de vector hepático de ratones a los que se administró cápsides mutantes por deleción de VR1 respalda esta noción, al igual que el descubrimiento de que los genomas de vector administrados a células cardíacas por cápsides mutantes se expresaron de manera mucho más eficiente que los administrados por contrapartes de tipo silvestre. Además, este concepto no carece de precedentes, ya que rAAV2 exhibe un direccionamiento muscular mejorado y una transducción hepática disminuida cuando la cápside se muta para eliminar la unión a heparina (Asokanet al., Nat. Biotechnol. 28(1)29(2010); Kemet al., J. Virol. 77(20):11072(2003)). rAAV9 también exhibe un fenotipo sistémicamente mejorado dirigido a aliver cuando se muta para reducir la unión de galactosa (Shenet al., J. Virol. 86(19):10408(2012)). Es notable que se ha demostrado que las mutaciones de VR1 reducen la capacidad de las cápsides de rAAV2 y rAAV6 para unirse a sulfato de heparina (Warischalket al., Mol. Ther.2015). Además, la región N-terminal de VR1 se coloca en la cápside lo suficientemente cerca (<3A) de la huella de unión a galactosa de rAAV9 como para que las interacciones directas entre las dos regiones sean factibles (Bellet al., J. Virol.86(13):7326 (2012)). Estas observaciones plantean preguntas intrigantes sobre si los receptores identificados para diferentes serotipos de rAAVin vitroson artefactos potenciales de pase a través de cultivo celular, y si rAAV podría tener un potencial de transducciónin vivomucho mayor de lo que se creía anteriormente si estos artefactos se eliminan por mutación.

Desde una perspectiva estructural, la observación de que las mutaciones de deleción de VR1 hacen que rAAV4 y rAAV5 sean incapaces de producir viriones intactos es directa. En ambos de estos serotipos, VR1 forma un bucle relativamente corto que se une principalmente a hidrógeno a láminas B subyacentes. Por lo tanto, la interrupción de la estabilidad de esta región de la cápside puede dar como resultado posiblemente cambios estructurales brutos que evitan que los monómeros de cápside interactúen entre sí. La comprensión de por qué las mutaciones de deleción de VR1 hacen que rAAV2 y rAAV3b sean deficientes en transducción es menos clara. A pesar de no poder transducir tejidos de ratón, rAAV2/S264del y rAAV3b/S262del son capaces de transducir células en cultivo. Por lo tanto, cualquier deficiencia en la transducción de tejidos de ratón proviene de alguna faceta del ambientein vivo.Los experimentos futuros tienen como objetivo diseccionar más estas observaciones. Sin embargo, el fracaso para mejorar rAAV2 a través de deleciones de aminoácidos de VR1 no carecía de mérito, ya que condujo al descubrimiento fortuito de que las inserciones de ácido aspártico en VR1 producen el fenotipo opuesto de mutaciones de deleción: mejora robusta de la transducción hepática después de la administración sistémica de vector. Actualmente se desconocen los detalles mecanísticos que rigen el comportamiento de los mutantes de inserción VR1. El ácido aspártico es un fosfomimético conocido y, por lo tanto, puede redirigir potencialmente el tráfico de cápsides dentro de la célula. De hecho, se ha sugerido que la fosforilación de serina y treonina marca las cápsides de rAAV para la degradación proteasómica (Gabrielet al., Hum. Gene Ther. Meth. 24(2):80(2013)). Sin embargo, el software de predicción de sitio de fosforilación de código abierto (NetPhos2.0) no indica VR1 (ya sea modificado o no modificado) como un sitio de fosforilación, y los datos de experimentos de cultivo celular que utilizan inhibidor de proteasoma no apoyan que el fenotipo de cápsides mutantes 265D es el resultado de la eliminación proteasómica reducida. Otra posibilidad es que la inserción de ácido aspártico en VR1 produzca el efecto opuesto de la deleción de aminoácidos: estabilizar la estructura de VR1 en lugar de destruirla. Los residuos de ácido aspártico se conocen bien por su efecto estabilizador sobre la estructura de proteínas a través de la participación en interacciones intra-proteínas tal como apilamiento de carbonilo (Deaneet al., Protein Eng. 12(12):1025 (1999)), puentes salinos (Speareet al, J. Biol. Chem.278(14):12522(2003)), y redes de enlaces de hidrógeno (Worthet al., BMC Evol. Biol. 10:161(2010)). Si esto fuera cierto, es concebible que en tanto que las mutaciones de deleción de VR1 desestabilizan esta región de la cápside para prevenir la interacción con un receptor dado, las inserciones de ácido aspártico en VR1 en cambio mejoran tanto la estabilidad estructural de la cápside como las interacciones proteína:proteína resultantes. La mayoría de las cápsides mutantes de 265D incrementaron las poblaciones de genoma de vector tanto en el hígado como en el GC, que sugiere que la mutación de 265D mejora la entrada de células. Sin embargo, en tanto que esto parece ventajoso en el caso de la transducción hepática, la eficiencia de transducción en GC no se mejoró en el contexto de la mutación 265D, lo que sugiere que el procesamiento posterior a la unión de la cápside también se ve afectado por la mutación.

En resumen, los estudios ofrecen nuevos conocimientos estructurales sobre la influencia de la región VR1 de la cápside de rAAV en la eficiencia de transducción y la orientación a tejidosin vivo.Estos conocimientos permitieron el desarrollo de dos estrategias de modificación racional conservadas que mejoran el direccionamiento a tejidos después de la administración sistémica de vector. A primera vista, la recolección de cápsides mutantes por deleción de VR1 parece ser la más clínicamente relevante, ya que se desarrollaron seis vectores novedosos que pueden funcionar a o por arriba del nivel de rAAV9 al dirigirse al corazón. En tanto que este es de hecho un avance valioso en la vectorología de rAAV, la recolección de cápside mutante 265D no debe pasarse por alto en términos de valor clínico. Aunque rAAV8 se considera consistentemente el mejor transductor hepático en modelos de ratón (Davidoffet al., Mol. Ther. 11(6):875(2005)), y aunque la colección de cápsides 265D no pudo superar a rAAV8 en el estudio, también es notable que rAAV8 puede no ser el vector más ideal para aplicaciones de terapia génica humana traslacional. De hecho, se ha encontrado que tanto rAAV2 como una variante de rAAV3b infectan hepatocitos humanos con mayor eficiencia que rAAV8 (Lisowskiet al., Nature, 506(7488)1382(2014)). Por lo tanto, las dos colecciones de cápsides mutantes de VR1 tienen la capacidad de expandir el grupo de reactivos disponible para aplicaciones de terapia génica orientadas a músculo o hígado. Se espera que esta expansión permita una mejor personalización de la terapia génica en el futuro, tal vez permitiendo el perfil de anticuerpos neutralizantes preexistentes de un paciente (Louiset al., Hum. Gene Ther. Meth. 24(2)59(2013)) para ayudar a elegir el serotipo más adecuado para sus necesidades individuales y mejorar la capacidad de readministrar el vector si es necesario.

Lo que antecede se describe ilustrativamente en la presente, y no se va a interpretar como limitante de la misma. La invención se define por las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones que se incluirán en ellas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína cápside de virus asociado a adenovirus (AAV) modificada por deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos dentro del bucle de región variable 1 (VR1), en donde la proteína cápside es serotipo AAV1 que tiene un bucle VR1 de SEQ ID NO: 1, es serotipo AAV6 que tiene un bucle VR1 de SEQ ID NO: 6, es serotipo AAV8 que tiene un bucle VR1 de SEQ ID NO: 7, o es serotipo AAV9 que tiene un bucle VR1 de SEQ ID NO: 8, para provocar desestabilización regional dentro del bucle debido a la destrucción dirigida de patrones de enlace de hidrógeno orquestada por los residuos, en donde la proteína de cápside que comprende la modificación proporciona a un vector de virus que comprende la proteína de cápside eficiencia de transducción incrementada y/o especificidad de tejido modificada con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación, en donde:

a) la proteína de cápside es serotipo AAV1 y tiene una deleción en la posición S1, S2, A3, S4, T5, G6, A7, S8 o N9 de SEQ ID NO: 1, en donde la proteína de cápside proporciona eficiencia de transducción incrementada de músculo con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la deleción; b) la proteína cápside es serotipo AAV6 y treonina en la posición 5 de SEQ ID NO: 6 se elimina, o serotipo AAV8 y treonina en la posición 3 de SEQ ID NO: 7 se elimina, en donde la proteína de cápside proporciona eficiencia de transducción incrementada de músculo con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la deleción;

c) la proteína cápside es serotipo AAV1 y tiene una sustitución de aminoácido de T5E, T5F o T5D en SEQ ID NO: 1. en donde la proteína de cápside proporciona a un vector de AAV que comprende la proteína de cápside eficiencia de transducción muscular incrementada por al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la modificación;

d) la proteína de cápside es serotipo AAV9, y comprende una sustitución de aminoácido de S3 A y deleción de S5 de SEQ ID NO: 8, en donde la proteína de cápside proporciona a un vector de AAV que comprende la proteína de cápside una eficiencia de transducción hepática disminuida por al menos aproximadamente 10 % con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la deleción o sustitución; o e) la proteína de cápside es serotipo AAV1 y comprende una sustitución de ácido aspártico en la posición 5 de SEQ ID NO: 1, o es serotipo AAV6, y comprende una sustitución de ácido aspártico en la posición 5 de SEQ ID NO: 6, en donde la proteína de cápside proporciona, a un vector de AAV que comprende la proteína de cápside, eficiencia de transducción muscular incrementada por al menos aproximadamente 10 %, y además proporciona eficiencia de transducción hepática incrementada, con respecto a un vector de virus que comprende una proteína de cápside que no contiene la sustitución.

2. Un polinucleótido que codifica para la proteína de cápside de la reivindicación 1.

3. Una cápside de AAV que comprende la proteína de cápside de la reivindicación 1.

4. Un vector de AAV que comprende:

(a) la cápside de AAV de la reivindicación 3; y

(b) un ácido nucleico que comprende una plantilla viral recombinante,

en donde el ácido nucleico se encapsida por la cápside de AAV.

5. Una composición farmacéutica que comprende el vector de AAV de la reivindicación 4 en un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Un métodoin vitropara administrar un ácido nucleico a una célula, el método que comprende poner en contacto la célula con el vector de virus de la reivindicación 4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 5 bajo condiciones suficientes para que el ácido nucleico ingrese a la célula.

7. El vector de virus de la reivindicación 4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 5 para uso en un método terapéutico para administrar un ácido nucleico a un sujeto en necesidad del mismo.

8. El vector de virus o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde una célula que se ha puesto en contacto con el vector de virus de la reivindicación 4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 5, bajo condiciones suficientes para que el ácido nucleico ingrese a la célula, se administra a un sujeto.

9. El vector de virus o composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde el sujeto es un sujeto humano.

10. El vector de virus o composición farmacéutica para un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el sujeto tiene o está en riesgo de un trastorno seleccionado del grupo que consiste de una distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, hemofilia A, hemofilia B, esclerosis múltiple, diabetes mellitus, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, cáncer, artritis, atrofia muscular, enfermedad cardíaca, insuficiencia cardíaca congénita, enfermedad arterial periférica, hiperplasia íntima, un trastorno neurológico, epilepsia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, una enfermedad autoinmune, fibrosis quística, talasemia, síndrome de Hurler, síndrome de Sly, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A, B, C, D, síndrome de Morquio, síndrome de Maroteaux-Lamy, enfermedad de Krabbe, fenilcetonuria, enfermedad de Batten, ataxia espinal cerebral, deficiencia del receptor de LDL, hiperamonemia, anemia, artritis, un trastorno degenerativo de la retina, degeneración macular y deficiencia de adenosina desaminasa

11. El vector de virus o composición farmacéutica para un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el vector de virus o composición farmacéutica se administra al ojo, al cerebro, músculo esquelético, músculo cardíaco y/o músculo del diafragma, o se administra de manera intravenosa.

12. El vector de virus o composición farmacéutica para un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el sujeto tiene o está en riesgo de una condición elegida de distrofia muscular, enfermedad cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva o enfermedad arterial periférica, o tiene o está en riesgo de un trastorno metabólico.

13. El uso del vector de virus de la reivindicación 4 , o la composición farmacéutica de la reivindicación 5, en un método de diagnóstico o examenin vitro,por lo que un ácido nucleico de interés se expresa de manera transitoria o estable en un sistema de cultivo celular.

14. Un método para producir una partícula de AAV recombinante (rAAV), que comprende proporcionar a una célula permisiva para la replicación de AAV:

a) una plantilla de rAAV que comprende (i) un ácido nucleico heterólogo, y (ii) al menos una repetición terminal invertida; y

b) un polinucleótido que comprende secuencias codificadoras de proteína de replicación y secuencias que codifican para la proteína de cápside de la reivindicación 1;

bajo condiciones suficientes para la replicación y empaquetamiento de la plantilla de rAAV;

por lo que las partículas de rAAV se producen en la célula.