ES3034233T3 - Non-blocking pd1 specific antibodies - Google Patents

Non-blocking pd1 specific antibodies

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ES3034233T3 ES21181607T ES21181607T ES3034233T3 ES 3034233 T3 ES3034233 T3 ES 3034233T3 ES 21181607 T ES21181607 T ES 21181607T ES 21181607 T ES21181607 T ES 21181607T ES 3034233 T3 ES3034233 T3 ES 3034233T3
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Abstract

Esta divulgación se refiere a agentes de unión con especificidad para la muerte celular programada 1 (PD-1) y a métodos para su uso en el tratamiento, la prevención o la mejora de enfermedades infecciosas (p. ej., el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), cáncer o autoinmunidad. Además, esta divulgación identifica un nuevo parche de unión ("P2") en PD-1 que está vinculado con una actividad funcional previamente no identificada de PD-1, distinta del sitio de interacción involucrado con los ligandos PD-L1 o PD-L2. Asimismo, demostramos que los anticuerpos que interactúan con esta región de PD-1 pueden actuar como antagonistas de PD-1 y que este antagonismo se potencia aún más con la adición de anticuerpos que actúan bloqueando la interacción PD-1/PD-L1/L2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos específicos PD1 no bloqueantes
Aplicaciones relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad a U.S. Ser. No. 62/286,269 presentada el 22 de enero de 2016 y U.S. Ser. N° 62/290.745 presentado el 3 de febrero de 2016.
Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere a agentes de unión con especificidad para la muerte celular programada 1 (PD-1) (por ejemplo, PD-1 humana) y a procedimientos para usar los mismos para tratar y/o prevenir infecciones (por ejemplo, por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), cáncer y/o autoinmunidad.
Antecedentes de la divulgación
A medida que nos adentramos en la cuarta década de la epidemia del VIH, se han producido avances significativos en la comprensión de la patogénesis del VIH y en el desarrollo de fármacos antivirales potentes y seguros. Se han registrado más de 30 fármacos antivirales y el impacto de la terapia antirretroviral combinada (TAR) tanto en la morbilidad como en la mortalidad ha sido notable. Sin embargo, a pesar de la supresión a largo plazo de la replicación del VIH conseguida en pacientes con una adherencia óptima al TAR, el VIH rebrota invariablemente tras la interrupción de la terapia. Además, una terapia exitosa no induce ni permite la restauración/desarrollo de respuestas inmunitarias específicas del virus capaz de controlar la replicación del VIH en ausencia de TAR. De este modo, es necesario un tratamiento antirretroviral de por vida para controlar la replicación del VIH y la enfermedad asociada en la gran mayoría de los individuos infectados por el VIH.
Se ha identificado en la sangre una población de células T CD4 de memoria central de larga vida infectada de forma latente por el VIH como un componente importante del reservorio celular del VIH y como la causa principal de la persistencia del VIH. Se estima que la vida útil de este reservorio celular latente es de aproximadamente 70 años en presencia de una supresión total del VIH con TAR. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que dos poblaciones de células T CD4 residentes en los ganglios linfáticos constituyen el compartimento primario de células T CD4 para la infección, replicación y producción del VIH. Estas dos poblaciones de células T CD4 se definen por la expresión de PD-1 y CXCR5, e incluyen las poblaciones de células T auxiliares foliculares (Tfh) PD-1+CXCR5+ y de células T CD4 PD-1+CXCR5-.
Se han propuesto varios mecanismos responsables del establecimiento y mantenimiento del reservorio o reservorios celulares latentes del VIH. Uno de los mecanismos es la persistencia de una replicación mínima del virus bajo tratamiento antirretroviral, que puede reponer el reservorio celular del VIH. Por lo tanto, la terapia antirretroviral es incapaz de inducir la supresión total de la replicación del VIH y la respuesta inmunitaria "natural" específica del VIH-1 bajo la terapia antirretroviral tampoco es capaz de suprimir y eliminar totalmente la replicación del virus residual en curso. Los fracasos de la terapia antirretroviral y de la respuesta inmunitaria específica del VIH justifican la investigación de intervenciones alternativas dirigidas también al reservorio celular persistente del VIH.
En el pasado se han investigado una serie de intervenciones inmunológicas que se están desarrollando actualmente con el objetivo de lograr la cura funcional del VIH, en la que se suprime la replicación viral sin terapia antiviral sostenida (9). Las estrategias de vacunas terapéuticas han sido la principal estrategia de intervención investigada, pero los resultados han mostrado una eficacia modesta en modelos animales experimentales y en pacientes, con la excepción de una vacuna contra el VIH con vector basado en CMV (eficacia del 50% en el modelo NHP; 10). Estudios recientes han generado resultados interesantes sobre la posibilidad de utilizar anticuerpos antienvolventes ampliamente neutralizantes (bNabs) como agentes terapéuticos en la infección por VIH (11,12). Además, se ha demostrado que los Abs PD-1 antagonistas restauran las funciones de las células T en pacientes infectados por el VIH y se ha propuesto la posibilidad de utilizar estos Abs como estrategia terapéutica para aumentar la potencia de las respuestas de las células T específicas del VIH (13,14).
Está bien establecido que las células T CD8 específicas de tumor infiltrantes son disfuncionales con respecto a su capacidad para proliferar y mediar la actividad citotóxica. La gran mayoría de las células T CD8 tumorales infiltrantes se encuentran en un estado funcional denominado de agotamiento. El principal mecanismo responsable del agotamiento de las células T CD8 infiltrantes específicas del tumor es el aumento de la expresión de una serie de receptores reguladores y, en particular, del receptor regulador PD-1. La observación de que el bloqueo de PD-1/PDL-1/2 (ligandos de PD-1) se asocia con la recuperación de las células T CD8 tras su agotamiento ha justificado el desarrollo de estrategias de intervención dirigidas a la molécula PD-1 expresada por las células T CD8 agotadas. Estudios recientes han mostrado resultados muy prometedores con el uso de anticuerpos PD-1 con actividad antagonista en pacientes con enfermedad avanzada asociada al cáncer. Los estudios han mostrado tasas sustanciales de respuesta, que oscilan entre el 18 y el 40%, en pacientes con melanoma avanzado, carcinoma pulmonar de células no pequeñas y carcinoma renal. En estos estudios, los anticuerpos anti-PD-1 se han utilizado solos o en combinación con un anticuerpo anti-CTL-A4. Tras estos estudios iniciales, los actuales se están realizando en pacientes con diversos tumores, incluidos también tumores hematológicos.
Existe una necesidad en el arte de reactivos adicionales para dirigir PD-1 y procedimientos para usar los mismos. La presente invención aborda esas necesidades proporcionando un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a PD-1 humana y procedimientos que se utilizan para dirigir PD-1 y células y/o tejidos como se define en las reivindicaciones.
El documento WO 2015/112805 desvela anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente al ligando del receptor inmunomodulador ligando de muerte programada 1 (PD-L1), y procedimientos terapéuticos y de diagnóstico de uso de dichos anticuerpos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1.Curvas de respuesta de concentración de anticuerpo para la inhibición de la interacción PD-1 / PD-L1 (panelesA-C).
Figura 2.Representación estructural del ectodominio de la proteína PD-1 de los residuos 33 a 149. Los aminoácidos implicados en la interacción con PD-L1 o PD-L2 se sitúan en la estructura mediante los círculos morados con el número de residuo indicado (el número de residuo es relativo a SEQ ID NO. 275 (Fig. 3H)).Figura 3. A.Secuencia de aminoácidos del ectodominio PD-1 humano. Para cada una de las 31 mutaciones (M1 a M31) se indican los residuos que fueron objeto de sustitución de aminoácidos. Los residuos en texto morado corresponden a aminoácidos que están implicados en la interacción PD-1 /PD-L1 y los residuos de asparagina en verde son sitios potenciales para la glicosilación ligada a N.B-G.Polipéptidos PD-1 modificados.H.Secuencia de aminoácidos de PD-1 humana (SEQ ID NO. 275).I.Secuencia de aminoácidos de PD-1 de mono.
Figura 4.Unión de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes a las proteínas PD-1 modificadas M13, M14 y M23 (control de tipo salvaje (WT) (S<e>Q ID N<o>. 275)) expresada en la superficie de células HeLa transfectadas transitoriamente.
Figura 5.Unión de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes a las proteínas PD-1 modificadas M13, M23 y M4 (control de tipo salvaje (WT) (SEQ ID NO. 275)) expresada en la superficie de células HeLa transfectadas transitoriamente.
Figura 6.Unión de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes a las proteínas PD-1 modificadas M31, M5 y M18 (control de tipo salvaje (WT) (SEQ ID NO. 275)) expresada en la superficie de células HeLa transfectadas transitoriamente.
Figura 7.Unión de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes a las proteínas PD-1 modificadas M1, M9, M13, M17, M18, M23 y M28 (control de tipo salvaje (<w>T) (SEQ ID NO. 275)) expresada en la superficie de células HeLa transfectadas transitoriamente.
Figura 8.Unión de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes a las proteínas PD-1 modificadas M17, M30 y M26 (control de tipo salvaje (WT) (Se Q ID No . 275)) expresada en la superficie de células HeLa transfectadas transitoriamente.
Figura 9.La combinación de dos anticuerpos anti-PD-1 antagonistas que se unen a diferentes epítopos de PD-1, uno bloqueante y otro no bloqueante de la interacción PD-1/PD-L1, produce un mayor alivio del agotamiento funcional y un aumento de la proliferación de células T CD8 específicas del VIH más allá de lo que puede conseguir cualquiera de los anticuerpos por sí solo.
Figura 10.Los anticuerpos anti-PD-1 antagonistas individuales y las combinaciones de dos anticuerpos anti-PD-1 antagonistas que se unen a diferentes epítopos de PD-1 producen un aumento de la proliferación (a) y de la producción de IFN<y>(b) de células T CD4 de memoria PD-1+ en un ensayo de reacción linfocitaria mixta.
Figura 11.Representación estructural de los parches evolutivamente conservados P1 (a) y P2 (b) de PD-1 junto con las alineaciones de secuencias de aminoácidos del ectodominio de PD-1 de diferentes especies (c).
Figura 12.Estudios de unión competitiva de anticuerpos para PD-1 de superficie celular en células T CD4+ activadas.
Figura 13a-b.Mapeo de epítopos de sitios de unión de anticuerpos a la estructura de PD-1 mediante el uso de una combinación de resultados tanto de mutagénesis dirigida al sitio como de unión por competición de anticuerpos.
Figura 14a-b.Aumento selectivo de la muerte celular (tinción de Aqua (panel a)) o apoptosis (tinción de Annexing V (panel b)) en células T CD4 con PD-1 alto de un donante infectado por VIH virémico tras el tratamiento con un ADC anti-PD-1 en comparación con anticuerpos anti-PD-1 solos o un anticuerpo de control IgG.
Figura 15.El tratamiento con el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) anti-PD-1 produce un aumento de la apoptosis (tinción de Annexin V) y/o muerte celular (tinción de Aqua) en células T CD4+ con alto contenido en PD-1 procedentes de múltiples donantes diferentes infectados por VIH virémico. Se observa una baja muerte celular/apoptosis en las muestras de control tratadas con anticuerpos anti-PD-1 solos o con un anticuerpo de control IgG1.
Figura 16.Evaluación de la destrucción mediada por el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) anti-PD-1 de células T CD4+ infectadas PD-1 positivas procedentes de un donante con infección crónica por VIH. Tras cinco días de tratamiento con anticuerpos, las células se utilizaron en un ensayo cuantitativo de crecimiento viral para controlar el número de células infecciosas en las diferentes muestras tratadas.
Figura 17.Actividad funcional de un panel de anticuerpos humanizados que contienen los bucles CDR variables de cadena pesada y ligera del 137F2 bloqueante (de la interacción PD-1/PD-L1 (A35795, A35796, A35797, quimera 137F2)) y del 135C12 no bloqueante de la interacción PD-1/PD-L1 (A35774, A35783, A35789, A346443, 135C H2L2, 135C H1cL1c, 135C H1cL1b, 135C12 quimera) anticuerpos anti-PD-1 muestran una actividad antagonista equivalente a MK3475 en el restablecimiento de la proliferación de células T CD8 específicas del péptido del VIH en un ensayo de recuperación del agotamiento funcional.
Figura 18.La combinación de dos anticuerpos anti-PD-1 antagonistas que se unen a diferentes epítopos de PD-1, uno bloqueante (MK3475 o A35795) y otro no bloqueante (A35774) de la interacción PD-1/PD-L1, produce un mayor alivio del agotamiento funcional y un aumento de la proliferación de células T CD8 específicas del VIH más allá de lo que puede conseguir cualquiera de los anticuerpos por sí solo.
Figura 19.La combinación de dos anticuerpos anti-PD-1 antagonistas que se unen a diferentes epítopos de PD-1, uno bloqueante (MK3475) y otro no bloqueante (135C H1cL1b o 135C H1cL1c) de la interacción PD-1/PD-L1, produce un mayor alivio del agotamiento funcional y un aumento de la proliferación de células T CD8 específicas del VIH más allá de lo que cualquiera de los dos anticuerpos puede conseguir por sí solo.
Figura 20.Estimulación de la línea celular Jurkat PD-1 NFAt reporter con una línea celular 293T transfectada transitoriamente que expresa un activador del TCR y la proteína PD-L1.A.MK3475 y A35774.B.MK3475 y 135C H1cL1c.
Figura 21.Internalización de PD-1 en la superficie celular tras la incubación de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes, no bloqueantes o combinaciones de bloqueantes y no bloqueantes con células T de memoria de un donante con infección crónica por VIH. Se midieron los niveles de superficie celular de PD-1 en células T CD4+ de memoria (Fig. 20,paneles a, c y e) y células T CD8+ (Fig. 20, paneles b, d y f) en diferentes puntos temporales tras el tratamiento con anticuerpos.
Figura 22.Las PBMC de un donante infectado crónicamente por el VIH que poseía células T de memoria con altos niveles basales de PD-1 se incubaron con anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes (MK3475), no bloqueantes (A35774) o una combinación de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes (A35774 y MK3475), seguida de una estimulación de 24 horas con células activadoras del TCR en presencia o ausencia de PD-L1. En las estimulaciones con células activadoras del TCR que expresan PD-L1, los tratamientos que combinan anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes conducen a un mayor nivel de IFN-y en el medio celular (A) y en el IFN-y intracelular asociado a la célula T CD8 PD-1+ (B).
Figura 23.Cristales de proteína del complejo hPD-1/Fab A35774. A. Bucles CDR de cadena pesada y ligera de A35774 que interactúan con la proteína PD-1 humana. B El modelado de la estructura hPD-1 / Fab A35774 con PD-L1 humano (PDB 4ZQK) confirma que los anticuerpos anti-PD-1 no bloqueantes se unen a un epítopo distinto y no solapado en PD-1 en comparación con PD-L1.
Figura 24.Estudio de eficaciain vivose realizó en ratones PD-1 HuGEMM para evaluar el potencial terapéutico de un anticuerpo anti-PD-1 humanizado IgG4 no bloqueante (135C H1cL1c) el anticuerpo anti-PD-1 bloqueante Keytruda (MK3475) o una combinación de 135C H1cL1c Keytruda. (A) Se indica el volumen tumoral medio de las células MC38 para los ratones de control con vehículo en relación con los distintos tratamientos con anticuerpos. (B) Porcentaje medio de inhibición del crecimiento tumoral para los tratamientos con anticuerpos en comparación con el control con vehículo solo. (C) Porcentaje de ratones en cada grupo de tratamiento anti-PD-1 que mostraron una remisión completa del tumor MC38 implantado.
Figura 25.A. 137F2 Cadenas pesadas variables (Vh). B. 137F2 Cadenas de luz variable (Vl). C. 135C Cadenas pesadas variables (V<h>). D. Cadenas de luz variable 135C (V<l>).
Sumario de la divulgación
La presente divulgación se refiere a agentes de unión con especificidad para muerte celular programada 1 (PD-1) (por ejemplo, PD-1 humana) y a procedimientos para usar los mismos tales como para tratar, prevenir y/o mejorar infección (por ejemplo, por virus de inmunodeficiencia humana (VIH)), cáncer y/o una afección autoinmune y/o una afección neurodegenerativa). También se proporcionan ensayos funcionales para identificar agentes de unión que interactúan con PD-1. También se proporcionan combinaciones de agentes de unión, como un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1, que actúan sinérgicamente para rescatar a las células T del agotamiento.
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a agentes de unión que se unen a la proteína de muerte celular programada (PD-1) (por ejemplo, SEQ ID NO:1, Fig. 1A, Fig. 1B de U.S. Pat. No. 5.698.520 (Honjo, et al.) (por ejemplo, PD-1 humana) en la superficie de las célulasin vitroy/oin vivo.Los agentes de unión también pueden unir polipéptido PD-1 aislado (por ejemplo, PD-1 humano) y/o fragmentos y/o derivados del mismo, típicamentein vitro.También se proporcionan procedimientos para utilizar dichos agentes de unión para diagnosticar, tratar, prevenir y/o mejorar una o más enfermedades asociadas con la existencia de células que expresan PD-1. Por ejemplo, los agentes de unión pueden ser anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que pueden reaccionar con los epítopos de PD-1 y/o unirse a ellos. Los "agentes de unión" descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, un agonista o un antagonista de PD-1. Un agente agonista de unión es aquel que típicamente no es capaz de restaurar la función de las células T y/o la expresión de PD-1. Un agente agonista de unión a PD-1 puede ser útil para tratar enfermedades autoinmunes y otras en las que las células que expresan PD-1 están implicadas en la progresión de la enfermedad. Por el contrario, un agente de unión antagonista es aquel capaz de restaurar la función de las células T y/o reducir la expresión de PD-1 en la superficie celular. Por ejemplo, un agente de unión antagonista de PD-1 puede ser capaz de restaurar la función de las células T que expresan PD-1 desde el agotamiento funcional, como se sabe que ocurre en la infección por VIH y en una variedad de tumores. La restauración de la función de las células T puede determinarse, por ejemplo, midiendo la proliferación, la producción de citocinas, la actividad citotóxica u otras características de dichas células. Otro uso de los agentes de unión descritos en el presente documento es la selección y eliminación de poblaciones de células T CD4+ infectadas por el VIH que contengan VIH competente para la replicación (por ejemplo, en estado latente y/o de replicación). Se sabe que estas células que expresan PD-1 constituyen un importante reservorio celular para la replicación competente del VIH. Un mecanismo potencial para la eliminación de estas poblaciones de células T CD4+ es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) utilizando los agentes de unión descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos PD-1 mono y/o bi-específicos). En algunas realizaciones, pueden combinarse uno o más agentes de unión antagonistas de PD-1 que tengan, por ejemplo, diferentes especificidades (p. ej., que reconozcan diferentes epítopos) para inducir el rescate de células T CD8+ específicas de antígeno del agotamiento funcional causado por la expresión de PD-1 en dichas células (p. ej., restaurando o mejorando la proliferación, la producción de citocinas y/o la actividad citotóxica). En algunas realizaciones, los agentes de unión descritos en el presente documento también pueden proporcionar la eliminación selectiva y / o supresión de las células que expresan PD-1. En algunas realizaciones, los agentes de unión agonista o antagonista de PD-1 descritos en el presente documento pueden utilizarse para suprimir y/o eliminar células que expresan PD-1 para tratar, por ejemplo, enfermedades infecciosas (p. ej., VIH), cáncer y/o, especialmente, afecciones autoinmunes. A continuación se describen otras realizaciones, usos y similares.
Los agentes de unión pueden ser anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales que pueden comprender, por ejemplo, cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en laTabla 1(y/o uno o más fragmentos y/o derivados de los mismos). La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a PD-1 humano y comprende una combinación de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), la combinación que comprende:
SEQ ID NO. 172 y SEQ ID NO: 186;
SEQ ID NO. 173 y SEQ ID NO: 187;
SEQ ID NO. 174 y SEQ ID NO: 188;
SEQ ID NO. 175 y SEQ ID NO: 189;
SEQ ID NO. 176 y SEQ ID NO: 190; o
SEQ ID NO. 177 y SEQ ID NO: 190.
La presente divulgación también proporciona el uso de anticuerpos monoclonales para aislar, identificar y/o dirigir células que expresan PD-1. En ciertas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales pueden ser reactivos contra PD-1 expresado en la superficie de las células. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" puede referirse a anticuerpos enteros o fragmentados en forma no purificada o parcialmente purificada (por ejemplo, sobrenadante de hibridoma, ascitis, antisueros policlonales) o en forma purificada. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen o forma adecuados, incluyendo, por ejemplo, murinos (por ejemplo, producidos por células de hibridoma murino), o expresados como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y similares. Por ejemplo, los anticuerpos pueden derivarse total o parcialmente de seres humanos (por ejemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG2a, Ig2b, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD e IgE), caninos (por ejemplo, IgGA, IgGB, IgGC, IgGD), pollos (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY), cabra (p. ej., IgG), ratón (p. ej., IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), y/o cerdo (p. ej., IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), rata (p. ej., IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), por ejemplo. Los procedimientos de preparación, utilización y almacenamiento de diversos tipos de anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica y serían adecuados para practicar la presente invención (véase, por ejemplo, Harlow, et al. Anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al. Uso de anticuerpos: Manual de laboratorio, Protocolo portátil n° 1, 1998; Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975)); Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-329 (1988); Presta (Curr.). Op. Estructurar. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen et al. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368856-859 (1994); Morrison, Nature 368812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995); así como U.S. Pat. Nos.
4,816,567; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5.633.425; 5.661.016, y 9.090.994 B2, entre otros). En determinadas aplicaciones, los anticuerpos pueden estar contenidos en el sobrenadante de hibridoma o en ascitis y utilizarse directamente como tales o tras su concentración mediante el uso de técnicas estándar. En otras aplicaciones, los anticuerpos pueden purificarse aún más mediante el uso de, por ejemplo, fraccionamiento salino y cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía de afinidad mediante el uso de proteína A, proteína G, proteína A/G, y/o proteína L, y/u otros, ligandos acoplados covalentemente a un soporte sólido como perlas de agarosa, o combinaciones de estas técnicas. Los anticuerpos pueden almacenarse en cualquier formato adecuado, incluyendo como preparación congelada (por ejemplo, -20°C o -70°C), en forma liofilizada, o en condiciones normales de refrigeración (por ejemplo, 4°C). Cuando se almacena en forma líquida, por ejemplo, se prefiere utilizar un tampón adecuado como la solución salina tamponada con Tris (TBS) o la solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas realizaciones, el agente de unión puede prepararse como una preparación inyectable, tal como en suspensión en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable para los padres. Los vehículos y disolventes adecuados que pueden utilizarse incluyen agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico, TBS y/o PBS, entre otros. Dichas preparaciones pueden ser adecuadas para su usoin vitrooin vivopueden prepararse como se conoce en la técnica y la preparación exacta puede depender de la aplicación particular.
Sin embargo, los agentes de unión descritos no se limitan en modo alguno a anticuerpos. Por ejemplo, el agente de unión puede ser cualquier compuesto que presente propiedades de unión similares a otro (por ejemplo, un mimético). Por ejemplo, un agente de unión ejemplar puede ser uno que se una a PD-1 y/o pueda competir con un agente de unión que tenga especificidad para ello (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal). En algunas realizaciones, el mimético puede mostrar sustancialmente la misma afinidad en ensayos de unión que el agente de unión (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) con el que se compara. La afinidad de un agente de unión particular puede medirse mediante cualquier ensayo adecuado, incluyendo pero sin limitarse a la tinción FACS de PD-1 de superficie celular endógena en células T CD4+ activadas como se describe en los Ejemplos. Se puede decir que un agente de unión tiene "sustancialmente la misma afinidad" que otro cuando las mediciones (por ejemplo, constante de unión aparente con afinidad nanomolar) se encuentran dentro de aproximadamente 1-20, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 por ciento entre sí. Los miméticos ejemplares pueden incluir, por ejemplo, compuestos orgánicos que se unen específicamente a PD-1, o un afibodino (Nygren, et al.). FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008)), affilina (Ebersbach, et al.). J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 (2007)), afitina (Krehenbrink, et al.). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68 (2008)), anticalina (Skerra, A. FEBS J. 275 (11) :). 2677-83 (2008)), avimer (Silverman, et al.). Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 (2005)), DARPin (Stumpp, et al.). Drug Discov. Hoy 13 (15-16): 695-701 (2008)), Fynomer (Grabulovski, et al.). J. Biol. Química. 282 (5): 3196-3204 (2007)), péptido de dominio de Kunitz (Nixon, et al.). Curr. Opinen. Drug Discov. Devel. 9 (2): 261-8 (2006)), y/o un monocuerpo (Koide, et al.). procedimientos Mol. Biol. 352: 95-109 (2007)). Otros miméticos pueden incluir, por ejemplo, un derivado de un anticuerpo como, por ejemplo, un anticuerpo Fab, Fab<2>, anticuerpo de cadena única Fab', Fv, anticuerpo de dominio único, anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo triespecífico, anticuerpo multivalente, anticuerpo quimérico, anticuerpo quimérico canino-humano, anticuerpo quimérico canino-ratón, anticuerpo que comprende un Fc canino, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, caninizado, anticuerpo injertado con CDR, anticuerpo tiburón, nanocuerpo, anticuerpo canélido, microcuerpo, y/o intracuerpo, o derivado del mismo. En el presente documento también se proporcionan otros agentes aglutinantes, como entendería una persona con conocimientos ordinarios en la técnica.
A fin de generar agentes de unión que tengan especificidad para (por ejemplo, unión a) PD-1, puede usarse cualquier procedimiento conocido por aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, para generar y aislar anticuerpos monoclonales se puede administrar a un animal, tal como un ratón (p. ej., inmunizarlo), una o más proteínas PD-1 (p. ej., proteína de fusión PD-1 Fc y/o proteína PD-1 His tag). Los animales que muestren reactividad sérica a PD-1 expresada en linfocitos T humanos activados (según se determine, por ejemplo, mediante citometría de flujo y/o microscopía) pueden seleccionarse entonces para la generación de líneas celulares de hibridoma anti-PD-1. Esto puede repetirse en varias rondas. Por ejemplo, los criterios primarios para la primera ronda de selección del agente de unión pueden ser, entre otros, los siguientes i) nivel de tinción de PD-1 en linfocitos T humanos activados mediante citometría de flujo; ii) diversidad de secuencias CDR VH y VL en comparación con las de los anticuerpos anti-PD-1 existentes; y, iii) mapeo de epítopos realizado mediante estudios de unión competitiva con perlas Luminex conjugadas con PD-1 y preacopladas con PD-L1 o uno de varios anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente que se unen a diferentes epítopos en PD-1. Una primera o segunda ronda de selección ejemplar también puede incluir, por ejemplo, la unión por afinidad (no es un criterio primario dado que puede no correlacionarse con el potencial estimulador de los anticuerpos anti-PD-1); y/o, la caracterización funcional para identificar el agente de unión como un agonista o un antagonista.
Como se describe en el Ejemplo 1 del presente documento, por ejemplo, puede usarse el Ensayo de Recuperación Funcional por Agotamiento (EFRA). En este ensayo, se puede evaluar la capacidad de los agentes de unión de prueba para rescatar del agotamiento a células inmunitarias como las células T Esto puede determinarse midiendo la capacidad de un agente de unión para restaurar la proliferación de dichas células en presencia de un antígeno, tal como un péptido de prueba derivado de un virus como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La proliferación se mide en un ensayo CFSE en comparación con un control, como el péptido de ensayo solo o un anticuerpo anti-PD-1 de control positivo como MK-3475 (pembrolizumab). En algunas realizaciones, se determina que un agente de unión restablece la proliferación cuando la comparación muestra una diferencia significativa (como un valor P de <0,001) en comparación con un control de péptido solo o de péptido con un anticuerpo IgG1 de ratón de control de isotipo. Este ensayo puede utilizarse para identificar agentes de unión (como anticuerpos) que compiten con otros agentes de unión por unirse a PD-1 (como PD-L1 o PD-L2) y/o conducen a la restauración funcional de las células inmunitarias. El Ejemplo 1 también describe dos procedimientos de mapeo de epítopos de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, enumerados enTabla 3) usando ensayos basados en Luminex. En un ensayo bioquímico, una proteína de fusión Fc de PD-1 se une a microesferas y se realizan estudios de unión competitiva entre los anticuerpos anti-PD-1 descritos en laTabla 3y uno de dos anticuerpos anti-PD-1 diferentes disponibles comercialmente. En el ejemplo 1 se describen cuatro clases de anticuerpos monoclonales que se unen a epítopos distintos de PD-1: clase 1 (competitiva con un primer anticuerpo monoclonal que bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 2 (competitiva con un segundo anticuerpo monoclonal que se une a PD-1 pero no bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 3 (competitiva tanto con el primer anticuerpo monoclonal como con el segundo) y clase 4 (no competitiva con el primer anticuerpo ni con el segundo). En un ensayo separado, se evaluó la competencia por la unión a una proteína PD-1 recombinante para los anticuerpos anti-PD-1 enumerados en laTabla 3y una proteína PD-L1 recombinante biotinilada. Los anticuerpos que indujeron la proliferación en el EFRA fueron identificados de las cuatro clases de unión que se proponen de unión a diferentes epítopos en PD-1. Asimismo, el EFRA permitió identificar anticuerpos anti-PD-1 que bloqueaban o no la interacción PD-1 /PD-L1 y restauraban específicamente la función proliferativa de las células T CD8+ específicas del VIH.
También pueden identificarse combinaciones de agentes de unión. En algunas realizaciones, las combinaciones pueden identificarse para proporcionar diferencias estadísticamente significativas con respecto a los resultados obtenidos mediante el uso de sólo uno o más de los agentes de unión y no otros. En algunas realizaciones, pueden identificarse combinaciones que muestren una capacidad sinérgica o cooperativa para restaurar la función de las células inmunitarias. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. El primer y segundo agentes de unión pueden ser entidades diferentes, como dos o más anticuerpos monoclonales diferentes o derivados de los mismos, o pueden encontrarse en la misma entidad, como un anticuerpo bifuncional (un único anticuerpo o derivado del mismo que comprende múltiples especificidades de unión). Por ejemplo, un anticuerpo bifuncional ejemplar puede comprender una primera región de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 y una segunda región de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. También se contemplan combinaciones que proporcionan múltiples tipos de cada agente aglutinante. Por ejemplo, la combinación puede comprender múltiples tipos de agentes de unión que bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1 con uno o más que no bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender uno o más agentes de unión que bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1 con múltiples agentes de unión que no bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender múltiples agentes de unión que bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1 con múltiples agentes de unión que no bloquean la interacción de PD-1 y PD-L1. Dichas combinaciones, tal como se describen en el presente documento, también pueden combinarse con uno o más agentes que pueden afectar a la función de las células inmunitarias, como anticuerpos contra CTLA-4 y similares. Un experto en la técnica reconocerá que muchas de estas combinaciones pueden ser adecuadas para su uso tal como se describe en el presente documento.
Cuando el agente de unión es un anticuerpo, puede identificarse con referencia a la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos correspondiente a la variabilidad y/o regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") del mismo. Las secuencias de región variable / CDR pueden utilizarse en combinación con una o más secuencias de aminoácidos de región variable / CDR. Las secuencias de aminoácidos de región variable / CDR pueden alternativamente y/o también estar unidas a uno o más tipos de polipéptidos de región constante de una molécula de anticuerpo. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos CDR mostradas en lasTablas 1Ay1Bpueden unirse o asociarse con las regiones constantes de cualquier molécula de anticuerpo de la misma o diferente especie (por ejemplo, humana, cabra, rata, oveja, pollo) y/o subtipo de anticuerpo de aquel del que se derivó la secuencia de aminoácidos CDR. Por ejemplo, un agente de unión ejemplar puede ser, o puede derivarse de, o puede estar relacionado con el anticuerpo monoclonal producido por los hibridomas enumerados en, y / o puede tener aproximadamente la misma afinidad y / o efecto de proliferación, y / o exhibir la misma clase de unión mostrada enTabla 3y11-13y / o puede tener cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS. 1 190 y/o como se muestra enTablas 1Ay 1<b>. El agente de unión puede comprender un anticuerpo de cadena pesada y/o ligera que comprenda cada uno una o más regiones constantes y/o variables. Las regiones variables comprenden típicamente una o más CDR que pueden determinar la especificidad de unión del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales también pueden identificarse por medio del análisis de las secuencias de aminoácidos de (por ejemplo, que pueden estar codificadas por dichas secuencias de nucleótidos) dichas regiones variables. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada de los agentes de unión que se unen a PD-1 pueden incluir una o más de las que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS. 1-190, y/o cualquier otro que figure en lasTablas 1Ay/o1B.Cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, y/o cualquier fragmento y/o derivado de las mismas, también puede combinarse con cualquier otra región variable y/o CDR en cualquier orden y/o combinación para formar agentes de unión híbridos y/o de fusión y/o insertarse en otras regiones variables de cadenas pesadas y/o ligeras utilizando técnicas estándar. Las combinaciones de CDR (por ejemplo, combinación de secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o ligera) que pueden encontrarse en un agente de unión a PD-1 (por ejemplo, PD-1 humana) de la presente divulgación pueden incluir, por ejemplo, las realizaciones mostradas enTablas 1Ay/o1B(que están fuera del alcance de la presente invención).
Tabla 1A(en la que SEQ ID NO: 1-16,18-39, 41-62 y 64-69 quedan fuera del ámbito de la presente invención)
Tabla 1B(en la que SEQ ID NO: 70-85, 87-108, 110-131 y 133-138 quedan fuera del ámbito de la presente invención)
En realizaciones preferentes, las CDR de cadena pesada de cada clon se combinan con sus respectivas CDR de cadena ligera en un agente de unión. Un agente de unión puede comprender las CDR de cadena pesada y las CDR de cadena ligera que se muestran a continuación (no son acordes con la invención reivindicada):
122F10 (SEQ ID NOS. 1,24, 47, 70, 93 y 116);
139D6 (SEQ ID NOS. 2, 25, 48, 71, 94 y 117);
135D1 (SEQ ID NOS. 3, 26, 49, 72, 95 y 118);
134D2 (SEQ ID NOS. 4, 27, 50, 73, 96 y 119);
121G1 (SEQ ID NOS. 5, 28, 51, 74, 97 y 120);
136B5 (SEQ ID NOS. 6, 29, 52, 75, 98 y 121);
127C2 (SEQ ID NOS. 7, 30, 53, 76, 99 y 122);
137F2 (SEQ ID NOS. 8, 31, 54, 77, 100 y 123);
138H5 (SEQ ID NOS. 9, 32, 55, 78, 101 y 124);
140A1 (SEQ ID NOS. 10, 33, 56, 79, 102 y 125);
135H12 (SEQ ID NOS. 11, 34, 57, 80, 103 y 126);
131D11 (SEQ ID NOS. 12, 35, 58, 81, 104 y 127);
132F7 (SEQ ID NOS. 13, 36, 59, 82, 105 y 128);
126E4 (SEQ ID NOS. 14, 37, 60, 83, 106 y 129);
135G1 (SEQ ID NOS. 15, 38, 61, 84, 107 y 130);
136E10 (SEQ ID NOS. 16, 39, 62, 85, 108 y 131);
136F4 (SEQ ID NOS. 18, 41, 64, 87, 110 y 133);
136B4 (SEQ ID NOS. 19, 42, 65, 88, 111 y 134);
135E10 (SEQ ID NOS. 20, 43, 66, 89, 112 y 135);
140G5 (SEQ ID NOS. 21, 44, 67, 90, 113 y 136);
122H2 (SEQ ID NOS. 22, 45, 68, 91, 114 y 137);
139F11 (SEQ ID NOS. 23, 46, 69, 92, 115 y 138); o bien
135C12 (SEQ ID NOS. 17, 40, 63, 86, 109 y 132) (de acuerdo con la presente invención).
La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que comprende una combinación de regiones variables de cadena pesada y ligera humanizadas. Humanizado "137F2", que está fuera del objeto de la presente invención, incluyendo secuencias variables de cadena pesada que comprenden las CDR de cadena pesada 137F2 SEQ ID NOS. 8, 31 y 54 pueden incluir:
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTTVTVSS (A35790-VH (SEQ ID NO. 139));
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTTVTVSS (A35796-VH (SEQ ID NO. 140));
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTTVTVSS (A35793-VH (SEQ ID NO. 141));
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTTVTVSS (A3581S-VH (SEQ ID NO. 142));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQAPGQGLEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTTVTVSS (A35795-VH (SEQ ID NO. 143));
EVQLVQSGAEVKKHGESLKISCKGSGYSFTNYWIGWVRQATGQGLEWMGDIY
PGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLD
RWGQGTTVTVSS (A35797-VH (SEQ ID NO. 144));
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTTVTVSS (A35799-VH (SEQ ID NO. 145));
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQAPGKGLEWMGDIY
PGGGYTNYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLD
RWGQGTTVTVSS (A35805-VH (SEQ ID NO. 146));
Q VQ LVQSG AE VKKPGASVKVSCKASGYTFTN Y Wl GVWRQAPGQG LE WMG DI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTLVTVSS (137F VH1 (SEQ ID NO. 147));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAAGYTFTNYWIGVWRQAPGQGLEWMGDI
YPGGGYTNYNEKFKGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVL
DRWGQGTLVTVSS (137F VH2 (SEQ ID NO. 148));
QVQLVQSGAEV KKPGASVKVSCKASGYTFTN YW1GWVR QA PGQ G LEW1G DIY
PGGG YTN Y N EKF KGR VTM TA DTSTSTVYM ELSSL RSEDTAVYYCA RGYDFVLD
RWGQGTLVTV5S (137F VH1 b (SEQ ID NO. 149)); y,■'o
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIGWIRQAPGQGLEWIGDIYP
GGGYTNYNEKFKGRATLTADTSTSTVYMEVSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDR
WGQGTLVTVSS (137F VH1c (SEQ ID NO. 150)).
Humanizado "137F2", que está fuera del objeto de la presente invención, incluyendo secuencias de cadena ligera variables que comprenden las CDR de cadena ligera 137F2 SEQ ID NOS. 77, 100 y 123 pueden incluir:
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35790-VL (SEQ ID NO. 151));
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35795-VL (SEQ ID NO. 152));
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35793-VL (SEQ ID NO. 153));
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQAPRLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35818-VL (SEQ ID NO. 154));
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQAPRLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35795-VL (SEQ ID NO. 155));
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35797-VL (SEQ ID NO. 156));
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35799-VL (SEQ ID NO. 157));
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCKQSYTLRTFGGGT
KLEIK (A35805-VL (SEQ ID NO. 158));
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGT
KLEIK (137F VL1 (SEQ ID NO. 159));
DIVMTQSPDSLAVSLGERATITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
FWASTRESGVPDRFLGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGT
KLEIK (137F VL2 (SEQ ID NO. 160));
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLU
YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGT
KLEIK (137F VL1b (SEQ ID NO. 161));
DIVMTQSPDSLAVSLGERATITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLI
FWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGT
KLEIK (137F VL1c (SEQ ID NO. 162));
y / o,
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMTCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLL
IFWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQG
TKLEIK (137F VL1d (SEQ ID NO. 163)).
Secuencias de cadena pesada variable "135C12" humanizadas ejemplares que comprenden las CDR de cadena pesada 135C12 SEQ ID NOS. 17, 40 y 63 pueden incluir, donde SEQ ID NO. 164-171 quedan fuera del ámbito de la presente invención:
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQAPGQRLEWMGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A35775-VH (SEQ ID NO. 164));
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHVWRQARGQRLEWIGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A35783-VH (SEQ ID NO. 165));
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQAPGQRLEWMGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A35774-VH (SEQ ID NO. 166);
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNFYIHWVRQARGQRLEWIGSIYPN
YGDTAYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYW
GQGTTVTVSS (A36443-VH (SEQ ID NO. 167));
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNFYIHWVRQAPGKGLEWMGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A35777-VH (SEQ ID NO. 168));
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQMPGKGLEWMGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A35789-VH (SEQ ID NO. 169));
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQMPGKGLEWMGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A36448-VH (SEQ ID NO. 170));
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQMPGKGLEWMGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTTVTVSS (A36437-VH (SEQ ID NO. 171));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIH WVRQAPGQG LEWMGSIY
PNYGDTAYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAM
DYWGQGTLVTVSS (1350 VH1 (SEQ ID NO. 172));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIH WVRQAPGQG LEWMGSI Y
PNYGDTAYNQKFKDRVTMTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCARGYSYAM
DYWGQGTLVTVSS (1350 VH2 (SEQ ID NO. 173));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIHWVKQAHGQGLEWMGSIY
PNYGDTAYNQKFKDRVTMTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCARGYSYAM
DYWGQGTLVTVSS (135C VH3 (SEQ ID NO. 174));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIHVWRQAPGQGLEWIGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMD
YWGQGTLVTVSS (135C VH1b (SEQ ID NO. 175));
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTNFYIHVWRQAPGQGLEWIGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTLVTVSS (135C VH1c (SEQ ID NO. 176));
y / o,
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYP
NYGDTAYNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDY
WGQGTLVTVSS (135C VH1d (SEQ ID NO. 177)).
Secuencias de cadena ligera variable humanizada "135C12" ejemplares que comprenden las CDR de cadena ligera 135C12 SEQ ID NOS. 86, 109 y 132 pueden incluir, donde SEQ ID NO. 178-185 quedan fuera del ámbito de la presente invención:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A35775-VL (SEQ ID NO. 178));
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKTPKLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A35783-VL (SEQ ID NO. 179));
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A35774-VL (SEQ ID NO. 180));
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFAVYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A36443-VL (SEQ ID NO. 181));
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A35777-VL (SEQ ID NO. 182));
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSL
HSGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A35789-VL (SEQ ID NO. 183));
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKTPKLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A36448-VL (SEQ ID NO. 184));
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSL
HSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(A36437-VL (SEQ ID NO. 185));
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(135C VL1 (SEQ ID NO. 186));
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAVKLUYHTSSL
HSGVPLRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(135CVL2 (SEQ ID NO. 187));
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKSDGAVKLLIYHTSSL
HSGVPLRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(135C VL3 (SEQ ID NO. 188));
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK
(135C VL1b (SEQ ID NO. 189));
y / o,
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSSL
HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLELK
(135C VL1c (SEQ ID NO. 190)).
También se describen en el presente documento secuencias de ácido nucleico que codifican estas secuencias de aminoácidos, y/o procedimientos para determinar las mismas (por ejemplo, SEQ ID NOS. 191-243). Cualquiera de las secuencias variables humanizadas compatibles mostradas anteriormente o divulgadas de otro modo en el presente documento puede combinarse entre sí para proporcionar un agente(s) de unión, como un anticuerpo que se une a PD-1. Por ejemplo, SEQ ID NOS. 143 y 155 pueden combinarse en un agente de unión (por ejemplo, como en mAb A35795) (no según la presente invención); SEQ ID NOS. 166 y 180 pueden combinarse en un agente de unión (por ejemplo, como en mAb A35774) (no según la presente invención); SEQ ID NOS. 196 y 189 pueden combinarse en un agente de unión (por ejemplo, como en mAb 135cH1cL1b); SEQ ID NOS. 196 y 190 pueden combinarse en un agente de unión (por ejemplo, como en mAb 135cH1cL1c). Además, las cadenas pesadas y ligeras variables pueden estar presentes dentro de un aglutinante (por ejemplo, combinadas).Tabla 2muestra combinaciones de cadenas pesadas y ligeras variables dentro de un aglutinante donde 135C V<h>1/V<i>1, 135C V<h>2/V<i>2, 135C V<h>3/V<i>3, 135C Vn1b/Vi1b.
135C V<h>1<c>/V<i>1c y 135C VH1d/Vi 1c están dentro del alcance de la presente invención.
Tabla 2
Un anticuerpo "bloqueante" es aquel que compite con PD-L1 por la unión a PD-1 en la superficie celular según se determina por medio de cualquier ensayo adecuado incluyendo, pero sin limitación, el ensayo bioquímico de interacción PD-1 / PD-L1 de Luminex (Figuras 1). Los estudios de mapeo de epítopos realizados con anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes también mapean regiones de PD-1 que se solapan con la interacción PD-1 / PD-L1. Un anticuerpo "no bloqueante" es aquel que solo compite parcialmente o no compite con PD-L1 para unirse a PD-1 en un ensayo adecuado, incluyendo pero sin limitarse al ensayo bioquímico de interacción PD-1 / PD-L1 de Luminex (Figura 1). Los estudios de mapeo de epítopos y/o los estudios de co-cristalización de PD-1/ Fab humanos confirman que los anticuerpos no bloqueantes no se unen a PD-1 en un sitio que se solapa con la interacción PD-1 / PD-L1. Un agente de unión puede comprender dos o más pares de tales secuencias en, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, SEQ ID NOS. 143 y 155, así como SEQ ID NOS. 166 y 180, que están fuera del alcance de la presente invención, pueden combinarse en un agente aglutinante, o en una combinación de agentes aglutinantes). También pueden ser útiles otras combinaciones, como podrá comprobar un experto en la materia.
Agentes de unión que comprenden las CDR deTablas 1Ay/o1B,o descritas de otro modo en el presente documento (por ejemplo, que comprenden cualquiera de SEQ ID NOS. 139-190 y/o se muestran en laTabla 2), también pueden presentar las siguientes características:
Tabla 3
Como se explica en la sección Ejemplos, los estudios de mapeo de epítopos revelaron al menos dos parches conservados (que comprenden epítopos lineales y/o conformacionales) en PD-1 a los que pueden unirse los agentes de unión descritos en el presente documento, designados "P1" y "P2" (véase, por ejemplo, lasFigs. 11ay11b).El parche P1 está evolutivamente conservado y corresponde a la región central de PD-1 implicada en la interacción entre PD-1 y los ligandos PD-L1 /PD-L2, y se corresponde con los círculos morados deFig. 2yFig. 11a.El segundo "parche" P2 también está conservado evolutivamente y ocupa una superficie similar pero con secuencias de aminoácidos diferentes (Fig. 11b) que el parche P1. P2 no tiene un papel estructural o funcional previamente identificado en PD-1. Agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento, tales como anticuerpos anti-PD-1 que comprenden las secuencias de aminoácidos de 135C12 (SEQ ID NOS. 17, 40, 63, 86, 109 y 132), 139D6 (SEQ ID NOS. 2, 25, 48, 71, 94 y 117), 135D1 (SEQ ID NOS. 3, 26, 49, 72, 95 y 118) (no según la presente invención), y 136B4 (SEQ ID NOS. 19, 42, 65, 88, 111, y 134) (no de acuerdo con la presente invención), se unen a epítopos que se solapan con el parche P2, proporcionando así pruebas directas de la importancia funcional de esta región funcional de PD-1 recientemente identificada. La sección Ejemplos describe estudios de mapeo de epítopos que se llevaron a cabo mediante el uso de los polipéptidos PD-1 modificados que se muestran en laFig.3 y s Eq ID NOS. 244-274. Estos estudios revelaron que los anticuerpos no bloqueantes con la mayor "potencia funcional" o "actividad antagonista" se unen a un "parche" de PD-1 que se solapa con la región de las sustituciones de aminoácidos M4 (serina 38 por alanina, prolina 39 por alanina y leucina 41 por alanina (Fig. 3; SEQ ID NO. 247)), y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M17 (asparagina 102 por alanina y arginina 104 por alanina (Fig. 3; SEQ ID NO. 260), y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M18 (ácido aspártico 105 por alanina (Fig. 11; SEQ ID NO. 261), y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M26 (arginina 138 por alanina y ácido glutámico 141 por alanina (Fig.
3; SEQ ID NO. 269)) y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M31 (leucina 41 por alanina y valina 43 por leucina (Fig. 3; SEQ ID NO. 274). Este "parche" se denomina en lo sucesivo "P2". Estos estudios demuestran que P2 comprende al menos un epítopo (lineal, conformacional o una combinación de los mismos) al que se unen dichos anticuerpos no bloqueantes. Dado que esta región no tiene ninguna implicación previa en la actividad funcional de PD-1, se propone en la presente memoria que la unión a P2 representa un nuevo mecanismo de acción en un nuevo sitio de PD-1 en el que puede ejercerse una actividad antagonista hacia PD-1. Se propone además en el presente documento que otros anticuerpos, fragmentos de anticuerpos u otros agentes de unión a proteínas que pueden interactuar con la región P2 de PD-1 también pueden actuar como antagonistas de PD-1 de manera distinta y complementaria a los anticuerpos anti-PD-1 que actúan a través del bloqueo de la interacción PD-1 /PD-L1. Los agentes de unión descritos en la presente memoria, por ejemplo, interactuar con un ligando aún no identificado; interferir con, inducir y/o potenciar la multimerización de PD-1; y/o, al interactuar con (p. ej., unirse a) P2, alterar la señalización intracelular asociada a PD-1. En consecuencia, los agentes de unión descritos en el presente documento que interactúan con (por ejemplo, se unen a) P2 pueden proporcionar la función antagonista de PD-1 a través de cualquiera de estos mecanismos, o de cualquier otro aún por identificar.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona procedimientos para afectar a la función de PD-1 interactuando con este parche P2 de PD-1 en o sobre una célula. Los residuos de aminoácidos en el parche P2 de la PD-1 pueden comprender treonina 36, fenilalanina 37, serina 38, prolina 39, leucina 41, valina 43, alanina 50, treonina 51, fenilalanina 52, treonina 53, cisteína 54, serina 55 asparagina 102, arginina 104, ácido aspártico (aspartato) 105, fenilalanina 106, histidina 107, metionina 108, arginina 138 y ácido glutámico (glutamato) 141, la numeración de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO. 275. En algunas realizaciones, los residuos de aminoácidos del parche P2 pueden comprender treonina 36, fenilalanina 37, alanina 50, treonina 51, fenilalanina 52, treonina 53, cisteína 54, serina 55, ácido aspártico (aspartato) 105, fenilalanina 106, histidina 107 y metionina 108, correspondiendo la numeración de aminoácidos a SEQ ID NO. 275. En algunas realizaciones, los residuos de aminoácidos del parche P2 pueden comprender residuos de aminoácidos serina 38, prolina 39, leucina 41, valina 43, asparagina 102, arginina 104, y/o ácido aspártico (aspartato) 105. De este modo, en algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender interactuar con los aminoácidos treonina 36, fenilalanina 37, serina 38, prolina 39, leucina 41, valina 43, alanina 50, treonina 51, fenilalanina 52, treonina 53, cisteína 54, serina 55, asparagina 102, arginina 104, ácido aspártico (aspartato) 105, fenilalanina 106, histidina 107, y/o metionina 108, la numeración de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO. 275. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender interaccionar con los aminoácidos treonina 36, fenilalanina 37, alanina 50, treonina 51, fenilalanina 52, treonina 53, cisteína 54, serina 55, ácido aspártico (aspartato) 105, fenilalanina 106, histidina 107 y/o metionina 108. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender interaccionar con el aminoácido serina 38, prolina 39, leucina 41, valina 43, asparagina 102, arginina 104, y/o ácido aspártico (aspartato) 105. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende interactuar con cualquier aminoácido dentro y/o superpuesto al parche P2 (por ejemplo, porciones de PD-1 que comprenden los residuos de aminoácidos descritos anteriormente). En algunas realizaciones de dichos procedimientos, el procedimiento comprende interactuar con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a la serina 38, prolina 39 y/o leucina 41 de SEQ ID NO. 275 (M4; Fig. 3; SEQ ID NO. 247); y/o uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a asparagina 102 y/o arginina 104 en relación con S<e>Q ID NO. 275 (M17; Fig. 3; SEQ ID NO. 260); y/o uno o más residuos de aminoácido correspondientes al ácido aspártico (aspartato) 105 en relación con SEQ ID NO. 204 (M18; Fig. 3; SEQ ID NO. 261); y/o uno o más residuos de aminoácido correspondientes a arginina 138 y/o ácido glutámico (glutamato) 141 (M26; Fig. 3; SEQ ID NO. 269) y/o uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a leucina 41 y/o valina 43 (M31; Fig. 3; SEQ ID NO. 274). En algunas de dichas realizaciones, la interacción puede disminuirse y/o eliminarse modificando (por ejemplo, sustituyendo, eliminando) uno o más de dichos residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden afectar antagónicamente la función de PD-1. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden interactuar con PD-1 mediante el uso de un agente de unión a PD-1. En algunas realizaciones, el agente de unión a PD-1 tiene especificidad para una región (por ejemplo, un epítopo) que comprende uno o más de dichos residuos de aminoácidos correspondientes como, por ejemplo, leucina 41 y/o valina 43 (M4) de SEQ ID NO. 275; y/o uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a asparagina102 y/o arginina104 (M17) en relación con SEQ ID NO. 275. En algunas realizaciones, la interacción puede implicar un agente de unión que tenga la capacidad de unirse a PD-1 (SEQ ID NO. 275) pero no PD-1 M4 (Se Q ID NO. 247), y/o implican un agente de unión que tiene la capacidad de unirse a PD-1 (SEQ ID NO. 275) pero no PD-1 M17 (SEQ ID NO. 260). En algunas realizaciones, los procedimientos pueden comprender la interacción con PD-1 en un sitio implicado en la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2 (por ejemplo, el parche P1) y P2. La frase "uno o más residuos de aminoácido correspondientes a" un aminoácido "de s Eq ID NO. 275" se refiere a un aminoácido en otra versión de PD-1 posicionada de forma similar a la que se encuentra en SEQ ID NO. 275 (Fig. 3H). Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que un aminoácido en un polipéptido PD-1 distinto de SEQ ID NO. 275 (Fig. 3H) puede determinarse que "corresponde" a un aminoácido concreto de SEQ ID NO. 275 (Fig. 3H) por su contexto dentro del polipéptido. Por ejemplo, PD-1 de mono (SEQ ID NO. 276 (Fig. 3I)) comprende leucina en la posición 41, al igual que SEQ ID NO. 275. Pero la numeración de otra PD-1 puede diferir debido, por ejemplo, a una o más adiciones, supresiones y/o sustituciones de tal manera que la leucina "correspondiente" en esa PD-1 particular puede encontrarse, por ejemplo, en la posición 40 o 43. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderían que esa leucina "corresponde" a la leucina 41 en relación con su contexto dentro del SEQ ID NO. 275 (Fig. 3H) (por ejemplo, puede estar rodeado por los aminoácidos PAy LV como en SEQ ID NO. 275 (Fig. 3H)). En algunas realizaciones, el agente de unión tiene la capacidad de unirse a los aminoácidos F37, P39, A40, L41, V43, L138, R139 y R143 de PD-1 (SEQ ID NO. 275); y/o P34, S137 y R139 de PD-1 (SEQ ID NO. 275) (por ejemplo, A35774 incluyen F37, P39, A40, L41, V43, L138, R139 y R143 para los bucles V<h c>D<r>y P34, E136, S137 y R139 para los bucles V<l>CDR). En el presente documento también se contemplan otras formas de realización de dichos procedimientos y aminoácidos (por ejemplo, uno "correspondiente a" otro), tal y como entenderían aquellos con conocimientos ordinarios en la materia.
La afinidad de unión puede determinarse por medio de cualquier técnica disponible para aquellos con conocimientos ordinarios en la materia. Los datos de afinidad de unión presentados en la Tabla 3 se evaluaron por medio de tinción por citometría de flujo de la superficie celular endógena de PD-1 en células T CD4 que se estimularon durante un periodo de 3 a 6 días con fitohemaglutinina (PHA). La clase de enlace también puede determinarse por medio de cualquier técnica disponible para los expertos en la técnica. Los datos de clase de unión presentados en la Tabla 3 se determinaron mediante estudios de unión competitiva por ensayo Luminex. En la Tabla 3, los anticuerpos mAb de clase 1 de unión son aquellos que se ha determinado que son competitivos con el anticuerpo comercial clon EH12.2H7 (disponible en BioLegend, San Diego, CA (por ejemplo, Cat. No. 329905)); los anticuerpos de clase 2 son aquellos que se ha determinado que son competitivos con el anticuerpo comercial clon J116 (disponible en Affymetrix eBioscience, San Diego, CA (por ejemplo, Cat. N° 16-9989-80)); y los anticuerpos de clase 3 son aquellos que se ha determinado que son competitivos con los anticuerpos EH12.2H7 y J116; y los anticuerpos clonados mAb de clase 4 son aquellos que se ha determinado que se unen a PD-1 en presencia de los anticuerpos EH12.2H7 y J116.
El efecto proliferativo puede determinarse por medio de cualquier técnica disponible para aquellos con habilidad ordinaria en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse el sistema EFRA descrito anteriormente y empleado en el Ejemplo 1. Dicho ensayo se utilizó para determinar los datos del efecto proliferativo presentados en la Tabla 3. Brevemente, un ensayo de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) en el que se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un individuo infectado crónicamente por el VIH y se estimularon con un péptido específico del VIH en presencia y ausencia de un anticuerpo anti-PD-1. Un anticuerpo anti-PD1 de control (el anticuerpo MK-3475 de Merck, también denominado pembrolizimab o Keytruda (descrito en Pat.EE.UU.). N° 8.354.509 y 8.900.587 y disponible en Merck & Co.); y/o que comprenden RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO. 287), LASYLES (SEQ ID NO.
288), QHSRDLPLT (SEQ ID NO. 289), NYYMY (SEQ ID NO. 290), GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO. 291), y/o RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO. 292)) como control positivo. Tras una incubación de seis días, se evaluó la proliferación de células T CD8 específicas del VIH en las muestras tratadas con anti-PD-1 en relación con el control de péptido solo y el resultado se expresó como porcentaje por encima del control ("efecto de proliferación").
En algunas realizaciones, las técnicas usadas para identificar y caracterizar agentes de unión a PD-1 tales como anticuerpos pueden combinarse para proporcionar un sistema para identificar y caracterizar tales agentes de unión. Por ejemplo, uno o más agentes de unión candidatos, como uno o más anticuerpos monoclonales, pueden ensayarse por medio de EFRA o un ensayo similar para determinar la capacidad del agente de unión candidato para restaurar la función de las células inmunitarias, medida, por ejemplo, mediante la proliferación en presencia de un péptido inmunogénico. En algunas realizaciones, este tipo de ensayo se puede utilizar como un cribado inicial para garantizar que los agentes de unión candidatos que se van a seguir estudiando son capaces de restaurar la función de las células inmunitarias. En algunas realizaciones, estos tipos de ensayos pueden ir seguidos de uno para determinar la afinidad de unión a células inmunitarias como las células mononucleares de sangre periférica activadas (PBMC). En algunas realizaciones, este ensayo puede utilizar una técnica como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). En algunas realizaciones, el ensayo puede incluir la presencia o ausencia de unión no específica y/o estudios de unión competitiva mediante el uso de reactivos de unión conocidos como el anticuerpo anti-PD1 (por ejemplo, el anticuerpo MK-3475 de Merck). Estos ensayos pueden ir seguidos de la secuenciación de las CDR de los agentes de unión candidatos, tal como se proporciona en lasTablas 1Ay/o1Banteriores. En conjunto, pues, los procedimientos EFRA, de determinación de afinidad, de estudios de cartografía de epítopos y de identificación de CDR descritos en la presente memoria proporcionan un sistema con el que se puede identificar un candidato a agente de unión.
Cualquiera de las secuencias de aminoácidos deTablas 1Ay/o1B,y/o cualquiera de SEQ ID NOS. 139-190 (y/o uno o más fragmentos y/o derivados de los mismos) también pueden sustituirse por cualquier otro aminoácido que desee un experto en la técnica. Por ejemplo, un experto en la técnica puede llevar a cabo sustituciones conservadoras sustituyendo aminoácidos particulares por otros como se muestra en laTabla 4a continuación. La sustitución específica de aminoácidos seleccionada puede depender de la ubicación del sitio seleccionado. Tales sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo de forma que haya poco o ningún efecto sobre el tamaño, la polaridad, la carga, la hidrofobicidad o la hidrofilicidad del residuo de aminoácido en esa posición y, en particular, no dé lugar a una disminución de la unión a PD-1.
Tabla 4
Por lo tanto, se contemplan en el presente documento sustituciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras, en las secuencias de aminoácidos de los agentes de unión descritos en el presente documento. Por ejemplo, pueden llevar a cabose sustituciones de aminoácidos que correspondan a las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas (V<h>) y ligeras (V<l>) variables humanizadas descritas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NOS. 139-190). Las sustituciones no conservadoras y conservadoras, tal como las mismas pueden caracterizarse mediante el uso deTabla 4,se muestran a continuación enTablas 5-8(véase tambiénFig.25A-D):
Tabla 5
Tabla 6
Tabla 7
Tabla 8
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona agentes de unión con múltiples especificidades tales que PD-1 y al menos otro antígeno secundario (por ejemplo, una proteína de superficie celular) pueden unirse por un único agente de unión. En algunas realizaciones, el antígeno secundario puede ser uno expresado por células infectadas por un agente infeccioso. Por ejemplo, un antígeno secundario ejemplar puede ser el antígeno Env del VIH. Dichos agentes aglutinantes pueden unirse al antígeno secundario y/o pueden servir para neutralizar el agente infeccioso. En ciertas realizaciones, tales como en el caso de un agente de unión biespecífico que tenga doble especificidad para PD-1 y un antígeno del VIH como Env y/u otro antígeno, por ejemplo. El inmunógeno del VIH puede derivarse de cualquiera de los subtipos descritos en el presente documento, o de cualquier otro. En algunas realizaciones, dichos agentes aglutinantes pueden incluir: PD-1 agonista / unión Env; PD-1 agonista PD-1 / unión Env y neutralización; PD-1 antagonista / unión Env; y / o PD-1 antagonista / PD-1 / unión Env y neutralización. Dada la preponderancia de los diversos subtipos, puede ser preferente seleccionar antígenos de los subtipos B y/o C del VIH-1. También puede ser deseable incluir agentes de unión que tengan especificidad para antígenos de múltiples subtipos del VIH (por ejemplo, los subtipos B y C del VIH-1, los subtipos A y B del VIH-2, o una combinación de los subtipos VIH-1 y VIH-2) en una única composición. A fin de tratar una enfermedad tal como el cáncer, puede ser beneficioso obtener agentes de unión con múltiples especificidades PD-1 (p. ej., anticuerpos PD-1 antagonistas PD-1a/PD1b biespecíficos para dos epítopos diferentes) y/o especificidad tanto para PD-1 como para uno o más antígenos tumorales (p. ej., antígeno cáncer-testículo (CT) (es decir, MAGE, NY-ESO-1); antígeno de diferenciación de melanocitos (es decir, Melan A/MART-1, tirosinasa, gp100); antígeno mutacional (es decir, MUM-1, p53, CDK-4); antígeno "propio" sobreexpresado (es decir, HER-2/neu, p53); y/o antígenos víricos (es decir, VPH,<v>E<b>)). Los agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) pueden generarse como se ha descrito anteriormente. Las especificidades de dichos agentes de unión pueden recombinarse en un único agente de unión mediante el uso de técnicas ampliamente disponibles para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, también pueden combinarse y utilizarse (por ejemplo, administrarse) múltiples agentes de unión de especificidad única para proporcionar un reactivo de especificidad múltiple eficaz.
En algunas realizaciones, los agentes de unión descritos en el presente documento pueden conjugarse con agentes activos para dirigirse e inhibir la función de y/o eliminar poblaciones celulares que expresan PD-1 (y/o otro antígeno en el caso de agentes de unión con especificidades múltiples). Por ejemplo, las poblaciones de células T CD4+ que contienen VIH competente para la replicación pueden dirigirse y eliminarse mediante el uso de conjugados de fármaco/agente de unión (por ejemplo, conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC)). Los agentes de unión candidatos mono- y/o bi-específicos pueden conjugarse con uno o más tipos de fármacos (por ejemplo, fármacos que dañan el ADN, dirigidos a los microtúbulos). Los agentes de unión descritos en el presente documento y/o derivados de los mismos también pueden unirse a y/o conjugarse con agentes funcionales para usoin vitroy/oin vivo.Por ejemplo, el agente de unión puede estar unido y/o conjugado a moléculas funcionales como fármacos citotóxicos o toxinas, y/o fragmentos activos de los mismos como la cadena A de la difteria, la cadena A de la exotoxina, la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la curcina, la crotina, la fenomicina, la enomicina, entre otros. Las moléculas funcionales adecuadas también pueden incluir radioquímicos. Los agentes de unión, como los anticuerpos, pueden unirse y/o conjugarse con uno o más agentes funcionales mediante técnicas habituales en la técnica.
En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden administrarse junto con otros agentes tales como agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antibióticos, medicamentos antivirales). Por ejemplo, los agentes de unión descritos en el presente documento pueden combinarse con anticuerpos monoclonales y/u otros reactivos como Nivolumab (también conocido como MDX-1106, BMS-936558 (Topalian, et al.). N. Eng. J. Med. 2012; 366(26): 2443-2454), MDX-1106, ONO-4538, un mAb IgG4 totalmente humano disponible en Bristol-Myers Squibb), Pembrolizumab (también conocido como MK-3475 y SCH 900475, un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado disponible en Merck), Pidilizumab (un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado disponible en CureTech), AMP-224 (una proteína de fusión B7-DC/IgG1 disponible en GlaxoSmithKline / Amplimmune), y/o un anticuerpo u otro reactivo o procedimiento descrito en cualquiera de U.S. Pat. No. 8.354.509B2 (Carven, et al), Pat. de EE.UU. N° 8.008.449B2 (Korman, et al), WO 2012/135408A1 (Manoj, et al.), US 2010/026617 (Carven, et al.), WO 2011/110621A1 (Tyson, et al), U.S. Pat. N° 7.488.802B2 (Collins, et al.), WO 2010/029435A1 (Simon, et al.), WO 2010/089411A2 (Olive, D.), WO 2012/145493A1 (Langermann, et al.), WO 2013/0435569A1 (Rolland, et al.), WO 2011/159877A2 (Kuchroo, et al.), U.S. Pat. No.
7.563.869B2 (Ono Pharm.), Pat.EE.UU. No. 7,858,746B2 (Honjo, et al.), Pat. de EE.UU. No. 8,728,474B2 (Ono Pharm.), y/o U.S. Pat. N° 9.067.999 (Ono Pharm.). De acuerdo con una realización preferente, cualquiera de los agentes de unión a PD-1 puede fusionarse a otros agentes de unión para formar moléculas de unión biespecíficas, en particular anticuerpos biespecíficos. Dichas moléculas biespecíficas acoplan ventajosamente el agente de unión a PD1 con otro agente de unión a PD1, o con otro agente de unión dirigido a inhibidores o moduladores de puntos de control, en particular CTLA-4, LAG3, TIM3, CD137, 4-1BB, OX40, CD27, GITR (Factor de Necrosis Tumoral Inducido por Glucocorticoides), CD40, KIR, IDO IL-2, IL-21 y CSF-1R (Receptor del Factor 1 Estimulador de Colonias). También se contemplan en el presente documento otras combinaciones y/o moléculas de unión biespecíficas, como comprenderían los expertos en la técnica.
Como se ha mencionado anteriormente, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento (por ejemplo, un antagonista de PD-1) pueden usarse para tratar y/o prevenir y/o mejorar los síntomas de la infección por VIH. Como es bien sabido, los aislados de VIH se clasifican actualmente en subtipos genéticos diferenciados. Se sabe que el VIH-1 comprende al menos diez subtipos (A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J y K) (Taylor et al, NEJM, 359(18):1965-1966 (2008). Se sabe que el VIH-2 incluye al menos cinco subtipos (A, B, C, D y E). El subtipo B se ha asociado a la epidemia de VIH en hombres homosexuales y usuarios de drogas intravenosas en todo el mundo. La mayoría de los inmunógenos, aislados adaptados en laboratorio, reactivos y epítopos mapeados del VIH-1 pertenecen al subtipo B. En el África subsahariana, la India y China, zonas donde la incidencia de nuevas infecciones por VIH es elevada, el subtipo B del VIH-1 sólo representa una pequeña minoría de las infecciones, y el subtipo C del VIH-1 parece ser el subtipo infeccioso más común. Cualquiera de estos tipos de aislados puede abordarse mediante el uso de los agentes aglutinantes descritos en la presente memoria. Uno o más agentes de unión también pueden administrarse con o junto con uno o más agentes utilizados para prevenir, tratar y/o mejorar el VIH tal como, por ejemplo, un inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la entrada del VIH, un inhibidor de la transcriptasa inversa y/o un análogo de nucleósido antirretroviral. Los compuestos adecuados incluyen, por ejemplo, Agenerase (amprenavir), Combivir (Retrovir / Epivir), Crixivan (indinavir), Emtriva (emtricitabina), Epivir (3tc / lamivudina), Epzicom, Fortovase / Invirase (saquinavir), Fuzeon (enfuvirtida), Hivid (ddc / zalcitabina), Kaletra (lopinavir), Lexiva (Fosamprenavir), Norvir (ritonavir), Rescriptor (delavirdina), Retrovir / AZT (zidovudina), Reyatax (atazanavir, BMS-232632), Sustiva (efavirenz), Trizivir (abacavir / zidovudina / lamivudina), Truvada (emtricitabina / tenofovir DF), Videx (ddl / didanosina), Videx EC (ddl, didanosina), Viracept (nevirapina), Viread (tenofovir disoproxil fumarato), Zerit (d4T / estavudina) y Ziagen (abacavir). Otros agentes adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser adecuados para el uso descrito en el presente documento. Dichos agentes pueden utilizarse antes, durante o después de la administración de los agentes aglutinantes y/o del uso de los procedimientos descritos en la presente memoria.
Como se ha mencionado anteriormente, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento (por ejemplo, un antagonista de PD-1) pueden usarse para tratar y/o prevenir y/o mejorar los síntomas del cáncer. Cánceres ejemplares pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de mama, sangre, colon, estómago, recto, tejido esquelético, piel (por ejemplo, melanoma) cerebro, pulmón, vejiga, riñón, ovario y / o hígado, entre otros. Además, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento, preferentemente los anticuerpos que son no bloqueantes con respecto a la interacción PD-1/PD-L1, en particular aquellos a los que se hace referencia en el presente documento como Clase de unión II, tales como pero no limitados a 135C12 (de acuerdo con la presente invención), 139D6 (fuera del alcance de la presente invención), 136B4 (fuera del alcance de la presente invención) y 135D1 (fuera del alcance de la presente invención), son particularmente útiles, solos o en combinación unos con otros y/u otros anticuerpos PD-1, para tratar diversos tipos de neoplasias malignas, en particular melanoma (por ej.g., melanoma maligno metastásico), cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de vejiga, cáncer de próstata (por ejemplo, cáncer de próstata resistente a la castración), cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células de Merkel, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma, sarcomas y otras neoplasias malignas. Los agentes de unión a PD-1 preferentes anteriormente están más particularmente dedicados al tratamiento de neoplasias hematológicas tales como la enfermedad de Hodgkin, el linfoma no Hodgkin tal como el linfoma folicular, el linfoma difuso de células B grandes, el mieloma múltiple (MM), la leucemia mieloide aguda (LMA), la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y los síndromes mielodisplásicos. Los agentes aglutinantes descritos en el presente documento también pueden utilizarse para tratar otros tipos de cáncer, como comprenderán los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, uno o más de los agentes de unión a PD-1 también pueden combinarse con y/o administrarse con o junto con uno o más agentes utilizados para prevenir, tratar y/o mejorar el cáncer como, por ejemplo, un agente alquilante (por ejemplo, cualquier mostaza nitrogenada, nitrosourea, tetrazina, aziridina, cisplatino y/o derivados de los mismos), antimetabolito (por ejemplo, cualquiera de los metotrexatos, pemetrexeds, fluoropirimidinas y/o derivados de los mismos), agente antimicrotúbulos (por ejemplo, vinca alquiloides, taxanos, podofilotoxina y/o derivados de los mismos), inhibidores de la topoisomerasa I y/o II (por ejemplo, camptotecina, irinotecán, topotecán, etopósido, doxorrubicina, mitoxantrona, tenipósido, novobiocina, merbarona, aclarubicina y/o sus derivados) y/o antibióticos citotóxicos (por ejemplo, antraciclinas, actinomicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina y/o sus derivados). El uno o más agentes aglutinantes pueden combinarse también, o alternativamente, con uno o más agentes aglutinantes disponibles para los expertos en la técnica para tratar, prevenir y/o mejorar el cáncer como, por ejemplo, Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab y/u otros agentes similares y/o derivados de los mismos. Los uno o más agentes de unión a PD-1 también pueden usarse solos o en combinación con otros agentes de unión dirigidos a PD-1, PDL-1 y/u otros efectores de puntos de control inmunitarios. También pueden utilizarse en combinación con otros agentes antineoplásicos o agentes inmunogénicos (por ejemplo, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorales (incluidas proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células presentadoras de antígenos, como células dendríticas pulsadas con antígenos o ácidos nucleicos derivados del tumor, citocinas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF), y/o células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes, como el GM-CSF, entre otras; tratamientos oncológicos estándar (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia o cirugía); u otros agentes dirigidos contra VEGF, EGFR, Her2/neu, receptores de VEGF, otros receptores de factores de crecimiento. De acuerdo con una realización preferente, uno o más agentes de unión a PD-1 se combinan con agentes vacunales y/o moduladores de puntos de control inmunitarios que actúan más particularmente sobre CTLA-4, LAG3, TIM3, CD137, 4-1BB, OX40, CD27, GITR (Factor de Necrosis Tumoral Inducido por Glucocorticoides), CD40, KIR, IDO IL-2, IL-21 y/o CSF-1R (Receptor del Factor 1 Estimulador de Colonias) para formar una composición terapéutica y/o un kit para administración terapéutica secuencial. Otros agentes adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser adecuados para el uso descrito en el presente documento. Dichos agentes pueden utilizarse antes, durante o después de la administración de los agentes aglutinantes y/o del uso de los procedimientos descritos en la presente memoria.
Como se ha mencionado anteriormente, los agentes de unión a PD-1 descritos en el presente documento (por ejemplo, un agonista de PD-1) pueden usarse para tratar y/o prevenir y/o mejorar los síntomas de autoinmunidad. Las afecciones autoinmunes ejemplares pueden incluir, por ejemplo, cualquiera en la que PD-1 participe en el mantenimiento de la autotolerancia y/o una que implique células T inflamatorias (por ejemplo, células T autoreactivas o específicas de antígeno propio) como, por ejemplo, el lupus eritematoso sistémico (LES), la diabetes tipo I, la artritis reumatoide, la glomerulonefritis y la esclerosis múltiple. Dichos agentes de unión a PD-1 también pueden combinarse con otros agentes como los agentes anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab). Uno o más de los agentes de unión también pueden combinarse con y/o administrarse con o junto con uno o más agentes utilizados para prevenir, tratar y/o mejorar la autoinmunidad como, por ejemplo, glucocorticoides, citostáticos (por ejemplo, agente alquilante, antimetabolito, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, antibióticos citotóxicos (por ejemplo, dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina), anticuerpos (p. ej., Atgam, timoglobulina, Simulect, Zenapax), fármacos que actúan sobre las inmunofilinas (p. ej., ciclosporina, tacrolimus, sirolimus), interferones, opiáceos, agentes de unión al TNF (p. ej., Remicade, Enbrel, Humira), micofenolato, fingolimod, miriocina y/o derivados de los mismos. Otros agentes adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser adecuados para el uso descrito en el presente documento. Dichos agentes pueden utilizarse antes, durante o después de la administración de los agentes aglutinantes y/o del uso de los procedimientos descritos en la presente memoria.
En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden estar unidos a y/o conjugados con una o más etiquetas detectables. Por ejemplo, las etiquetas detectables adecuadas pueden incluir, por ejemplo, fluorosceínas (por ejemplo, DyLight, Cy3, Cy5, FITC, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647; 5-carboxi-2,7-diclorofluoresceína; 5-carboxifluoresceína (5-FAM); 5-HAT (hidroxitriptamina); 5-hidroxitriptamina (HAT); 6-JOE; 6-carboxifluoresceína (6-FAM); FITC; 6-carboxi-1,4-dicloro-2',7'-diclorofluoresceína (TET); 6-carboxi-1,4-dicloro-2',4', 5', 7'-tetra-clorofluoresceína (HEX); 6-carboxi-4',5'-dicloro-2', 7'-dimetoxi-fluoresceína (JOE); fluorescentes Alexa (e.g., 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); fluoróforos BODIPY (ej, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, FI-Ceramida, R6G SE, TMR, conjugado TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE)), rodaminas (por ejemplo, 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-carboxitetrametilrhodamina (5-TAMRA), 5 GLD, 6-carboxirhodamina 6G, lisamina, lisamina rodamina B, falicidina, faloidina, rojo, rod-2, ROX (6-carboxi-X-rodamina), 5-ROX (carboxi-X-rodamina), Sulforodamina B puede C, Sulforodamina G Extra, TAMRA (6-carboxitetrametilrhodamina), Tetrametilrhodamina (TRITC), WT), Texas Red, y/o Texas Red-X. También pueden utilizarse otras etiquetas detectables conocidas en la técnica. Los agentes de unión, tales como los anticuerpos, pueden unirse y/o conjugarse con una o más etiquetas detectables mediante técnicas habituales en la técnica.
En ciertas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más agentes de unión descritos en el presente documento puede insertarse en uno o más vectores de expresión, como se discute a continuación con mayor detalle. En dichas realizaciones, el agente de unión puede estar codificado por nucleótidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos. Las combinaciones particulares de nucleótidos (codones) que codifican los diversos aminoácidos (AA) son bien conocidas en la técnica, como se describe en diversas referencias utilizadas por los expertos en la técnica (por ejemplo, Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994). Las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos de dichos agentes de unión pueden determinarse con referencia a laTabla 9,por ejemplo. Las variantes de ácido nucleico pueden utilizar cualquier combinación de nucleótidos que codifiquen el agente de unión.
Tabla 9
Aquellos expertos en la técnica entienden que una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos particular puede derivarse fácilmente de la secuencia de aminoácidos y la información presentada enTabla 9(y, en algunas realizaciones, por ejemplo,Tablas 5-8). Por ejemplo, puede deducirse de la secuencia de aminoácidos DDFLH (SEQ ID NO.: 1) y la información presentada enTabla 9que la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos GAT TTT TTA CAT (SEQ ID NO.:191). Los expertos en la técnica entenderán que las secuencias de nucleótidos que codifican cualquiera de los SEQ ID NOS. 2-190 pueden deducirse del mismo modo, y dichas secuencias de nucleótidos se contemplan en el presente documento. Cuando los agentes de unión son anticuerpos, las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de los mismos también pueden aislarse de los fagos y/o células de hibridoma que expresan los mismos clonados en vectores de expresión para producir determinadas preparaciones (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de región variable de SEQ ID NOS. 139-190 se muestran en laTabla 10,en la que SEQ ID NOS. 139-171 quedan fuera del ámbito de la presente invención.
Tabla 10
Como es entendido por aquellos expertos en la técnica, las secuencias usadas anteriormente pueden ser modificadas para su uso por, por ejemplo, optimización de codón u otra(s) técnica(s) disponible(s) en la técnica. Los procedimientos para producir dichas preparaciones se describen en el presente documento y/o son bien conocidos y están disponibles para los expertos en la técnica.
A fin de determinar las secuencias de aminoácidos de las regiones variables (por ejemplo, CDR) de interés, pueden seleccionarse células de hibridoma de ratones inmunizados con un antígeno / inmunógeno PD-1 mediante el uso de los ensayos funcionales descritos en el presente documento y técnicas de clonación que están fácilmente disponibles para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, para aislar y secuenciar ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los hibridomas seleccionados, puede extraerse ARN total de células de hibridoma frescas usando reactivo TRIzol según el protocolo del fabricante. Puede sintetizarse ADNc a partir del ARN usando cebadores antisentido específicos de isotipo o cebadores universales usando técnicas estándar (por ejemplo, siguiendo el manual técnico de PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit). A continuación, puede llevar a cabose la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables (cadenas pesada y ligera) del anticuerpo producido por el hibridoma seleccionado, que luego pueden clonarse en un vector de clonación estándar por separado y secuenciarse. A continuación, puede llevar a cabose un cribado de colonias por PCR para identificar clones con inserciones de tamaños correctos. Preferentemente, se secuencian no menos de cinco colonias individuales con insertos de tamaños correctos para cada región variable de anticuerpo. A continuación, pueden utilizarse protocolos estándar para la expresión y purificación de los anticuerpos anti-PD-1. Por ejemplo, los clones de hibridoma pueden cultivarse en medio libre de suero y el caldo de cultivo celular centrifugarse y luego filtrarse. A continuación, el sobrenadante filtrado que contiene el anticuerpo puede cargarse en una columna de afinidad (por ejemplo, proteína A), lavarse y eluirse con un tampón adecuado (por ejemplo, tampón de elución Pierce IgG). A continuación, las fracciones eluidas pueden juntarse y lavarse con tampón en PBS, pH 7,2. A continuación, el anticuerpo purificado puede analizarse por medio de s DS-PAGE y Western blot mediante el uso de protocolos estándar de peso molecular, rendimiento y pureza. A continuación, puede llevar a cabose una cromatografía de exclusión por tamaño HPLC en una columna adecuada (por ejemplo, la columna TSK GEL-G3000 SWXL (Tosoh)) para la caracterización biofísica con el fin de garantizar una alta pureza del anticuerpo (generalmente >90%) con baja presencia de agregados proteicos. Estos procedimientos se utilizaron para aislar y secuenciar los ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NOS. 1-190 de células seleccionadas y otras fuentes. Estas técnicas, variaciones de las mismas y/u otras también pueden ser de utilidad para estos fines, como entenderían los expertos en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más agentes de unión a PD-1 pueden estar contenidas dentro de un vector viral y/o no viral. En una realización, se utiliza un vector de ADN para administrar ácidos nucleicos que codifican uno o más agentes de unión a PD-1 al paciente. Para ello, pueden utilizarse diversas estrategias para mejorar la eficacia de dichos mecanismos, incluyendo, por ejemplo, el uso de replicones virales autorreplicantes (Caley, et al.).
1999. Vacuna, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cancer Res. 60: 51 55), optimización de codón (Liu, et al. 2000. Mol. Ther., 1: 497-500; Dubensky,supra;Huang, et al. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951), electroporaciónin vivo(Widera, et al.). 2000. J. Immunol. 164: 4635-3640), incorporación de ácidos nucleicos que codifican moléculas coestimuladoras, citocinas y/o quimiocinas (Xiang, et al.). 1995. Inmunidad, 2: 129135; Kim, et al. 1998. Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103; Iwasaki, et al. 1997. J. Immunol. 158: 4591-3601; Sheerlinck, et al. 2001. Vacuna, 19: 2647-2656), incorporación de motivos estimuladores como CpG (Gurunathan,supra;
Leitner,supra),secuencias para la orientación de las vías endocítica o de procesamiento de ubiquitina (Thomson, et al.). 1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166: 5366-5373), regímenes prime-boost (Gurunathan,supra;Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vacuna, 16: 439-445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74), sitios de escisión sensibles al proteasoma y el uso de vectores de administración en mucosas comoSalmonella(Darji, et al.). 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, et al. 2001. Vacuna, 19: 2945-2954). En la técnica se conocen otros procedimientos, algunos de los cuales se describen a continuación. Varios vectores virales que se han utilizado con éxito para introducir un ácido nucleico en un huésped incluyen retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), virus del herpes y poxvirus, entre otros. Los vectores pueden construirse utilizando técnicas recombinantes estándar ampliamente disponibles para un experto en la técnica. Dichas técnicas pueden encontrarse en referencias comunes de biología molecular como Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), y PCR Protocols: Guía de procedimientos y aplicaciones (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, ca). Los vectores plasmídicos "no virales" también pueden ser adecuados en determinadas realizaciones. Los vectores plasmídicos preferidos son compatibles con células huésped bacterianas, de insectos y/o de mamíferos. Dichos vectores incluyen, por ejemplo, PCR-ii, PCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSii (Stratagene, La Jolla, CA), pet15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFp-n2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETI (Bluebacii, Invitrogen), pDSR-alfa (PCT pub.). N° WO 90/14363) y pFASTBACdual (Gibco-BRL, Grand island, N<y>), así como derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido basado en COLe1 de alto número de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), plásmidos de clonación por PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados por TAQ (por ejemplo, TOPO™ TA cloning® kit, PCR2.1® plasmid derivatives, Invitrogen, Carlsbad, CA). También pueden utilizarse vectores bacterianos. Estos vectores incluyen, por ejemplo,Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille Calmette Guérin (BCG) y Streptococcus(véase, por ejemplo, WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; yW O 92/21376). Muchos otros sistemas y vectores de expresión de plásmidos no virales son conocidos en la técnica y pueden utilizarse. También pueden ser suficientes otras técnicas de administración, por ejemplo, complejos ADN-ligando, complejos adenovirus-ligando-ADN, inyección directa de ADN, precipitación de CaPO<4>, técnicas de pistola génica, electroporación y sistemas de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, tales como emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferente es un liposoma, que son vesículas de membrana artificial útiles como vehículos de administraciónin vitroein vivo.El ARN, el ADN y los viriones intactos pueden encapsularse en el interior acuoso y llegar a las células en forma biológicamente activa (Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem.). Sci., 6: 77). La composición del liposoma suele ser una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta temperatura de transición de fase, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden utilizarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Algunos ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas son los compuestos fosfatidilados, tales como el fosfatidilglicerol, la fosfatidilcolina, la fosfatidilserina, la fosfatidiletanolamina, los esfingolípidos, los cerebrósidos y los gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en los que la fracción lipídica contiene entre 14 y 18 átomos de carbono, en particular entre 16 y 18 átomos de carbono, y está saturada. Algunos fosfolípidos ilustrativos son la fosfatidilcolina de huevo, la dipalmitoilfosfatidilcolina y la distearoylfosfatidilcolina.
También se proporciona una célula cultivada que comprende el vector. La célula cultivada puede ser una célula cultivada transfectada con el vector o una progenie de la célula, en la que la célula expresa el polipéptido inmunogénico. Las líneas celulares adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica y están disponibles comercialmente, por ejemplo, a través de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células transfectadas pueden utilizarse en un procedimiento de producción de un polipéptido inmunogénico. El procedimiento comprende el cultivo de una célula que comprende el vector en condiciones que permitan la expresión del polipéptido inmunogénico, opcionalmente bajo el control de una secuencia de expresión. El polipéptido inmunogénico puede aislarse de la célula o del medio de cultivo mediante el uso de procedimientos estándar de purificación de proteínas.
El experto en la técnica dispone de muchas técnicas adecuadas para utilizar los agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos) descritos en el presente documento para identificar muestras biológicas que contienen proteínas que se unen a los mismos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos para aislar PD-1 mediante el uso de, por ejemplo, inmunoprecipitación u otro ensayo de tipo captura. Esta conocida técnica se realiza uniendo el anticuerpo a un soporte sólido o material cromatográfico (por ejemplo, una perla recubierta con Proteína A, Proteína G y/o Proteína L). A continuación, el anticuerpo unido se introduce en una solución que contiene o se cree que contiene la PD-1 (por ejemplo, un lisado de células T infectadas por el VIH). A continuación, la PD-1 puede unirse al anticuerpo y los materiales que no se unen se lavan en condiciones en las que la PD-1 permanece unida al anticuerpo. A continuación, la proteína unida puede separarse del anticuerpo y analizarse como se desee. Procedimientos similares para aislar una proteína mediante el uso de un anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Los agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos) también pueden utilizarse para detectar PD-1 en una muestra biológica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse en ensayos tales como, por ejemplo, análisis de citometría de flujo, ELISA, inmunotransferencia (por ejemplo, Western blot), detecciónin situ,inmunocitoquímica, y/o inmunhistoquímica. Los procedimientos para llevar a cabo tales ensayos son bien conocidos en la técnica.
Los agentes de unión descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar la presencia de un estado de enfermedad en un paciente, para predecir el pronóstico o para determinar la eficacia de un régimen quimioterapéutico u otro régimen de tratamiento. Los ensayos de perfil de expresión, realizados como se describe en el presente documento o como se conoce de otro modo en la técnica, pueden utilizarse para determinar el nivel relativo de expresión de PD-1. A continuación, el nivel de expresión puede correlacionarse con los niveles de base (por ejemplo, de control) para determinar si el paciente padece una enfermedad concreta, su pronóstico o si un régimen de tratamiento concreto es eficaz. Por ejemplo, si el paciente está siendo tratado con un régimen antiinfeccioso concreto, un nivel aumentado o disminuido de expresión de PD-1 en los tejidos del paciente (por ejemplo, en sangre periférica, biopsia de tejido mamario) puede indicar que el régimen está empeorando o mejorando la carga del agente infeccioso en ese huésped. El aumento o disminución de la expresión puede indicar que el régimen está teniendo o no el efecto deseado y, por lo tanto, se puede seleccionar otra modalidad terapéutica.
También es posible utilizar los agentes de unión descritos en el presente documento como reactivos en ensayos de cribado de fármacos para probar, por ejemplo, nuevos candidatos a fármacos. Los reactivos pueden utilizarse para determinar el efecto de un candidato a fármaco sobre la expresión de la diana inmunogénica en una línea celular, o en una célula o tejido de un paciente. La técnica de perfiles de expresión puede combinarse con técnicas de cribado de alto rendimiento para permitir la rápida identificación de compuestos útiles y monitorizar la eficacia del tratamiento con un candidato a fármaco (véase, por ejemplo, Zlokarnik, et al., Science 279, 84-8 (1998)). Los fármacos candidatos pueden ser compuestos químicos, ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos o derivados de los mismos, ya sean naturales o sintéticos. Los fármacos candidatos así identificados pueden utilizarse, entre otros usos, como composiciones farmacéuticas para su administración a pacientes o para su uso en otros ensayos de cribado.
En algunas realizaciones, los agentes de unión están en forma purificada. Un agente de unión "purificado" (por ejemplo, un anticuerpo) puede ser aquel que está separado de al menos aproximadamente el 50% de las proteínas y/u otros componentes con los que se encuentra inicialmente (por ejemplo, como parte de un sobrenadante de hibridoma o de una preparación de ascitis en el caso de un anticuerpo monoclonal). Un agente de unión purificado (por ejemplo, un anticuerpo) puede ser aquel que está separado de al menos aproximadamente el 50%, 60%, 75%, 90% o 95% de las proteínas y/u otros componentes con los que se encuentra inicialmente.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden combinarse con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables antes de la administración a un hospedador. Un portador farmacéuticamente aceptable es un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, por ejemplo, el material puede ser administrado a un individuo, sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera deletérea con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El portador se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el individuo, como sería bien conocido por un experto en la técnica. Los soportes farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen, por ejemplo, en Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). Normalmente, se utiliza en la formulación una cantidad adecuada de una sal farmacéuticamente aceptable para hacer que la formulación sea isotónica. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, agua estéril, solución salina, soluciones tamponadas como la solución de Ringer y la solución de dextrosa. El pH de la solución es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Otros soportes incluyen preparaciones de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen polipéptidos o fragmentos de los mismos. Las matrices pueden presentarse en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para los expertos en la técnica que ciertos portadores pueden ser más preferentes dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración de la composición que se administre. Los soportes son los adecuados para la administración de polipéptidos y/o fragmentos de los mismos a seres humanos u otros individuos. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir portadores, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos, adyuvantes, inmunoestimulantes, además del polipéptido inmunogénico. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios y anestésicos. La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral, parenteral, por pulverización inhalatoria, rectal, intranodal o tópica en formulaciones de unidades de dosificación que contengan portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para lograr o mejorar la administración de un ácido nucleico, polipéptido o péptido como composición farmacéutica. Una "composición farmacéutica" es una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico o polipéptido. Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren cada uno a la cantidad de un agente de unión, ácido nucleico o similar utilizado para observar el efecto terapéutico deseado (por ejemplo, restaurar la función de las células T).
También se proporcionan procedimientos para tratar una o más afecciones de enfermedad (por ejemplo, VIH o cáncer) en un hospedador mamífero que comprenden administrar al mamífero al menos una o más dosis eficaces de uno o más agentes de unión (y/o derivado(s) del mismo) descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente de unión es un anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo que comprende uno o más de los SEQ ID NOS. 1-190, y/o se muestran enTablas 1Ay1B.Por ejemplo, el agente de unión o al menos uno de los agentes de unión en una combinación puede incluir SEQ ID NOS. 143 y 155 (por ejemplo, como en el anticuerpo A35795) (fuera del alcance de la presente invención), SEQ ID NOS. 166 y 180 (por ejemplo, como en el anticuerpo A35774) (fuera del alcance de la presente invención), SEQ ID NOS. 176 y 189 (por ejemplo, como en el anticuerpo 135CH1cL1b) o SEQ ID NOS. 176 y 190 (por ejemplo, como en el anticuerpo 135c H1cL1c), y/o una variante conservadora o no conservadora sustituida de los mismos. Preferentemente, las regiones CDR (es decir, SEQ ID NOS.
1-138) de dichos aglutinantes no se sustituyen. El uno o más agentes aglutinantes pueden administrarse en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg / kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg / kg, o aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg / kg (p. ej., aproximadamente 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 o 40 mg / kg). Las cantidades de cada aglutinante pueden ser iguales o diferentes. En ciertas realizaciones, el uno o más agentes de unión pueden ser administrados al mamífero (por ejemplo, por vía intradérmica, intravenosa, oral, rectal) en aproximadamente 10 mg / kg una o más veces. Cuando se administran dosis múltiples, las dosis pueden comprender aproximadamente la misma o diferente cantidad de agente aglutinante en cada dosis. Las dosis también pueden estar separadas en el tiempo por intervalos iguales o diferentes. Por ejemplo, las dosis pueden estar separadas por aproximadamente 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1,5 años, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, o cualquier periodo de tiempo antes, después y/o entre cualquiera de estos periodos de tiempo. En algunas realizaciones, los agentes de unión pueden administrarse junto con otros agentes (por ejemplo, agentes antiinfecciosos y/o agentes quimioterapéuticos). Estos otros agentes pueden administrarse casi simultáneamente con los agentes aglutinantes, o en un momento y/o frecuencia diferentes. Otras formas de realización de dichos procedimientos también pueden ser apropiadas, como podría determinar fácilmente un experto en la técnica.
A fin de ayudar al experto en la técnica en el uso del agente o agentes de unión tales como anticuerpos descritos en el presente documento, los mismos pueden proporcionarse en formato de kit. Se proporciona un kit que incluye dicho agente de unión, como anticuerpos, y opcionalmente otros componentes necesarios para utilizar los anticuerpos para detectar células que expresan PD-1. Los agentes de unión, como los anticuerpos del kit, pueden suministrarse en cualquier forma adecuada, incluyendo congelados, liofilizados o en un tampón farmacéuticamente aceptable, como TBS o PBS. El kit también puede incluir otros reactivos necesarios para la utilización de los anticuerposin vitrooin vivo,como tampones (por ejemplo, TBS, PBS), agentes de bloqueo (soluciones que incluyen leche en polvo desgrasada, sueros normales, detergente Tween-20, BSA o caseína), y/o reactivos de detección (por ejemplo, biotina IgG antiratón de cabra, conjugados estreptavidina-HRP, aloficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, peroxidasa, etiquetas detectables y otras etiquetas y/o kits de tinción (por ejemplo, ABC Staining Kit, Pierce)). Los kits también pueden incluir otros reactivos y/o instrucciones para utilizar los anticuerpos en ensayos comúnmente utilizados descritos anteriormente como, por ejemplo, análisis de citometría de flujo, ELISA, inmunotransferencia (por ejemplo, western blot), detecciónin situ, inmunocitoquímica, inmunhistoquímica. En una realización, el kit proporciona un agente de unión en forma purificada. En otra realización, el agente de unión puede proporcionarse en forma biotinilada, solo o junto con un reactivo de detección conjugado con avidina (por ejemplo, un anticuerpo). En otra realización, el kit incluye un agente de unión que comprende una o más etiquetas detectables que pueden utilizarse para detectar directamente PD-1. Los tampones y similares necesarios para utilizar cualquiera de estos sistemas son bien conocidos en la técnica y/o pueden ser preparados por el usuario final o suministrados como componente del kit. El kit también puede incluir un soporte sólido que contenga proteínas de control positivas y negativas y/o muestras de tejido. Por ejemplo, los kits para llevar a cabo ensayos de tipo spotting o western blot pueden incluir lisados de células o tejidos de control para su uso en SDS-PAGE o membranas de nylon u otras que contengan muestras de control prefijadas con espacio adicional para muestras experimentales. Los kits para la visualización de PD-1 en células en portaobjetos pueden incluir portaobjetos preformateados que contengan muestras de células o tejidos de control con espacio adicional para muestras experimentales. También se contemplan en el presente documento otras formas de realización de los kits, tal y como entenderían los expertos en la técnica.
De este modo, la presente divulgación proporciona un agente de unión que se une a PD-1 agonística o antagónicamente. Un agente de unión puede ser un polipéptido que comprenda al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NOS. 1-190 y/o se muestran en lasTablas 1Ay1B.El agente de unión puede ser un polipéptido que comprenda una o más combinaciones de SEQ ID NOS. 1-138 (por ejemplo, como se muestra enTablas 1Ay/o1B), y/o cualquiera de los SEQ ID NOS. 139-190. El agente de unión puede ser un anticuerpo. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n Os . 1-23. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS. 24-46. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS. 47-69. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS. 70-92. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID<n>O<s>. 93 115. El agente de unión es un polipéptido tal como un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS. 116-138. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprenda uno o más de los SEQ ID NOS. 164-190, y/o un derivado del mismo sustituido de forma conservadora o no conservadora. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprenda uno o más de los SEQ ID NOS. 139-150 y uno o más de los SEQ ID NOS. 151-163. El agente de unión puede ser un polipéptido tal como un anticuerpo que comprenda uno o más de los SEQ ID NOS. 164 177 y uno o más de los SEQ ID NOS. 178-190. Por ejemplo, el agente de unión o al menos uno de los agentes de unión en una combinación puede incluir SEQ ID NOS. 143 y 155 (por ejemplo, como en el anticuerpo A35795) (no de acuerdo con la presente invención), SEQ ID NOS. 166 y 180 (por ejemplo, como en el anticuerpo A35774) (no de acuerdo con la presente invención), SEQ ID NOS. 176 y 189 (por ejemplo, como en el anticuerpo 135C H1cL1b), y/o SEQ ID NOS. 176 y 190 (por ejemplo, como en el anticuerpo 135<c>H1cL1c), y/o una variante conservadora o no conservadora sustituida de los mismos (como se muestra en, por ejemplo,Tablas 5-8). El agente de unión puede comprender las combinaciones de CDR mostradas enTablas 1Ay/o1By/o tiene las propiedades descritas en una o más deTablas 3y/oTablas 11-13.
En algunas realizaciones, el agente de unión se deriva de o está relacionado con (por ejemplo, por secuencia o derivación) un anticuerpo humano, IgG humana, IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a humana, IgG2b humana, IgG3 humana, IgG4 humana, IgM humana, IgA humana, IgA1 humana, IgA2 humana, IgD humana, IgE humana, anticuerpo canino, IgGA canina, IgGB canina, IgGC canina, IgGD canina, anticuerpo de pollo, IgA de pollo, IgD de pollo, IgE de pollo, IgG de pollo, IgM de pollo, IgY de pollo, anticuerpo de cabra, IgG de cabra, anticuerpo de ratón, IgG de ratón, anticuerpo de cerdo, y/o anticuerpo de rata, y/o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el derivado puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, Fab<2>, Fab' de cadena única, Fv, de cadena única (por ejemplo, scFv), V<hh>/V<h>, anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo trimérico, anticuerpo multiespecífico, anticuerpo multivalente, anticuerpo quimérico, anticuerpo quimérico canino-humano, anticuerpo quimérico canino-ratón, anticuerpo que comprende un Fc canino, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, anticuerpo caninizado, anticuerpo injertado con CDR, anticuerpo tiburón, nanoanticuerpo, y/o anticuerpo canélido, entre otros. Dichos anticuerpos, fragmentos y similares pueden producirse mediante el uso de cualquiera de las técnicas ampliamente disponibles para ello. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados pueden producirse mediante el uso de los procedimientos descritos en U.S. Pat. No. 9,090,994 B2 (Zhang et al.) y/o mediante el uso de uno de los kits y/o sistemas ampliamente disponibles (por ejemplo, como puede estar disponible en entidades comerciales como GenScript® (por ejemplo, el sistema FASEBA)). La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a PD-1 humano y comprende una combinación de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), la combinación que comprende:
SEQ ID NO.: 172 y SEQ ID NO: 186;
SEQ ID NO.: 173 y SEQ ID NO: 187;
SEQ ID NO.: 174 y SEQ ID NO: 188;
SEQ ID NO.: 175 y SEQ ID NO: 189;
SEQ ID NO.: 176 y SEQ ID NO: 190; o
SEQ ID NO.: 177 y SEQ ID NO: 190
En algunas realizaciones no de acuerdo con la presente invención, el agente de unión puede ser un anticuerpo humanizado que comprende al menos uno de SEQ ID NOS. 139-150 y al menos uno de los SEQ ID NOS. 151-163, y/o derivados o variantes de los mismos (por ejemplo, derivados conservadoramente sustituidos o variantes de los mismos). En algunas realizaciones, el aglutinante presenta aproximadamente (es decir, dentro de aproximadamente cualquiera de 250%, 200%, 150%, 100%, 75%, 50%, 25%, 20%, 15%, o 10% de; y/o una afinidad mínima de 10 nM (KD 10<' 8>M)) las afinidades de unión (ka (M'<1>/s_1), kd (s_1), y KD (M)) para PD-1 humana y de mono demostradas por el anticuerpo humanizado A35796 (que comprende SEQ ID NOS. 140 y 152), el anticuerpo humanizado A35793 (que comprende SEQ ID NOS. 141 y 153), el anticuerpo humanizado A35818 (que comprende SEQ ID NOS. 142 y 154), el anticuerpo humanizado A35795 (que comprende SEQ ID NOS. 143 y 155), el anticuerpo humanizado A35797 (que comprende SEQ ID NOS. 144 y 156), el anticuerpo humanizado A35799 (que comprende SEQ ID NOS. 145 y 157), el anticuerpo humanizado A35805 (que comprende SEQ ID NOS. 146 y 158) como se muestra en laTabla 12; anticuerpo humanizado 137F VH1/VL1 (que comprende SEQ ID NOS. 147 y 159), el anticuerpo humanizado 137F VH2/VL2 (que comprende SEQ ID NOS. 148 y 160), el anticuerpo humanizado 137F VH1b/VL1b (que comprende SEQ ID NOS. 149 y 161), el anticuerpo humanizado 137F VH1c/VVL1c (que comprende SEQ ID NOS. 150 y 162), o un anticuerpo humanizado que comprende 137F VH1b/VL1d (que comprende<s>E<q>ID NO. 149 y 163). En algunas realizaciones, 137F VL1d puede combinarse (o emparejarse) con cualquier otra cadena pesada variable 137F.
En otras realizaciones, el agente de unión puede ser un anticuerpo humanizado que comprende al menos uno de los SEQ ID NOS. 164-177 y al menos uno de los SEQ ID NOS. 178-190, y/o derivados o variantes de los mismos (por ejemplo, derivados conservadoramente sustituidos o variantes de los mismos). En algunas realizaciones, el aglutinante presenta aproximadamente (es decir, dentro de aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, o aproximadamente el 10% de; y/o un mínimo de 10 nM de afinidad (K<d>10'<8>M)) las afinidades de unión (ka (M'<1>/s_1), kd (s_1), y K<d>(M)) para PD-1 humana y de mono como anticuerpo humanizado A35775 (que comprende SEQ ID NOS. 164 y 178) (no de acuerdo con la presente invención), anticuerpo humanizado A35783 (que comprende SEQ ID NOS. 165 y 179) (no de acuerdo con la presente invención), anticuerpo humanizado A35774 (que comprende SEQ ID NOS. 166 y 180) (no de acuerdo con la presente invención), anticuerpo humanizado A36443 (que comprende SEQ ID NOS. 167 y 181) (no de acuerdo con la presente invención), anticuerpo humanizado A35777 (que comprende SEQ ID NOS. 168 y 182) (no de acuerdo con la presente invención), anticuerpo humanizado A35789 (que comprende SEQ ID NOS. 169 y 183) (no de acuerdo con la presente invención), anticuerpo humanizado A36448 (que comprende SEQ ID NOS. 170 y 184) (no según la presente invención), o el anticuerpo humanizado A36437 (que comprende SEQ ID NOS. 171 y 185) (no según la presente invención), como se muestra en laTabla 13; anticuerpo humanizado 135C VH1/VL1 (que comprende SEQ<i>D NOS. 172 y 186), el anticuerpo humanizado 135C VH2/VL2 (que comprende SEQ ID NOS. 173 y 187), el anticuerpo humanizado 135C VH3/VL3 (que comprende SEQ ID NOS. 174 y 188), el anticuerpo humanizado 135C VH1b/VL1b (que comprende SEQ ID NOS. 175 y 189), el anticuerpo humanizado 135C VH1c/VL1b (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 189), el anticuerpo humanizado 135C VH1c/VL1c (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 190), o un anticuerpo humanizado que comprende 135C VH1d/VL1c (que comprende SEQ ID NO. 177 y 190).
En algunas realizaciones, el agente de unión comprende al menos una primera y una segunda especificidad, siendo la primera contra PD-1 y la segunda contra un antígeno diferente (por ejemplo, un antígeno de un agente infeccioso tal como VIH (por ejemplo, Env) y/o un antígeno tumoral). En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo puede comprender una etiqueta detectable fijamente unida al mismo. En algunas realizaciones, el agente de unión de uno cualquiera y/o derivado del mismo comprende una fracción efectora (por ejemplo, un fármaco citotóxico, una toxina, una cadena A de difteria, una cadena A de exotoxina, una cadena A de ricina, una cadena A de abrina, una curcina, una crotina, una fenomicina, una enomicina y un radioquímico) fijamente unida al mismo. En algunas realizaciones, también se proporcionan polinucleótidos que codifican uno o más agentes de unión (por ejemplo, como un vector de expresión). También se proporcionan células huésped que comprenden y/o expresan los productos polipeptídicos de dichos polinucleótidos. En algunas realizaciones, también se proporcionan composiciones que comprenden al menos un agente de unión o derivado; al menos un polinucleótido aislado; al menos un vector de expresión; y/o, al menos una célula huésped; o una combinación de los mismos; y, un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación también proporciona procedimientos para detectar PD-1 en una célula, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra biológica de ensayo con un agente de unión o derivado descrito en el presente documento y detectar el agente de unión unido a la muestra biológica o componentes de la misma. Dichos procedimientos pueden ser un procedimientoin vivoo un procedimientoin vitro. En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender la comparación de la cantidad de unión a la muestra biológica de ensayo o componentes de la misma con la cantidad de unión a una muestra biológica de control o componentes de la misma, en la que un aumento de la unión a la muestra biológica de ensayo o componentes de la misma en relación con la muestra biológica de control o componentes de la misma indica la presencia de una célula que expresa PD-1 en la muestra biológica de ensayo (por ejemplo, sangre de mamífero). En algunas realizaciones, se proporciona un sistema para identificar un agente de unión a anticuerpos PD-1 ensayando el agente de unión candidato mediante el ensayo de recuperación funcional por agotamiento (EFRA); determinando la afinidad del agente de unión candidato por PD-1; y, determinando la secuencia de nucleótidos de la CDR del agente de unión candidato.
En algunas realizaciones, un kit para detectar la expresión de PD-1 en o sobre una célula, comprendiendo el kit un agente de unión o derivado del mismo e instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo está en forma liofilizada.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad infecciosa, cáncer y/o autoinmunidad en un mamífero que comprenden administrar al mamífero al menos una dosis eficaz de una composición farmacéutica que comprende un agente de unión o derivado del mismo. En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo utilizado para tratar enfermedades infecciosas y/o cáncer es un antagonista de PD-1. En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo utilizado para tratar una afección autoinmune es un agonista de PD-1. En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis al animal. En algunas realizaciones, el agente de unión y/o derivado del mismo puede administrarse en una cantidad de dosificación de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg / kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg / kg, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg / kg (p. ej., aproximadamente 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, o 40 mg / kg).
La presente divulgación también proporciona combinaciones de agentes de unión a PD-1. En algunas realizaciones, la combinación comprende un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 y un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. Las combinaciones ejemplares pueden incluir, por ejemplo, uno o más de los anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y uno o más de los agentes de unión no bloqueantes descritos en el presente documento, tales como uno o más de los que comprenden las secuencias de aminoácidos de 135C12 (SEQ ID NOS. 17, 40, 63,<8 6>, 109 y 132), 139D6 (SEQ ID NOS. 2, 25, 48, 71, 94 y 117) (no de acuerdo con la presente invención), 135D1 (SEQ ID NOS. 3, 26, 49, 72, 95 y 118) (no de acuerdo con la presente invención), y/o 136B4 (SEQ ID NOS. 19, 42, 65,<8 8>, 111 y 134) (no de acuerdo con la presente invención). Las realizaciones ejemplares incluyen la combinación del anticuerpo bloqueante MK3475 (Pembrolizumab) o un agente de unión bloqueante que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS.<8>, 31, 54, 77, 100 y 123 (137F2) con un agente de unión a PD-1 no bloqueante que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ iD NOS. 17, 40, 63,<8 6>, 109 y 132 (135C12). Como se ilustra en laFig. 9A, B, ambas combinaciones ejemplares producen un alivio mejorado del agotamiento funcional y un aumento de la proliferación de células T CD<8>+ específicas del VIH más allá de lo que puede conseguir cualquiera de los anticuerpos por sí solo. Otros anticuerpos no bloqueantes ejemplares que pueden ser útiles en combinación con los anticuerpos bloqueantes MK3475 o 137F2 y el agente de unión no bloqueante específico del parche P2 (M4 (Fig.3A, B)) 135D1 (que comprende SEQ ID NOS. 3, 26, 49, 72, 95 y 118), y/o el agente de unión 139D6 (SEQ ID NOS. 2, 25, 48, 71, 94, y 117), y/o el agente de unión no bloqueante específico de parche P2 (M17 (Fig.3A, E) 136B4 (que comprende SEQ ID n Os .19, 42, 65,<8 8>, 111 y 134). También pueden ser adecuadas otras combinaciones, de acuerdo con determinen los expertos en la técnica.
Dichas combinaciones pueden usarse para cualquier uso descrito en el presente documento o como puedan determinar de otro modo aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, dichas combinaciones pueden utilizarse en los procedimientos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad infecciosa, cáncer y/o autoinmunidad en un mamífero descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, también se proporcionan procedimientos para tratar la inflamación en un individuo que comprenden la administración de una combinación de al menos dos agentes de unión a PD-1 antagonistas, en los que cada uno de dichos agentes de unión tiene especificidad para diferentes epítopos de PD-1, al menos uno de dichos agentes de unión es bloqueante de la interacción de PD-1 y PD-L1, y al menos uno de dichos agentes de unión es no bloqueante de la interacción de PD-1 y PD-L1. La presente divulgación también proporciona procedimientos para tratar una afección neurodegenerativa crónica en un individuo mediante la administración de una combinación de al menos dos agentes de unión a PD-1 antagonistas, en los que cada uno de dichos agentes de unión tiene especificidad para diferentes epítopos de PD-1, al menos uno de dichos agentes de unión es bloqueante de la interacción de PD-1 y PD-L1, y al menos uno de dichos agentes de unión es no bloqueante de la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa crónica es la enfermedad de Alzheimer. La presente divulgación también proporciona procedimientos para inhibir el crecimiento de una célula tumoral tal como una célula tumoral humanain vivo,tal como en el tratamiento del cáncer, comprendiendo el procedimiento administrar una combinación de al menos dos agentes de unión a PD-1 antagonistas, en donde cada uno de dichos agentes de unión tiene especificidad para diferentes epítopos de PD-1, al menos el primero de dichos agentes de unión es bloqueante de la interacción de PD-1 y PD-L1, y al menos el segundo de dichos agentes de unión es no bloqueante de la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, la combinación puede comprender un agente de unión bloqueante, tal como un anticuerpo, comprende al menos uno de RASKGVSTSGYSYLH (SEQ ID NO. 287), LASYLES (SEQ ID NO. 288), QHSRDLPLT (SEQ ID NO. 289), NYYMY (SEQ ID NO. 290), GINPSNGGTNFNEKFKN (SEQ ID NO. 291), y/o RDYRFDMGFDY (SEQ ID NO. 292); MK3475; y/o Keytruda. En algunas realizaciones, el agente de unión no bloqueante, tal como un anticuerpo, puede comprender al menos uno de los SEQ ID NOS. 17, 40, 63,<8 6>, 109 y 132 o uno o más de los SEQ ID NOS. 164-190 (como SEQ ID NOS. 176 y 190), y/o un derivado que comprenda al menos una sustitución aminoacídica de los mismos. En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis al mamífero que pueden estar separadas por aproximadamente una semana, aproximadamente dos semanas, aproximadamente tres semanas, o preferentemente aproximadamente un mes, o más tiempo.
La presente divulgación también proporciona procedimientos para producir los agentes de unión descritos en el presente documento expresando el agente de unión en una célula y aislando el agente de unión de la célula o de un sobrenadante de cultivo de la célula. En algunas realizaciones, dichos procedimientos pueden comprender además la expresión de un ácido nucleico que codifica dicho(s) agente(s) de unión. En algunas realizaciones, dichos procedimientos también pueden incluir la combinación del agente o agentes de unión tras el aislamiento con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
También se proporcionan por la presente divulgación procedimientos para producir una(s) combinación(es) de agentes de unión, tales como un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 y un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1. En algunas realizaciones, el segundo agente de unión se une a PD-1. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo agente de unión son anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales o fragmentos o derivados de los mismos. En algunas realizaciones, el segundo agente de unión comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS. 17, 40, 63,<8 6>, 109 y 132 (por ejemplo, 135C12); SEQ ID NOS. 2, 25, 48, 71, 94 y 117 (por ejemplo, 139D6) (no de acuerdo con la presente invención); SEQ ID NOS. 3, 26, 49, 72, 95 y 118 (por ejemplo, 135D1) (no de acuerdo con la presente invención); y/o SEQ ID NOS. 19, 42, 65,<8 8>, 111 y 134 (por ejemplo,136B4) (no de acuerdo con la presente invención). En algunas realizaciones, estos procedimientos pueden incluir además la adición de un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los términos "aproximadamente", "aproximadamente", y similares, cuando preceden a una lista de valores numéricos o rango, se refieren a cada valor individual en la lista o rango independientemente como si cada valor individual en la lista o rango estuviera inmediatamente precedido por ese término. Estos términos significan que los valores a los que se refieren son exactos, próximos o similares a los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, se entiende que un individuo o un huésped es un individuo. El individuo puede incluir animales domésticos, como gatos y perros, ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas y cabras), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayas) y aves. En un aspecto, el individuo es un mamífero, como un primate o un ser humano.
Opcional u opcionalmente significa que el suceso o circunstancia descrito posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que el suceso o circunstancia ocurre y casos en los que no ocurre. Por ejemplo, la frase opcionalmente la composición puede comprender una combinación significa que la composición puede comprender una combinación de moléculas diferentes o puede no incluir una combinación de tal manera que la descripción incluye tanto la combinación como la ausencia de la combinación (es decir, los miembros individuales de la combinación).
Los intervalos pueden expresarse en el presente documento como desde aproximadamente un valor particular, y/o hasta aproximadamente otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otro aspecto incluye desde el valor particular y/o hasta el otro valor particular. Del mismo modo, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente acerca de o aproximadamente, se entenderá que el valor concreto constituye otro aspecto. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, como independientemente del otro punto final. Los intervalos (por ejemplo, 90-100%) deben incluir el intervaloper seasí como cada valor independiente dentro del intervalo como si cada valor se enumerara individualmente.
El término "combinado" o "en combinación" o "en conjunción" puede referirse a una combinación física de agentes que se administran juntos o al uso de dos o más agentes en un régimen (por ejemplo, administrados por separado, física y/o temporalmente) para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad particular.
Cuando los términos tratar, prevenir y/o mejorar o derivados de los mismos se utilizan en el presente documento en relación con un tratamiento dado para una afección dada (por ejemplo, prevenir el cáncer o la infección por VIH), se pretende transmitir que el paciente tratado o bien no desarrolla un nivel clínicamente observable de la afección en absoluto, o bien la desarrolla más lentamente y/o en menor grado de lo que lo habría hecho en ausencia del tratamiento. Estos términos no se limitan únicamente a una situación en la que el paciente no experimenta ningún aspecto de la afección. Por ejemplo, se dice que un tratamiento ha prevenido la enfermedad si se administra durante la exposición de un paciente a un estímulo que se habría esperado que produjera una determinada manifestación de la enfermedad, y tiene como resultado que el paciente experimente menos síntomas de la enfermedad y/o síntomas más leves de lo que se habría esperado. Por ejemplo, un tratamiento puede "prevenir" la infección haciendo que el paciente sólo muestre síntomas manifiestos leves de la infección; ello no implica que no haya habido penetración de ninguna célula por el microorganismo infectante.
Del mismo modo, reducir, disminuir y reducción como se usa en el presente documento en relación con la prevención, tratamiento y/o mejora de una afección dada por un tratamiento particular se refiere típicamente a un individuo que desarrolla una infección más lentamente o en menor grado en comparación con un control o nivel basal de desarrollo de una infección en ausencia de un tratamiento (por ejemplo, administración de uno o más agentes de unión a PD-1). Una reducción del riesgo de infección puede dar lugar a que el paciente sólo presente síntomas manifiestos leves de la infección o síntomas retardados de la infección; no implica que no haya habido penetración de ninguna célula por el microorganismo infectante.
Ciertas realizaciones se describen además en los siguientes ejemplos. Estas realizaciones se ofrecen únicamente a modo de ejemplo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Generación y caracterización de agentes de unión a PD-1
Se han inmunizado cuatro cepas de ratones (un total de 16 ratones) con dos proteínas PD-1, es decir, proteína de fusión Fc PD-1 humana y una proteína monomérica PD-1 humana. Se han seleccionado ratones que muestran reactividad sérica a PD-1 expresada en linfocitos T humanos activados para la generación de líneas celulares de hibridoma anti-PD-1. Se seleccionaron 240 líneas celulares de hibridoma PD-1 para producir anticuerpos que se unen a la proteína PD-1 recombinante. Los criterios principales para la primera ronda de selección de anticuerpos fueron: i) tinción de PD-1 en linfocitos T humanos activados mediante citometría de flujo; ii) diversidad de secuencias CDR VH y VL en comparación con las de los anticuerpos anti-PD-1 existentes; y, iii) mapeo de epítopos realizado mediante estudios de unión competitiva con perlas Luminex conjugadas con PD-1 con dos anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente que se unen a diferentes epítopos en PD-1. A continuación se llevó a cabo una segunda ronda de selección por medio de: iv) ensayos de unión por afinidad (no un criterio primario dado que no se correlaciona con el potencial estimulador de los anticuerpos anti-PD-1); v) evaluación de los anticuerpos anti-PD-1 que se unen a PD-1 y son bloqueantes o no bloqueantes con la unión de PD-L1 en un ensayo bioquímico Luminex; y, vi) caracterización funcional de los anticuerpos como agonistas (no capaces de restaurar las células T desde el agotamiento funcional) o antagonistas (capaces de restaurar las células T desde el agotamiento funcional). En estos estudios, los anticuerpos se probaron y diferenciaron en función de su capacidad para rescatar la proliferación en células T CD<8>específicas del VIH agotadas.
En un cribado primario de sobrenadantes de anticuerpos de clones celulares de hibridoma cultivados individualmente, se llevó a cabo el ensayo EFRA para evaluar el efecto funcional de anticuerpos anti-PD1 sobre la proliferación de células T CD<8>específicas de VIH. Se encontró que los clones de anticuerpos E8-3, C2-3, E1-3, F3-3, H8-3, C10-2, G2-1, G3-2, H2-1 y H4-2 actúan como antagonistas de PD-1 y estimulan la proliferación, mientras que los clones de anticuerpos C8-1 y G10-2 son agonistas y promueven el efecto regulador negativo de PD-1. El nivel de proliferación inducido por el péptido de control (Pep<8>) está justo por debajo del 1% y la proliferación inducida por el anticuerpo Merck MK-3475 anti-PD1 está justo por encima del 2%. Los anticuerpos de interés identificados por medio de estos procesos se sometieron a una segunda ronda de subclonación y los clones de hibridoma resultantes se utilizaron para la producción y purificación de los anticuerpos de laTabla 3. Se llevaron a cabo ensayos de unión con los anticuerpos anti-PD-1 purificados para garantizar que los subclones conservaban su afinidad por PD-1. Se evaluó la unión concentración-respuesta de los anticuerpos anti-PD-1 a la superficie celular PD-1 en células T CD4 activadas.
El EFRA prevé la selección de agentes de unión que restauran las células T del agotamiento funcional, pero no se limitan necesariamente a agentes de unión que no interfieren con la interacción entre PD-1 y su(s) ligando(s) biológico(s) (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2). Una realización del EFRA consistía en identificar dichos agentes de unión (anticuerpos) que se unen a PD-1. El mapeo del epítopo de unión del anticuerpo a PD-1 se realizó con dos ensayos bioquímicos separados. En un ensayo, se evaluó la unión competitiva a microesferas marcadas con proteína de fusión Fc de PD-1 entre uno de dos anticuerpos comerciales anti-PD-1 (clones EH12.2H7 y J116) y los anticuerpos anti-PD-1 enumerados (también descritos en laTabla 3). A partir de este ensayo se identificaron cuatro clases de anticuerpos monoclonales que se unen a epítopos distintos. Estos son: clase 1 (competitivo con el clon comercial de anticuerpo monoclonal EH12.2H7 que bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 2 (competitivo con el clon comercial de anticuerpo monoclonal J116 que se une a PD-1 pero no bloquea eficazmente la interacción de PD-1 con PD-L1), clase 3 (competitivo con los anticuerpos monoclonales comerciales EH12.2H7 y J116), y clase 4 (no competitivo con los anticuerpos comerciales EH12.2H7 o J116). Los anticuerpos se clasificaron en una de las cuatro clases de unión y la unión relativa de estos anticuerpos a la PD-1 de la superficie celular se representa mediante la intensidad media de fluorescencia (IMF) en relación con un anticuerpo anti-PD-1 de control. Estos resultados mostraron que se identificaron anticuerpos de unión estrecha de las cuatro clases de unión. Se utilizó un segundo ensayo de unión Luminex para evaluar directamente si un anticuerpo anti-PD-1 bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L1. Este ensayo se llevó a cabo mediante el uso de microesferas recubiertas de proteína de fusión Fc de PD-1 que se incubaron con 20 nM de un anticuerpo anti-PD-1 de laTabla 3seguido de una incubación del complejo PD-1/anticuerpo con diferentes concentraciones de PD-L1 biotinilado. Las curvas de unión se compararon con la unión de PD-L1 en ausencia de un anticuerpo competidor anti-PD-1. Se descubrió que un cierto anticuerpo anti-PD-1 de laTabla 3puede bloquear competentemente la interacción entre PD-1 y PD-L1 (anticuerpo 137F2 mostrado en laFigura 1 A). Los anticuerpos enumerados en laTabla 3como no bloqueantes de la interacción PD-1 / PD-L1 producen un cambio en la afinidad de unión de PD-L1 por PD-1, pero no bloquean la interacción cuando se aumenta la concentración de PD-L1 (anticuerpos 135C12 y 136B4 mostrados en laFigura 1B y C, respectivamente). En una de las interpretaciones, estos anticuerpos son no competitivos o parcialmente competitivos con la interacción PD-1 / PD-L1. Algunos de estos anticuerpos también mostraron aumentos estadísticamente significativos de la proliferación en relación con los controles. En general, se determinó que los anticuerpos de clase 1 (competitivos con el anticuerpo monoclonal comercial EH12.2H7 que bloquea la interacción de PD-1 con PD-L1) o el bloqueo en el ensayo de intereacción PD-1/PD-L1 proporcionaban una mejor restauración proliferativa. Al combinar los datos de múltiples experimentos EFRA y utilizando MK-3475 como comparador común, los anticuerpos seleccionados descritos en laTabla 2mostraron una actividad equivalente o estadísticamente mejorada (p < 0,007) en comparación con el anticuerpo de referencia MK-3475.
Ejemplo 2
Combinaciones de anticuerpos
Se descubrió que las combinaciones de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de PD-1 mejoran la restauración de la proliferación de células T CD<8>+ específicas de péptido del VIH en un ensayo de recuperación de agotamiento funcional. También se observó sinergia entre los tipos de anticuerpos. Por ejemplo, se ha determinado que los anticuerpos de clase 1 (MK-3475) y de clase 2 (139D6) son capaces de unirse simultáneamente a PD-1. Mientras que la estimulación máxima observada para MK-3475 es sistemáticamente de alrededor del<2 0 0>% en relación con el péptido del VIH, las combinaciones de anticuerpos monoclonales MK-3475 y 139D6 a 5 pg/ml cada una mostraron sinergia con un aumento del 288% en la proliferación de células T CD<8>específicas del VIH en relación con el control del péptido del VIH solo o un aumento del 144% en la proliferación en relación con MK-3475 o 139D6 añadidos solos. Este aumento sinérgico de la proliferación se observó en varias pruebas experimentales con un valor p estadísticamente significativo de 0,007. Como comparación, la adición de 10 ug/ml de MK-3475 o 139D6 solos no produjo un aumento de la proliferación en el EFRA. De este modo, se ha determinado que la combinación de un primer agente de unión que bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 con un segundo agente de unión que no bloquea la interacción de PD-1 y PD-L1 actúa sinérgicamente para rescatar a las células T del agotamiento.
Ejemplo 3
Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-PD-1
Las evaluaciones preliminares de mapeo de epítopos se basaron en estudios de ensayos bioquímicos de unión competitiva entre anticuerpos anti-PD-1 comercialmente disponibles (EH12.2H3 y J116) y los anticuerpos anti-PD-1 recientemente identificados definidos en esta patente. Este procedimiento nos permitió clasificar los anticuerpos en una de las cuatro clases de unión basadas en la unión competitiva o no competitiva con cualquiera de los dos anticuerpos comerciales. Un procedimiento más preciso para definir los epítopos de unión del anticuerpo sobre PD-1 es monitorizar la interacción del anticuerpo con diferentes proteínas PD-1 que tienen sustituciones discretas de aminoácidos en residuos accesibles al disolvente. Si estos residuos son importantes para la unión firme de los anticuerpos anti-PD-1, la sustitución puede resultar en una unión reducida para la proteína PD-1. Estos estudios se llevar a cabo por medio de mutagénesis dirigida al sitio del gen PD-1 codificado dentro del vector de expresión de mamíferos pReceiver-M67 bajo el control del promotor CMV. Mediante el uso de los datos estructurales 3RRQ PDB publicados para la proteína PD-1, se diseñaron 31 clones diferentes de PD-1 con sustituciones de aminoácidos simples, dobles o triples en residuos accesibles al disolvente. Los residuos implicados en la interacción entre PD-1 y PD-L1/L2 se determinaron en base a la estructura cristalina publicada del complejo entre PD-1 humana y PD-L2 (Lazar-Molnar, PNAS, 2008, p10483-10488) y se mapearon en la estructura de PD-1 en laFigura 2como esferas numeradas (la numeración corresponde a los residuos de aminoácidos de PD-1 humana (Fig. 2H, SEQ ID NO. 275)). Las sustituciones se seleccionaron en residuos implicados en la interacción PD-1 /PD-L1 (representados por M10, M11, M12, M14, M23, M24, M25), o en superficies opuestas o adyacentes de la proteína PD-1 no implicadas directamente en la interacción PD-L1 (representadas por M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M13, M15, m 16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M26, M27, M<2 8>, M29, M30, M31) y se definen en laFigura 3. A continuación, los vectores de ADN que codifican PD-1 se utilizaron para transfectar transitoriamente células HeLa mediante el uso del reactivo de transfección Lipofectamine 2000. Las células se incubaron en un incubador de cultivo celular a 37°C durante 36 48 horas para permitir la expresión en la superficie celular de la proteína PD-1, y después las células se volvieron a suspender y se incubaron durante 30 minutos con entre 0,3 y 2 pg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 determinado seleccionado de laTabla 3. Tras un lavado, las células se tiñeron con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón marcado con PE y se analizaron por citometría de flujo. En cada experimento, se utilizó la proteína PD-1 de tipo salvaje como control positivo para la unión de anticuerpos y se evaluaron en paralelo varios anticuerpos que unían diferentes epítopos de PD-1 (según se determinara por ser bloqueantes o no bloqueantes de la interacción PD-1 / PD-L1 o a partir de estudios de unión competitiva con clones de PD-1 disponibles comercialmente) para monitorizar el nivel de expresión relativo de la proteína PD-1 con las diferentes sustituciones de aminoácidos. Todos los anticuerpos anti-PD-1 probados de laTabla 3se unieron específicamente a células HeLa transfectadas con PD-1 de tipo salvaje, pero no a células transfectadas con un control de vector vacío. Todas las proteínas PD-1 mutantes se expresaron casi a niveles de tipo salvaje o dieron un cambio significativo en la intensidad media de fluorescencia en relación con un control no transfectado cuando se tiñeron con anticuerpos anti-PD-1 que eran bloqueantes o no bloqueantes de la interacción PD-1/PD-L1. A continuación, se probó sistemáticamente la capacidad de un conjunto selecto de anticuerpos de laTabla 3para unirse a la proteína PD-1 de tipo salvaje o mutante expresada en la superficie celular de las células HeLa transfectadas. Estos resultados se resumen en laTabla 11con las mutaciones indicadas que derogan o reducen la unión para cada uno de los diferentes clones de anticuerpos anti-PD-1. Los histogramas de citometría de flujo representados en lasFiguras 4-8proporcionan ejemplos de diferentes anticuerpos que se unen eficazmente o con afinidad reducida a células HeLa transfectadas con las construcciones PD-1 mutantes indicadas. Como se predijo, los anticuerpos que demostraron ser bloqueantes de la interacción PD-1 / PD-L1 en un ensayo bioquímico (MK-3475, 137F2, 140G5, y 139F11) también se unieron a epítopos en PD-1 que se solapan con este sitio de interacción. En consonancia con los estudios bioquímicos de la interacción PD-1 / PD-L1, los anticuerpos que no bloqueaban la interacción PD-1 / PD-L1 (136B4, 135C12, 136E10) se unían a epítopos distintos que eran distales a los residuos de aminoácidos implicados en la interacción PD-1 / PD-L1. En laFigura 8, se observó un cambio significativo en la unión a la proteína PD-1 M17 para los anticuerpos 136B4 y 122F10, mientras que se observó un pequeño cambio en la unión para el anticuerpo 135C12 para la proteína PD-1 M26. Estas diferencias ponen de relieve el hecho de que 136B4 y 135C12 tienen bucles CDR que pertenecen a familias distintas y se unen a diferentes epítopos de PD-1 que se solapan con el parche P2, como se muestra en laFigura 13.
Tabla 11
Ejemplo 4
Epítopo de anticuerpo no bloqueante relacionado con una nueva acción antagonista de PD-1
Los anticuerpos que se unen a diversos epítopos en PD-1 se evaluaron para su actividad antagonista en un ensayo de recuperación de agotamiento funcional. Estos estudios revelaron que los anticuerpos antagonistas podían bloquear o no la interacción PD-1 / PD-L1. Teniendo en cuenta que el modo de acción atribuido a la actividad funcional de los anticuerpos anti-PD-1 es a través del bloqueo de PD-1, estos resultados apuntan a una nueva función de PD-1 que está siendo inhibida por los anticuerpos antagonistas no bloqueantes. Esta afirmación se ve respaldada por el hecho de que la combinación de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes conduce a una mayor actividad antagonista en el ensayo de recuperación funcional por agotamientoin vitro.Esta actividad funcional mejorada va más allá del nivel de inducción que puede alcanzarse con cualquiera de los dos anticuerpos cuando se administran solos y se demostró con diferentes combinaciones de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes (es decir, anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes (es decir, competitivos) (MK3475 o 137F2) con los anticuerpos anti-PD-1 no bloqueantes (es decir, no competitivos o parcialmente competitivos en el ensayo bioquímico de interacción PD-1 / PD-L1) 135C12 (Figura 9A) o 139D6 (Figura 9B). Como prueba adicional de su actividad funcional, se ensayaron anticuerpos anti-PD-1 solos o en combinaciones entre anticuerpos bloqueantes de PD-1/PD-L1 y anticuerpos antagonistas no bloqueantes en un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR). El ensayo MLR consistió en mezclar monocitos de un donante sano con células T CD4 con memoria PD-1+de un segundo donante sano. Los monocitos se aislaron a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por medio de selección positiva de CD14 con perlas magnéticas. Las PBMC de un segundo donante se eliminaron primero de las células que expresaban CD45RA con perlas magnéticas y, a continuación, se utilizó un conjunto diferente de perlas magnéticas para la selección positiva de células T CD4 positivas. A continuación, estas células T CD4 de memoria (CD4+ CD45RA') se tiñeron con un kit de tinción Aqua Live/Dead y el clon 127C2 de anticuerpos anti-PD-1 (que ha demostrado no tener actividad antagonista y no competir con MK3475, 137F2 o 135C12 en la unión a PD-1) y un anticuerpo secundario anti-Mouse PE para clasificar la población de células PD-1+ viables. Tras mezclar monocitos y células T CD4+ de los dos donantes diferentes en proporciones 1:2 o 1:5, las células se dejaron sin tratar o se trataron con 1|jg/ml de los anticuerpos anti-PD-1 indicados en laFigura 10. Tras cinco días en una incubadora de cultivos celulares, se recogieron alícuotas de sobrenadantes de cultivos celulares y se analizó la secreción de IFN<y>mediante ELISA. Se añadió timidina tritiada (<3>H-TdR) al medio de cultivo celular y se incubaron las células durante<18>horas más. La incorporación de<3>H-TdR se utilizó como medida de la proliferación celular. Este segundo ensayoin vitroindependiente confirmó la actividad funcional de nuestros anticuerpos anti-PD-1. En laFigura 10a, aumento de la proliferación de hasta 2 veces para las células T CD4+ inducido por anticuerpos anti-PD-1 individuales y combinados. En laFigura 10b, se observó un fuerte aumento de la producción de IFNy para todos los anticuerpos anti-PD-1 cuando se probaron individualmente con 137F2 dando los niveles más altos de inducción. En las combinaciones de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes (MK3475 y 135C12 o 137F2 y 135C12), se observó una tendencia hacia un aumento de la proliferación y de la producción de IFNy de las células T CD4 de memoria PD-1+. Dado que el aumento de la producción de IFNy de las células T CD4+ se asocia con una reducción de la patología y una mejora de la memoria en un modelo de ratón para la enfermedad de Alzheimer cuando se trata con una terapia de bloqueo del punto de control inmunitario PD-1 (Baruch K, Nature Med, 2015), se esperaría que el tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 o combinaciones de anticuerpos anti-PD-1 como se describe en el presente documento, tuviera un beneficio terapéutico equivalente o mejorado. Como se describe a continuación, el mapeo de epítopos reveló que los anticuerpos no bloqueantes con la mayor potencia se unen todos a un parche similar de PD-1, denominado en el presente documento "parche P2", que se solapa con la región de las sustituciones de aminoácidos M4 (serina 38 por alanina, prolina 39 por alanina y leucina41 por alanina (Fig. 3; SEQ ID NO. 142)), y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M17 (asparagina 102 por alanina y arginina 104 por leucina (Fig. 3; SEQ ID NO. 155)), y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M18 (aspartato 105 a alanina (Fig. 3; SEQ ID NO. 156), y/o la región de las sustituciones de aminoácidos M31 (leucina 41 por alanina y valina 43 por leucina (Fig.
3; SEQ ID NO. 206).
A fin de investigar más a fondo las regiones de PD-1 que están implicadas en la actividad antagonista de los anticuerpos anti-PD-1, se mapearon residuos de aminoácidos variantes accesibles por disolvente de diferentes especies a la estructura de PD-1 humana. Esta representación estructural basada en el PDB 3RRQ muestra la cara de PD-1 que interacciona con PD-L1/L2 enFigura 11ay la cara opuesta de PD-1 enFigura 11b. Los residuos que son disímiles entre la PD-1 de mono y humana se indican con círculos rojos, otros residuos variantes encontrados en la PD-1 de roedores (ratón y rata) se muestran como círculos verdes y residuos variantes adicionales de la PD-1 de perro se muestran en naranja. Los residuos 46, 58, 74 y 116 han sido implicados como sitios de glicosilación ligada al N y están marcados con círculos cian. En laFigura 11cse muestran los alineamientos de las secuencias de aminoácidos del ectodominio de PD-1 humana, de mono, de caballo, de perro, de ratón y de rata, y las homologías correspondientes con PD-1 humana son 96,6%, 79,9%, 73,2%, 62,4% y 66,4%, respectivamente. Con estos residuos variantes entre especies de PD-1 mostrados en la estructura, se hace evidente que hay dos parches conservados en PD-1 que se designan P1 y P2 en lasFiguras 11ay11b. El parche P1 corresponde a la región central implicada en la interacción entre PD-1 y los ligandos PD-L1 /PD-L2 (compárense los residuos marcados con esferas en laFigura 2con los de laFigura 11a). Se prevé la conservación entre especies de este parche P1, dado que los residuos variantes que se acumulan en PD<-1>durante la evolución aún necesitarían mantener la interacción con los ligandos PD-L1 /L2. En las variantes de ratón se observan algunas sustituciones de residuos implicados en la interacción PD-1 / PD-L1 (por ejemplo, los residuos 64 y<6 8>) que podrían atribuirse a la coevolución de PD-1 con sus ligandos PD-L1/L2; sin embargo, la región central de interacción dentro de P1 permanece conservada. El parche P2, evolutivamente conservado, ocupa una superficie similar a la del parche P1 y, sin embargo, esta región no tiene ningún papel previamente identificado para PD-1, ni estructural ni funcionalmente. El hecho de que el parche P2 esté evolutivamente conservado en las especies investigadas indica que PD-1 estaba bajo presión funcional para preservar el sitio P2. Esta conservación es tanto más significativa cuanto que el ectodominio de PD-1 sólo está conservado entre un 62,4% y un 79,9% en cuatro de las especies investigadas. Si se tienen en cuenta todos los residuos variantes en estas cuatro especies en comparación con la PD-1 humana se obtiene una conservación de secuencia aún menor, del 52,3% (Figura 11c, las flechas azules representan la región estructural representada enFigura 11ay11b). Queda por determinar si esta presión funcional se atribuye a que el parche P2 sirve como sitio de interacción para un ligando aún no identificado, sitio para la formación de complejos de orden superior o vinculado a eventos de señalización relacionados con PD-1. Sin embargo, los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento, incluidos 135C12, 139D6, 135D1 y 136B4, con epítopos de unión solapados con el parche<p>2, proporcionan pruebas directas de la importancia funcional de esta región.
Dado que esta región no tiene implicación previa en la actividad funcional de PD-1, se propone en el presente documento que los anticuerpos ejemplificados por 135C12 con unión que se solapa con el Parche 2 en PD-1 mostrado en laFigura 11brepresentan un mecanismo y sitio novedosos para ejercer una actividad antagonista sobre PD-1. Se propone además en el presente documento que otros anticuerpos, fragmentos de anticuerpos u otros agentes de unión a proteínas que pueden interaccionar con esta región del parche 2 de PD-1 también actuarían como un antagonista de PD-1 de una manera que es distinta y complementaria a los anticuerpos anti-PD-1 que actúan a través del bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 como se demuestra en lasFiguras 9, 10y17-20. Como ejemplo adicional de la importancia de la región del Parche 2 en PD-1, el anticuerpo 136B4 se une a un epítopo distinto en PD-1 en comparación con los anticuerpos 135C12, 139D6 y 135D1 que también se solapa con el Parche 2. 136B4 muestra una afinidad fuertemente reducida en la unión con las mutaciones M17 y M18 de PD-1 que están situadas en el borde del parche P2 (M17: asparagina 102 a alanina y arginina 104 a alanina, M18: ácido aspártico 105 a alanina). Junto con los anticuerpos 135C12, 139D6 y 135D1, el 136B4 demostró la mayor actividad funcional de todos los anticuerpos no bloqueantes ensayados.
Ejemplo 5
Estudios de unión competitiva de anticuerpos
A fin de caracterizar adicionalmente los epítopos de unión de anticuerpos seleccionados enumerados en laTabla 3, se llevar a caboon una serie de estudios de competición de anticuerpos para la unión a PD-1 de superficie celular. Los anticuerpos que se unen a distintos epítopos de PD<- 1>(MK3475, 137F2, 135C12 y 134D2) se conjugaron químicamente mediante el uso de un kit de marcaje de anticuerpos Maxpar (Fluidigm). En este procedimiento, los enlaces disulfuro de los anticuerpos se reducen parcialmente para conjugar los residuos de cisteína con un polímero quelante de metales. A continuación, estos anticuerpos modificados con isótopos metálicos se utilizaron para teñir las células con el fin de determinar los niveles de expresión de PD-1 de superficie, y el análisis se realizó por medio de citometría de masas. A fin de generar células T CD4 con altos niveles de expresión de PD-1, se estimularon células mononucleares de sangre periférica de un donante sano con PHA e IL-2 y se incubaron durante 5 días. Tras la tinción de las células, se realizó un gating para seleccionar las células CD3+/CD4+ viables y se evaluaron los niveles de PD-1 en la superficie celular de cada muestra por medio de citometría de masas. En el ensayo de competencia de anticuerpos, se incubaron muestras de 2 * 10<6>células durante 30 minutos a 4°C con 15 pg/ml de uno de los anticuerpos competidores indicados en laFigura 12. A continuación, se añadió a las células uno de los anticuerpos anti-PD-1 marcados con un isótopo metálico (MK3475, 137F2, 135C12 o 134D2) a < 1 pg/ml, se incubaron durante 20 minutos más, se lavaron para eliminar el anticuerpo no unido y se analizaron los niveles de PD-1 en la superficie celular. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo IgG1 de ratón como control negativo y como referencia para calcular el porcentaje de células PD-1 positivas en relación con las muestras incubadas con los clones de anticuerpos competidores anti-PD-1. ;;Los anticuerpos anti-PD-1 de Clase 1 que son bloqueantes de la interacción PD-1/PD-L1 son todos competitivos (como se muestra en laFigura 12con <29% de tinción de células PD-1 positivas en relación con el control IgG1) en experimentos se tiñeron células PD-1 altas con MK3475 o 137F2. Estos resultados eran de esperar, dado que la cartografía de epítopos de varios de estos anticuerpos presenta sitios de unión que son idénticos o se solapan. Los anticuerpos de clase 1 también fueron competitivos o parcialmente competitivos (como se muestra en laFigura 12con un 30-59% de tinción relativa al control IgG1) con el anticuerpo 134D2. Aunque bloquea la interacción PD-1/ PD-L1, 134D2 se une a un epítopo que se solapa principalmente con el mutante M15, pero también en menor medida con la mutación 17. Se observó que los anticuerpos de clase 1 no eran competitivos (> 60% de unión de la tinción de anticuerpos marcados de células PD-1 positivas en relación con el control IgG1, como se muestra en laFigura 12) con el anticuerpo 135C12, lo que confirma los estudios de unión a epítopos que muestran que estos anticuerpos se unen a sitios distintos en PD-1. ;;Mediante el uso de anticuerpos de clase 2 como los competidores, tanto los anticuerpos marcados MK3475 como 137F2 se unen con poca o ninguna reducción en la unión en relación con el control IgG1. La única excepción es el anticuerpo 135D1 que bloqueó la unión a PD-1 del 137F2 marcado. Dado que el epítopo 135D1 está cerca de la mutación M4, parece probable que haya cierta hingerancia esteárica en la unión del anticuerpo 137F2 en la región de la mutación M23. Los clones 135C12 y 139D6 también presentan un desplazamiento en la unión a PD-1 que codifica la mutación M4, sin embargo, dado que no compiten con la unión de 137F2, la unión de estos anticuerpos de clase 2 se centra más en la región del parche P2. El anticuerpo 135C12 también presentó pequeños desplazamientos en la unión a las mutaciones M17, M18, M26, M28 y M31, que se encuentran en el borde de la mancha P2. Todos los anticuerpos de clase 2 utilizados como competidores bloquean la unión del 135C12 marcado, lo que confirma que se están uniendo a epítopos solapados en PD-1. La mayoría de los anticuerpos competidores de clase 2 no compiten con el 134D2 marcado en la unión a PD-1. El anticuerpo 136B4 es una excepción para los anticuerpos de Clase 2 que bloquea la unión del 134D2. Estos resultados son coherentes con los estudios de unión al epítopo delEjemplo 3, donde la unión de 134D2 a PD-1 se ve parcialmente alterada por la mutación M17, pero principalmente por las mutaciones M13 y M15. La unión del anticuerpo 136B4 sólo se ve alterada por las mutaciones M17 y M18 que se encuentran en el borde o dentro del parche P2. ;;Los anticuerpos de clase 3 son competitivos a parcialmente competitivos (definidos como 30-59% de tinción relativa al control IgG1 como se muestra en laFigura 12) con MK3475 y 137F2 y se unen a PD-1 de forma no competitiva con 135C12. El anticuerpo de clase 3135E10 es competitivo con el 134D2 marcado, mientras que el anticuerpo de clase 3 140A1 no es competitivo con el 134D2 marcado. El mapeo del epítopo muestra que 140A1 se une en la región de la mutación M13, que es distinta del epítopo de unión para 134D2 (M15 mayor y M17 menor). ;;Al evaluar los datos funcionales para los anticuerpos de clase 4, solo 134D2 y 136B5 tienen una actividad antagonista significativa que conduce a un aumento de la proliferación de células T CD<8>específicas del VIH en el ensayo de recuperación funcional por agotamiento (>150% de aumento de la proliferación como se indica en laFigura 12). Estos anticuerpos también bloquean la interacción de PD-1 con PD-L1 en un ensayo bioquímico y, por lo tanto, es muy probable que funcionen como antagonistas a través del bloqueo de PD-1/PD-L1. Dado que el exceso de 136B5 bloquea la tinción de células PD-1+ con 134D2 marcado, estos anticuerpos se unen a PD-1 en epítopos similares o solapados (Figura 12). Los datos de unión competitiva con los restantes anticuerpos de clase 4 muestran que se unen a diversos sitios en PD-1 y que esta unión generalmente no se solapa con el anticuerpo 135C12. El anticuerpo 122F10 es una excepción que se une a un epítopo análogo o solapado con 136B4 dado que estos dos anticuerpos tienen un perfil de unión similar en los estudios de competición de anticuerpos (Figura 12) y ambos tienen una unión reducida a la construcción PD-1 mutante M17 (Tabla 11). ;;Al combinar la información de los estudios de mapeo de epítopos realizados mediante sustituciones de aminoácidos en residuos accesibles por disolvente de PD-1 (Ejemplo 3) y los estudios de competencia de anticuerpos (Figura 12), en lasFiguras 13ay13b) se muestra un mapa estructural coherente de las regiones de PD-1 a las que se unen los diferentes clones de anticuerpos anti-PD-1. Estos epítopos de unión se indican con parches circulares de diferentes colores para la mayoría de los clones en laTabla 11.La Figura 13amuestra la cara de PD-1 que tiene la mayoría de los residuos implicados en las interacciones PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2. Las excepciones son los residuos 89 y 90 que se encuentran en el lado izquierdo de laFigura 13aen una región de bucle flexible. El conjunto primario de anticuerpos que son competitivos con la interacción PD-1/PD-L1 se unen todos a esta cara de PD-1 incluyendo los clones 137F2, 139F11, 140A1, 140G5 y MK3475. Cabe señalar que los dos anticuerpos que identificamos con la mayor actividad antagonista en el ensayo funcional (Tabla 11) se unen ambos al centro del parche P1 que se muestra en lasFiguras 11a y 13ay centrado en los residuos 124-126 de PD-1. Este hallazgo se ve confirmado por el hecho de que 137F2 y 139F11 tienen secuencias CDR de cadena pesada y ligera significativamente diferentes y pertenecen a familias distintas según las alineaciones de secuencias de todos los clones de anticuerpos analizados en esta solicitud. Los clones de anticuerpos 134D2 y 136B5 demostraron ser competitivos con la interacción PD-1 /PD-L1 en un ensayo bioquímico aunque se unen a una región de PD-1 en laFigura 13bque se solapa con las mutaciones M13, M15 y M17. En base a este epítopo mapeado, estos anticuerpos se unen cerca de los residuos 85 y<86>de PD-1 que forman parte de una región de bucle en PD-1 que contiene los residuos 89 y 90. Dado que los residuos 89 y 90 están implicados en la interacción con PD-L1 (Figura 2a), la unión a esta región del bucle puede inducir un cambio conformacional en PD-1 que inhiba la unión a PD-L1. En consonancia con estas observaciones, los estudios de competencia de anticuerpos muestran que la adición de un anticuerpo competidor de clase<1>da lugar a una unión significativamente reducida del anticuerpo 134D2 marcado (Figura 12). ;;Los anticuerpos que son no bloqueantes de la interacción PD-1/PD-L1 enumerados en laTabla 3se unen todos a epítopos que son distantes de residuos implicados en la interacción PD-1/PD-L1. Los anticuerpos que tienen una fuerte actividad funcional (>150% de aumento de la proliferación de células T CD<8>en el ensayo de recuperación funcional,Figura 12), se unen todos en epítopos que se solapan con el parche P2 ilustrado en laFigura 13b. Los clones de anticuerpos 135C12 (todos los mutantes probados), 139D6 (mutantes seleccionados probados) y 135D1 (mutantes seleccionados probados) tienen secuencias CDR de cadena pesada y ligera relacionadas y se unen a un sitio que se solapa con las mutaciones M4, M18 y M31. El clon de anticuerpo 136B4 tiene secuencias CDR distintas y se observaron grandes cambios en la afinidad de unión con PD-1 mutante M17 y M18, lo que indica que se une a un epítopo distinto en el borde del parche P2. El anticuerpo 135C12 se une competitivamente con el clon 136B4 pero no con el 134D2 ni con el 136E10. Estos estudios de unión competitiva de anticuerpos apoyan aún más la unión de 135C12, 139D6 135C1, y 136B4 a un epítopo que se solapa con el parche P2. El epítopo de unión para el anticuerpo 136E10 está localizado por las mutaciones M1 que anulan completamente la unión de este anticuerpo a PD-1. ;Ejemplo 6;;Eliminación selectiva de células por medio de conjugados anticuerpo-fármaco;;Como se discute en el presente documento, los agentes de unión tales como anticuerpos (por ejemplo,Tabla 3) pueden conjugarse con una toxina con el fin de llevar a cabo una eliminación dirigida de las células que expresan PD-1. Un ejemplo de los beneficios terapéuticos de esta estrategia sería la eliminación selectiva de las células T CD4+ infectadas por el VIH que son predominantemente PD-1 positivas. A fin de llevar a cabo estos estudios, se conjugaron químicamente dos anticuerpos anti-PD-1 diferentes (140G5 y 136B5) con PEG4-vc-PAB-PNU-159682 (denominado PNU de ahora en adelante) a través de grupos de cisteína accesibles tras la reducción parcial de los enlaces disulfuro del anticuerpo. Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) se perfilaron mediante cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de exclusión por tamaño, y se comprobó que ambas muestras contenían >95% de anticuerpo conjugado con PNU. En el ensayo de destrucción de ADC, se aislaron células T CD4+ de las PBMC de un paciente infectado crónicamente por el virus VIH-1. Estas células T CD4+ se incubaron con un anticuerpo de control del isotipo, un mAb 140G5, un conjugado mAb 140G5-PNU, un mAb 136B5 o un conjugado mAb 136B5-PNU. Las concentraciones de anticuerpos fueron todas de 10 pg/ml y las células se incubaron a 37°C en un incubador de cultivos celulares con 5% de CO<2>durante 5 días. Al quinto día, las células se tiñeron para análisis de citometría de flujo con anticuerpos para monitorizar los niveles de CD4 y PD-1 en la superficie celular, junto con tinción de Aqua para la viabilidad celular y tinción de Annexin V para identificar las células en apoptosis. Como se muestra en laFigura 14, todas las muestras tratadas con los diferentes anticuerpos o ADC presentan niveles equivalentes de células T Aqua positivas (Figura 14a) o Annexin V positivas (Figura 14b) o CD4+ que poseen una expresión de nivel bajo a medio de PD-1. Sin embargo, en las poblaciones celulares con altos niveles de PD-1, se produce un aumento significativo de la cantidad de células Annexin V y Aqua positivas en las muestras tratadas con los ADC anti-PD-1 (140G5-PNU y 136B5-PNU enFigura 14ay14b). ;;A fin de proporcionar más pruebas del beneficio terapéutico potencial de un ADC anti-PD-1, las células T CD4+ tratadas durante cinco días con los diferentes anticuerpos o ADC (anticuerpo de control del isotipo, 140G5 mAb, conjugado 140G5-PNU mAb, 136B5 mAb, o conjugado 136B5-PNU mAb) se evaluó la frecuencia de células infectadas por el VIH mediante un ensayo cuantitativo de crecimiento viral. En este ensayo, las células tratadas con anticuerpos o ADC procedentes de pacientes infectados por el VIH se dejan sin estimular o se estimulan con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 y, a continuación, se incuban a diferentes diluciones en presencia de PBMC alogénicas mermadas en CD<8>. La realización de las pruebas con diferentes diluciones de linfocitos T CD4+ de cada muestra permite estimar la frecuencia de células que contienen virus competentes para la replicación tras el tratamiento de cinco días con anticuerpos o ADC. Tras una incubación de 14 días de células T c D4+y PBMC alogénicas deplecionadas CD<8>, se analizan las muestras tanto en un ELISA p24 como para detectar la presencia de ARN del VIH con el fin de establecer la frecuencia de células que contienen virus competentes para la replicación. De acuerdo con la depleción específica de células PD-1 altas mostrada en laFigura 14, se observó un aumento del porcentaje de células PD-1 altas que son Annexin V o Aqua positivas, lo que indica un aumento de los niveles de células sometidas a apoptosis y muerte celular, respectivamente (Figura 15ay15b). En el ensayo de crecimiento viral que se muestra en laFigura 16, las muestras de células T CD4+ de un donante infectado por el VIH que fueron tratadas con anticuerpo de control isotópico IgG1, anticuerpos anti-PD-1 (136B5 o 140G5) o que se dejaron sin tratamiento durante cinco días presentan todas ellas una frecuencia similar de células que contienen virus competentes para la replicación (de 16 a 28 células positivas al ARN del VIH-1 por millón (RUPM)). Sin embargo, en las muestras tratadas con ADCs anti-PD-1 (conjugado mAb 140G5-PNU, mAb 136B5, o conjugado mAb 136B5-PNU) hay una disminución significativa en la frecuencia de células infectadas que se corresponde con una reducción de 4 a 5 veces en las células que pueden producir virus infecciosos. Estos resultados se han reproducido en varios experimentos separados con una reducción de hasta 10 veces en RUPM asociada con un tratamiento de cinco días de ADC anti-PD-1. Como tal, estos estudios proporcionan una prueba de principio in vitro para el concepto de que un ADC anti-PD-1 podría ser una terapia eficaz para la depleción de células infectadas de pacientes VIH-1 positivos. ;;Ejemplo 7;;Humanización de anticuerpos anti-PD-1 de ratón;;Las secuencias de anticuerpo IgG1 de ratón para clones anti-PD-1 seleccionados se compararon con una base de datos de genes de línea germinal V de inmunoglobulina humana para encontrar los marcos de cadena pesada y ligera más similares a los de los anticuerpos de ratón. A partir de estas secuencias marco, se diseñó una biblioteca combinatoria y se utilizó para construir una biblioteca de visualización de fagos que incorporaba los bucles CDR de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos que se iban a humanizar. A continuación, la biblioteca de fagos se utilizó en experimentos de paneo contra PD-1 humana recombinante en una construcción de fusión Fc. Se utilizó un ELISA de fagos para evaluar el fago de salida humanizado anti-PD-1 que unía PD-1 recombinante. El ADN de los fragmentos Fab procedentes de clones positivos se introdujo en una biblioteca FASEBA (cribado rápido de expresión, propiedades biofísicas y afinidad) y se utilizó para la producción de fragmentos proteicos Fab. Se evaluó el nivel de expresión de estos fragmentos Fab, su estabilidad proteica/propiedades biofísicas y su afinidad con las proteínas Fc-PD-1 humanas recombinantes, según determinaron los estudios Biacore. Los clones de anticuerpos de ratón 137F2 y 135C12 de laTabla 3se humanizaron de esta manera y las secuencias VH y VL resultantes para clones con las propiedades de expresión, estabilidad y afinidad deseadas se muestran a continuación. Las mediciones de afinidad Biacore de los clones Fab humanizados 137F2 y 135C12 para las proteínas Fc-PD-1 humana y de mono se muestran en lasTablas 12y13, respectivamente. A continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de la región variable (cadenas pesada y ligera, según se indique) de estos anticuerpos humanizados ejemplares. ;;A. Secuencias de la cadena pesada 137F2 humanizada;;1. Secuencia de referencia VH de ratón ;QVQLQQPGAELVRPGTSVKMSCKAAGYTFTNYWIGWIKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGKA TLTADTSSSTAYMQVSSLTSEDTGIYYCARGYDFVLDRWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO. 277) ;;2. A35790-VH ;QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 139) ;;3. A35796-VH ;QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 140) ;;4. A35793-VH ;QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV ;TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 141) ;;5. A35818-VH ;QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTNYWIGWVRQAPGQALEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV ;TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 142) ;;<6>. A35795-VH ;QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 143) ;;7. A35797-VH ;EVQLVQSGAEVKKHGESLKISCKGSGYSFTNYWIGWVRQATGQGLEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV ;TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 144) ;<8>. A35799-VH QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 145) 9. A35805-VH QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQAPGKGLEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 146) 10. 137F VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRVT MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 147) 11. 137F VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAAGYTFTNYWIGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGGGYTNYNEKFKGRVT MTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 148) 12. 137F VH1b ;QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FTNYWIGWVRQAPGQGLEWIGDIY PGGGYTNYNEKFKGRVT MTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 149) 13. 137F VH1c ;QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYWIGWIRQAPGQGLEWIGDIY PGGGYTNYNEKFKGRAT LTADTSTSTVYMEVSSLRSEDTAVYYCARGYDFVLDRWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 150)B. Secuencias de cadenas ligeras 137F2 humanizadas;1. Secuencia de referencia VL de ratón DIVMSQSPSSLAVSTGEKVTMTCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRF LGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 278) ;2. A35790-VL DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 151) ;3. A35796-VL DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 152) ;4. A35793-VL DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 153) ;5. A35818-VL DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 154) ;;<6>. A35795-VL DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 155) ;7. A35797-VL ;DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 156) ;;<8>. A35799-VL DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 157) ;9. A35805-VL DWMTQSPAFLSVTPGEKVTITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCKQSYTLRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 158) ;10. 137F VL1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 159) ;11. 137F VL2 DIVMTQSPDSLAVSLGERATITCKSSQSLENSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFL GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 160) ;12. 137F VL1b DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 161) ;13. 137F VL1c DIVMTQSPDSLAVSLGERATITCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 162) ;14. 137F VL1d DIVMTQSPDSLAVSLGERATMTCKSSQSLFNSETQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYTLRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO. 163) ;C. Secuencias de la cadena pesada 135C12 humanizada;1. Secuencia de referencia VH de ratón EVQLHQSGPELLKPGASVRMSCKASGYTFTNFYIHWVKQSHGKSIEWIGSIYPNYGDTAYNQKFKDKA TLTVDKSSSTAYMALRSLTSEDSAVYYCARGYSYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO. 279) 2. A35775-VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQAPGQRLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRF VFSLDTSVSIAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 164) 3. A35783-VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQARGQRLEWIGSIYPNYGDTAYNQKFKDRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 165) 4. A35774-VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQAPGQRLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRF VFSLDTSVS1AYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 166) 5. A36443-VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNFYIHWVRQARGQRLEWIGSIYPNYGDTAYNQKFKDRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 167) ;<6>. A35777-VH ;EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNFYIHWVRQAPGKGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 168) 7. A35789-VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQMPGKGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 169) ;<8>. A36448-VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQMPGKGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 170) 9. A36437-VH EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNFYIHWVRQMPGKGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRF VFSLDTSVS1AYLQISSLKAEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO. 171) 10. 135C VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRVT MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 172) 11. 135C VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRVT MTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 173) 12. 135C VH3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIHWVKQAHGQGLEWMGSIYPNYGDTAYNQKFKDRVT MTVDKSTSTVYMELRSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 174) 13. 135C VH1b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPNYGDTAYNQKFKDRVT MTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 175) 14. 135C VH1c ;QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKAS GYTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWIGSIY PNYGDTAYNQKFKDRAT LTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 176) 15. 135C VHId ;QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKAS GYTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWIGSIY PNYGDTAYNQKFKDRAT LTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 177)D. Secuencias de cadenas ligeras humanizadas 135C12;1. Secuencia de referencia VL de ratón NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENWTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSA TDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 280) ;2. A35775-VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 178) ;3. A35783-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKTPKLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 179) ;4. 35774-VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 180) ;5. A36443-VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSG TEFTLTISRLEPEDFAVYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 181) ;;<6>. A35777-VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 182) ;7. A35789-VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSLHSGIPARFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 183) ;;<8>. A36448-VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKTPKLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 184) ;9. A36437-VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSSLHSGIPARFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFAVYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 185) ;10. 135C VL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 186) ;11. 135C VL2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSSLHSGVPLRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 187) ;12. 135C VL3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKSDGAVKLLIYHTSSLHSGVPLRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 188) ;13. 135C VL1b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO. 189) ;14. 135C VL1c DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISGDLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSSLHSGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCQYYSKDLLTFGGGTKLELK (SEQ ID NO. 190) ;Las mediciones de afinidad de unión Biacore para los anticuerpos humanizados indicados se presentan enTablas 12y13a continuación. ;Tabla 12;; ; ;;; Tabla 13;; ;;; Ejemplo 8;;Estimulación de células T con anticuerpos anti-PD1 y sus combinaciones;;Los resultados de la estimulación antígeno-específica de PBMC de un donante VIH infectado crónicamente da lugar a la proliferación de células T CD<8>+ específicas del VIH se ilustran en lasFigs. 17-19. Debido al estado de agotamiento de las células T CD<8>+ en el donante virémico, la adición de anticuerpos anti-PD-1 aumenta la proliferación específica del antígeno hasta aproximadamente un<2 0 0>% (valor p <<0>,<0 0 0 1>). ;;Los anticuerpos anti-PD-1 humanizados que codifican CDR derivadas del anticuerpo anti-PD-1 bloqueante de ratón 137F2 y el anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante de ratón 135C12 se evaluaron por su capacidad para aliviar el agotamiento funcional en células T CD<8>específicas de antígeno en el ensayo de agotamiento funcional CFSE. Se probaron varios anticuerpos humanizados para los clones 137F2 y 135C12 con variaciones en la región marco del anticuerpo humano en múltiples ensayos y todos demostraron una actividad similar en la promoción de la proliferación de células T CD<8>+ en comparación con MK3475 y los anticuerpos quiméricos ratón/humano (porciones Vl y Vh de las regiones constantes de ratón y humana de IgG4) de 137F2 y 135C12. Debido al estado de agotamiento de las células T CD<8>en el donante virémico, la adición de los anticuerpos anti-PD-1 aumenta la proliferación específica de antígeno hasta aproximadamente un 200% (valor p < 0,0001) (Figura 17). Anticuerpos anti-PD-1 humanizados que codifican CDR derivadas del anticuerpo anti-PD-1 bloqueante de ratón (es decir, bloqueante de la interacción PD-1/PD-L1) 137F2 (es decir, anticuerpos humanizados A35795 (que comprenden SEQ ID NOS. 143 y 155), A35796 (que comprende SEQ ID NOS. 140 y 152) y A35797 (que comprende S<e>Q ID NOS. 144 y 156), y la quimera ratón-humano 137F2 (que comprende SEQ ID NOS.<8>, 31, 54, 77, 100 y 123)) y el anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante de ratón 135C12 (es decir, los anticuerpos humanizados A35774 (que comprenden SEQ ID NOS. 166 y 180), A35783 (que comprende SEQ ID NOS. 165 y 179), A35789 (que comprende SEQ ID NOS. 169 y 183), A36443 (que comprende SEQ ID NOS. 167 y 181), 135C H2L2 (que comprende SEQ ID NOS. 173 y 187), 135C H1cL1c (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 190), 135C H1cL1b (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 189), y la quimera ratón-humano 135C12 (que comprende SEQ ID NOS. 17, 40, 63,<8 6>, 109 y 132)) se evaluó su capacidad para aliviar el agotamiento funcional en células T CD<8>+ específicas de antígeno en el ensayo de agotamiento funcional CFSE. Se probaron en múltiples ensayos varios anticuerpos humanizados para los clones 137F2 (bloqueante) y 135C12 (no bloqueante) con variaciones en la región marco del anticuerpo humano. Todos demostraron una actividad similar en la promoción de la proliferación de células T CD<8>+ en comparación con MK3475 y los anticuerpos quiméricos ratón/humano de 137F2 y 135C12. ;;La Figura 18ilustra los resultados de la combinación de un anticuerpo que bloquea la interacción PD-1/PD-L1 (MK3475 o A35795) con un anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante (A35774) dio lugar a un aumento estadísticamente significativo de la proliferación en relación con cualquiera de los anticuerpos solos (valor de p < 0,0001). Los datos mostrados en laFig. 18son la media de tres experimentos para combinaciones de MK3475 y cuatro experimentos para combinaciones de A35795 con A35774. ;;La Figura 19muestra el efecto de otras combinaciones de un anticuerpo que bloquea la interacción PD-1/PD-L1 (MK3475) y un anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante (135C H1cL1c (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 190) o 135C H1cL1b (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 189). Como se muestra en la misma, la combinación del anticuerpo bloqueante MK3475 y un anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante (135C H1cL1c o 135C H1cL1b) produce un aumento estadísticamente significativo de la proliferación en relación con cualquiera de los anticuerpos por separado (valores de p de 0,018 o <<0>,<0 0 0 1>, según se indica). Los datos mostrados enFig. 19son la media de dos experimentos para cada combinación. ;;Ejemplo 9;;Activación de células reporteras Jurkat PD-1 con tratamiento combinado de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes.;;En estos experimentos, se estimuló una línea celular reportera de Jurkat PD-1 NFAT con una línea celular 293T transfectada transitoriamente que coexpresa un activador de TCR y la proteína PD-L1. En ausencia de un anticuerpo anti-PD-1, la interacción PD-L1/PD-1 suprimió la estimulación de las células Jurkat, lo que condujo a una menor activación de NFAT y a niveles más bajos de producción de luciferasa. La adición de un anticuerpo anti-PD-1 bloqueante (por ejemplo, MK3475) dio lugar a una mayor activación de NFAT, una mayor producción de luciferasa y una mayor cantidad de luz quimioluminiscente producida al añadir el sustrato de luciferasa. En estas condiciones de ensayo extremas con un gran exceso de PD-1 y PD-L1, los anticuerpos anti-PD-1 no bloqueantes (ejemplificados por A35774 en laFigura 20Ay 135C H1cL1c en laFigura 20Btienen una actividad reducida en relación con los anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes. Sin embargo, la combinación de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes conduce a un aumento adicional de la activación de las células T hasta niveles superiores a los que pueden alcanzarse con MK3475 solo. Esta mayor activación de NFAT con anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes se observa tanto a concentraciones bajas como altas de cada anticuerpo probado. Los datos mostrados son la media de tres réplicas con aumentos estadísticamente significativos en la activación de NFAT mostrados para las combinaciones de anticuerpo bloqueante MK3475 no bloqueante A35774 (Figura 20A) o anticuerpo bloqueante MK3475 anticuerpo no bloqueante 135 H1cL1c (Figura 20B). ;;Ejemplo 10;;Internalización de PD-1 en la superficie celular con tratamiento de anticuerpos anti-PD-1;;Se incubaron PBMC de un donante VIH infectado crónicamente con células T de memoria que tenían niveles basales altos de PD-1 con anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes, no bloqueantes o combinaciones de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes para determinar el efecto sobre la internalización de PD-1 (Figura 21). Se monitorizaron los niveles de PD-1 en la superficie celular en células T CD4+ de memoria (Fig. 21, paneles a, c y e) y células T CD<8>+ (Fig. 21, paneles b, d y f) por medio de citometría de flujo para determinar si los anticuerpos anti-PD-1 inducían la internalización de PD-1 en la superficie celular durante 48 a 72 horas. Se muestran tres experimentos separados mediante el uso de las combinaciones de anticuerpos A35795 (que comprende SEQ ID NOS. 143 y 155) y A35774 (que comprende SEQ ID NOS. 166 y 180) (Fig. 21, paneles a,b); MK3475 y A35774 (que comprenden SEQ ID NOS. ;166 y 180) (Fig. 21, paneles c,d); así como A35795 (que comprende SEQ ID NOS. 143 y 155) y 135C H1cL1c (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 190) (Fig. 21, paneles e, f). En todos los casos, la combinación de bloqueantes (ejemplificada por A35795 o MK3475) y no bloqueantes (ejemplificada por A35774 (que comprende SEQ ID NOS. 166 y 180) o 135C H1cL1c (que comprende SEQ<i>D NOS. 176 y 190)) anticuerpos anti-PD-1 se observó que inducían una internalización más rápida y/o más pronunciada del receptor PD-1. En cada experimento, las PBMC se incubaron con un anticuerpo de control isotópico IgG4 humano que actuó como referencia para las células T no tratadas que mantuvieron niveles elevados de PD-1 durante todas las incubaciones del cultivo celular. Mecánicamente, la internalización de PD-1 puede contribuir a la actividad funcional antagonista de los anticuerpos anti-PD-1 (ya sea solos o en combinaciones de anticuerpos bloqueantes y no bloqueantes), dado que una expresión reducida de PD-1 en la superficie celular podría limitar la regulación negativa de las células T a través de la interacción PD-1 / PD-L1. ;;Ejemplo 11;;Producción de IFN-y tras el tratamiento con anticuerpos anti-PD-1;;Se incubaron PBMC de un donante VIH infectado crónicamente que poseía células T de memoria con altos niveles basales de PD-1 con anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes, no bloqueantes o combinaciones de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes. A continuación, las mezclas de PBMC y anticuerpos se estratificaron sobre células 293T transfectadas transitoriamente para expresar un activador del TCR anti-CD3 o para coexpresar el activador del TCR anti-CD3 y PD-L1. Tras una estimulación de 24 horas de las PBMC con las células activadoras del TCR en presencia o ausencia de PD-L1, se recogieron los sobrenadantes y se analizó la producción de IFN-<y>por medio de ELISA. Se detectaron niveles similares de IFN-<y>en todas las muestras tratadas con anticuerpos cuando se estimularon con las células activadoras del TCR anti-CD3 (Figura 22A). Por el contrario, se detectaron niveles más bajos de IFN-Y en la muestra tratada con el control isotópico IgG4 y hubo una mayor producción de IFN-<y>en la muestra tratada con anticuerpos anti-PD-1. Los niveles más altos de producción de citocinas se observaron en las muestras tratadas con anticuerpos anti-PD-1 tanto bloqueantes (MK3475) como no bloqueantes (A35774) (* p < 0,05).
En otro experimento, PBMC de un donante VIH infectado crónicamente que poseía células T de memoria con altos niveles basales de PD-1 se incubaron con anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes, no bloqueantes (A35774), bloqueantes (MK3475), o una combinación de anticuerpos anti-PD-1 bloqueantes y no bloqueantes (A35774 y MK3475 (Figura 22B)). A continuación, las mezclas PBMC / anticuerpo se estratificaron sobre células 293T transfectadas transitoriamente para coexpresar el activador del TCR anti-CD3 y la proteína PD-L1. Se añadió el inhibidor del transporte de proteínas GolgiPlug™y se incubaron las células durante aproximadamente 18 horas para permitir la acumulación de citocinas en su interior. Los porcentajes de células productoras de IFN-<y>se evaluaron para cada una de las condiciones de tratamiento con anticuerpos mediante citometría de flujo (Figura 22B). La producción de IFN-y aumentó en las células PD-1 positivas con la terapia anti-PD-1 y la combinación de un anticuerpo bloqueante (MK3475) y no bloqueante (A35774) condujo a un aumento adicional de la producción de citocinas (datos mostrados para las células T CD<8>PD-1+).
Ejemplo 12
Cristalografía
La proteína PD-1 humana purificada expresada recombinantemente (residuos 33 a 150 del ectodominio del receptor ("hPD<1>")) se incubó con el fragmento Fab del anticuerpo humanizado A35774, y el complejo se purificó por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. Se generaron cristales de proteína para la hPD-1/Fab A35774 (que comprende SEQ ID NOS. 166 y 180) y la estructura resuelta por medio de cristalografía de rayos X. La estructura de cocristal de laFigura 23Amuestra los bucles CDR de cadena pesada y ligera de A35774 (que comprende SEQ ID NOS. 166 y 180, cuyos CDR están representados por SEQ ID NOS. 17, 40, 63,<8 6>, 109 y 132) que interactúan con hPD-1. Los datos indican que los residuos primarios que sirven como epítopo de unión en PD-1 para A35774 incluyen F37, P39, A40, L41, V43, L138, R139 y R143 para los bucles V<h>CDR y P34, E136, S137 y R139 para los bucles V<l>CDR. Estos estudios estructurales son coherentes con el mapeo de epítopos realizado con el anticuerpo 135C12 de ratón que posee las mismas CDR de cadena pesada y ligera que A35774 como se describe enEjemplos 3y5. En esos experimentos de unión de anticuerpos con PD-1 codificando sustituciones de aminoácidos, se observó un cambio en la unión entre el anticuerpo 135C12 y PD-1 mutante M4 incluyendo sustituciones S36A/P37A/L41A, M26 con sustituciones R139A/E141A; y PD-1 mutante M31 con sustituciones L141A/V143L. Otras mutaciones de PD-1 que dieron lugar a un pequeño cambio en la afinidad de unión de 135C12 (las presentes en M17, M18 y M28) se encuentran muy cerca del sitio de unión de A35774 Fab en PD-1 y estas sustituciones de aminoácidos podrían introducir cambios conformacionales locales en PD-1 que redujeran la afinidad de unión del anticuerpo en estos ensayos. En conjunto, los estudios de co-cristalografía, mapeo de epítopos y unión competitiva de anticuerpos proporcionan pruebas concluyentes de que la unión de anticuerpos que se solapa con la región del parche P2 puede poseer una actividad funcional antagonista que es distinta de los anticuerpos que actúan a través del bloqueo de PD-1 /PD-L1. Una prueba adicional de que los anticuerpos ejemplificados por A35774 no bloquean la interacción entre PD-1 y PD-L1 se proporciona en laFigura 23Bdonde se generó un modelo entre nuestra estructura de co-cristal de hPD-1 / Fab A35774 y la estructura de co-cristal de 4ZQK de PD-1 con PD-L1. Este modelo muestra una unión no solapada del A35774 Fab y la proteína PD-L1 a PD-1 humana (Figura 23B).
Ejemplo 13
Estudios de eficacia in vivo
Se realizó un estudio de eficaciain vivoen ratones PD-1 HuGEMM para evaluar el potencial terapéutico de un anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante 135C H1cL1c (que comprende SEQ ID NOS. 176 y 190)) en comparación con Keytruda (MK3475), cada uno administrado individualmente a 10 mg/kg quincenales (Figura 24). Un tratamiento terapéutico adicional incluyó la administración conjunta de 135C H1cL1c y Keytruda a razón de 5 mg/kg cada dos semanas. Los ratones HuGEMM fueron modificados genéticamente para expresar una proteína PD-1 quimérica humana/ratón en la que la mayor parte del ectodominio del receptor codifica la proteína PD-1 humana (secuencia PD-1 humana de los residuos 26 a 146). Antes del estudioin vivo,las pruebas de citometría de flujo confirmaron que los anticuerpos anti-PD-1 135C H1cL1c y Keytruda se unían específicamente al quimérico PD-1 humano/ratón HuGEMM en la superficie de las células T estimuladas. Como preparación para el estudio, se inocularon por vía subcutánea células MC38 derivadas de un adenocarcinoma de colon en varios ratones HuGEMM PD-1 para el desarrollo tumoral. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de unos 95 mm<3>± 50, se aleatorizaron un total de 40 ratones en cuatro grupos con un tamaño tumoral medio de 84 mm<3>y se inició la dosificación (vehículo, 135C H1cL1c, Keytruda y 135C H1cL1c+Keytruda) el día 0 del estudio. Los anticuerpos terapéuticos anti-PD-1 se administraron quincenalmente y el tamaño del tumor y el peso corporal del ratón se midieron dos veces por semana. Se monitorizó la inhibición del crecimiento tumoral en relación con los ratones de control no tratados con tampón PBS y se comparó la eficacia con la de Keytruda. El anticuerpo anti-PD-1 no bloqueante 135C H1cL1c indujo una reducción del crecimiento tumoral a niveles comparables a Keytruda. La administración conjunta de 135C H1cL1c y Keytruda también indujo una reducción del crecimiento tumoral que fue al menos tan eficaz como Keytruda administrado solo a 10 mg/kg. Sin embargo, en todos los momentos posteriores al tratamiento durante el estudio, los ratones tratados con la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda mostraron una tendencia hacia una mejor respuesta y un menor volumen tumoral medio en relación con el control positivo de Keytruda. Es importante destacar que la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda mostró una reducción estadísticamente significativa del volumen tumoral en relación con el control con vehículo el día 4 (valor p de 0,0676, cercano al límite estadístico), el día 7 (valor p de 0,0266), el día 11 (valor p de 0,0067), el día 14 (valor p de 0,0037) y el día 17 (valor p de 0,0021) del estudio (mediante el uso de la prueba de Wilcox por pares para el análisis estadístico). Por el contrario, Keytruda administrado solo mostró una reducción estadísticamente significativa del volumen tumoral en relación con el control con vehículo el día 11 (valor p de 0,0205), el día 14 (valor p de 0,0145) y el día 17 (valor p de 0,0145). La administración de 135C H1cL1c solo mostró una reducción estadísticamente significativa del volumen tumoral en relación con el control con vehículo el día 11 (valor p de 0,0266), el día 14 (valor p de 0,0062) y el día 17 (valor p de 0,0044) del estudio (Figura 24A). La interpretación de los datos en términos del porcentaje medio de inhibición del volumen tumoral de MC38 en relación con el control con vehículo también muestra una fuerte tendencia hacia y una mejor actividad antitumoral de la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda en relación con Keytruda o 135C H1cL1c administrados solos (Figura 24B). Este perfil apoya la evidenciain vitrode que la combinación de un anti-PD-1 bloqueante (por ejemplo, Keytruda o MK3475) y un anti-PD-1 no bloqueante (135C H1cL1c) conduce a un aumento de las actividades funcionales de las células T (por ejemplo, proliferación (Ejemplos 2 y 8) y producción de citoquinas (Ejemplo 11)). Una observación adicional es que la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda comienza a ejercer un efecto antitumoral en puntos temporales mucho más tempranos (por ejemplo, el día 4 o 7 del estudio) en relación con Keytruda solo, a pesar de que se dosificaron cantidades totales equivalentes de anticuerpo para cada brazo del estudio (Keytruda: 10 mg/kg y 135C H1cL1c y Keytruda: 5 mg/kg de cada uno). Por último, los datos del modelo tumoralin vivose interpretaron en términos del porcentaje de ratones que experimentaron una remisión completa del tumor M38 durante la terapia con anticuerpos (Figura 24C). En consonancia con la mejora del porcentaje de inhibición tumoral observada con la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda, esta rama del estudio (la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda) presentó un aumento de 2 veces en los ratones que tuvieron una remisión completa del tumor implantado (cuatro ratones para la combinación de 135C H1cL1c y Keytruda frente a dos ratones para Keytruda o 135C H1cL1c administrados individualmente/solos). En conjunto, estos datosin vivoconfirman que la unión a un epítopo de PD-1 que se solapa con el parche P2 y el no bloqueo de la interacción PD-1 /PD-L1, activa una respuesta inmune específica del tumor que es distinta y cooperativa con los anticuerpos anti-PD-1 que actúan a través del bloqueo PD-1 / PD-L1.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a PD-1 humano y comprende una combinación de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), la combinación que comprende:
    SEQ ID NO. 172 y SEQ ID NO: 186;
    SEQ ID NO. 173 y SEQ ID NO: 187;
    SEQ ID NO. 174 y SEQ ID NO: 188;
    SEQ ID NO. 175 y SEQ ID NO: 189;
    SEQ ID NO. 176 y SEQ ID NO: 190; o
    SEQ ID NO. 177 y SEQ ID NO: 190;
    2. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 176 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 190.
    3. Una composición que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1 o 2 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
    4. Un procedimientoin vitropara inducir la internalización de PD-1 de la superficie de una célula T CD<8>por medio del contacto de la célula T CD<8>con una composición que comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo humanizado que comprende SEQ ID NO: 176 y SEQ ID NO: 190, en el que la célula T es una célula T humana infectada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
    5. Un procedimientoin vitropara aumentar la proliferación de células T CD<8>específicas de antígeno mediante el contacto de las células T CD<8>con una composición que comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo humanizado que comprende:
    SEQ ID NO.: 175 y SEQ ID NO: 189;
    SEQ ID NO.: 176 y SEQ ID NO: 190; o
    SEQ ID NO.: 173 y SEQ ID NO: 187;
    en el que las células T son específicas para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
    <6>. El procedimiento de la reivindicación 4 o 5, en el que el procedimiento comprende además poner en contacto las células T con el anticuerpo anti-PD-1 pembrolizumab.
    7. Un producto que comprende una composición de la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento del cáncer en un ser humano.
    <8>. El producto para uso de la reivindicación 7, en el que también se administra pembrolizumab al ser humano.
    9. El fragmento de la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento Fab, Fab<2>, Fab', anticuerpo de cadena simple, o Fv.
    10. Una composición que comprende el fragmento de la reivindicación 3 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
    11. Una composición que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1 o 2 y el anticuerpo anti-PD-1 pembrolizumab.
    12. Un derivado del anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en el que el derivado comprende el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación<1>y una etiqueta detectable o una fracción efectora fijamente unida al mismo; opcionalmente, en el que el derivado está comprendido en una composición que comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
    13. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la reivindicación 1 o 2.
    14. El polinucleótido aislado de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo comprende un VH y un VL codificados por una secuencia de ácido nucleico como se establece en:
    SEQ ID NO. : 225 y SEQ ID NO: 239 respectivamente;
    SEQ ID NO. : 226 y SEQ ID NO. 240 respectivamente;
    SEQ ID NO. : 227 y SEQ ID NO. 241 respectivamente;
    SEQ ID NO. : 228 y SEQ ID NO. 242 respectivamente;
    SEQ ID NO. : 229 y SEQ ID NO. 243 respectivamente; o;
    SEQ ID NO. 230 y SEQ ID NO. 243 respectivamente.
    15. Un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos de la reivindicación 13 o 14, o una célula huésped que comprende los mismos.
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