ES3036043T3 - Methods for enhancing tcr alpha beta+ cell depletion efficiency - Google Patents

Methods for enhancing tcr alpha beta+ cell depletion efficiency

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ES3036043T3 ES20720187T ES20720187T ES3036043T3 ES 3036043 T3 ES3036043 T3 ES 3036043T3 ES 20720187 T ES20720187 T ES 20720187T ES 20720187 T ES20720187 T ES 20720187T ES 3036043 T3 ES3036043 T3 ES 3036043T3
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Abstract

Se proporcionan aquí métodos mejorados para la depleción robusta de células TCR+ y la producción de poblaciones de células TCR-, lo cual puede ser beneficioso para minimizar el riesgo de EICH en pacientes que reciben terapia alogénica con células T CAR. Se proporcionan aquí métodos que aumentan la eficiencia de la depleción de células TCR+ de una población celular para reducir significativamente cualquier nivel residual de células TCR+ presente en poblaciones celulares en las que la expresión de TCR endógeno se ha reducido o eliminado. También se proporcionan kits y poblaciones celulares asociados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para mejorar la eficiencia de agotamiento de células TCR alfa beta+
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere a métodos para agotar células que expresan un TCR endógeno (por ejemplo, TCRap) de una población de células inmunes manipuladas, incluidas aquellas que comprenden receptores de antígenos quiméricos (CAR).
ANTECEDENTES
La transferencia adoptiva de células inmunes modificadas genéticamente para reconocer antígenos asociados a la malignidad se muestra prometedora como un nuevo enfoque para tratar el cáncer (véase, por ejemplo, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Las células inmunes pueden modificarse genéticamente para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) (véase, por ejemplo, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), y Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)). Las células inmunes que comprenden CAR, por ejemplo células CAR-T (CAR-T), están manipuladas para dotarlas de especificidad antigénica mientras conservan o mejoran su capacidad de reconocer y matar una célula diana, tal como una célula cancerosa. Sin embargo, la posibilidad de desarrollar enfermedad de injerto contra hospedante (GvHD) o enfermedad de hospedante contra injerto (HvGD) representa un importante obstáculo de seguridad o eficacia para el uso generalizado de células CAR-T alogénicas manipuladas en la terapia contra el cáncer. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos eficaces para reducir el riesgo de GvHD y HvGD, en particular para las terapias alogénicas.
SUMARIO
Se describen aquí métodos mejorados para el agotamiento de células TCR+ (TCRap+) de una población de células inmunes, métodos para producir una población de células inmunes agotada en células TCR+, kits que comprenden reactivos para ello, poblaciones de células TCR-(TCRap-) altamente puras, y métodos de tratamiento que emplean poblaciones de células preparadas usando los métodos descritos. Por ejemplo, se describen aquí métodos que son particularmente adecuados para el agotamiento de células TCR+, que se pueden usar para la fabricación de células útiles en terapias celulares alogénicas al reducir el riesgo de GvHD, y se pueden usar en terapias que emplean receptores de antígenos quiméricos (por ejemplo, terapia de células CAR-T alogénicas).
En un aspecto, la invención es un método para producir una población de células inmunes desprovista de células inmunes que expresan un TCR endógeno como se define en la reivindicación 1. El método puede comprender además marcar la población de células inmunes con un anticuerpo anti-CD52; y agotar las células inmunes marcadas con el anticuerpo anti-CD52 de la población de células inmunes. Además, el método puede comprender además marcar la población de células inmunes con un anticuerpo anti-CD52; y separar las células inmunes marcadas con un anticuerpo anti-CD52 de las células inmunes no marcadas.
En otro aspecto, la invención es un método para agotar células que expresan un TCR endógeno de una población de células inmunes como se define en la reivindicación 2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y/o el anticuerpo anti-CD52 está conjugado con biotina, y el método puede comprender además poner en contacto las células marcadas con un agente que reconoce específicamente la biotina. El agente que reconoce específicamente la biotina se puede seleccionar del grupo que consiste en un anticuerpo anti-biotina, avidina y estreptavidina, y se puede conjugar con una perla magnética, una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de pocillos de plástico, una placa de pocillos de vidrio, una placa de pocillos de cerámica, una columna, una bolsa de cultivo celular, o una membrana. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y/o el anticuerpo anti-CD52 se conjuga directamente con una perla magnética, una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de pocillos de plástico, una placa de pocillos de vidrio, una placa de pocillos de cerámica, una columna, una bolsa de cultivo celular, o una membrana.
En los métodos que emplean separación, la separación se puede lograr usando una separación magnética o una separación por ondas acústicas.
En realizaciones, las células inmunes de los métodos descritos son células inmunes alogénicas, y las células inmunes pueden modificarse genéticamente para reducir o eliminar la expresión de TCR endógeno, CD 52 endógeno, o tanto de TCR endógeno como de CD52 endógeno; la reducción o eliminación de la expresión de TCR endógeno o CD52 endógeno, o tanto de TCR endógeno como de CD52 endógeno se logra usando una TALEN, CRISPR/Cas9, una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), una MegaTAL, una meganucleasa, Cpf1, recombinación homóloga, o un oligodesoxirribonucleótido monocatenario (ssODN).
Las células inmunes de los métodos descritos pueden ser células inmunes manipuladas que expresan un receptor de antígeno quimérico.
En algunas realizaciones, la población de células que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende no más de 1,0 % de células TCR+, no más de 0,9 % de células TCR+, no más de 0,8 % de células TCR+, no más de 0,7 % de células TCR+, no más de 0,6 % de células TCR+, no más de 0,5 % de células TCR+, no más de 0,4 % de células TCR+, no más de 0,3 % de células TCR+, no más de 0,2 % de células TCR+, o no más del 0,1 % de células TCR+. En algunas realizaciones, la población de células que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende entre 0,01-0,001 % de células TCR+ inmediatamente después del agotamiento. En algunas realizaciones, la población de células que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende entre 0,1-0,01 % de células TCR+ después de 1-10 días de cultivo posteriores al agotamiento; en algunas realizaciones, la población de células que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende menos de 0,1-1,0 % de células TCR+ después de 1 día de cultivo posterior al agotamiento. En algunas realizaciones, la población de células que desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende menos de 0,1-1,0 % de células TCR+ después de 10 días de cultivo posteriores al agotamiento.
En realizaciones de los métodos descritos, la célula inmune es una célula T.
Se describe aquí como referencia un kit para agotar células que expresan un TCR endógeno de una población de células inmunes, que comprende un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3. El kit puede comprender además un anticuerpo anti-CD52. En los kits descritos, el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y/o el anticuerpo anti-CD52 se conjugan con un agente que reconoce específicamente la biotina; el agente que reconoce específicamente la biotina puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-biotina, estreptavidina y avidina. El agente se puede conjugar con una perla magnética, una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de plástico con pocillos, una placa de vidrio con pocillos, una placa de cerámica con pocillos, una columna, una bolsa de cultivo celular, o una membrana.
En los kits descritos, el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y/o el anticuerpo anti-CD52 se conjugan directamente a un soporte, y el soporte puede ser una de una perla magnética, una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de pocillos de plástico, una placa de pocillos de vidrio, una placa de pocillos de cerámica, una columna, una bolsa de cultivo celular, o una membrana.
Además, se proporciona como referencia un método para tratar un cáncer sólido o hematológico en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéutica de una población de células inmunes desprovista de células inmunes que expresan un TCR endógeno preparada usando los métodos descritos, o una población de células T manipuladas preparada usando los métodos descritos.
Los métodos proporcionados aquí representan un avance significativo en la terapia alogénica. Por lo tanto, también se proporciona como referencia un método para tratar un cáncer sólido o hematológico en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto la población de células inmunes desprovista de células inmunes que expresan un TCR endógeno, preparada usando cualquiera de los métodos descritos aquí.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG.1 muestra una representación esquemática de un procedimiento de fabricación de CAR T alogénico con diferentes escenarios de operación unitaria.
La FIG. 2A representa las frecuencias residuales de células TCR+ en las poblaciones celulares agotadas varios días después del agotamiento; las flechas indican los cambios en el porcentaje de TCR+ de diferentes métodos de agotamiento (que emplean diferentes combinaciones de anticuerpos) en comparación con el método de control (que emplea sólo el anticuerpo anti-TCR) el día 2 después del agotamiento en comparación con el día 0 después del agotamiento.
La FIG. 2B representa las frecuencias de células TCR+ residuales en las poblaciones de células agotadas; las flechas indican los cambios en el porcentaje de TCR+ en el día 9 posterior al agotamiento en comparación con el día 0 posterior al agotamiento entre diferentes métodos de agotamiento en comparación con el método de control.
La FIG. 3A representa gráficos de citometría de flujo de las eficiencias de agotamiento de células TCR+ usando diferentes anticuerpos en el día 0 y el día 1 posteriores al agotamiento, medidas mediante tinción de anticuerpos anti-TCR.
La FIG. 3B representa las frecuencias de células TCR+ residuales en las poblaciones de células agotadas el día 0 y el día 1 después del agotamiento, en forma de barras numéricas.
La FIG. 4 muestra gráficos de citometría de flujo que demuestran frecuencias residuales de TCR+ y CD3+ en las poblaciones agotadas detectadas por tinción simple o doble de anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 el día 0 y el día 1 después del agotamiento.
La FIG. 5A representa gráficos de citometría de flujo de las frecuencias de TCR+, CD3+, CD3+/TCR- y CD3/TCR+ en las poblaciones de células agotadas medidas mediante tinción simple o doble de anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 en el día 1 posterior al agotamiento antes y después de la congelación.
La FIG. 5B representa las frecuencias de células TCR+ en las poblaciones de células agotadas medidas mediante tinción de anticuerpos anti-TCR el día 1 después del agotamiento antes y después de la congelación, en forma de barra numérica.
La FIG. 5C representa las frecuencias de células CD3+ en las poblaciones de células agotadas medidas mediante tinción de anticuerpos anti-CD3 el día 1 después del agotamiento antes y después de la congelación, en forma de barra numérica.
La FIG. 5D representa las frecuencias de células CD3+/TCR- en las poblaciones de células agotadas medidas mediante doble tinción de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 el día 1 posterior al agotamiento antes y después de la congelación, en forma de barra numérica.
La FIG. 5E representa las frecuencias de células CD3+/TCR+ en las poblaciones de células agotadas medidas mediante doble tinción de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 el día 1 después del agotamiento antes y después de la congelación, en forma de barra numérica.
La FIG. 6 muestra gráficos de citometría de flujo para la frecuencia de TCR+ usando tinción de anticuerpos anti-TCR durante un cultivo de 10 días posterior al agotamiento.
La FIG. 7 muestra gráficos de citometría de flujo para la frecuencia de CD3+ usando tinción de anticuerpos anti-CD3 durante un cultivo de 10 días posterior al agotamiento.
La FIG. 8 representa gráficos de citometría de flujo para la frecuencia doble de TCR+ y CD3+ usando tinción tanto de anticuerpo anti-TCR como anti-CD3 durante el cultivo de 10 días posterior al agotamiento. La FIG. 9A representa la frecuencia de células TCR+ usando tinción de anticuerpos anti-TCR durante el cultivo posterior al agotamiento, en forma de barra numérica.
La FIG. 9B representa la frecuencia de células CD3+ usando tinción de anticuerpos anti-CD3 durante el cultivo posterior al agotamiento, en forma de barra numérica.
La FIG. 9C representa la frecuencia de células CD3+/TCR- usando tinción tanto de anticuerpo anti-TCR como anti-CD3 durante el cultivo posterior al agotamiento, en forma de barra numérica.
La FIG. 9D representa la frecuencia de células CD3+/TCR+ usando tinción tanto de anticuerpo anti-TCR como anti-CD3 durante el cultivo posterior al agotamiento, en forma de barra numérica.
La FIG. 10A representa el estado de crecimiento celular en términos de densidad de células viables durante el cultivo de 10 días posterior al agotamiento.
La FIG. 10B representa el estado de crecimiento celular en términos de viabilidad celular durante el cultivo de 10 días posterior al agotamiento.
La FIG. 10C representa el estado de crecimiento celular en términos de diámetro celular durante el cultivo de 10 días posterior al agotamiento.
La FIG. 10D representa el estado de crecimiento celular en términos de la expansión celular total durante el cultivo posterior al agotamiento de 10 días.
La FIG. 11A muestra gráficos de citometría de flujo que demuestran las eficiencias de agotamiento de CD52 mediante el uso de diferentes anticuerpos el día 0 y el día 1 posteriores al agotamiento, medidas mediante tinción anti-CD52.
La FIG. 11B representa las frecuencias de células CD52+ residuales en las poblaciones de células agotadas el día 0 y el día 1 después del agotamiento medidas mediante tinción de anticuerpos anti-CD52 en forma de barra numérica.
La FIG. 12 muestra gráficos de citometría de flujo para frecuencias de células CD52+ residuales durante un cultivo de 10 días posterior al agotamiento monitorizadas mediante tinción de anticuerpos anti-CD52.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se proporcionan aquí métodos mejorados para el agotamiento robusto de células TCRa/p+, que pueden minimizar el riesgo de GVHD en pacientes que reciben terapia de células CAR T alogénicas, y poblaciones de células preparadas usando los métodos descritos. En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para aumentar la eficiencia de agotamiento de células TCR+ para reducir significativamente los niveles residuales de células TCR+ en poblaciones de células TCR-.
Como se utilizan aquí, los términos "un" y "una" se utilizan para significar uno o más. Por ejemplo, una referencia a "una célula" o "un anticuerpo" significa "una o más células" o "uno o más anticuerpos".
Como se usa aquí, la expresión "desprovista de TCR", cuando se usa en referencia a una población de células generadas usando los métodos proporcionados en la presente descripción, significa una población de células que comprende menos células que expresan un heterodímero TCRa/p endógeno que una población de células que se recolecta de un donante. Por ejemplo, una población de células desprovista de TCR (células desprovistas de TCRa/p) puede comprender 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %. o menos de 1 % de células que expresan un complejo TCRa/p endógeno.
Como se usa aquí, el término "TCR+" y "TCR", cuando se usa en referencia a una célula o población de células, incluidas las poblaciones generadas usando los métodos proporcionados en la presente descripción, se refiere a células que expresan al menos un heterodímero TCRa/p endógeno, aunque uno o más componentes del complejo CD3 pueden o no expresarse en la superficie celular.
Como se usa aquí, el término "TCR-", cuando se usa en referencia a una célula o población de células, incluidas las poblaciones generadas usando los métodos proporcionados en la presente descripción, se refiere a células que carecen de al menos un heterodímero TCRa/p, aunque uno o más componentes del complejo CD3 pueden o no expresarse en la superficie celular.
Como se usa aquí, la expresión "anticuerpo anti-TCR" y "anti-TCR", que se usan indistintamente, se refieren a un anticuerpo que se une y reconoce la cadena TCRa humana sola, la cadena TCRp humana sola, o el heterodímero TCRa/p humano. Un anticuerpo anti-TCR puede ser un anticuerpo murino, humano o humanizado.
Como se usa aquí, la expresión "anticuerpo anti-CD3" y "anti-CD3", que se usan indistintamente, se refieren a un anticuerpo que se une, reconoce y se une a la cadena CD3<y>humana, a la cadena CD35 humana, a la cadena CD3Z, a la cadena CD3s, o a un complejo CD3 humano que comprende dos o más componentes del complejo CD3z/z/ljljy/5 humano normal. Un anticuerpo anti-CD3 puede ser un anticuerpo murino, humano o humanizado.
Los términos "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente, e incluyen sujetos humanos y animales no humanos, así como aquellos con trastornos diagnosticados formalmente, aquellos sin trastornos formalmente reconocidos, aquellos que reciben atención médica, aquellos en riesgo de desarrollar los trastornos, etc.
El término "tratar" y "tratamiento" incluye tratamientos terapéuticos, tratamientos profilácticos, y aplicaciones en las que se reduce el riesgo de que un sujeto desarrolle un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere la curación completa de un trastorno, y abarca ejemplos en los que se reducen los síntomas o los factores de riesgo subyacentes. El término "prevenir" no requiere la eliminación del 100 % de la posibilidad de un acontecimientos. En su lugar, se refiere a que la probabilidad de la aparición del acontecimiento se ha reducido en presencia del compuesto o método.
Los productos CAR-T alogénicos basados en células TCR- manipulados ejemplifican una estrategia para generar terapias CAR-T de próxima generación. Sin embargo, las posibles respuestas inmunes tales como el riesgo de enfermedad de injerto contra hospedante (GvHD) y la enfermedad de hospedante contra injerto (HvGD) representan una de las preocupaciones importantes en materia de seguridad o eficacia de la terapia con células CAR-T alogénicas. La GvHD es el resultado de células T derivadas del donante que reconocen la incompatibilidad de HLA a través del receptor de células T ap (TCRap) y tienen el potencial de atacar los tejidos del paciente. La GVHD y la HvGD pueden ser graves e incluso mortales, incluso en el contexto de un donante compatible con HLA, ya que desajustes menores aún pueden provocar una respuesta inmune.
Los métodos actuales para eliminar células TCR+ (agotamiento de células TCRap+), tales como CliniMACS Prodigy® y el kit de reactivos TCR, emplean un anticuerpo anti-TCR solo para separar las células TCR+ (células TCRap+) de las células TCR- (células TCRap-) usando un anticuerpo anti-TCR, y pueden lograr una pureza de células TCR- del 99 % o más en el producto farmacéutico final (véase, por ejemplo, Radestad et al, (2014) J Immunol Res, Vol 2014: 578741). Sin embargo, menos del 1 % de niveles residuales de células TCR+ presentes en el producto farmacéutico final TCR- aún pueden presentar el riesgo de GvHD asociado con la terapia de células CAR-T alogénicas, especialmente en niveles de dosis altas.
La presente descripción proporciona métodos para producir una población de células inmunes manipuladas desprovista de células inmunes que expresan un TCR endógeno, comprendiendo el método descrito marcar una población de células inmunes con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3; y separar las células inmunes marcadas con el anticuerpo anti-TCR y las células inmunes marcadas con el anticuerpo anti-CD3 de la población de células inmunes manipuladas.
La presente descripción también proporciona un método para agotar células que expresan un TCR endógeno de una población de células inmunes, comprendiendo el método descrito marcar la población de células inmunes con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3; separar las células inmunes marcadas con anticuerpo anti-TCR y las células inmunes marcadas con anticuerpo anti-CD3 de las células inmunes no marcadas; y recolectar las células inmunes no marcadas, obteniendo así una población de células inmunes que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno. El método también se puede adaptar para comprender una población de células inmunes marcadas con anticuerpos anti-TCR y uno o más anticuerpos dirigidos contra cualquier otra diana o dianas de interés distintas de CD3 (por ejemplo, MHC1, MHC2, CD52 o<p>D1).
En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para agotar células TCRap+, que comprenden poner en contacto una población de células inmunes con un anticuerpo TCR y un anticuerpo CD3. El método también se puede adaptar para comprender una población de células inmunes marcadas con anticuerpos anti-TCR y uno o más anticuerpos dirigidos contra cualquier otra diana o dianas de interés distintas de CD3 (por ejemplo, MHC1, MHC2, CD52 o PD1.
En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para agotar células TCRap+, que comprende poner en contacto una población de células inmunes con un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD52.
Los métodos descritos aquí aplican anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 juntos para el agotamiento de células TCRap+, lo que es de particular uso para generar un producto CAR T alogénico basado en células TCRap- manipuladas. Antes de la presente descripción, el agotamiento a escala clínica de células TCR+ en células T manipuladas (no un producto de células T no modificadas) hasta un nivel de pureza de células TCR- de 99,9 %-99,99 %, dejando un residuo de células TCR+ del 0,1 %-0,01 %, era extremadamente difícil, y representaba un desafío para el desarrollo de terapias alogénicas. La descripción actual proporciona una solución a este problema.
Lograr este tipo de células TCR+ residuales de bajo nivel (por ejemplo, en el intervalo de 0,1 %-0,01 % de células TCR+ medidas 1 día después del agotamiento) representa un avance significativo de los productos CAR T alogénicos manipulados (por ejemplo, células CAR T TCRa/p-) y brinda un beneficio clínico mejorado a los pacientes al disminuir el potencial de GvHD.
Los métodos eficaces para reducir el riesgo de GvHD (y HvGD), así como para mejorar la potencia antitumoral, pueden ser particularmente útiles para la fabricación de células inmunes alogénicas manipuladas efectivas, seguras y puras (por ejemplo, células CAR-T alogénicas que expresan un CAR dirigido contra un antígeno del cáncer). En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para producir células CAR-T alogénicas y productos que reducen el riesgo de, o previenen el desarrollo de, GvHD y/o HvGD. En algunas realizaciones, las células CAR-T alogénicas manipuladas tienen actividades antitumorales mejoradas contra tumores sólidos o cánceres hematológicos. En algunas realizaciones, las células CAR-T comprenden una población de células que están modificadas para reducir o eliminar la expresión de uno o más de los genes endógenos TCR, CD52, MHC1, MHC2 o PD1. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las células CAR-T comprenden una población que está desprovista de células que son TCR+, CD52+, MHC1+, MHC2+ y/o PD1+.
Se proporcionan aquí métodos para agotar poblaciones de células que expresan uno o más de TCR, CD3, CD52, MHC1, MHC2 o PD1 expresados endógenamente (por ejemplo, células que son TCR+, CD3+, CD52+, MHC1+, MHC2+ y/o PD1+), de una población de células inmunes manipuladas, y kits que comprenden reactivos de anticuerpos para ello.
Señalización del receptor de células T
El complejo del receptor de células T (TCR, como se describe aquí) es una molécula receptora de antígeno en la superficie de las células T, responsable del reconocimiento del antígeno presentado a las células T por las moléculas del MHC, lo que conduce potencialmente a la activación de la célula T y a una respuesta inmune al antígeno. El receptor de células T humano es un heterodímero que consiste en dos cadenas de glicoproteínas heterodímeras transmembrana, las cadenas a y p (también hay una pequeña proporción de cadenas y5), cada una con dos dominios, que están unidos por un enlace disulfuro. Debido a la cola citoplasmática corta del TCR, no puede señalar directamente cuándo se une a un complejo péptido-MHC. En cambio, el TCR está asociado con un grupo de moléculas de señalización denominadas colectivamente CD3 que transmiten una señal intracelular cuando el TCR se une a un complejo péptido-MHC.
El CD3 está formado por una molécula<y>, una 5 y dos £, las cuales tienen en sus dominios extracelulares cierta homología de secuencia limitada con el dominio de inmunoglobulina. Estas moléculas tienen pequeños dominios citoplasmáticos y dominios transmembrana con restos cargados negativamente. En la membrana, estos restos cargados negativamente forman puentes salinos con los restos cargados positivamente en la región transmembrana del TCR. El complejo receptor TCR-CD3 se completa con otras dos proteínas invariantes Z y n que forman dímeros unidos por enlaces disulfuro. Por lo tanto, en la superficie de las células T, el complejo TCR-CD3 se expresa como un heterodímero ap (o<y>5), en asociación con dímeros CD3<ye>y CD35<e>con un homodímero ZZ intracelular o un heterodímero Zn.
Sin querer estar limitados por la teoría, algunos investigadores creen que si se altera la expresión de TCR, también se puede eliminar la expresión superficial de CD3. Sin embargo, como se describe aquí, se descubrió inesperadamente que la expresión superficial residual de CD3 aún puede ser indicativa de células TCR+ residuales, y la eficiencia de agotamiento de TCR+ se puede mejorar mediante el uso de un anticuerpo anti-CD3 en combinación con un anticuerpo anti-TCR.
Métodos de clasificación y agotamiento de células inmunes
Como se describe aquí, en un aspecto, la presente descripción proporciona un método para agotar células que expresan un dímero TCRa/p endógeno de una población de células inmunes, comprendiendo el método marcar la población de células con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3 (marcaje que puede realizarse secuencialmente o al mismo tiempo en una sola operación), separar las células marcadas con anti-TCR y anti-CD3 de las células no marcadas, y recolectar las células no marcadas, obteniendo así una población de células que están desprovistas de células que expresan un TCR endógeno.
Inicialmente, las células inmunes manipuladas y modificadas para ser deficientes en el gen TCRa o TCRp endógeno se exponen a un reactivo de agotamiento de TCR. El reactivo de agotamiento de TCR comprende un anticuerpo dirigido contra el polipéptido TCRa, el polipéptido TCRp o el heterodímero TCRa/p expresado endógenamente en la superficie de células inmunes. Como se describe aquí, el agotamiento de TCR usando un anticuerpo anti-TCR en combinación con un anticuerpo anti-CD3 (y opcionalmente un anticuerpo anti-CD52) aumenta inesperadamente la eficiencia del agotamiento de TCR+ en comparación con los agotamientos realizados con un anticuerpo anti-TCR solo.
El anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 o el anticuerpo anti-CD52 (o cualquier otro anticuerpo dirigido contra una diana de interés para una operación de agotamiento de TCR) se puede conjugar con biotina para facilitar un etiquetado y/o separación adicional usando un anticuerpo secundario (por ejemplo, un anticuerpo anti-biotina) conjugado directa o indirectamente con un reactivo de agotamiento magnético tal como un agente de agotamiento magnético tales como microperlas magnéticas (nanopartículas que generalmente, pero no necesariamente, tienen un diámetro de alrededor de 50 nm) o cualquier otra superficie, tal como una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de plástico con pocillos, una placa de vidrio con pocillos, una placa de cerámica con pocillos, una columna, una bolsa de cultivo celular o una membrana. Cuando se utilizan microperlas magnéticas, éstas facilitan la separación de las células TCR+ de las células TCR-; al entrar en contacto con una columna magnética, las células TCR+ pueden quedar retenidas en la columna mientras que las células TCR- no marcadas pasan a una bolsa de recolección. Las partículas de ondas acústicas pueden facilitar la separación de las células TCR+ de las células TCR- cuando se exponen a una onda acústica. Si bien se proporciona un anticuerpo anti-biotina en el contexto del método descrito, se pueden emplear otras parejas de unión a la biotina, tales como estreptavidina, avidina y otras proteínas que reconocen la biotina, en lugar de un anticuerpo anti-biotina en todos los métodos proporcionados aquí. En algunas realizaciones, las células proporcionadas pueden clasificarse opcionalmente para otros marcadores de superficie celular. Por ejemplo, un subconjunto de una población de células inmunes puede comprender células inmunes manipuladas que expresan un CAR específico de antígeno que a su vez comprende uno o más epítopos específicos para uno o más anticuerpos monoclonales (por ejemplo, secuencias de mimotopos ejemplares; véase, por ejemplo, el documento WO2016/120216). El método comprende poner en contacto la población de células inmunes con un anticuerpo monoclonal específico para los epítopos, y seleccionar las células inmunes que se unen al anticuerpo monoclonal para obtener una población de células enriquecida en células inmunes manipuladas que expresan un CAR específico de antígeno.
En algunas realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal específico para dicho epítopo se conjuga opcionalmente con un fluoróforo. En esta realización, la etapa de seleccionar las células que se unen al anticuerpo monoclonal puede hacerse por clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS).
En algunas realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal específico para dicho epítopo se conjuga opcionalmente con una partícula magnética. En esta realización, la etapa de seleccionar las células que se unen al anticuerpo monoclonal puede hacerse por clasificación de células activadas magnéticas (MACS).
En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal usado en el método para clasificar células inmunes que expresan el CAR se escoge de alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, muromonab-CD3, tositumomab, abciximab, basiliximab, brentuximab vedotin, cetuximab, infliximab, rituximab, bevacizumab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, natalizumab, omalizumab, palivizumab, ranibizumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, adalimumab, belimumab, canakinumab, denosumab, golimumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, QBEND-10 y/o ustekinumab. En algunas realizaciones, dicho mAb es rituximab. En otra realización, dicho mAb es QBEND-10.
La citometría de flujo se puede usar para cuantificar tipos de células específicos dentro de una población de células. En general, la citometría de flujo es un método para cuantificar componentes o rasgos característicos estructurales de células principalmente por medios ópticos. Como los diferentes tipos celulares pueden distinguirse cuantificando rasgos característicos estructurales, puede usarse citometría de flujo y clasificación celular para contar y clasificar células de diferentes fenotipos en una mezcla.
Un análisis de citometría de flujo implica dos etapas principales: 1) marcar tipos de células seleccionados con uno o más marcadores detectables, y 2) determinar el número de células marcadas con respecto al número total de células de la población. En algunas realizaciones, el método de marcaje de los tipos celulares incluye unir anticuerpos marcadas a marcadores expresados por el tipo celular específico. Los anticuerpos pueden marcarse directamente con un compuesto fluorescente o marcarse indirectamente usando, por ejemplo, un anticuerpo secundarios marcado fluorescente que reconoce el primer anticuerpo.
En algunas realizaciones de los métodos descritos, la clasificación o separación de células TCR+, que expresan opcionalmente un CAR, de las células TCR- se puede lograr usando la clasificación celular activada magnéticamente (MACS). La clasificación de células activadas magnéticas (MACS) es un método para la separación de diversas poblaciones celulares dependiendo de sus antígenos de superficie (moléculas CD) usando nanopartículas superparamagnéticas y columnas. Se puede utilizar MACS para obtener una población celular muy pura. Las células en una suspensión unicelular se pueden marcar magnéticamente con microperlas. La muestra se aplica a una columna compuesta por un material ferromagnético, que está revestida con un revestimiento que no altera las células, permitiendo así una separación rápida y suave de las células. Las células no marcadas pasan a través de la columna mientras que las células marcadas magnéticamente quedan retenidas dentro de la columna. El flujo directo puede recogerse como la fracción celular no marcada. Después de una etapa de lavado, la columna se retira del separador, y las células marcadas magnéticamente se eluyen de la columna.
Se puede encontrar un protocolo detallado para la purificación de una población celular específica, tal como células T, en Basu S et al. (2010). (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS), J. Vis. Exp. (41): 1546).
En algunas realizaciones de los métodos descritos, la clasificación o separación de células TCR+, que opcionalmente expresan un CAR, de células TCR- se puede lograr usando separación por ondas acústicas en lugar de métodos de separación basados en magnetismo. Sin querer estar limitados por la teoría, se entiende que la separación por ondas acústicas se basa en una onda estacionaria tridimensional para separar los componentes de una mezcla. En el contexto de los métodos descritos, un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD52 o un anticuerpo anti-CD3, se puede conjugar con una superficie, tal como una partícula de onda acústica. Una partícula de onda acústica puede ser una perla. En una realización, las células se exponen a partículas de ondas acústicas que portan uno o más de un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD52 o un anticuerpo anti-CD3, asociando la partícula de ondas acústicas con cualquier célula que exprese la diana de interés. Después, las células se colocan en una cámara acústica y se exponen a una onda acústica. Dadas las diferentes propiedades de las células asociadas a las perlas y las células que no se marcaron con las partículas de perlas de anticuerpos, la onda acústica separa las células marcadas y las no marcadas, que se pueden recolectar mientras que las células marcadas (por ejemplo, células TCR+ o CD52+) se pueden desviar de las células marcadas.
Células inmunes
Las células adecuadas para los métodos de agotamiento de células TCR+ descritos aquí son células inmunes. Antes de la manipulaciónin vitroo la modificación genética (por ejemplo, como se describe aquí), las células inmunes para uso en los métodos descritos aquí se pueden obtener de un sujeto. Las células se pueden obtener de varias fuentes no limitativas basadas en el sujeto, incluidas células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, fluido ascítico, derrame pleural, tejido del bazo, y tumores. En algunas realizaciones, puede usarse infinidad de líneas de linfocitos T disponibles y conocidas por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las células pueden derivar de un donante sano o de un paciente diagnosticado con cáncer. En algunas realizaciones, las células pueden formar parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas.
En algunas realizaciones, las células inmunes se obtienen de un sujeto que en última instancia recibirá las células inmunes manipuladas (es decir, terapia autóloga). En algunas realizaciones, las células inmunes se obtienen de un donante, que es un individuo diferente del sujeto que recibirá las células inmunes manipuladas (es decir, terapia alogénica).
Las células se pueden obtener de la sangre circulante de un individuo mediante aféresis. El producto de aféresis típicamente contiene linfocitos, incluyendo linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros leucocitos nucleados, eritrocitos y plaquetas. En ciertas realizaciones, las células recolectadas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma, y colocarse en un tampón o medio apropiado para el procesamiento posterior. Las PBMC se pueden utilizar directamente para la modificación genética para generar células inmunes manipuladas (tales como CAR o TCR) usando métodos como los descritos aquí. En ciertas realizaciones, después de aislar las PBMC, los linfocitos T se pueden aislar opcionalmente aún más para generar una población que comprenda sólo células T, y los linfocitos T tanto citotóxicos como auxiliares se pueden clasificar además en subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria, y efectoras, ya sea antes o después de la modificación y/o expansión genética. En ciertas realizaciones, las células T se pueden aislar de las PBMC mediante la lisis de los glóbulos rojos y el agotamiento de los monocitos, por ejemplo usando centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL®. Las subpoblaciones específicas de células T, tales como células T CD28+, CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD62L+, CD5+, CD45RA-, CCR7+, CD95+, IL2Rp+ y CD45RO+, se pueden aislar adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede realizarse enriquecimiento de una población de linfocitos T por selección negativa con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas negativamente. Un método para su uso en este documento es clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. La citometría de flujo y clasificación celular también pueden usarse para aislar poblaciones de células de interés para su uso en la presente divulgación.
En algunas realizaciones, una población de células T se enriquece con células CD8+ antes o después de aplicar los métodos de agotamiento proporcionados aquí.
En algunas realizaciones, una población de células T se enriquece con células CD4+ antes o después de aplicar los métodos de agotamiento proporcionados aquí.
En algunas realizaciones, las poblaciones de células CD4+ y/o CD8+ se pueden clasificar además en células vírgenes, de memoria de células madre, de memoria central, de memoria efectora, y efectoras mediante la identificación de antígenos de superficie celular que están asociados con cada uno de estos tipos de células. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos para células T vírgenes incluye CD45RA+, CD95-, IL2Rp-, CCR7+ y CD62L+. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos para células T de memoria de células madre incluye CD45RA+, CD95+, IL2Rp+, CCR7+ y CD62L+. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos para células T de memoria central incluye CD45RO+, CD95+, IL2Rp+, CCR7+ y CD62L+. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos para células T de memoria efectora incluye CD45RO+, CD95+, IL2Rp+, CCR7- y CD62L-. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos para células T efectoras incluye CD45RA+, CD95+, IL2Rp+, CCR7- y CD62L-. De este modo, las células T auxiliares CD4+ y/o CD8+ se pueden clasificar en células vírgenes, células de memoria de células madre, células de memoria central, células de memoria efectora y células T efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. En realizaciones específicas, los métodos descritos se pueden emplear para mejorar el agotamiento de uno o más de estos subconjuntos de células T.
Se apreciará que las PBMC pueden incluir además otros linfocitos citotóxicos tales como células NK o células T NK. Un vector de expresión que porta la secuencia codificante de un receptor quimérico como se describe aquí se puede introducir en una población de células T, células NK o células T NK de donantes humanos. Se pueden usar procedimientos estándar para la criopreservación de células T que expresan el CAR para su almacenamiento y/o preparación para uso en un sujeto humano. En una realización, la transducción, el cultivo y/o la expansiónin vitrode células T se realizan en ausencia de productos derivados de animales no humanos, tales como suero fetal de ternero y suero fetal bovino. En diversas realizaciones, un medio criopreservante puede comprender, por ejemplo, CryoStor® CS2, CS5 o CS10 u otro medio que comprenda DMSO, o un medio que no comprenda DMSO.
Células inmunes manipuladas
Los métodos de agotamiento de células TCR+ descritos aquí pueden ser particularmente útiles en la fabricación de terapias con células inmunes para tratar el cáncer, incluidas terapias que comprenden células inmunes manipuladas (por ejemplo, células CAR-T).
Las células inmunes manipuladas pueden ser alogénicas o autólogas, y los métodos descritos se pueden aplicar en una terapia autóloga o alogénica.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada (o población de las mismas) es o comprende una célula T (por ejemplo, linfocito T inflamatorio, linfocito T citotóxico, linfocito T regulador, linfocito T auxiliar, linfocito infiltrante de tumores (TIL)), célula NK, célula T NK, célula que expresa TCR, célula dendrítica, célula dendrítica asesina, un mastocito, o un macrófago. En algunas realizaciones, la célula inmune manipulada puede derivar del grupo que consiste en linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones ejemplares, el inmunocito manipulado es un linfocito T. Las células T también pueden ser células T<y>/5.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada puede derivar, por ejemplo sin limitación, de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre totipotentes, o células madre hematopoyéticas. Las células madre pueden ser CD34+ o CD34-.
En algunas realizaciones, la célula se obtiene o se prepara a partir de sangre periférica. En algunas realizaciones, la célula se obtiene o prepara a partir de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC). En algunas realizaciones, la célula se obtiene o prepara a partir de médula ósea. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula se transfecta o transduce mediante un vector de ácido nucleico usando un método seleccionado del grupo que consiste en transducción viral (lentiviral o gamma retroviral), electroporación, sonoporación, biolístico (por ejemplo, Gene Gun), transfección de lípidos, transfección de polímeros, nanopartículas, o poliplexos. En algunas realizaciones, la célula es una célula T que se ha reprogramado a partir de una célula no T En algunas realizaciones, la célula es una célula T que se ha reprogramado a partir de una célula T.
Agentes ligantes (incluidos anticuerpos y fragmentos de los mismos)
Los métodos descritos comprenden el uso de un anticuerpo o agente de unión a antígeno (por ejemplo, que comprende un dominio de unión a antígeno o que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo). Como se analiza a continuación, en diversas realizaciones, las células inmunes manipuladas también pueden comprender un agente de unión.
Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que incluye elementos de secuencia de inmunoglobulina canónica suficientes para conferir unión específica a un antígeno diana particular. Como se sabe en la técnica, los anticuerpos intactos tal como se producen en la naturaleza son agentes tetraméricos de aproximadamente 150 kD compuestos por dos polipéptidos de cadena pesada idénticos (alrededor de 50 kD cada uno) y dos polipéptidos de cadena ligera idénticos (alrededor de 25 kD cada uno) que se asocian entre sí en lo que comúnmente se conoce como una estructura "en forma de Y". Cada cadena pesada se compone de al menos cuatro dominios (cada uno de alrededor de 110 aminoácidos de longitud): un dominio variable amino-terminal (VH) (ubicado en las puntas de la estructura Y), seguido de tres dominios constantes: CHI, CH2 y el CH3 carboxi-terminal (ubicado en la base del tallo de la Y). Una región corta, conocida como el "interruptor", conecta las regiones variable y constante de la cadena pesada. La "bisagra" conecta los dominios CH2 y CH3 con el resto del anticuerpo. Dos enlaces disulfuro en esta región bisagra conectan los dos polipéptidos de cadena pesada entre sí en un anticuerpo intacto. Cada cadena ligera se compone de dos dominios: un dominio variable amino-terminal (VL), seguido de un dominio constante carboxi-terminal (CL). Los expertos en la técnica están familiarizados con la estructura de los anticuerpos y los elementos de la secuencia, reconocen regiones "variables" y "constantes" en las secuencias proporcionadas, y entienden que puede haber cierta flexibilidad en la definición de un "límite" entre dichos dominios, de modo que diferentes presentaciones de la misma secuencia de cadena de anticuerpo pueden, por ejemplo, indicar dicho límite en una ubicación que se desplaza uno o unos pocos restos con respecto a una presentación diferente de la misma secuencia de cadena de anticuerpo.
Los tetrámeros de anticuerpos intactos se componen de dos dímeros de cadena pesada y cadena ligera en los que las cadenas pesada y ligera están unidas entre sí por un único enlace disulfuro; otros dos enlaces disulfuro conectan las regiones de bisagra de la cadena pesada entre sí, de modo que los dímeros se conectan entre sí y se forma el tetrámero. Los anticuerpos producidos naturalmente también están glicosilados, generalmente en el dominio CH2. Cada dominio de un anticuerpo natural tiene una estructura caracterizada por un "pliegue de inmunoglobulina" formado a partir de dos láminas beta (por ejemplo, láminas de 3, 4 o 5 hebras) empaquetadas una contra la otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Cada dominio variable contiene tres bucles hipervariables conocidos como "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR1, CDR2 y CDR3) y cuatro regiones "de marco" algo invariantes (FR1, FR2, FR3 y FR4). Cuando los anticuerpos naturales se pliegan, las regiones FR forman las láminas beta que proporcionan el marco estructural para los dominios, y las regiones de bucle CDR de las cadenas pesadas y ligeras se unen en un espacio tridimensional para crear un único sitio de unión a antígeno hipervariable ubicado en la punta de la estructura Y. La región Fc de los anticuerpos naturales se une a elementos del sistema del complemento, y también a receptores en células efectoras, incluidas, por ejemplo, células efectoras que median la citotoxicidad. Como se sabe en la técnica, la afinidad y/u otros atributos de unión de las regiones Fc para los receptores Fc pueden modularse a través de glicosilación u otra modificación. En algunas realizaciones, los anticuerpos producidos y/o utilizados de acuerdo con la presente invención incluyen dominios Fc glicosilados, incluidos dominios Fc con dicha glicosilación modificada o manipulada.
Para los fines de la presente descripción, en ciertas realizaciones, cualquier polipéptido o complejo de polipéptidos que incluya suficientes secuencias de dominio de inmunoglobulina como las que se encuentran en los anticuerpos naturales puede denominarse y/o usarse como un "anticuerpo", ya sea que dicho polipéptido se produzca de manera natural (por ejemplo, generado por un organismo que reacciona frente a un antígeno) o se produzca mediante ingeniería recombinante, síntesis química u otro sistema o metodología artificial. En algunas realizaciones, un anticuerpo es policlonal; en algunas realizaciones, un anticuerpo es monoclonal. En algunas realizaciones, un anticuerpo tiene secuencias de región constante que son características de los anticuerpos de ratón, conejo, primate o humano. En algunas realizaciones, los elementos de la secuencia de anticuerpos son humanizados, primatizados, quiméricos, etc., como se conoce en la técnica.
Además, el término "anticuerpo", como se usa aquí, puede referirse a cualquiera de las construcciones o formatos conocidos o desarrollados en la técnica para utilizar las características estructurales y funcionales del anticuerpo en una presentación alternativa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo utilizado en los métodos de la presente descripción está en un formato seleccionado de, pero no limitado a, anticuerpos IgA, IgG, IgE o IgM intactos; anticuerpos bi o multiespecíficos (por ejemplo, Zybodies®, etc.); fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, fragmentos Fd, y CDR aisladas o conjuntos de los mismos; fragmentos variables monocatenarios (scFV); fusiones de polipéptido-Fc; anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón tales como IgNAR o fragmentos de los mismos); anticuerpos de camélidos (también denominados aquí nanocuerpos o VHH); anticuerpos de tiburón, anticuerpos enmascarados (por ejemplo, Probodies®); inmunofármacos modulares pequeños (SMIPs™); diacuerpos de cadena única o en tándem (TandAb®); VHH; Anticalins®; minicuerpos Nanobodies®; BiTE®; proteínas de repetición de anquirina o DARPINs® ; Avimers®; DART; anticuerpos similares a TCR; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; y KALBITOR®. En algunas realizaciones, un anticuerpo puede carecer de una modificación covalente (por ejemplo, la unión de un glicano) que presentaría si se produjera de forma natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo puede contener una modificación covalente (por ejemplo, la unión de un glicano, una carga útil (por ejemplo, un resto detectable, un resto terapéutico, un resto catalítico, etc.) u otro grupo colgante (por ejemplo, polietilenglicol, etc.).
Como se usa aquí, la expresión "agente de anticuerpo" generalmente se refiere a un agente que se une específicamente a un antígeno particular. En algunas realizaciones, la expresión abarca cualquier polipéptido o complejo polipeptídico que incluya elementos estructurales de inmunoglobulina suficientes para conferir unión específica. Los agentes de anticuerpo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo puede incluir una o más secuencias de región constante que son características de los anticuerpos de ratón, conejo, primate o humano. En algunas realizaciones, un agente de anticuerpo puede incluir uno o más elementos de secuencia que son humanizados, primatizados, quiméricos, etc., como se conoce en la técnica. En muchas realizaciones, la expresión "agente de anticuerpo" se usa para referirse a uno o más de los constructos o formatos conocidos o desarrollados en la técnica para utilizar características estructurales y funcionales de anticuerpos en una presentación alternativa. Por ejemplo, un agente de anticuerpo utilizado de acuerdo con la presente invención está en un formato en un formato seleccionado de, pero no limitado a, anticuerpos IgA, IgG, IgE o IgM intactos; anticuerpos bi o multiespecíficos (por ejemplo, Zybodies®, etc.); fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fd, y CDR aisladas o conjuntos de los mismos; Fv monocatenarios (scFv); fusiones de polipéptido-Fc; anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón tales como IgNAR o fragmentos de los mismos); anticuerpos cameloides; anticuerpos enmascarados (por ejemplo, Probodies®); inmunofármacos modulares pequeños (SMIPs™); diacuerpos de cadena única o en tándem (TandAb®); VHH; Anticalins®; minicuerpos Nanobodies®; BiTE®; proteínas de repetición de anquirina o DARPINs® ; Avimers®; DART; anticuerpos similares a TCR; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; y KALBITOR®.
Un anticuerpo o agente de anticuerpo usado para realizar los métodos de la presente descripción puede ser monocatenario o bicatenario. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno es monocatenario. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un Fab, un Fab', un Fv, un F(ab')<2>, un dAb, y cualquier combinación de los mismos.
Los anticuerpos y agentes de anticuerpo incluyen fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo comprende una porción de un anticuerpo intacto, tal como la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>, Fv, diacuerpo, anticuerpos lineales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo y fragmentos scFv, y otros fragmentos. Los anticuerpos también incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, dAb quiméricos (anticuerpo de dominio), de cadena simple, fragmentos Fab, Fa, F(ab')<2>, y los scFv. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, una inmunoglobulina o un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir mediante diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células hospedantes recombinantes (por ejemplo, E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), o fagos), como se conoce en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o agente de anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico (véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo de "clase cambiada", en el que la clase o subclase ha cambiado con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo humanizado (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patente U.S. Nos. 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005); Padlan, Mol. Immunol, 28:489-498 (1991); Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005); Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005); y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)). Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácidos de regiones hipervariables no humanas y restos de aminoácidos de FR humanas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las regiones marco (FR) corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o agente de anticuerpo proporcionado aquí es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001); y Lonberg, Curr. Opin. Immunol, 20:450-459 (2008)). Un anticuerpo humano puede ser aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que usa repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado, que comprende restos de unión al antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando métodos bien conocidos en la técnica.
Receptores de antígenos quiméricos (CAR)
Como se describe aquí, los métodos descritos se pueden usar para agotar células TCR+ de una población de células inmunes. Las células inmunes pueden ser células CAR+ y manipuladas para uso en aplicaciones terapéuticas tal como la terapia alogénica. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada comprende un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular. Como se usa aquí, los receptores de antígenos quiméricos (CAR) comprenden proteínas que reconocen específicamente antígenos diana (por ejemplo, antígenos diana en células cancerosas; antígenos del cáncer). Cuando se une al antígeno diana, el CAR puede activar la célula inmune para atacar y destruir la célula portadora de ese antígeno (por ejemplo, la célula cancerosa). Los CAR también pueden incorporar dominios coestimuladores que comprenden la totalidad o una parte de proteínas tales como 4-1BB, CD28 u OX 40, y/o un dominio de señalización tal como CD3zeta para aumentar su potencia. Véase Krause et al., J. Exp. Med., Volumen 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797, Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), y Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016); patenes U.S. Nos.
7.741.465, y 6.319.494.
Los receptores de antígenos quiméricos descritos aquí comprenden un dominio extracelular, un dominio transmembrana, opcionalmente un dominio bisagra que une el dominio extracelular al dominio transmembrana, y un dominio intracelular, en los que el dominio extracelular comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la diana.
En algunas realizaciones, los CAR específicos del antígeno comprenden además un interruptor de seguridad y/o un epítopo específico de anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, un CAR selectivo de antígenos comprende un péptido líder o señal.
Dominios de unión a antígeno de CAR
Como se discutió anteriormente, los CAR descritos aquí comprenden un dominio de unión a antígeno. Un "dominio de unión a antígeno", como se usa aquí, significa cualquier polipéptido que se une a un antígeno diana específico. En algunas realizaciones, un dominio de unión a antígeno es un scFv. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno en una célula tumoral. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno en una célula involucrada en una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, u otro cáncer sólido o hematológico). Los métodos descritos se pueden emplear para agotar las células TCR+ que también son células CAR+, proporcionando así una población de células CAR+/TCR-. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de un CAR comprende una cadena pesada variable, una cadena ligera variable y/o una o más CDR descritas aquí. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un fragmento variable monocatenario (scFv), que comprende las CDR de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3, y las CDR de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3.
Se afirma que un dominio de unión a antígeno es "selectivo" cuando se une a una diana con más fuerza que a una segunda diana.
El dominio de unión a antígeno del CAR se dirige selectivamente contra un antígeno del cáncer. En algunas realizaciones, el antígeno del cáncer se selecciona de EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudina-18.2, Muc17, FAP alfa, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 o CD34. En algunas realizaciones, el CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se dirige contra EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudina-18.2, Muc17, FAP alfa, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 o CD34.
En algunas realizaciones, el antígeno del cáncer se selecciona del grupo que consiste en anhidrasa carbónica IX (CAIX), antígeno carcinoembrionario (CEA), CDS, CD7, CDIO, CD19, Cd20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, un antígeno de una célula infectada por citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, un antígeno de superficie celular), glicoproteína epitelial (EGP 2), glicoproteína epitelial-40 (EGP-40), molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), tirosina-proteína cinasas receptoras erb-B2,3,4, proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptores de folato, gangliósido G2 (GD2), gangliósido G3 (GD3), receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2), transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera x, receptor del dominio de inserción de cinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), molécula de adhesión celular LI (LICAM), familia de antígenos de melanoma A, 1 (MAGE-AI), mucina 16 (Muc-16), mucina 1 (Muc-1), mesotelina (MSLN), ligandos NKG2D, antígeno de cáncer testicular NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), antígeno de células madre prostáticas (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2), y proteína tumoral de Wilms (WT-1).
En otras realizaciones, la descripción se refiere a polinucleótidos aislados que codifican uno cualquiera de los dominios de unión a antígeno descritos aquí. En algunas realizaciones, la descripción se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un CAR. También se proporcionan aquí vectores que comprenden los polinucleótidos, y métodos para obtenerlos.
En algunas realizaciones, una célula inmune de CAR (por ejemplo, una célula CAR-T) que puede formar un componente de una población de células generada mediante la práctica de los métodos de la presente descripción comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido interruptor de seguridad, tal como por ejemplo RQR8. Véase, por ejemplo, el documento WO2013153391A. En una célula inmune de CAR (por ejemplo, una célula CAR-T) que comprende el polinucleótido, el polipéptido interruptor de seguridad se puede expresar en la superficie de una célula inmune de CAR (por ejemplo, una célula CAR-T).
Dominios bisagra de CAR
El dominio extracelular de los CAR de la descripción puede comprender un dominio "bisagra" (o región bisagra). El término en general a cualquier polipéptido que funcione ligando el dominio transmembranario en un CAR al dominio extracelular de unión a antígeno en un CAR. En particular, los dominios de bisagra pueden usarse para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio extracelular de unión a antígeno.
Un dominio bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos -en algunas realizaciones, 10 a 100 aminoácidos, o en algunas realizaciones, 25 a 50 aminoácidos. El dominio bisagra puede derivar de la totalidad o parte de moléculas de origen natural, tal como de la totalidad o parte de la región extracelular de CD8, CD4, CD28, 4-1BB o IgG (en particular, la región bisagra de una IgG; se apreciará que la región bisagra puede contener parte o la totalidad de un miembro de la familia de inmunoglobulinas tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM o un fragmento de las mismas), o de la totalidad o parte de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo. Alternativamente, el dominio bisagra puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia natural, o puede ser una secuencia bisagra completamente sintética. En algunas realizaciones, dicho dominio de bisagra es una parte de la cadena CD8a humana (por ejemplo, NP_001139345.1). En otra realización particular, dichos dominios de bisagra y transmembranario comprenden una parte de la cadena CD8a humana. En algunas realizaciones, el dominio de bisagra de los CAR descritos en este documento comprende una subsecuencia de CD8a, IgG1, IgG4, PD-1 o FcYRIIIa, en particular la región de bisagra de cualquiera de CD8a, IgG 1, IgG4, PD-1 o FcYRIIIa. En algunas realizaciones, el dominio de bisagra comprende una bisagra de CD8a humana, una bisagra de IgG 1 humana, IgG4 humana, PD-1 humana o una bisagra de FcYRIIIa humano. En algunas realizaciones, los CAR divulgados en este documento comprenden un scFv, bisagra humana de CD8a y dominios transmembranarios, el dominio de señalización CD3Z y el dominio de señalización 4-1BB.
Dominios transmembrana de CAR
Los CAR proporcionados aquí están diseñados con un dominio transmembrana que se fusiona al dominio extracelular del CAR. Puede fusionarse de manera similar al dominio intracelular del CAR. En algunos casos, el dominio transmembranario puede seleccionarse o modificarse por sustitución aminoacídica para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembranarios de las mismas o diferentes proteínas superficiales de membrana para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En algunas realizaciones, los enlazadores cortos pueden formar enlaces entre cualquiera o algunos de los dominios extracelulares, transmembrana e intracelulares del CAR.
Las regiones transmembrana pueden ser sintéticas (no naturales), o pueden derivar de (comprender o corresponder a un fragmento de) CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, muerte programada-1 (PD-1), coestimulador inducible de células T (ICOS), antígeno 1 asociado a la función linfocítica (LFA-1, CD1 -1 a/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), receptores activadores de células NK, BTLA, receptores de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que se une específicamente con CD83, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana en el CAR de la descripción es un dominio transmembrana CD8a.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana en el CAR de la descripción es un dominio transmembrana CD28.
Dominios intracelulares de CAR
El dominio intracelular (citoplasmático) de un CAR puede proporcionar la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune que comprende el CAR. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede referirse a la actividad citolítica o a la actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.
Se apreciará que los dominios intracelulares adecuados (por ejemplo, activadores) incluyen, pero no se limitan a, los dominios de señalización derivados de (comprenden o corresponden a la totalidad o un fragmento de) CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, muerte programada-1 (PD-1), coestimulador inducible de células T (ICOS), antígeno 1 asociado a la función linfocítica (LfA-1, CD1-1a/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), D<a>P-10, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), receptores activadores de células NK, BTLA, receptores de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, G<a>D<s>, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que se une específicamente con CD83, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular/citoplasmático de un CAR puede diseñarse para comprender el dominio 41BB/CD137 por sí solo o combinado con cualquier otro dominio intracelular deseado útil en el contexto de un CAR. La secuencia de aminoácidos natural completa de 41BB/CD137 se describe en la secuencia de referencia de NCBI: NP_001552.2. La secuencia de ácido nucleico natural completa de 41BB/CD137 se describe en la secuencia de referencia de NCBI: NM_001561.5.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular/citoplasmático de un CAR puede diseñarse para comprender un dominio CD28 por sí solo o combinado con cualquier otro dominio o dominios intracelulares deseados útiles en el contexto de un CAR de la presente descripción. La secuencia de aminoácidos natural completa de CD28 se describe en la secuencia de referencia de NCBI: NP_006130.1. La secuencia de ácido nucleico natural completa de CD28 se describe en la secuencia de referencia de NCBI: NM_006139.1.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular/citoplasmático de un CAR puede diseñarse para comprender la totalidad o un fragmento del dominio CD3 zeta por sí solo o combinado con cualquier otro dominio o dominios intracelulares deseados útiles en el contexto de un CAR.
En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular de un CAR comprende un dominio de una molécula coestimuladora. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular de un CAR comprende una parte de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en un fragmento de 41BB (GenBank: AAA53133) y CD28 (NP_006130.1).
Células inmunes manipuladas que comprenden CAR
Se proporcionan aquí células inmunes manipuladas y poblaciones de células inmunes manipuladas que expresan CAR (por ejemplo, células CAR-T o células CAR+), que están desprovistas de células que expresan TCR endógeno. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada comprende una célula CAR T, cada célula CAR T comprende un dominio de unión a antígeno extracelular y tiene una expresión reducida o eliminada de TCR endógeno. En algunas realizaciones, una población de células inmunes manipuladas comprende una población de células CAR T, comprendiendo cada célula CAR T dos o más dominios de unión a antígeno extracelular diferentes y tiene una expresión reducida o eliminada de TCR endógeno. En algunas realizaciones, una célula inmune comprende una población de CAR, comprendiendo cada célula CAR T los mismos dominios de unión a antígeno extracelulares y tiene una expresión reducida o eliminada de TCR endógeno.
Las células inmunes manipuladas pueden ser alogénicas o autólogas.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada o una población de células inmunitarias manipuladas es una célula T (por ejemplo, linfocito T inflamatorio, linfocito T citotóxico, linfocito T regulador, linfocito T auxiliar, linfocito infiltrante de tumores (TIL)), célula NK, célula T NK, célula que expresa TCR, célula dendrítica, célula dendrítica asesina, un mastocito, o una célula B, y expresa un CAR. En algunas realizaciones, la célula T puede derivar del grupo que consiste en linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, o una población que comprende una combinación de células T CD4+ y CD8+.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada o una población de células inmunitarias manipuladas que se generan usando los métodos descritos puede derivar de, por ejemplo sin limitación, una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada o una población de células inmunes que se generan usando los métodos descritos se obtiene o se prepara a partir de sangre periférica. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada se obtiene o se prepara a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada se obtiene o se prepara a partir de médula ósea. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada se obtiene o se prepara a partir de sangre del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula se transfecta o transduce por el vector de ácido nucleico usando un método seleccionado del grupo que consiste en electroporación, sonoporación, biolística (por ejemplo, pistola génica), transfección lipídica, transfección polimérica, nanopartículas, transfección vírica (por ejemplo, retrovirus, lentivirus, AAV) o poliplexes.
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno comprenden un porcentaje de células de memoria de células madre y células de memoria central superior al 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 %.
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno de la descripción comprenden un porcentaje de células de memoria de células madre y células de memoria central de alrededor de 10 % a alrededor de 100 %, alrededor de 10 % a alrededor de 90 %, alrededor de 10 % a alrededor de 80 %, alrededor de 10 % a alrededor de 70 %, alrededor de 10 % a alrededor de 60 %, alrededor de 10 % a alrededor de 50 %, alrededor de 10 % a alrededor de 40 %, alrededor de 10 % a alrededor de 30 %, alrededor de 10 % a alrededor de 20 %, alrededor de 15 % a alrededor de 100 %, alrededor de 15 % a alrededor de 90 %, alrededor de 15 % a alrededor de 80 %, alrededor de 15 % a alrededor de 70 %, alrededor de 15 % a alrededor de 60 %, alrededor de 15 % a alrededor de 50 %, alrededor de 15 % a alrededor de 40 %, alrededor de 15 % a alrededor de 30 %, alrededor de 20 % a alrededor de 100 %, alrededor de 20 % a alrededor de 90 %, alrededor de 20 % a alrededor de 80 %, alrededor de 20 % a alrededor de 70 %, alrededor de 20 % a alrededor de 60 %, alrededor de 20 % a alrededor de 50 %, alrededor de 20 % a alrededor de 40 %, alrededor de 20 % a alrededor de 30 %, alrededor de 30 % a alrededor de 100 %, alrededor de 30 % a alrededor de 90 %, alrededor de 30 % a alrededor de 80 %, alrededor de 30 % a alrededor de 70 %, alrededor de 30 % a alrededor de 60 %, alrededor de 30 % a alrededor de 50 %, alrededor de 30 % a alrededor de 40 %, alrededor de 40 % a alrededor de 100 %, alrededor de 40 % a alrededor de 90 %, alrededor de 40 % a alrededor de 80 %, alrededor de 40 % a alrededor de 70 %, alrededor de 40 % a alrededor de 60 %, alrededor de 40 % a alrededor de 50 %, alrededor de 50 % a alrededor de 100 %, alrededor de 50 % a alrededor de 90 %, alrededor de 50 % a alrededor de 80 %, alrededor de 50 % a alrededor de 70 %, alrededor de 50 % a alrededor de 60 %, alrededor de 60 % a alrededor de 100 %, alrededor de 60 % a alrededor de 90 %, alrededor de 60 % a alrededor de 80 %, alrededor de 60 % a alrededor de 70 %, alrededor de 70 % a alrededor de 90 %, alrededor de 70 % a alrededor de 80 %, alrededor de 80 % a alrededor de 100 %, alrededor de 80 % a alrededor de 90 %, alrededor de 90 % a alrededor de 100 %, alrededor de 25 % a alrededor de 50 %, alrededor de 75 % a alrededor de 100 %, o alrededor de 50 % a alrededor de 75 %
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno comprenden un porcentaje de células de memoria de células madre y células de memoria central superior al 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, o 60 %.
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno comprenden un porcentaje de células de memoria de células madre y células de memoria central de alrededor de 10 % a alrededor de 60 %, alrededor de 10 % a alrededor de 50 %, alrededor de 10 % a alrededor de 40 %, alrededor de 15 % a alrededor de 50 %, alrededor de 15 % a alrededor de 40 %, alrededor de 20 % a alrededor de 60 %, o alrededor de 20 % a alrededor de 70 %.
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno se enriquecen en células T<cm>y/o T<scm>, de modo que las células inmunes manipuladas comprenden al menos alrededor de 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de células T<cm>y T<scm>combinadas. En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno se enriquecen en células T<cm>y/o T<scm>, de modo que las células inmunes manipuladas comprenden al menos alrededor de 70 % de células T<cm>y T<scm>combinadas. En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno se enriquecen en células T<cm>y/o T<scm>, de modo que las células inmunes manipuladas comprenden al menos alrededor de 75 % de células T<cm>y/o T<scm>combinadas.
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno de la descripción se enriquecen en células T<cm>y/o T<scm>, de modo que las células inmunes manipuladas comprenden al menos alrededor de 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, o 60 % de células T<scm>. En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas que expresan en su membrana de superficie celular un CAR específico de antígeno de la descripción se enriquecen en células T<cm>y/o T<scm>, de modo que las células inmunes manipuladas comprenden al menos alrededor de 30 %, 35 %, 40 %, o 45 % de células T<scm>.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada es un linfocito T inflamatorio que expresa un CAR. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada es un linfocito T citotóxico que expresa un CAR. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada es un linfocito T regulador que expresa un CAR. En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada es un linfocito T auxiliar que expresa un CAR.
En algunas realizaciones, una célula inmune manipulada según la presente descripción puede comprender uno o más genes alterados o inactivados. En algunas realizaciones, un gen para un antígeno diana (por ejemplo, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudina-18.2, Muc17, FAP alfa, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, o CD34, CD70) se puede eliminar para introducir un CAR dirigido al mismo antígeno (por ejemplo, un EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, c D23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudina-18.2, Muc17, FAP alfa, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, or CD34, CD70 CAR) para evitar la activación inducida de CAR. Como se describe aquí, en algunas realizaciones, una célula inmune manipulada de acuerdo con la presente descripción comprende un gen alterado o inactivado seleccionado del grupo que consiste en MHC1 (p2M), MHC2 (CIITA), EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudina-18.2, Muc17, FAP alfa, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, o CD34, CD70, TCRa y TCRp, y/o expresa un CAR o un CAR multicatenario. En algunas realizaciones, una célula comprende un CAR multicatenario. En algunas realizaciones, la célula aislada comprende dos genes alterados o inactivados seleccionados del grupo que consiste en: CD52 y TCRá, CDR52 y TCRa, PD-1 y TCRá, PD-1 y TCRa, MHC-1 y TCRá, MHC-1 y TCRa, m Hc 2 y TCRá, MHC2 y TCRa, y/o expresa un CAR o un cAr multicatenario.
En algunas realizaciones, el método comprende alterar o inactivar uno o más genes introduciendo en las células una endonucleasa capaz de inactivar selectivamente un gen mediante escisión selectiva del ADN. En algunas realizaciones, la endonucleasa puede ser, por ejemplo, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una nucleasa megaTAL, una meganucleasa, una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (nucleasa TALE, o TALEN®) o una endonucleasa CRISPR (por ejemplo, una Cas9 o Cas12).
En algunas realizaciones, una célula TCR+ o una población de la misma se vuelve no funcional en las células al alterar o inactivar el gen TCRa endógeno y/o el gen o genes TCRp. Los métodos de agotamiento de la presente descripción son particularmente útiles para eliminar cualesquiera células T TCR+ restantes de una población de células, después de la inactivación del gen TRCa. Las células inmunes manipuladas generadas usando los métodos descritos aquí se pueden usar para tratar pacientes que lo necesitan al prevenir o reducir el rechazo de hospedante contra injerto (HvGD) y la enfermedad de injerto contra hospedante (GvHD); por lo tanto, el alcance de la presente descripción es un método para tratar pacientes que lo necesitan al prevenir o reducir el rechazo de hospedante contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra hospedante (GvHD), que comprende tratar a dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad efectiva de células inmunes manipuladas que comprenden genes TCRa y/o TCRp alterados o inactivados.
La presente descripción proporciona métodos para aumentar la pureza de una población de células inmunes manipuladas que carecen o que tienen una expresión de TCR endógeno reducida. En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas comprenden menos del 1,0 % de células TCR+, menos del 0,9 % de células TCR+, menos del 0,8 % de células TCR+, menos del 0,7 % de células TCR+, menos del 0,6 % de células TCR+, menos del 0,5 % de células TCR+, menos del 0,4 % de células TCR+, menos del 0,3 % de células TCR+, menos del 0,2 % de células TCR+, o menos del 0,1 % de células TCR+. Esta población puede ser un producto de los métodos descritos.
En algunas realizaciones, una población de células inmunes manipuladas comprende menos del 0,1 % de células TCR+. En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas comprenden menos del 0,09 % de células TCR+, menos del 0,08 % de células TCR+, menos del 0,07 % de células TCR+, menos del 0,06 % de células TCR+, menos del 0,05 % de células TCR+, menos del 0,04 % de células TCR+, menos del 0,03 % de células TCR+, menos del 0,02 % de células TCR+, menos del 0,01 % de células TCR+. Esta población puede ser un producto de los métodos descritos.
En algunas realizaciones, una población de células inmunes manipuladas comprende entre alrededor de 0,01-0,001 % de células TCR+. Esta población puede ser un producto de los métodos descritos.
La descripción también proporciona células inmunes manipuladas que comprenden cualquiera de los CAR descritos aquí, y también pueden presentar una expresión reducida o eliminada de uno o más genes endógenos. En algunas realizaciones, un CAR puede introducirse en un inmunocito como un transgén mediante un vector plasmídico. En algunas realizaciones, el vector plasmídico también puede contener, por ejemplo, un marcador de selección que proporciona la identificación y/o selección de células que recibieron el vector.
Obtención de células inmunes manipuladas TCR- y poblaciones de células inmunes manipuladas of TCR-(incluyendo células CAR T)
Se proporcionan aquí métodos para agotar células que expresan un TCR endógeno de una población de células inmunes (incluidas células inmunes manipuladas tales como células CAR+). Como se describe aquí, marcar la población de células con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3, separar las células marcadas con anti-TCR y anti-CD3 de las células no marcadas, y recolectar las células no marcadas, facilita la obtención de una población de células que están desprovistas de células que expresan un TCR endógeno. En diversas realizaciones, la separación se puede lograr generalmente usando perlas magnéticas, partículas de ondas acústicas, membranas (todas las cuales se pueden conjugar con un resto que es reconocido por las células marcadas), FACS y otros métodos de separación conocidos. Las células generadas usando este método también forman un aspecto de la presente descripción.
También se proporcionan aquí métodos para agotar células que expresan un TCR endógeno de una población de células inmunes (incluidas células inmunes manipuladas tales como células CAR+). Como se describe aquí, marcar la población de células con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD52, separar las células marcadas con anti-TCR, anti-CD3 y anti-CD52 de las células no marcadas, y recolectar las células no marcadas, facilita la obtención de una población de células que están desprovistas de células que expresan un TCR endógeno. En diversas realizaciones, la separación se puede lograr generalmente usando perlas magnéticas, partículas de ondas acústicas, membranas (todas las cuales se pueden conjugar con un resto que es reconocido por las células marcadas), FACS y otros métodos de separación conocidos. Las células generadas usando este método también forman un aspecto de la presente descripción.
Antes de la manipulaciónin vitroo la modificación genética de las células inmunes manipuladas descritas aquí, las células pueden obtenerse de un sujeto. Una población de células que expresan un CAR puede derivar de un proceso alogénico o autólogo, como se describe aquí, y pueden agotarse del TCR endógeno como se describe aquí. Modificación genética de células inmunes aisladas
Como se describe aquí, las células inmunes, tales como las células T, pueden modificarse genéticamente antes de realizar los métodos proporcionados aquí usando métodos conocidos, o las células inmunes pueden activarse y expandirse (o diferenciarse en el caso de iPSC o células progenitoras) in vitro antes de modificarse genéticamente. Las células inmunes se modifican genéticamente para reducir o eliminar la expresión de TCR endógeno (TRAC). En algunas realizaciones, las células inmunes se modifican genéticamente para reducir o eliminar la expresión de MHC1(p2M), MHC2, PD1, y/o CD52. En algunas realizaciones, se puede reducir o eliminar la expresión de dos o más proteínas endógenas. Por ejemplo, se puede reducir o eliminar la expresión de TRAC y CD52. En otro ejemplo, se puede reducir o eliminar la expresión de TRAC y una proteína que es la diana de un CAR transducido. En algunas realizaciones, las células se modifican genéticamente usando tecnología de edición genética (por ejemplo, CRISPR/Cas9, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una TALEN®, una MegaTAL, una meganucleasa) para reducir o eliminar la expresión de una o más proteínas endógenas (por ejemplo, TCRa, MHC1, MHC2, PD1, CD52). En otra realización, las células inmunes, tales como las células T, se modifican genéticamente con los receptores de antígenos quiméricos descritos aquí (por ejemplo, se transducen con un vector viral que comprende una o más secuencias nucleotídicas que codifican un CAR, o usando medios no virales), y después se activan y/o expandenin vitro.
En la solicitud PCT WO2015/120096 (PCT/US15/14520) se describen ciertos métodos para obtener las construcciones y células inmunes manipuladas de la descripción.
La descripción proporciona un método para almacenar células manipuladas genéticamente que expresan los CAR. Esto implica crioconservar los inmunocitos de modo que las células permanezcan viables tras la descongelación. Una fracción de los inmunocitos que expresan los CAR puede crioconservarse por métodos conocidos en la técnica para proporcionar una fuente permanente de dichas células para el futuro tratamiento de pacientes afectados con una neoplasia. Cuando se necesitan, los inmunocitos transformados crioconservados pueden descongelarse, cultivarse y expandir para tener más de estas células. Como lo demuestran los ejemplos y dibujos, las poblaciones de células generadas usando los métodos de agotamiento proporcionados aquí pueden criopreservarse y después descongelarse para aplicaciones terapéuticas.
Linfocitos T-CAR alogénicos
Un procedimiento para fabricar una terapia CAR T alogénica, o AlloCARs™, implica la recolección de células T
sanas, seleccionadas, examinadas y probadas de donantes sanos. A continuación, las células T se manipulan para expresar los CAR, que reconocen ciertas proteínas de la superficie celular (por ejemplo, antígenos diana tales como EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP alfa, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25,<c>D19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 o CD34) que se expresan en tumores hematológicos o sólidos. Las células T alogénicas se editan genéticamente usando herramientas de edición genética tales como TALEN®, dedos de zinc, CRISPR u otras tecnologías de edición genética, para reducir el riesgo de enfermedad de injerto contra hospedante (GvHD) y prevenir el rechazo alogénico (HvGD) cuando se administran a un paciente diferente del donante.
La expresión de un gen del receptor de células T endógeno (por ejemplo, TCRa, TCRp) se puede reducir o eliminar para evitar GvHD. La expresión de MHC1 (p2M), MHC2 y/o PD1 endógenos también se puede reducir o eliminar para evitar que la HvGD impida que las células inmunes del hospedante reconozcan MHC1 y MHC2 en las células del injerto como antígenos extraños. La expresión endógena del gen CD52 (grupo de diferenciación 52) también se
puede reducir o eliminar para hacer que el producto CAR T sea resistente al tratamiento con anticuerpos anti-CD52.
Por lo tanto, el tratamiento de linfoagotamiento con anticuerpos anti-CD52 se puede utilizar para suprimir el sistema inmunológico del hospedante, lo que permite que los CAR T permanezcan injertados para lograr su impacto terapéutico completo. Como se describe aquí, una célula inmune manipulada o una población de la misma para uso
en terapia alogénica puede comprender múltiples eliminaciones, al menos para los fines ejemplificados anteriormente.
En algunas realizaciones, la expresión endógena del gen que codifica la proteína de muerte celular programada 1
(PD1), también conocida como CD279, puede reducirse o eliminarse para mejorar la potencia antitumoral.
Linfocitos T-CAR autólogos
La terapia con células T con receptores de antígenos quiméricos autólogas (CAR) implica recolectar las propias células del paciente (por ejemplo, glóbulos blancos, incluidas las células T) y manipular genéticamente las células T para que expresen los CAR que reconozcan antígenos diana expresados en la superficie celular de una o más células cancerosas específicas y destruyan las células cancerosas. Las células manipuladas entonces se crioconservan y posteriormente se administran al paciente.
Composiciones farmacéuticas y terapia
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una población de células preparadas usando los métodos descritos pueden ser útiles para tratar un paciente que tiene un cáncer. Las cantidades de tratamiento deseadas de
células manipuladas de una población generada usando los métodos proporcionados aquí son generalmente de al menos 2 células (por ejemplo, al menos 1 célula T de memoria central CD8+ o al menos 1 subconjunto de células T auxiliares CD4+ o una de cada una de una célula CD8+ y una célula CD4+), o son más típicamente mayores que
102 células, y hasta 106, hasta e incluyendo 108 o 109 células, y pueden ser más de 1010 células. El número de
células dependerá del uso deseado para el que está destinada la composición, y el tipo de células incluidas en la misma. La densidad de las células deseadas suele ser mayor que 106 células/ml, y generalmente es mayor que 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o mayor. La cantidad clínicamente relevante de células inmunes se puede distribuir en infusiones múltiples que en conjunto igualen o superen 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, En algunas aplicaciones de una población de células generada usando los métodos de la presente descripción, particularmente puesto que todas las células infundidas se redirigirán contra un antígeno diana particular, se pueden administrar cantidades menores de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente). Los tratamientos con CAR se pueden administrar varias veces en dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser autólogas, alogénicas, o heterólogas del paciente sometido a terapia.
Como se describe aquí, una población de células inmunes manipuladas puede verse desprovista de células que expresan TCR endógeno (por ejemplo, las células son TCR- y/o comprenden niveles residuales de células TCR+).
En algunas realizaciones, las células inmunes manipuladas comprenden menos del 1,0 % de células TCR+, menos del 0,9 % de células TCR+, menos del 0,8 % de células TCR+, menos del 0,7 % de células TCR+, menos del 0,6 %
de células TCR+, menos del 0,5 % de células TCR+, menos del 0,4 % de células TCR+, menos del 0,3 % de células TCR+, menos del 0,2 % de células TCR+, o menos del 0,1 % de células TCR+. Las poblaciones de células que
tienen los niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunas realizaciones, una población de células inmunes manipuladas comprende menos del 0,09 % de células TCR+, menos del 0,08 % de células TCR+, menos del 0,07 % de células TCR+, menos del 0,06 % de células TCR+, menos del 0,05 % de células TCR+, menos del 0,04 % de células TCR+, menos del 0,03 % de células TCR+, menos del 0,02 % de células TCR+, menos del 0,01 % de células TCR+. Las poblaciones de células que tienen los niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunas realizaciones, una población de células inmunes manipuladas comprende entre alrededor de 0,01-0,001 % de células TCR+. Las poblaciones de células que tienen los niveles de células TCR+ mencionados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunas realizaciones, una población de células inmunes manipuladas comprende niveles indetectables de células TCR+. Las poblaciones de células que tienen los niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunas realizaciones, la población de células inmunes manipuladas comprende más del 99 % de células TCR-, más del 99,9 % de células T<c>R-, más del 99,91 % de células TCR-, más del 99,92 % de células TCR-, más del 99,93 % de células TCR-, más del 99,94 % de células TCR-, más del 99,95 % de células TCR-, más del 99,96 % de células TCR-, más del 99,97 % de células TCR- o más del 99,98 % de células TCR-. Las poblaciones de células que tienen los niveles de células TCR- citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunas realizaciones, la población de células inmunes manipuladas comprende entre alrededor de 99,99-99,999 % de células TCR-. Las poblaciones de células que tienen estos niveles de células TCR- citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
Las poblaciones de células que expresan CAR desprovistas de TCR generadas usando los métodos de la presente descripción se pueden administrar solas o en combinación con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones de células. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden comprender una población de células TCR- que expresan CAR, tales como células T manipuladas, como se describe aquí. Las composiciones de la presente descripción se formulan preferiblemente para infusión o administración intravenosa. Métodos de tratamiento
La presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad (por ejemplo, cáncer) en un paciente, que comprenden administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una población de células inmunes manipuladas (por ejemplo, células obtenidas no del paciente, sino de un donante sano) que comprenden un CAR, en los que la población de células inmunes manipuladas está desprovista de células que expresan TCR endógeno (por ejemplo, las células son TCR- y/o comprenden niveles residuales de células TCR+).
En algunos ejemplos de referencia, la población de células inmunes manipuladas comprende menos del 1,0 % de células TCR+, menos del 0,9 % de células TCR+, menos del 0,8 % de células TCR+, menos del 0,7 % de células TCR+, menos del 0,6 % de células TCR+, menos del 0,5 % de células TCR+, menos del 0,4 % de células TCR+, menos del 0,3 % de células TCR+, menos del 0,2 % de células TCR+, o menos del 0,1 % de células TCR+. Las poblaciones de células que tienen los niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunos ejemplos de referencia, la población de células inmunes manipuladas comprende menos del 0,09 % de células TCR+, menos del 0,08 % de células TCR+, menos del 0,07 % de células TCR+, menos del 0,06 % de células TCR+, menos del 0,05 % de células TCR+, menos del 0,04 % de células TCR+, menos del 0,03 % de células TCR+, menos del 0,02 % de células TCR+, menos del 0,01 % de células TCR+. Las poblaciones de células que tienen los niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunos ejemplos de referencia, la población de células inmunes manipuladas comprende entre alrededor de 0,01-0,001 % de células TCR+. En algunos ejemplos de referencia, las células inmunes manipuladas comprenden niveles indetectables de células TCR+. Las poblaciones de células que tienen estos niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunos ejemplos de referencia, la población de células inmunes manipuladas comprende más del 99 % de células TCR-, más del 99,9 % de células TCR-, más del 99,91 % de células TCR-, más del 99,92 % de células TCR-, más del 99,93 % de células TCR-, más del 99,94 % de células TCR-, más del 99,95 % de células TCR-, más del 99,96 % de células TCR-, más del 99,97 % de células TCR- o más del 99,98 % de células TCR-. Las poblaciones de células que tienen estos niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
En algunos ejemplos de referencia, la población de células inmunes manipuladas comprende entre alrededor de 99,99-99,999 % de células TCR-. Las poblaciones de células que tienen estos niveles de células TCR+ citados anteriormente se pueden lograr usando los métodos descritos aquí.
Como referencia, se proporcionan aquí métodos para tratar enfermedades o trastornos, incluido el cáncer. Los métodos reducen la probabilidad de que un paciente se enfrente a GvHD cuando se trata con una terapia alogénica. En algunos ejemplos, la descripción se refiere a la administración de una cantidad efectiva de una población de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR, preparadas usando los métodos de la presente descripción, al sujeto que lo necesita. En algunos ejemplos, la respuesta inmune mediada por células T se dirige contra una célula o células diana que expresan un antígeno del cáncer. En algunos ejemplos, la población de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR comprende células que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos ejemplos, la célula diana es una célula tumoral sólida o hematológica. En algunos aspectos, la descripción comprende un método para tratar o prevenir una neoplasia maligna, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de una población de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR preparadas usando los métodos descritos aquí. En algunos aspectos, la descripción comprende un método para tratar o prevenir una neoplasia maligna, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una población de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR preparadas usando los métodos proporcionados aquí, en el que la población de células inmunes desprovistas de TCR comprende al menos un receptor de antígeno quimérico y/o un dominio de unión a antígeno aislado como se describe aquí. En algunos ejemplos, una población de células inmunes que contienen CAR desprovistas de TCR preparadas usando los métodos de la descripción se puede utilizar para tratar neoplasias hematológicas o tumores sólidos.
En algunos ejemplos, una población de células inmunes que contienen CAR desprovistas de TCR preparadas usando los métodos de la presente descripción se puede utilizar para tratar cáncer de pulmón microcítico, melanoma, gliomas de bajo grado, glioblastoma, cáncer de tiroides medular, carcinoides, tumores neuroendocrinos dispersos en el páncreas, vejiga y próstata, cáncer testicular, y adenocarcinomas de pulmón con características neuroendocrinas. En algunos ejemplos, una población de células inmunes que contienen CAR desprovistas de TCR, por ejemplo células CAR-T preparadas usando los métodos de la presente descripción, se usan para tratar cánceres de tumores sólidos. En algunos ejemplos, una población de células inmunes que contienen CAR desprovistas de TCR, por ejemplo células CAR-T preparadas usando los métodos de la presente descripción, se usan para tratar linfoma no de Hodgkin (LNH), carcinoma de células renales (RCC), leucemia linfocítica aguda (LLA), mieloma múltiple (MM), o leucemia mieloide aguda (LMA).
También se proporcionan, como referencia, métodos para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una población de células manipuladas desprovistas de TCR preparadas usando los métodos de la presente descripción al sujeto, en los que la célula comprende un receptor de antígeno quimérico que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno en el tumor.
En algunos ejemplos, el sujeto tiene un tumor sólido, o una neoplasia de la sangre, tal como un linfoma o una leucemia (un cáncer hematológico). En algunos ejemplos, una población de células manipuladas desprovistas de TCR preparadas usando los métodos de la presente descripción se administra a un lecho tumoral. En algunos ejemplos, el cáncer está presente en la médula ósea del sujeto, y se le administra una población de células preparadas usando los métodos de la presente descripción. En algunos ejemplos, el cáncer está presente en las células sanguíneas o inmunes del paciente, y se le administra una población de células preparada usando los métodos de la presente descripción. En algunos ejemplos, las células manipuladas son células inmunes autólogas, por ejemplo células T autólogas. En algunos ejemplos, las células manipuladas son células inmunes alogénicas, por ejemplo células T alogénicas, para las cuales el uso de los métodos descritos será de particular beneficio.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis eficaz", "cantidad eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico, por ejemplo una población de células CAR T manipuladas desprovistas de TCR generadas usando los métodos de la presente descripción, es cualquier cantidad que, cuando se usa sola o en combinación con otro agente terapéutico, protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o la discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico de promover la regresión de la enfermedad puede evaluarse usando una diversidad de métodos conocidos por el facultativo experto, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelo animal predictivos de la eficacia en seres humanos, o ensayando la actividad del agente en ensayosin vitro.
Las cantidades de tratamiento deseadas de células manipuladas desprovistas de TCR en una composición comprenden al menos 2 células (por ejemplo, al menos una célula T de memoria central CD8+ y al menos un subconjunto de células T auxiliares CD4+ o al menos 2 células CD4+ o al menos 2 células CD8+), o es más típicamente mayor que 102 células, y hasta 106, hasta e incluyendo 108 o 109 células, y pueden ser más de 1010 células. El número de células dependerá del uso deseado para el que está destinada la composición, y el tipo de células incluidas en la misma. Se observa que los métodos proporcionados aquí se pueden usar para generar poblaciones de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR que comprenden sólo células CD4+, sólo células CD8+, o tanto células CD4+ como CD8+. La densidad de las células deseadas suele ser mayor que 106 células/ml, y generalmente es mayor que 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o mayor. La cantidad clínicamente relevante de células inmunes se puede distribuir en infusiones múltiples que en conjunto igualen o superen 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, o 1012 células. En algunos aspectos de la presente descripción, particularmente puesto que todas las células infundidas se redirigirán contra un antígeno diana particular, se pueden administrar cantidades menores de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente). Los tratamientos con CAR pueden administrarse múltiples veces a dosificaciones dentro de estos intervalos. Las células pueden ser autólogas, alogénicas o heterógenas al paciente que se está sometiendo a tratamiento.
En algunos ejemplos, la cantidad terapéuticamente eficaz de células CAR T con TCR agotado preparadas usando los métodos de la presente descripción es alrededor de 1 X 105 células/kg, alrededor de 2 X 105 células/kg, alrededor de 3 X 105 células/kg, alrededor de 4 X 105 células/kg, alrededor de 5 X 105 células/kg, alrededor de 6 X 105 células/kg, alrededor de 7 X 105 células/kg, alrededor de 8 X 105 células/kg, alrededor de 9 X 105 células/kg, 2 X 106 células/kg, alrededor de 3 X 106 células/kg, alrededor de 4 X 106 células/kg, alrededor de 5 X 106 células/kg, alrededor de 6 X 106 células/kg, alrededor de 7 X 106 células/kg, alrededor de 8 X 106 células/kg, alrededor de 9 X 106 células/kg, alrededor de 1 X 107 células/kg, alrededor de 2 X 107 células/kg, alrededor de 3 X 107 células/kg, alrededor de 4 X 107 células/kg, alrededor de 5 X 107 células/kg, alrededor de 6 X 107 células/kg, alrededor de 7 X 107 células/kg, alrededor de 8 X 107 células/kg, o alrededor de 9 X 107 células/kg.
En algunos ejemplos, las dosis diana para células T CAR+/TCR- oscilan de 1x106 a 2x108 células/kg, por ejemplo 2x106 células/kg. Se apreciará que pueden ser apropiadas dosis por encima y por debajo de este intervalo para determinados sujetos, y los niveles de dosis apropiados puede determinarlos el profesional sanitario según lo necesario. Además, pueden proporcionarse múltiples dosis de células de acuerdo con la divulgación.
En algunos ejemplos, tras la administración a un paciente, una población de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR preparadas usando los métodos de la presente descripción que expresan en su superficie celular uno cualquiera de los CAR específicos de antígeno descritos aquí pueden reducir, matar o lisar células endógenas que expresan antígeno del paciente. En un ejemplo, una reducción porcentual o lisis de células endógenas que expresan antígeno o células de una línea celular que expresa un antígeno por células inmunes manipuladas que expresan uno cualquiera de los CAR específicos de antígeno descritos aquí es al menos alrededor de o mayor que 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %. En un ejemplo, una reducción porcentual o lisis de células endógenas que expresan antígeno o células de una línea celular que expresa un antígeno por células inmunes manipuladas que expresan CAR específicos de antígeno es alrededor de 5 % a alrededor de 95 %, alrededor de 10 % a alrededor de 95 %, alrededor de 10 % a alrededor de 90 %, alrededor de 10 % a alrededor de 80 %, alrededor de 10 % a alrededor de 70 %, alrededor de 10 % a alrededor de 60 %, alrededor de 10 % a alrededor de 50 %, alrededor de 10 % a alrededor de 40 %, alrededor de 20 % a alrededor de 90 %, alrededor de 20 % a alrededor de 80 %, alrededor de 20 % a alrededor de 70 %, alrededor de 20 % a alrededor de 60 %, alrededor de 20 % a alrededor de 50 %, alrededor de 25 % a alrededor de 75 %, o alrededor de 25 % a alrededor de 60 %. En un ejemplo, las células endógenas que expresan antígeno son células endógenas de médula ósea que expresan antígeno.
Se pueden usar diversos agentes terapéuticos adicionales junto con las composiciones descritas aquí. Por ejemplo, los agentes terapéuticos adicionales potencialmente útiles incluyen inhibidores de PD-1 tales como nivolumab (Opdivo®), pembrolizumab (Keytruda®), pembrolizumab, pidilizumab y atezolizumab; estos compuestos se pueden administrar antes, simultáneamente con o después de la administración de una población de células inmunes manipuladas desprovistas de TCR preparadas usando los métodos proporcionados aquí.
En algunos ejemplos, una composición que comprende una población de células inmunes que expresan CAR desprovistas de TCR preparadas usando los métodos proporcionados aquí se puede administrar antes, simultáneamente con o después de un régimen terapéutico diseñado para prevenir o tratar el síndrome de liberación de citocinas (CRS) o neurotoxicidad, tal como un anticuerpo anti-IL6.
En ciertos ejemplos, las composiciones de una población de células inmunes que contienen CAR desprovistas de TCR preparadas usando los métodos proporcionados aquí se pueden administrar a un sujeto junto con una citocina. Ejemplos de citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citocinas las hormonas del crecimiento tales como hormona del crecimiento humana; hormona del crecimiento humana N-metionilada y hormona del crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteínicas tales como hormona foliculoestimulante (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático (HGF); factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactógeno placentario; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado a gonadotropina murina; inhibina; activina; factor de crecimiento del endotelio vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso (NGF) tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factores de crecimiento I y II similares a la insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimuladores de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta y otros factores polipeptídicos, incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o procedentes de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural.
Kits y artículos de fabricación
Como referencia, la presente descripción proporciona kits que comprenden reactivos de agotamiento de TCR que comprenden uno o más de un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD52. Los kits se pueden emplear en los métodos de agotamiento que se proporcionan aquí.
En un ejemplo, un kit proporcionado aquí comprende un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3. En el kit, uno o ambos anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 se pueden conjugar opcionalmente con biotina. En un ejemplo específico, tanto el anticuerpo anti-TCR como el anticuerpo anti-CD3 están conjugados con biotina.
En un ejemplo, un kit proporcionado aquí comprende un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD52. En el kit, uno o todos los anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 y/o anti-CD52 se pueden conjugar opcionalmente con biotina. En un ejemplo específico, el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD52 están todos conjugados con biotina.
En otro aspecto, un kit proporcionado aquí puede comprender además un anticuerpo anti-biotina que está conjugado con microperlas de nanomatriz magnéticas, perlas del tamaño de una célula, u otro soporte, tal como una membrana, partícula de onda acústica o perla, placa de plástico o columna. El anticuerpo anti-biotina puede proporcionarse en forma conjugada, u opcionalmente como un anticuerpo desnudo junto con materiales útiles para unir el anticuerpo a microperlas de nanomatriz magnéticas, perlas del tamaño de una célula, u otro soporte.
En un ejemplo específico, un kit proporcionado aquí comprende un anticuerpo anti TCR y un anticuerpo anti-CD3. En el kit, uno o ambos anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 se pueden conjugar opcionalmente directamente con una perla magnética, una membrana, una partícula de onda acústica, una placa de plástico o una columna.
En un ejemplo específico, un kit proporcionado aquí comprende un anticuerpo anti-TCR, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD52. En el kit, uno o ambos anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 y/o anti-CD52 se pueden conjugar opcionalmente directamente con una perla magnética, una membrana, una partícula de onda acústica, una placa de plástico o una columna.
Se observa que, si bien el uso de anticuerpos anti-biotina constituye una realización de los métodos descritos aquí, se pueden emplear otros medios para capturar restos marcados con biotina. Por ejemplo, en los métodos descritos se pueden usar estreptavidina, avidina y otros restos de unión a biotina en lugar de anticuerpos anti-biotina.
La presente descripción también proporciona artículos de fabricación que comprenden cualquiera de las composiciones terapéuticas y kits descritos aquí. Los ejemplos de un artículo de fabricación incluyen recipientes (por ejemplo, viales sellados) que contienen un agente terapéutico (por ejemplo, una población de células desprovistas de TCR, que pueden comprender además un CAR, preparadas usando los métodos descritos aquí).
EJEMPLOS
Como se muestra en los siguientes ejemplos, el enfoque de anticuerpos combinados descrito condujo a una mejora significativa en la eficiencia de agotamiento de células TCR+, que inesperadamente redujo el nivel de TCR+% residual de 0,1-1 % a 0,1-0,01 % en comparación con el anticuerpo TCR solo (medido el día 1 posterior al agotamiento). Estos ejemplos demuestran las ventajas significativas que ofrecen los métodos de agotamiento descritos sobre los enfoques actuales para agotar células TCR+. Estas ventajas pueden proporcionar un beneficio a los pacientes que reciben terapia alogénica en forma de una menor probabilidad de que el paciente presente GvHD.
Ejemplo 1. La combinación de anticuerpos anti-TCR y CD3 aumenta la eficiencia de agotamiento de células TCR+
Usando células inmunes manipuladas con CAR, se eliminó la expresión de los genes TCR y CD52 endógenos mediante electroporación de TALENs® dirigida a los genes TRAC y CD52. Las células sin TCR y CD52 se expusieron entonces a reactivos de agotamiento de TCR. Las células se pusieron en contacto con un anticuerpo anti-TCR primario conjugado con biotina, solo o en combinación con un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD52 como se muestra en la Tabla 1.
A continuación, se añadió además un anticuerpo anti-biotina secundario conjugado con microesferas magnéticas (nanopartículas de alrededor de 50 nm de diámetro) a las células marcadas con el anticuerpo primario, para unir las microesferas magnéticas a cualesquiera células TCR+ residuales a través del resto de bioína anti-TCR primario. Las células marcadas se aplicaron entonces a una columna magnética, usando un instrumento CliniMACS Prodigy®. Las células TCR+ quedaron retenidas dentro de la columna magnética, mientras que las células TCR- no marcadas pasaron a la bolsa de recolección de producto. Posteriormente, las células TCR+ se liberaron de la columna a una bolsa de desechos. Se exploró la eficiencia de agotamiento de células TCR+ usando los diversos métodos de agotamiento proporcionados en la presente descripción, y las células TCR+ residuales presentes en la fracción de población de células TCR- se monitorizaron varios días posteriores al agotamiento usando anticuerpos anti-TCRa, TCRp y/o CD3. La Figura 1 proporciona una representación esquemática de los procedimientos de fabricación de CART alogénicas con diferentes escenarios de operación unitaria.
Tabla 1. Diseño experimental de condiciones de anticuerpos
Tabla 2. Información del anticuerpo
Como se muestra en la Figura 2A, el porcentaje de células TCR+ presentes en la población de productos TCR-agotados usando diversos métodos de agotamiento diferentes es sustancialmente menor que 1 % o menos. La Figura 2A muestra una disminución inesperada de 204 veces en la frecuencia de células TCR+ cuando se usaron anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 juntos en el método de agotamiento, como se detectó el día 2 posterior al agotamiento en comparación con el método de agotamiento de control que utilizó una concentración baja de anticuerpo TCR 1x; también se observó una disminución equivalente cuando las células se trataron con anticuerpos anti-TCR, anti-CD3 y anti-CD52. La Figura 2A también muestra que el uso de anticuerpos anti-TCR y anti-CD52, así como una concentración 3x de anticuerpo anti-TCR, fue menos eficaz que la combinación de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3, mostrando el tratamiento con anticuerpos TCR 3x una disminución de 6,2 veces, y la combinación de anticuerpos anti-TCR y anti-CD52 una disminución de 2,7 veces. Curiosamente, la Figura 2A demuestra que el agotamiento usando anticuerpos anti-CD52 y anti-TCR fue más eficiente que usando anticuerpo anti-TCR solo. Este resultado fue sorprendente debido al hecho de que, como se señala aquí, el CD52 no tiene asociación biológica con el TCR o el complejo TCR, y por lo tanto fue inesperado que los métodos de agotamiento que emplean estos dos anticuerpos juntos fueran más eficientes para agotar células TCR+ que solo los anticuerpos anti-TCR solos. Los resultados que se muestran en la Figura 2A también demuestran que, inesperadamente, simplemente aumentar la concentración de anticuerpo anti-TCR no produce resultados marcadamente mejores que usar concentraciones más bajas de anticuerpo anti-TCR combinado con anticuerpo anti-CD3.
Las poblaciones agotadas también se estudiaron el día 9 posterior al agotamiento, y los resultados se muestran en la Figura 2B. La Figura 2B muestra una disminución de 8 veces en la frecuencia de células TCR+ cuando se usaron anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 en el método de agotamiento; también se observó una disminución equivalente cuando las células fueron tratadas con anticuerpos anti-TCR, anti-CD3 y anti-CD52. La Figura 2B también muestra que el uso de anticuerpos anti-TCR y anti-CD52, así como una concentración 3x de anticuerpo anti-TCR, fue menos eficaz que la combinación de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3, mostrando el tratamiento con anticuerpos TCR 3x una disminución de 5 veces, y la combinación anti-TCR y anti-CD52 una disminución de 2 veces. Estos resultados demuestran que simplemente aumentar la concentración de anticuerpos anti-TCR no produce resultados marcadamente mejores que utilizar concentraciones más bajas de anticuerpos anti-TCR combinados con anticuerpos anti-CD3.
Los gráficos FACS de la Figura 3A visualizaron una presencia mínima de células TCR+ cuando el método de agotamiento se realizó usando anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 en comparación con el anticuerpo anti-TCR solo o en combinación con anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD52, o una concentración aumentada (3x) de anticuerpo anti-TCR. Los datos se adquirieron el día 0 y el día 1 posterior al agotamiento, y se compararon con las muestras de células previas al agotamiento. Los resultados demuestran además que simplemente aumentar la concentración de anticuerpos anti-TCR no produce resultados marcadamente mejores que utilizar concentraciones más bajas de anticuerpos anti-TCR combinados con anticuerpos anti-CD3 durante los días estudiados.
El gráfico de barras numérico de la Figura 3B muestra una disminución de 151 y 23-32 veces en la frecuencia de células TCR+ cuando se usaron anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 en el método de agotamiento el día 0 y el día 1 posterior al agotamiento en comparación con el método de agotamiento de control que usan una concentración baja de anticuerpos anti-TCR 1x; también se observó una disminución equivalente de 70 veces cuando las células se trataron con anticuerpos TCR, anti-CD3 y anti-CD52. Se observa que las operaciones actuales de agotamiento de TCR emplean solo una concentración de anticuerpo TCR estándar 1x, lo que es un punto de diferenciación entre los métodos descritos y lo que se entiende como el estado actual de la técnica. La Figura 3B también muestra que el uso de anticuerpos anti-TCR y anti-CD52, así como una concentración 3x de anticuerpo anti-TCR, fue menos eficaz que la combinación de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3, mostrando el tratamiento con anticuerpos TCR 3x una disminución de 19 y 7 veces, y la combinación de anti-TCR y anti-CD52 una disminución de 2,7 y 1,6 veces. Estos resultados demuestran además que simplemente aumentar la concentración de anticuerpos anti-TCR no produce resultados marcadamente mejores que utilizar concentraciones más bajas de anticuerpos anti-TCR combinados con anticuerpos anti-CD3 durante los días estudiados.
La Figura 4 es un gráfico de FACS de los datos recopilados el día 0 y el día 1 posterior al agotamiento, y demuestra además que la combinación de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 proporciona un mayor nivel de agotamiento de TCR que el uso del anticuerpo anti-TCR solo en concentración alta (3X) o baja (1X), y que el uso del anticuerpo anti-TCR en combinación con el anticuerpo anti-CD52. Las células TCR+ residuales después del agotamiento se visualizaron mediante tinción anti-TCR, anti-CD3 simple o anti-TCR/CD3 doble, y se espera que se tiñan positivamente para TCR+, CD3+ o CD3+/TCR+. La pequeña población de células teñidas como CD3+/TCR- refleja las células T TCR<yó>restantes presentes en la población de células TCR- agotadas, ya que se espera que las células T TCR<yó>se eliminen a través del anticuerpo anti-CD3.
Ejemplo 2. Cultivo posterior al agotamiento
Este ejemplo demuestra que las poblaciones de células inmunes agotadas conservaron los mismos niveles bajos de TCR+ residuales durante el cultivo posterior al agotamiento. El día 1 posterior al agotamiento, las células agotadas se congelaron y después se descongelaron para el cultivo posterior al agotamiento. Se detectaron los niveles de expresión de TCR y CD3 antes de la congelación e inmediatamente después de la descongelación. Como se muestra en las Figuras 5A-5E, no hubo diferencia significativa en la frecuencia de TCR y CD3 debido al ciclo de congelación-descongelación; la Figura 5A representa la frecuencia de células TCR+, CD3+, CD3+/TCR- y CD3+/TCR+ antes de la congelación y después de la descongelación mediante un gráfico de FACS usando tinción simple anti-TCR, anti-CD3, o tinción doble anti-TCR/CD3; la Figura 5B representa la frecuencia de células TCR+ antes de la congelación y después de la descongelación usando anticuerpo anti-TCR de forma numérica; la Figura 5C representa la frecuencia de células CD3+ antes de la congelación y después de la descongelación usando anticuerpos anti-CD3 de forma numérica; la Figura 5D representa la frecuencia de células CD3+/TCR- antes de la congelación y después de la descongelación usando anticuerpos anti-TCR/CD3 de forma numérica; y la Figura 5E representa la frecuencia de células CD3+/TCR+ antes de la congelación y después de la descongelación usando anticuerpos anti-TCR/CD3 de forma numérica.
Para determinar si la frecuencia de células TCR+ residuales en las poblaciones de células TCR- agotadas aumentaría con el tiempo de cultivo, las células agotadas se cultivaron durante 10 días posteriores al agotamiento. Las frecuencias de células TCR y CD3 se detectaron mediante tinción simple de anticuerpos anti-TCR (Figura 6) y anti-CD3 (Figura 7), o tinción doble de anticuerpos anti-TCR/CD3 (Figura 8), cada 2-3 días durante todo el proceso de cultivo. Específicamente, los gráficos de FACS de las Figuras 6, 7 y 8, a pesar de una tendencia de aumento gradual en la frecuencia de células TCR+, CD3+ o CD3+/TCR+ seguido de la consecución de un pico alrededor de 5-7 días durante el cultivo posterior al agotamiento para todos los métodos de agotamiento, los cultivos agotados usando una combinación de anticuerpos anti-TCR, anti-CD3 y/o anti-CD52 mantuvieron la misma menor frecuencia de células TCR+ o CD3+ a lo largo del tiempo que los cultivos tratados con anticuerpo anti-TCR solo en concentración baja o alta, o anticuerpo anti-TCR en combinación con anticuerpo anti-CD52.
Continuando, los gráficos de barras de las Figuras 9A, 9B, 9C y 9D representan la frecuencia de TCR+, CD3+, CD3+/TCR- o CD3+/TCR+ durante el cultivo posterior al agotamiento de manera numérica.
Además, el estado de crecimiento celular, incluyendo la densidad de células viables (Figura 10A), la viabilidad (Figura 10B), el diámetro celular (Figura 10C) en cada pasada, y el número de veces de la expansión total (Figura 10D), también se monitorizaron durante el período de cultivo posterior al agotamiento. En general, se observaron características de crecimiento celular comparables para todos los métodos de agotamiento estudiados.
También se estudió la eficiencia de agotamiento de CD52 usando diferentes combinaciones de anticuerpos descritos aquí. Específicamente, para el agotamiento de CD52 se usaron anticuerpos anti-CD52 solos o en combinación con otros anticuerpos, y también se estudió el impacto de los anticuerpos anti-TCR y/o anti-CD3 usados para el agotamiento de células TCR+ en la eliminación de células CD52+. Los gráficos de FACS de la Figura 11A muestran la frecuencia de células CD52+ residuales posterior al agotamiento el día 0 y el día 1 posterior al agotamiento. El gráfico de barras de la Figura 11B muestra la frecuencia de células CD52+ residuales de forma numérica. Finalmente, los gráficos de FACS de la Figura 12 muestran la frecuencia de células CD52+ residuales durante el cultivo de 10 días posterior al agotamiento.
En resumen, los datos del Ejemplo 2 demostraron que el uso de anticuerpos anti-TCR y anti-CD3 mejoró la eficiencia de agotamiento de células TCR+. El uso de un anticuerpo anti-CD3 además de un anticuerpo anti-TCR eliminó las células CD3+/TCR+ más ampliamente que si se usa un anticuerpo anti-TCR solo. Este mecanismo de agotamiento proporciona una eficiencia mejorada de agotamiento de células TCR+, y puede ser una ventaja significativa para aplicaciones alogénicas terapéuticas. Las células posteriores al agotamiento mostraron un crecimiento similar para todas las condiciones durante el cultivo posterior al agotamiento, lo que indica que los métodos de agotamiento no afectaron la viabilidad y el crecimiento celulares.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una población de células inmunes desprovista de células inmunes que expresan un TCR endógeno, en el que las células inmunes se modifican genéticamente para que sean deficientes en el gen TCRa o TCRp endógeno con el fin de reducir o eliminar la expresión del TCR endógeno, comprendiendo el método:
(a) marcar una población de células inmunes con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3; y
(b) separar las células inmunes marcadas con anticuerpos anti-TCR y las células inmunes marcadas con anticuerpos anti-CD3 de la población de células inmunes.
2. Un método para agotar células que expresan un TCR endógeno de una población de células inmunes, en el que las células inmunes se modifican genéticamente para que sean deficientes en el gen TCRa o TCRp endógeno con el fin de reducir o eliminar la expresión del TCR endógeno, comprendiendo el método:
(a) marcar la población de células inmunes con un anticuerpo anti-TCR y un anticuerpo anti-CD3;
(b) separar las células inmunes marcadas con anticuerpos anti-TCR y las células inmunes marcadas con anticuerpos anti-CD3 de las células inmunes no marcadas; y
(c) recolectar las células inmunes no marcadas,
obteniendo así una población de células inmunes que están desprovistas de células que expresan el TCR endógeno.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende además:
marcar la población de células inmunes con un anticuerpo anti-CD52; y agotar o separar las células inmunes marcadas con un anticuerpo anti-CD52 de la población de células inmunes.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y/o el anticuerpo anti-CD52 está conjugado con biotina.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el método comprende además poner en contacto las células marcadas con un agente que reconoce específicamente la biotina.
6. El método de la reivindicación 5, en el que el agente que reconoce específicamente la biotina se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-biotina, avidina y estreptavidina.
7. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que el agente está conjugado con una perla magnética, una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de pocillos de plástico, una placa de pocillos de vidrio, una placa de pocillos de cerámica, una columna, una bolsa de cultivo celular, o una membrana.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo anti-TCR, el anticuerpo anti-CD3 y/o el anticuerpo anti-CD52 se conjuga directamente con un soporte; opcionalmente en el que el soporte es una perla magnética, una perla de agarosa, una partícula de onda acústica, una placa de pocillos de plástico, una placa de pocillos de vidrio, una placa de pocillos de cerámica, una columna, una bolsa de cultivo celular, o una membrana.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la separación se logra usando una separación magnética o una separación por ondas acústicas.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células inmunes son células inmunes alogénicas.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células inmunes se modifican genéticamente para reducir o eliminar la expresión de CD52 endógeno.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células inmunes son células inmunes manipuladas que expresan un receptor de antígeno quimérico.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células inmunes son células T.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la reducción o eliminación de TCR endógeno, o tanto de TCR endógeno como de CD52 endógeno, se logra usando una TALEN, CRISPR/Cas9, una nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una MegaTAL, una meganucleasa, Cpf1, recombinación homóloga, o un oligodesoxirribonucleótido monocatenario (ssODN).
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la población de células que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende:
(i) no más de 1,0 % de células TCR+, no más de 0,9 % de células TCR+, no más de 0,8 % de células TCR+, no más de 0,7 % de células TCR+, no más de 0,6 % de células TCR+, no más de 0,5 % de células TCR+, no más de 0,4 % de células TCR+, no más de 0,3 % de células TCR+, no más de 0,2 % de células TCR+, o no más de 0,1 % de células TCR+; o
(ii) entre 0,01-0,001 % de células TCR+ inmediatamente después del agotamiento; o
(iii) entre 0,1-0,01 % de células TCR+ después de 1-10 días de cultivo posteriores al agotamiento; opcionalmente en el que la población de células que está desprovista de células que expresan un TCR endógeno comprende menos de 0,1-1,0 % de células TCR+ después de 1 o 10 días de cultivo posterior al agotamiento.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la población de células que está desprovista de células que expresan el TCR endógeno se criopreserva o se formula en una composición para infusión o administración intravenosa, y en el que la población de células desprovista de TCR expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR).
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022132720A1 (en) * 2020-12-14 2022-06-23 Allogene Therapeutics, Inc. Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
EP4353253A1 (en) * 2022-10-10 2024-04-17 Charité - Universitätsmedizin Berlin Purification of tcr-modified t cells using tcr-specific car-nk cells

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
EP1769078A1 (en) * 2004-07-01 2007-04-04 VIRxSYS Corporation Vector packaging cell line
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
GB201206559D0 (en) 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
KR102437522B1 (ko) 2012-05-25 2022-08-26 셀렉티스 면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 ｔ 세포의 조작 방법
GB2508414A (en) * 2012-11-30 2014-06-04 Max Delbrueck Centrum Tumour specific T cell receptors (TCRs)
JP2017505819A (ja) 2014-02-04 2017-02-23 カイト ファーマ インコーポレイテッドＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ Ｂ細胞悪性腫瘍及び他のがんの治療に有用な自己ｔ細胞を産生する方法、並びにその組成物
WO2016069282A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering gene expression in modified t cells and uses thereof
ES2869972T3 (es) 2015-01-26 2021-10-26 Cellectis Sistemas de receptores de antígenos quiméricos dirigidos por mAb para clasificar/agotar células inmunitarias genomanipuladas
AU2016297014B2 (en) * 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
CN107828730B (zh) * 2017-11-07 2019-04-30 南京北恒生物科技有限公司 具有抗体药物抗性的通用型cart/tcrt细胞及其构建方法

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