ES3036403T3 - Hypersensitive response elicitor peptides and use thereof - Google Patents

Hypersensitive response elicitor peptides and use thereof

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ES3036403T3
ES3036403T3 ES15847410T ES15847410T ES3036403T3 ES 3036403 T3 ES3036403 T3 ES 3036403T3 ES 15847410 T ES15847410 T ES 15847410T ES 15847410 T ES15847410 T ES 15847410T ES 3036403 T3 ES3036403 T3 ES 3036403T3
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Zhongmin Wei
Gregory A Zornetzer
Stephen Bornick
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Plant Health Care Inc
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Abstract

Se describen péptidos que inducen respuesta hipersensible que presentan mayor solubilidad, estabilidad, resistencia a la degradación química o una combinación de estas propiedades. También se describe el uso de estos péptidos o polipéptidos de fusión, o construcciones de ADN que los codifican, para modular la señalización bioquímica de las plantas, conferirles resistencia a enfermedades, mejorar el crecimiento vegetal, conferirles tolerancia al estrés biótico, conferirles tolerancia y resistencia al estrés abiótico, conferir resistencia a la desecación a esquejes de plantas ornamentales, conferir resistencia a enfermedades o a la desecación poscosecha a una fruta o verdura, o aumentar la longevidad de la maduración de frutas o verduras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos inductores de respuesta de hipersensibilidad y su uso
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos péptidos inductores de la respuesta de hipersensibilidad y su uso para inducir respuestas de plantas activas que incluyen, entre otras, mejora del crecimiento, resistencia a la enfermedad, resistencia a plagas o insectos y resistencia al estrés.
Antecedentes de la invención
La identificación y aislamiento de proteínas harpinas provienen de la investigación básica en la Universidad de Cornell que intentaba comprender cómo las bacterias fitopatógenas interactúan con plantas. Una primera línea de defensa es la respuesta de hipersensibilidad (HR), una muerte celular de planta localizada en el sitio de infección. La muerte celular crea una barrera física al movimiento del patógeno y en algunas células muertas de plantas puede liberar compuestos tóxicos al patógeno invasor. La investigación había indicado que las bacterias patógenas probablemente tuvieran un factor simple que era responsable de la activación de H<r>. Un objeto básico de la investigación de Cornell consistía en identificar una proteína bacteriana específica responsable de producir la HR. La proteína objeto era conocida por estar codificada por uno de un grupo de genes de bacterias denominado clúster génico de respuesta de hipersensibilidad y patogenicidad (hrp). El clúster hrp en la bacteria Erwinia amylovora (Ea), que causa tizón en pera y manzana, fue diseccionado y se identificó una proteína simple que producía HR en ciertas plantas. A esta proteína se le dio el nombre harpina (y más tarde, harpinaEa) y el correspondiente gen se designó hrpN. Este fue el primer ejemplo de tal proteína y gen identificado de cualquier especie bacteriana.
Desde entonces se ha identificado una cantidad de diferentes proteínas harpinas de especies Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas y Pantoea, entre otras. Las proteínas harpinas, si bien son diversas en el nivel de la secuencia de aminoácidos primarios, comparten características comunes bioquímicas y biofísicas, así como funciones biológicas. En base a sus propiedades exclusivas, las proteínas harpinas se consideran en la literatura como pertenecientes a una clase simple de proteínas.
Posteriormente a su identificación y aislamiento, se describió que las harpinas pueden inducir resistencia a la enfermedad en plantas y aumentar el crecimiento de las plantas. Un hallazgo temprano importante era que la aplicación de proteína harpina purificada hacía resistente a una planta a un posterior ataque por patógenos y en locaciones en la planta alejadas del sitio de inyección. Esto significa que las proteínas harpinas pueden activar una resistencia adquirida sistémica (SAR), un mecanismo de defensa de la planta que proporciona resistencia a una variedad de patógenos virales, bacterianos y fúngicos.
En la protección de cultivos, hay una continua necesidad de composiciones que mejoren la salud de las plantas. Se desean plantas más sanas dado que dan como resultado mejores rendimientos y/o una mejor calidad de las plantas o cultivos. Las plantas más sanas también resisten mejor el estrés biótico y abiótico. A su vez, una mayor resistencia contra estreses bióticos permite que los agricultores reduzcan la cantidad de pesticidas aplicados y, en consecuencia, retarden el desarrollo de las resistencias contra los respectivos pesticidas.
Harpinaap es una proteína de fusión que se deriva de varias harpinas diferentes. La harpinaap mostró que suprime la producción de huevos de nematodos, mejora el crecimiento, la calidad y el rendimiento de una planta y aumenta el vigor de una planta. Sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos se describen en detalle en la publicación de solicitud U. S. No. 2010/0043095.
Hasta la fecha, la producción de harpina y harpinaap y su uso en aplicaciones agrícolas y hortícolas fueron como un sólido en polvo recubierto en almidón. Esto limita el uso y la versatilidad de las proteínas harpinas, porque las suspensiones líquidas de las proteínas harpinas pulverulentas en agua tienen una vida útil efectiva de sólo 48-72 horas antes de que ocurra la significativa degradación y pérdida de actividad. Otro problema con soluciones de harpina es la solubilidad y la estabilidad de las proteínas.
Sería deseable identificar péptidos de harpina sintéticos y derivados que ya son solubles en solución acuosa, estables, resistentes a degradación química y efectivos en el inicio de la respuesta de hipersensibilidad en plantas.
La presente invención se refiere a la superación de estas y otras limitaciones en el arte.
Resumen
Se divulga un primer péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/A)-X-X-(L/I)-(L/I/V/F) (SEQ ID NO: 93)
en donde el péptido está libre de cisteína y metionina; cada X en las posiciones 2 y 6 es opcional y, de estar presente, es cualquier aminoácido; y cada X en las posiciones 3, 7, 10 y 11 es cualquier aminoácido. En una forma de realización, X en sólo una de las posiciones 2 y 6 es opcional. En determinadas formas de realización, SEQ ID NO: 93 también puede incluir un residuo de aminoácido adicional entre los dobletes hidrofóbicos (dos de L/I/V/F/A, como se indicó). En determinadas formas de realización, el péptido aislado también incluye una secuencia de aminoácidos hidrofílicos que se ubica N-terminal o C-terminal en SEQ ID NO: 93.
Se divulga un segundo péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/A)-X-X-(L/I)-(L/I/V/F) (SEQ ID NO: 93) en donde el péptido está libre de cisteína y metionina; cada X en las posiciones 2, 6 y 10 es opcional y, de estar presente, es cualquier aminoácido; y cada X en las posiciones 3, 7 y 11 es cualquier aminoácido. En una forma de realización, X en sólo una de las posiciones 2, 6 y 10 es opcional. En determinadas formas de realización, SEQ ID NO: 93 también puede incluir un residuo de aminoácido adicional entre los dobletes hidrofóbicos (dos de L/I/V/F/A, como se indicó). En determinadas formas de realización, el péptido aislado también incluye una secuencia de aminoácidos hidrofílicos que se ubica N-terminal o C-terminal en SEQ ID NO: 93.
Se divulga un tercer péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
XXGISEKXXXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 1, P1/P4 consenso),
en donde
X en a posición 1 es opcional y puede ser S, N, D, isoD, G, A o S;
X en a posición 2 es opcional y puede ser Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en a posición 8 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en a posición 9 es L, I, F o V;
X en a posición 10 es opcional y puede ser D o isoD;
X en a posición 11 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en a posición 12 es M, L, I o F;
X en a posición 13 es M, L o I;
X en la posición 14 es opcional y puede ser cualquier aminoácido hidrofílico, con preferencia, C, S, T, A, D, isoD, K o Q;
X en a posición 15 es Q, E, g-glutamato, G, A, S, K o I;
X en a posición 16 es M, L, I, V o F;
X en a posición 17 es M, L, I, A o V;
X en a posición 18 es Q, E, g-glutamato, G, A, S, M, T o K;
X en a posición 19 es A, D, isoD, S, V, T, K, R, E, H o G;
X en a posición 20 es M, L o I;
X en a posición 21 es M, L, I, V, S o F;
X en a posición 22 es Q, E, g-glutamato, G, A, S;
X en a posición 23 es P, Q, E, g-glutamato, G, A o S; y
en donde el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje.
Una familia de péptidos de ejemplo de acuerdo con el tercer aspecto tiene la secuencia de aminoácidos de: SXGISEKXXDXXXXXXXXAXXXP (SEQ ID NO: 2, P4 consenso), en donde
X en la posición 2 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 9 es L, A, D, isoD, I, V o F;
X en la posición 11 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 12 es L, D, isoD, I o F;
X en la posición 13 es L, I, V o F;
X en la posición 14 es cualquier aminoácido hidrofílico, con preferencia, C, S o T, S o T o sólo S;
X en la posición 15 es Q, E, g-glutamato, G, A, S, K o I;
X en la posición 16 es L, A, I, V, M o F;
X en la posición 17 es I, S o F;
X en la posición 18 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 20 es L, I, V o F;
X en la posición 21 es L o F; y
X en la posición 22 es Q, E, g-glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, estos péptidos de acuerdo con el tercer aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto. Otra familia de péptidos de ejemplo de acuerdo con el tercer aspecto tiene la secuencia de aminoácidos de: XXGISEKXLDXLLTXLIXALLXX (SEQ ID NO: 3, P1 consenso), en donde
X en la posición 1 es N, D, isoD, G, A o S;
X en la posición 2 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 11 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 15 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 18 es M, T, K, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 22 es Q, E, g-glutamato, G, A o S; y
X en la posición 23 es Q, E, g-glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, estos péptidos de acuerdo con el tercer aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto. Se divulga un cuarto péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) KPXDSXSXIAKLISXLIXSLLX (SEQ ID NO: 47, P15b/P20 consenso), en donde
X en la posición 3 es N, D o isoD;
X en la posición 6 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es N, D o isoD;
X en la posición 15 es opcional y puede ser cualquier aminoácido;
X en la posición 18 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; y
X en la posición 22 es opcional y puede ser Q, E, g-glutamato, G, A o S; o
(ii) IAKLISXLIXSLLX (SEQ ID NO: 12, P15/20 min consenso), en donde
X en la posición 7 es opcional y puede ser cualquier aminoácido;
X en la posición 10 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; y
X en la posición 14 es opcional y puede ser Q, E, g-glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con el cuarto aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto.
Se divulga un quinto péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) PSPXTXXLXXIVGXILXAXN (SEQ ID NO: 66, P6/6a consenso), en donde
X en la posición 4 es F o Y;
X en la posición 6 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 7 es opcional y puede ser L, M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K;
X en la posición 9 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K;
X en la posición 10 es H o N;
X en la posición 14 es E, g-glutamato, D o isoD;
X en la posición 17 es Q, E, g-glutamato, G, A o S; y
X en la posición 19 es Q, E, g-glutamato, G, A o S; o
(ii) XTXXLXXIVGXIL (SEQ ID NO: 135, P6/6a min consenso), en donde
X en la posición 1 es F o Y;
X en la posición 3 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 4 es opcional y, de acuerdo con una forma de realización, puede ser M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; o de acuerdo con otra forma de realización puede ser L;
X en la posición 6 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K;
X en la posición 7 es H o N; y
X en la posición 11 es E, g-glutamato, D o isoD;
en donde el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con el quinto aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto.
Se divulga un sexto péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) XXXXXXLXXLLXXLVXLLK (SEQ ID NO: 13, P14d consenso), en donde
X en la posición 1 puede ser: Q, N, D, E, g-glutamato, isoD o S;
X en la posición 2 puede ser: D, E, g-glutamato, isoD;
X en la posición 3 puede ser: P, D, E, isoD o g-glutamato;
X en la posición 4 puede ser M, A, S, D, E, isoD o g-glutamato
X en la posición 5 puede ser Q, E o g-glutamato;
X en la posición 6 puede ser A, E o g-glutamato;
X en la posición 8 puede ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 9 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 12 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 13 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato; y
X en la posición 16 puede ser K, Q, N, E, D, R, G, A o S; o
(ii) LXXLLXXLVXLLK (SEQ ID NO: 14, P14d min consenso), en donde
X en la posición 2 puede ser M, L, E, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 3 puede ser Q, N, E, isoD o g-glutamato;
X en la posición 6 puede ser Q, N, E, isoD o g-glutamato;
X en la posición 7 puede ser Q, N, E, isoD o g-glutamato; y
X en la posición 10 puede ser K, Q, N, E, D, R, G, A o S.
En determinadas formas de realización, el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con el sexto aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto.
Se divulga un séptimo péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) LXXL(L/M)XILXXLV (SEQ ID NO: 16, P25 consenso), en donde
X en la posición 2 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 3 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 6 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 9 puede ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A o G; y
X en la posición 10 puede ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q o N; o
(ii) LXXVLXXL(L/M)XILXXLV (SEQ ID NO: 17, P25 consenso), en donde
X en la posición 2 puede ser T, S, A, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q o N;
X en la posición 3 puede ser G, T, S, A, D, isoD, E, g-glutamato, Q o N;
X en la posición 6 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 7 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 10 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 13 puede ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A o G;
X en la posición 14 puede ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q o N; y
V en la posición s opcional.
En determinadas formas de realización, el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con el séptimo aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto.
La invención se refiere a un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de: XXXXXXXXXXX(L/M)XXLLXXLLXXLLXXX (SEQ ID NO: 18, P17/18), en donde
X en la posición 1 es opcional y, cuando está presente, es Q;
X en la posición 2 es opcional y, cuando está presente, es Q;
X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente, es P o S;
X en la posición 4 es opcional y, cuando está presente, es I, S o E;
X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente, es D, E o Q;
X en la posición 6 es opcional y, cuando está presente, es R, S o E;
X de la posición 7 es opcional, y cuando está presente, es Q o E;
X en la posición 8 es opcional y, cuando está presente, es T o E;
X en la posición 9 es opcional y, cuando está presente, es I o E;
X en la posición 10 es opcional y, cuando está presente, es E o K;
X en la posición 11 es opcional y, cuando está presente, es Q o E;
X en la posición 13 es A;
X en la posición 14 es Q o E;
X en la posición 17 es A;
X en la posición 18 es Q o E;
X en la posición 21 es K o E;
X en la posición 22 es S;
X en la posición 25 es opcional y, cuando está presente, es S o E;
X en la posición 26 es opcional y, cuando está presente, es P o E; y
X en la posición 27 es opcional y, cuando está presente, es Q o E;
Se divulga un noveno péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de: XLXX(L/M)LXLIXX(L/I/V/F/M)(L/I/V/F/M) (SEQ ID NO: 26, P19 consenso), en donde
X en la posición 1 es opcional y puede ser L, I, V, F o M;
X en la posición 3 puede ser cualquier aminoácido, pero preferiblemente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N o R;
X en la posición 4 puede ser cualquier aminoácido, pero preferiblemente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K o R;
X en la posición 7 puede ser cualquier aminoácido, pero preferiblemente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N o R;
X en la posición 10 puede ser cualquier aminoácido, pero preferiblemente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K o R; y
X en la posición 11 puede ser cualquier aminoácido, pero preferiblemente R, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N o K.
En determinadas formas de realización, el péptido aislado comprende una o más mutaciones en relación con una secuencia de aminoácidos de tipo salvaje correspondiente, y una o más mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, la estabilidad o la resistencia a la degradación química del péptido aislado en relación con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje correspondiente. En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con el noveno aspecto también cumplen las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o segundo aspecto.
Se divulga un décimo péptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos de (L/M)XXLLX(L/M)FXXI(L/M)XX (SEQ ID NO: 15, P3min consenso) en donde
X en la posición 2 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 3 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 6 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 9 puede ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A o G;
X en la posición 10 puede ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q o N;
X en la posición 13 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G; y
X en la posición 14 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G.
En determinadas formas de realización, el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje y las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con el décimo aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de acuerdo con el primer o el segundo aspecto.
La invención se refiere además a una proteína de fusión que incluye uno de los péptidos de la invención junto con uno o varios de un rótulo de purificación, un rótulo de solubilidad o un segundo péptido de acuerdo con la invención.
La invención se refiere a una composición que incluye uno o varios péptidos de acuerdo con la invención o una proteína de fusión de acuerdo con la invención y un portador.
La invención se refiere además a un método para impartir resistencia a la enfermedad a plantas. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado de acuerdo con la invención, una proteína de fusión de acuerdo con la invención o una composición de acuerdo con la invención a una planta o semilla de planta, en donde dicha aplicación es efectiva para impartir resistencia a la enfermedad.
También se divulga un método para mejorar el crecimiento de la planta. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado, una proteína de fusión a una planta o semilla de planta o el locus donde la planta crece o se espera que crezca, en donde dicha aplicación es efectiva para mejorar el crecimiento de las plantas.
También se divulga un método para incrementar la tolerancia y la resistencia de una planta a estresores bióticos. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado, una proteína de fusión, o una composición a una planta o semilla de planta o el locus donde la planta crece o se espera que crezca, en donde dicha aplicación es efectiva para incrementar la tolerancia y la resistencia de una planta a factores de estrés biótico seleccionados del grupo que consiste en plagas tales como insectos, arácnidos, nematodos, malezas y combinaciones de ellos.
También se divulga un método para incrementar la tolerancia de una planta un estrés abiótico. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado, una proteína de fusión o una composición a una planta o semilla de planta o el locus donde la planta crece o se espera que crezca, en donde dicha aplicación es efectiva para incrementar la tolerancia de la planta a factores de estrés abiótico seleccionados del grupo que consiste en estrés por sal, estrés por agua (incluyendo sequía e inundación), estrés por ozono, estrés por metales pesados, estrés por frío, estrés por calor, estrés nutricional (deficiencia de fosfato, potasio, nitrógeno), blanqueo y estrés fotoinducido y combinaciones de ellos.
También se divulga un método para impartir resistencia a la desecación a esquejes retirados de plantas ornamentales. Este método incluye: aplicación de un péptido aislado, una proteína de fusión o una composición a una planta o el locus donde crece la planta, en donde dicha aplicación es efectiva para impartir resistencia a la desecación a esquejes retirados de la planta ornamental.
También se divulga un método para impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación poscosecha a una fruta u hortaliza. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado, una proteína de fusión o una composición a una planta que contiene una fruta o una hortaliza o el locus donde crece la planta; o aplicar una cantidad efectiva del péptido aislado o la composición a una fruta u hortaliza cosechada, en donde dicha aplicación es efectiva para impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a la fruta u hortaliza.
También se divulga un método para mejorar la longevidad de la maduración de la fruta u hortaliza. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado, una proteína de fusión o una composición a una planta que contiene una fruta o una hortaliza o el locus donde crece la planta; o aplicar una cantidad efectiva del péptido aislado o la composición a una fruta u hortaliza cosechada, en donde dicha aplicación es efectiva para mejorar la longevidad de la maduración de la fruta u hortaliza.
También se divulga un método para modular uno o varios procesos de señalización biológica de una planta. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado, una proteína de fusión o una composición a una planta o el locus donde crece la planta, en donde dicha aplicación es efectiva para la modulación de uno o varios procesos de señalización bioquímicos.
La invención se refiere además a un constructo de ADN incluyendo una primera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo la invención o una proteína de fusión de acuerdo con la invención; y una molécula de ácido nucleico efectivo de promotor operativamente acoplada con la primera molécula de ácido nucleico. Este aspecto de la invención también comprende un vector de expresión recombinante que contiene el constructo de ADN, una célula huésped recombinante que contiene el constructo de ADN, así como plantas transgénicas o semillas de plantas que incluyen una célula de planta recombinante de la invención (que contiene el constructo de ADN).
La invención se refiere además a un método para impartir resistencia a la enfermedad a plantas,. Este método incluye proporcionar una planta transgénica transformada con un constructo de ADN de acuerdo con la invención; y cultivar la planta en condiciones efectivas para permitir que el constructo de ADN exprese el péptido o el polipéptido de fusión imparta resistencia a la enfermedad, mejorar el crecimiento de la planta, impartir tolerancia al estrés biótico, impartir tolerancia a estrés abiótico o modular la señalización bioquímica a la planta transgénica.
También se divulga un método para impartir resistencia a la desecación a esquejes retirados de plantas ornamentales, impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la resistencia a la desecación poscosecha a una fruta u hortaliza o mejorar la longevidad de la maduración de la fruta u hortaliza. El método incluye proporcionar una planta transgénica transformada con un constructo de ADN incluyendo una primera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido o una proteína de fusión; y cultivar la planta en condiciones efectivas para permitir que el constructo de ADN exprese el péptido o el polipéptido de fusión imparta resistencia a la desecación a esquejes removed de una planta ornamental transgénica, impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a una fruta u hortaliza retirada de la planta transgénica o mejorar la longevidad de la maduración para una fruta u hortaliza retirada de la planta transgénica.
La invención se refiere además a un método para impartir resistencia a la enfermedad a plantas. Este método incluye proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con un constructo de ADN de acuerdo con la invención; plantar la semilla de planta transgénica en el suelo; y propagar una planta transgénica de la semilla de planta transgénica para permitir que el constructo de ADN exprese el péptido o el polipéptido de fusión para impartir resistencia a la enfermedad.
También se divulga un método para impartir resistencia a la desecación a esquejes retirados de plantas ornamentales, impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la resistencia a la desecación poscosecha a una fruta u hortaliza o mejorar la longevidad de la maduración de la fruta u hortaliza. El método incluye proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con un constructo de ADN; plantar la semilla de planta transgénica en el suelo; y propagar una planta transgénica de la semilla de planta transgénica para permitir que el constructo de ADN exprese el péptido o el polipéptido de fusión para impartir resistencia a la desecación a esquejes removed de una planta ornamental transgénica, impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a una fruta u hortaliza retirada de la planta transgénica o mejorar la longevidad de la maduración para una fruta u hortaliza retirada de la planta transgénica.
Proporcionando péptidos que inducen la HR que exhiben mayor solubilidad, estabilidad, resistencia a degradación química o una combinación de estas propiedades, los agricultores lograrán con mayor flexibilidad la preparación, manipulación y suministro a plantas en sus campos o invernaderos de cantidades efectivas de composiciones que contienen estos péptidos inductores de la HR. La simplificación del proceso de aplicación para agricultores llevará a un mayor cumplimiento y, así, mejores resultados con respecto a una o varias de resistencia a la enfermedad, mejora del crecimiento, tolerancia y resistencia a estresores bióticos, tolerancia a estrés abiótico, resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas. Estos y otros beneficios se describen en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en agua desionizada. Los siguientes péptidos se muestran: P1 (SEQ ID NO: 4); P1-18A (Se Q ID NO: 44); P1-18K (SEQ ID NO: 45); y P1-18T (Se Q ID NO: 42). La curva para 1* se normaliza al 100% de P1 en el punto temporal del día 1; 1** es la fecha original P1.
La Figura 2 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de citrato, pH 5,6. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18k y P1-18T. La curva para 1* se normaliza al 100% de P1 en el punto temporal del día 1; 1** es la fecha original P1.
La Figura 3 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de MES, pH 6. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18K y P1-18T. La curva para 1* se normaliza al 100% de P1 en el punto temporal del día 1; 1** es la fecha original P1.
La Figura 4 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de MOPS, pH 6,5. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18<k>y P1-18T
La Figura 5 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de citrato, pH 7,2. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18K y P1-18T.
La Figura 6 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de EDDS, pH 7,3. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18<k>y P1-18T.
La Figura 7 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de imidazol, pH 7,5. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18K y P1-18T
La Figura 8 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de EDTA, pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18k y P1-18T
La Figura 9 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en fosfato, pH 8,0. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18K y P1-18T
La Figura 10 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P1 y P1 disueltos en 50 mM de TES, pH 8,0. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18<k>y P1-18T
La Figura 11 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en agua desionizada. Los siguientes péptidos se muestran: P1, P1-18A, P1-18K y P1-18T
La Figura 12 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de citrato, pH 5,6. Los siguientes péptidos se muestran: P4 (SEQ ID NO: 5); P4-14A (SEQ ID NO: 136); P4-14D (SEQ ID NO: 137); P4-14K (SEQ ID NO: 138); P4-14Q (SEQ ID NO: 139); y P4-14S (SEQ ID NO: 6).
La Figura 13 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de MES, pH 6. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, P4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S. La Figura 14 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de MOPS, pH 6,5. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A,<p>4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S.
La Figura 15 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de citrato, pH 7,2. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A,<p>4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S.
La Figura 16 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de EDDS, pH 7,3. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, p4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S.
La Figura 17 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de imidazol, pH 7,5. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, P4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S.
La Figura 18 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de EDTA, pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, P4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S. La Figura 19 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en fosfato, pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, P4-14D, P4-14k , P4-14Q y P4-14S. La Figura 20 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en 50 mM de TES, pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, P4-14D, P4-14K, P4-14Q y P4-14S. La Figura 21 muestra una comparación de la estabilidad de mutantes de péptido P4 y P4 disueltos en el 30% de isopropanol, 5 mM de DTPA, 0,5% de tiosulfato de sodio y 50 mM de TES pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P4, P4-14A, P4-14D, P4-14K, P4-14Qy P4-14S
La Figura 22 muestra una comparación de la estabilidad de varios péptidos disueltos en 50 mM de TES pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P1 (SEQ ID NO: 4); P4-14S (SEQ ID NO: 6); P1-1S (SEQ ID NO: 109); P1-14S (SEQ ID NO: 110); P1-18Q (SEQ ID NO: 115); y P1-23P (SEQ ID NO:118).
La Figura 23 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de péptido P18 (SEQ ID NO: 83) disueltos ya sea en MES pH 6, MOPS pH 6,5, EDDS pH 7,3, imidazol pH 7,5 o EDTA pH 8.
La Figura 24 muestra un ensayo de solubilidad y estabilidad de mutantes de péptido P18 y P18 disueltos en 50 mM de EDTA, pH 8. Los siguientes péptidos se muestran: P18 (SEQ ID NO: 83), P18-1 (SEQ ID NO: 163) y P18-4 (SEQ ID NO: 164).
La Figura 25 muestra un ensayo de estabilidad de péptido P19 (SEQ ID NO: 89) y P19-20L (SEQ ID NO: 90) mutant disueltos en 50 mM de citrato, pH 7,2.
La Figura 26 muestra un ensayo de estabilidad de mutantes de péptido P19 (SEQ ID NO: 89) y P19-20L (SEQ ID NO: 90) disueltos en 50 mM de TES, pH 8,0.
Descripción detallada
La invención se refiere a nuevos péptidos que poseen la capacidad de inducir una respuesta de hipersensibilidad en plantas y promover las respuestas de plantas activas que dan uno o varios de los siguientes atributos: resistencia a la enfermedad, mejora del crecimiento, tolerancia y resistencia a estresores bióticos, tolerancia a estrés abiótico, resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas.
Como se usa en la presente, los aminoácidos naturales se identifican aquí por medio de las abreviaturas convencionales de tres letras y/o una letra, correspondientes al nombre trivial del aminoácido, de acuerdo con la siguiente lista: Alanina (Ala, A), Arginina (Arg, R), Asparagina (Asn, N), Ácido aspártico (Asp, D), Cisteína (Cys, C), Ácido glutámico (Glu, E), Glutamina (Gln, Q), Glicina (Gly, G), Histidina (His, H), Isoleucina (Ile, I), Leucina (Leu, L), Lisina (Lys, K), Metionina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Prolina (Pro, P), Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Triptófano (Trp, W), Tirosina (Tyr, Y) y Valina (Val, V). Las abreviaturas son aceptadas en el arte de los péptidos y son recomendadas por la comisión IUPAC-IUB en la nomenclatura bioquímica. Las variaciones naturales de los aminoácidos incluyen, sin limitación, gamma-glutamato (g-Glu) y isoaspartato (iso-Asp o isoD).
El término “aminoácido” también incluye análogos, derivados y congéneres de cualquier aminoácido específico mencionado en la presente, así como derivados de aminoácidos protegidos C-terminales o N-terminales (por ejemplo, modificados con un grupo protector N-terminal, C-terminal o de cadena lateral, incluyendo, pero sin limitación, acetilación, formilación, metilación, amidación, esterificación, PEGilación y adición de lípidos. Los aminoácidos no naturales son bien conocidos y pueden ser introducidos en los péptidos de la presente invención usando síntesis en fase sólida como se describe más abajo. Por otra parte, el término “aminoácido” incluye los aminoácidos D como L. Así, un aminoácido que se identifica en la presente por su nombre, símbolo de tres letras o de una letra y no se identifica específicamente como por tener configuración D o L, se entiende que asume cualquiera de las configuraciones D o L. En una forma de realización, un péptido comprende todos los aminoácidos L.
En determinadas formas de realización, los péptidos se identifican por “consistir en” una secuencia mencionada, en cuyo caso el péptido incluye sólo la secuencia de aminoácidos mencionada(s) sin aminoácidos extraños en sus extremos N -o C-terminales. En la medida en que una secuencia mencionada esté en la forma de una secuencia consenso donde uno o varios de los residuos X o Xaa denotados puede ser cualquiera de uno o varios aminoácidos, entonces están comprendidas múltiples secuencias peptídicas por un péptido que consiste en tal secuencia mencionada.
En otras determinadas formas de realización, los péptidos se identifican para “consistir esencialmente en” una secuencia mencionada, en cuyo caso el péptido incluye la secuencia de aminoácidos mencionada(s) opcionalmente con uno o varios aminoácidos extraños en sus extremos N y/o C-terminales, aminoácidos extraños que no alteran materialmente una o varias de las siguientes propiedades: (i) la capacidad del péptido de inducir una respuesta de hipersensibilidad en plantas, (ii) solubilidad del péptido en agua o soluciones acuosas, (iii) estabilidad del péptido disuelto en agua o solución acuosa a 50 °C durante un período de tiempo (por ejemplo, 3 semanas) y (iv) resistencia del péptido a degradación química en presencia de una solución tamponada acuosa que incluye un agente biocida (por ejemplo, Proxel®GXL) a 50 °C durante un período de tiempo (por ejemplo, 3 semanas).
En resumen, la estabilidad y resistencia a degradación química de péptidos puede ser evaluada de la siguiente manera, usando muestras de péptido que tienen una pureza inicial de al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 96% o al menos aproximadamente el 98%. Para la estabilidad en agua, el péptido se disuelve directamente en agua desionizada. Para ensayos de degradación química, el péptido se disuelve en una solución acuosa que contiene 50 mM de tampones de pH y 0,25% de Proxel GXL. Los tampones de pH de ejemplo incluyen, sin limitación: (i) Citrato pH 5,6; (ii) MES pH 6,2; (iii) MOPS pH 6,5; (iv) imidazol pH 7,0; (v) Citrato pH 7,2; (vi) EDDS, pH 7,3; (vii) EDTA pH 8,0; (viii) fosfato de sodio pH 8,0; o (ix) TES pH 8,0. Los péptidos se disuelven primero en la solución acuosa a una concentración de 0,5 mg/ml. Las muestras se incuban a 50 °C para permitir una degradación acelerada. Una muestra inicial del péptido se remueve, se diluye 10x con agua y se analiza por HPLC en fase inversa. En resumen, se inyectan 20 |il de la muestra en el flujo de solvente un instrumento de HPLC y analizan en un columna C18 de HPLC (YMC ProPack C18, YMC, Japan o C18 Stablebond, Agilent Technologies, Estados Unidos) usando ya sea un fosfato de trietilamina en gradiente de agua/acetonitrilo o 0,1% de TFA en agua/0,1% de TFA en gradiente de acetonitrilo para separar diferentes especies de péptido. La elución de péptidos se controla por absorbancia UV a 218 nm y se cuantifica en base al área debajo del pico. El área debajo del pico para la muestra de péptido inicial se trata como estándar para la cuantificación relativa en posteriores corridas. A intervalos regulares (por ejemplo, 1, 3, 7, 10, 14, 17 y 21 días), cada muestra de péptido se inspecciona y se analiza por HPLC como se describió con anterioridad. Si es necesario observar la degradación (es decir, donde el péptido exhibe un alto grado de estabilidad química), este protocolo puede ser extendido durante varias semanas para observar la degradación. La cuantificación de posteriores corridas de péptido se expresa como un porcentaje del resultado de HPLC original (día 0).
Un péptido que es al menos parcialmente soluble en agua o solución acuosa exhibe una solubilidad de más de 0,1 mg/ml, con preferencia, de al menos aproximadamente 1,0 mg/ml, de al menos aproximadamente 2,0 mg/ml, de al menos aproximadamente 3,0 mg/ml o de al menos aproximadamente 4,0 mg/ml. En determinadas formas de realización, el péptido exhibe alta solubilidad en agua o solución acuosa, con una solubilidad de al menos aproximadamente 5,0 mg/ml, de al menos aproximadamente 10,0 mg/ml, de al menos aproximadamente 15,0 mg/ml o de al menos aproximadamente 20 mg/ml.
Un péptido que es estable en agua o solución acuosa exhibe al menos aproximadamente el 66%, al menos aproximadamente el 68%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 72%, al menos aproximadamente el 74%, al menos aproximadamente el 76%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 88% o al menos aproximadamente el 90% de la concentración del péptido original durante el período de tiempo designado incubado a 50 °C. En determinadas formas de realización, el período de tiempo designado es de 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, un mes, dos meses o tres meses.
Un péptido que es resistente a degradación química exhibe al menos aproximadamente el 66%, al menos aproximadamente el 68%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 72%, al menos aproximadamente el 74%, al menos aproximadamente el 76%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 88% o al menos aproximadamente 90% de la concentración del péptido original durante el período de tiempo designado incubado a 50 °C. En determinadas formas de realización, el período de tiempo designado es de 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, un mes, dos meses o tres meses.
Una propiedad de un péptido para inducir una respuesta de hipersensibilidad o no, después de la infiltración o aplicación del péptido a tejidos de planta puede ser medida aplicando el péptido en forma de polvo seco o en forma de solución a una planta, en particular pero no exclusivamente una hoja de planta. Las tasas de aplicación incluyen 1-500 ug/ml para la solución líquida y 0,0001 - 0,5% (p/p para aplicación de polvo). La aplicación de ejemplo del péptido en forma de solución se describe en los ejemplos acompañantes. Las plantas son consideradas HR-positivas (“HR+”) si exhiben una muerte celular macroscópica ampliamente difundida visible a simple vista, acompañada por marchitamiento y amarronado del tejido afectado en un lapso de 48 horas. Las plantas son consideradas HR-negativas (“HR-”) si no exhiben marchitamiento discernible o muerte de tejido observable a simple vista.
En determinadas formas de realización, alteración del material de las una o varias propiedades pretende significar que hay menos del 20% de variación, menos del 15% de variación, menos del 10% de variación o menos del 5% de variación en una propiedad mencionada cuando se compara con un péptido que posee los uno o varios aminoácidos extraños con un péptido idéntica de otro modo que carece de los uno o varios aminoácidos extraños. En determinadas formas de realización, la cantidad de aminoácidos extraños en los extremos N - o C-terminales es de hasta 3 aminoácidos. Además, en la medida en que una secuencia mencionada esté en la forma de una secuencia consenso donde uno o varios de los residuos X o Xaa denotados pueden ser cualquiera de uno o varios aminoácidos, entonces múltiples secuencias peptídicas están comprendidas por el péptido que consiste esencialmente en tal secuencia mencionada, sin tener en cuenta variaciones adicionales de tales secuencias que se logran por medio de la presencia de aminoácidos extraños en sus extremos N y/o C-terminales.
En diversas formas de realización de la invención, los péptidos revelados pueden incluir una secuencia de aminoácidos hidrofílicos, en el extremo N-terminal de una secuencia de péptidos designada. La secuencia de aminoácidos hidrofílica tiene una longitud de al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos e incluye residuos de aminoácidos que contribuyen con una propiedad hidrofílica de la secuencia de aminoácidos que es adyacente a la secuencia de aminoácidos del péptido designado (es decir, el péptido que induce una respuesta activa de la planta). Se han usado diferentes métodos en el arte para calcular la hidrofobicidad/hidrofilicidad relativa de residuos de aminoácidos y proteínas (Kite et al., “A Simple Method for Displaying the Hydropatic Character of a Protein”, J. Mol. Biol. l57: 105-32 (1982); Eisenberg D, “Three-dimensional Structure of Membrane and Surface Proteins”, Ann. Rev. Biochem.
53: 595-623 (1984); Rose et al., “Hydrogen Bonding, Hydrofobicity, Packing and Protein Folding”, Annu. Rev. Biomol. Struct. 22: 381-415 (1993); Kauzmann, “Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation”, Adv. Protein Chem. 14: 1-63 (1959)). Cualquiera de estas escalas de hidrofobicidad puede ser usada a los fines de la presente invención; sin embargo, la escala de hidrofobicidad de Kite-Doolittle es quizá la escala más mencionada. Estas escalas de hidropatía proporcionan una lista de clasificación para la hidrofobicidad relativa de residuos de aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos que contribuyen con la hidrofilicidad incluyen Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) y His (H) así como, aunque en menor medida, Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y) y Trp (W). Por ejemplo, las secuencias de poliglutamato se pueden usar para mejorar la solubilidad de proteínas y otras moléculas farmacológicas (Lilie et al, Biological Chemistry 394(8):995-1004(2013); Li et al., Cancer Research 58: 2404-2409(1998))).
El “ índice de hidropatía” de una secuencia de proteínas o aminoácidos es un número que representa sus propiedades hidrofílicas o hidrofóbicas promedio. Un índice de hidropatía negativo define la hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de interés. El índice de hidropatía es directamente proporcional a la hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de interés; así, cuando más negativo el índice, mayor será la hidrofilicidad. En determinadas formas de realización, la secuencia de aminoácidos hidrofílica añadida descrita con anterioridad tiene un índice de hidropatía de menos de 0, -0,4, -0,9, -1,3, -1,6, -3,5, -3,9 o -4,5. En determinadas formas de realización, todo el péptido resultante tendrá un índice de hidropatía de menos de 0,3, 0,2, 0,1 o 0,0, con preferencia, menos de -0,1, -0,2, -0,3, -0,4, con mayor preferencia, menos de -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9 o -1,0.
En los péptidos de la presente invención, los aminoácidos que contribuyen con un índice de hidropatía hidrofílica, para cada péptido como un todo o la secuencia de aminoácidos hidrofílica añadida, incluyen Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), His (H), Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y) y Trp (W). De ellos, se prefieren Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) o sus variantes. Las variantes de ejemplo incluyen g-glutamato para Glu y ácido isoaspártico (o isoD) para Asp.
Como se usa en la presente, en este y en otros aspectos de la invención, la expresión “aminoácido hidrofóbico” pretende referirse a un aminoácido que contribuye la hidrofobicidad con el índice de hidropatía de una secuencia de aminoácidos designada. Los aminoácidos que contribuyen con un índice de hidropatía hidrofóbica, para cada péptido como un todo o una de sus secuencias de aminoácidos particular, incluyen Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), Cys (C), Met (M) y Ala (A). En determinadas formas de realización, la expresión “aminoácido hidrofóbico” se puede referir a cualquiera de Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), Cys (C), Met (M) y Ala (A); o, alternativamente, a cualquiera de Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F) y Ala (A). En otras determinadas formas de realización, la expresión “aminoácido hidrofóbico” se puede referir a uno de Ile (I), Val (V), Leu (L) y Phe (F).
Como se usa en la presente, la expresión “aminoácido no hidrofóbico” pretende significar un aminoácido que es hidrofílico (o no hidrofóbico) en una de las escalas de hidrofobicidad antes identificadas. Este término se refiere en general a aquellos aminoácidos que contribuyen con un índice de hidropatía hidrofílico para cada péptido como un todo o la secuencia de aminoácidos hidrofílica añadida.
Se divulga un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de:
(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/A)-X-X-(L/I)-(L/I/V/F) (SEQ ID NO: 93) en donde el péptido está libre de cisteína y metionina; cada X en las posiciones 2 y 6 es opcional y, de estar presente, es cualquier aminoácido, incluyendo cualquier aminoácido natural; y cada X en las posiciones 3, 7, 10 y 11 es cualquier aminoácido, incluyendo cualquier aminoácido natural.
En un aspecto relacionado de la invención, el péptido incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 (mostrada con anterioridad), en donde el péptido está libre de cisteína y metionina; cada X en las posiciones 2, 6 y 10 es opcional y, de estar presente, es cualquier aminoácido, incluyendo cualquier aminoácido natural; y cada X en las posiciones 3, 7 y 11 es cualquier aminoácido, incluyendo cualquier aminoácido natural.
De acuerdo con una forma de realización, una o varias de X en las posiciones 2, 6 y 10 no está presente (es decir, la brecha entre el primer aminoácido hidrofóbico y el primer doblete de aminoácido hidrofóbico se reduce de dos a un residuo de aminoácido y/o la brecha entre el primer y el segundo doblete de aminoácido hidrofóbico se reduce de dos a un residuo de aminoácido y/o la brecha entre el segundo y el tercer doblete de aminoácido hidrofóbico se reduce de dos a un residuo de aminoácido). En esta forma de realización, se contempla que estos péptidos excluyan el aminoácido en sólo una de las posiciones 2, 6 y 10.
En una forma de realización alternativa, X en las posiciones 2 y 6 está presente (es decir, la brecha entre los aminoácidos hidrofóbicos se mantiene en dos residuos de aminoácidos en ambas ubicaciones).
En otra forma de realización, X en cada una de las posiciones 2, 6 y 10 está presente (es decir, la brecha entre los aminoácidos hidrofóbicos se mantiene en dos residuos de aminoácidos en cada ubicación).
En determinadas formas de realización, SEQ ID NO: 93 también puede incluir un residuo de aminoácido adicional entre los dobletes hidrofóbicos (dos de L/I/V/F/A, como se indicó) y el aminoácido adicional puede ser cualquier aminoácido. En tese formas de realización, la brecha antes del primer doblete hidrofóbico es de tres aminoácidos, la brecha entre el primer y el segundo doblete hidrofóbico es de tres aminoácidos, la brecha entre el segundo y el tercer doblete hidrofóbico es de tres aminoácidos o combinaciones de ellos.
La longitud del péptido en esta forma de realización es de menos de 100 aminoácidos o alternativamente, de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, la longitud del péptido está entre 13 y aproximadamente 50 aminoácidos.
En las formas de realización descritas con anterioridad, donde X en cada una de las posiciones 2, 3, 6, 7, 10 y 11 (de estar presente) de SEQ ID NO: 93 puede ser cualquier aminoácido, en determinadas formas de realización, estos residuos son hidrofílicos por naturaleza. Como se describió con anterioridad, estos aminoácidos hidrofílicos incluyen Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), His (H), Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y) y Trp (W). De ellos, se prefieren Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) o sus variantes. Las variantes de ejemplo incluyen g-glutamato para Glu y ácido isoaspártico (o isoD) para Asp.
En esta forma de realización, el péptido aislado es estable cuando se disuelve en agua; resistente a degradación química en condiciones acuosas en presencia de un tampón de pH y un biocida, como se describió con anterioridad; y/o tiene una solubilidad en una solución acuosa de al menos aproximadamente 1,0 mg/ml. También se divulga un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
XXGISEKXXXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 1, P1/P4 consenso), en donde
X en la posición 1 es opcional y puede ser S, N, D, isoD, G, A o S;
X en la posición 2 es opcional y puede ser Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 9 es L, I, F o V;
X en la posición 10 es opcional y puede ser D o isoD;
X en la posición 11 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 12 es M, L, I o F;
X en la posición 13 es M, L o I;
X en la posición 14 es opcional y puede ser cualquier aminoácido hidrofílico, con preferencia, C, S, T, A, D, isoD, K o Q;
X en la posición 15 es Q, E, g-glutamato, G, A, S, K o I;
X en la posición 16 es M, L, I, V o F;
X en la posición 17 es M, L, I, A o V;
X en la posición 18 es Q, E, g-glutamato, G, A, S, M, T o K;
X en la posición 19 es A, D, isoD, S, V, T, K, R, E, g-glutamato, H o G;
X en la posición 20 es M, L o I;
X en la posición 21 es M, L, I, V, S o F;
X en la posición 22 es Q, E, g-glutamato, G, A, S;
X en la posición 23 es P, Q, E, g-glutamato, G, A o S; y
en donde el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje.
En determinadas formas de realización, estos péptidos de acuerdo con el segundo aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes.
En esta forma de realización, la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje, a los fines de comparar las propiedades del péptido, es un polipéptido que comprende o el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de NQGISEKQLDQLLTQLIMALLQQ (P1, SEQ ID NO: 4) o SQGISEKQLDQLLCQLIQALL (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 5, P4). P1 (SEQ ID NO: 4) se deriva de la proteína de largo total de Xanthomonas harpin HpaG (Kim et al., “Mutational Analysis of Xanthomonas Harpin HpaG Identifies a Key Functional Region That Elicits The Hypersensitive Response in Nonhost Plants”, J. Bacteriol. 186(18):6239-6247 (2004)). P4 (SEQ ID NO: 5) se deriva de la harpina de longitud total de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ji et al., “Two Coiled-Coil Regions of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Harpin Differ in Oligomerization and Hypersensitive Response Induction”, Amino Acids 40:381-392 (2011)).
En esta forma de realización, el péptido aislado es estable cuando se disuelve en agua; resistente a degradación química en condiciones acuosas en presencia de un tampón de pH y un biocida, como se describió con anterioridad; y/o tiene una solubilidad en una solución acuosa de al menos aproximadamente 1,0 mg/ml. La longitud de péptidos de acuerdo con este segundo aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, la longitud del péptido es de entre 23 y aproximadamente 50 aminoácidos.
Una familia de péptidos de ejemplo de acuerdo con el segundo aspecto tiene la secuencia de aminoácidos de: SXGISEKXXDXXXXXXXXAXXXP (SEQ ID NO: 2, P4 consenso), en donde
X en la posición 2 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 9 es L, A, D, isoD, I, V o F;
X en la posición 11 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 12 es L, D, isoD, I o F;
X en la posición 13 es L, I, V o F;
X en la posición 14 es cualquier aminoácido hidrofílico, con preferencia, C, S o T, S o T o sólo S;
X en la posición 15 es Q, E, g-glutamato, G, A, S, K o I
X en la posición 16 es L, A, I, V, M o F
X en la posición 17 es I, S o F
X en la posición 18 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 20 es L, I, V o F;
X en la posición 21 es L o F; y
X en la posición 22 es Q, E, g-glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, estos péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Así, en tese formas de realización, X en la posición 14 es S o T, con preferencia, S.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NO: 2 o se derivan de SEQ ID NO: 2 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1: Variantes peptídicas de Péptido P4 (SEQ ID NO: 5)
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: P4 SQGISEKQLDQLLCQLIQALLQP 5
P4-14s SQGISEKQLDQLLSQLIQALLQP 6
P4-14s-18e SEGISEKQLDQLLSQLIEALLQP 191 P4-14s-18s SQGISEKQLDQLLSQLISALLQP 7
P4-14s-2,18e SEGISEKQLDQLLSQLIEALLQP 8
P4-2e-8e SEGISEKELDQLLSQLIQALLQP 9
P4-2e-8e-15e SEGISEKELDQLLSELIQALLQP 10 P4-allE SEGISEKELDELLSELIEALLQP 11 P4-14s-9i SQGISEKQIDQLLSQLIQALLQP 196 P4-14s-9v SQGISEKQVDQLLSQLIQALLQP 19 P4-14s-9f SQGISEKQFDQLLSQLIQALLQP 20 P4-14s-12i SQGISEKQLDQILSQLIQALLQP 22 P4-14s-12f SQGISEKQLDQFLSQLIQALLQP 23 P4-14s-13i SQGISEKQLDQLISQLIQALLQP 24 P4-14s-15a SQGISEKQLDQLLSALIQALLQP 27 P4-14s-15k SQGISEKQLDQLLSKLIQALLQP 28 P4-14s-15s SQGISEKQLDQLLSSLIQALLQP 29 P4-14s-15i SQGISEKQLDQLLSILIQALLQP 30 P4-14s-16i SQGISEKQLDQLLSQIIQALLQP 32 P4-14s-16f SQGISEKQLDQLLSQFIQALLQP 34 P4-14s-20i SQGISEKQLDQLLSQLIQAILQP 37 P4-14s-21f SQGISEKQLDQLLSQLIQALFQP 40 P4-14s-dN6KQLDQLLSQLIQALLQP 94 P4-14s-dN5EKQLDQLLSQLIQALLQP 95 P4-14s-dN4SEKQLDQLLSQLIQALLQP 96 P4-14s-dN2GISEKQLDQLLSQLIQALLQP 97 P4-14s-3E SQEISEKQLDQLLSQLIQALLQP 98 P4-14S-4L SQGLSEKQLDQLLSQLIQALLQP 99 P4-14S-4A SQGASEKQLDQLLSQLIQALLQP 100
Tabla 1 Cont.
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: P4 SQGISEKQLDQLLCQLIQALLQP 5
P4-14S-4D SQGDSEKQLDQLLSQLIQALLQP 101 P4-14s-5V SQGIVEKQLDQLLSQLIQALLQP 102 P4-14s-6R SQGISRKQLDQLLSQLIQALLQP 103 P4-14s-6V SQGISVKQLDQLLSQLIQALLQP 104 P4-14s-7D SQGISEDQLDQLLSQLIQALLQP 105 P4-14s-7V SQGISEVQLDQLLSQLIQALLQP 106 P4-14S-8V SQGISEKVLDQLLSQLIQALLQP 107 P4-14S-8S SQGISEKSLDQLLSQLIQALLQP 108 P4-14S-10V SQGISEKQLVQLLSQLIQALLQP 111 P4-14S-11V SQGISEKQLDVLLSQLIQALLQP 112 P4-14S-12V SQGISEKQLDQVLSQLIQALLQP 113 P4-14S-12S SQGISEKQLDQSLSQLIQALLQP 114 P4-14S-14V SQGISEKQLDQLLVQLIQALLQP 116 P4-14S-15V SQGISEKQLDQLLSVLIQALLQP 117 P4-14s-17L SQGISEKQLDQLLSQLLQALLQP 119 P4-14s-17A SQGISEKQLDQLLSQLAQALLQP 120 P4-14s-17V SQGISEKQLDQLLSQLVQALLQP 121 P4-14S-18V SQGISEKQLDQLLSQLIVALLQP 122 P4-14S-19V SQGISEKQLDQLLSQLIQVLLQP 123 P4-14S-19D SQGISEKQLDQLLSQLIQDLLQP 124 P4-14S-19S SQGISEKQLDQLLSQLIQSLLQP 125 P4-14S-21S SQGISEKQLDQLLSQLIQALSQP 127 P4-14S-211 SQGISEKQLDQLLSQLIQALIQP 128 P4-14S-21V SQGISEKQLDQLLSQLIQALVQP 129
P4-14S-22V SQGISEKQLDQLLSQLIQALLVP 130
P4-14S-dC2 SQGISEKQLDQLLSQLIQALL131
p4-d10 SQGISEKQL_QLLSQLIQALLQP 132
p4-d14 SQGISEKQLDQLL_QLIQALLQP 133
P4-14A SQGISEKQLDQLLAQLIQALLQP 136
p4-14D SQGISEKQLDQLLDQLIQALLQP 137
P4-14K SQGISEKQLDQLLKQLIQALLQP 138
P4-14Q SQGISEKQLDQLLQQLIQALLQP 139
p4-i9A SQGISEKQALDQLLSQLIQALLQP 140
polyE-minp4 SEEEEELDQLLSQLIQALLQP 232
polyE-min2p4 SEEEEELDQLLSQLIQALLQ 31
polyE-min3P4 SEEEEELDQLLSQLIQALL 33
P4-NpolyR EERRRGGLDQLLSQUQALLQP 35
P4-CpolyR LDQLLSQUQALLQPGGEERRR 36
P4-NpolyK KKKKKGGLDQLLSQLIQALLQP 38
P4-CpolyK LDQLLSQLIQALLQPG G K K K K K39
P4-7E-cR SQGISEEQLDQLLSQLIQALLQPR 194
minp4-PolyE LDQLLSQLIQALLEEEEE 192
SEE-minp4-EE SEELDQLLSQLIQALLEE 193
Los péptidos seleccionados en la Tabla 1 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE, SEE, EEEEE, EE, RRRRRGG, KKKKKGG, GGKKKKK y GGRRRRR. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 1 pero que carece de estos rótulos específicos de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Como se observó con anterioridad, el péptido P4 (SEQ ID NO: 5) se deriva de la harpina de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ji et al., “Two Coiled-Coil Regions of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Harpin Differ in Oligomerization and Hypersensitive Response Induction”, Amino Acids 40:381-392 (20l1)). Ji et al. revela un fragmento de esta harpina que tiene la secuencia de aminoácidos SQGISEKQLDQLLCQLIQALL (es decir, aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 5). En determinadas formas de realización, un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 es un péptido que tiene un largo general de menos de aproximadamente 100 aminoácidos (es decir, de 23 aminoácidos hasta aproximadamente 100 aminoácidos de largo). En otras determinadas formas de realización, el péptido aislado consiste esencialmente en SEQ ID NO: 5, mientras que en otra forma de realización el péptido aislado consiste en SEQ ID NO: 5.
Otra familia de péptidos de ejemplo de acuerdo con el segundo aspecto tiene la secuencia de aminoácidos de: XXGISEKXLDXLLTXLIXALLXX (SEQ ID NO: 3, P1 consenso), en donde
X en la posición 1 es N, D, isoD, G, A o S;
X en la posición 2 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 11 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 15 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 18 es M, T, K, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 22 es Q, E, g-glutamato, G, A o S; y
X en la posición 23 es Q, E, g-glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, estos péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Así, en esas formas de realización, X en la posición 18 es T, K, E, g -glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, los péptidos que comparten la estructura de SEQ ID NO: 3 tienen al menos uno de los residuos en las posiciones 2, 8, 11, 15, 22 y 23 de SEQ ID NO: 3 que son distinto de Gln (Q), es decir, being E, g-glutamato, G, A o S. En determinadas formas de realización, dos o más de los residuos en las posiciones 2, 8, 11, 15, 22 y 23 de SEQ ID NO: 3 son distintos de Gln (Q), incluyendo tes, cuatro, cinco o seis de estos residuos que son distintos de Gln (Q).
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NO: 3 o se derivan de SEQ ID NO: 3 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 2:
Tabla 2: Variantes peptídicas de Péptido P1 (SEQ ID NO: 4)
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO:
P1 NQGISEKQLDQLLTQLIMALLQQ 4
NEGISEKQLDQLLTQLIMALLQQ 41
P1-18T NQGISEKQLDQLLTQLITALLQQ 42
P1-18E NQGISEKQLDQLLTQLIEALLQQ 43
P1-18A NQGISEKQLDQLLTQLIAALLQQ 44
P1-18K NQGISEKQLDQLLTQLIKALLQQ 45
P1-2E,8E,11E,15E,18E NEGISEKELDELLTELIEALLQQ 46
P1-1S SQGISEKQLDQLLTQLIMALLQQ 109
P1-14S NQGISEKQLDQLLSQLIMALLQQ 110
P1-18Q NQGISEKQLDQLLTQLIQALLQQ 115
P1-23P NQGISEKQLDQLLTQLIMALLQP 118
poliE-minP1 SEEEEELDQLLTQLIEALLQQ 126
poliE-min2P1 SEEEEELDQLLTQLIEALLQ 134
poliE-min3P1 SEEEEELDQLLTQLIEALL 141
p1-allE-17A NEGISEKELDELLTELAEALLQQ 195
Los péptidos seleccionados en la Tabla 2 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 2 pero que carecen de este rótulo específico de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Como se observó con anterioridad, el péptido de SEQ ID NO: 4 se deriva de la harpina de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ji et al., “Two Coiled-Coil Regions of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Harpin Differ in Oligomerization and Hypersensitive Response Induction”, Amino Acids 40:381-392 (2011)).
También se divulga un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) KPXDSXSXIAKLISXLIXSLLX (SEQ ID NO: 47, P15b/P20 consenso), en donde
X en la posición 3 es N, D o isoD;
X en la posición 6 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 8 es N, D o isoD;
X en la posición 15 es opcional y puede ser cualquier aminoácido;
X en la posición 18 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; y
X en la posición 22 es opcional y puede ser Q, E, g-glutamato, G, A o S; o
(ii) IAKLISXLIXSLLX (SEQ ID NO: 12, P15/20 min consenso), en donde
X en la posición 7 es opcional y puede ser cualquier aminoácido;
X en la posición 10 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; y
X en la posición 14 es opcional y puede ser Q, E, g-glutamato, G, A o S.
En determinadas formas de realización, estos péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 47 o 12 también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Así, en esas formas de realización, X en la posición 15 de SEQ ID NO: 47 es distinto de M y X en la posición 18 de SEQ ID NO: 47 es E, g-glutamato, G, A, S, T o K. De modo similar, X en la posición 7 de SEQ ID NO: 12 es distinto de M y X en la posición 10 de SEQ ID NO: 47 es E, g-glutamato, G, A, S, T o K.
La longitud de péptidos de acuerdo con este tercer aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, el péptido es de entre 20 y 44 aminoácidos de largo.
En determinadas formas de realización, los péptidos que comparten la estructura de SEQ ID NO: 47 tienen al menos uno de los residuos en las posiciones 6 y 22 de SEQ ID NO: 47 que es distinto de Gln (Q), es decir, E, g-glutamato, G, A o S. En determinadas formas de realización, ambos residuos en las posiciones 6 y 22 de SEQ ID NO: 47 son distintos de Gln (Q) o el residuo en la posición 6 es distinto de Gln (Q) mientras que el residuo en la posición 22 está ausente.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NO: 47 o 12 o se derivan de uno de SEQ ID NOS: 47 y 12 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 3:
Tabla 3: Variantes peptídicas de Péptido P15/P20 consenso (SEQ ID NOS: 47 o 12)Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO:
Tipo salvaje QKDVNFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIMSLLQMLT 48
P15b KPNDSQSNIAKLISALIMSLLQ 49 P15b-8D-18E KPNDSQSDIAKLISALIESLLQ 50 P15b-8D-18A KPNDSQSDIAKLISALIASLLQ 51
P15b-8D-18S KPNDSQSDIAKLISALISSLLQ 52 P15b-8D-18T KPNDSQSDIAKLISALITSLLQ 53 P15b-8D-18K KPNDSQSDIAKLISALIKSLLQ 54 P15b-8D-6,18E KPNDSESDIAKLISALIESLLQ 55
P15b-3,8D KPDDSQSDIAKLISALIMSLLQ 56 P15b-3,8D-6E KPDDSESDIAKLISALIMSLLQ 57 P15b-3,8D-18E KPDDSQSDIAKLISALIESLLQ 58 P15b-3,8D-6,18E KPDDSESDIAKLISALIESLLQ 59 P15b-3,8D-allE KPDDSESDIAKLISALIESLLE 60 P15b-8D-allE KPNDSESDIAKLISALIESLLE 61
P15b-3D-allE KPDDSESNIAKLISALIESLLE 62
P15a NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIMSLLQM 63 P15a-34Q-39P NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIQSLLQP142 P15a-39P NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIMSLLQP143 P15a-34Q NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIQSLLQM 144
P15 KPNDSQSNIAKLISALIMSLLQM 64
P15-59G SEEEEEGGIAKLISALIESLLE 149 P15-59 SEEEEEIAKLISALIESLLE 150 P15-dn4 SQSNIAKLISALIMSLLQ 227
P20 GTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLIS_LIMSLL 65
P20-5 KPNDSQSNIAKLIS_LIMSLL 151
P20-6 KPNDSQSNIAKLIS LIESLL 152
Los péptidos seleccionados en la Tabla 3 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 3 pero que carecen de este rótulo específico de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
En esta forma de realización, la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje corresponde a los aminoácidos 52 a 96 de secuencia de Pseudomonas syringae HrpW identificada en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos, se prefiere que el polipéptido que comprende o el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 se use como una referencia.
En determinadas formas de realización, el péptido incluye una o varias mutaciones respecto a la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de SEQ ID NO: 48. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto a SEQ ID NO: 48. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de SEQ ID NO: 48. En esta forma de realización, el péptido aislado es estable cuando se disuelve en agua; resistente a degradación química en condiciones acuosas en presencia de un tampón de pH y un biocida, como se describió con anterioridad; y/o tiene una solubilidad en una solución acuosa de al menos aproximadamente 1,0 mg/ml.
En determinadas formas de realización, un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es un péptido que tiene un largo general entre 20 y 36 aminoácidos y consiste esencialmente en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 64, mientras que en otra forma de realización el péptido aislado consiste en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 64.
En determinadas formas de realización, un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es un péptido que tiene un largo general de menos de 100 aminoácidos y la secuencia de aminoácidos incluye SEQ ID NO: 65. En determinadas formas de realización la secuencia de aminoácidos del péptido consiste esencialmente en SEQ ID NO: 65, mientras que en otra forma de realización el péptido aislado consiste en SEQ ID NO: 65.
También se divulga un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) PSPXTXXLXXIVGXILXAXN (SEQ ID NO: 66, P6/6a consenso), en donde
X en la posición 4 es F o Y;
X en la posición 6 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 7 es opcional y, de acuerdo con una forma de realización, puede ser M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; o de acuerdo con otra forma de realización puede ser L;
X en la posición 9 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K;
X en la posición 10 es H o N;
X en la posición 14 es E, g-glutamato, D o isoD;
X en la posición 17 es Q, E, g-glutamato, G, A o S; y
X en la posición 19 es Q, E, g-glutamato, G, A o S; o
(ii) XTXXLXXIVGXIL (SEQ ID NO: 135, P6/6a min consenso), en donde
X en la posición 1 es F o Y;
X en la posición 3 es Q, E, g-glutamato, G, A o S;
X en la posición 4 es opcional y, de acuerdo con una forma de realización, puede ser M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K; o de acuerdo con otra forma de realización puede ser L;
X en la posición 6 es M, E, g-glutamato, G, A, S, T o K;
X en la posición 7 es H o N; y
X en la posición 11 es E, g-glutamato, D o isoD;
en donde el péptido aislado comprende una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad acuosa, estabilidad o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje.
Una secuencia de tipo salvaje comparativa corresponde a los aminoácidos 85-105 de la harpina de longitud total de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ji et al., “Two Coiled-Coil Regions of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Harpin Differ in Oligomerization and Hypersensitive Response Induction”, Amino Acids 40:381-392 (2011)). Esta secuencia de tipo salvaje comparativa es el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos PSPFTQMLMHIVGEILQAQNG (SEQ ID NO: 153).
En determinadas formas de realización, el péptido de acuerdo con este aspecto no consiste en la secuencia de aminoácidos de PSPFTQMLMHIVGEI<l>Q<a>QN (P6a, SEQ ID NO: 67), que corresponde a los aminoácidos 85-104 de la harpina de longitud total de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ji et al., “Two Coiled-Coil Regions of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae Harpin Differ in Oligomerization and Hypersensitive Response Induction”, Amino Acids 40:381-392 (2011)).
En determinadas formas de realización, el péptido de este aspecto no comprende el péptido secuencia del motivo 2 como se describe en la patente U. S. No. 8.440.881, que se define como (P/A/V)S(P/Q/A)(F/L/Y)TQ(M/A)LM(H/N/Q)IV(G/M)(E/D/Q), SEQ ID NO: 154. A modo de ejemplo, los péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 66 no incluyen los péptidos que tienen M/A/T en la posición 7 cuando todos los otros residuos de alineación coinciden con la secuencia del motivo 2; o péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 66 no incluyen los péptidos que tienen H/N en la posición 10 cuando todos los otros residuos de alineación coinciden con la secuencia del motivo 2; o péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 66 no incluyen los péptidos que tienen E/D en la posición 14 cuando todos los otros residuos de alineación coinciden con la secuencia del motivo 2. De modo similar, péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 135 no incluyen los péptidos que tienen M/A/T en la posición 4 cuando todos los otros residuos de alineación coinciden con la secuencia del motivo 2; o péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 135 no incluyen los péptidos que tienen H/N en la posición 7 cuando todos los otros residuos de alineación coinciden con la secuencia del motivo 2; o péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 135 no incluyen los péptidos que tienen E/D en la posición 11 cuando todos los otros residuos de alineación coinciden con la secuencia del motivo 2.
En determinadas formas de realización, el péptido incluye una o varias mutaciones respecto a la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de SEQ ID NO: 153. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto a SEQ ID NO: 153. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de s Eq ID NO: 153.
La longitud de péptidos de acuerdo con este aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, el péptido es de entre 19 y 50 aminoácidos de largo.
En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con la SEQ ID NOS: 66 y 135 también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Por ejemplo, en los péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 66 que están libres de residuos de aminoácido de metionina, X en la posición 7, de estar presente, es E, g-glutamato, G, A, S, T, K o L; y X en la posición 9 es E, g-glutamato, G, A, S, T o K. De modo similar, para péptidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 135 que están libres de residuos de aminoácido de metionina, X en la posición 4, de estar presente, es E, g-glutamato, G, A, S, T, K o L; y X en la posición 6 es E, g-glutamato, G, A, S, T o K. En determinadas formas de realización, los péptidos que comparten la estructura de SEQ ID NO: 66 tienen al menos uno de los residuos en las posiciones 6, 17 y 19 de SEQ ID NO: 66 que es distinto de Gln (Q), es decir, E, g-glutamato, G, A o S. En determinadas formas de realización, dos o tres de los residuos en las posiciones 6, 17 y 19 de SEQ ID NO: 66 son distintos de Gln (Q). De modo similar, para péptidos que comparten la estructura de SEQ ID NO: 135, de acuerdo con una forma de realización estos péptidos tienen el residuo en las posiciones 6 que es distinto de Gln (Q), es decir, E, g-glutamato, G, A o S.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NO: 66 o 135 o se derivan de uno de SEQ ID NOS: 66 y 135 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 4:
Tabla 4: Variantes peptídicas de Péptido P6/P6b consenso (SEQ ID NO: 66 o 135) Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: tipo salvaje PSPFTQMLMHIVGEILQAQNG 153
P6a PSPFTQMLMHIVGEILQAQN 67
P6 PSPFTQ_LMHIVGEILQAQN 68
P6a-7A PSPFTQALMHIVGEILQAQN 69
P6a-10N PSPFTQMLMNIVGEILQAQN 70
P6a-4Y PSPYTQMLMHIVGEILQAQN 71
P6a-14D PSPFTQMLMHIVGDILQAQN 72
P6a-7,9A PSPFTQALAHIVGEILQAQN 73
P6a-6E-7A PSPFTEALMHIVGEILQAQN 74
P6a-6,17E-7A PSPFTEALMHIVGEILEAQN 75
P6a-allE-7A PSPFTEALMHIVGEILEAEN 76
P6a-allE-4Y-7A PSPYTEALMHIVGEILEAEN 77
P6a-allE-7A-10N PSPFTEALMNIVGEILEAEN 78
P6a-allE-7A-14D PSPFTEALMHIVGDILEAEN 79
P6a-allE-4Y-7A-10N-14D PSPYTEALMNIVGDILEAEN 80
P6b FTQMLMHIVGEILQAQN 155
P6c PSPFTQMLMHIVGEIL 156
P6-7L PSPFTQLLMHIVGEILQAQN 157
P6-9E PSPFTQMLEHIVGEILQAQN 158
P6a-7L,9E PSPFTQLLEHIVGEILQAQN 159
P6d SEEEEEFTQMLMHIVGEIL 160
P6d-7L-9E SEEEEEFTQLLEHIVGEIL 161
p6a-dN3-sol SEEETQMLMHIVGEILQAQN 197
p6a-dC4-sol SEEEPSPFTQMLMHIVGEIL 198
Los péptidos seleccionados en la Tabla 4 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEE, SEEE y SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 4 pero que carece de estos rótulos específicos de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
La invención se refiere a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de:
(i) XXXXXXXXXXX(L/M)XXLLXXLLXXLLXXX (SEQ ID NO: 18, P17/18), en donde
X en la posición 1 opcional y, cuando está presente, es Q;
X en la posición 2 opcional y, cuando está presente, es Q;
X en la posición 3 opcional y, cuando está presente, es P o S;
X en la posición 4 opcional y, cuando está presente, es I, S o E;
X en la posición 5 opcional y, cuando está presente, es D, E o Q;
X en la posición 6 opcional y, cuando está presente, es R, S o E;
X de la posición 7 es opcional, y cuando está presente, es Q o E;
X en la posición 8 es opcional y, cuando está presente, es T o E;
X en la posición 9 es opcional y, cuando está presente, es I o E;
X en la posición 10 es opcional y, cuando está presente, es E o K;
X en la posición 11 es opcional y, cuando está presente, es Q o E;
X en la posición 13 es A;
X en la posición 14 es Q o E;
X en la posición 17 es A;
X en la posición 18 es Q o E;
X en la posición 21 es K o E;
X en la posición 22 es S;
X en la posición 25 es opcional y, cuando está presente, es S o E;
X en la posición 26 es opcional y, cuando está presente, es P o E; y
X en la posición 27 es opcional y, cuando está presente, es Q o E.
El péptido incluye una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Erwinia amylovora HrpW. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto de la secuencia HrpW de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Erwinia amylovora HrpW.
La solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al., identifica dos dominios que inducen una respuesta hipersensible de HrpWEa. El primero se extiende desde el aminoácido 5 hasta el aminoácido 64, en particular desde el aminoácido 31 hasta el aminoácido 57 de HrpWEa. El segundo dominio se extiende desde el aminoácido 103 hasta el aminoácido 146, en particular desde el aminoácido 116 hasta el aminoácido 140 de HrpWEa. A pesar de esta descripción en Fan et al., la referencia identifica sólo un fragmento de péptido simple de HrpWEa, que es el péptido que consiste en aminoácidos 10 a 59.
Una secuencia de tipo salvaje comparativa corresponde a los aminoácidos 10 a 59 de la secuencia de longitud total de Erwinia amylovora HrpW identificada en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos de la invención, se prefiere que el péptido que consiste en aminoácidos 10 a 59 de la Erwinia amylovora HrpW se use como una referencia.
El péptido de este aspecto no consiste en la secuencia de aminoácidos TSSSPGLFQSGGDNGLGGHNANSALGQQPIDRQTIEQMAQLLAELLKSLL (SEQ ID NO: 162), que corresponde a los aminoácidos 10 a 59 de Erwinia amylovora HrpW longitud total (solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al.).
El péptido incluye una o varias mutaciones respecto a la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de SEQ ID NO: 162. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto a SEQ ID NO: 162. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de SEQ ID NO: 162.
La longitud de péptidos es de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. El péptido tiene una longitud de entre 13 y 40 aminoácidos de largo.
En determinadas formas de realización, los péptidos de acuerdo con la SEQ ID NOS: 18 y 25 también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Por ejemplo, cuando el péptido que comprende SEQ ID NO: 18 está libre de residuos de aminoácido de metionina, el aminoácido en la posición 12 es L. De modo similar, cuando el péptido que comprende SEQ ID NO: 25 está libre de residuos de aminoácido de metionina, el aminoácido en la posición 1 es L.
Uno o más de aminoácidos 1 a 11 y/o 25 a 27 no está presente en el péptido aislado de SEQ ID NO: 18. Por ejemplo, péptidos que carecen de los aminoácidos 25 a 27 exhiben mayor estabilidad respecto a la secuencia de tipo salvaje.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NO: 18 o 25 o se derivan de uno de SEQ ID NOS: 18 y 25 o satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 5:
Tabla 5: Variantes peptídicas de Péptidos P17/P18 consenso (SEQ ID NO: 18 o 25) Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: tipo salvaje [*]QQPIDRQTIEQMAQLLAELLKSLL 162
P17 [*]QQPIDRQTIEQMAQLLAQLLKSLL 81
P17a [*]QQPIDRQTIEQLAQLLAQLLKSLL 82
P18 QQPIDRQTIEQMAQLLAQLLKSLLSPQ 83
P18a QQPIDRQTIEQLAQLLAQLLKSLLSPQ 84
P18b IEQMAQLLAQLLKSLL 85
P18c IEQLAQLLAQLLKSLL 86
P18d DRQTIEQMAQLLAQLLKSLL 87
P18e DRQTIEQLAQLLAQLLKSLL 88
P18-1 QQPIDRQTIEQMAQLLAQLLKSLL 163
P18-3 QQPIDRQTIEQLAQLLAQLLKSLLSP 228
P18-4 DRQTIEQLAQLLAQLLKSLLSP 164
P18-5 QTIEQLAQLLAQLLKSLLSP 165
P18-6 SEEEEEIEQLAQLLAQLLKSLL 166
P18-7 SEEEEELAQLLAQLLKSLL 167
P18-10 SEEEEELAELLAELLKSLL 231
En P17, P17a y la secuencia de tipo salvaje, [*] = TSSSPGLFQSGGDNGLGGHNANSALG Los péptidos seleccionados en la Tabla 5 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 5 pero que carece de estos rótulos específicos de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
En esta forma de realización, la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje corresponde a los aminoácidos 10 a 59 de la secuencia de Erwinia amylovora HrpW identificada en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos de la invención, se prefiere que el péptido que consiste en aminoácidos 10 a 59 de Erwinia amylovora HrpW se use como una referencia.
También se divulga un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de:
XLXX(L/M)LXLIXX(L/I/V/F/M)(L/I/V/F/M) (SEQ ID NO: 26, P19 consenso), en donde
X en la posición 1 es opcional y puede ser L, I, V, F o M;
X en la posición 3 puede ser cualquier aminoácido, pero preferentemente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N o R;
X en la posición 4 puede ser cualquier aminoácido, pero preferentemente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K o R;
X en la posición 7 puede ser cualquier aminoácido, pero preferentemente K, A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N o R;
X en la posición 10 puede ser cualquier aminoácido, pero preferentemente A, S, T, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q, N, K o R; y
X en la posición 11 puede ser cualquier aminoácido, pero preferentemente R, A, S, T, G, D, isoD, E, g -glutamato, Q, N o K.
Como se observó con anterioridad, solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al., identifica dos dominios que inducen una respuesta hipersensible de HrpWEa, uno de los cuales se extiende desde el aminoácido 103 hasta el aminoácido 146, en particular desde el aminoácido 116 hasta el aminoácido 140 de HrpWEa. A pesar de esta descripción en Fan et al., esta referencia no identifica un fragmento de péptido de HrpWEa que contiene este dominio.
Una secuencia de tipo salvaje comparativa corresponde a los aminoácidos 116 a 140 de la secuencia de longitud total de Erwinia amylovora HrpW identificada en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos, se prefiere que el péptido que consiste en aminoácidos 116 a 140 de Erwinia amylovora HrpW se use como una referencia.
En determinadas formas de realización, el péptido de este aspecto no consiste en la secuencia de aminoácidos ITPDGQGGGQIGDNPLLKAMLKLIA (SEQ ID NO: 89), que corresponde a los aminoácidos 116 a 140 de Erwinia amylovora HrpW de longitud total (solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al.).
En determinadas formas de realización, el péptido incluye una o varias mutaciones respecto a la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de SEQ ID NO: 89. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto a SEQ ID NO: 89. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de<s>E<q>ID NO: 89.
La longitud de péptidos de acuerdo con este aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, el péptido es de entre 18 y 50 aminoácidos de largo.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NO: 26 o se derivan de SEQ ID NO: 26 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 6:
Tabla 6: Variantes peptídicas de Péptido P19 consenso (SEQ ID NO: 26)
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO:
P19 ITPDGQGGGQIGDNPLLKAMLKLIA 89
P19-20L ITPDGQGGGQIGDNPLLKALLKLIA 90
P19a ITPDGQGGGQIGDNPLLKAMLKLIARMMDG91
P19a-allL ITPDGQGGGQIGDNPLLKALLKLIARLLDG 92
P19-4 QGGGQIGDNPLLKAMLKLIARMMDG 226
P19-5 SEEEE0GDNPLLKALLKLIARLLDG 168
P19-5a SEEEEEIGDDELLKALLKLIARLLDG 169
P19-6 SEEEEELLKALLKLIARLLDG 170
P19-11 SEEEEEIGDNPLLKALLKLIARLL 171
P19-7 SEEEEELLKALLKLIARLL 172
P19-8 SEEEEELKALLKLIARLL 173
Los péptidos seleccionados en la Tabla 6 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 6 pero que carecen de este rótulo específico de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Ciertos péptidos en la Tabla 6 también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Cuando estos péptidos también cumplen con las limitaciones de SEQ ID NO: 93, el residuo de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 26, de estar presente, es L, I, V o F; aminoácido 5 de SEQ ID NO: 26 es L; y aminoácidos 12 y 13 de SEQ ID NO: 26 son, de modo independiente, L, I, V o F.
También se divulga un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:
(i) XXXXXXLXXLLXXLVXLLK (SEQ ID NO: 13, P14d consenso), en donde
X en la posición 1 puede ser: Q, N, D, E, g-glutamato, isoD o S;
X en la posición 2 puede ser: D, E, g-glutamato, isoD;
X en la posición 3 puede ser: P, D, E, isoD o g-glutamato;
X en la posición 4 puede ser M, A, S, D, E, isoD o g-glutamato
X en la posición 5 puede ser Q, E o g-glutamato;
X en la posición 6 puede ser A, E o g-glutamato;
X en la posición 8 puede ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 9 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 12 puede ser Q, N, , G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 13 puede ser Q, N, , G, A, S, isoD o g-glutamato; y
X en la posición 16 puede ser K, Q, N, E, D, R, G, A o S; o
(ii) LXXLLXXLVXLLK (SEQ ID NO: 14, P14d min consenso), en donde
X en la posición 2 puede ser M, L, E, Q, D, N, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 3 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 6 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato;
X en la posición 7 puede ser Q, N, E, D, G, A, S, isoD o g-glutamato; y
X en la posición 10 puede ser K, Q, N, E, D, R, G, A o S.
En determinadas formas de realización, el péptido incluye una o varias mutaciones respecto a la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Ralstonia solanacearum (previamente, Pseudomonas solanacearum) PopA. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto de la secuencia PopA de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Ralstonia solanacearum PopA.
Una secuencia de tipo salvaje comparativa corresponde a los aminoácidos 92 a 125 de la secuencia de Ralstonia solanacearum (previamente, Pseudomonas solanacearum) PopA identificada en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos, se prefiere que el péptido de tipo salvaje de Fan et al., que consiste en aminoácidos 92 a 125 de Ralstonia solanacearum PopA, se use como una referencia.
En determinadas formas de realización, el péptido de este aspecto no consiste en la secuencia de aminoácidos de QAPQSANKTGNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKL (SEQ ID NO: 174), que corresponde a los aminoácidos 92 a 125 de Ralstonia solanacearum PopA (ver la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al.).
La longitud de péptidos de acuerdo con este aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, el péptido tiene una longitud de entre 12 y 50 aminoácidos.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NOS: 13 o 14 o se derivan de SEQ ID NO: 13 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 7:
Tabla 7: Variantes peptídicas de Péptido P14d (SEQ ID NO: 13)
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO:
tipo salvaje QAPQSANKTGNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKL 174
P14d QDPMQALMQLLEDLVKLLK 175
P14e QDPAQALLQLLEDLVKLLK 176
P14f QDPAQALEQLLEDLVKLLK 177
P14-30 SEEEEEALEQLLEDLVKLLK 178
P14c QAGPQSANKTGNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKLLK 199
Los péptidos seleccionados en la Tabla 7 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 7 pero que carecen de este rótulo específico de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Es notable que un residuo de lisina C-terminal parece ser necesario para la inducción de una HR por variantes p14d. Esta es una ligera desviación de la secuencia canónica de SEQ ID NO: 93. Sin querer estar ligados a la teoría, se cree que la lisina C-terminal puede ser necesaria debido al aminoácido hidrofílico simple entre 2 secuencias de doblete hidrofóbico dentro de las variantes de p14d (LVKLL).
Determinados péptidos de acuerdo con este aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Por ejemplo, para los péptidos que comprenden SEQ ID NO: 13, el residuo de aminoácido 4 de<s>E<q>ID NO: 13 es A, S, D, isoD, E o g-glutamato y el residuo de aminoácido 8 de SEQ ID NO: 13 es L, E, g-glutamato, Q, D, isoD, N, G, A o S. De modo similar, para los péptidos que comprenden SEQ ID NO: 14 el residuo de aminoácido en la posición 2 es L, E, g-glutamato, Q, D, isoD, N, G, A o S.
También se divulga un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:
(i) LXXL(L/M)XILXXLV (SEQ ID NO: 16, P25 consenso) en donde
X en la posición 2 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 3 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 6 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 9 puede ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A o G; y
X en la posición 10 puede ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q o N; o
(ii) LXXVLXXL(L/M)XILXXLV (SEQ ID NO: 17, P25 consenso) en donde
X en la posición 2 puede ser T, S, A, G, D, isoD, E, g-glutamato, Q o N;
X en la posición 3 puede ser G, T, S, A, D, isoD, E, g-glutamato, Q o N;
X en la posición 6 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 7 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 10 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 13 puede ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A o G;
X en la posición 14 puede ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q o N; y
V en la posición 16 es opcional.
En determinadas formas de realización, el péptido incluye una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Ralstonia solanacearum (previamente, Pseudomonas solanacearum) PopA. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto de la secuencia PopA de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Ralstonia solanacearum PopA.
Una secuencia de tipo salvaje comparativa corresponde a los aminoácidos 206 a 260 de la secuencia PopA de Ralstonia solanacearum (previamente, Pseudomonas solanacearum), que se identifica en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al., como un dominio de respuesta de hipersensibilidad. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos, se prefiere que el péptido de tipo salvaje de Fan et al., que consiste en aminoácidos 206 a 260 de Ralstonia solanacearum PopA, se use como una referencia.
En determinadas formas de realización, el péptido de este aspecto no consiste en la secuencia de aminoácidos de NGADGGNGVNGNQANGPQNAGDVNGANGADDGSEDQGGLTGVLQK LMKILNALVQ (SEQ ID NO: 179), que corresponde a los aminoácidos 206 a 260 de Ralstonia solanacearum PopA (ver la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al.).
La longitud de péptidos de acuerdo con este aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos o de menos de aproximadamente 50 aminoácidos. En determinadas formas de realización, el péptido tiene una longitud de entre 12 y 50 aminoácidos.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con uno de SEQ ID NOS: 16 o 17 o se derivan de uno de Se Q ID NOS: 16 o 17 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 8:
Tabla 8: Variantes peptídicas de Péptidos P2 (SEQ ID NO: 180) y P25 (SEQ ID NO: 182) Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: tipo salvaje [*] ANGADDGSEDQGG_LTGVLQKLMKILNALVQ 179
P2 ANGADDGSEDQGGLTLTGVLQKLMKILNALVQ 180
P25-4 EDQGGLTLTGVLQKLMKILNALVQ 181
P25 GGLTLTGVLQKLMKILNAL 182
P25s EDQGGLTLTGVLQKLMKILNAL 183
P25-7 EDQGGLTLTGVLQKLLKILNAL 184
P25-8 EDQGGLTLTGVLQELMEILNAL 185
P25-20E EDQGGLTLTGVLQKLLKILEALVQ 186
P25-10 SEEEELTLTGVLQKLLKILEAL 187
P25-11 SEEEEELTGVLQKLLKILEAL 188
P25-15 SEEEEELTLTGVLQKLLKILEA 200
P25-16 SEEEEEVLQKLLKILEALV 201
P25-17 SEEEEELQKLLKILEALVQ 202
[*] = N-terminal secuencia NGADGGNGVNGNQANGPQNAGDVNG
Los péptidos seleccionados en la Tabla 8 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 8 pero que carece de estos rótulos específicos de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Notablemente, una cantidad de estos péptidos derivados en la Tabla 8 incluyen una secuencia LT repetida no observada en la secuencia de tipo salvaje. Sin embargo, se ha de notar que estas secuencias requieren de una secuencia hidrofóbica más grande para causar una respuesta de hipersensibilidad en comparación con la SEQ ID NO: 93. Sin quedar ligados por la teoría, se cree que se puede deber a la presencia del aminoácido valina en la secuencia más que la leucina así como la presencia de sólo un aminoácido hidrofílico simple entre los dobletes hidrofóbicos (LLKIL). A pesar de que estos cambios son nocivos para la HR, este efecto se puede invertir por adición de residuos adicionales hidrofóbicos en el término C del péptido (...KIL versus ...KlLEALV o ...KILNALV).
Ciertos péptidos de acuerdo con este aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Por ejemplo, para péptidos que comprenden SEQ ID NO: 16, el residuo de aminoácido 5 es L; y para péptidos que comprenden SEQ ID NO: 17, el residuo de aminoácido 9 es L.
También se divulga un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:
(i) (L/M)XXLLX(L/M)FXXI(L/M)XX (SEQ ID NO: 15, P3min consenso) en donde
X en la posición 2 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 3 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 6 puede ser K, Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G;
X en la posición 9 puede ser E, g-glutamato, D, isoD, Q, N, T, S, A o G;
X en la posición 10 puede ser A, G, S, T, E, g-glutamato, D, isoD, Q o N;
X en la posición 13 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G; y
X en la posición 14 puede ser Q, N, E, g-glutamato, D, isoD, T, S, A o G.
En determinadas formas de realización, el péptido incluye una o varias mutaciones respecto a una correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Erwinia amylovora HrpN. Estas una o varias mutaciones incluyen supresiones o sustituciones respecto a la secuencia HrpN de tipo salvaje. En determinadas formas de realización, las una o varias mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, estabilidad, y/o resistencia a degradación química del péptido aislado respecto a un polipéptido que comprende o que consiste en la correspondiente secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de Erwinia amylovora HrpN. Una secuencia de tipo salvaje comparativa corresponde a los aminoácidos 137 a 180 o 150 a 180 de la secuencia de Erwinia amylovora HrpN, que se identifican en la patente U. S. No. 7.132.525 de Wey et al. El péptido HrpN que contiene aa 137 a 180 se identificó como un fragmento que induce una respuesta de hipersensibilidad, mientras que el péptido HrpN que contiene aa 150 a 180 no se podía expresar y ensayar. Con fines de comparar las propiedades de los péptidos, se prefiere que el péptido de tipo salvaje de Wey et al., que consiste en los aminoácidos 137 a 180 o 150 a 180 de Erwinia amylovora HrpN, se use como una referencia.
En determinadas formas de realización, el péptido de este aspecto no consiste en la secuencia de aminoácidos de S<137>TSQNDDSTSGTDS<150>TSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQDGT<180>(SEQ ID NO: 230), que corresponde a los aminoácidos 137 a 180 de Erwinia amylovora HrpN (ver la patente U. S. No. 7.132.525 de Wey et al.) o el péptido de 31 aminoácidos correspondiente a aa 150 a 180.
La longitud de péptidos de acuerdo con este aspecto es, con preferencia, de menos de aproximadamente 100 aminoácidos o alternativamente de menos de 90 aminoácidos, de menos de 80 aminoácidos, de menos de 70 aminoácidos, de menos de 60 aminoácidos, de menos de aproximadamente 50 aminoácidos, de menos de aproximadamente 40 aminoácidos o de menos de 30 aminoácidos. En determinadas formas de realización, el péptido es de entre 12 y 30 aminoácidos de largo.
Los péptidos de ejemplo que comparten la estructura de consenso con SEQ ID NOS: 15 o se derivan de SEQ ID NOS: 15 y satisfacen la estructura de consenso de SEQ ID NO: 93, se identifican en la siguiente Tabla 9:
Tabla 9: Variantes peptídicas de Péptido P3 consenso (SEQ ID NO: 15)
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO:
tipo salvaje STSQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQDGT 203
P3 QNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQDGT 204
P3-3 SDPMQQLLKMFSEIMQSLF 205
P3-4 SEEELQQLLKLFSEILQSLF 206
P3-6 SEEEEELQQLLKLFSEILQSL 207
P3-7 SEEEEELQQLLKLFSEILQS 208
P3-11 LQQLLKLFSEILQSLFEEEE 209
Los péptidos seleccionados en la Tabla 9 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEEE, SEEEEE y EEEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 9 pero que carece de estos rótulos específicos de solubilidad (o que tienen un diferente rótulo de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Es notable que la secuencia mínima P3 requiere una secuencia más grande que la secuencia HR-box mínima de SEQ ID NO: 93. Sin quedar ligados por la teoría, se cree que se puede deber a la presencia de dos residuos de fenilalanina dentro de la secuencia hidrofóbica.
Ciertos péptidos de acuerdo con este aspecto también cumplen con las características estructurales que definen los péptidos de SEQ ID NO: 93, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes. Por ejemplo, para péptidos que comprenden SEQ ID NO: 15, los residuos de aminoácidos 1, 7 y 12 son L.
En base a la secuencia consenso revelada (SEQ ID NO: 93), es posible generar nuevas secuencias peptídicas con actividad pronosticada de HR que se desvía de modo significativo de las secuencias proteicas bacterianas. Estos péptidos pueden contener residuos hidrofílicos optimizados para máxima solubilidad y estabilidad química. En una forma de realización preferida, estos residuos hidrofílicos son glutamato. Lisina y arginina también son posibles elecciones, sin embargo, un gran número de estos residuos causará una respuesta tóxica en la planta.
Además de los péptidos anteriores que se modelan (y modifican) en base a secuencias naturales dentro de proteínas que inducen HR más grandes, la presente divulgación también contempla péptidos enteramente sintéticos que cumplen con el consenso de s Eq ID NO: 93. Idealmente, estos péptidos sintéticos incluyen una cantidad de aminoácidos fuertemente hidrofílicos que se extienden entre los residuos hidrofóbicos especificados por la SEQ ID NO: 93. Los péptidos sintéticos de ejemplo se enumeran en la siguiente Tabla 10. Estos péptidos contienen los péptidos hidrofóbicos necesarios asociados con la inducción de HR. Los residuos hidrofílicos intervinientes se eligen por la máxima solubilidad, con preferencia, con aminoácidos cargados. Es posible usar aminoácidos descargados, pero mayores proporciones de aminoácidos no cargados pueden causar que el péptido resultante se agregue en solución y forme un precipitado o gel. Se prefiere el glutamato por la estabilidad química respecto del aspartato. A pesar de que lisina y arginina tienen características de solubilidad aún mayores, los policationes produjeron una respuesta tóxica en las plantas ensayadas. Como resultado, las secuencias ricas en arginina tales como P30-1 (SEQ ID NO: 211) se deberán evitar.
Tabla 10: Otros péptidos HR-box
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO:
P30-2S E E L E E L L E E L IE E L L189
P30-3 LEELLEELIEELLEE 190
P30-4 LEELLEELIEELL 210
P30-1R L R R L L R R L IR R L L R P211
P30-5 LDDLLDDLIDDLLDD 212
P18-13 LEELLEELLEELLEE 213
P14-54 LEQLLEDLVKLLKEE 214
P14-55 LEQLLEDLVELLEEE 215
P14-56 LEELLEDLVELLEE E216
P14-57 LEELLEELVELLEE E217
P3-12 LEELLELFEEILEELFEE 218
P3-13 LEELLKLFEEILEELFEE 219
P20-50a IEELIELIEELLEE 220
P15-67 IEELIEELIEELLEE 221
P19-54c LEELLKLIERLLEE 222
P19-54b LEELLELIERLLEE 223
P19-54a LEELLKLIEELLEE 224
P19-54 LEELLELIEELLEE 225
Los péptidos seleccionados en la Tabla 10 incluyen rótulos de solubilidad, indicados por letra cursiva, incluyendo SEE, EE, DD o EEE. Los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 10 pero que carece de estos rótulos específicos de solubilidad (o que tiene diferentes rótulos de solubilidad) también están contemplados en la presente.
Los péptidos aislados de la invención también pueden estar presentes en la forma de un péptido de fusión que incluye, en adición, una segunda secuencia de aminoácidos acoplada con los péptidos de la invención por medio de enlace peptídico. La segunda secuencia de aminoácidos puede ser un rótulo de purificación, tales como poli-histidina (Hisa-), una glutatión-S-transferasa (GST-) o proteína de unión a maltosa (MBP-), que ayuda en la purificación pero que más tarde se puede remover, es decir, escindir del péptido después de la recuperación. Los sitios de escisión específicos de proteasa o sitios de escisión químicos específicos (es decir, en una secuencia ligadora escindible) pueden ser introducidos entre el rótulo de purificación y el péptido deseado. Los sitios de escisión específicos de proteasa son bien conocidos en la literatura e incluyen, sin limitación, el sitio de escisión específico de enteroquinasas (Asp)<4>-Lys, que se escinde después de lisina; el sitio de escisión específico del factor Xa Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg, que se escinde después de arginina; el sitio de escisión específico de tripsina, que se escinde después de Lys y Arg; y el sitio de escisión específico de Genenase™ I Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr. Los productos químicos y sus sitos de escisión específicos incluyen, sin limitación, bromuro de cianógeno (CNBr), que se escinde en residuos de metionina (Met); BNPS-skatol, que se escinde en residuos de triptófano (Trp); ácido fórmico, que se escinde en enlaces peptídicos de ácido aspártico-prolina (Asp-Pro); hidroxilamina, que se escinde en los enlaces peptídicos de asparagina-glicina (Asn-Gly); y ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico (NTCB), que se escinde en residuos de cisteína (Cis) (ver Crimmins et al., “Chemical Cleavage of Proteins in Solution”, Curr. Protocol. Protein Sci., Chapter 11:Unit 11,4 (2005)). A fin de usar uno de estos métodos de escisión, puede ser necesario remover sitios de escisión no deseada de dentro de las secuencias peptídicas deseadas por mutación. Por ejemplo, p4-7E-cR (SEQ ID NO: 194) se mutó por compatibilidad con tripsina: el residuo de lisina en la posición 7 se muta en un glutamato y una arginina C-terminal se añade para representar el producto de una escisión teórica de tripsina. Del mismo modo, p19-5 (SEQ ID NO: 168) contiene la secuencia 'NP' que puede ser escindida en condiciones ácidas. La mutación de estos residuos a 'DE' en p19-5a (SEQ ID NO: 169) evita este mecanismo particular de escisión. El producto peptídico deseado puede ser purificado luego para remover los rótulos de purificación escindidos.
Los péptidos aislados de la invención también se pueden presentar en forma de un péptido de fusión que incluye múltiples secuencias peptídicas de la presente invención ligadas junto con una secuencia ligadora que puede o no adoptar la forma de una secuencia de aminoácidos escindible del tipo descrito con anterioridad. Estas proteínas de fusión multiméricas pueden incluir o no rótulos de purificación. En una forma de realización, cada secuencia monomérica puede incluir un rótulo de purificación ligado con un péptido de la invención por una primera secuencia de péptidos escindible; y las diversas secuencias monoméricas se pueden ligar con secuencias monoméricas adyacentes por medio de una segunda secuencia de péptidos escindible. En consecuencia, después de la expresión de la proteína de fusión multimérica, es decir, en una célula huésped, la proteína de fusión recuperada puede ser tratada con una proteasa o producto químico que es efectiva para escindir la segunda secuencia de péptidos escindible, liberando así secuencias peptídicas monoméricas individuales que contienen rótulos de purificación. Después de la purificación por afinidad, las secuencias peptídicas monoméricas recuperadas pueden ser tratadas con una proteasa o producto químico que son efectivos para escindir la primera secuencia de péptidos escindible y liberando así el rótulo de purificación del péptido de interés. El último se puede purificar luego usando filtración en gel y/o HPLC como se describe más abajo.
De acuerdo con un enfoque, los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse por medio de operaciones de síntesis de péptidos estándar. Incluyen tanto protocolos de síntesis de FMOC (9-fluorenilmetiloxi-carbonilo) y tBoc (ter-butiloxi-carbonilo) que se pueden llevar a cabo en instrumentos de síntesis de péptidos en fase sólida automatizados incluyendo, sin limitación, los sintetizadores de Applied Biosystems 431 A, 433 A y Peptide Technologies Symphoyi o sintetizadores en gran escala Sonata o CEM Liberty automatizados de péptidos en fase sólida. El uso de instrumentos alternativos de síntesis de péptidos también se contempla. Los péptidos preparados usando síntesis en fase sólida se recuperan en una forma sustancialmente pura.
Los péptidos de la presente invención también se pueden preparar usando sistemas de expresión recombinantes seguidos de separación y purificación de los péptidos preparados de forma recombinante. En general, esto implica la inserción de una molécula de ácido nucleico en un sistema de expresión en el que la molécula es heteróloga (es decir, normalmente no presente). Una o varias moléculas de ácido nucleico deseadas que codifican un péptido de la invención se pueden insertar en el vector. La molécula de ácido nucleico heterólogo se inserta en el sistema de expresión o en vector en una orientación con sentido apropiada (5'—3') y el marco de lectura correcto respecto al promotor y cualquier otra molécula reguladora 5' y 3'.
Las secuencias representativas de nucleótidos para la expresión en las bacterias y huéspedes de plantas se incluyen en la siguiente Tabla 11:
Tabla 11
Péptido & Huésped optimizado Secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:
P4-14s TCTCAAGGAATTTCTGAAAAGCAACTTGATCAACTTCTT TCTCAACTTATTCAAGCTCTTCTTCAACCT 145A. th a lia n a
P4-14s AGCCAGGGTATTAGCGAAAAACAGCTGGATCAGCTGC TGAGCCAGCTGATTCAGGCACTGCTGCAGCCG 146E. co li
P1-2E,8E,11E,15E,18E AATGAAGGAATTTCTGAAAAGGAACTTGATGAACTTCTT ACTGAACTTATTGAAGCTCTTCTTCAACAA 147A. th a lia n a
P1-2E,8E,11E,15E,18E AATGAAGGTATTAGCGAAAAAGAACTGGATGAACTGCT GACCGAACTGATTGAAGCACTGCTGCAGCAG 148E. co li
Con conocimiento de la secuencia de aminoácidos codificada enumerada en la presente y el organismo transgénico deseado, se pueden generar secuencias de ADN adicionales optimizadas con codón y secuencias de ARN nada más que con experiencia de rutina.
La expresión (incluyendo transcripción y traducción) de un péptido o polipéptido de fusión de la invención por el constructo de a Dn se puede regular respecto del nivel de expresión, los tipos tisulares donde la expresión tiene lugar y/o la etapa de desarrollo de expresión. Una cantidad de secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo, promotores y mejoradores) están a disposición para controlar la expresión del constructo de<a>D<n>.
Ellas incluyen promotores constitutivos, inducibles y regulables, así como promotores y mejoradores que controlan la expresión de una manera específica de tejidos o temporales. Los promotores constitutivos de ejemplo incluyen el promotor de frambuesa E4 (patentes U. S. Nros. 5.783.393 y 5.783.394), el promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 84:5745-5749 (1987)), el promotor de octopina sintasa (OCS) (que se lleva a cabo en plásmidos inductores de tumores de Agrobacteria tumefaciens), los promotores de caulimovirus tales como el promotor de virus mosaico de coliflor (CaMV) 19S (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9:315-324 (1987)) y el promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)), el promotor de virus mosaico de escrofularia 35S (patente U. S. No. 5.378.619), el promotor fotoinducible de la subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bis-fosfatocarboxilasa (ssRUBISCO), el promotor Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 84:6624-6628 (1987)), el promotor de sacarosa sintasa (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 87:4144-4148 (1990),), el promotor del complejo génico R (Chandler et al., Plant Cell 1:1175-1183 (1989)), el promotor génico de proteína de unión de clorofila a/b, el promotor CsVMV (Verdaguer et al., Plant Mol Biol., 37:1055-1067 (1998)) y el promotor de actina de melón (publ. PCT No. WO00/56863). Los promotores específicos de tejidos de ejemplo incluyen los promotores E4 y E8 del tomate (patente U. S. No. 5,859,330) y el promotor génico 2AII del tomate (Van Haaren et al., Plant Mol Bio., 21:625-640 (1993)).
En una forma de realización preferida, la expresión del constructo de ADN está bajo control de secuencias de regulación de genes cuya expresión se asocia con un desarrollo temprano de semillas y/o de embriones. De hecho, en una forma de realización preferida, el promotor usado es un promotor mejorado de semilla. Los ejemplos de tales promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de tales genes como napina (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991)), globulina (Belanger y Kriz, Genet. 129: 863-872 (1991), No. de acceso a Genbank L22295), gamma zeína Z 27 (Lopes et al., Mol Gen Genet. 247:603-613 (1995)), promotor de oleosina L3 (patente U. S. No. 6.433.252), faseolina (Bustos et al., Plant Cell 1(9):839-853 (1989)), arcelin5 (publicación de solicitud U. S. No. 2003/0046727), un promotor de soja 7S, un promotor 7Sa (publicación de solicitud U. S. No. 2003/0093828), el promotor de conglicinina de soja 7Sap, un promotor 7Sa (Beachi et al., EMBO J. 4:3047 (1985); Schuler et al., Nucleic Acid Res. 10(24):8225-8244 (1982)), inhibidor de tripsina de soja (Riggs et al., Plant Cell 1(6):609-621 (1989)), ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2):255-267 (1993)), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe et al., Plant Physiol. 104(4):167-176 (1994)), subunidad a' de p-conglicinina de soja (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:8560-8564 (1986)), Vicia faba USP (publicación de solicitud U. S. No.
2003/229918) y promotor de oleosina de Zea mays L3 (Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3):549-555 (1997)).
Se pueden preparar moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de la presente invención por medio de síntesis en fase sólida usando, por ejemplo, el método de fosforamidita y bloques constructivos de fosforamidita derivados de 2-desoxinucleósidos protegidos. Para obtener los oligonucleótidos deseados, los bloques constructivos se acoplan secuencialmente con la cadena creciente de oligonucleótidos en el orden requerido por la secuencia del producto. Después de completar el ensamble de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege, se recolecta y típicamente se purifica usando HPLC. Los límites de síntesis en fase sólida son apropiados para preparar oligonucleótidos hasta aproximadamente 200 nt de largo, que codifica péptidos en el orden de aproximadamente 65 aminoácidos o menos. Los extremos de los oligonucleótidos sintetizados se pueden diseñar para incluir sitio de escisión de enzima de restricción para facilitar la ligación de los oligonucleótidos sintetizados en un vector de expresión.
Para péptidos más largos, los oligonucleótidos se pueden preparar por medio de síntesis en fase sólida y luego las secuencias de oligonucleótidos sintéticos ligadas juntas usando técnicas varias. Las técnicas recombinantes para la fabricación de genes sintéticos enteros se reseñan, por ejemplo, en Hughes et al., “Chapter Twelve -Gene Synthesis: Metods and Applications”, Methods in Enzymology 498:277-309 (2011).
Una vez seleccionado un vector de expresión apropiado, las secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas se clonan en el vector usando procedimientos de clonación estándar en el arte, tal como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y (1989) o la patente U. S. No. 4.237.224 de Cohen y Boyer. El vector se introduce luego en un huésped apropiado.
Una variedad de sistemas de huésped-vector se puede utilizar para expresar de forma recombinante los péptidos de la presente invención. Primeramente, el sistema de vectores puede ser compatible con el huésped usado. Los sistemas de huésped-vector incluyen, sin limitación, los siguientes: bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido; microorganismos tales como levadura que contienen vectores de levadura; sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus de vacunas, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); y células de plantas infectadas por Agrobacterias. Los elementos de expresión de estos vectores varían en su largo y sus especificidades. Según el sistema de huésped-vector utilizado, cualquiera de una cantidad de elementos apropiados de transcripción y traducción se puede usar para llevar esto a cabo y otros aspectos de la presente invención.
Los péptidos purificados se pueden obtener por medio de varios métodos. El péptido se produce, con preferencia, en forma purificada (con preferencia, al menos aproximadamente 80% o 85% puro, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 90% o 95% puro) por técnicas convencionales. Según si la célula huésped recombinante se hace para segregar el péptido en medio de cultivo (ver la patente U. S. No. 6.596.509 de Bauer et al.), el péptido puede ser aislado y purificado por centrifugación (para separar los componentes celulares del sobrenadante que contiene el péptido segregado) seguido por precipitación secuencial de sulfato de amonio del sobrenadante. La fracción que contiene el péptido se somete a filtración en gel de una columna de dextrano o poliacrilamida de tamaño apropiado para separar los péptidos de otras proteínas. De ser necesario, la fracción de péptido se puede seguir purificando por HPLC.
Alternativamente, si el péptido de interés de interés no se segrega, se puede aislar de células recombinantes usando esquemas estándar de aislamiento y purificación. Esto incluye disrumpir las células (por ejemplo, por sonicación, congelamiento, prensa francesa, etc.) y luego recuperar el péptido de desechos celulares. La purificación se puede lograr usando los procedimientos de centrifugación, precipitación y purificación descritos con anterioridad. El uso de rótulos de purificación, descritos con anterioridad, puede simplificar este proceso.
En determinadas formas de realización, no se requiere purificación. Cuando no se realiza una purificación, los lisados libres de células se pueden recuperar después de la centrifugación para eliminación de desecho celular. El lisado libre de células resultante puede ser tratado con calor durante una cantidad de tiempo suficiente para desactivar cualquier proteasa nativa en la fracción recuperada, por ejemplo, 10 min a 100 °C. Si se desea, se pueden introducir uno o varios de agentes biocidas, inhibidores de proteasas y tensioactivos no iónicos a tal preparación libre de células (ver la publicación de solicitud U. S. No. 20100043095 de Wey).
Una vez recuperados los péptidos de la presente invención, se pueden usar para preparar una composición que incluye un portador y uno o vario aditivos seleccionados del grupo que consiste en un agente bactericida o biocida, un inhibidor de proteasa, un tensioactivo no iónico, un fertilizante, un herbicida, un insecticida, un fungicida, un nematicida, inoculantes biológicos, reguladores de plantas y mezclas de ellos.
En determinadas formas de realización, las composiciones incluyen más de aproximadamente 1 nM del péptido, más de aproximadamente 10 nM del péptido, más de aproximadamente 20 nM del péptido, más de aproximadamente 30 nM del péptido, más de aproximadamente 40 nM del péptido, más de aproximadamente 50 nM del péptido, más de aproximadamente 60 nM del péptido, más de aproximadamente 70 nM del péptido, más de 80 aproximadamente nM del péptido, más de aproximadamente 90 nM del péptido, más de aproximadamente 100 nM del péptido, más de aproximadamente 150 nM del péptido, más de aproximadamente 200 nM del péptido o más de aproximadamente 250 nM del péptido. En determinadas formas de realización, las composiciones incluyen menos de aproximadamente 1 nM del péptido. Por ejemplo, ciertos péptidos pueden estar presentes a una concentración de menos de aproximadamente 2 ng/ml, menos de aproximadamente 1,75 ng/ml, menos de aproximadamente 1,5 ng/ml, menos de aproximadamente 1,25 ng/ml, menos de aproximadamente 1,0 ng/ml, menos de aproximadamente 0,75 ng/ml, menos de aproximadamente 0,5 ng/ml, menos de aproximadamente 0,25 ng/ml o incluso menos de aproximadamente 0,1 ng/ml.
Los portadores apropiados incluyen agua, soluciones acuosas que contiene opcionalmente uno o varios cosolventes, suspensiones y partículas portadoras sólidas. Los portadores sólidos de ejemplo incluyen tierras minerales tales como silicatos, geles de sílice, talco, caolines, piedra caliza, cal, tiza, bolo, loess, arcillas, dolomita, tierra de diatomeas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticos molidos y productos de origen vegetal, tales como harina de cereal, harina de corteza de árbol, aserrín y harina de cáscaras de nuez, polvos de celulosa, almidones y derivados de almidón, así como otros mono-, d i- y polisacáridos.
Los fertilizantes apropiados incluyen, sin limitación, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas y combinaciones de ellos.
Los insecticidas apropiados incluyen, sin limitación, miembros de la clase de neonicotinoides tales como imidicloprida, clotianidina y tiametoxam; miembros de la clase de organofosfatos tales como clorpirifos y malationa; miembros de la clase de piretroides tales como permetrina; otros insecticidas naturales tales como nicotina, nornicotina y piretrinas; miembros de la clase de carbamatos tales como aldicarb, carbofurano y carbarilo; miembros de la clase de lactona macrocíclica tales como varios productos de abamectina, avermectina e ivermectina; miembros de la clase de diamida tales como clorantraniliprol, ciantraniliprol y flubendiamida; inhibidores de la síntesis de quitina, en particular aquellos de la clase de benzoilurea tales como lufenurona y diflubenzurona; y cualquier combinación de ellos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más o cuatro o más insecticidas. Los insecticidas adicionales se enumeran en el Compendium of Pesticide Common Names, que es una base de datos operada por Alan Wood y disponible en forma electrónica en el sitio de internet alanwood.net.
Los fungicidas apropiados incluyen, sin limitación, miembros de la clase de estrobilurinas tales como azoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina, picoxistrobina y fluoxastrobina; miembros de la clase de triazoles tales como ipconazol, metconazol, tebuconazol, triticonazol, tetraconazol, difenoconazol, flutriafol, propiconazol y protioconazol; miembros de la clase de succinato deshidrogenasa tales como carboxina, fluxapiroxad, boscalida y sedaxano: miembros de la clase de fenilamida tales como metalaxilo, mefenoxam, benalaxilo y oxadixilo; miembros de la clase de fenilpirrol tales como fludioxonilo; miembros de la clase de ftalimidas tales como captano; miembros de la clase de ditiocarbamatos tales como mancozeb y tiram; miembros de la clase de bencimidazoles tales como tiabendazol; y cualquier combinación de ellos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más o cuatro o más fungicidas. Los fungicidas adicionales se enumeran en el Compendium of Pesticide Common Names, que es una base de datos operada por Alan Wood y disponible en forma electrónica en el sitio de internet alanwood.net.
Los nematicidas apropiados incluyen, sin limitación, productos químicos de la clase de carbamatos tales como aldicarb, aldoxicarb, oxamilo, carbofurano y cleotocarb; y productos químicos de la clase de los organofosfatos tales como tionazina, etoprofos, fenamifos, fensulfotiona, terbufos, isazofos y ebufos. Los nematicidas adicionales se enumeran en el Compendium of Pesticide Common Names, que es una base de datos operada por Alan Wood y disponible en forma electrónica en el sitio de internet alanwood.net.
Los bactericidas apropiados incluyen, sin limitación, aquellos a base de diclorofeno y alcohol bencílico hemiformal (Proxel® de ICI o Acticide® RS de Thor Chemie and Katon® MK de Rohm & Haas) y derivados de isotiazolinona tales como alquilisotiazolinonas y benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie; Proxel® GXL de ICI). Los bactericidas adicionales se enumeran en el Compendium of Pesticide Common Names, que es una base de datos operada por Alan Wood y disponible en forma electrónica en el sitio de internet alanwood.net.
Los inoculantes apropiados incluyen, sin limitación, Bradyrhizobium spp., en particular Bradyrhizobium japonicum (productos de BASF Vault®), Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus pumilis, Streptomyces lidicus, Trichoderma spp., Pasteuria spp., otros cultivos de células rizobianas (BASF Nodulator® y Rhizo-Flo®) y cualquier combinación de ellos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más o cuatro o más inoculantes.
Los reguladores de plantas son sustancias químicas, ya sea naturales o sintéticas, que estimulan o inhiben la señalización bioquímica de la planta. Usual, pero no exclusivamente, reconocidos por receptores sobre la superficie de la célula, causando una cascada de reacciones en la célula. Los reguladores de plantas apropiados incluyen, sin limitación, etefona; etileno; ácido salicílico; ácido acetilsalicílico; ácido jasmónico; jasmonato de metilo; dihidrojasmonato de metilo; quitina; quitosano; ácido abscísico; cualquier compuesto o inhibidor de auxina, incluyendo, pero sin limitación, ácido (4-clorofenoxi)acético, ácido (2,4-diclorofenoxi)acético y ácido 2,3,5-triyodobenzoico; cualquier citoquinina, incluyendo, pero sin limitación, quinetina y zeatina; gibberelinas; brassinolidas; y cualquier combinación de ellos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más o cuatro o más reguladores.
Otros aditivos apropiados incluyen agentes tamponantes, agentes humectantes, agentes de recubrimiento y agentes de abrasión. Estos materiales pueden ser usados para facilitar la aplicación de las composiciones de acuerdo con la presente invención. Además, las composiciones se pueden aplicar a semillas de plantas con otra formulación de semillas convencionales y materiales de tratamiento, incluyendo arcillas y polisacáridos.
Las composiciones o sistemas usados para el tratamiento de semillas de plantas incluyen: uno o varios de los péptidos de la presente invención, con preferencia, pero exclusivamente, uno de P1, P4-14S, P6a, P14d, P15a, P18, P19 o<p>25, en combinación con uno o varios insecticidas, nematicidas, fungicidas, otros inoculantes u otros reguladores de plantas, incluyendo combinaciones de múltiples insecticidas o múltiples nematicidas, múltiples fungicidas, otros múltiples inoculantes o múltiples reguladores de plantas. Los insecticidas, nematicidas, fungicidas, inoculantes y reguladores de plantas apropiados para estos tratamientos combinados incluyen aquellos identificados con anterioridad. Estas composiciones se presentan en forma de una composición simple al momento del tratamiento de semillas. Por el contrario, un sistema usado para tratamiento de semillas puede implicar múltiples tratamientos, por ejemplo, una composición que contiene los péptidos se usa en un tratamiento y una composición que contiene uno o varios insecticidas, nematicidas, fungicidas, reguladores de plantas y/o bactericidas, se usa en un tratamiento separado. En la última forma de realización, los dos de estos tratamientos se llevan a cabo a aproximadamente el mismo tiempo, es decir, antes de plantar o a aproximadamente el tiempo de plantado.
Un ejemplo tal incluye uno o varios de péptidos de la presente invención, en combinación con Poncho™ (clotianidina) disponible de Bayer Crop Science, Poncho™ VOTiVO (clotianidina y nematicida biológico de Bacillus firmus) disponible de Bayer Crop Science y Gaucho™ (imidicloprida) disponible de Bayer Crop Science.
Otro ejemplo incluye uno o varios de péptidos de la presente invención, en combinación con Cruiser™ (tiametoxam) disponible de Syngenta, CruiserMaxx™ (tiametoxam, mefenoxam y fludioxinilo) disponible de Syngenta, Cruiser Extreme™ (tiametoxam, mefenoxam, fludioxinilo y azoxistrobina) disponible de Syngenta, Avicta™ (tiametoxam y abamectina) disponible de Syngenta y Avicta™ Complete (tiametoxam, abamectina y Clariva Complete™ que contiene el inoculante biológico de Pasteuria nishizawae - Pn1) disponible de Syngenta y Avicta Complete™ maíz (tiametoxam, mefenoxam, fludioxinilo, azoxistrobina, tiabendazol y abamectina) disponible de Syngenta.
Otro ejemplo incluye uno o varios de péptidos de la presente invención, en combinación con Vault Liquid plus Integral (especies de Bradyrhizobium e inoculantes de la cepa MBI 600 de Bacillus subtilis) disponible de BASF, Vault NP (inoculante de Bradyrhizobium japonicum) disponible de BASF y Subtilex NG (inoculante biológico de Bacillus subtilis) disponible de BASF.
La presente invención también se refiere a métodos para impartir resistencia a las enfermedades a plantas. Estos métodos implican aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado de la invención o una composición de la invención a una planta o semilla de planta o el locus donde la planta crece o se espera que crezca. Como consecuencia de tal aplicación, el péptido entra en contacto con células de la planta o semillas de plantas e induce en la planta o un crecimiento de planta crecida de la semilla de la planta resistencia a la enfermedad. Alternativamente, el péptido o la composición de la invención se puede aplicar a plantas tales como semillas recuperadas de tales plantas en sí son capaces de impartir resistencia a la enfermedad.
En estas formas de realización, también es posible seleccionar plantas o semillas de plantas o el locus al que se aplica el péptido aislado o la composición de la invención. Por ejemplo, para campos conocidos por contener un alto contenido de nematodos, las plantas o semillas de plantas por crecer en tales campos o los campos (locus), se pueden tratar selectivamente por aplicación del péptido aislado o la composición de la invención como se describe en la presente; mientras que ningún tratamiento pueda ser necesario para plantas o semillas de plantas crecidas en campos que contienen bajo contenido de nematodos. De modo similar, para campos que tienen irrigación reducida, las plantas o semillas de plantas por crecer en tales campos o los campos (locus), se pueden tratar selectivamente por aplicación del péptido aislado o la composición de la invención como se describe en la presente; mientras que ninguno de tales tratamientos pueda ser necesario para plantas o semillas de plantas crecidas en campos que tienen una adecuada irrigación. Del mismo modo, para campos tendientes a inundación, las plantas o semillas de plantas por crecer en tales campos o los campos (locus), se pueden tratar selectivamente por aplicación del péptido aislado o composición de la invención como se describe en la presente; mientras que ninguno de tales tratamientos pueda ser necesario para plantas o semillas de plantas crecidas en campos que no tienden a inundación. Como otro ejemplo más de tal selección, para campos tendientes al ataque de insectos en determinados momentos de la estación de cultivo, las plantas o semillas de plantas por crecer en tales campos o los campos (locus), se pueden tratar selectivamente por aplicación del péptido aislado o composición de la invención como se describe en la presente; mientras que el mismo campo puede no ser tratado en momentos inefectivos de la estación de cultivo u otros campos que no tienden a tal ataque. Estas etapas de selección se pueden ser llevar a cabo cuando se ponen en práctica cada uno de los métodos de uso descritos en la presente, es decir, impartir resistencia a las enfermedades a plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, efectuar el control de plagas (incluyendo insectos y nematodos), impartir tolerancia al estrés biótico o abiótico en plantas, y/o modular la señalización bioquímica de la planta.
Como una alternativa a la aplicación de un péptido aislado o una composición que contiene el mismo a plantas o semillas de plantas a fin de impartir resistencia a la enfermedad en plantas, para efectuar el crecimiento de plantas, controlar insectos, impartir resistencia al estrés y/o señalización modulada, se pueden utilizar productos bioquímicos a las plantas o plantas crecidas de las semillas, plantas transgénicas o semillas de plantas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y cultivar la planta en condiciones efectivas para permitir que esa molécula de ADN imparta resistencia a la enfermedad a plantas, mejorar el crecimiento de la planta, controlar insectos, impartir tolerancia a estrés biótico o abiótico, y/o para modular la señalización bioquímica. Alternativamente, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y plantar en suelo. Una planta se propaga luego de la semilla de planta en condiciones efectivas para permitir que la molécula de ADN exprese el péptido e imparta así resistencia a la enfermedad a la planta transgénica, para mejorar el crecimiento de la planta, para controlar insectos, impartir tolerancia a estrés biótico o abiótico, y/o modular la señalización bioquímica.
También se divulgan métodos de mejora de la resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas. Estos métodos implican aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado o una composición a una planta o el locus donde crece la planta. Como una consecuencia de tal solicitud, el péptido entra en contacto con las células de la planta o semillas de planta e induce resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas. Alternativamente, una cantidad efectiva de un péptido aislado o una composición puede aplicarse a una fruta u hortaliza cosechada. Como consecuencia de tal aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la fruta u hortaliza cosechada e induce resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a las frutas u hortalizas tratadas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para las frutas u hortalizas tratadas.
Como una alternativa a la aplicación de un péptido aislado o una composición que lo contiene a plantas o semillas de plantas a fin de inducir resistencia a la desecación a esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas, se pueden utilizar plantas transgénicas o semillas de plantas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y cultivar la planta en condiciones efectivas para permitir que la molécula de ADN induzca resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas. De modo alternativo, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y plantada en el suelo. Luego se propaga una planta de la semilla plantada en condiciones efectivas para permitir que molécula de ADN exprese el péptido e induzca así resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas.
En estas formas de realización, también es posible seleccionar plantas transgénicas o semillas de plantas para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, para campos conocidos por contener un alto contenido de nematodos, las plantas transgénicas o semillas de plantas pueden cultivarse selectivamente en tales campos; mientras que las plantas no transgénicas o semillas de plantas pueden crecer en campos que contienen un bajo contenido de nematodos. De modo similar, para campos que tienen irrigación reducida, las plantas transgénicas o semillas de plantas se pueden cultivar selectivamente en tales campos; mientras que plantas no transgénicas o semillas de plantas pueden crecer en campos que tienen una adecuada irrigación. Del mismo modo, para campos tendientes a inundación, las plantas transgénicas o semillas de plantas puede ser cultivadas en tales campos; mientras que plantas no transgénicas o semillas de plantas pueden ser cultivadas en campos que no tienden a inundación. Como otro ejemplo de tal selección, para campos tendientes al ataque de insectos en determinados momentos de la estación de cultivo, las plantas transgénicas o semillas de plantas pueden ser selectivamente cultivadas en tales campos; mientras que plantas no transgénicas o semillas de plantas puede ser cultivadas en campos que no tienden a tal ataque por insectos. Tales etapas de selección se pueden llevar a cabo cuando se pone en práctica cada uno de los métodos de uso descritos en la presente, es decir, impartir resistencia a las enfermedades a plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, efectuar el control de plagas (incluyendo insectos y nematodos), impartir tolerancia al estrés biótico o estrés abiótico a las plantas, y/o modular la señalización bioquímica de la planta.
También se divulgan métodos de mejora de la resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas. Estos métodos implican aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado o una composición a una planta o el locus donde crece la planta. Como una consecuencia de tal aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la planta o semillas de planta e induce resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas. De modo alternativo, una cantidad efectiva de un péptido aislado de la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención puede ser aplicada a una fruta u hortaliza cosechada. Como una consecuencia de tal aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la fruta u hortaliza cosechada e induce resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a las frutas u hortalizas tratadas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para las frutas u hortalizas tratadas.
En estas formas de realización, también es posible seleccionar plantas, esquejes, frutas, vegetables o el locus al que se aplica el péptido aislado o la composición de la invención. Por ejemplo, para esquejes o frutas u hortalizas cosechados que se envían a grandes distancias o se almacenan durante largos períodos de tiempo, entonces se pueden tratar selectivamente por aplicación del péptido aislado o composición de la invención como se describe en la presente; mientras que los esquejes o frutas u hortalizas cosechados que se envían localmente y se pretenden consumir sustancialmente sin períodos de almacenamiento se pueden excluir de tal tratamiento.
Como una alternativa a la aplicación de un péptido aislado o una composición que lo contiene a plantas o semillas de plantas a fin de inducir resistencia a la desecación a esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de plantas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de plantas, se pueden utilizar plantas transgénicas o semillas de plantas. Cuando se utilizan plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y cultivar la planta en condiciones efectivas para permitir que molécula de ADN para inducir resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas. De modo alternativo, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y plantar en el suelo. Una planta luego se propaga de la semilla plantada en condiciones efectivas para permitir que molécula de ADN exprese el péptido e induzca así resistencia a la desecación para esquejes retirados de plantas ornamentales, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas de las plantas transgénicas.
En estas formas de realización, también es posible seleccionar plantas transgénicas o semillas de plantas para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, las plantas transgénicas o semillas de plantas se pueden seleccionar para cultivo cuando se sabe que los esquejes o frutas u hortalizas cosechados pretenden ser enviados largas distancias o almacenados durante largos períodos de tiempo después de la cosecha; mientras que las plantas no transgénicas o semillas de plantas se pueden seleccionar para cultivo cuando se sabe que los esquejes o frutas u hortalizas cosechados se han de enviar localmente y/o consumir sustancialmente sin períodos de almacenamiento.
Las plantas apropiadas incluyen dicotiledóneas y monocotiledóneas, incluyendo plantas agrícolas, silvícolas, ornamentales y hortícolas, ya sea en una forma natural o una forma genéticamente modificada. Las plantas de ejemplo incluyen, sin limitación, alfalfa, manzana, damasco, espárrago, paltas, bananas, cebada, frijoles, haya (Fagus spec.), begonia, abedul, mora, arándano, col, alcanfor, canola, zanahoria, planta de aceite de ricino, cereza, canela, cítricos, grano de cacao, café, maíz, algodón, pepino, cucurbitáceas, eucalipto, abeto, lino, remolacha forrajera, fucsia, ajo, geranio, vides, nuez, cáñamo, lúpulo, cornillo, Brassica juncea, yute, lenteja, lechuga, semilla de lino, melón, mostaza, nectarina, roble, avena, palma oleífera, colza oleaginosa, oliva, cebolla, pimiento, guisante, durazno, pera, pelargonio, pimientas, petunia, pino (Pinus spec.), ciruela, álamo (Populus spec.), fruta de pepita, papa, nabo, frambuesa, arroz, gomero, centeno, sorgo, soja, espinaca, picea, calabaza, frutilla, remolacha, caña de azúcar, girasol, té, teca, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía, trigo y sauce (Salix spec.), Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, poinsettia, crisantemo, clavel y zinnia.
Con respecto a la señalización bioquímica modificada, esto incluye tanto mejora de ciertas vías bioquímicas de plantas como reducción de ciertas vías bioquímicas de plantas. Las vías de señalización bioquímicas que se pueden alterar de acuerdo con la presente invención incluyen expresión génica y producción de proteínas, producción de metabolitos y producción de moléculas de señalización / metabolitos secundarios. Las vías de señalización bioquímica de ejemplo y sus modificaciones incluyen, sin limitación, inducción de la producción de óxido nítrico, producción de peróxido y otros metabolitos secundarios; agonista de la vía de señalización de etileno e inducción de la expresión génica que responde a etileno (ver Dong et al., Plant Phys. 136:3628-3638 (2004); Li et al., Planta 239:831-46 (2014); Chang et al., PLoS One 10,e0125498 (2015)); agonista de la vía de señalización de ácido salicílico e inducción de la expresión génica que responde al ácido salicílico (ver Dong et al., Plant J. 20:207-215 (1999)); agonista de la vía de ácido abscísico e inducción de expresión génica que responde al ácido abscísico (ver Dong et al., Planta 221: 313-327 (2005)); agonista de la vía de señalización de gibberelina e inducción de la expresión génica que responde a gibberelina (ver Li et al., Planta 239:831-46 (2014)); antagonista de señalización de ácido jasmónico e inhibición de la expresión de genes que responden al ácido jasmónico (ver Dong et al., Plant Phys. 136:3628-3638 (2004)); inducción de la expresión del inhibidor de proteasa (ver Laluk y Mengiste, Plant J. 68:480-494 (2011); Xia et al., Chin. Sci. Bull 56: 2351 2358 (2011)); inducción de la producción de especies de oxígeno reactivo en tejidos de planta; inducción de la producción de péptidos inmunorrelacionados y antimicrobianos, tales como, sin limitación, peroxidasa, superóxido dismutasa, quitinasa y p-1,3-glucanasa (Wang et al., J. Agric. Food Chem. 59:12527-12533 (2011)); e inducción de la expresión génica y la producción de expansina (ver Li et al., Planta 239:831-46 (2014)).
Con respecto a la resistencia a la enfermedad, puede no conferirse inmunidad absoluta contra infección, pero la severidad de la enfermedad se reduce y el desarrollo de los síntomas se demora. Se reducen cantidades de lesiones, tamaño de lesiones y extensión de esporulación de patógenos fúngicos. Este método para impartir resistencia a la enfermedad tiene el potencial para tratar previamente enfermedades no tratables, tratamiento de enfermedades de forma sistémica que pueden no ser tratadas por separado debido a costes y evitar el uso de agentes infecciosos o materiales nocivos para el medio ambiente.
El método para impartir resistencia a patógenos a plantas de acuerdo con la presente invención es de utilidad para impartir resistencia a una amplia variedad de patógenos que incluyen virus, bacterias y hongos. La resistencia, inter alia, a los siguientes virus se puede lograr por medio del método de la presente invención: virus mosaico del tabaco y virus mosaico de tomate. La resistencia, inter alia, a las siguientes bacterias también se puede impartir a plantas de acuerdo con la presente invención: Pseudomonas spp. patógenos, Erwinia spp. patógenos, Xanthomonas spp. patógenos y Ralstonia spp. patógenos. Las plantas se pueden hacer resistentes, inter alia, a los siguientes hongos con el uso del método de la presente invención: Fusarium spp. y Phytophthora spp.
Con respecto al uso de los péptidos o composiciones de la presente invención para mejorar el crecimiento de la planta, se pueden lograr varias formas de mejora del crecimiento o promoción de plantas. Esto puede ocurrir cuando el crecimiento de la planta comienza de semillas o más tarde en la vida de una planta. Por ejemplo, el crecimiento de la planta de acuerdo con la presente invención comprende mayor rendimiento, mayor vigor de la planta, mayor vigor de las plántulas (es decir, posgerminación), mayor peso de la planta, mayor biomasa, mayor cantidad de flores por planta, mayor rendimiento de granos y/o frutos, mayor cantidad de semillas producidas, mayor porcentaje de semillas germinadas, mayor velocidad de germinación, mayor tamaño de planta, menor altura de planta (para trigo), mayor biomasa, más y más grandes frutas, coloración más temprana de la fruta, brotes más tempranos, maduración de la fruta y la planta, mayor cantidad de macollos o brotes laterales, hojas más grandes, senescencia de hojas demorada, mayor crecimiento de brotes, mayor crecimiento de raíces, asignación alterada de raíces / brotes, mayor contenido de proteínas, mayor contenido de aceite, mayor contenido de carbohidratos, mayor contenido de pigmentos, mayor contenido de clorofila, mayor fotosíntesis total, mayor eficacia de la fotosíntesis, reducida respiración (menor uso de O<2>), compensación para tratamientos reductores de rendimiento, mayor durabilidad de los tallos (y resistencia a vertido de tallos), mayor durabilidad de raíces (y resistencia a vertido de raíces), mejor crecimiento de plantas en condiciones de baja luminosidad y combinaciones de ellos. Como resultado, la presente invención proporciona un beneficio económico para agricultores. Por ejemplo, la temprana germinación y temprana maduración permite que los cultivos crezcan en áreas donde las estaciones de cultivo cortas podrían impedir su crecimiento en esa localidad. Mayor porcentaje de germinación de semillas da como resultado mejores posiciones de los cultivos y un uso de semillas más eficaz. Mayor rendimiento, mayor tamaño y mayor producción de biomasa permiten una mayor generación de ingresos de una parcela de tierra dada.
Con respecto al uso de los péptidos o composiciones de la presente invención para controlar plagas (incluyendo, pero sin limitación, insectos y nematodos, que son estresores bióticos), tal control de plagas comprende prevenir que las plagas entren en contacto con plantas a las que se ha aplicado el péptido o la composición de la invención, evitar el daño directo a plantas por lesión por alimentación, causar que las plagas salgan de tales plantas, matar plagas cercanas a tales plantas, interferir con la alimentación de larvas de insectos en tales plantas, evitar que las plagas colonicen la plantas huésped, prevenir la colonización de insectos que liberan fitotoxinas, interferir con la deposición de huevos en plantas huésped, etc. La presente invención también evita el posterior daño de enfermedad a plantas que resultan de la infección por plagas.
La presente invención es efectiva contra una amplia variedad de insectos (estresores bióticos). El perforador europeo del maíz es una principal plaga del maíz (maíz dente y dulce) pero también se alimenta en más de 200 especies de plantas incluyendo guisantes verdes, cera y lima y sojas comestibles, pimientas, papa y tomate más muchas especies de malezas. Las plagas que se alimentan de larvas de insectos adicionales que dañan una amplia variedad de cultivos vegetales incluyen las siguientes: gusano soldado, looper de la col, gusano del maíz, gusano cogollero, polilla espalda de diamante, gusano de la raíz de la col, gusano de la cebolla, gusano de las semillas de maíz, gusano del melón, gusano del pimiento y gusano del tomate. Colectivamente, este grupo se plagas de insectos representa el grupo económicamente más importante de plagas para la producción de vegetales a nivel mundial. La presente invención también es efectiva contra nematodos, otra clase de estresores bióticos económicamente importantes. Los nematodos del quiste de la soja (Heterodera glycines) es una plaga principal de las sojas. El nematodo reniforme (Rotilenchulus reniformis) es una plaga principal del algodón que puede parasitizar especies de cultivos adicionales, notablemente soja y maíz. Las plagas de nematodos adicionales incluyen los nematodos de los nudos de raíz del género Meloidogyne (en particular en algodón, trigo y cebada), nematodos de quistes de cereales del género Heterodera (en particular en soja, trigo y cebada), nematodos de lesión de raíces del género Pratilenchus, nematodos de agallas de semillas del género Anguina (en particular en trigo, cebada y centeno) y nematodos de tallos del género Ditilenchus. Otros estresores bióticos incluyen arácnidos, malezas y combinaciones de ellos.
Con respecto al uso de los péptidos o composiciones de la presente invención para impartir resistencia al estrés abiótico a plantas, este estrés abiótico comprende cualquier factor medioambiental que tiene un efecto adverso sobre la fisiología y el desarrollo de las plantas. Los ejemplos de tal estrés medioambiental incluyen estrés relacionado con el clima (por ejemplo, sequía, inundación, helada, temperatura fría, alta temperatura, luz excesiva y luz insuficiente), estrés por polución de aire (por ejemplo, dióxido de carbono, monóxido de carbono, dióxido de azufre, NOx, hidrocarburos, ozono, radiación ultravioleta, lluvia ácida), productos químicos (por ejemplo, insecticidas, fungicidas, herbicidas, metales pesados), estrés nutricional (por ejemplo, sobre- o subabundancia de fertilizante, micronutrientes, macronutrientes, en particular potasio, derivados nitrogenados y derivados de fósforo) y mayor respuesta de curación a las heridas. El uso de péptidos de la presente invención imparte resistencia a plantas contra tales formas de estrés medioambiental.
Se divulga el uso de los péptidos de la presente invención como un protector en combinación con uno o varios de los agentes activos (es decir, en una composición o en composiciones separadas) para el control de malezas acuáticas en un cuerpo acuático como se describe en la publicación U. S. No. 20150218099 de Mann.
Se divulga el uso de los péptidos de la presente invención como un fortalecedor de planta en una composición para aplicar a plantas crecidas en condiciones de irrigación de agua reducida, cuya composición también incluye al menos un antioxidante y al menos un controlador de la radiación y opcionalmente al menos un regulador del crecimiento de plantas, como se describe en la publicación U. S. No. 20130116119 de Rees et al..
Los métodos de la presente invención que implican la aplicación del péptido o la composición puede llevarse a cabo por medio de una variedad de procedimientos cuando se trata todo o una parte de la planta, incluyendo hojas, tallos, raíces, propágulos (por ejemplo, esquejes), fruta, etc. Esto (pero no necesariamente) implican infiltración del péptido en la planta. Los métodos de aplicación apropiados incluyen pulverización a alta o baja presión, inyección y abrasión de la hojas próximas a cuando la aplicación del péptido tiene lugar. Cuando se tratan semillas de plantas, de acuerdo con la forma de realización de aplicación de la presente invención, la proteína o polipéptido de proteína que induce la respuesta de hipersensibilidad puede ser aplicado por pulverización a alta o baja presión, revestimiento, inmersión (por ejemplo, imbibición) o inyección. Otros procedimientos de aplicación apropiados pueden ser proporcionados por los expertos en el arte siempre que sean capaces de efectuar un contacto del polipéptido o la proteína que induce la respuesta hipersensible con células de la planta o semilla de la planta. Una vez tratadas con los péptidos o composiciones de la presente invención, las semillas se pueden plantar en suelo natural o artificial y se pueden cultivar usando procedimientos convencionales para producir plantas. Después de haber propagado las plantas de semillas tratadas de acuerdo con la presente invención, las plantas se pueden tratar con una o varias aplicaciones de los péptidos o composiciones de la invención para impartir resistencia a la enfermedad a plantas, para mejorar el crecimiento de la planta, para controlar insectos en las plantas, para impartir tolerancia al estrés biótico o estrés abiótico, para mejorar la resistencia a la desecación de esquejes retirados, para impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación a frutas u hortalizas cosechadas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas.
Los péptidos o composiciones de la invención se pueden aplicar a plantas o semillas de plantas de acuerdo con la presente invención solos o en una mezcla con otros materiales. De modo alternativo, los péptidos o composiciones puede ser aplicados por separado a plantas con otros materiales aplicados en diferentes momentos.
En la forma alternativa de realización de la presente invención que implica el uso de plantas transgénicas y semillas transgénicas, puede no ser necesario aplicar un péptido de la invención tópicamente a las plantas o semillas. De hecho, las plantas transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifican un péptido de la invención se producen de acuerdo con procedimientos bien conocidos en el arte. Un vector apropiado para la expresión en plantas (es decir, que contiene secuencias de control de traducción y transcripción operables en plantas) puede ser microinyectado directamente en células de plantas por medio del uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genetics, 202:179-85 (1985). El material genético también se puede transferir a la célula de planta usando polietilenglicol. Krens, et al., Nature, 296:72-74 (1982).
Otro enfoque de a transformación de células de plantas con un gen que codifica el péptido de la invención es bombardeo de partículas (también conocido como transformación biolística) de la célula huésped. Esto puede ser llevado a cabo en una de varias vías. La primera implica la propulsión de partículas inertes o biológicamente activas en las células. Esta técnica se revela en las patentes U. S. Nros. 4.945.050, 5.036.006 y 5.100.792, todas de Sanford et al.. En general, este procedimiento implica la propulsión de partículas inertes o biológicamente activas en las células en condiciones efectivas para penetrar la superficie exterior de la célula e incorporarse dentro de su interior. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede ser introducido en la célula por revestimiento de las partículas con el vector que contiene el ADN heterólogo. De modo alternativo, la célula diana puede ser rodeada por el vector de modo que el vector sea llevado dentro de la célula al despertar la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células bacterianas secas que contienen el vector y ADN heterólogo) también se pueden impulsar en las células de plantas.
Otro método de introducción más es la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sea minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos en superficie de lípidos fusibles. Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1859-63 (1982). La molécula de ADN también se puede introducir en células de planta por electroporación. Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824 (1985). En esta técnica, los protoplastos de planta se electroporan en presencia de plásmidos que contienen el casete de expresión. Los impulsos eléctricos de alta fuerza de campo permeabilizan de forma reversible las biomembranas que permite la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de plantas electroporados reforman la pared celar, se dividen y se regeneran.
Otro método de introducción de la molécula de ADN en células de plantas consiste en infectar una célula de planta con Agrobacteria tumefaciens o A. rhizogenes previamente, transformada con el gen. En condiciones apropiadas conocidas en el arte, las células de planta transformadas se cultivan para formar brotes o raíces y desarrollarse en otras plantas. En general, este procedimiento implica la inoculación del tejido de planta con una suspensión de bacterias e incubar el tejido durante 48 a 72 horas en medio de regeneración sin antibióticos a 25-28 °C. Agrobacteria es un género representativo de la familia gram-negativa de Rhizobiaceae. Sus especies son responsables de la enfermedad de corona biliar (A. tumefaciens) y enfermedad de raíces pilosas (A. rhizogenes). Las células de planta en tumores de corona biliar y raíces pilosas se inducen para producir derivados de aminoácido conocidos como opinas, que se catabolizan sólo por las bacterias. Los genes bacterianos responsables de la expresión de las opinas son una fuente conveniente de elementos de control para casetes de expresión quiméricos. Además, el ensayo de la presencia de opinas se puede usar para identificar tejido transformado. Las secuencias genéticas heterólogas se pueden introducir en células de plantas apropiadas, por medio del plásmido Ti de A. tumefaciens o el plásmido Ri de A. rhizogenes. El plásmido Ti o Ri se transmite a células de plantas en infección por Agrobacteria y se integra establemente en el genoma de planta. J. Schell, Science, 237:1176-83 (1987).
Después de la transformación, las células de plantas transformadas deben ser regeneradas. La regeneración de plantas de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Handbook de Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., New York, 1983); y Nasil I.R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. 1, 1984 y Vol. Ill (1986).
Se sabe que prácticamente todas las plantas puede ser regeneradas de células cultivadas o tejidos. Los medios para la regeneración varían de especie a especie de plantas, pero en general se proporciona primero una suspensión de protoplastos transformados o una placa de Petri que contiene explantes transformados. Se forma tejido de callos y los brotes se pueden inducir de callos y posteriormente de raíces. De modo alternativo, la formación de embriones puede ser inducida en el tejido de los callos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. El medio de cultivo contendrá en general varios aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquininas. También es ventajoso adicionar ácido glutámico y prolina al medio, en especial para tales especies como maíz y alfalfa. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas variables, entonces la regeneración es usualmente reproducible y repetible.
Después de incorporar establemente el casete de expresión en plantas transgénicas, se puede transferir a otras plantas por cruza sexual. Cualquiera de una cantidad de técnicas de cría estándar puede ser usada, según las especies por cruzar.
Una vez producidas las plantas transgénicas de este tipo, las plantas propiamente dichas pueden ser cultivadas de acuerdo con un procedimiento convencional con la presencia del gen que codifica el inductor de la respuesta hipersensible resultante en la resistencia a la enfermedad, mayor crecimiento de la planta, control de insectos en la planta, tolerancia al estrés abiótico o estrés biótico, mayor resistencia a la desecación de esquejes retirados, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación en frutas u hortalizas cosechadas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas.
De modo alternativo, las semillas transgénicas se recuperan de las plantas transgénicas. Estas semillas se pueden plantar luego en el suelo y cultivar usando procedimientos convencionales para producir plantas transgénicas. Las plantas transgénicas se propagan de las semillas transgénicas plantadas en condiciones efectivas para impartir resistencia a la enfermedad a plantas, para mejorar el crecimiento de la planta, para controlar insectos, para impartir tolerancia al estrés abiótico o estrés biótico, para mejorar la resistencia a la desecación de esquejes retirados, impartir resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación en frutas u hortalizas cosechadas, y/o impartir mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas.
Cuando las plantas transgénicas y las semillas de plantas se usan de acuerdo con la presente invención, se pueden tratar adicionalmente con los mismos materiales cuando se usan para tratar las plantas y semillas a las que se aplica un péptido de la invención o composición de la invención. Estos otros materiales, incluyendo péptidos o composición de la invención, puede ser aplicados a las plantas transgénicas y semillas de plantas por medio de los procedimientos antes anotados, incluyendo pulverización a alta o baja presión, inyección, recubrimiento e inmersión. De modo similar, después de propagar las plantas de las semillas de plantas transgénicas, las plantas se pueden tratar con una o varias aplicaciones de los péptidos o composiciones de la invención para impartir resistencia a la enfermedad, mejorar el crecimiento, controlar insectos, tolerancia al estrés abiótico o estrés biótico, resistencia a la desecación de esquejes retirados, resistencia a la enfermedad poscosecha o resistencia a la desecación en frutas u hortalizas cosechadas, y/o mayor longevidad de la maduración de fruta u hortaliza para frutas u hortalizas cosechadas.
Tales plantas transgénicas también se pueden tratar con agentes de tratamiento de plantas convencionales, por ejemplo, agentes bactericidas biocidas, inhibidores de proteasas, tensioactivos no iónicos, fertilizantes, herbicidas, insecticidas, fungicidas, nematicidas, inoculantes biológicos, reguladores de plantas y mezclas de ellos, como se describió con anterioridad.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar las formas de realización de la presente invención, pero no pretenden limitar su alcance de modo alguno.
Ejemplo 1 - desarrollo de péptidos “HR Box” de SEQ ID NO: 93
HR box se desarrolló originalmente en base a examinación de una cantidad de secuencias inductoras de respuesta de hipersensibilidad (P1, SEQ ID NO: 4; P4, SEQ ID NO: 5; y P15, SEQ ID NO: 64, entre otras). Se identificó una secuencia repetida de residuos de leucina e isoleucina. P4 se eligió como una secuencia representativa como la base para estudios mutacionales que revelarían los determinantes de secuencia de inducción de HR. HR en tabaco se ensayó como se describió en Wey, Science 257:85-88 (1992). En resumen, los péptidos se disolvieron a una concentración de 500 |ig/ml en solución acuosa. Cuatro diluciones seriales se llevaron a cabo con un volumen igual de agua, para dar muestras de péptido a 500, 250, 125, 62,5, 31,25 |ig/ml de soluciones de péptido. Se usaron plantas de Nicotiana tabacum cultivar xanti de 5-7 semanas de edad (prefloración). Las hojas se perforaron ligeramente con un mordadientes en un panel de hojas central. Las soluciones de péptido se infundieron luego por medio de una jeringa sin aguja en la herida, llenando el panel. Cada muestra de péptido se infundió en una hoja de 2 plantas diferentes. Las hojas se observaron y se puntuaron durante las siguientes 48 horas respecto de marchitamiento y amarronado, lesiones típicas de la muerte celular programada. Estos estudios mutacionales tenían tres objetivos principales: (1) aumento de la estabilidad de la solución de los péptidos; (2) realización de mutaciones disruptivas para verificar los residuos que son más importantes para la inducción de HR; y (3) realización de mutaciones conservativas para identificar el grado de especificidad para aminoácidos particulares.
Los péptidos se evaluaron respecto de una o varias de solubilidad, estabilidad contra degradación química, efecto de agentes a granel sobre la estabilidad de la solución, protección de la oxidación y estudios de estabilidad de la solución.
La solubilidad se evaluó creando soluciones al 0,2% de AI (ingrediente activo) de péptido puro, químicamente sintetizado en agua desionizada y observando la solución respecto de la evidencia de precipitación durante 48 horas a temperatura ambiente. P1 (SEQ ID NO: 4) era muy insoluble en agua. Sin embargo, la mutante con varios residuos de glutamina que reemplazan los residuos de glutamato (P1-2E,8E,11E,15E,18E, SEQ ID NO: 46) era soluble. P4 (SEQ ID NO: 5) y P4-14S (SEQ ID NO: 6) también eran completamente solubles.
Se corrieron posteriores experimentos para cuantificar mejor la solubilidad de los péptidos. 20-50 mg de péptido puro se mezclaron con 0,25 ml de agua y mayores cantidades de agua se añadieron hasta disolver el péptido. Estos experimentos estiman la solubilidad de P1 (SEQ ID NO: 4) a < 1mg/ml, la solubilidad de P4 (SEQ ID NO: 5) a 100 mg/ml y la solubilidad de P1-18K (SEQ ID NO: 45) a 20 mg/ml.
La estabilidad contra degradación química se evaluó en varios tampones de pH creando soluciones al 0,2% de AI de péptido puro químicamente sintetizado en agua desionizada, 0,25% en peso a volumen de Proxel® GXL (biocida) y 50 milimolar (mM) de ocho tampones (por separado) de la siguiente manera: MES pH 5,6, MOPS pH 6,5, Citrato pH 7,2, EDDS pH 7,3, ED<t>A pH 8, Fosfato pH 8, Imidazol pH 8 y TES pH 8. Las soluciones se observaron en HPLC respecto de la evidencia de la degradación (% de pérdida del péptido señal en el tiempo, respecto a la muestra de tiempo 0) en un período de semanas a temperatura elevada (50 °C). P1-2E,-8E,-11E,-15E,-18E (SEQ ID NO: 46) era más estable que P1 (SEQ ID NO: 4) (40 días vs 20 días al 80%) y P4-14S (SEQ ID NO: 6) era significativamente más estable que P4 (SEQ ID n O: 5) (35 días vs 3 días al 80%). Los mejores tampones para P1 y P4-14S son TES pH 8 y Citrato pH 7,2, en ese orden. La precipitación de P1 se observó después de varios días. Otros péptidos (P1-2E,-8E,-11E,-15E,-18E; P4 y P4-14s) quedaron en solución.
El efecto de agentes a granel sobre la degradación química de P1 y P1-2E,-8E,-11E,-15E,-18E se evaluó creando soluciones al 0,2% de AI de péptido puro químicamente sintetizado en una solución de 50 mM de TES pH 8,0 en agua y 20% en peso a volumen (de solución) de los agentes a granel trehalosa, maltrina, sacarosa o talco (formulaciones separadas). Estas soluciones se observaron en HPLC respecto de la evidencia de degradación (% de pérdida del péptido señal en el tiempo, respecto de la muestra en tiempo 0) en el tiempo a temperatura elevada (50 °C). La concentración de P1 en todas las mezclas cayó a menos del 60% de la concentración del péptido original después de 6 días de incubación. Por el contrario, la concentración de p1-2E,-8E,-11E,-15E,-18E en todas las muestras quedó por encima del 80% de la concentración original durante al menos 14 días. El mejor agente a granel para P1-2E,-8E,-11E,-15E,-18E es talco en polvo (44 días a más del 80%).
Se llevaron a cabo estudios de estabilidad de la solución creando soluciones al 0,2% de AI de péptido puro químicamente sintetizado en agua desionizada, 50 mM de tampón TES, 0,25% de Proxel GXL y 30% de isopropanol. Las soluciones de péptidos se analizaron por HPLC para % de pérdida del péptido señal en el tiempo, respecto de la muestra en tiempo 0. El tiempo de vida máximo de P1-2E,-8E,-11E,-15E,-18E es de 45 días con el 80%. El tiempo de vida máximo de P4-14S es de 140 días del 80%.
Mutaciones de la estabilidad de la solución: la estabilidad de la solución se incrementó seleccionando una secuencia de péptidos (P4, SEQ ID NO: 5) que no contenía residuos de metionina. Sin embargo, este péptido contenía un residuo de cisteína, que llevó a una muy pobre estabilidad. La mutación de esta cisteína en el reemplazo conservativo serina (cambio de azufre por oxígeno en la estructura química) generó P4-14s (SEQ ID NO: 6), que retenía su capacidad de inducir la HR. Posteriormente se mostró (como se observó con anterioridad) que P4-14s es un péptido muy estable. Los estudios adicionales reemplazaron uno o varios residuos de glutamina con residuos de glutamato para reducir la oportunidad de desamidación en solución. En particular, una variante de P1, denominada P1-2E, 8E, 11E, 15E, 18E (SEQ ID NO: 46), contenía estas mutaciones en las posiciones 2, 8, 11, 15 y 18. Este péptido exhibía tanto mayor solubilidad como estabilidad en comparación con P1.
En base a la estructura estable de P4-14s (SEQ ID NO: 6), se introdujeron mutaciones disruptivas simples en residuos específicos dentro de la secuencia. En el caso de residuos de leucina, se mutaron a alanina (cadena lateral más pequeña y menos hidrofóbica, una mutación moderadamente disruptiva) y/o ácido aspártico (cadena lateral cargada negativamente, una mutación altamente disruptiva). Las secuencias intervinientes, según la identidad del aminoácido en cuestión, se mutaron para tener una carga negativa (ácido aspártico o ácido glutámico), tienen una cadena lateral hidrofóbica (valina), una mínima cadena lateral (alanina) o una pequeña cadena lateral polar pequeña (serina). Estos péptidos mutantes se ensayaron por producción de la respuesta de hipersensibilidad. Se eligieron mutaciones adicionales en base a los resultados de HR iniciales. Además, el espaciado entre los residuos de leucina/isoleucina se evaluó ya sea suprimiendo un residuo simple entre las repeticiones de leucina (denotadas con 'del') o insertando un residuo de alanina entre las repeticiones de leucina (denotadas con iA).
Para esos aminoácidos que eran importantes para la producción de HR, se eligieron mutaciones más conservativas para determinar la especificidad de interacciones. Los residuos de leucina se mutaron a isoleucina, valina, fenilalanina o tirosina, siendo los últimos 2 residuos menos conservativos. Como antes, estas mutantes se ensayaron respecto de inducción de la HR.
Los resultados de estos estudios de mutación se resumen en la siguiente Tabla 12:
En la Tabla 12, la secuencia de P4-14s se muestra junto con todas las mutaciones ensayadas en cada posición. Esas mutaciones que no interfieren con la respuesta hipersensible se enumeran en la columna rotulada “Mutaciones de HR Positivas” rotuladas. Esas mutaciones que causaban una reducción de la gravedad de la respuesta hipersensible se muestran en la columna rotulada “Mutaciones de HR débiles”. Las mutaciones que eliminaron la respuesta hipersensible se muestran en la columna roja rotulada “Mutaciones de HR Negativas”. La notación dN2 y dN4 denotan una supresión de 2 o 4 residuos, respectivamente, desde el inicio del péptido; dC2 denota una supresión de 2 residuos del extremo del péptido; del denota una supresión del residuo en esa posición; y iA representa la inserción de un residuo de alanina antes de esa posición.
Ejemplo 2 - Solubilidad y estabilidad de péptidos P1 y mutantes
Como se describió con anterioridad, las secuencias derivadas de P1 y P1 mutadas en la posición 18 (metionina reemplazada con alanina, treonina o lisina) se evaluaron respecto de la estabilidad de la solución y la compatibilidad química durante 14 días. Notablemente, P1 exhibió problemas de solubilidad a menor pH (en solución de agua desionizada, en 50 mM de citrato pH 5,6 y en 50 mM de MES pH 6,0). En estos casos, la concentración de péptido aumentó después de una incubación de 24 horas a 50 °C. Notablemente, los péptidos mutantes no exhibían en general este tejido. Como se muestra en las Figuras 1-3, los datos se normalizaron al 100% de péptido en el punto temporal del día 1 (mostrado como péptido 1* en la leyenda y los datos originales de péptido 1 se marcan con un doble asterisco **). En un ensayo de estabilidad disuelto en agua (Figura 1), el péptido 1 era modestamente estable, pero exhibía problemas de solubilidad. Las mutantes 18K y 18A exhibían una estabilidad ligeramente mayor (10-25% después de 14 días). Disuelto en un tampón ligeramente ácido de citrato (Figura 2), P1 exhibió tanto problemas de solubilidad como de estabilidad. No se detectó por HPLC después de 14 días en solución. Contrariamente, las mutantes 18T y 18K retenían el 80% de la concentración original y la mutante 18A retenía ~60% de la concentración original. Como se muestra en la Figura 3, en 50 mM de MES pH 6,0, P1 exhibió problemas de solubilidad más fuertes, con un incremento del 50% en concentración soluble después de una incubación de 24 horas a 50 oC. Sin embargo, exhibía mejor estabilidad que las mutantes (10-30% después de 14 días). En citrato pH 7,2 (Figura 6), P1 no exhibía problemas de solubilidad, pero exhibía pobre estabilidad (20% de la concentración original después de 7 días a 50 °C. Por el contrario, las mutantes 18k y 18T exhibían > 60% de estabilidad después de 14 días. En 50 mM de EDDS, pH 7,3 (Figura 7), el Péptido 1 exhibía pobre estabilidad, con sólo 10% del material que quedaba después de 7 días. En comparación, las mutantes retenían al menos 50% de material de partida después de 14 días. En 50 mM de imidazol, pH 8,0 (Figura 8), el Péptido 1 exhibía en particular baja estabilidad, se redujo a menos del 10% de la concentración original después de sólo 3 días. En comparación, todas las mutantes exhibían mayor estabilidad, donde las mutantes 18K y 18T retenían el 60-75% del material original después de 14 días. El Péptido 1 exhibía mejor estabilidad en una solución de 50 mM de EDTA, pH 8,0 (Figura 9), haciendo coincidir el rendimiento de la mutante 18A. Sin embargo, las mutantes 18K y 18T exhibían mejor estabilidad después de 14 días incubadas a 50o C (15-20% de mejora). Cuando se diluían en fosfato, pH 8,0 (Figura 10), el Péptido 1 parece superar la estabilidad de las mutantes, a pesar de que exhibe problemas de solubilidad (cierta turbidez en solución). En una solución de 50 mM de TES, pH 8,0 (Figura 11), el Péptido 1 se degrada más del 90% después de 1 semana de incubación a 80 oC. En comparación, las mutantes 18T, 18K y 18A exhiben mejor rendimiento (71%, 58% y 47% quedaba después de 14 días de incubación a 50 oC).
En general, el Péptido 1 exhibe problemas de solubilidad o baja estabilidad en una amplia variedad de soluciones tamponadas. Esto se realiza por mutación de metionina a otros residuos. Los residuos a granel (treonina y lisina) parecen preferirse en general a la alanina respecto de la estabilidad.
Ejemplo 3-Solubilidad y estabilidad de péptidos P4 y mutante
Como se describió con anterioridad, las secuencias derivadas de P4 y P4 mutadas en la posición 14 (cisteína reemplazada por alanina/A, ácido aspártico/D, lisina/K, glutamina/Q y serina/S) se evaluaron respecto de la estabilidad de la solución y la compatibilidad química durante 14 días. En general, el péptido 4 exhibía muy pobre estabilidad debido a la presencia de cisteína (Figuras 12-21). Después de menos de 1 día, el pico original P4 de HPLC no se detectó en las muestras. En comparación, todas las mutantes exhibían mejor estabilidad. La mayoría de ellas retenía al menos el 50% del material original durante 14 días a 50 oC. En general, los mutantes de péptido 4 exhiben mejor estabilidad a mayores valores de pH (> 7,0). Notablemente, p4-14s pueden exhibir regularmente una estabilidad del 90% después de 14 días, según las condiciones. Todos los péptidos mutantes exhibían la respuesta hipersensible cuando se infiltraba en hojas de tabaco (como en el ejemplo 1).
Ejemplo 4-Comparación de la estabilidad del Péptido 1 y Péptido 4
A pesar de que el péptido 1 y el péptido 4 exhiben un alto grado de similitud de secuencia, las mutantes de péptido 4 estabilizadas son más estables que las mutantes p1. Se realizó una serie de mutaciones de p1 para conferir una estabilidad similar a p4-14s. Ellas son: p1-1S (SEQ ID NO: 109, Tabla 1), p1-14S (SEQ ID NO: 110, Tabla 1), p1-18Q (SEQ ID NO: 115, Tabla 1), p1-23P (SEQ ID NO: 118, Tabla 1). Estos péptidos, junto con p1 y p4-14s, se disolvieron en el 30% de isopropanol, 5 mM de DTPA y 50 mM de TES pH 8,0 y se ensayaron respecto de la estabilidad a 50 °C. Se observó una estabilidad similar para p4-14S y p1-1S, lo que indica que el aminoácido N-terminal exhibe un fuerte efecto sobre la estabilidad del péptido.
Ejemplo 5 - Solubilidad para P15b y mutantes
Los resultados iniciales sugieren que p15b tiene problemas de solubilidad. Tiene una hidrofobicidad relativamente alta (0,19). A 0,2% p/v, era parcialmente soluble en agua, insoluble en 50 mM de cada uno de citrato pH ~5,2, citrato pH 7,0, fosfato pH 7,0 (control), TES pH 8,0, EDTA pH 8,0 y EDDS pH 7,0. Era al menos parcialmente soluble en 50 mM de MES pH 6,0 y MOPS pH 6,5. Sin embargo, P15a se disuelve más fácilmente en soluciones acuosas. Su solubilidad es > 10 mg/ml en 50 mM de TES pH 8,0. Se sintetizaron variantes adicionales de p15 que incluían rótulos de solubilidad de poli-glutamato (p15-59G y p15-59, SEQ ID NOS: 149 y 150, respectivamente). Cuando p15-59 se disolvió en 50 mM de TES, pH 8,0, exhibía una solubilidad > 10 mg/ml (1% p/v).
Ejemplo 6 - Estabilidad de P17/P18 & Variantes
Como se describió con anterioridad, se ensayó P18 (SEQ ID NO: 83) respecto de la estabilidad y compatibilidad química con diferentes tampones de pH. P18 exhibe una estabilidad relativamente pobre en soluciones tamponadas acuosas a 50 °C. La mayoría de las muestras se degradó al 20% de la concentración original en 3 días. Una excepción es una solución de 50 mM de EDTA, que se degrada al 35% después de 7 días (Fig. 24). La mutación de la metionina en la posición 12 en leucina (in P18-4, SEQ ID NO: 164) causa una estabilización moderada: 60% de estabilidad después de 14 días. Notablemente, la truncación de los últimos 3 aminoácidos del término C (P18-1, SEQ ID NO: 163) también lleva a una estabilidad dramáticamente incrementada (>90% de estabilidad durante el ensayo de 14 días).
Ejemplo 7 - estabilidad de P19 & Variantes
En general, P19 (SEQ ID NO: 89) exhibe una estabilidad relativamente alta, >80% de estabilidad durante 14 días a 50 °C en una variedad de condiciones. Las excepciones eran péptido disuelto en agua solo (52%) o 50 mM de TES pH 8,0 (62%). La mutación de su residuo de metionina en la posición 12 en leucina (P19-20L, SEQ ID NO: 90) lleva a un aumento modesto de estabilidad cuando se disuelve en 50 mM de citrato pH 7,2 o 50 mM de TES, pH 8,0 (Figs. 25 y 26). Cuando se usan usando tampones a menor pH (5,5-7,0), el rendimiento de P19 y P19-20L se observó como similar; más del 80% de péptido quedó retenido durante 14 días.
Ejemplo 8 - estabilidad de P14d, P14e, P14f
La secuencia de P14d (SEQ ID NO: 175) se deriva de la secuencia de popA de Ralstonia solanacearum. Conforma el motivo HR-box y causa una HR en hojas de tabaco. La mutación de los residuos de metionina generó los péptidos estabilizados P14e (SEQ ID<n>O: 176) y P14f (SEQ ID NO: 177). Los péptidos mutados exhiben >85% de estabilidad durante >50 días a 50 °C (en 50 mM de TES, pH 8,0 y 30% de isopropanol). Durante el mismo período de tiempo, P14d exhibe aproximadamente el 50% de estabilidad química.
Ejemplo 9 - ensayos de crecimiento
Para ensayos de crecimiento, se plantaron semillas de maíz y soja en pisos con 2 semillas por celda dentro del piso en una instalación de invernadero. Las semillas se dejaron germinar y la planta más pequeña se entresaca, dejando una planta por celda. Una vez expendidas por completo las primera hojas verdaderas y que comenzaran a expandirse las segundas hojas, las plantas se midieron inicialmente en cuanto a la altura. Esto se realizó por estiramiento de la hoja más alta hacia arriba y medición de la distancia al suelo. Los péptidos se disolvieron en agua a las concentraciones indicadas (abajo). Las plantas se trataron luego con un spray foliar usando botellas de pulverización ampliamente disponibles hasta que el líquido se hizo gotear desde las hojas.
4 pisos de 14 plantas cada uno se trataron por condición (péptido o control). Se trataron maíz y soja como se indicó en la Tabla 13 y se compararon con plantas de control tratadas con agua coincidentes. Las plantas se dejaron crecer durante 14 días. La altura de las plantas se midió otra vez y se comparó con la altura original para cuantificar el crecimiento. En algunos casos, las plantas se dejaron crecer sin irrigación durante 2-4 días hasta el inicio de marchitamiento y estrés por sequía. En este momento, las porciones por encima de la tierra de las plantas se cosecharon y se pesaron para determinar la masa fresca. Finalmente, el material aéreo se secó a 70 °C durante 48 horas y se pesó para determinar la biomasa seca. Los resultados de estos ensayos de crecimiento se muestran en la Tabla 13. El crecimiento, la biomasa seca y la masa fresca se calculan como el % de aumento respecto del control tratado con agua.
N.D. = No determinado.
Varios de los péptidos ensayados exhiben aumentos de crecimiento y/o biomasa en maíz y soja. Notablemente, a pesar de que P15b no causaba un crecimiento abierto o fenotipo de biomasa seco, causaba un incremento en biomasa fresca que sugiere una mayor captación o retención de agua. Esta es una indicación de tolerancia a la sequía en aquellas plantas tratadas. Se observó que otro péptido, P30-3, causaba un incremento del crecimiento, la masa fresca y biomasa seca.
Ejemplo 10 - Mínimas secuencias requeridas para la respuesta HR
Después de determinar los residuos más críticos para la inducción de la respuesta hipersensible, diseñamos mutantes adicionales para verificar la secuencia de péptidos más pequeñas responsable de su comportamiento. Debido a la naturaleza hidrofóbica de la secuencia central de HR (que contiene 7 residuos de leucina o isoleucina en 13 residuos en total), se reconoció que la solubilidad sería un problema para el péptido mínimo. Como resultado, las secuencias hidrofílicas se añadieron a muchos péptidos para llevar la hidrofobicidad en la escala de Kite-Doolittle a alrededor de -0,2 para los péptidos.
Inicialmente, se usó una secuencia de poli-lisina o poli-arginina, es decir, P4 que tiene una secuencia poliR o poliK ligada a N o una secuencia poliR o poliK ligada a C (SEQ ID NOS: 35, 36, 38, 39). Sin embargo, cuando se infiltró en hojas de tabaco, estos péptidos causaron lesiones necróticas no típicas de HR. Esto llevó a la hipótesis de que las secuencias policatiónicas causan una respuesta tóxica cuando se infiltra en hojas de tabaco. Cuando la poli-lisina y poli-arginina sola se infiltró en la hoja, se observó una lesión necrótica similar. Como resultado, se discontinuó el ensayo de péptidos con solubilidad catiónica que mejoraba las secuencias. Notablemente, los péptidos HR+ pueden contener al menos uno o dos aminoácidos catiónicos, pero mayores números de cargas positivas parecen ser nocivas. Como un sustituto para péptidos catiónicos, se consideraron los polianiones, específicamente el poli-glutamato. El poli-glutamato se eligió dado que el aspartato tiene una mayor posibilidad de isomerizar en iso-aspartato y se añadió serina en el término N para eliminar la formación de ácido piroglutámico en el término N del péptido. También es razonable añadir residuos de glutamato en el extremo C del péptido.
El ensayo de respuesta hipersensible se corrió como se describió en el ejemplo No. 1. Para P4, la variante de péptido más pequeña que producía HR era P4-poliE-min3 (SEQ ID NO: 33). Para P1, la variante de péptido más pequeña que producía HR era P1-poliE-min3 (SEQ ID NO: 141). Para P18, la variante de péptido más pequeña que producía HR era P18-7 (SEQ ID NO: 167). Para P19, la variante de péptido más pequeña que producía Hr era P19-8 (SEQ ID NO: 173). Para P15, la variante de péptido más pequeña que producía HR era P15-59 (SEQ ID NO: 150). Para P14d, la variante de péptido más pequeña que producía HR era P14-30 (SEQ ID NO: 178). Para P25, la variante de péptido más pequeña que producía H<r>era P25-11 (SEQ ID NO: 188). Además, se generaron secuencias peptídicas mínimas que incorporaban la característica de secuencia de repetición de leucina de HR-box y residuos de ácido glutámico en las posiciones variables para incrementar la solubilidad. Estas secuencias son: P30-2 (SEELEELLEELIEELL, SEQ ID NO: 189), P30-3 (LEELLEELIEELLEE, SEQ ID NO: 190) y P30-4 (LEELLEELIEELL, SEQ ID NO: 210). Estas secuencias mínimas HR-box eran solubles > 5 mg/ml en 50 mM de TES y produjeron una respuesta HR cuando se infiltraban en hojas de tabaco.
Del mismo modo, se desarrollaron péptidos adicionales para mayor solubilidad en base a secuencias de estructura hidrofóbica de P3, P25, P14, P15 y P19. Se enumeran en la Tabla 10, supra.
En base al comportamiento previamente descrito de las harpinas y péptidos HR+, se espera que estos nuevos péptidos tengan una bioactividad de mayor amplitud incluyendo inducción de resistencia a TMV, resistencia a nematodos, mayor resistencia a estrés y sequía, mayor crecimiento y mayor rendimiento como se describe en la solicitud PCT WO 01/98501 de Fan et al..
Ejemplo 11 - Derivados de péptido P1 que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P1 para determinar la secuencia mínima requerida para HR y para identificar residuos de importancia. Los siguientes péptidos de la Tabla 14 se determinaron para ser positivos para HR:
Tabla 14
Nombre del Secuencia SEQ ID NO: péptido
P1 NQGISEKQLDQLLTQLIMALLQQ 4
P1-allE, NEGISEKELDELLTELIEALLQQ 46
P1-18T NQGISEKQLDQLLTQLITALLQQ 42
P1-18E NQGISEKQLDQLLTQLIEALLQQ 43
P1-18A NQGISEKQLDQLLTQLIAALLQQ 44
P1-18K NQGISEKQLDQLLTQLIKALLQQ 45
P1-1S SQGISEKQLDQLLTQLIMALLQQ 109
P1-14S NQGISEKQLDQLLSQLIMALLQQ 110
P1-18Q NQGISEKQLDQLLTQLIQALLQQ 115
P1-23P NQGISEKQLDQLLTQLIMALLQP 118
poliE-min3p1 SEEEEELDQLLTQLIEALL 141
Ejemplo 12 - Derivados de péptido P3 que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P3 para determinar la mínima secuencia requerida para h R e identificar residuos de importancia. Los siguientes péptidos de la Tabla 15 se determinaron como positivos para HR.
Tabla 15
Nombre del Secuencia SEQ ID NO: péptido
P3 QNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDGQDGT 204
P3-3 SDPMQQLLKMFSEIMQSLF 205
P3-4 SEEELQQLLKLFSEILQSLF 206
P3-6 SEEEEELQQLLKLFSEILQSL 207
P3-7 SEEEEELQQLLKLFSEILQS 208
Es notable que P3 parezca requerir una secuencia más larga que la repetición mínima HR-box para inducción eficaz de HR. Esto se puede deber a los residuos subóptimos de fenilalanina y la presencia de sólo un residuo K simple para separar los residuos hidrofóbicos (LLKLF en P3 y sus variantes) presentes en esta secuencia. Sin embargo, es importante notar que los residuos adicionales hidrofóbicos no son estrictamente necesarios, considerando que P3-6 y P3-7 causan HR.
Ejemplo 13 - Derivados de Péptido P25 que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P25 para determinar la secuencia mínima requerida para HR e identificar los residuos de importancia. Los siguientes péptidos de Tabla 16 se determinaron como positivos para HR.
Tabla 16
Nombre del Secuencia SEQ ID NO:
péptido
P25 GGLTLTGVLQKLMKILNAL 182
P25s EDQGGLTLTGVLQKLMKILNAL 183
P25-4 EDQGGLTLTGVLQKLMKILNALVQ 181
P25-10 SEEEEELTLTGVLQKLLKILEAL 187
P25-11 SEEEEELTGVLQKLLKILEAL 188
P25-15 SEEEEELTLTGVLQKLLKILEA 200
P25-16 SEEEEEVLQKLLKILEALV 201
P25-17 SEEEEELQKLLKILEALVQ 202
Es importante notar que las variantes P25 parecen requerir mayor secuencia que el consenso HR mínimo (SEQ ID n O:93) para inducción de HR. Esto se puede deber a la presencia de residuos de valina donde se prefiere leucina o debido a la presencia de un residuo hidrofílico simple entre las repeticiones hidrofóbicas (LLKIL). A pesar de que incluimos P25-15, P25-16 y P25-17 como HR+, exhibían una respuesta hipersensible muy débil que sólo se producía en algunas plantas de tabaco a la máxima tasa de aplicación. Notablemente, el contenido adicional de secuencia no parece requerir residuos de leucina/isoleucina/valina, como se sugería por la respuesta biológica a P25-15.
Ejemplo 14 - Derivados de Péptido P14d que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P14 para determinar la secuencia mínima requerida para HR e identificar los residuos de importancia. Los siguientes péptidos de Tabla 17 se determinaron como positivos para HR.
Tabla 17
Nombre del Secuencia SEQ ID NO: péptido
P14d QDPMQALMQLLEDLVKLLK 175
P14e QDPAQALLQLLEDLVKLLK 176
P14f QDPAQALEQLLEDLVKLLK 177
P14c QAGPQSANKTGNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKLLK 199
P14-30 SEEEEEALEQLLEDLVKLLK 178
Es importante notar que variantes P14d parecen requerir mayor secuencia que el consenso HR mínimo (SEQ ID NO: 93) para inducción de HR. En particular, el residuo adicional C-terminal de lisina parece ser requerido para la actividad. Esto se puede deber a la presencia de un único residuo hidrofílico entre las repeticiones hidrofóbicas (LVKLL).
Ejemplo 15 - Derivados de Péptidos P15/P20 que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P15/P20 para determinar la secuencia mínima requerida para HR e identificar los residuos de importancia. Los siguientes péptidos de Tabla 18 se determinaron como positivos para HR.
Tabla 18
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: P15a NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIMSLLQM 63 P15b KPNDSQSNIAKLISALIMSLLQ 49 P20 GTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISJJMSLL 65 P15-8D-18E KPNDSQSDIAKLISALIESLLQ 50 P15-dN4 SQSNIAKLISALIMSLLQ 227 P15a-39P NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIMSLLQP143 P15a-34Q NFGTPDSTVQNPQDASKPNDSQSNIAKLISALIQSLLQM 144 p15-59 SEEEEEEIAKLISALIESLLE150
Ejemplo 16 - Derivados de Péptidos P17/P18 que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P17 y P18 para determinar la secuencia mínima requerida para HR e identificar los residuos de importancia. Los siguientes péptidos de Tabla 19 se determinaron como positivos para HR.
Tabla 19
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: P17 [*]QQPIDRQTIEQMAQLLAQLLKSLL 81
P18 QQPIDRQTIEQMAQLLAQLLKSLLSPQ 83
P18—1 QQPIDRQTIEQMAQLLAQLLKSLL 163
P18-2 QQPIDRQTIEQLAQLLAQLLKSLL 229
P18-3 QQPIDRQTIEQLAQLLAQLLKSLLSP 228
P18-4 DRQTIEQLAQLLAQLLKSLLSP 164
P18-5 QTIEQLAQLLAQLLKSLLSP 165
P18-6 SEEEEEIEQLAQLLAQLLKSLL 166
P18-7 SEEEEELAQLLAQLLKSLL 167
P18-10 SEEEEELAELLAELLKSLL 231
[*] = N-terminal secuencia de TSSSPGLFQSGGDNGLGGHNANSALG
Ejemplo 17 - Derivados de péptidos P19 que causan la respuesta HR en tabaco
Se corrieron ensayos de HR (descritos en el Ejemplo 1) en variantes de P19 para determinar la secuencia mínima requerida para HR e identificar los residuos de importancia. Los siguientes péptidos de Tabla 20 se determinaron como positivos para HR.
Tabla 20
Nombre del péptido Secuencia SEQ ID NO: P19 ITPDGQGGGQIGDNPLLKAMLKLIA 89
P19-20L ITPDGQGGGQIGDNPLLKALLKLIA 90
P19a ITPDGQGGGQIGDNPLLKAMLKLIARMMDG 91 P19a—aML ITPDGQGGGQIGDNPLLKALLKLIARLLDG 92
P19-4 QGGGQIGDNPLLKAMLKLIARMMDG 226
P19-7 SEEEEEELLKALLKLIARLL172
P19-8 SEEEEELKALLKLIARLL 173
P19-11 SEEEEEIGDNPLLKALLKLIARLL 171
Es importante notar que a pesar de que P19 y P19—1 exhiben HR, no concuerdan por completo con la secuencia consenso HR-box (SEQ ID NO: 93). Sin embargo, la adición de la secuencia contexto en P19-2 y P19-3 lleva a una secuencia que está conforme con el consenso. Probablemente los residuos adicionales de isoleucina en P19 y P19-1 (isoleucina N-terminal y la secuencia IGDN) incrementan la propensión a la inducción de HR.
Ejemplo 18 - Resistencia inducida de tabaco a infección con el virus mosaico del tabaco
Se ensayaron péptidos respecto de la inducción de resistencia al virus mosaico del tabaco (TMV) en tabaco. En resumen, tres plantas de tabaco de 6-8 semanas de edad se seleccionaron por grupo (muestras y controles). La hoja de más abajo de la planta se cubrió y la planta se pulverizó con una solución de agua (control negativo), péptido o Proact (control positivo). El spray se aplicó hasta que las hojas estuvieran totalmente humectadas, indicado por chorreado de líquido de las hojas. Las plantas se dejaron secar luego y se retiró la cobertura de la hoja.
Tres días después del tratamiento, la hoja previamente cubierta y una hoja del lado opuesto de la planta se pulverizaron luego ligeramente con tierra de diatomeas y se aplicaron 20 ul de una solución de 1,7 ug/ml de virus mosaico del tabaco purificado. La solución TMV luego se dispersó sobre la superficie de la hoja por ligera fricción de la solución y la tierra de diatomeas sobre la superficie de las hojas. Dos minutos después de la inoculación, la tierra de diatomeas se enjuagó de las hojas con agua. 3 días después de la inoculación de TMV, las hojas se calificaron en base a la cantidad de lesiones de TMV observadas. La hoja también se calificó con signos de la repuesta de hipersensibilidad, incluyendo amarilleo y marchitamiento de las hojas afectadas.
La efectividad descrita en la Tabla 21 se refiere al % de declinación en las lesiones TMV en plantas tratadas vs UTC. Una reducción de TMV en hojas cubiertas indica una respuesta inmune sistémica en la planta mientras que una reducción en hojas no cubiertas indica una respuesta local. Los asteriscos indican que el valor P derivado de un ensayo T era < 0,05.
Tabla 21: Síntesis de la resistencia de TMV
En general, los péptidos que producen una respuesta de hipersensibilidad en tabaco también confieren una fuerte resistencia a TMV. Los péptidos proporcionaban resistencia en las hojas que recibían el tratamiento. Sin embargo, los péptidos también causaban “resistencia adquirida del sistema” donde una respuesta inmune en una parte de una planta activa la señalización que incrementa inmunidad en otras partes de la planta. Esto se mostró por la infección reducida de TMV en hojas cubiertas que no recibían directamente el tratamiento con el péptido. Los péptidos que causaban en particular fuertes respuestas inmunes incluían algunas de las mínimas secuencias peptídicas HR box: P14d, p25-11 y P30-3.
Ejemplo 19 - Efecto del tratamiento de semillas de péptido en el crecimiento de raíces y brotes
Se ensayaron péptidos respecto de los efectos biológicos sobre la asignación de recursos de crecimiento a los brotes (aéreos) y raíces (subterráneas). Los péptidos se disolvieron a 0,2, 2 o 5 pg/ml en un volumen total de 100 ml de agua desionizada. Semillas de maíz o soja luego se embebieron durante una hora en la solución del péptido. Las plantas de control no tratadas (UTC) se embebieron en agua desionizada. Se prepararon recipientes de bebida de 300 ml de plástico transparente (Solo®, Dart Container Corporation) para plantar marcando la parte inferior con una cruz, dividiendo la parte inferior en cuatro cuadrantes iguales. Los recipientes se llenaron luego con suelo Sunshine Mix #1 (SunGro Horticulture) tamizados a %”. Se añadieron 100 ml de agua al suelo. Las semillas tratadas se plantaron luego por compresión ligera de las semillas sobre la parte superior del suelo. Las semillas se cubrieron luego con 50 ml adicionales de suelo suelto. Las semillas se dejaron germinar y crecer durante 12 - 14 días.
La longitud de los brotes se midió como la distancia desde el suelo hasta la punta ligeramente estirada de la hoja más alta para cada planta. Las plantas que fallaban en la germinación o que exhibían un crecimiento detenido se retiraron del ensayo. El retraso en el crecimiento se definió como falta de una hoja verdadera totalmente expandida al momento de la recolección de datos o que tiene una hoja verdadera expandida juzgada a simple vista en < A del área de la hoja promedio del grupo de tratamiento. En general, se plantaron 30 semillas por grupo de tratamiento y se usaron 15 - 25 plantas para la colección de datos.
El crecimiento de las raíces se estimó por recuento de la cantidad de veces que una raíz primaria cruza las marcas del cuadrante en la parte inferior del recipiente. A menudo se observaron a lo largo de la circunferencia inferior del recipiente, a pesar de que algunos eran visibles a lo largo del lado del recipiente y se contaron como si cruzaran una extensión vertical de línea del cuadrante. Este número se dividió por 4 para producir un índice de crecimiento de las raíces. Se halló que este índice correlacionaba con ~90% con el largo de las raíces primario total medido (suma de los largos de todas las raíces primarias después de enjuague del suelo de raíces y medición directa).
Tabla 22: Síntesis de crecimiento de raíces y brotes

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido aislado que:
consiste en la secuencia de aminoácidos de
XXXXXXXXXXX(L/M)XXLLXXLLXXLLXXX (SEQ ID NO: 18) y opcionalmente hasta 3 aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal, en donde
X en la posición 1 es opcional y, cuando está presente, es Q;
X en la posición 2 es opcional y, cuando está presente, es Q;
X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente, es P o S;
X en la posición 4 es opcional y, cuando está presente, es I, S o E;
X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente, es D, E o Q;
X en la posición 6 es opcional y, cuando está presente, es R, S o E;
X de la posición 7 es opcional, y cuando está presente, es Q o E;
X en la posición 8 es opcional y, cuando está presente, es T o E;
X en la posición 9 es opcional y, cuando está presente, es I o E;
X en la posición 10 es opcional y, cuando está presente, es E o K;
X en la posición 11 es opcional y, cuando está presente, es Q o E;
X en la posición 13 es A;
X en la posición 14 es Q o E;
X en la posición 17 es A;
X en la posición 18 es Q o E;
X en la posición 21 es K o E;
X en la posición 22 es S;
X en la posición 25 es opcional y, cuando está presente, es S o E;
X en la posición 26 es opcional y, cuando está presente, es P o E; y
X en la posición 27 es opcional y, cuando está presente, es Q o E.
2. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido contiene la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 83-88, 163-167, 228, 229 y 231.
3. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 83-88, 163-167, 228, 229 y 231.
4. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que uno o más de los aminoácidos en las posiciones 1 a 11 y/o en las posiciones 25 a 27 no están presentes.
5. El péptido aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el péptido es al menos 90% puro.
6. Un polipéptido de fusión que comprende una pluralidad de secuencias de aminoácidos enlazadas entre sí en serie, comprendiendo cada una de las pluralidades de secuencias de aminoácidos el péptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.
7. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende además un rótulo de purificación.
8. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende además una secuencia de enlace escindible entre unidades adyacentes de la pluralidad de secuencias de aminoácidos.
9. Una composición que comprende uno o más péptidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o un polipéptido de fusión de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8, y un vehículo.
10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende además un aditivo seleccionado del grupo que consiste en fertilizante, herbicida, insecticida, fungicida, nematicida, un agente bactericida, un inóculo biológico, un regulador de plantas y mezclas de los mismos.
11. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el vehículo es un vehículo acuoso o un vehículo sólido en forma de partículas.
12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el vehículo es un vehículo acuoso y el vehículo acuoso comprende además uno o más de un agente biocida, un inhibidor de proteasa, un tensioactivo no iónico o una combinación de los mismos.
13. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el vehículo es un vehículo sólido y el vehículo sólido es un polvo seco.
14. Un método para impartir resistencia a las enfermedades a las plantas que comprende:
aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, un polipéptido de fusión de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8, o una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 13 a una planta o semilla de planta, en donde dicha aplicación es eficaz para impartir resistencia a enfermedades.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la enfermedad es una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana o una enfermedad fúngica.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha aplicación se lleva a cabo con una planta.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha aplicación se lleva a cabo con una semilla de planta, comprendiendo además dicho método plantar la semilla tratada con el péptido o la composición en suelo natural o artificial, y propagar una planta a partir de la semilla plantada en el suelo.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la planta se selecciona entre plantas agrícolas, silvícolas, ornamentales y hortícolas, cada una en su forma natural o modificada genéticamente.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la planta a tratar se selecciona del grupo que consiste en alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, haya (Fagus spec.), begonia, abedul, mora, arándano, col, alcanfor, canola, zanahoria, ricino, cereza, canela, cítricos, cacao, café, maíz, algodón, pepino, cucurbitáceas, eucalipto, abeto, lino, remolacha forrajera, fucsia, ajo, geranio, uvas, cacahuete, cáñamo, lúpulo, baya de junio, juncea (Brassica juncea), yute, lenteja, lechuga, linaza, melón, mostaza, roble, avena, palma aceitera, colza, aceituna, cebolla, pimentón, guisante, melocotón, pera, pelargonium, pimientos, petunia, pino (Pinus spec.), álamo (Populus espec.), frutas de pepita, papa, colza, frambuesa, arroz, árbol del caucho, centeno, sorgo, soja, espinaca, abeto, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, té, teca, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía, trigo y sauce (Salix spec.).
20. Un constructo de ADN que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 o un polipéptido de fusión de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 8, y una molécula de ácido nucleico eficaz como promotor acoplada operativamente a la primera molécula de ácido nucleico.
21. Un vector de expresión recombinante o una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 20.
22. La célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 21, en la que la célula huésped recombinante es (i) un protoplasto de planta o (ii) una bacteria.
23. Una planta transgénica o una semilla de planta transgénica que comprende una célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 21 o el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 20.
24. Un método para impartir resistencia a las enfermedades a las plantas que comprende:
proporcionar una planta transgénica transformada con el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 20; y,
cultivar la planta en condiciones efectivas para permitir que el constructo de ADN exprese el péptido o el polipéptido de fusión para impartir resistencia a las enfermedades.
25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicho suministro de la planta transgénica comprende:
proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con el constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 20;
plantar la semilla de la planta transgénica en el suelo; y
propagar la planta transgénica a partir de la semilla de la planta transgénica.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3201341T3 (pl) 2014-10-01 2025-09-01 Plant Health Care, Inc. Peptydy wywołujące reakcję nadwrażliwości i ich zastosowanie
KR20170080579A (ko) 2014-10-01 2017-07-10 플랜트 헬스 케어, 인코포레이티드 파괴된 과민성 반응 박스를 갖는 유발제 펩티드 및 그의 용도
US11371011B2 (en) 2016-04-06 2022-06-28 Plant Health Care, Inc. Beneficial microbes for delivery of effector peptides or proteins and use thereof
PL3439682T3 (pl) 2016-04-06 2025-12-01 Plant Health Care, Inc. Peptydy pochodzące od czynnika wywołującego odpowiedź nadwrażliwości i ich stosowanie
GB201609193D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
JP7075125B2 (ja) 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
WO2018064503A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 J.R. Simplot Company Growing strawberry plug plants at low elevation without the need for conditioning
AR111893A1 (es) * 2017-05-26 2019-08-28 Plant Health Care Inc Péptidos derivados de inductores de la respuesta de hipersensibilidad y su uso
WO2022142978A1 (zh) * 2020-12-31 2022-07-07 吴伯骥 HrpW型多拟表位配体蛋白在食品、化妆品、保健品或制药中的应用
PL4253583T3 (pl) 2021-04-22 2025-01-13 Ma Aluminum Corporation Folia ze stopu aluminium
CN113621074B (zh) * 2021-08-06 2023-04-25 苏州乙水茉生物科技有限公司 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
CN114600712B (zh) * 2022-02-28 2023-05-05 浙江大学 一种促进番茄果实成熟和提高其品质的方法
AR130564A1 (es) * 2022-09-27 2024-12-18 Kureha Corp Agente para mejorar la tolerancia al estrés ambiental en una planta y método para mejorar la tolerancia al estrés ambiental en una planta

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US208293A (en) * 1878-09-24 Improvement in student-lamps
US5473039A (en) 1989-08-18 1995-12-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E, diagnostic systems and methods using the analogs
JPH10500010A (ja) 1994-05-11 1998-01-06 ジョン インズ センター イノベイションズ リミティド 植物において病原体耐性を誘導する方法
US5859339A (en) 1995-01-17 1999-01-12 The Reagents Of The University Of California Nucleic acids, from oryza sativa, which encode leucine-rich repeat polypeptides and enhance xanthomonas resistance in plants
DE69635307T2 (de) 1995-06-07 2006-07-13 Cornell Research Foundation, Inc. Induzierte widerstandsfähigkeit gegen überempfindlichkeitsreaktionen bei pflanzen
AR008286A1 (es) 1996-08-09 1999-12-29 Gen Hospital Corp Molecula de acido nucleico aislada, vector, celula, planta transgenica que la incluyen, semilla y celula de dicha planta, polipeptido de resistenciaadquirida codificado por dicha molecula, metodo para producir dicho polipeptido, anticuerpo substancialmente puro que se liga a dicho polipeptido y
US6235974B1 (en) 1996-12-05 2001-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor
SE9604593D0 (sv) 1996-12-13 1996-12-13 Sbl Vaccin Ab Antimicrobially active polypeptides
US6277814B1 (en) 1997-01-27 2001-08-21 Cornell Research Foundation, Inc. Enhancement of growth in plants
US5977060A (en) 1997-02-28 1999-11-02 Cornell Research Foundation, Inc. Insect control with a hypersensitive response elicitor
WO1998054214A2 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response elicitor fragments and uses thereof
BR9806183A (pt) 1997-07-08 1999-11-16 Univ Kentucky Res Found Quinases de proteìna e usos das mesmas
US6262018B1 (en) * 1997-08-06 2001-07-17 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response elicitor from Erwinia amylovora and its use
KR100314721B1 (ko) * 1998-01-22 2001-11-23 김일웅 생물학적 활성이 있는 신규한 펩타이드
AU6508599A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response
US6858707B1 (en) 1998-10-05 2005-02-22 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response elicitor fragments which are active but do not elicit a hypersensitive response
US6624139B1 (en) 1998-11-05 2003-09-23 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response elicitor-induced stress resistance
AU1813500A (en) 1998-11-06 2000-05-29 Cornell Research Foundation Inc. Hypersensitive response elicitor from (agrobacterium vitis)
US6835868B1 (en) * 1999-03-17 2004-12-28 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Transgenic plants expressing dermaseptin peptides providing broad spectrum resistance to pathogens
AU3733000A (en) 1999-03-24 2000-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize chitinases and their use in enhancing disease resistance in crop plants
EP1261735A4 (en) * 2000-01-25 2005-04-06 Nuvelo Inc METHODS AND MATERIALS RELATING TO POLYPEPTIDES AND POLYNUCLEOTIDES LIKE IMMUNOGLOBULIN-LIKE LEUKOCYTE RECEPTORS (LIR)
US20020007501A1 (en) 2000-03-23 2002-01-17 Xiaoling Song Receptors for hypersensitive response elicitors and uses thereof
US20020019337A1 (en) 2000-04-19 2002-02-14 Zhong-Min Wei Treatment of fruits or vegetables with hypersensitive response elicitor to inhibit postharvest disease or desiccation
US20020059658A1 (en) 2000-06-15 2002-05-16 Zhong-Min Wei Methods of improving the effectiveness of transgenic plants
AU2001275465A1 (en) * 2000-06-16 2002-01-02 Eden Bioscience Corporation Hypersensitive response eliciting domains of bacterial harpins and use thereof
US6875907B2 (en) 2000-09-13 2005-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antimicrobial peptides and methods of use
US20030104979A1 (en) 2000-11-13 2003-06-05 Zhong-Min Wei Methods of inhibiting desiccation of cuttings removed from ornamental plants
WO2004022736A1 (ja) 2002-08-30 2004-03-18 Japan Science And Technology Corporation 遺伝子のターゲティング破壊法および超耐熱菌ゲノム、ならびにこれらを利用したゲノムチップ
EP1599499A2 (en) * 2003-02-24 2005-11-30 Dow Global Technologies Inc. Periodic antimicrobial peptides
CN1454989A (zh) 2003-03-05 2003-11-12 江苏五彩精细化工股份有限公司 表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法
CN1860230B (zh) 2003-08-13 2011-05-04 淡马锡生命科学研究院有限公司 赋予对黄单胞菌引起的细菌性黑枯病的抗性的来自水稻的核酸
ES2491166T3 (es) 2003-11-15 2014-09-05 Polyphor Ltd. Miméticos de lazo de horquilla beta fijados a patrón y su utilización en exposición en fagos
GB0329254D0 (en) 2003-12-17 2004-01-21 Univ Manchester Treatment of viral infections
US9592277B2 (en) 2004-04-14 2017-03-14 Avirid, Inc. Compositions with modified nucleases targeted to viral nucleic acids and methods of use for prevention and treatment of viral diseases
US7148404B2 (en) 2004-05-04 2006-12-12 Novozymes A/S Antimicrobial polypeptides
CN101115498A (zh) * 2005-01-24 2008-01-30 耶达研究与发展有限公司 用于免疫调节的HIV-1 gp41融合肽
US7132393B2 (en) 2005-02-28 2006-11-07 Gene Tools. Llc Transporter compositions and methods for detecting and killing cells in acidic areas of tumors
CN101257919B (zh) * 2005-08-05 2012-08-29 国立大学法人德岛大学 可以由选择性产生IgA抗体向产生IgA和IgG两种抗体转换的抗原药物载体和使用该载体的经鼻·粘膜疫苗
CN100389124C (zh) 2005-12-22 2008-05-21 武汉大学 无诱导表达基因工程菌株及构建方法和应用
ES2574981T3 (es) 2007-02-28 2016-06-23 Cropdesign N.V. Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y procedimiento de producción de las mismas
EP1997502A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 CHIESI FARMACEUTICI S.p.A. Reconstituted surfactants having improved properties
CN101284876B (zh) 2008-05-28 2011-06-22 武汉大学 融合蛋白Penharpin及制备方法和用途
AU2009282274B2 (en) 2008-08-12 2014-09-04 Plant Health Care, Inc. Production, formulation, and uses of stable liquid harpin protein formulations
EP2168590A1 (en) * 2008-09-24 2010-03-31 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Antimicrobial peptides
EP2168592A1 (en) * 2008-09-24 2010-03-31 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Antimicrobial peptides
CA2739608A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 The Regents Of The University Of California Recombinant nell protein production
WO2010091294A2 (en) * 2009-02-05 2010-08-12 The Regents Of The University Of California New targeted antimicrobial moieties
WO2011084816A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Glanbia Nutritionals (Ireland) Ltd. Leucine/peptide composition and method of formulation
US8492333B2 (en) 2010-02-22 2013-07-23 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Peptides and methods for inducing cell death
CN101892244B (zh) 2010-03-17 2012-06-27 华中农业大学 药用野生稻抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26-2和它在改良水稻抗病性中的应用
BR122021002366B1 (pt) 2010-04-28 2022-05-24 Evogene Ltd Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor e/ou eficiência de uso de nitrogênio de uma planta
BR112013015175A2 (pt) 2010-12-22 2016-07-12 Basf Se mistura e composição agroquímica para aumentar a saúde de um vegetal, método para aumentar de maneira sinérgica a saúde de um vegetal e utilização de uma mistura
CN106350538A (zh) * 2011-01-18 2017-01-25 瑞典树木科技公司 抗旱植物和使用转录调节子制备其的方法
US20120265513A1 (en) 2011-04-08 2012-10-18 Jianwen Fang Methods and systems for designing stable proteins
WO2013039857A1 (en) * 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013067103A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Bayer Cropscience Lp Compositions and methods for enhancing plant quality
US9204638B2 (en) 2011-12-30 2015-12-08 Plant Health Care, Inc. Method for increasing plant yield, and yield improving compositions
CN103103202A (zh) 2013-01-16 2013-05-15 南京农业大学 Harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用
SG11201605488PA (en) 2014-01-31 2016-08-30 Dow Agrosciences Llc Methods for control of aquatic weeds using herbicidal 4-amino-3-chloro-6-(4-chloro-2-fluoro-3-methoxyphenyl)pyridine-2-carboxylic acids
KR20170080579A (ko) 2014-10-01 2017-07-10 플랜트 헬스 케어, 인코포레이티드 파괴된 과민성 반응 박스를 갖는 유발제 펩티드 및 그의 용도
PL3201341T3 (pl) 2014-10-01 2025-09-01 Plant Health Care, Inc. Peptydy wywołujące reakcję nadwrażliwości i ich zastosowanie
CN106831964A (zh) 2017-03-20 2017-06-13 上海交通大学 激发植物产生过敏反应的蛋白质及其编码基因

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