ES3035263T3 - Methylated control dna - Google Patents

Abstract

Se proporciona tecnología relacionada con composiciones y métodos para el análisis de ADN metilado de un sujeto. Esta tecnología también se relaciona con el uso de ADN metilado endógeno como controles internos para ensayos de metilación de genes marcadores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

ADN de control metilado

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

[0001]La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional US-62/364.082, presentada el 19 de julio de 2016.

Campo de la invención

[0002]En la presente memoria se proporciona tecnología relacionada con composiciones y métodos para analizar y cuantificar el ADN, p.ej.,ADN metilado, en un sujeto. La tecnología se refiere al uso de un marcador de referencia metilado como control interno en ensayos de metilación en muestras tales como muestras de sangre, plasma, heces o tejido de un sujeto.

Antecedentes

[0003]El ADN metilado se ha estudiado como una posible clase de biomarcadores en los tejidos de la mayoría de los tipos de tumores. En muchos casos, las ADN metiltransferasas agregan un grupo metilo al ADN en los sitios de islas de citosina-fosfato-guanina (CpG) como control epigenético de la expresión génica. En un mecanismo biológicamente atractivo, se cree que los eventos de metilación adquiridos en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores silencian la expresión, contribuyendo así a la oncogénesis. La metilación del ADN puede ser una herramienta de diagnóstico química y biológicamente más estable que el ARN o la expresión de proteínas (Laird (2010) “ Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis” Nat Rev Genet 11: 191-203). Además, en otros cánceres como el cáncer de colon esporádico, los marcadores de metilación ofrecen una excelente especificidad y son más informativos y sensibles que las mutaciones de ADN individuales (Zou y col. (2007) “ Highly methylated genes in colorectal neoplasia: implications for screening” Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: 2686 96).

[0004]Los ácidos nucleicos de muestras de pacientes, p.ej.,muestras de sangre, heces y tejido, que se analizan para detectar la presencia de mutaciones y/o el estado de metilación asociado con la enfermedad o el riesgo de enfermedad, generalmente pasan por una serie de pasos del proceso durante el análisis. Estos pasos pueden comprender, p.ej.,filtración, precipitación, captura, lavado, elución y/o modificación química. Para el análisis de ADN para determinar el estado de metilación,p. ej.,el porcentaje de metilación de un ADN de prueba, el procesamiento generalmente comprende el tratamiento con bisulfito para convertir las bases de dC no metiladas en residuos de dU, haciéndolos más fácilmente distinguibles de los residuos de metil-C que están protegidos de la conversión de bisulfito.

[0005]La cuantificación precisa de un ADN de prueba(p. ej.,determinar el porcentaje de metilación, la presencia y la cantidad de ADN que porta una mutación,etc.)normalmente requiere la normalización con un ácido nucleico de control,p. ej.,un gen invariante endógeno que tenga características conocidas(p. ej.,secuencia conocida, número de copias conocido por célula). La normalización de los controles para las variaciones de muestra a muestra que pueden ocurrir, por ejemplo, en el procesamiento de muestras, la eficiencia del ensayo,etc.,y permite una comparación precisa de los datos de muestra a muestra. Los antecedentes tecnológicos de la presente invención, como se definen en las reivindicaciones, se pueden encontrar en las patentes US-2014/228231 A1, WO 2014/036314 A2, US-2016/168643A1 y US-2016/194721AI, en donde las patentes US-2016/168643A1 y U-2016/194721A1, en particular, se refieren a ZDHHC1 como marcador de referencia metilado y control interno.

Resumen

[0006]La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no se encuentran dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. En la presente memoria se proporciona tecnología relacionada con la caracterización de muestras, p. ej., muestras de sangre, muestras de heces, etc., para detectar la presencia o ausencia de, y/o las cantidades de diferentes especies de ácidos nucleicos que, p. ej., pueden estar asociadas con el estado de salud de un sujeto. La tecnología se refiere al ADN de control metilado que puede procesarse y detectarse junto con el ADN marcador metilado indicativo de una enfermedad. La tecnología proporciona una composición que comprende un ácido nucleico B3GALT6. Una composición puede comprender un complejo de un ácido nucleico de B3GALT6 convertido con bisulfito y al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción de dicho oligonucleótido se hibrida con dicho ácido nucleico de B3GALT6. La presente invención proporciona el uso de dicha composición tal como se define en la presente reivindicación 1. El ácido nucleico de B3GALT6 puede ser una cadena de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 2 o el complemento de la misma. El oligonucleótido no se limita a ningún tipo particular de oligonucleótido y puede comprender,p. ej.,ADN, ARN y/o PNA (ácido nucleico peptídico). El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido cebador.

[0007]La composición puede comprender además un oligonucleótido de sonda de detección, comprendiendo el oligonucleótido de sonda de detección una región que es complementaria a una porción de una cadena de ADN de B3GALT6. El oligonucleótido de la sonda de detección puede comprender una región que es complementaria a una porción de la Id. de sec. n.°: 2 o al complemento de la misma.

[0008]La sonda de detección no se limita a ninguna configuración en particular y,p. ej.,puede ser una sonda de detección para utilizarse en la PCR, la LCR, los ensayos de escisión invasiva, los ensayos de solapa QuARTS y/o cualquier ensayo de detección de ácidos nucleicos conocido por los expertos en la técnica, cuyos ejemplos se describen a continuación en la presente memoria. Un oligonucleótido de sonda de detección puede comprender una molécula indicadora,p. ej.,un resto reactivo o un fluoróforo. El oligonucleótido de la sonda de detección puede comprender una secuencia de solapa.

[0009]La composición que comprende el ácido nucleico B3GALT6 y el oligonucleótido puede comprender otros componentes. Por ejemplo, la composición comprende además un casete FRET, una endonucleasa FEN-1 y/o una ADN polimerasa termoestable. Las composiciones descritas anteriormente pueden estar presentes juntas en una mezcla de reacción, p.ej.,para un ensayo de detección de ácido nucleico. La mezcla de reacción puede comprender además uno o más de un cebador, oligonucleótido de solapa, una ADN polimerasa termoestable, una endonucleasa FEN-1 y/o un casete FRET.

[0010]La tecnología puede proporcionar un kit que no forma parte de la invención, que comprende ácido nucleico relacionado con B3GALT6. Por ejemplo, la tecnología puede proporcionar un kit que comprende a) al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción del oligonucleótido se hibrida específicamente con ADN de B3GALT6 convertido con bisulfito; y b) reactivo de bisulfito. El al menos un oligonucleótido puede comprender una región que es complementaria a una porción de la Id. de sec. n.°: 2 o un complemento de la misma. A modo de ejemplo y no de forma limitativa, el oligonucleótido puede seleccionarse entre uno o más de un oligonucleótido de captura, un par de cebadores de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico y un oligonucleótido invasivo. El kit puede comprender además un ADN metilado sintético que esencialmente no tiene homología con el ADN de mamíferos para utilizarse,p. ej.,como un control de ejecución. El ADN metilado sintético es un ADN de pez cebra,p. ej.,una porción sintética del genrassfldel pez cebra.

[0011]La tecnología proporciona además métodos para caracterizar muestras. El método puede comprender a) tratar el ADN de una muestra con un reactivo de bisulfito para producir ADN convertido con bisulfito, y b) amplificar una región del ADN convertido con bisulfito utilizando un par de cebadores de ácido nucleico, en donde la amplificación produce un producto amplificado que tiene una secuencia que comprende una región de la Id. de sec. n.°: 2. El producto amplificado puede tener una secuencia que comprende la totalidad de la Id. de sec. n.°: 2.

[0012]El método puede comprender además un paso de detección del producto amplificado con una sonda de detección. Como se ha descrito anteriormente, la sonda de detección no se limita a ninguna forma o función particular de la sonda de detección. La sonda de detección puede comprender una molécula indicadora. La sonda de detección puede comprender una secuencia de solapa.

Breve descripción de los dibujos

[0013]Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente tecnología se entenderán mejor haciendo referencia a los siguientes dibujos:

la figura 1 muestra un diagrama esquemático de un B3GALT6 (hg19_dnarange=chr1: 1163595-1163733 strand=+), región diana del marcador en forma no convertida y en forma tratada con bisulfito. Se muestran los cebadores y las sondas del ensayo de solapa para la detección de ADN de B3GALT6 convertido con bisulfito.

La figura 2 muestra un diagrama esquemático de una región diana de p-actina en forma no convertida y en forma tratada con bisulfito. Se muestran los cebadores y sondas del ensayo de solapa para la detección del ADN de pactina convertido con bisulfito.

La figura 3 proporciona una gráfica que compara la detección de ADN de B3GALT6 convertido con bisulfito con ADN de p-actina convertido con bisulfito en ADN extraído de 32 muestras de tejido pulmonar, como se describe en el ejemplo 3.

La figura 4 proporciona una gráfica que compara la detección de ADN de B3GALT6 convertido con bisulfito con ADN de p-actina convertido con bisulfito en ADN extraído de 118 muestras de plasma, como se describe en el ejemplo 4. La figura 5 proporciona una gráfica que compara la detección de ADN de B3GALT6 convertido con bisulfito con ADN de p-actina convertido con bisulfito en ADN extraído de 297 muestras de plasma, como se describe en el ejemplo 5.

Las figuras 6A y 6B proporcionan gráficas que comparan el porcentaje de mutilación de los genes marcadores CYP26C1 y NFIX, respectivamente, en ADN extraído de 297 muestras de plasma, calculado utilizando B3GALT6 convertido con bisulfito o p-actina convertido con bisulfito como gen de referencia, como se describe en el ejemplo 6.

Definiciones

[0014]Para facilitar la comprensión de la presente tecnología, a continuación se definen una serie de términos y expresiones. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

[0015]Como se utiliza en la presente memoria, “ un” o “ una” o “el” pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, “ un” complemento puede significar un complemento o una pluralidad de complementos.

[0016]La frase transitoria “ que consiste esencialmente en” , como se utiliza en la presente memoria, limita el alcance a los materiales o pasos especificados “y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)” de la invención reivindicada, como se describe en In re Hertz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976). Por ejemplo, una composición “que consiste esencialmente en” los elementos citados puede contener un contaminante no mencionado a un nivel tal que, aunque presente, el contaminante no altera la función de la composición mencionada en comparación con una composición pura,es decir,una composición que “ consiste en” los componentes citados.

[0017]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ analito” debe interpretarse ampliamente como cualquier compuesto, molécula, elemento, ion u otra sustancia de interés para ser detectado, identificado o caracterizado.

[0018]Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ sujeto” y “ paciente” se refieren a cualquier animal, tal como un perro, gato, ave, ganado y, en particular, un mamífero, preferiblemente un ser humano. En algunos casos, el sujeto también es un “ usuario” (y, por lo tanto, el usuario también es el sujeto o el paciente).

[0019]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ muestra” y “ espécimen” se utilizan indistintamente y en los sentidos más amplios. En un sentido, se entiende que muestra incluye un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas se pueden obtener de animales (que incluyen humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, tales como plasma, suero, heces, orina y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia superficial, suelo, lodo, lodos, biopelículas, agua, cristales y muestras industriales. Sin embargo, tales ejemplos no deben interpretarse como limitativos de los tipos de muestra aplicables a la presente invención.

[0020]Como se utiliza en la presente memoria, una “ muestra remota” , como se utiliza en algunos contextos, se refiere a una muestra recolectada indirectamente de un sitio que no es la fuente de células, tejidos u órganos de la muestra. Por ejemplo, cuando el material de la muestra que se origina en el páncreas se evalúa en una muestra de heces(p. ej.,no de una muestra tomada directamente del páncreas), la muestra es una muestra remota.

[0021]El término “ diana” , cuando se utiliza en referencia a un método de captura, detección o análisis de ácido nucleico, generalmente se refiere a un ácido nucleico que tiene una característica,p. ej.,una secuencia particular de nucleótidos a detectar o analizar,p. ej.,en una muestra que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana. Una diana puede ser un ácido nucleico que tiene una secuencia particular para la que es deseable determinar un estado de metilación. Cuando se utiliza en referencia a la reacción en cadena de la polimerasa, “ diana” generalmente se refiere a la región de ácido nucleico limitada por los cebadores utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa. Por lo tanto, se busca que la “ diana” se ordene a partir de otras secuencias de ácido nucleico que pueden estar presentes en una muestra. Un “ segmento” se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia diana. La expresión “ cadena molde de muestra” se refiere a un ácido nucleico que procede de una muestra que se analiza en busca de la presencia de una diana.

[0022]El término “ marcador” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una sustancia(p. ej.,un ácido nucleico o una región de un ácido nucleico, o una proteína) que puede utilizarse para distinguir células no normales(p. ej.,células cancerosas) de células normales,p. ej.,en base a la presencia, ausencia o estado(p. ej.,estado de metilación) de la sustancia marcadora.

[0023]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ADN de pescado” es distinto del ADN de pez cebra y se refiere al ADN no diana exógeno aislado de pescado. El término “ exógeno” como se utiliza en referencia al ADN no diana se refiere a ADN no diana que se aísla y purifica de una fuente distinta de la fuente o muestra que contiene el ADN diana. Dicho ADN exógeno se selecciona para que no sea detectado por un ensayo configurado para detectar y/o cuantificar el ácido nucleico diana en la reacción a la que se añade el ADN exógeno. Por ejemplo, el ADN de pescado purificado es ADN exógeno con respecto a una muestra que comprende ADN diana humano,p. ej.,como se describe en la patente US-9.212.392. El ADN de pescado purificado a granel está disponible comercialmente,p. ej.,se proporciona en forma de ADN de esperma de bacalao y/o arenque (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) o ADN de salmón (USB/Affymetrix).

[0024]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ADN de pez cebra” es distinto del ADN de pescado y se refiere al ADN aislado deDanio rerioo creadoin vitro (p. ej.,enzimáticamente; sintéticamente) para tener una secuencia de nucleótidos que se encuentra en el ADN deDanio rerio.El ADN de pez cebra puede ser un ADN metilado añadido como ADN de control detectable,p. ej.,un control de proceso para verificar la recuperación de ADN a través de los pasos de procesamiento de la muestra.

[0025]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ locus” se refiere a una posición particular,p. ej.,de una mutación, polimorfismo o un residuo C en un dinucleótido CpG, dentro de una región o segmento definido de ácido nucleico, tal como un gen o cualquier otra secuencia caracterizada en un cromosoma o molécula de ARN. Un locus no se limita a ningún tamaño o longitud particular y puede referirse a una porción de un cromosoma, un gen, un elemento genético funcional o un único nucleótido o un par de bases. Como se utiliza en la presente memoria en referencia a sitios CpG que pueden metilarse, un locus se refiere al residuo C en el dinucleótido CpG.

[0026]El término “ amplificar” o “ amplificación” en el contexto de ácidos nucleicos se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o una porción del polinucleótido, que típicamente comienza a partir de una pequeña cantidad del polinucleótido(p. ej.,una única molécula polinucleotídica), donde los productos de amplificación o amplicones son generalmente detectables. La amplificación de polinucleótidos abarca diversos procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula o cadena molde de ADN diana durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR); véase,p. ej.,la patente US-5.494.810) son formas de amplificación. Los tipos adicionales de amplificación incluyen, pero sin limitarse a, PCR específica de alelo (véase,p. ej.,la patente US-5.639.611), PCR de ensamblaje (véase,p. ej.,la patente US-5.965.408), amplificación dependiente de helicasa (véase,p. ej.,la patente US-7.662.594), PCR de inicio en caliente (véanse,p. ej.,las patentes US-5.773.258 y US-5.338.671), PCR específica de intersecuencia, PCR inversa (véase,p. ej.,Triglia, y col. (1988) Nucleic Acids Res., 16:8186), PCR mediada por ligación (véase,p. ej.,Guilfoyle, R. y col., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); patente US-5.508.169), PCR específica de metilación (véase,p. ej.,Herman y col., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826), PCR de minicebador, amplificación de sonda dependiente de ligadura multiplex (véase,p. ej.,Schouten y col., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57), PCR multiplex (véase,p. ej.,Chamberlain y col., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio y col., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden y col., (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR de superposición-extensión (véase,p. ej.,Higuchi y col., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367), PCR en tiempo real (véase,p. ej.,Higuchi y col., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, y col., (1993) Biotechnology 11:1026-1030), PCR de transcripción inversa (véase,p. ej.,Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193), PCR en fase sólida,P c Rentrelazada asimétrica térmica y PCR Touchdown (véase,p. ej.,Don, y col., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, y col., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485). La amplificación de polinucleótidos también se puede lograr utilizando PCR digital (véase, p.ej.,Kalinina, y col., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999); la publicación de patente internacional n.° WO/05023091A2; publicación de solicitud de patente US-20070202525).

[0027]La expresión “ reacción en cadena de la polimerasa” (“ PCR” ) se refiere al método de K.B. Mullis, patentes US-4.683.195, US-4.683.202 y US-4.965.188, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN o ARN genómico u otro, sin clonación ni purificación. Este proceso de amplificación de la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores de oligonucleótidos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus cadenas respectivas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se hibridan posteriormente con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Después de la hibridación, se extienden los cebadores con una polimerasa a fin de formar un nuevo par de hebras complementarias. Los pasos de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión de la polimerasa se pueden repetir muchas veces(es decir,la desnaturalización, la hibridación y la extensión constituyen un “ ciclo” ; puede haber numerosos “ ciclos” ) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Debido al aspecto repetitivo del proceso, el método se denomina “ reacción en cadena de la polimerasa” (“ PCR” ). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están “ amplificados por PCR” y son “ productos de PCR” o “ amplicones” . Los expertos en la técnica comprenderán el término “ PCR” abarca muchas variantes del método descrito originalmente utilizando,p. ej.,PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR de retrotranscripción (RT-PCR), cebador único y PCR cebada arbitrariamente,etc.

[0028]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ ensayo de detección de ácido nucleico” se refiere a cualquier método para determinar la composición de nucleótidos de un ácido nucleico de interés. Los ensayos de detección de ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitarse a, métodos de secuenciación de ADN, métodos de hibridación de sondas, ensayos de escisión específica de estructura(p. ej.,el ensayo INVADER, (Hologic, Inc.) y se describen, p.ej.,en las patentes US-5.846.717, US-5.985.557, US-5.994.069, US-6.001.567, US-6.090.543, y US-6.872.816; Lyamichev y col, Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall y col, PNAS, EE. UU., 97:8272 (2000), y el documento US-2009/0253142); métodos de escisión de desajustes enzimáticos(p. ej.,Variagenics, patentes US-6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrita anteriormente; métodos de hibridación ramificados(p. ej.,Chiron, patentes US-5.849.481, US-5.710.264, US-5.124.246, y US-5.624.802); replicación en círculo rodante (p. ej., patentes US-6.210.884, US-6.183.960 y US-6.235.502); NA<s>B<a>(p. ej.,patente uS-5.409.818); tecnología de baliza molecular(p. ej.,patente US-6.150.097); Tecnología E-sensor (Motorola, patentes US-6.248.229, US-6.221.583, US-6.013.170, y US-6.063.573); tecnología de sonda cíclica(p. ej.,patentes US-5.403.711, US-5.011.769, y US-5.660.988); métodos de amplificación de señales de Dade Behring(p. ej.,patentes US-6.121.001, US-6.110.677, US-5.914.230, US-5.882.867, y US-5.792.614); reacción en cadena de la ligasa(p. ej.,Barnay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); y métodos de hibridación en sándwich(p. ej.,la patente US-5.288.609).

[0029]El ácido nucleico diana puede amplificarse(p. ej.,mediante PCR) y el ácido nucleico amplificado puede detectarse simultáneamente utilizando un ensayo de escisión invasivo. Los ensayos configurados para realizar un ensayo de detección(p. ej.,ensayo de escisión invasiva) en combinación con un ensayo de amplificación se describen en la patente US-20090253142 AI (solicitud con n.° de serie US-12/404.240). Las configuraciones adicionales de amplificación más detección de escisión invasiva, denominadas método QuARTS, se describen en las patentes US-8.361.720; US-8.715.937; US-8.916.344; y US-9.127.318. El término “ estructura de escisión invasiva” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una estructura de escisión que comprende i) un ácido nucleico diana, ii) un ácido nucleico corriente arriba(p. ej.,un oligonucleótido invasivo o “ INVADER” ) y iii) un ácido nucleico corriente abajo(p. ej.,una sonda), donde los ácidos nucleicos corriente arriba y corriente abajo se hibridan con regiones contiguas del ácido nucleico diana, y donde una superposición se forma entre la porción 3' del ácido nucleico corriente arriba y el dúplex formado entre el ácido nucleico corriente abajo y el ácido nucleico diana. Se produce una superposición donde una o más bases de los ácidos nucleicos corriente arriba y corriente abajo ocupan la misma posición con respecto a una base de ácido nucleico diana, si la base o bases superpuestas del ácido nucleico corriente arriba son complementarias con el ácido nucleico diana, y si esas bases son bases naturales o bases no naturales. La porción 3' del ácido nucleico corriente arriba que se superpone con el dúplex cadena abajo puede ser un resto químico no básico tal como una estructura de anillo aromático, p.ej.,como se describe, por ejemplo, en la patente US-6.090.543. Uno o más de los ácidos nucleicos pueden unirse entre sí, p.ej.,a través de un enlace covalente tal como un tallo-bucle de ácido nucleico, o a través de un enlace químico no de ácido nucleico(p. ej.,una cadena de múltiples carbonos). Como se utiliza en la presente memoria, el término “ensayo de endonucleasa de solapa” incluye ensayos de escisión invasivos “ INVADER” y ensayos QuARTS, como se ha descrito anteriormente.

[0030]El término “ sonda” se refiere a un oligonucleótido(p. ej.,una secuencia de nucleótidos), ya sea de origen natural como en una digestión de restricción purificada o producido de forma sintética, recombinante o mediante amplificación por PCR, que es capaz de hibridarse con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares(p. ej.,una “ sonda de captura” ). Se contempla que cualquier sonda utilizada según la presente descripción puede marcarse con cualquier “ molécula indicadora” , de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, que incluye, pero sin limitarse a, sistemas enzimáticos(p. ej.,ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No hay ninguna limitación para ningún sistema de detección o etiqueta en particular. Cuando se utiliza en referencia al ensayo de solapa, el término se refiere a un oligonucleótido que interactúa con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión en presencia de un oligonucleótido invasivo. Como se utiliza en referencia a un ensayo de solapa, los términos “ sonda de solapa” y “ oligonucleótido de solapa” se utilizan indistintamente.

[0031]El término “ oligonucleótido invasivo” se refiere a un oligonucleótido que hibrida con un ácido nucleico diana en una ubicación adyacente a la región de hibridación entre una sonda y el ácido nucleico diana, en donde el extremo 3' del oligonucleótido invasivo comprende una porción(p. ej.,un resto químico, o uno o más nucleótidos) que se solapan con la región de hibridación entre la sonda y la diana. El nucleótido terminal 3' del oligonucleótido invasivo puede o no formar un par de bases con un nucleótido de la diana. El oligonucleótido invasivo puede contener secuencias en su extremo 3'que son sustancialmente las mismas que las secuencias ubicadas en el extremo 5' de una porción del oligonucleótido sonda que se hibrida con la cadena diana.

[0032]El término “ endonucleasa de solapa” o “ FEN” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una clase de enzimas nucleolíticas, típicamente nucleasas 5', que actúan como endonucleasas específicas de estructura en estructuras de ADN con un dúplex que contiene un saliente 5' monocatenario o solapa, en una de las cadenas que se desplaza por otra cadena de ácido nucleico(p. ej.,de tal modo que hay nucleótidos superpuestos en la unión entre el a Dn monocatenario y bicatenario). Los fEn catalizan la escisión hidrolítica del enlace fosfodiéster en la unión de ADN monocatenario y bicatenario, liberando el saliente o la solapa. Las endonucleasas de solapa son revisadas por Ceska y Savers (Trends Biochem. Sci. 199823:331-336) and Liu et al (Annu. Rev. Biochem. 200473: 589-615). Las FEN pueden ser enzimas individuales, enzimas multisubunidad o pueden existir como una actividad de otra enzima o complejo de proteínas(p. ej.,una ADN polimerasa).

[0033] Una endonucleasa de solapa puede ser termoestable. Por ejemplo, la endonucleasa de solapa FEN-1 a partir de organismos termófilos arqueales es termoestable típica. Como se utiliza en la presente memoria, el término “ FEN-1” se refiere a una endonucleasa de solapa no polimerasa de un organismo eucariota o arqueal. Véase,p. ej.,la patente WO 02/070755 y Kaiser M. W., y col. (1999) J. Biol. Chem., 274:21387.

[0034] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ solapa escindida” se refiere a un oligonucleótido monocatenario que es un producto de escisión de un ensayo de solapa.

[0035] El término “ casete” , cuando se utiliza en referencia a una reacción de escisión de solapa, se refiere a un oligonucleótido o combinación de oligonucleótidos configurados para generar una señal detectable en respuesta a la escisión de un oligonucleótido de solapa o sonda, p.ej.,en una estructura primaria o de primera escisión formada en un ensayo de escisión de solapa. El casete puede hibridarse con un producto de escisión no diana producido mediante la escisión de un oligonucleótido de solapa para formar una segunda estructura de escisión superpuesta, de tal modo que el casete pueda escindirse después mediante la misma enzima,p. ej.,una endonucleasa FEN-1.

[0036] El casete puede ser un único oligonucleótido que comprende una porción en horquilla(es decir, unaregión en donde una porción del oligonucleótido del casete se hibrida con una segunda porción del mismo oligonucleótido en condiciones de reacción, para formar un dúplex). Un casete puede comprender al menos dos oligonucleótidos que comprenden porciones complementarias que pueden formar un dúplex en condiciones de reacción. El casete puede comprender un marcador,p. ej.,un fluoróforo. Un casete puede comprender fracciones etiquetadas que producen un efecto FRET.

[0037] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ FRET” se refiere a la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, un proceso en el que restos,(p. ej.,fluoróforos) de transferencia de energíap. ej.,entre sí, o a partir de un fluoróforo a un no fluoróforo(p. ej.,una molécula inactivadora). En algunas circunstancias, la FRET implica que un fluoróforo donante excitado transfiera energía a un fluoróforo aceptor de menor energía a través de una interacción dipolo-dipolo de corto alcance(p. ej.,aproximadamente 10 nm o menos). En otras circunstancias, FRET implica una pérdida de energía de fluorescencia de un donante y un aumento de la fluorescencia en un fluoróforo aceptor. En otras formas más de FRET, la energía puede intercambiarse a partir de un fluoróforo donante excitado a una molécula no fluorescente(p. ej.,una molécula de extinción “ oscura” ). FRET es conocida por los expertos en la técnica y se ha descrito (véase,p. ej.,Stryer y col., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47:819; Selvin, 1995, Methods Enzymol., 246:300; Orpana, 2004 Biomol Eng 21, 45-50; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110).

[0038] En un ensayo de detección de solapa ilustrativo, un oligonucleótido invasivo y un oligonucleótido de solapa se hibridan con un ácido nucleico diana para producir un primer complejo que tiene un solapamiento como se ha descrito anteriormente. Una “solapa” no emparejada o “ brazo” se incluye en el extremo 5' del oligonucleótido de solapa. El primer complejo es un sustrato para una endonucleasa de solapa, p.ej.,una endonucleasa FEN-1, que escinde el oligonucleótido de solapa para liberar la porción de solapa 5'. En una reacción secundaria, el producto de solapa 5' liberado sirve como un oligonucleótido invasivo en un casete de FRET para crear nuevamente la estructura reconocida por la endonucleasa de aleta, de tal modo que el casete de FRET se escinde. Cuando el fluoróforo y el desactivador se separan por escisión del casete de FRET, se produce una señal fluorescente detectable por encima de la fluorescencia de fondo.

[0039] El término “tiempo real” , como se utiliza en la presente memoria se refiere a la detección de amplificación de ácido nucleico o amplificación de señal mediante la detección o medición de la acumulación de productos o señal en la reacción mientras la reacción está en curso, p.ej.,durante la incubación o el ciclo térmico. Dicha detección o medición puede ocurrir continuamente, o puede ocurrir en una pluralidad de puntos discretos durante el progreso de la reacción de amplificación, o puede ser una combinación. Por ejemplo, en una reacción en cadena de la polimerasa, la detección(p. ej.,de fluorescencia) puede producirse de forma continua durante todo o parte del ciclo térmico, o puede producirse transitoriamente, en uno o más puntos durante uno o más ciclos. La detección en tiempo real de las reacciones de PCR o QuARTS puede lograrse determinando un nivel de fluorescencia en el mismo punto(p. ej.,un punto de tiempo en el ciclo, o un paso de temperatura en el ciclo) en cada uno de una pluralidad de ciclos, o en cada ciclo. La detección en tiempo real de amplificación también puede denominarse detección “durante” la reacción de amplificación.

[0040] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ conjunto de datos de amplificación cuantitativa” se refiere a los datos obtenidos durante la amplificación cuantitativa de la muestra diana, p.ej.,ADN diana. En el caso de los ensayos de PCR cuantitativa o QuARTS, el conjunto de datos de amplificación cuantitativa es una colección de valores de fluorescencia obtenidos durante la amplificación, p.ej.,durante una pluralidad de, o todos los ciclos térmicos. Los datos para la amplificación cuantitativa no se limitan a los datos recogidos en cualquier punto particular en una reacción, y la fluorescencia puede medirse en un punto discreto en cada ciclo o continuamente durante cada ciclo.

[0041]Las abreviaturas “ Ct” y “ Cp” , como se utilizan en la presente memoria, en referencia a los datos recolectados durante la PCR en tiempo real y los ensayos PCR+INVADER, se refieren al ciclo en el que la señal,(p. ej.,una señal fluorescente) cruza un valor umbral predeterminado indicativo de una señal positiva. Se han utilizado diversos métodos para calcular el umbral que se utiliza como determinante de la concentración de la señal frente a la concentración, y el valor se expresa generalmente como el “ umbral de cruce” (Ct) o el “ punto de cruce” (Cp). Se pueden utilizar valores de Cp o valores de Ct en los métodos presentados en la presente memoria para el análisis de la señal en tiempo real para la determinación del porcentaje de constituyentes variantes y/o no variantes en un ensayo o muestra.

[0042]Como se utiliza en la presente memoria, los términos “complementario” o “ complementariedad” utilizados en referencia a polinucleótidos(es decir,una secuencia de nucleótidos) se refieren a polinucleótidos relacionados mediante las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “ 5'-A-G-T-3'” es complementaria a la secuencia “3'-T-C-A-5'” . La complementariedad puede ser “ parcial” , en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan según las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad “ completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre las cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los métodos de detección que dependen de la unión entre los ácidos nucleicos.

[0043]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ cebador” se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural, como en una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico(p. ej.,en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como un biocatalizador(p. ej.,una ADN polimerasa o similar). El cebador es típicamente monocatenario para una máxima eficiencia en la amplificación, pero alternativamente puede ser parcial o completamente bicatenario. La porción del cebador que se hibrida con un ácido nucleico molde es lo suficientemente larga como para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los iniciadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del iniciador y el uso del método. Los cebadores pueden comprender marcadores, etiquetas, restos de captura,etc.

[0044]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ molécula de ácido nucleico” se refiere a cualquier molécula que contiene ácido nucleico, que incluye, de modo no taxativo, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN que incluyen, pero no limitado a, 4 acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxil-metil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.

[0045]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ nucleobase” es sinónimo de otros términos en uso en la técnica que incluyen “ nucleótido” , “ desoxinucleótido” , “ residuo de nucleótido” , “ residuo de desoxinucleótido” , “ nucleótido trifosfato (NTP)” o desoxinucleótido trifosfato (dNTP).

[0046]Un “ oligonucleótido” se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico(p. ej.,nucleótidos), típicamente más de tres unidades monoméricas y, más típicamente, más de diez unidades monoméricas. El tamaño exacto de un oligonucleótido generalmente depende de varios factores, incluida la función o el uso final del oligonucleótido. Para ilustrar adicionalmente, los oligonucleótidos tienen típicamente menos de 200 residuos de longitud(p. ej.,entre 15 y 100), sin embargo, tal como se utiliza en la presente memoria, el término también pretende abarcar cadenas de polinucleótidos más largas. Los oligonucleótidos se denominan con frecuencia por su longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos se denomina “24-mer” . Típicamente, los monómeros de nucleósidos están unidos mediante enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos, que incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares, que incluyen contraiones asociados, p.ej.,H+, NH<4>+, Na+ y similares, si tales contraiones están presentes. Además, los oligonucleótidos son típicamente monocatenarios. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, que incluye, pero sin limitarse a, aislamiento de una secuencia existente o natural, replicación o amplificación de a Dn , transcripción inversa, clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas, o síntesis química directa mediante un método tal como el método de fosfotriéster de Narang y col. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99; el método de fosfodiéster de Brown y col. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage y col. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; el método de triéster de Matteucci y col. (1981) J Am Chem Soc. 103:3185-3191; métodos de síntesis automatizados; o el método de soporte sólido de la patente US-4.458.066, titulada “ Process For Preparing Polynucleotides” , expedida el 3 de julio de 1984 a Caruthers y col., u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

[0047]Una “ secuencia” de un biopolímero se refiere al orden y la identidad de las unidades monoméricas(p. ej.,nucleótidos, aminoácidos,etc.)en el biopolímero. La secuencia(p. ej.,la secuencia de bases) de un ácido nucleico se lee normalmente en la dirección 5' a 3'.

[0048]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico(p. ej.,ADN) que comprende las secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, precursor o ARN(p. ej.,ARN no codificantes tales como ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN esplicosómico, microARN). Un polipéptido o ARN no codificante puede codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que se conserve la actividad deseada o las propiedades funcionales(p. ej.,actividad enzimática, unión a ligandos, transducción de señales, inmunogenicidad,etc.)del polipéptido de longitud completa o fragmento. El término también abarca la región codificante de un gen estructural y las secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante en los extremos 5' y 3' a una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cada extremo, de tal modo que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias ubicadas en 5' de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas en 5'. Las secuencias ubicadas en 3' o corriente abajo de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas en 3'. El término “ gen” abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas “ intrones” o “ regiones intermedias” o “ secuencias intermedias” . Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear(p. ej.,ARNnh); intrones pueden contener elementos reguladores(p. ej.,potenciadores). Los intrones se eliminan o “ cortan” del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

[0049]Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones “flanqueantes” (estas secuencias flanqueantes están ubicadas en 5' o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, la escisión postranscripcional y la poliadenilación.

[0050]Como se utiliza en la presente memoria, “ metilación” se refiere a la metilación de citosina en las posiciones C5 o N4 de la citosina, la posición N6 de la adenina u otros tipos de metilación de ácidos nucleicos. El ADN amplificadoin vitrogeneralmente no está metilado porque los métodos típicos de amplificación de ADN in vitro no conservan el patrón de metilación de la cadena molde de amplificación. Sin embargo, “ADN metilado” o “ADN no metilado” también pueden referirse a ADN amplificado cuya cadena molde original está metilada o no metilada, respectivamente.

[0051]Por consiguiente, como se utiliza en la presente memoria, un “ nucleótido metilado” o una “ base de nucleótido metilada” se refiere a la presencia de un resto de metilo en una base de nucleótido, en donde el resto de metilo no está presente en una base de nucleótido típica reconocida. Por ejemplo, la citosina no contiene un resto de metilo en su anillo de pirimidina, pero la 5-metilcitosina contiene un resto de metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por lo tanto, la citosina no es un nucleótido metilado y la 5-metilcitosina es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, la timina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina; sin embargo, para los fines de la presente memoria, la timina no se considera un nucleótido metilado cuando está presente en el ADN, ya que la timina es una base nucleotídica típica del ADN.

[0052]Como se utiliza en la presente memoria, una “ molécula de ácido nucleico metilado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados.

[0053]Como se utiliza en la presente memoria, un “ estado de metilación” , “ perfil de metilación” y “ estatus de metilación” de una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de una o más bases de nucleótido metiladas en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina metilada se considera metilada(p. ej.,el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico está metilado). Una molécula de ácido nucleico que no contiene nucleótidos metilados se considera no metilada.

[0054]El estado de metilación de una secuencia de ácido nucleico particular(p. ej.,un marcador génico o región de a Dn como se describe en la presente memoria) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de las bases(p. ej.,de una o más citosinas) dentro de la secuencia, o puede indicar información con respecto a la densidad de metilación regional dentro de la secuencia con o sin proporcionar información precisa de las ubicaciones dentro de la secuencia donde se produce la metilación.

[0055]El estado de metilación de un locus de nucleótido en una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de un nucleótido metilado en un locus particular en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el estado de mutilación de una citosina en el 7° nucleótido de una molécula de ácido nucleico está metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido de la molécula de ácido nucleico es 5-metilcitosina. De manera similar, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido de una molécula de ácido nucleico no está metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido de la molécula de ácido nucleico es citosina (y no 5-metilcitosina).

[0056]El estado de metilación puede representarse o indicarse opcionalmente mediante un “valor de metilación”(p. ej.,que representa una frecuencia, fracción, relación, porcentaje de metilación,etc.)Se puede generar un valor de metilación, por ejemplo, cuantificando la cantidad de ácido nucleico intacto presente después de la digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de la metilación o comparando los perfiles de amplificación después de la reacción con bisulfito o comparando las secuencias de ácidos nucleicos tratados con bisulfito y no tratados. En consecuencia, un valor,p. ej.,un valor de metilación, representa el estado de metilación y, por lo tanto, puede utilizarse como un indicador cuantitativo del estado de metilación en múltiples copias de un locus. Esto es particularmente útil cuando se desea comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un umbral o valor de referencia.

[0057]Como se utiliza en la presente memoria, “ frecuencia de metilación” o “ porcentaje de metilación (%)” se refiere a la cantidad de casos en los que una molécula o locus está metilado con respecto a la cantidad de casos en los que la molécula o locus no está metilado.

[0058]Como tal, el estado de metilación describe el estado de metilación de un ácido nucleico(p. ej.,una secuencia genómica). Además, el estado de metilación se refiere a las características de un segmento de ácido nucleico en un locus genómico particular relevante para la metilación. tales características incluyen, entre otras, si alguno de los restos de citosina (C) dentro de esta secuencia de ADN está metilado, la ubicación del residuo(s) de C metilados, la frecuencia o el porcentaje de C metilado en cualquier región particular de un ácido nucleico y diferencias alélicas en la metilación debidas,p. ej.,a diferencias en el origen de los alelos. Los términos “ estado de metilación” , “ perfil de metilación” y “ estado de metilación” también se refieren a la concentración relativa, concentración absoluta o patrón de C metilado o C no metilado en cualquier región particular de un ácido nucleico en una muestra biológica. Por ejemplo, si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados, se puede decir que están “ hipermetilados” o que tienen “ metilación aumentada” , mientras que si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metiladas, se puede denominar “ hipometilada” o que tiene “ metilación disminuida” . Del mismo modo, si el (los) residuo(s) de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico(p. ej.,de una región diferente de un individuo diferente,etc.),esa secuencia se considera hipermetilada o tiene una mayor metilación en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, si el (los) residuo(s) de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico(p. ej.,de una región diferente o de un individuo diferente,etc.),esa secuencia se considera hipometilada o con una metilación disminuida en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Además, la expresión “ patrón de metilación” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a los sitios colectivos de nucleótidos metilados y no metilados sobre una región de un ácido nucleico. Dos ácidos nucleicos pueden tener la misma o similar frecuencia de metilación o porcentaje de metilación pero tener diferentes patrones de metilación cuando el número de nucleótidos metilados y no metilados es el mismo o similar en toda la región pero las ubicaciones de los nucleótidos metilados y no metilados son diferentes. Se dice que las secuencias están “ diferencialmente metiladas” o que tienen una “ diferencia en la metilación” o que tienen un “ estado de metilación diferente” cuando difieren en el grado(p. ej.,una tiene una metilación aumentada o disminuida con respecto a la otra), la frecuencia o el patrón de metilación. La expresión “ metilación diferencial” se refiere a una diferencia en el nivel o patrón de metilación de ácidos nucleicos en una muestra positiva para cáncer en comparación con el nivel o patrón de metilación de ácidos nucleicos en una muestra negativa para cáncer. También puede referirse a la diferencia en niveles o patrones entre pacientes que tienen recurrencia del cáncer después de la cirugía frente a pacientes que no tienen recurrencia. La metilación diferencial y los niveles o patrones específicos de metilación del ADN son biomarcadores pronósticos y predictivos, p.ej.,una vez que se han definido las características de corte o predictivas correctas.

[0059]La frecuencia del estado de metilación se puede utilizar para describir una población de individuos o una muestra de un solo individuo. Por ejemplo, un locus de nucleótido que tiene una frecuencia de estado de metilación del 50 % está metilado en el 50 % de los casos y no metilado en el 50 % de los casos. Dicha frecuencia se puede utilizar, por ejemplo, para describir el grado en que un locus de nucleótido o región de ácido nucleico está metilado en una población de individuos o una colección de ácidos nucleicos. Por lo tanto, cuando la metilación en una primera población o conjunto de moléculas de ácido nucleico es diferente de la metilación en una segunda población o conjunto de moléculas de ácido nucleico, la frecuencia del estado de metilación de la primera población o conjunto será diferente de la frecuencia del estado de metilación del segundo. población o conjunto. Dicha frecuencia también puede utilizarse, por ejemplo, para describir el grado en que un locus de nucleótido o región de ácido nucleico está metilado en un solo individuo. Por ejemplo, dicha frecuencia se puede utilizar para describir el grado en que un grupo de células de una muestra de tejido está metilado o no metilado en un locus de nucleótido o región de ácido nucleico.

[0060]El término “ altamente metilado” se refiere a los ácidos nucleicos en los que un locus particular(p. ej.,un dinucleótido CpG o un conjunto de dinucleótidos o una región rica en CpG) se metila en un tipo de muestra o tipo de tejido particular a una velocidad que es considerablemente mayor que la observada para el locus comparable en el mismo ADN en otro tejido o tipo de muestra. “Altamente metilado” puede referirse a un único residuo C en particular o a una tasa promedio de metilación en múltiples C en una región, como una fracción de las copias de ese locus en la muestra que se está analizando. Sin limitar el término a ningún nivel particular de metilación, un locus altamente metilado puede estar metilado en > 10 %, preferiblemente > 20 % a 40 %, más preferiblemente > 50 % a 75 %, aún más preferiblemente entre 75 % y 100 %.

[0061]Como se utiliza en la presente memoria, un “ locus de nucleótidos” se refiere a la ubicación de un nucleótido en una molécula de ácido nucleico. Un locus de nucleótido de un nucleótido metilado se refiere a la ubicación de un nucleótido metilado en una molécula de ácido nucleico.

[0062]Típicamente, la metilación del ADN humano ocurre en una secuencia de dinucleótidos que incluye una guanina y una citosina adyacentes donde la citosina está ubicada en 5' de la guanina (también denominadas secuencias de dinucleótidos de CpG). La mayoría de las citosinas dentro de los dinucleótidos de CpG están metiladas en el genoma humano, sin embargo, algunas permanecen sin metilar en regiones genómicas ricas en dinucleótidos de CpG específicas, conocidas como islas de CpG (véase,p. ej.,Antequera y col. (1990) Cell 62: 503 514).

[0063]Como se utiliza en la presente memoria, una “ isla de CpG” se refiere a una región de ADN genómico rica en G:C que contiene un número aumentado de dinucleótidos de CpG en relación con el ADN genómico total. Una isla de CpG puede tener al menos 100, 200 o más pares de bases de longitud, donde el contenido G:C de la región es al menos el 50 % y la relación entre la frecuencia de CpG observada y la frecuencia esperada es 0,6; en algunos casos, una isla de CpG puede tener al menos 500 pares de bases de longitud, donde el contenido G:C de la región es al menos el 55 %) y la relación entre la frecuencia de CpG observada y la frecuencia esperada es 0,65. La frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada puede calcularse según el método proporcionado en Gardiner-Garden y col. (1987) J. Mol. Biol. 196: 261-281. Por ejemplo, la frecuencia de CpG observada sobre la frecuencia esperada se puede calcular según la fórmula R = (A * B) / (C * D), donde R es la relación entre la frecuencia de CpG observada y la frecuencia esperada, A es el número de dinucleótidos de CpG en una secuencia analizada, B es el número total de nucleótidos en la secuencia analizada, C es el número total de nucleótidos C en la secuencia analizada y D es el número total de nucleótidos G en la secuencia analizada. El estado de metilación típicamente se determina en las islas de CpG,p. ej.,en las regiones promotoras. Sin embargo, se apreciará que otras secuencias en el genoma humano son propensas a la metilación del ADN, tales como CpA y CpT (véase Ramsahoye (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5237-5242; Salmon y Kaye (1970) Biochim. Biophys. Acta.

204: 340-351; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2827-2842; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4353 4367; Woodcock (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 888-894).

[0064]Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ célula tisular” se refiere a cualquier célula tisular en un cuerpo,p. ej.,un cuerpo humano o animal, que incluye, p.ej.,células epiteliales, musculares, nerviosas y óseas. Las células de los tejidos no incluyen las células sanguíneas. Como se utiliza en la presente memoria, la sangre normalmente comprende plasma, glóbulos rojos, glóbulos blancos (incluidos leucocitos y linfocitos) y plaquetas. Los leucocitos incluyen neutófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos, y los linfocitos incluyen células T, células B y células asesinas naturales.

[0065]Como se utiliza en la presente memoria, un reactivo que modifica un nucleótido de la molécula de ácido nucleico en función del estado de metilación de la molécula de ácido nucleico, o un reactivo específico de metilación, se refiere a un compuesto o composición u otro agente que puede cambiar la secuencia de nucleótidos. de una molécula de ácido nucleico de tal modo que refleje el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico. Los métodos para tratar una molécula de ácido nucleico con dicho reactivo pueden incluir poner en contacto la molécula de ácido nucleico con el reactivo, junto con pasos adicionales, si se desea, para lograr el cambio deseado de secuencia de nucleótidos. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido metilado se modifica en un nucleótido diferente. Dicho cambio en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido no metilado se modifica en un nucleótido diferente. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada uno de un nucleótido seleccionado que no está metilado(p. ej.,cada citosina no metilada) se modifica a un nucleótido diferente. El uso de tal reactivo para cambiar la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido que es un nucleótido metilado (p. ej., cada citosina metilada) se modifica a un nucleótido diferente. Como se utiliza en la presente memoria, el uso de un reactivo que modifica un nucleótido seleccionado se refiere a un reactivo que modifica un nucleótido de los cuatro nucleótidos que ocurren típicamente en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para ADN y C, G, U, y A para ARN), de modo que el reactivo modifica un nucleótido sin modificar los otros tres nucleótidos. Tal reactivo puede modificar un nucleótido seleccionado no metilado para producir un nucleótido diferente. En otro ejemplo, tal reactivo puede desaminar nucleótidos de citosina no metilados. Un ejemplo de reactivo es bisulfito.

[0066]La expresión “ reactivo de bisulfito” se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles como se describe en la presente memoria para distinguir entre secuencias de dinucleótidos de CpG metilados y no metilados. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (p. ej., PCT/EP2004/011715 y WO 2013/116375). El tratamiento con bisulfito se puede llevar a cabo en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero sin limitarse a, n-alquilenglicol o dietilenglicol dimetil éter (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. Los disolventes desnaturalizantes se pueden utilizar en concentraciones entre el 1 % y el 35 % (v/v). La reacción de bisulfito se puede llevar a cabo en presencia de depuradores tales como, pero sin limitarse a, derivados de cromano, p.ej.,ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico o ácido de trihidroxibenzona y derivados de los mismos,p. ej.,ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La reacción de bisulfito puede comprender el tratamiento con hidrogenosulfito de amonio,p. ej.,como se describe en la patente WO 2013/116375.

[0067]La expresión “ ensayo de metilación” se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos de CpG dentro de una secuencia de un ácido nucleico.

[0068]El término “AP-PCR MS” (reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente sensible a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un escaneo global del genoma utilizando cebadores ricos en CG para enfocarse en las regiones con mayor probabilidad de contener dinucleótidos de CpG, y descrita por Gonzalgo y col. (1997) Cancer Research 57: 594-599.

[0069]El término “ MethyLight™” se refiere a la técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads y col. (1999) Cancer Res. 59: 2302-2306.

[0070]El término “ HeavyMethyl™” se refiere a un ensayo en donde las sondas de bloqueo específicas para la metilación (también denominadas en la presente memoria bloqueantes) que cubren las posiciones de CpG entre o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

[0071]El término “ Ms-SNuPE” (extensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531.

[0072]El término “ MSP” (PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826, y en la patente US- 5.786.146.

[0073]El término “ COBRA” (análisis combinado de restricción de bisulfito) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito porXiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534.

[0074]El término “ MCA” (amplificación de las islas de CpG) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota y col. (1999) Cancer Res. 59: 2307-12, y en el documento WO 00/26401A1.

[0075]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ kit” se refiere a cualquier sistema de administración para administrar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, tales sistemas de administración incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o administración de reactivos de reacción(p. ej.,oligonucleótidos, enzimas,etc.en los contenedores apropiados) y/o materiales de apoyo(p. ej.,tampones, instrucciones para realizar el ensayo,etc.)de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos(p. ej.,cajas) que contienen los reactivos de reacción relevantes y/o los materiales de apoyo. Como se utiliza en la presente memoria, el término “ kit fragmentado” se refiere a sistemas de administración que comprenden dos o más contenedores separados, cada uno de los cuales contiene una subporción de los componentes totales del kit. Los contenedores se pueden entregar al destinatario previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer contenedor puede contener una enzima para utilizar en un ensayo, mientras que un segundo contenedor contiene oligonucleótidos.

[0076]El término “sistema” como se utiliza en la presente memoria se refiere a una colección de artículos para su uso para un propósito particular. Los artículos pueden comprender instrucciones de uso, como información suministrada enp. ej.,un artículo, en papel o en medios grabables(p. ej.,DVD, CD, unidad flash,etc.).Las instrucciones pueden dirigir a un usuario a una ubicación en línea,p. ej.,un sitio web.

[0077]Como se utiliza en la presente memoria, el término “ información” se refiere a una colección de hechos o datos. En referencia a la información almacenada o procesada utilizando un(os) sistema(s) informático(s), que incluyen, pero no se limitan a interredes, el término se refiere a cualquier dato almacenado en cualquier formato(p. ej.,analógico, digital, óptico,etc.).Como se utiliza en la presente memoria, el término “ información relacionada con un sujeto” se refiere a hechos o datos relacionados con un sujeto(p. ej.,un ser humano, vegetal o animal). El término “ información genómica” se refiere a información que pertenece a un genoma que incluye, pero no se limita a, secuencias de ácido nucleico, genes, porcentaje de metilación, frecuencias alélicas, niveles de expresión de ARN, expresión de proteínas, fenotipos relacionados con los genotipos,etc.” Información de frecuencia de alelos” se refiere a hechos o datos relacionados con las frecuencias alélicas, que incluyen, pero sin limitarse a, identidades de alelos, correlaciones estadísticas entre la presencia de un alelo y una característica de un sujeto(p. ej.,un sujeto humano), la presencia o ausencia de un alelo en un individuo o población, la probabilidad porcentual de un alelo que está presente en un individuo que tiene una o más características particulares,etc.

Descripción detallada

[0078]La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no se encuentran dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. En la presente memoria se proporciona tecnología relacionada con la realización de ensayos para la detección y cuantificación de ADN, p.ej.,ADN metilado. En particular, la tecnología se refiere a los controles internos para tales ensayos de metilación.

[0079]La presente descripción proporciona un marcador denominado “ B3GALT6” para utilizarse como marcador de metilación y control interno. El gen de la actina beta (ACTB) se utiliza a menudo como diana de control interno en los ensayos que detectan el ADN metilado. Sin embargo, el ACTB no contiene islas CpG metiladas y, por lo tanto, tras la conversión con bisulfito se pierden todos los residuos de citosina, lo que da como resultado una secuencia muy rica en AT que puede resultar problemática para el diseño de cebadores y sondas(p. ej.,para ensayos múltiples con ADN que tienen un contenido de G-C más alto, se deben utilizar sondas y cebadores más largos para lograr el mismo rango de Tm para el ACTB, y la complejidad de secuencia reducida del ACTB convertido aumenta riesgo de reactividad cruzada de cebadores y sondas con otro ADN de la reacción). Además, se ha determinado que el ADN ACTB se convierte con bisulfito a una velocidad más rápida que los marcadores de ADN metilado, lo que dificulta la consecución de parámetros de conversión de bisulfito optimizados tanto para el marcador ACTB como para los marcadores de ADN metilado en la misma muestra.

[0080]Durante el desarrollo de la presente tecnología, se determinó que el B3GALT6 es ADN altamente metilado que puede utilizarse como ADN de control alternativo. Durante el desarrollo de la tecnología, se determinó que el ADN de B3GALT6 se comporta de manera similar a los ADN marcadores metilados duran te la conversión con bisulfito. Como las C metiladas no se convierten durante el tratamiento con bisulfito, el uso de un ADN metilado como ADN de control interno en lugar de la beta-actina proporciona un control interno que mantiene su complejidad de secuencia tras la conversión, y que permite el uso de oligonucleótidos más cortos en los ensayos de detección de ADN,p. ej.,los ensayos de PCR y/o endonucleasa de solapa, como el ensayo QuARTS que se describe a continuación en la presente memoria.

I. Genes de control metilados

[0081]En los ensayos que detectan y cuantifican el ADN rico en CpG metilado que se ha sometido a conversión con bisulfito, es habitual detectar también un gen de control presente en la misma muestra, y el gen de control verifica la entrada de ADN en el ensayo independientemente de la fuente(p. ej.,cáncer, tejido normal, heces o tejidos). Tal gen de control se utiliza, por ejemplo, para normalizar los datos del número de copias de ADN obtenidos en ensayos en diferentes muestras, para mostrar con precisión niveles de marcadores asociados a la enfermedad más altos o más bajos de muestra a muestra.

[0082]Para que un gen normalizador de un ensayo de metilación funcione mejor, debe cumplir varios criterios. Un gen normalizador ideal, por ejemplo: 1) debe estar igualmente presente tanto en el tejido normal como en el enfermo; 2) deben tener aproximadamente el mismo contenido de G<c>que el (los) gen(es) o marcador(es) de prueba que se está(n) analizando(p. ej.,marcadores de ADN en los que la hipermetilación es un indicador de un estado patológico); 3) deben reaccionar de la misma manera que los genes o marcadores de ensayo a los tratamientos de muestra previos a la cuantificación (antes de la PCR), como la conversión con bisulfito; y 4) deben tener una eficiencia de amplificación por PCR similar a la de los genes/marcadores de prueba que se están ensayando.

[0083]El gen de p-actina, un gen típicamente utilizado como gen normalizador para la detección de ADN marcadores metilados, no tiene el mismo contenido de GC y metilación de CpG que los marcadores de metilación asociados con enfermedades como el cáncer y el adenoma(p. ej., vimentina, septina 9, NDRG4, BMP3),por lo que no se comporta como tales ADN marcadores en la conversión de bisulfito previa a la PCR o en la amplificación por PCR.

[0084]Los experimentos descritos en la presente memoria identificaron genes(p. ej.,B3GALT6) que están altamente metilados en el tejido normal y canceroso y en los glóbulos blancos. Los genes descritos en la presente memoria se utilizan para normalizar los niveles de marcadores en pacientes y muestras.

II Ensayos de detección de metilación

[0085]Los marcadores descritos en la presente memoria(p. ej.,B3GALT6, en particular) encuentran uso en una variedad de ensayos de detección de metilación como reactivos de normalización e indicadores de estados patológicos.

[0086]El método utilizado más frecuentemente para analizar un ácido nucleico en busca de 5-metilcitosina se basa en el método del bisulfito descrito por Frommer y col. para la detección de 5-metilcitosinas en el ADN (Frommer y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31) o variaciones del mismo. El método del bisulfito para cartografiar las 5-metilcitosinas se basa en la observación de que la citosina, pero no la 5-metilcitosina, reacciona con el ion sulfito de hidrógeno (también conocido como bisulfito). La reacción generalmente se realiza según los siguientes pasos: en primer lugar, la citosina reacciona con el sulfito de hidrógeno para formar una citosina sulfonada. A continuación, la desaminación espontánea del intermedio de reacción sulfonado da como resultado un uracilo sulfonado. Finalmente, el uracilo sulfonado se desulfona en condiciones alcalinas para formar uracilo. La detección es posible porque la base de uracilo se empareja con la adenina (por lo tanto, se comporta como la timina), mientras que la base de 5-metilcitosina se empareja con la guanina (por lo tanto, se comporta como la citosina). Esto hace posible la discriminación de las citosinas metiladas de las citosinas no metiladas mediante,p. ej.,secuenciación genómica con bisulfito (Grigg G, y Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98), PCR específica de metilación (MSP) como se describe,p. ej.,en la patente US-5.786.146, o mediante el uso de un ensayo que comprende la escisión de la sonda específica de secuencia,p. ej.,un ensayo de endonucleasa de solapa QuARTS (véasep. ej.,Zou y col. (2010) “ Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology” Clin Chem 56: A199; la patente US- 8.361.720,).

[0087]Algunas tecnologías convencionales se relacionan con métodos que consisten en encerrar el ADN a analizar en una matriz de agarosa, impidiendo en este modo la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con el ADN monocatenario), y reemplazando los pasos de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A, y col. (1996) “A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis” Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). Por lo tanto, es posible analizar el estado de metilación de las células individuales, lo que ilustra la utilidad y la sensibilidad del método. Se proporciona una descripción general de los métodos convencionales para detectar la 5-metilcitosina en Rein, T., y col. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 2255.

[0088]La técnica del bisulfito típicamente implica amplificar fragmentos específicos, cortos de un ácido nucleico conocido después de un tratamiento con bisulfito, y posteriormente analizar el producto mediante secuenciación (Olek y Walter (1997) Nat. Genet. 17: 275-6) o una reacción de extensión del cebador (Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-31; documento WO 95/00669; la patente US- 6.251.594) para analizar posiciones individuales de citosina. Algunos métodos utilizan la digestión enzimática (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res.

25: 2532-4). La detección por hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek y col, documento WO 99/28498). De forma adicional, se ha descrito el uso de la técnica de bisulfito para la detección de metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark (1994) Bioessays 16: 431-6,; Zeschnigk y col. (1997) Hum Mol Genet.

6: 387-95; Feil y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 695; Martin y col. (1995) Gene 157: 261-4; el documento WO 9746705; documento WO 9515373).

[0089]Se pueden utilizar diversos procedimientos de ensayo de metilación junto con el tratamiento con bisulfito según la presente tecnología. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos de CpG(p. ej.,islas de CpG) dentro de una secuencia de ácido nucleico. Tales ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ácido nucleico tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis de transferencia de Southern y uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

[0090]Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de patrones de metilación y distribuciones de 5-metilcitosina utilizando el tratamiento con bisulfito (Frommer y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-1831). De forma adicional, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito resulta útil para evaluar el estado de metilación,p. ej.,como describen Sadri y Hornsby (1997) Nucl. Acids Res. 24: 5058-5059 o como se incorpora en el método conocido como COBRA (Análisis combinado de restricción de bisulfito) (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534).

[0091]El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativa útil para determinar los niveles de metilación del a Dn en loci específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). Brevemente, la digestión con enzimas de restricción se utiliza para revelar diferencias de secuencia dependientes de la metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante un tratamiento estándar con bisulfito según el procedimiento descrito por Frommer y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). A continuación, se realiza la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito utilizando cebadores específicos para las islas de CpG de interés, seguida de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y detección utilizando sondas de hibridación marcadas y específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de forma cuantitativa lineal en un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de forma fiable al ADN obtenido a partir de muestras de tejido embebido en parafina microdiseccionado.

[0092]Los reactivos típicos (p. ej., como se pueden encontrar en un kit basado en COBRA™típico) para el análisis C<o b>R<a>™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para locus específicos(p. ej.,genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG,etc.);enzima de restricción y tampón adecuado; oligonucleótido de hibridación génica; oligonucleótido de hibridación de control; kit de marcaje de cinasa para sonda de oligonucleótidos; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; Reactivos o kits de recuperación de ADN(p. ej.,precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de a Dn .

[0093]Los ensayos tales como “ MethyLight™” (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads y col., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), las reacciones Ms-SNuPE™ (extensión del cebador de nucleótido único sensible a la metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación (“ MSP” ; Herman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; la patente US- 5.786.146), y amplificación de las islas de CpG metiladas (“ MCA” ; Toyota y col., Cancer Res. 59:2307-12, 1999) se utilizan solos o en combinación con uno o más de estos métodos.

[0094]La técnica de ensayo “ HeavyMethyl™” es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación según la amplificación específica de metilación del ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación (“ bloqueantes “ ) que cubren las posiciones CpG entre, o cubiertas por, los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

[0095]La expresión ensayo “ HeavyMethyl™ MethyLight™” se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también puede utilizarse combinado con cebadores de amplificación específicos de metilación.

[0096]Los reactivos típicos(p. ej.,como se pueden encontrar en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis HeavyMethyl™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para locus específicos(p. ej.,genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG,etc.);oligonucleótidos bloqueantes; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.

[0097]La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de prácticamente cualquier grupo de sitios de CpG dentro de una isla de CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; la patente US- US-5.786.146). Brevemente, el ADN se modifica con bisulfito de sodio, que convierte las citosinas no metiladas, pero no a las metiladas, en uracilo, y los productos se amplifican posteriormente con cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. MSP requiere solo pequeñas cantidades de ADN, es sensible al 0,1 % de alelos metilados de un locus de isla de CpG determinado y se puede realizar en ADN extraído de muestras embebidas en parafina. Los reactivos típicos(p. ej.,como se pueden encontrar en un kit típico basado en MSP) para el análisis de MSP pueden incluir, entre otros: cebadores de PCR metilados y no metilados para locus específicos(por ejemplo,genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados, y sondas específicas.

[0098]El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza PCR en tiempo real basada en fluorescencia(p. ej.,TaqMan®) que no requiere manipulaciones adicionales tras el paso de la PCR (Eads y col., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso de MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción de bisulfito de sodio, en un grupo mixto de diferencias de secuencia dependientes de la metilación según los procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los restos de citosina no metilados en uracilo). La PCR basada en fluorescencia se realiza a continuación en una reacción “ sesgada” ,p. ej.,con cebadores de PCR que se superponen a dinucleótidos de CpG conocidos. La discriminación de secuencias se produce tanto a nivel del proceso de amplificación como a nivel del proceso de detección de fluorescencia.

[0099]El ensayo MethyLight™ se utiliza como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en un ácido nucleico,p. ej.,una muestra de ADN genómico, donde la discriminación de secuencia ocurre a nivel de la hibridación de la sonda. En una versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un supuesto sitio de metilación particular. Una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido de CpG proporciona un control no sesgado de la cantidad de ADN de entrada. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica sondeando el conjunto de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren sitios de metilación conocidos(p. ej.,una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.

[0100]El proceso MethyLight™ se utiliza con cualquier sonda adecuada(p. ej.,una sonda “TaqMan®” , una sonda Lightcycler®,etc.)Por ejemplo, en algunas aplicaciones, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR utilizando sondas TaqMan®,p. ej.,con cebadores MSP y/u oligonucleótidos bloqueadores de HeavyMethyl y una sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene doble marcaje con moléculas fluorescentes “ indicadoras” e “ inactivadoras” y está diseñada para ser específica para una región con un contenido de GC relativamente alto, de modo que se funde a una temperatura aproximadamente 10 °C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el paso de hibridación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, eventualmente llegará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora sin inactivar utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

[0101]Los reactivos típicos(p. ej.,como se pueden encontrar en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para locus específicos(p. ej.,genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG,etc.);sondas TaqMan® o LigthCycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.

[0102]El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencias se produce a nivel de hibridación de sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación sin sesgo en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un supuesto sitio de metilación particular. Una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido de CpG proporciona un control no sesgado de la cantidad de ADN de entrada. Como alternativa, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica sondando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren posibles sitios de metilación.

[0103]El proceso QM™se puede utilizar con cualquier sonda adecuada,p. ej.,sondas “TaqMan®” , sondas Lightcycler®, en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y a la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene doble marcaje con moléculas fluorescentes “ indicadoras” e “ inactivadoras” y está diseñada para ser específica para una región con un contenido de GC relativamente alto, de modo que se funde, a una temperatura aproximadamente 10 °C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el paso de hibridación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, eventualmente llegará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora sin inactivar utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real. Los reactivos típicos(p. ej.,como se pueden encontrar en un kit basado en QM™ típico) para el análisis QM™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para locus específicos(p. ej.,genes específicos, marcadores, DMR, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG,etc.);sondas TaqMan® o LigthCycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa. La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basados en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido de la extensión del cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo mientras se deja la 5-metilcitosina sin cambios. A continuación, se realiza la amplificación de la secuencia diana deseada utilizando cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como plantilla para el análisis de metilación en el sitio de CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN(p. ej.,secciones de patología microdiseccionadas) y se evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios CpG.

[0104]Los reactivos típicos(p. ej.,como se pueden encontrar en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para locus específicos(p. ej.,genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc.); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE™ para locus específicos; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN(p. ej.,precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN. La secuenciación con bisulfito de representación reducida (RRBS, por sus siglas en inglés) comienza con el tratamiento con bisulfito del ácido nucleico para convertir todas las citosinas no metiladas en uracilo, seguido de la digestión con enzimas de restricción (p. ej., mediante una enzima que reconoce un sitio que incluye una secuencia CG como MspI) y la secuenciación completa de los fragmentos después de acoplarse a un ligando adaptador. La elección de la enzima de restricción enriquece los fragmentos para las regiones densas de CpG, lo que reduce el número de secuencias redundantes que pueden asignarse a múltiples posiciones de genes durante el análisis. Como tal, las RRBS reducen la complejidad de la muestra de ácido nucleico mediante la selección de un subconjunto(p. ej.,mediante selección por tamaño utilizando electroforesis en gel preparativa) de fragmentos de restricción para la secuenciación. A diferencia de la secuenciación con bisulfito del genoma completo, cada fragmento producido por la digestión con enzimas de restricción contiene información de metilación del ADN para al menos un dinucleótido de CpG. Como tal, la RRBS enriquece la muestra en promotores, islas de CpG y otras características genómicas con una alta frecuencia de sitios de corte de enzimas de restricción en estas regiones y, por lo tanto, proporciona un ensayo para evaluar el estado de metilación de uno o más locus genómicos.

[0105]Un protocolo típico de RRBS comprende los pasos de digerir una muestra de ácido nucleico con una enzima de restricción como Mspl, rellenar salientes y añadir colas de A, ligar adaptadores, conversión de bisulfito y PCR. Véase,p. ej.,y col. (2005) “Genome-scale d Na methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution” Nat Methods 7: 133-6; Meissner y col. (2005) “ Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis” Nucleic Acids Res. 33: 5868-77.

[0106]Se puede utilizar un ensayo cuantitativo de amplificación de señal y diana en tiempo real específico de alelo (QuARTS) para evaluar el estado de metilación. Tres reacciones ocurren secuencialmente en cada ensayo QuARTS, incluida la amplificación (reacción 1) y la escisión de la sonda diana (reacción 2) en la reacción primaria; y escisión de FRET y generación de señal fluorescente (reacción 3) en la reacción secundaria. Cuando el ácido nucleico diana se amplifica con cebadores específicos, una sonda de detección específica con una secuencia de solapa se une débilmente al amplicón. La presencia del oligonucleótido invasivo específico en el sitio de unión a la diana provoca que una nucleasa 5',p. ej.,una endonucleasa FEN-1, libere la secuencia de solapa mediante el corte entre la sonda de detección y la secuencia de solapa. La secuencia de solapa complementaria a una porción sin horquilla de un casete FRET correspondiente. En consecuencia, la secuencia del flap funciona como un oligonucleótido invasivo en el casete de FRET y efectúa una escisión entre el fluoróforo del casete de FRET y un inactivador, que produce una señal fluorescente. La reacción de escisión puede cortar múltiples sondas por diana y, por lo tanto, liberar múltiples fluoróforos por flap, lo que proporciona una amplificación exponencial de la señal. QuARTS puede detectar múltiples objetivos en un solo pocillo de reacción mediante el uso de casetes de FRET con diferentes colorantes. Véase,p. ej.,en Zou y col. (2010) “ Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology” Clin Chem 56: A199).

[0107]La expresión “ reactivo de bisulfito” se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles como se describe en la presente memoria para distinguir entre secuencias de dinucleótidos de CpG metilados y no metilados. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica(p.e., las patentes PCT/EP2004/011715 y WO 2013/116375). El tratamiento con bisulfito se puede llevar a cabo en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero sin limitarse a, n-alquilenglicol o dietilenglicol dimetil éter (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. Los disolventes desnaturalizantes se pueden utilizar en concentraciones entre el 1 % y el 35 % (v/v). La reacción de bisulfito se puede llevar a cabo en presencia de depuradores tales como, pero sin limitarse a, derivados de cromano,p. ej.,ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico o ácido de trihidroxibenzona y derivados de los mismos,p. ej.,ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La reacción de bisulfito puede comprender el tratamiento con hidrogenosulfito de amonio,p. ej.,como se describe en la patente WO 2013/116375.

[0108]El ADN tratado con bisulfito se puede purificar antes de la cuantificación. Esto puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la técnica, como, entre otros, ultrafiltración,p. ej.,por medio de columnas Microcon™ (fabricadas por Millipore™). La purificación se lleva a cabo según un protocolo modificado del fabricante (véase,p. ej.,PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito puede unirse a un soporte sólido,p. ej.,una perla magnética, y la desulfonación y el lavado se producen mientras el ADN está unido al soporte. Tales ejemplos se proporcionan,p. ej.,en la patente WO 2013/116375. El ADN unido al soporte puede estar listo para un ensayo de metilación inmediatamente después de la desulfonación y el lavado en el soporte. El ADN desulfonado puede eluirse del soporte antes del ensayo.

[0109]Los fragmentos del ADN tratado pueden amplificarse utilizando conjuntos de oligonucleótidos cebadores según la presente descripción(p. ej.,véase la tabla 2) y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN se puede llevar a cabo simultáneamente en un recipiente de reacción. Típicamente, la amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

[0110]El estado de metilación de las posiciones de CpG dentro o cerca de un marcador puede detectarse mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito,p. ej.,en las patentes US-5.786.146 y US-6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estado de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que se hibrida con un dinucleótido de CpG tratado con bisulfito. Por tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido de CpG. Los cebadores MSP específicos para ADN no metilado contienen una “T” en la posición correspondiente a la posición C en el CpG.

[0111]Los fragmentos obtenidos mediante la amplificación pueden llevar un marcador directa o indirectamente detectable. Los marcadores pueden ser marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas desmontables que tienen una masa típica que se puede detectar en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, se puede proporcionar que los amplicones marcados tengan una sola carga neta positiva o negativa, lo que permite una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse por medio de,p. ej.,espectrometría de masas de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDl) o utilizando espectrometría de masas de electropulverización (ESI, por sus siglas en inglés).

[0112]Los métodos para aislar ADN adecuados para estas tecnologías de ensayo son conocidos en la técnica. En particular, el aislamiento de ácidos nucleicos, como se describe en la solicitud de patente pat. estadounidense con n.° de serie US-13/470.251 (“ Isolation of Nucleic Acids” , publicada como U<s>-2012/0288868) puede estar comprendido.

[0113]Los marcadores descritos en la presente memoria pueden ser útiles en los ensayos QuARTS realizados en muestras de heces. Se pueden proporcionar métodos para producir muestras de ADN y, en particular, métodos para producir muestras de ADN que comprendan ácidos nucleicos altamente purificados y de baja abundancia en un volumen pequeño(p. ej.,menos de 100, menos de 60 microlitros) y que estén sustancialmente y/o eficazmente libres de sustancias que inhiban los ensayos utilizados para analizar las muestras de ADN(p. ej.,ensayos de PCR, INVADER, QuARTS,etc.).Tales muestras de ADN encuentran uso en ensayos de diagnóstico que detectan cualitativamente la presencia de, o miden cuantitativamente la actividad, expresión o cantidad de, un gen, una variante génica(p. ej.,un alelo) o una modificación genética(p. ej.,metilación) presente en una muestra tomada de un paciente. Por ejemplo, algunos cánceres se correlacionan con la presencia de alelos mutantes particulares o estados de metilación particulares y, por lo tanto, la detección y/o cuantificación de tales alelos mutantes o estados de metilación tiene un valor predictivo en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

[0114]Muchos marcadores genéticos valiosos están presentes en cantidades extremadamente bajas en las muestras y muchos de los eventos que producen tales marcadores son poco frecuentes. En consecuencia, incluso los métodos de detección sensibles, como la PCR, requieren una gran cantidad de ADN para proporcionar una diana de baja abundancia suficiente para cumplir o reemplazar el umbral de detección del ensayo. Además, la presencia de cantidades incluso bajas de sustancias inhibidoras compromete la exactitud y precisión de estos ensayos dirigidos a detectar cantidades tan bajas de una diana. En consecuencia, en la presente memoria se proporcionan métodos que proporcionan la gestión requerida del volumen y la concentración para producir tales muestras de ADN.

[0115]Algunas muestras biológicas, como las muestras de heces, contienen una amplia variedad de compuestos diferentes que inhiben la PCR. Por lo tanto, los procedimientos de extracción de ADN incluyen métodos para eliminar y/o inactivar los inhibidores de la PCR. Como tal, el procesamiento y la preparación de muestras y, en particular, pero no exclusivamente, los métodos, sistemas y kits para eliminar los inhibidores del ensayo de muestras que comprenden ácidos nucleicos se describen en el ejemplo 1.

[0116]La muestra puede comprender sangre, suero, plasma, secreciones gástricas, jugo pancreático, muestras de biopsia,p. ej.,de cánceres gastrointestinales, pulmonares y de otro tipo, células microdisecadas de una biopsia, células desprendidas en el lumen y/o células recuperadas de las heces. El sujeto puede ser humano. La muestra puede incluir células, secreciones o tejidos de, por ejemplo, el pulmón, el hígado, los conductos biliares, el páncreas, el estómago, el colon, el recto, el esófago, el intestino delgado, el apéndice, el duodeno, los pólipos, la vesícula biliar, el ano y/o el peritoneo. La muestra puede comprender líquido celular, ascitis, orina, heces, líquido pancreático, líquido obtenido durante la endoscopia, sangre, moco o saliva. La muestra puede ser una muestra de heces.

[0117]Dichas muestras se pueden obtener por cualquier número de medios conocidos en la técnica, como será evidente para el experto en la materia. Por ejemplo, las muestras de orina y heces se obtienen fácilmente, mientras que las muestras de sangre, ascitis, suero o líquido pancreático se pueden obtener por vía parenteral utilizando, por ejemplo, una aguja y una jeringa. Las muestras libres de células o sustancialmente libres de células se pueden obtener sometiendo la muestra a diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, centrifugación y filtración. Aunque generalmente se prefiere que no se usen técnicas invasivas para obtener la muestra, aún puede ser preferible obtener muestras como homogeneizados de tejido, secciones de tejido y muestras de biopsia. La tecnología no está limitada en los métodos utilizados para preparar las muestras y proporcionar un ácido nucleico para la prueba. Por ejemplo, un ADN puede aislarse de una muestra de heces o de sangre o de una muestra de plasma utilizando captura génica directa,p. ej.,como se detalla en la patente US-8.808.990 y US-9.169.511, y en la patente WO 2012/155072, o mediante un método relacionado.

[0118]El análisis de marcadores se puede realizar por separado o simultáneamente con marcadores adicionales dentro de una muestra de prueba. Por ejemplo, se pueden combinar varios marcadores en una sola prueba para un procesamiento eficiente de múltiples muestras y para proporcionar potencialmente una mayor precisión diagnóstica y/o pronóstica. Además, un experto en la técnica reconocería el valor de probar múltiples muestras (por ejemplo, en puntos de tiempo sucesivos) del mismo sujeto. Dicha prueba de muestras en serie puede permitir la identificación de cambios en los estados de metilación del marcador a lo largo del tiempo. Los cambios en el estado de metilación, así como la ausencia de cambios en el estado de metilación, pueden brindar información útil sobre el estado de la enfermedad que incluye, entre otros, identificar el tiempo aproximado desde el inicio del evento, la presencia y la cantidad de tejido salvable, la idoneidad de las terapias farmacológicas, la eficacia de varias terapias y la identificación del resultado del sujeto, incluido el riesgo de eventos futuros.

[0119]El análisis de biomarcadores se puede llevar a cabo en una variedad de formatos físicos. Por ejemplo, se puede utilizar el uso de placas de microtitulación o la automatización para facilitar el procesamiento de un gran número de muestras de prueba. Como alternativa, se podrían desarrollar formatos de muestra única para facilitar el tratamiento y diagnóstico inmediatos de manera oportuna, por ejemplo, en transporte ambulatorio o salas de urgencias.

[0120]La tecnología se puede proporcionar en forma de un kit. Los kits pueden comprender las composiciones, dispositivos, aparatos,etc.descritos en la presente memoria, e instrucciones para el uso del kit. Tales instrucciones describen métodos apropiados para preparar un analito a partir de una muestra,p. ej.,para recolectar una muestra y preparar un ácido nucleico a partir de la muestra. Los componentes individuales del kit se envasan en recipientes y envases apropiados(p. ej.,viales, cajas, blísteres, ampollas, frascos, botellas, tubos y similares) y los componentes se envasan juntos en un recipiente apropiado(p. ej.,una caja o cajas) para un almacenamiento, envío y/o uso conveniente por parte del usuario del kit. Se entiende que los componentes líquidos(p. ej.,un tampón) pueden proporcionarse en forma liofilizada para ser reconstituidos por el usuario. Los kits pueden incluir un control o referencia para evaluar, validar y/o garantizar el rendimiento del kit. Por ejemplo, un kit para analizar la cantidad de un ácido nucleico presente en una muestra puede incluir un control que comprenda una concentración conocida del mismo u otro ácido nucleico para su comparación y, p. ej., un reactivo de detección(p. ej.,un cebador) específico para el ácido nucleico de control. Los kits son apropiados para su uso en un entorno clínico y, por ejemplo, para su uso en el hogar de un usuario. Los componentes de un kit pueden proporcionar las funcionalidades de un sistema para preparar una solución de ácido nucleico a partir de una muestra. El usuario puede proporcionar ciertos componentes del sistema.

III. Otras aplicaciones

[0121]Los ensayos de diagnóstico pueden identificar la presencia de una enfermedad o afección en un individuo. La enfermedad puede ser cáncer(p. ej.,cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer del sistema gastrointestinal).

[0122]La presente descripción no se limita a marcadores particulares. Se pueden utilizar marcadores cuya metilación aberrante esté asociada con una neoplasia(p. ej.,uno o más devimentina, septina 9, NDRG4).Un ensayo puede comprender además la detección de genes KRAS mutados (véase,p. ej.,el ejemplo 1). Los ensayos pueden comprender además la detección de hemoglobina en muestras de heces (véasep. ej.,ejemplo 1).

[0123]La tecnología se refiere a un método para tratar a un paciente(p. ej.,un paciente con cáncer, con cáncer en etapa temprana o que puede desarrollar cáncer), comprendiendo el método determinar el estado de metilación de uno o más marcadores como se proporcionan en la presente memoria y administrar un tratamiento al paciente basado en los resultados de la determinación del estado de metilación. El tratamiento puede ser la administración de un compuesto farmacéutico, una vacuna, realizar una cirugía, obtener imágenes del paciente, realizar otra prueba. Preferiblemente, dicho uso es en un método de detección clínica, un método de evaluación de pronóstico, un método de seguimiento de los resultados del tratamiento, un método para identificar a los pacientes con mayor probabilidad de responder a un tratamiento terapéutico particular, un método de obtención de imágenes de un paciente o sujeto y un método para el cribado y desarrollo de fármacos.

[0124]Se proporciona un método para diagnosticar cáncer en un sujeto. Los términos “ diagnóstico” y “ diagnóstico” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a métodos mediante los cuales el experto en la técnica puede estimar e incluso determinar si un sujeto sufre o no una determinada enfermedad o afección o puede desarrollar una determinada enfermedad o afección en el futuro. El experto en la técnica frecuentemente realiza un diagnóstico basándose en uno o más indicadores de diagnóstico, como p. ej. un biomarcador(p. ej.,los descritos en la presente memoria), cuyo estado de metilación es indicativo de la presencia, gravedad o ausencia de la afección.

[0125]Junto con el diagnóstico, el pronóstico clínico del cáncer se relaciona con la determinación de la agresividad del cáncer y la probabilidad de recurrencia del tumor para planificar la terapia más eficaz. Si se puede hacer un pronóstico más preciso o incluso se puede evaluar un riesgo potencial de desarrollar el cáncer, se puede elegir la terapia adecuada y, en algunos casos, una terapia menos agresiva para el paciente. La evaluación (p. ej.,determinar el estado de metilación) de los biomarcadores de cáncer es útil para separar a los sujetos con buen pronóstico y/o bajo riesgo de desarrollar cáncer que no necesitarán terapia o terapia limitada de aquellos con más probabilidades de desarrollar cáncer o sufrir una recurrencia de cáncer que podrían beneficiarse de tratamientos más intensivos.

[0126]Como tal, “ hacer un diagnóstico” o “ diagnosticar” , como se utiliza en la presente memoria, incluye además determinar un riesgo de desarrollar cáncer o determinar un pronóstico, lo que puede proporcionar la predicción de un resultado clínico (con o sin tratamiento médico), seleccionar un tratamiento apropiado (o si el tratamiento sería eficaz), o monitorear un tratamiento actual y potencialmente cambiar el tratamiento, en función de la medida de los biomarcadores de diagnóstico(p. ej.,los descritos en la presente memoria) descritos en la presente memoria. Además, se pueden realizar múltiples determinaciones de los biomarcadores a lo largo del tiempo para facilitar el diagnóstico y/o el pronóstico. Se puede utilizar un cambio temporal en el biomarcador para predecir un resultado clínico, monitorizar la progresión del cáncer y/o monitorizar la eficacia de las terapias apropiadas dirigidas contra el cáncer. En tales circunstancias, se podría esperar ver un cambio en el estado de mutilación de uno o más biomarcadores descritos en la presente memoria (y potencialmente uno o más biomarcador(es) adicional(es), si se controlan) en una muestra biológica a lo largo del tiempo durante el curso de una terapia eficaz.

[0127]El objeto descrito en la presente memoria proporciona además un método para determinar si iniciar o continuar la profilaxis o el tratamiento de un cáncer en un sujeto. El método puede comprender proporcionar una serie de muestras biológicas durante un período de tiempo del sujeto; analizar la serie de muestras biológicas para determinar un estado de metilación de al menos un biomarcador descrito en la presente memoria en cada una de las muestras biológicas; y comparar cualquier cambio medible en los estados de metilación de uno o más de los biomarcadores en cada una de las muestras biológicas. Cualquier cambio en los estados de metilación de los biomarcadores durante el periodo de tiempo se puede utilizar para predecir el riesgo de desarrollar cáncer, predecir el resultado clínico, determinar si se debe iniciar o continuar la profilaxis o la terapia del cáncer y si una terapia actual está tratando el cáncer de manera eficaz. Por ejemplo, se puede seleccionar un primer punto de tiempo antes del inicio de un tratamiento y se puede seleccionar un segundo punto de tiempo en algún momento después del inicio del tratamiento. Los estados de metilación se pueden medir en cada una de las muestras tomadas de diferentes puntos de tiempo y se pueden observar las diferencias cualitativas y/o cuantitativas. Un cambio en los estados de metilación de los niveles de biomarcadores de las diferentes muestras se puede correlacionar con el riesgo de cáncer, el pronóstico, la determinación de la eficacia del tratamiento y/o la progresión del cáncer en el sujeto.

[0128]Los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden ser para el tratamiento o diagnóstico de la enfermedad en una etapa temprana, por ejemplo, antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad. Los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden ser para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad en una etapa clínica.

[0129]Como se señaló, se pueden realizar múltiples determinaciones de uno o más biomarcadores de diagnóstico o pronóstico, y se puede utilizar un cambio temporal en el marcador para determinar un diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, se puede determinar un marcador de diagnóstico en un momento inicial y de nuevo en un segundo momento. En tales circunstancias, un aumento en el marcador desde el tiempo inicial hasta el segundo tiempo puede ser un diagnóstico de un tipo o gravedad particular de cáncer, o un pronóstico dado. Asimismo, una disminución en el marcador desde el tiempo inicial hasta el segundo tiempo puede ser indicativo de un tipo o gravedad particular de cáncer, o de un pronóstico determinado. Además, el grado de cambio de uno o más marcadores puede estar relacionado con la gravedad del cáncer y futuros acontecimientos adversos. El experto en la técnica entenderá que, si bien se pueden realizar mediciones comparativas del mismo biomarcador en múltiples puntos de tiempo, también se puede medir un biomarcador dado en un punto de tiempo y un segundo biomarcador en un segundo punto de tiempo, y una comparación de estos marcadores puede proporcionar información de diagnóstico.

[0130]Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ determinar el pronóstico” se refiere a métodos mediante los cuales el experto en la técnica puede predecir el curso o el resultado de una afección en un sujeto. El término “ pronóstico” no se refiere a la capacidad de predecir el curso o el resultado de una afección con un 100 % de precisión, o incluso que un curso o resultado determinado sea previsiblemente más o menos probable en función del estado de metilación de un biomarcador. En su lugar, el experto en la técnica entenderá que el término “ pronóstico” se refiere a una mayor probabilidad de que ocurra un cierto curso o resultado; es decir, que es más probable que ocurra un curso o resultado en un sujeto que muestra una afección dada, en comparación con aquellos individuos que no presentan la afección. Por ejemplo, en personas que no presentan la afección(p. ej.,que tienen un estado de metilación normal de uno o más genes diana), la probabilidad de un resultado determinado(p. ej.,padecer un cáncer) puede ser muy baja. Un análisis estadístico puede asociar un indicador de pronóstico con una predisposición a un resultado adverso. Por ejemplo, un estado de metilación diferente al de una muestra de control normal obtenida de un paciente que no tiene cáncer puede indicar que es más probable que un sujeto sufra cáncer que sujetos con un nivel que es más similar al estado de metilación en la muestra de control, determinado por un nivel de significación estadística. Además, un cambio en el estado de metilación desde un nivel inicial(p. ej.,“ normal” ) puede reflejar el pronóstico del sujeto, y el grado de cambio en el estado de metilación puede estar relacionado con la gravedad de los acontecimientos adversos. La significación estadística a menudo se determina comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valorp.Véase,p. ej.,Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley y Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza ilustrativos de la presente materia son 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % y 99,99 %, mientras que valores depilustrativos son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

[0131]Se puede establecer un grado umbral de cambio en el estado de metilación de un biomarcador de pronóstico o diagnóstico descrito en la presente memoria, y el grado de cambio en el estado de metilación del biomarcador en una muestra biológica se compara simplemente con el grado umbral de cambio en el estado de metilación. Un cambio de umbral preferido en el estado de metilación para los biomarcadores proporcionados en la presente memoria es de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 100 % y aproximadamente el 150 %. Se puede establecer un “ nomograma” , mediante el cual un estado de mutilación de un indicador pronóstico o diagnóstico (biomarcador o combinación de biomarcadores) está directamente relacionado con una disposición asociada hacia un resultado dado. El experto en la técnica está familiarizado con el uso de dichos nomogramas para relacionar dos valores numéricos con el entendimiento de que la incertidumbre en esta medición es la misma que la incertidumbre en la concentración del marcador porque se hace referencia a mediciones de muestras individuales, no a promedios de población.

[0132]Una muestra de control puede analizarse simultáneamente con la muestra biológica, de tal modo que los resultados obtenidos de la muestra biológica puedan compararse con los resultados obtenidos de la muestra de control. Además, se contempla que se puedan proporcionar curvas patrón con las que se puedan comparar los resultados del ensayo para la muestra biológica. Estas curvas patrón presentan los estados de metilación de un biomarcador en función de las unidades de ensayo,p. ej.,la intensidad de la señal fluorescente, si se utiliza un marcador fluorescente. Mediante muestras tomadas de múltiples donantes, se pueden proporcionar curvas estándar para controlar los estados de metilación del uno o más biomarcadores en tejido normal, así como para los niveles “ en riesgo” del uno o más biomarcadores en tejido tomado de donantes con metaplasia o de donantes con un cáncer. En determinados métodos, se puede identificar que un sujeto tiene metaplasia al identificar un estado de metilación aberrante de uno o más marcadores proporcionados en la presente en una muestra biológica obtenida del sujeto. En otros métodos, la detección de un estado de metilación aberrante de uno o más de tales biomarcadores en una muestra biológica obtenida del sujeto puede dar como resultado que se identifique que el sujeto tiene cáncer.

[0133]Se puede diagnosticar que el sujeto tiene un cáncer si, en comparación con un estado de metilación de control, hay una diferencia medible en el estado de metilación de al menos un biomarcador en la muestra. Por el contrario, cuando no se identifica ningún cambio en el estado de metilación en la muestra biológica, se puede identificar que el sujeto no tiene cáncer, no está en riesgo de cáncer o tiene un bajo riesgo de cáncer. A este respecto, los sujetos que tienen cáncer o riesgo del mismo pueden diferenciarse de sujetos que tienen cáncer o riesgo de cáncer bajo o sustancialmente nulo. Aquellos sujetos que tienen un riesgo de desarrollar un cáncer particular,p. ej.,cáncer gastrointestinal, se pueden colocar en un programa de detección más intensivo y/o regular, que incluye,p. ej.,vigilancia endoscópica. Por otro lado, aquellos sujetos que tienen de bajo a sustancialmente ningún riesgo pueden evitar ser sometidos a métodos de detección invasivos tales como endos momento en que una detección futura, por ejemplo, una detección realizada según la presente tecnología, indique que ha aparecido un riesgo de cáncer en esos sujetos.

[0134]Como se mencionó anteriormente, dependiendo de los métodos de la presente tecnología, la detección de un cambio en el estado de metilación del uno o más biomarcadores puede ser una determinación cualitativa o puede ser una determinación cuantitativa. Como tal, el paso de diagnosticar a un sujeto que tiene, o corre el riesgo de desarrollar, un cáncer indica que se realizan ciertas mediciones de umbral,p. ej.,el estado de metilación de uno o más biomarcadores en la muestra biológica varía con respecto a un estado de metilación de control predeterminado. El estado de metilación de control puede ser cualquier estado de metilación detectable del biomarcador. En otros métodos en los que una muestra de control se analiza simultáneamente con la muestra biológica, el estado de metilación predeterminado puede ser el estado de metilación en la muestra de control. En otros métodos, el estado de metilación predeterminado puede basarse en y/o identificarse mediante una curva estándar. En otros métodos, el estado de metilación predeterminado puede ser un estado o intervalo de estado específico. Como tal, se puede elegir el estado de metilación predeterminado, dentro de límites aceptables que resultarán evidentes para los expertos en la técnica, basándose en parte en el método que se está practicando y la especificidad deseada, etc.

[0135]Además, con respecto a los métodos de diagnóstico, un sujeto preferido es un sujeto vertebrado. Un vertebrado preferido es uno de sangre caliente; un vertebrado de sangre caliente preferido es un mamífero. Un mamífero preferido es más preferiblemente un ser humano. Como se utiliza en la presente memoria, el término “ sujeto” incluye tanto sujetos humanos como animales. Por lo tanto, en la presente memoria se proporcionan usos terapéuticos veterinarios. Como tal, la presente tecnología permite el diagnóstico de mamíferos como los humanos, así como de aquellos mamíferos de importancia por estar en peligro de extinción, como los tigres siberianos; de importancia económica, como animales criados en granjas para el consumo humano; y/o animales de importancia social para los seres humanos, como animales que se mantienen como mascotas o en zoológicos. Algunos ejemplos de dichos animales incluyen, pero no se limitan a: carnívoros tales como gatos y perros; cerdos, incluidos cerdos y jabalíes; rumiantes y/o ungulados, tales como vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos; pinnípedos y caballos. Por lo tanto, también se proporciona el diagnóstico y tratamiento de ganado, incluidos, entre otros, cerdos domesticados, rumiantes, ungulados, caballos (incluidos caballos de carreras) y similares. El objeto descrito en la presente memoria incluye además un sistema para diagnosticar un cáncer gastrointestinal, pulmonar u otros cánceres en un sujeto. El sistema puede proporcionarse, por ejemplo, como un kit comercial que puede utilizarse para detectar un riesgo de cáncer o diagnosticar un cáncer en un sujeto del que se ha recolectado una muestra biológica. Un sistema ilustrativo proporcionado según la presente tecnología incluye evaluar el estado de metilación de un marcador descrito en la presente memoria.

[0136]Las composiciones, mezclas de reacción y/o métodos descritos en la presente memoria pueden ser útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico, médicas, analíticas y de investigación, y la invención no debe considerarse limitada a ningún campo o uso particular. Sin embargo, la presente invención encuentra uso en el análisis, detección, caracterización,etc.de ácido nucleico(p. ej.,ácido nucleico humano, ácido nucleico diana,etc.)de las heces. Las composiciones, métodos, dispositivos,etc.para utilizarse como se describe en la presente memoria se encuentran, por ejemplo, en las patentes US-8.361.720; US-7.981.612; US-7.368.233; US-6.964.846 US-6.919.174 US-6.849.403 US-6.844.155; US-6.818.404; US-6.750.020; US-6.586.177; US-6.551.777 US-6.503.718 US-6.498.012 US-6.482.595; US-6.475.738; US-6.428.964; US-6.415.455; US-6.406.857 US-6.351.857 US-6.303.304 US-6.300.077; US-6.280.947; US-6.268.136; US-6.203.993; US-6.146.828 US-6.143.529 US-6.020.137 US-5.952.178; US-5.928.870; US-5.888.778; US-5.830.665; US-5.741.650 US-5.670.325. Las composiciones y métodos descritos en la presente memoria pueden encontrar uso, por ejemplo, en un ensayo cuantitativo de amplificación de señal y diana en tiempo real específico de alelo (ensayo Q<ua>R<t>S), como se describe,p. ej.,en las solicitudes de patente U<s>-8.361.720; U<s>-8.715.937; US-8.916.344; y US-9.212.392.

Experimental

[0137]Durante el desarrollo de la tecnología relacionada con las pruebas del cáncer,p. ej.,el cáncer de pulmón, los experimentos sugirieron que el uso de un ADN de control metilado proporcionaría una prueba mejorada. En consecuencia, en la presente memoria se proporcionan tecnologías que comprenden dianas de control del ADN metilado que generan señales específicas cuando se procesan y detectan en paralelo con las dianas experimentales(p. ej.,genes marcadores metilados) en una muestra(p. ej.,de un paciente). En particular, los controles proporcionados en la presente memoria comprenden diversas dianas de ácidos nucleicos que se extraen de una muestra en paralelo con uno o más ADN marcadores, que se convierten durante la conversión con bisulfito y que presentan una secuencia convertida para su detección mediante ensayos de detección de ácidos nucleicos,p. ej.,ensayos de metilación de los QuARTS.

Ejemplo 1

Métodos de preparación de muestras

Métodos para el aislamiento de ADN y el ensayo de QUARTS

[0138]A continuación, se proporciona un método ilustrativo para el aislamiento de ADN antes del análisis, y un ensayo de QuARTS ilustrativo, tal como se puede utilizar según la tecnología. La aplicación de la tecnología QuARTS al ADN de heces y diversas muestras de tejido se describe en este ejemplo, pero la tecnología se aplica fácilmente a otras muestras de ácido nucleico, p. ej., como se muestra en otros ejemplos.

[0139]Opcionalmente, se puede añadir ADN de pez cebra,p. ej.,ADN sintético, a las muestras como se describe en la presente memoria como un control de ejecución para el ensayo de aislamiento, conversión con bisulfito y/o detección de ADN. Por ejemplo, 100 pl de 120 copias/pl de ADN de pez cebra metilado sintético en 0,4 ng/pl de diluyente de ADN de pez (ADN genómico a granel aislado de salmón, bacalao y/o arenque, como se describe,p. ej.,en la patente US-9.212.392) puede añadirse a una muestra,p. ej.,una muestra de plasma, antes de la adición de un tampón de lisis, antes o después de la adición de proteinasa K,etc.y detectarse junto con los ADN marcadores y de referencia.

Colección de ADN diana de muestras de heces.

[0140]Las heces enteras se recolectan en cubos de plástico. Se añade a las heces un tampón conservante,p. ej.,150 mM de EDTA, Tris-500 mM de Cl 10 mM de y de NaCl (pH 9,0),p. ej.,a aproximadamente 4 ml por gramo de heces, y las heces tamponadas pueden utilizarse directamente o archivarse a -80 °C.

[0141]Procedimiento ilustrativo para el aislamiento de ácidos nucleicos diana a partir de muestras de heces: 1. Una muestra de heces se homogeneiza,p. ej.,con un tampón, para formar un homogeneizado de heces. El homogeneizado se trató para dividir los sólidos residuales del fluido,p. ej.,mediante centrifugación o filtración, para producir un “sobrenadante fecal” .

2. El sobrenadante de las heces se trata para eliminar los inhibidores del ensayo(p. ej.,con polivinilpolipirrolidona, como se describe en la patente US-8.993.341), que produce un “sobrenadante clarificado” .

3. Se mezclan diez mililitros de sobrenadante clarificado (que representan un equivalente a aproximadamente 4 gramos de heces) con tiocianato de guanidina (GTC) hasta una concentración final de 2,4 M;

4. La mezcla se calienta después en un baño de agua a 90 °C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN (y las proteínas) presentes en las heces.

5. Se añaden a la muestra partículas paramagnéticas que contienen oligonucleótidos unidos covalentemente (acoplados) complementarios a la(s) secuencia(s) diana de interés (“ sondas de captura específicas de la diana” ). La muestra se incuba después(p. ej., atemperatura ambiente, aproximadamente 22-25 °C) durante una hora para permitir la hibridación del ADN diana con las sondas de captura en las partículas magnéticas.

6. La mezcla de sobrenadante clarificado, GTC y partículas se expone a un campo magnético para separar las partículas (que ahora contienen el ADN diana hibridado con las sondas de captura) de la mezcla de sobrenadante fecal y GTC, que se transfiere a un tubo nuevo. Véase,p. ej.,la patente US-2012/0262260A1.

[0142]El ciclo de desnaturalización/hibridación/separación (pasos 4-6) puede repetirse,p. ej.,al menos cuatro o más veces para extraer en serie diferentes ADN diana de la misma muestra sobrenadante de heces.

ADN tisular FFPE

[0143]El ADN del tejido fijado con formalina y embebido en parafina(FFPE)se aísla utilizando el kit de tejidos QIAamp DNA FFPE (Qiagen Sciences, Germantown, MD).

Aislamiento de ADN de células y plasma

[0144]Para las líneas celulares, el ADN genómico puede aislarse de medios acondicionados celulares utilizando, por ejemplo, el kit de plasma “ Maxwell® RSC ccfDNA Plasma (Promega Corp., Madison, WI). Siguiendo el protocolo del kit, se utiliza 1 ml de medio acondicionado celular (RCC) en lugar de plasma y se procesa según el procedimiento del kit.

[0145]Un procedimiento ilustrativo alternativo para aislar el ADN del plasma es el siguiente:

• A una muestra de 4 ml de plasma, se añaden 300 pl de proteinasa K (20 mg/ml) y se mezcla.

• Añadir 3 pl de 1 pg/pl de diluyente de ADN de pescado a la mezcla de plasma-proteinasa K.

• Añadir 2 ml de tampón de lisis de plasma al plasma.

El tampón de lisis plasmática es:

- tiocianato de guanidina 4,3 M

- 10 % de IGEPAL CA-630 (octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol, ramificado)

(5,3 g de IGEPAL CA-630 combinados con 45 ml de tiocianato de guanidina 4,8 M)

Incubar las mezclas a 55 °C durante 1 hora con agitación a 500 rpm.

Añadir 3 ml de tampón de lisis de plasma y mezclar.

Añadir 200 pL de perlas magnéticas de unión a sílice (16 pg de perlas/pL} y mezclar de nuevo.

Añadir 2 ml de isopropanol al 100 % y mezclar.

Incubar a 30 °C durante 30 minutos con agitación a 500 rpm.

Colocar el (los) tubo(s) en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante.

• Añadir 750 pl de GuHCl-EtOH al recipiente que contiene las perlas de unión y mezclar.

El tampón de lavado de GuHCl-EtOH es:

- GuHCl 3M (clorhidrato de guanidina)

- EtOH al 57 % (alcohol etílico)

• Agitar a 400 rpm durante 1 minuto.

• Transferir las muestras a una placa de pocillos profundos o tubos de microcentrífuga de 2 ml.

• Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante.

Añadir 1000 |jl de tampón de lavado (Tris 10 mM de HCl, EtOH al 80 %) a los glóbulos, e incubar a 30 °C urante 3 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante. Añadir 500 j l de tampón de lavado a los glóbulos e incubar a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante. Añadir 250 j l de tampón de lavado e incubar a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el tampón restante. Añadir 250 j l de tampón de lavado e incubar a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen. Aspirar y desechar el tampón restante. Secar los glóbulos a 70 °C durante 15 minutos, con agitación.

Añadir 125 j l de tampón de elución (Tris 10 mM de HCl, pH 8,0, 0,1 mM de EDTA) a los glóbulos e incubar 65 °C durante 25 minutos con agitación.

Colocar los tubos en el imán y dejar que los glóbulos se acumulen durante 10 minutos.

Aspirar y transferir el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo recipiente o tubo.

Conversión de ADN con bisulfito

[0146]El ADN para las pruebas de metilación se trata con bisulfito utilizando,p. ej.,el kit de metilación de ADN EZ-96 (Zymo Research, Irvine CA) o utilizando sulfito de hidrógeno de amonio como se describe en la patente US-9.315.853.

[0147]Un método ilustrativo para tratar el ADN con un reactivo de bisulfito para convertir residuos de citosina no metilados es el siguiente:

I. Sulfonación de ADN utilizando sulfito de hidrógeno de amonio

1. En cada tubo, combinar 64 j l de ADN, 7 j l de NaOH 1 N y 9 j l de solución portadora que contiene 0,2 mg/ml de BSA y 0,25 mg/ml de ADN de pescado.

2. Incubar a 42 °C durante 20 minutos.

3. Añadir 120 j l de sulfito de hidrógeno de amonio al 45 % e incubar a 66 °C durante 75 minutos.

4. Incubar a 4 °C durante 10 minutos.

II Desulfonación utilizando glóbulos magnéticos

Materiales

[0148]Glóbulos magnéticos (partículas paramagnéticas de Promega MagneSil, número de catálogo Promega AS1050, 16 jg /jl).

Tampón de unión: 6,5-7 M de clorhidrato de guanidina.

Tampón de lavado después de conversión: Etanol al 80 % con 10 mM de Tris HCl (pH 8,0).

Tampón de desulfonación; Se seleccionó alcohol isopropílico al 70 %, NaOH 0,1 N para el tampón de desulfonación.

[0149]Las muestras se mezclan utilizando cualquier dispositivo o tecnología apropiado para mezclar o incubar muestras a las temperaturas y velocidades de mezcla esencialmente como se describe a continuación. Por ejemplo, puede utilizarse un Thermomixer (Eppendorf) para la mezcla o incubación de muestras. Una desulfonación ilustrativa es la siguiente:

1. Mezclar bien la reserva de glóbulos agitando la botella durante 1 minuto.

2. Alícuota de 50 j l de glóbulos en un tubo de 2,0 ml (p. ej., de USA Scientific).

3. Añadir 750 j l de tampón de unión a los glóbulos.

4. Añadir 150 j l de ADN sulfonado del paso I.

5. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 30 minutos).

6. Colocar el tubo en el soporte del imán y dejarlo en el lugar durante 5 minutos. Con los tubos en el soporte, retirar y desechar el sobrenadante.

7. Añadir 1.000 j l de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

8. Colocar el tubo en el soporte del imán y dejarlo en el lugar durante 5 minutos. Con los tubos en el soporte, retirar y desechar el sobrenadante.

9. Añadir 250 j l de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

10. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

11. Añadir 200 j l de tampón de desulfonación. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 5 minutos).

12. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

13. Añadir 250 j l de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

14. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

15. Añadir 250 j l de tampón de lavado al tubo. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30 °C durante 3 minutos).

16. Colocar el tubo en el soporte magnético; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

17. Incubar todos los tubos a 30 °C con la tapa abierta durante 15 minutos.

18. Retirar el tubo del soporte magnético y añadir 70 j l de tampón de elución directamente a los glóbulos. 19. Incubar los glóbulos con tampón de elución (p. ej., 1000 RPM a 40 °C durante 45 minutos).

20. Colocar los tubos en el soporte magnético durante aproximadamente un minuto; eliminar y guardar el sobrenadante.

[0150]El ADN convertido se utiliza después en ensayos de preamplificación y/o endonucleasa de solapa, como se describe a continuación.

Ensayo de endonucleasa de solapa QuARTS

[0151]La tecnología QuARTS combina un proceso de amplificación de ADN diana basado en polimerasa con un proceso de amplificación de señal basado en escisión invasivo. Se describe la tecnología,p. ej.,en las patentes US-US-8.361.720; US-8.715.937; US-8.916.344; y US-9.212.392. La señal de fluorescencia generada por la reacción QuARTS se controla de una manera similar a la PCR en tiempo real y permite la cuantificación de la cantidad de un ácido nucleico diana en una muestra.

[0152]Una reacción de QuARTS ilustrativa típicamente comprende aproximadamente 400-600 nmol/l(p. ej.,500 nmol/l) de cada sonda de cebador y detección, aproximadamente 100 nmol/l del oligonucleótido invasivo, aproximadamente 600-700 nmol/l de cada casete de FRET (FAM,p. ej.,tal como se suministra comercialmente por Hologic, Inc.; HEX,p. ej.,como se suministra comercialmente por BioSearch Technologies; y Quasar 670,p. ej.,como se suministra c comercialmente por BioSearch Technologies), 6,675 ng/jl de endonucleasa FEN-1(p. ej.,Cleavase® 2.0, Hologic, Inc.), 1 unidad de ADN polimerasa Taq en un volumen de reacción de 30 j l(p. ej.,ADN polimerasa GoTaq®, Promega Corp., Madison, WI), 10 mmol/l de ácido 3-(n-morfolino) propanosulfónico (MOPS), 7,5 mmol/l de MgCh y 250 jmol/l de cada dNTP. Las condiciones de ciclado de QuARTS ejemplares son como se muestran en la tabla a continuación. En algunas aplicaciones, el análisis del ciclo de cuantificación (Cq) proporciona una medida de la cantidad inicial de cadenas de a Dn diana(p. ej.,número de copias) en la muestra.

Inmunoamplificación dirigida a multiplex de ADN convertido con bisulfito de gran volumen

[0153]Para preamplificar la mayoría o todo el ADN tratado con bisulfito de una muestra de entrada, se puede utilizar un gran volumen del ADN tratado en una única reacción de amplificación multiplexada de gran volumen. Por ejemplo, el ADN se extrae de una línea celular(p. ej.,línea celular DFCI032 (adenocarcinoma); línea celular H1755 (neuroendocrina)), utilizando, por ejemplo, el kit de sangre Maxwell Promega número AS1400, como se ha descrito anteriormente. El ADN se convierte con bisulfito,p. ej.,como se ha descrito anteriormente.

[0154]Se realiza una preamplificación, p. ej, en una mezcla de reacción que contiene 7,5 mM de MgCh, 10 mM de MOPS, 0,3 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,8 mM de KCl, 0,1 pg/pl de BSA, 0,0001 % de Tween-20, 0, 0001 % de IGEPAL CA-630, 250 pM cada dNTP, cebadores oligonucleotídicos((p. ej.,para 12 dianas, 12 pares de cebadores/24 cebadores, en cantidades equimolares (que incluyen, pero no se limitan a, los rangos de,p. ej.,200 500 nM cada cebador), o con concentraciones de cebador individuales ajustadas para equilibrar las eficiencias de amplificación de las diferentes regiones diana), 0,025 unidades/pl de concentración de GoTaq de inicio en caliente y 20 a 50 % en volumen de ADN diana tratado con bisulfito(p. ej.,10 pl de ADN diana en una mezcla de reacción de 50 pl, o 50 pl de ADN diana en una mezcla de reacción de 125 pl). Los tiempos y temperaturas de los ciclos térmicos se seleccionan para que sean apropiados para el volumen de la reacción y el recipiente de amplificación. Por ejemplo, las reacciones pueden realizarse en ciclos de la siguiente manera

[0155]Después del ciclo térmico, las alícuotas de la reacción de preamplificación(p. ej.,10 pl) se diluyen a 500 pl en 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM de EDTA, con o sin ADN de pescado. Las alícuotas del ADN preamplificado diluido(p. ej.,10 pl) se utilizan en un ensayo QuARTS PCR-de solapa,p. ej.,como se ha descrito anteriormente. Ejemplo 2

Prueba del ensayo B3GALT6 en ADN genómico humano convertido con bisulfito y ADN extraído de muestras de tejido de colon FFPE

[0156]El estándar universal de ADN humano metilado convertido con bisulfito, número de catálogo D5015 (Zymo research), se diluyó a 1 ng y 0,1 ng por pl en 20 ng/ul de ADN de pescado. El ADN de un tejido de colon se extrajo de muestras montadas en portaobjetos FFPE utilizando el protocolo miniKit de Qiagen y se trató con bisulfito utilizando el kit de conversión de ADN Zymo EZ número D5001.

[0157]Los plásmidos pUC57 digeridos con EcoRI que contenían un fragmento de inserción con la secuencia de B3GALT6 convertida con bisulfito o de beta-actina convertida con bisulfito se diluyeron en 20 ng/pl de ADN de pescado a niveles de 2000, 200, 20 y 2 cadenas/pl.

Procedimiento:

[0158]

1) Hacer la siguiente mezcla de 10X oligonucleótidos y mezcla de 20X enzimas: Mezcla de 10X oligonucleótidos 1 (B3GALT6 y p-actina biplex):

Mezcla de 20X enzimas:

200 mM de MOPS, pH 7,5,

150 mM de MgCh,

6,38 mM de Tris-HCl, pH 8,0,

15,94 mM de KCl,

2 |jg/|jl de BSA,

0,16 % de Tween-20,

0,16% de IGEPAL CA-630,

25 % de glicerol,

146 ng/jl de Cleavase 2.0,

1 unidad/jl de polimerasa HotStart GoTaq

2) Distribuya lo siguiente a los pozos en una placa de 96 pozos:

3) Sellar la placa con un precinto óptico, colocarla en el LightCycler 480 y ejecutar el perfil descrito a continuación:

Enfriamiento40 °C/30” 2,2 Ninguna

4) Calcular las cantidades de ADN genómico de Zymo y del ADN aislado de los tejidos basándose en los plásmidos calibradores presentes en cada mezcla de oligonucleótidos. Los datos se resumen en la siguiente tabla:

[0159]Estos datos muestran que la señal de B3GALT6 se observa tanto en el ADN genómico masivo como en el ADN extraído de muestras de tejido de colon FFPE.

Ejemplo 3

Prueba del ensayo de B3GALT6 en ADN extraído de muestras de tejido canceroso y normal

[0160]El ADN se extrajo de portaobjetos de FFPE de 32 muestras de tejido pulmonar utilizando el protocolo MiniKit de Qiagen, con ADN sintético de pez cebra-rassfl añadido como control del proceso. Las muestras se convirtieron con bisulfito con bisulfito de amonio, como se describe en el ejemplo 1. Para la calibración cuantitativa se utilizaron calibradores de plásmidos del pUC57 digerido con EcoRI que contenían insertos para el B3GALT6 convertido con bisulfito o la p-actina convertida con bisulfito, diluidos en 20 ng/pl de ADN de pescado. Los ensayos QuARTS tríplex se realizaron como se describe en el ejemplo 1.

[0161]Los resultados se muestran en la Figura 3. Se observa una buena correlación entre el B3GALT6 y la pactina en las muestras de pulmón. A medida que el ensayo detecta el ADN que se ha protegido de la conversión de secuencia mediante metilación, las diferencias en el número de copias entre la p-actina convertida y B3GALT6 son consistentes con diferentes niveles de metilación entre p-actina y B3GALT6 (es decir, todo el ADN de p-actina no está metilado y se convierte en una secuencia que coincide con sus cebadores y sondas de ensayo, mientras que una fracción de B3GALT6 no está metilada y los oligonucleótidos de ensayo diseñados para detectar el ADN de B3GALT6 metilado no coinciden con la fracción convertida con bisulfito no metilada).

Ejemplo 4

Prueba del ensayo de B3GALT6 en muestras de plasma

[0162]El ADN se extrajo de 118 muestras de plasma (4 ml cada una) de pacientes con cáncer y normales mediante extracción a base de sílice y se trató con bisulfito, como se describe en el ejemplo 1. Para la calibración cuantitativa se utilizaron calibradores de plásmidos de pUC57 digerido con EcoRI que contenían ADN insertado con las secuencias de B3GALT6 o beta-actina convertida con bisulfito, diluido en 20 ng/pl de ADN de pescado.

[0163]Las muestras se analizaron utilizando el ensayo QUARTS como se describe en el ejemplo 1 y los resultados se muestran en la figura 4. Se observa una buena correlación entre el B3GALT6 y la p-actina en las muestras de plasma, independientemente del estado patológico del sujeto del que se toman las muestras.

Ejemplo 5

Prueba del ensayo de B3GALT6 en muestras de plasma adicionales

[0164]El B3GALT6 se comparó con la p-actina como diana de referencia en un conjunto ampliado de muestras compuestas tanto de sujetos normales como de pacientes con cáncer de pulmón. El ADN se extrajo de un conjunto de 297 muestras de plasma (2 ml) de pacientes con cáncer y normales mediante extracción a base de sílice y se trató con bisulfito, como se describe en el ejemplo 1. Para la calibración cuantitativa se utilizaron calibradores de plásmidos de pUC57 digerido con EcoRI que contenían ADN insertado con la secuencia de B3GALT6 convertida con bisulfito o beta-actina convertida con bisulfito, diluido en 20 ng/pl de ADN de pescado. Los ensayos QuARTS triplex se realizaron como se describe para los ensayos QuARTS múltiples en el ejemplo 1, utilizando 12 ciclos en la amplificación inicial.

[0165]Los resultados se muestran en la figura 5, que compara los recuentos de cadenas detectadas para cada una de las dianas de B3GALT6 y p-actina. Estos datos muestran que se observa una buena correlación entre el B3GALT6 y la p-actina independientemente del estado de la enfermedad, lo que demuestra la idoneidad del B3GALT6 como gen de referencia metilado.

Ejemplo 6

Comparación de B3GALT6 y p-actina como genes de referencia para calcular el% de metilación de los genes marcadores

[0166]Las 297 muestras de plasma descritas en el ejemplo 5 se analizaron además utilizando el ensayo QuARTS para detectar la presencia de los marcadores de metilación CYP26C1 y NFIX. Las figuras 6A y 6B comparan la betaactina tratada con bisulfito o el B3GALT6 tratado con bisulfito como referencia para calcular el % de metilación de estos genes marcadores en el ADN de las muestras de plasma.

Ejemplo 7

Prueba del B3GALT6 como gen de referencia en las células pulmonares

[0167]Se cultivaron veinte líneas de células pulmonares y se extrajo su ADN utilizando el kit Qiagen Miniblood. El ADN extraído se trató con bisulfito amónico como se describe en el Ejemplo 1. Para la calibración cuantitativa se utilizaron calibradores de plásmidos de pUC57 digerido con EcoRI que contenían ADN insertado con la secuencia de B3GALT6 convertida con bisulfito o beta-actina convertida con bisulfito, diluido en 20 ng/pl de ADN de pescado. Los ensayos QuARTS multiplex se realizaron como se describe en el ejemplo 1. Los resultados, que se muestran en la tabla siguiente, demuestran que el marcador de referencia B3GALT6 está presente en todos los tipos de células pulmonares ensayados.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   i. Uso de una composición, que comprende:

   un complejo de un ácido nucleicoB3GALT6convertido con bisulfito y al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción de dicho oligonucleótido se hibrida con dicho ácido nucleico deB3GALT6,en donde dicho ácido nucleico deB3GALT6convertido con bisulfito se utiliza como un control interno que se procesa y detecta junto con el ADN marcador indicativo de enfermedad en ensayos de metilación.
2. 2. Uso de la composición de la reivindicación 1, que comprende además un oligonucleótido de sonda de detección, en donde el oligonucleótido de sonda de detección comprende una región que es complementaria a una porción del ácido nucleico de B3GALT6,

   en donde el oligonucleótido de sonda de detección comprende preferiblemente una región que es complementaria a una porción de la Id. de sec. n.°: 2 o el complemento de la misma,

   en donde dicho oligonucleótido de sonda de detección comprende además preferiblemente una molécula indicadora, y en donde dicha molécula indicadora comprende preferiblemente un fluoróforo.
3. 3. Un método para caracterizar una muestra, que comprende:

   a) tratar el ADN de una muestra de un sujeto con un reactivo de bisulfito para producir una muestra de ADN tratada con bisulfito;

   b) medir una cantidad de al menos un ADN marcador de metilación convertido con bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito;

   c) medir una cantidad de ADN deB3GALT6convertido con bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito, en donde dicho ADN deB3GALT6convertido con bisulfito se utiliza como un control interno junto con dicho ADN marcador de metilación en el paso b); y

   d) comparar la cantidad de dicho al menos un ADN marcador de metilación tratado con bisulfito y la cantidad de ADN deB3GALT6convertido con bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito para determinar una cantidad del al menos un ADN marcador de metilación convertido con bisulfito en dicha muestra de un sujeto.
4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde medir dicha cantidad de al menos un ADN marcador de metilación convertido con bisulfito y dicha cantidad de ADN deB3GALT6convertido con bisulfito en dicha muestra de ADN tratada con bisulfito comprende amplificar regiones de dicho ADN tratado con bisulfito utilizando pares de cebadores de ácido nucleico, en donde dicha amplificación produce al menos un producto amplificado que comprende una región de dicho al menos un ADN marcador de metilación, y un producto amplificado que comprende una región de dicho ADN deB3GALT6,

   y/o

   en donde dicho al menos un ADN marcador de metilación convertido con bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito comprende al menos dos ADN marcadores de metilación.
5. 5. Un método para cuantificar, en una muestra de sangre de un sujeto, una cantidad de un ADN marcador metilado que es indicativo de un tumor en un tejido sólido, comprendiendo el método:

   a) medir una cantidad de un primer ADN marcador metilado en una muestra de sangre de un sujeto, en donde la metilación de dicho primer ADN marcador en un tejido sólido de un sujeto es indicativa de un tumor en dicho tejido;

   b) medir una cantidad de un segundo ADN marcador metilado en dicha muestra de sangre, en donde dicho segundo ADN marcador está metilado en tejido normal y en leucocitos, y en donde dicho segundo ADN marcador comprende ADN deB3GALT6y se utiliza como un control interno que se procesa y detecta junto con dicho primer ADN marcador metilado; y

   c) comparar las cantidades de dicho primer ADN marcador metilado y dicho segundo ADN marcador metilado en dicha muestra de sangre para determinar una fracción de dicho primer ADN marcador en dicha muestra de sangre que está metilada;

   en donde dicha medición comprende tratar el ADN de la muestra de sangre con un reactivo de bisulfito para producir una muestra de ADN tratada con bisulfito, y medir las cantidades del primer ADN marcador metilado y el segundo ADN marcador metilado en la muestra de ADN tratada con bisulfito.