ES2976707T3 - Soporte sólido - Google Patents

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Abstract

Un soporte sólido para uso en reacciones de moléculas conjugadas de ADN no acuosas, en donde el soporte comprende un cuerpo sólido formado a partir de una pluralidad de unidades de polietilenglicol, en donde el cuerpo sólido incluye al menos un resto catiónico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Soporte sólido
Campo de la invención
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas y se refiere a soportes sólidos, que son adecuados para su uso en reacciones químicas no acuosas, por ejemplo, en reacciones químicas que se llevan a cabo en ADN o en presencia de ADN para sintetizar colecciones codificadas por ADN (DEL, por sus siglas en inglés), y también a un método de uso de estos soportes sólidos, donde el método incluye los pasos de absorber el ADN en el soporte sólido de la invención y hacer reaccionar el compuesto marcado con ADN con un reactivo en un sistema de disolventes no acuoso.
Antecedentes de la invención
Las colecciones codificadas por ADN (DEL) son colecciones de cientos de miles a miles de millones de moléculas sintéticas de bajo peso molecular, cada una conjugada a una secuencia de ADN única que sirve como identificador estructural. Estas vastas colecciones de conjugados de ADN y moléculas sintéticas de bajo peso molecular se someten a cribado en mezclas mediante procesos de selección de afinidad, lo que las convierte en una herramienta atractiva para el descubrimiento de ligandos para dianas biomoleculares de interés farmacéutico. Las reacciones que se utilizan para la síntesis de las DEL implican habitualmente la formación de enlaces químicos covalentes en condiciones acuosas suaves que son compatibles con la solubilidad y estabilidad de las marcas o etiquetas de ácidos nucleicos. La solubilización de ácidos nucleicos requiere normalmente una proporción elevada de agua, lo que tiene la consecuencia inevitable de inducir reacciones secundarias, como la protonación de reactivos o intermedios de reacción o la hidrólisis de reactivos en reacciones utilizadas para la síntesis de las DEL. Esto limita severamente la implementación de transformaciones químicas novedosas para la síntesis de DEL y estas se limitan normalmente a aquellas que tienen el potencial de funcionar en presencia de agua. Muchas de estas reacciones son procesos químicos de derivatización de nitrógeno (tales como amidación, aminación reductiva, sulfonilación, uretanación) o acoplamientos cruzados mediados por paladio (y de forma más destacada el acoplamiento cruzado de Suzuki), que pueden conducir a moléculas con propiedades limitadas de tipo fármaco que pueden requerir una optimización significativa para proporcionar candidatos clínicos.
Se sabe cómo inmovilizar moléculas conjugadas a ADN en un soporte sólido con el fin de aumentar la proporción de disolvente orgánico que se utiliza en las reacciones. El soporte habitual en tales casos es un soporte de polisacárido, tal como DEAE-Sepharose. Sin embargo, tales soportes sólidos de polisacáridos son hidrófilos y por lo tanto es prácticamente imposible secarlos completamente. Además, tales soportes sólidos no son compatibles con todos los disolventes orgánicos utilizados habitualmente en síntesis orgánica.
Actualmente, los métodos para llevar a cabo reacciones en moléculas de bajo peso molecular conjugadas con ADN en disolventes orgánicos con exclusión total de agua se limitan a la unión covalente de la molécula de ADN a un soporte sólido (MacConnell A. B., Price A. K. y Paegel B. M. «An integrated microfluidic processor for DNA-encoded combinatorial library functional screening».ACS Combinatorial Science,2017(3), 181-192; Klika Skopic M., Salamon H., Bugain O., Jung K., Gohla A., Doetsch L. J., Dos Santos D., Bhat A., Wagner B., Brunschweiger A. «Acid- and Au(I)-mediated synthesis of hexathymidine-DNA-heterocycle chimeras, an efficient entry to DNA-encoded libraries inspired by drug structures».Chemical Science,2017(8), 3356-3361). En estos ejemplos, la unión covalente del ADN al soporte sólido o bien impide el cribado de la colección frente a la diana inmovilizada en experimentos de selección de afinidad, o evita la elongación de la marca de ADN para codificar la estructura de los compuestos de la colección. La adaptación de tales transformaciones para conseguir síntesis grandes y diversas de la colección en entornos acuosos sigue siendo un desafío significativo y costoso. Es importante destacar que esta estrategia no permite aprovechar inmediatamente los avances en la química orgánica moderna que pueden ser incompatibles con la presencia de agua en medios de reacción compatibles con el ADN.
Por lo tanto, actualmente no existen métodos genéricos y prácticos para llevar a cabo reacciones en moléculas unidas al ADN en disolventes orgánicos anhidros con el propósito de la síntesis de colecciones codificadas por ADN.
El problema se ha resuelto a través de la adsorción no covalente de estructuras unidas al ADN mediante interacciones iónicas reversibles sobre un soporte catiónico insoluble basado en PEG, que esencialmente hace posible llevar a cabo procesos químicos en ausencia de agua, y la liberación del soporte permite la miniaturización de la tecnología DEL.
Compendio de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un soporte sólido para su uso en reacciones de moléculas conjugadas a ADN no acuosas, en donde el soporte comprende un cuerpo sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol, en donde el cuerpo sólido incluye al menos un resto catiónico, en donde el resto catiónico incluye un grupo de amonio cuaternario o un grupo de guanidinio, y en donde el resto catiónico es un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III tal como se define a continuación: 1
1. (I) un compuesto de acuerdo con la Fórmula I:
Fórmula I
en donde:
el Cuerpo es el soporte sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol; R es hidrógeno; alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C1-C8; cicloalquilo C3-C8; -C(O)(alquilo C1-C8); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros;
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-; naftilo; y
antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo; Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1,2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
Y es C(O); y
R1, R2, R3 se seleccionan cada uno independientemente entre hidroxi; alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C1-C8; cicloalquilo C3-C8; -C(O)(alquilo C1-C8); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno; hidroxi; alquilo Ci-Cs opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico d e 5 a 10 miembros u -Oalquilo Ci-Cs; cicloalquilo C3-Cs; -C(O)(alquilo Ci-Cs); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; o
2. II) un compuesto de acuerdo con la Fórmula II:
en donde:
el Cuerpo y R son cada uno como se han definido anteriormente;
R10 es un alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C1-Cs; cicloalquilo C3-Cs; un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros o R11;
n es un número entero de 2 a 12;
R es hidrógeno; alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C1-Cs; cicloalquilo C3-Cs; -C(O)(alquilo C1-Cs); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; y
R6 y R11 son cada uno independientemente un grupo que tiene la fórmula IIa:
Fórmula lia
en donde m es un número entero de 0 a S; y
R1, R2 y R3 son como se han definido anteriormente;
O
un grupo que tiene la fórmula IIb:
Fórmula IIb
en donde m es como se ha definido anteriormente;
O
un grupo que tiene la fórmula -(CFh)q-NFIR7
en donde q es un número entero de 1 a 6 ; y
R7 es un grupo que tiene la fórmula IIc:
Fórmula lie en donde p es un número entero de 1 a 12; y
R1, R2 y R3 son como se han definido anteriormente; o 3. III) un compuesto de acuerdo con la Fórmula III:
Fórmula III en donde
el Cuerpo, R e Y son cada uno como se han definido anteriormente; r es un número entero de 1 a 6 ; y
R8 es un grupo que tiene la fórmula IIIa:
en donde
Y' es C(O) o CH2;
s es un número entero de 1 a 6 ;
R7 es como se ha definido anteriormente; y
R9 es H o alquilo C1-C6;
O
R8 es un grupo que tiene la fórmula IIIb:
en donde
Y' es C(O) o CH2;
t es un número entero de 1 a 6 ; y
R1, R2, R3 y R9 son como se han definido anteriormente.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para hacer reaccionar un compuesto conjugado a ADN utilizando uno o más disolventes no acuosos, en donde el método incluye los pasos de:
i) absorber el compuesto marcado con ADN sobre un soporte sólido; y
ii) hacer reaccionar el compuesto marcado con ADN soportado con un reactivo en un sistema de disolventes no acuoso,
en donde el soporte comprende un cuerpo sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol, en donde el cuerpo sólido incluye al menos un resto catiónico, en donde el resto catiónico incluye un grupo de amonio cuaternario o un grupo de guanidinio.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un soporte sólido de acuerdo con el primer aspecto para soportar un compuesto conjugado a ADN.
Descripción de los dibujos
Figura 1. Resina polimérica sólida pegilada TentaGel (RTM) XV-NH2 que tiene la fórmula (VI).
Figura 2. Estructura química y representación esquemática de un soporte polimérico anfifílico de la presente invención y su uso en la transferencia e inmovilización de un oligonucleótido de ADN, conjugado en este caso a un tinte Cy5.
Descripción detallada de la invención
Se ha puesto de manifiesto que las resinas sólidas a base de polietilenglicol (resinas a base de PEG) son adecuadas para su uso en las reacciones deseadas, ya que se pueden utilizar tanto en condiciones acuosas como orgánicas. Los soportes sólidos incluyen las propiedades anfifílicas de la resina a base de PEG y una capacidad de unión al ácido nucleico proporcionada por el resto catiónico. El resto catiónico proporciona interacciones electrostáticas reversibles con los ácidos nucleicos. Por lo tanto, el soporte sólido de acuerdo con la invención se puede suspender en agua para la adsorción del ADN y a continuación se puede lavar con disolventes orgánicos para dejar las moléculas codificadas por el ADN inmovilizadas en condiciones pseudoorgánicas. Los soportes sólidos de acuerdo con la invención se pueden utilizar, por tanto, en transformaciones químicas no acuosas que impliquen moléculas conjugadas al ADN, donde los soportes sólidos son insolubles tanto en sistemas de disolventes acuosos como orgánicos y, además, son inertes.
Convenientemente, es posible eliminar sustancialmente el agua del sistema de soporte mediante el uso de métodos de secado conocidos, tales como la adición de tamices moleculares.
Las moléculas codificadas por el ADN inmovilizadas secas pueden someterse a reacciones no acuosas que antes no eran posibles.
En la invención, el resto catiónico incluye un grupo de amonio cuaternario o un grupo de guanidinio. Por ejemplo, el resto catiónico puede ser un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III tal como se ha definido anteriormente.
En una realización de la invención, R y R12 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6, convenientemente R y R12 son cada uno independientemente hidrógeno.
En una realización adicional de la invención, R1, R2 y R3 son iguales. Convenientemente, R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6. En una realización adicional más de la invención, R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional de la invención, R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno y un alquilo C1-C6.
En una realización adicional de la invención, R9 es hidrógeno.
En una realización adicional R10 es un alquilo C1-C6, opcionalmente un alquilo C1-C3, opcionalmente además un grupo metilo.
En una realización adicional, X1 es una cadena de alquileno C1-C20, donde la cadena de alquileno es lineal y no está sustituida.
En una realización adicional, X1 es una cadena de alquileno C1-C10, donde la cadena de alquileno es lineal y no está sustituida.
En la invención, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
R<x>2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
R<x>3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2.
En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X i es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno; hidroxi; alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C1-C8; cicloalquilo C3-C8; -C(O)(alquilo C1-C8); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros.
En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno; alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C3-C8, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C1-C8; cicloalquilo C3-C8; -C(O)(alquilo C1-C8); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros.
En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-; naftilo; y
antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracenilo, donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno; alquilo C1-C8 opcionalmente sustituido con fenilo o cicloalquilo C3-C8; cicloalquilo C1-C8.
En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-; naftilo; y
antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6, preferentemente R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; -C(H)2-x((alquilo Ci -C6)x)-; naftilo; y
antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, alquilo C1-C6, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; naftilo; y antracilo,
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6, preferentemente R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; y -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-;
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8 o alquilo C1-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; y naftilo;
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8 o naftilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx2 se selecciona entre fenilo; y cicloalquileno C3-C8;
donde el fenilo o cicloalquileno C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 o halo;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6, preferentemente R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -(CH2)a-Rx-(CH2)a-NH-C(=O)-; -(CH2)a-CH((CH2)a-Rx1)NH-C(=O)-; -(CH2)a-(O)0-1-Rx2-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(O)0-1-(CH2)b-NH-C(=O)-;
a es un número entero de 0 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C3-C8; y -C(H)2-x((alquilo C1-C6)x)-;
donde el fenilo, cicloalquileno C3-C8 o alquilo C1-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;
Rx1 se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C3-C8; y naftilo;
donde el fenilo, cicloalquilo C3-C8 o naftilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;
Rx2 se selecciona entre fenilo; y cicloalquileno C3-C8;
donde el fenilo o cicloalquileno C3-C8 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;
Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6,
donde el fenilo o cicloalquilo C3-C6 están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;
x es un número entero de 0 a 2;
R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6, preferentemente R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C1-C8, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C3-C6, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo;
X2 es -Z-Xi -en donde Z se selecciona entre -fenil-CH2-NH-C(O)-; -CH2-C(CH2)2-5-CH2-NH-C(O)-; -CH(CH2-naftil)-NH-C(O)-; -CH2-O-fenil-CH(Rz)-NH-C(O)-;
en donde Rz es fenilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo C1-C6 y alcoxi C1-C6;
R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6, preferentemente R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional, el resto catiónico es un compuesto de fórmula (I), en donde
R es hidrógeno;
Y es C(O);
X es X1 o X2, en donde
X I es una cadena de alquileno C1-C20 no sustituida, en donde la cadena es lineal o ramificada;
X2 es -Z-X1-en donde Z se selecciona entre -fenil-CH2-NH-C(O)-; -CH2-C(CH2)2-5-CH2-NH-C(O)-; -CH(CH2-naftil)-NH-C(O)-; -CH2-O-fenil-CH(Rz)-NH-C(O)-;
en donde Rz es fenilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo C1-C6 y alcoxi C1-C6;
R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C1-C6, preferentemente R1, R2 y R3 son cada uno metilo. En una realización adicional de la invención, se proporciona un método para hacer reaccionar un compuesto conjugado a ADN utilizando uno o más disolventes no acuosos, en donde el método incluye los pasos de adsorber el compuesto marcado con ADN sobre un soporte sólido y hacer reaccionar el compuesto marcado con ADN soportado con un reactivo en un sistema de disolventes no acuoso, en donde el método es tal como se define en las reivindicaciones.
En una realización adicional del método, el método incluye además el paso de liberar el producto del soporte sólido. En una realización adicional de la invención, se proporciona el uso de un soporte sólido tal como se define en las reivindicaciones 3-14 para soportar un compuesto conjugado a ADN. También se divulga el uso de un soporte sólido tal como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores para adsorber un compuesto conjugado a ADN.
Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «alquileno C1-C20» se refiere a un radical bivalente de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación, que tiene de uno a veinte átomos de carbono.
Tal como se utilizan en el presente documento, la expresión «alquilo C1-C8» se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación, que tiene de uno a ocho átomos de carbono y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo. La expresión «alquilo C1-C6» se debe interpretar de forma correspondiente.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «alquenileno C2-C20» se refiere a un grupo radical bivalente de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un doble enlace, que tiene de dos a veinte átomos de carbono.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «alquinileno C2-C20» se refiere a un grupo radical bivalente de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace, que tiene de dos a veinte átomos de carbono.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «cicloalquileno C3-C8» se refiere a un grupo hidrocarbonado que es un radical bivalente monocíclico saturado de 3-8 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, el grupo cicloalquileno C3-C8 puede estar enlazado mediante el mismo átomo de carbono o mediante átomos de carbono diferentes del grupo cicloalquileno C3-C8. Los ejemplos de cicloalquileno C3-C8 incluyen ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, cicloheptileno y ciclooctileno.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «alcoxi Ci -Cs» se refiere a un radical de fórmula -ORa donde Ra es un radical alquilo Ci-Cs tal como se ha definido en general anteriormente. La expresión «alcoxi C1-C6» se debe interpretar de forma correspondiente.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término «halo» se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo. Preferentemente, halo es fluoro o cloro. Más preferentemente, halo es fluoro.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «haloalquilo C1-C6» se refiere a un radical alquilo C1-C6, como se ha definido anteriormente, sustituido con uno o más radicales halo, como se han definido anteriormente. Los ejemplos de haloalquilo C1-C6 incluyen, sin carácter limitante, trifluorometilo, difluorometilo, fluorometilo, triclorometilo, 1,1-difluoroetilo, 2,2-difluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 2-fluoropropilo, 3,3-difluoropropilo y 1-fluorometilo-2-fluoroetilo. Preferentemente, el radical halo es fluoro.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «cicloalquilo C3-Cs» se refiere a un grupo hidrocarbonado monocíclico saturado de 3-8 átomos de carbono. En una realización, el cicloalquilo C3-Cs se selecciona entre ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. La expresión «cicloalquilo C3-C6» se debe interpretar de forma correspondiente.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «-C(O)(alquilo C1-C8)» se refiere a un radical de fórmula -Ra1-(alquilo C1-Cs) donde Ra1 es un radical carbonilo y alquilo C1-Cs es como se ha definido anteriormente.
«Halógeno» o «halo» se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo. Preferentemente, halo es fluoro, cloro o bromo. Más preferentemente, halo es fluoro o cloro.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros» se refiere a un radical que es un anillo monocíclico o bicíclico no aromático estable. En una realización, el anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros comprende 1,2 o 3 heteroátomos seleccionados individualmente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclilo puede estar unido a través de un átomo de carbono o un heteroátomo. Los ejemplos de heterociclilo incluyen, sin carácter limitante, pirrolinilo, pirrolidilo, tetrahidrofurilo, tetrahidrotienilo, piperidilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo o perhidroazepinilo. La expresión «anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros» se debe interpretar de forma correspondiente. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «heteroarilo de 5 o 6 miembros» se refiere a un radical que es un anillo monocíclico aromático de 5 o 6 miembros. En una realización, el heteroarilo de 5 o 6 miembros comprende 1,2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados individualmente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heteroarilo puede estar unido mediante un átomo de carbono o un heteroátomo. Los ejemplos de heteroarilo incluyen, sin carácter limitante, furilo, pirrolilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidilo o piridilo.
En una realización, «carbamoílo» es un grupo de fórmula -C(=O)-NH2.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión «opcionalmente sustituido» incluye sustituido o no sustituido. En las realizaciones en las que Rx o Rx2 es fenilo, naftilo o antracilo, se entenderá que tales grupos fenilo, naftilo o antracilo son grupos radicales bivalentes.
Las resinas sólidas a base de polietilenglicol pueden ser un polímero de polietilenglicol reticulado o una matriz polimérica pegilada.
Los ejemplos de resinas sólidas a base de PEG reticulado incluyen las resinas NovaPEG/Chemmatrix disponibles en el mercado que tienen la fórmula (IV):
en donde la resina sólida está disponible con los grupos amino libres o con aminas funcionalizadas que se pueden hacer reaccionar para que incorporen el resto catiónico que se ha discutido anteriormente;
y la resina de PEGA disponible en el mercado (CAS 372109-59-6) que tienen la fórmula (V):
Un ejemplo de resina polimérica sólida pegilada es la resina TentaGel (RTM) XV-NH2 que tiene la fórmula (VI) (Figura 1). Los cuerpos de las resinas sólidas son anfifílicos y por lo tanto están bien solvatados y son compatibles con el uso de disolventes polares (tales como agua, DMSO, alcoholes, etc.) y disolventes orgánicos apolares (tales como DCM, THF, acetonitrilo, etc.).
Por lo tanto, un soporte sólido tal como se define en el presente documento es un material sólido que comprende un cuerpo formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol (PEG) y donde el cuerpo comprende además al menos un resto catiónico. Los soportes sólidos de la invención son insolubles tanto en medios acuosos como orgánicos y son inertes a la química de las reacciones donde se utilizan los soportes.
El resto catiónico es cualquier grupo que contiene un ion cargado positivamente capaz de adsorber ADN. Los ejemplos habituales de cationes incluyen cationes de tipo -onio, tales como amonio cuaternario, cationes conjugados a superbases tales como guanidinio, amidinio. El experto apreciará que el resto catiónico también abarca cationes latentes tales como ciertos cationes conjugados superbases, por ejemplo, guanidinio (de un resto de guanidina). El catión de guanidio se puede formar durante el paso inicial de la formación del complejo de adsorción de ADN en presencia de agua, con lo que se proporciona de este modo al menos un resto catiónico capaz de adsorber ADN.
Adsorción y liberación de las moléculas conjugadas a ADN
Tal como se ha mencionado anteriormente, las resinas sólidas a base de PEG de la invención se solvatan eficientemente en agua. Esto permite que las moléculas conjugadas a ADN se puedan incubar con el soporte sólido suspendido en agua. La mezcla de las moléculas conjugadas a ADN y el soporte de resina sólida a base de PEG se agita conjuntamente en agua durante aproximadamente 15 minutos y la adsorción de las moléculas conjugadas a ADN sobre el soporte de resina sólida a base de PEG se confirma mediante un análisis de UPLC-TOF del sobrenadante o midiendo la absorbancia del sobrenadante después de decantar la suspensión.
Después de que las moléculas conjugadas a ADN se hayan inmovilizado sobre el soporte de resina sólida a base de PEG, se pueden secar y suspender en un disolvente orgánico no acuoso lavando en primer lugar la resina con un disolvente miscible en agua (p. ej., THF, DMSO, acetonitrilo, DMF, un alcohol, etc.) y a continuación lavando la resina con el disolvente orgánico que se va a utilizar en la reacción posterior (p. ej., DCM, dicloroetano, tolueno, etc.). Normalmente, se llevan a cabo al menos tres pasos de lavado separados con el disolvente miscible en agua, seguidos de al menos tres pasos de lavado separados con el disolvente orgánico.
A continuación, se puede llevar a cabo la reacción química deseada utilizando las moléculas conjugadas a ADN inmovilizadas en el disolvente orgánico deseado con el fin de transformar la molécula conjugada a ADN.
Finalmente, la molécula conjugada a ADN se libera de la resina mediante métodos conocidos, tales como dos o más tratamientos de la resina con una solución concentrada de sal (NaCl 1,5-3 M/Triton-X100 al 0,005 % en agua), con lo que el soporte sólido se puede separar del conjugado de ADN recién transformado, por ejemplo, mediante filtración.
Por lo tanto, el experto entenderá que, para que el soporte sólido de la presente invención sea adecuado para su uso en reacciones de moléculas conjugadas a ADN no acuosas, el soporte sólido debe ser insoluble en medios tanto acuosos como orgánicos.
Preparación de los Ejemplos
Los siguientes Ejemplos se han preparado, aislado y caracterizado utilizando los métodos divulgados en el presente documento.
Abreviaturas
Las abreviaturas, tal como se utilizan en el presente documento, se definen de la siguiente manera: «1x» para una vez, «2x» para dos veces, «3x» para tres veces, «°C» para grados centígrados, «ac» para acuoso, «Col» para columna, «eq» para equivalente o equivalentes, «g» para gramo o gramos, «mg» para miligramo o miligramos, «nm» para nanómetro o nanómetros, «L» para litro o litros, «mL» o «ml» para mililitro o mililitros, «ul», «uL», «pl» o «pL» para microlitro o microlitros, «nL» o «nl» para nanolitro o nanolitros, «N» para normal, «uM» o «pM» para micromolar, «nM» para nanomolar, «mol» para mol o moles, «mmol» para milimol o milimoles, «min» para minuto o minutos, «h» para hora u horas, «TA» para temperatura ambiente, «TN» para toda la noche, «atm» para atmósfera, «psi» para libras por pulgada al cuadrado, «conc.» para concentrado, «ac» para acuoso, «sat» para saturado, «PM» para peso molecular, «mo» o «ponda» para microondas, «pf» para punto de fusión, «p» para peso, «MS» o «Espec Mas» para espectrometría de masas, «ESI» para espectroscopia de masas con ionización por electronebulización, «HR» para alta resolución, «HRMS» para espectrometría de masas de alta resolución, «LCMS» para cromatografía liquida-espectrometría de masas, «HPLC» cromatografía líquida de alta resolución, «RP HPLC» para HPLC en fase inversa, «TLC» o «tlc» para cromatografía en capa fina, «RMN» para espectroscopía por resonancia magnética nuclear, «nOe» para espectroscopía con efecto Overhauser nuclear, «1H» para protón, «6 « para delta, «s» para singulete, «d» para doblete, «t» para triplete, «c» para cuadruplete, «m» para multiplete, «a» para ancho, «Hz» para hercio, «ee» para «exceso enantiomérico» y «a», «p», «R», «r», «S», «s», «E» y «Z» son denominaciones esteroquímicas con las que está familiarizado el experto en la técnica. Las siguientes abreviaturas utilizadas en el presente documento a continuación tienen los significados correspondientes: ACN
acetonitrilo
AcOH
ácido acético
Ac2O
anhídrido acético
Bn
bencilo
Boc
terc-butoxicarbonilo
Boc2O
dicarbonato de di-terc-butilo
Bu
butilo
Cs2CO3
carbonato de cesio anhidro
DCE
1,2-dicloroetano
DCM
diclorometano
DIC
N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIPEA
diisopropiletilamina
DMF
dimetilformamida
DMSO
sulfóxido de dimetilo
EDTA
ácido etilendiaminotetraacético
Equiv.
equivalencia
Et
etilo
EtOH
etanol
HATU
hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
HCl
ácido clorhídrico
HCOOH
ácido fórmico
HFIP
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol
HOAt
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
i-Pr
isopropilo
iPrOH
alcohol isopropílico
Ir[dF(CFa)ppy]2(dtbbpy) PF6
hexafluorofosfato de [4,4'-bis(1,1-dimetiletil)-2,2'-bipiridin-N1,N1']bis[3,5-difluoro-2-[5-(trifluorometil)-2-piridinil-N]fenil-C]Iridio (III)
KCN
cianuro de potasio
K2CO3
carbonato de potasio
Me
metilo
MeCN
acetonitrilo
MeOH
metanol
MS
tamices moleculares o espectrometría de masas
NEt3
trietilamina
NH3
amoníaco
NiCl2(dme)
complejo de cloruro de níquel (II) y etilenglicol dimetil eterado
NMP
N-metil-2-pirrolidona
Ph
fenilo
TA
temperatura ambiente (°C)
tR
tiempo de retención
t-Buo But
terc-butilo
TEA
trietilamina
TIS
triisopropilsilano
TFA
ácido trifluoroacético
THF
tetrahidrofurano
Síntesis de los soportes sólidos a base de PEG de acuerdo con la invención
La resina base es habitualmente una resina sólida a base de PEG disponible en el mercado que incluye grupos amino funcionalizables. A continuación, los grupos amino funcionalizables se derivatizan mediante procedimientos estándar de acoplamiento de amidas (p. ej., HATU/DIPEA) para introducir uno o más grupos catiónicos tal como se han definido anteriormente en el presente documento.
Protocolo general para la prueba de Kaiser para la detección de aminas que no han reaccionado y que quedan después del acoplamiento de amida:
Solución 1: 5 g de ninhidrina en 100 mL de etanol
Solución 2: 80 g de fenol en 20 mL de etanol
Solución 3: 2 mL de KCN acuoso 0,001 M en 98 mL de piridina
Se colocan unas microesferas en un tubo eppendorf y se añaden 25 (50) pL de cada solución. El tubo se coloca en un termomezclador y se deja desarrollar la reacción durante 5 min a 100 °C. Si la resina y la solución son de color azul (intensidad variable - de azul claro a azul oscuro), esto significa que la reacción no se ha completado (prueba positiva). Si la resina y la solución son de incoloras a de color amarillo claro, esto significa que la reacción se ha completado (prueba negativa).
Ejemplo 1
Síntesis del ácido catiónico bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio
Se disolvió ácido 11-bromoundecanoico (Fluka CAS 2834-05-1) (8 g, 30,2 mmol) en trimetilamina (al 35 % en EtOH) (60 mL, 224 mmol) y el recipiente de reacción se selló con un septum y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. En este estadio, se formó un precipitado blanco. El precipitado blanco se filtró y se lavó con EtOH frío. El sólido blanco recolectado se recristalizó en EtOH, se filtró y se secó a presión reducida para proporcionar bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio puro como un polvo blanco.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 53,30 - 3,24 (m, 2H), 3,04 (s, 9H), 2,19 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,71 - 1,60 (m, 2H), 1,48 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 1,27 (d, J = 11,5 Hz, 12H).
UPLC-MS: 0,51 min; 244,3 (M)+. (2_MIN_MONITORIZACIÓN_REACCIÓN_IPA): Waters UPLC Acquity; columna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm a 80 °C, eluyente A: H2O 0,05 % de HCOOH acetato de amonio 3,75 mM, B: iPrOH 0,05 % de<h>C<o>O<h>, gradiente: 5-98 % de B en 1,7 min, flujo: 0,6 mL/min. tR 0,51 min, PM observado 244,3 (M)+. Ejemplo 2
Se obtuvo una resina NovaPEG con amida Rink disponible en el mercado. La resina NovaPEG con amida Rink (250 mg) (0,250 g, 0,115 mmol) se hinchó en DMF durante 3 horas.
La resina se transformó mezclando el ácido catiónico:
(0,460 mmol), HOAt (0,063 g, 0,460 mmol) y DIC (0,072 mL, 0,460 mmol) en DMF (volumen: 5 mL)/DMSO (volumen: 3 mL). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 2 horas. El proceso se repitió una vez utilizando solo DMSO como disolvente. Una prueba de Kaiser para la detección de aminas libres dio negativo.
La resina derivatizada resultante:
se lavó con DMSO cuatro veces y con agua cuatro veces.
Ejemplo 3
En las realizaciones en las que la derivatización de la amina con el ácido catiónico deseado es más difícil, se puede utilizar el siguiente procedimiento:
En un cartucho de 50 mL, la resina disponible en el mercado se lavó con DMSO (volumen: 6 mL). A una solución del ácido catiónico (0,800 mmol) en DMSO (volumen: 6 mL), se añadió HATU (0,304 g, 0,800 mmol) y DIPEA (0,140 mL, 0,800 mmol). La solución resultante se añadió a la resina y se agitó a 40 °C durante la noche.
A continuación, la resina se filtró y se lavó con DMSO y se trató de nuevo con una solución nueva de reactivos a 40 °C durante 20 h. A continuación, la resina se filtró y se lavó con DMSO. A continuación, se trató con una solución adicional del ácido catiónico (0,800 mmol), Oxyma (0,114 g, 0,800 mmol), DIC (0,125 mL, 0,800 mmol) y DIPEA (0,140 mL, 0,800 mmol) en DMF (volumen: 8 mL) a 60 °C durante 2,5 h.
A continuación, la resina derivatizada resultante se lavó con DMF cuatro veces, y a continuación con agua cuatro veces. De nuevo, se llevó a cabo una prueba de Kaiser para determinar el acoplamiento en la resina.
Ejemplo 4
El experto apreciará que algunos de los restos catiónicos definidos anteriormente se pueden formar a partir de oligopéptidos, tales como oligo-lisinas u oligo-argininas. En tales casos, los oligopéptidos se pueden injertar en la matriz polimérica sólida utilizando un sintetizador de péptidos automatizado.
Se prepararon resinas derivatizadas que tienen la fórmula:
Resina-N H-Arg-Arg-Arg-Arg-N HAc para cada una de las resinas NovaPEG Amino, Amino PEGA y Tentagel XV NH2 utilizando el siguiente procedimiento:
Se utilizó DMF como disolvente principal para los aminoácidos (AA), el Activador (Act) y la Base.
Acoplamiento:
En un sintetizador LibertyBlue, se introdujo el aminoácido (0,2 M), el Activador (DIC - 0,5 M), la Base (Oxym (1 M) DIPEA (0,1 M)) con una relación de resina/AA/Act/Base: 1/5/5/5 (volumen total de 4 mL). El sintetizador se operó de acuerdo con las instrucciones del fabricante a una temperatura de 90 °C.
Desprotección:
Los compuestos se desprotegieron utilizando piperidina al 10 % en NMP/EtOH (9/1).
Protección:
Se utilizó una solución de protección de Ac2O (5 mmol) y DIPEA (5 mmol) en DMF (5 mL). La resina se trató con la solución de protección y se agitó durante 1 h a 25 °C. A continuación, la resina se filtró y se lavó con DCM.
Desprotección de Arg (Pbf):
La resina se trató con una solución de 5 mL de TFA/TIS/agua (90:5:5) y se agitó a 25 °C durante 1 h. A continuación, la resina se filtró y se lavó con DCM, THF y agua.
Ejemplo 5
Síntesis de las diferentes resinas catiónicas con diferentes conectores
La síntesis se puede llevar a cabo a partir de la resina NovaPEG amino disponible en el mercado (número de producto Merck 8 ,55126) con una carga de 0,57 mmol/g (F. Garcia-Martinet al.(2006)J. Comb. Chem.,8, 213.).
Ejemplo 5.1
La resina NovaPEG amino (250 mg, 0,143 mmol) se suspendió en una jeringa de 25 mL (dotada de un relleno) utilizando DCM (volumen: 10,00 mL). La jeringa se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, se filtró y se lavó 3 veces con DMSO. Se mezcló previamente bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio (185 mg, 0,570 mmol), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (0,099 mL, 0,570 mmol) y HATU (223 mg, 0,570 mmol) en DMSO (volumen: 5 mL), se agitó durante 2 min a ta y se añadió a la resina. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Tratamiento: La resina se lavó 4x con DMSO.
La prueba de Kaiser realizada dio negativo. A continuación, la resina se lavó 2x con H2O/glicerol (1/1) y se hinchó durante la noche en 10 mL de esta solución. A continuación, la suspensión se filtró, se lavó 2 veces con la misma solución y se filtró a sequedad. La resina se transfirió desde la jeringa hasta un tubo Falcon de 15 mL con 2 x 2,5 mL de H2O/glicerol (1/1).
Síntesis de las diferentes resinas catiónicas con diferentes conectores -Z-Xi-Ejemplo 5.2
PEG-Bn-N“(Me)3
La resina NovaPEG amino (250 mg, 0,115 mmol) se hinchó en 10 mL de DCM durante 1h, a continuación se lavó 2 veces con 5 mL de DMSO. En un matraz por separado, el ácido se activó mezclando ácido Fmoc-(4-aminometil)benzoico (175 mg, 0,460 mmol), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (59,5 mg, 0,460 mmol) y HATU (180 mg, 0,460 mmol) en<d>M<s>O (volumen: 5 mL). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 horas a temperatura ambiente con agitación. La reacción de acoplamiento se repitió. La prueba de Kaiser para la detección de aminas que no habían reaccionado dio negativo. Para eliminar cualquier amina primaria remanente, la resina se protegió mediante un tratamiento con una solución de anhídrido acético/N,N-diisopropiletilamina/DMF 1/2/7 (vol/vol/vol) durante 15 min. La resina se lavó 4x con DMSO.
Desprotección del grupo Fmoc: Se añadieron 10 mL de piperidina al 20 % (v/v) en DMF a la resina. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, la resina se filtró. Se añadió una segunda porción de piperidina al 20 % en DMF y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La resina se filtró y se lavó con varias porciones de DMSo . Se mezcló previamente el compuesto bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio (146 mg, 0,450 mmol), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (0,078 mL, 0,450 mmol) y HATU (176 mg, 0,450 mmol) en DMSO (volumen: 5 mL), se agitó durante 2 min a ta y se añadió a la resina desprotegida. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La resina se lavó 4 veces con DMSO. La prueba de Kaiser dio negativo. A continuación, la resina se lavó 2 veces con H2O/glicerol (1/1) y se hinchó durante la noche en 10 mL de esta solución. A continuación, la suspensión se agitó a 60 °C durante 1 h y se filtró a sequedad. La resina se transfirió desde la jeringa hasta un tubo Falcon de 15 mL con 2 x 2,5 mL de H2O/glicerol (1/1).
Ejemplo 5.3
PEG-Ciclohexano-N+ Me
Acido Boc-1-aminometilciclohexanoacético
4 eq, DIPF.A 4 Sq. HATU, DMSO
La resina NovaPEG amino (250 mg, 0,115 mmol) se hinchó en 10 mL de DCM durante 1h y a continuación se lavó 2 veces con 5 mL de DMSO. El ácido Boc-1-aminometilciclohexano acético (125 mg, 0,460 mmol) se activó mediante un tratamiento con DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (0,082 mL, 0,460 mmol) y HATU (180 mg, 0,460 mmol) en DMSO (volumen: 5 mL). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 h a temperatura ambiente con agitación. La reacción de acoplamiento se repitió. Para eliminar cualquier amina primaria remanente, la resina se protegió mediante un tratamiento con una solución de anhídrido acético/N,N-diisopropiletilamina/DMF 1/2/7 (vol/vol/vol) durante 15 min. La resina se lavó 4x con DMSO. La prueba de Kaiser dio negativo (resina de color amarillo claro y solución de color amarillo claro).
Desprotección del grupo Boc: La resina se suspendió en 10 mL de TFA al 50 %/diclorometano (DCM) (v/v) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 minutos y se filtró. Se añadió una segunda porción de TFA al 50 %/DCM y se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La resina se lavó tres veces con 10 mL de DCM (1 mL/g de resina). La resina se lavó tres veces con 10 mL de diisopropiletilamina (DIPEA N,N-diisopropiletilamina) al 5 %/DCM (v/v) para eliminar el TFA. La resina se lavó cuatro veces con DMSO. Se mezcló previamente el compuesto bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio (146 mg, 0,450 mmol), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (0,078 mL, 0,450 mmol) y HATU (176 mg, 0,450 mmol) en DMSO (volumen: 5 mL), se agitó durante 2 min a ta y se añadió a la resina desprotegida. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La resina se lavó 4 veces con DMSO. La prueba de Kaiser dio negativo. A continuación, la resina se lavó 2 veces con H2O/glicerol (1/1) y se hinchó durante la noche en 10 mL de esta solución. A continuación, la suspensión se agitó a 60 °C durante 1 h y se filtró a sequedad. La resina se transfirió desde la jeringa hasta un tubo Falcon de 15 mL con 2 x 2,5 mL de H2O/glicerol (1/1).
Ejemplo 5.4
La resina NovaPEG amino (250 mg, 0,115 mmol) se hinchó en 10 mL de DCM durante 1h, a continuación se lavó 2 veces con 5 mL de DMSO. El ácido se activó mezclando N-Fmoc-3-(2-naftil)-L-alanina (212 mg, 0,460 mmol), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (0,082 mL, 0,460 mmol) y HATU (180 mg, 0,460 mmol) en Dm SO (volumen: 5 mL). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 horas a temperatura ambiente con agitación. La resina se lavó 4 veces con DMSO. La reacción de acoplamiento se repitió. Para eliminar cualquier amina primaria remanente, la resina se protegió mediante un tratamiento con una solución de anhídrido acético/N,N-diisopropiletilamina/DMF 1/2/7 (vol/vol/vol) durante 15 min. La resina se lavó 4 veces con DMSO. La prueba de Kaiser dio negativo (resina de color amarillo claro y solución de color amarillo claro). Desprotección del grupo Fmoc: Se añadieron 10 mL de piperidina al 20 % (v/v) en DMF a la resina. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se filtró la resina. Se añadió una segunda porción de piperidina al 20 % en DMF y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezcló previamente el compuesto bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio (146 mg, 0,450 mmol), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (0,078 mL, 0,450 mmol) y HATU (176 mg, 0,450 mmol) en DMSO (volumen: 5 mL), se agitó durante 2 min a ta y se añadió a la resina desprotegida. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h.
La resina se lavó 4x con DMSO. La prueba de Kaiser dio negativo. A continuación, la resina se lavó 2 veces con hhO/glicerol (1/1) y se hinchó durante la noche en 10 mL de esta solución. A continuación, la suspensión se agitó a 60 °C durante 1 h y se filtró a sequedad. A continuación, la resina se transfirió desde la jeringa hasta un tubo Falcon de 15 mL con 2 x 2,5 mL de h<h>O/glicerol (1/1).
Ejemplo 6
Síntesis de diferentes resinas catiónicas con diferentes grupos catiónicos a partir de la resina NovaPEG con amida Rink disponible en el mercado (número de producto Merck 8.55047) con una carga de 0,46 mmol/g.
Ejemplo 6.1
La resina NovaPEG con amida Rink (250 mg) (4 g, 1,840 mmol) se hinchó en DCM durante 3 horas. El ácido se activó mezclando bromuro de 10-carboxi-N,N,N-trimetildecan-1-aminio (2,387 g, 7,36 mmol), HATU (2,80 g, 7,36 mmol) y DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) (1,285 mL, 7,36 mmol) en DMSO (volumen: 40 mL). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 horas. Una prueba de Kaiser para la detección de aminas que no habían reaccionado dio negativo. La resina se lavó 4 veces con DMSO y 4 veces con agua, a continuación se suspendió en agua/glicerol 1/1.
Ejemplo 6.2
La resina NovaPEG Rink (500 mg) (0,5 g, 0,230 mmol) se hinchó en DCM durante 30 min. El ácido 11-bromodecanoico (Aldrich CAS 2834-05-1) (0,976 g, 3,68 mmol) se activó mediante un tratamiento con trietilamina (0,513 mL, 3,68 mmol) y diisopropilcarbodiimida (0,287 mL, 1,840 mmol). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 horas a temperatura ambiente. Una prueba de Kaiser para la detección de aminas que no habían reaccionado dio negativo. La resina se lavó con etanol 3 veces y se suspendió en 25 mL de NEt3/EtOH 1/1 vol/vol. Esta suspensión se calentó a reflujo durante 12 horas. Se lavó la resina y se llevó a cabo una protección para eliminar cualquier amina primaria residual (10 min, DMF/DIPEA (N,N-diisopropiletilamina )/Ac2O 7/2/1). El éxito de la cuaternización se determinó mediante una escisión en algunas microesferas de resina en TFA/agua 95/5 y la observación por UPLC-MS de la carboxamida de amonio cuaternario esperada bromuro de 11-amino-N,N,N-trietil-11-oxoundecan-1-aminio y la ausencia de la bromocarboxamida correspondiente 11-bromoundecanamida.
UPLC-MS: 0,61 min (detección de ELSD, sin cromóforo en la molécula); 285,4 (M+). (2_MIN_MONITORIZACIÓN_ REACCIÓN_IPA) : Waters UPLC Acquity; columna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm a 80 °C, eluyente A: H2O 0,05 % de HCOOH acetato de amonio 3,75 mM, B: iPrOH 0,05 % de HCOOH, gradiente: 5-98 % de B en 1,7 min, flujo: 0,6 mL/min. Se interpreta como compatible con la estructura del bromuro de 11-amino-N,N,N-trietil-11oxoundecan-1-aminio. La resina se lavó con DMSO 4 veces, MeOH, DMF y agua 4 veces. No fue necesaria ninguna purificación adicional y esta resina se utilizó tal cual después de ajustar el volumen de la suspensión en agua/glicerol 1/1 a 10 mL.
Ejemplo 6.3
PEG-N+(B<u>)3
La resina NovaPEG Rink (500 mg) (0,5 g, 0,230 mmol) se hinchó en DCM durante 30 min. El ácido 11-bromodecanoico (Aldrich CAS 2834-05-1) (0,976 g, 3,68 mmol) se activó mediante un tratamiento con tributilamina (0,043 g, 0,230 mmol) y DIC (0,287 mL, 1,840 mmol). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 h a temperatura ambiente. Una prueba de Kaiser para la detección de aminas que no habían reaccionado dio negativo. La resina se lavó con etanol 3 veces y se suspendió en 25 mL de tributilamina pura. Esta suspensión se agitó a 150 °C durante 12 h. La resina se lavó y se llevó a cabo una protección (10 min, DMF/DIPEA (N,N-diisopropiletilamina )/Ac2O 7/2/1). El éxito de la cuaternización se determinó mediante una escisión en algunas microesferas de resina y la observación por UPLC-MS de la carboxamida de amonio cuaternario esperada bromuro de 11-amino-N,N,N-tributil-11-oxoundecan-1-aminio y la ausencia de la bromocarboxamida correspondiente 11-bromoundecanamida.
UPLC-MS: 0,81 min (detección de ELSD, sin cromóforo en la molécula); 369,4 (M+). (2_MIN_MONITORIZACIÓN_ REACCIÓN_IPA) : Waters UPLC Acquity; columna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm a 80 °C, eluyente A: H2O 0,05 % de HCOOH acetato de amonio 3,75 mM, B: iPrOH 0,05 % de HCOOH, gradiente: 5-98 % de B en 1,7 min, flujo: 0,6 mL/min. Se interpreta como compatible con la estructura del bromuro de 11-amino-N,N,N-tributil-11-oxoundecan-1-aminio. La resina se lavó con DMSO 4 veces, MeOH, DMF y agua 4 veces. No fue necesaria ninguna purificación adicional y esta resina se utilizó tal cual a continuación después de ajustar el volumen de la suspensión en agua/glicerol 1/1 (vol/vol) a 10 mL.
Ejemplo 6.4
La resina NovaPEG Rink (500 mg) (0,5 g, 0,230 mmol) se hinchó en DCM durante 30 min. El ácido se activó mezclando el ácido 11-bromodecanoico (Aldrich CAS 2834-05-1) (0,976 g, 3,68 mmol) N,N-dimetil-1-fenilmetanamina (0,554 mL, 3,68 mmol) y DIC (0,287 mL, 1,840 mmol) en DCM (volumen: 8 mL). La solución resultante se añadió a la resina y se dejó reaccionar durante 12 horas a temperatura ambiente. El proceso se repitió una vez. Una prueba de Kaiser para la detección de aminas que no habían reaccionado dio negativo. La resina se lavó con etanol 3 veces y se suspendió en 25 mL de etanol/N,N-dimetil-1-fenilmetanamina 1/1 (vol/vol). Esta suspensión se calentó a reflujo durante 12 horas. La resina se lavó con etanol 3 veces y se llevó a cabo una protección (10 min, DMF/DIPEA (N,N-diisopropiletilamina )/Ac2O 7/2/1). El éxito de la cuaternización se determinó mediante una escisión en algunas microesferas de resina y la observación por UPLC-MS de la carboxamida de amonio cuaternario esperada bromuro de 11-amino-N-benil-N,N-dimetil-11-oxoundecan-1-aminio y la ausencia de la bromocarboxamida correspondiente 11-bromoundecanamida.
UPLC-MS: 0,67 min (detección de ELSD); 319,4 (M+) (2_MIN_MONITORIZACIÓN_ REACCIÓN_IPA) : Waters UPLC Acquity; columna: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm a 80 °C, eluyente A: H2O 0,05 % de HCOOH acetato de amonio 3,75 mM, B: iPrOH 0,05 % de HCOOH, gradiente: 5-98 % de B en 1,7 min, flujo: 0,6 mL/min. Se interpreta como compatible con la estructura del bromuro de 11-amino-N-bencil-N,N-dimetil-11-oxoundecan-1-aminio. La resina se lavó con DMSO 4 veces, MeOH, DMF y agua 4 veces.
A continuación, estas resinas diferentes se utilizaron para demostrar la ventaja de utilizar los soportes sólidos novedosos de la presente invención en comparación con soportes sólidos existentes descritos en la bibliografía para llevar a cabo reacciones de conjugación en oligonucleótidos en ausencia de agua (véase más adelante).
Reacciones utilizando las resinas de la invención como soporte sólido
Las resinas de la invención en cuestión se utilizaron para llevar a cabo reacciones sobre compuestos conjugados a ADN en condiciones no acuosas de la siguiente manera:
Ejemplo 7
La resina de soporte catiónico preparada en el Ejemplo 1 se hinchó inicialmente en agua. A continuación, la resina (250 pL) se incubó con una solución del conjugado de benzaldehído-ADN (87pL) en una jeringa de 2 mL dotada de un filtro durante 15 min. La resina se lavó con agua, THF y DCM (4 veces). Se añadieron 0,2 mL de DCM a la resina seguidos de unos pocos tamices moleculares de 4 A y (2-aminoetil)((tributilestannil)metil)carbamato de terc-butilo (8,42 pL). La suspensión se agitó durante 30 min a 40 °C, a continuación se lavó y se repitió este tratamiento. La resina se lavó con DCM, se añadió DCM (0,16 mL) y se trató con una suspensión de trifluorometanosulfonato de cobre (II) (0,181 mg) y 2,6-lutidina (0,058 pL) en HFIP (volumen: 0,04 mL) (que se había mezclado previamente a TA durante 1 h). La suspensión se agitó a 40 °C durante 2 h.
Tratamiento
La resina se lavó 3 veces con THF. A continuación, el ADN se liberó de la resina mediante un tratamiento con 500 pL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5 M, tampón de fosfato 50 mM pH 8, Triton-X al 0,005 %). La solución se recuperó y se diluyó con 500 pL de EDTA. Se desalaron 70 uL de esta solución diluida mediante una purificación en P6 tal como se indica a continuación: 1
1. Se invierte una columna P-6 preempaquetada (columnas de gel P-6 Micro Bio-Spin™, tampón de SSC n.° 732 6205, BioRad) bruscamente varias veces para resuspender el gel sedimentado y eliminar todas las burbujas 2. Se desprende la punta y se coloca la columna en un tubo de 2,0 mL y se retira el tapón
3. Se drena el tampón de envasado por gravedad y se descarta el tampón
4. Se drena por rotación durante 2 min, 1000 G = 3,9 rpm
5. Se añaden 500 pL de agua Milli-Q y se drena por rotación durante 1 min, 1000 G = 3,9 rpm
6. Se repite el paso 5 (3 veces)
7. Se aplica la muestra (50-75 pL)
8. Se recolecta la muestra purificada en un tubo eppendorf nuevo por rotación durante 4 min a 1000 G = 3,9 rpm. El producto tuvo un rendimiento de un 70 %.
Ejemplo comparativo 8
La misma reacción descrita en el Ejemplo 7 se llevó a cabo utilizando un soporte de DEAE-Sepharose. Las condiciones de reacción fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 7 , excepto que el conjugado de benzaldehído-ADN se soportó en un soporte de DEAE-Sepharose antes de la adición de (2-aminoetilo)((tributilestannil)metil)carbamato de tercbutilo.
El producto utilizando el soporte de DEAE-Sepharose dio como resultado un rendimiento de producto inferior a un 10 %. Ejemplo 9
Adición de un carbanión catalizada por rutenio
Debido a su posible alcance y disponibilidad de componentes básicos, esta reacción era de particular interés y se eligió como ejemplo adicional para evaluar el concepto de utilizar resinas catiónicas en condiciones no acuosas. Esta metodología novedosa opera en condiciones suaves en disolventes orgánicos puros, pero ni siquiera se describió que fuera compatible con la presencia de aire o agua. Utilizando un conjugado de cetona-ADN inmovilizado en una resina catiónica a base de PEG, pudimos evaluar esta metodología y obtuvimos rápidamente una conversión casi cuantitativa después de solo unas pocas rondas de optimización de la siguiente manera:
1. 1 es hidrazina hidratada
2. 2 es un dímero de dicloro(p-cimeno)rutenio (II)
3. 3 es 1,3-bis(difenilfosfino)propano (DPPP)
4. 4 es fosfato de potasio o carbonato de calcio
5. 5 es la resina utilizada en el Ejemplo 7
Preparación de la Solución A:
Se disolvió benzaldehído (Aldrich CAS 100-52-7) (488 pL) en THF (volumen: 2 mL) y a continuación se añadió hidrazina (233 pL). Esta solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió una pequeña cantidad de Na2SÜ4 (580 mg) a esta solución antes de utilizarla para disolver el dímero de dicloro(p-cimeno)rutenio (II) (Aldrich CAS 52462 29-0) (18 mg) y 1,3-bis(difenilfosfino)propano (Aldrich CAS 6737-42-4) (25 mg).
Preparación del conjugado de cetona-ADN soportado:
En una jeringa, se incubaron 200 pL de una suspensión de la resina catiónica preparada en el Ejemplo 2 (resina hinchada en agua) (200 pL) con 97 pL de una solución del conjugado de cetona-ADN (como solución en agua) (0,064 mg) durante 15 min. La resina se lavó con agua y THF (4 veces).
Adición de carbanión catalizada por rutenio:
A continuación, se añadieron 500 |<j>L de Solución A a este conjugado de cetona-ADN soportado, seguidos de la adición de K3PO4 sólido (79 mg) y se agitó a 45 °C durante 1 hora.
A continuación, se drenó el disolvente y la resina se lavó tres veces con THF antes de liberar el sustrato-ADN utilizando el procedimiento de tratamiento descrito anteriormente en el Ejemplo 7.
El sustrato del ADN se recuperó con un rendimiento de un 75 %.
Ejemplo comparativo 10
La misma reacción descrita en el Ejemplo 9 se llevó a cabo utilizando un soporte de DEAE-Sepharose. Las condiciones de reacción fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 9, excepto que el conjugado de cetona-ADN se soportó en un soporte de DEAE-Sepharose antes de la adición de Solución A.
La reacción del Ejemplo comparativo 10 no proporcionó ningún producto de adición de carbanión.
Ejemplo 11
Aminación reductiva
Se llevó a cabo una aminación reductiva de una cetona utilizando diclorometano como disolvente de la siguiente manera:
Preparación de la Solución A:
Se disolvió ácido acético en dicloroetano (285 mM) y a esto se le añadió una solución de la amina en dicloroetano (285 mM).
Preparación del conjugado de cetona-ADN soportado:
En una jeringa, se incubaron 200 j L de una suspensión de la resina catiónica preparada en el Ejemplo 2 (resina hinchada en agua) (200<j>L) con 97<j>L de una solución del conjugado de cetona-ADN (como solución en agua) (0,064 mg) durante 15 min. La resina se lavó con THF (4 veces) y dicloroetano (2 veces).
Reacción de aminación reductiva:
A continuación, se añadieron 500 j L de Solución A al conjugado de cetona-ADN soportado y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (42,4 mg) como sólido y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
A continuación, se drenó el disolvente y la resina se lavó tres veces con DCE y tres veces con THF. El producto se liberó del soporte mediante un tratamiento con 500<j>L de solución de elución de ADN que contenía un 5 % de 4-metilpi peridi na y a continuación se desaló mediante el método de purificación en P6 descrito en el Ejemplo 7.
En el Ejemplo 11.1, la amina fue anilina (es decir, R' = C6H5-CH2-) y el producto se recuperó con un rendimiento de un 87 %.
En el Ejemplo 11.2, la amina fue bencilamina (es decir, R' = C6H5-) y el producto se recuperó con un rendimiento de un 44 %.
Ejemplo 12
Acilación
Se llevó a cabo una reacción de acilación convencional sobre un soporte catiónico de la siguiente manera:
El resto de ADN se soportó en el soporte catiónico preparado en el Ejemplo 2 colocando 250 pL de la resina (hinchada en agua) en un cartucho de 1 mL dotado de un filtro e incubando la resina con una solución del resto de ADN (0,01 pmol) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La resina se lavó con agua y a continuación con DMF (4 veces).
A continuación, la resina se trató a temperatura ambiente con una solución de ácido 4-formilbenzoico (0,450 mg, 3,00 pmol), DIPEA (0,524 pL, 3,00 pmol), DIC (0,467 pL, 3,00 pmol) y HOAt (0,408 mg, 3,00 pmol) en DMF (volumen: 0,2 mL) durante 15 min, este tratamiento se repitió una vez.
A continuación, el producto se liberó del soporte y se purificó utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 7.
Ejemplo 13
Síntesis del oligonucleótido conjugado ADN-4-YODO
Estructura molecular del material de partida Oligo-Amina
La secuencia de este oligonucleótido modelo (5'-TACAGCTATGACTTGCTTAG-3') se aleatorizó.
El protocolo de acilación en ADN inmovilizado se adaptó a partir de Harburyet al.(Halpin, D. R.; Lee, J. A.; Wrenn, S. J.; Harbury, P. B., «DNA Display III. Solid-Phase Organic Synthesis on Unprotected d Na ».PLoS Biology2004, 2 (7), e175.). Protocolo de acilación para la síntesis de ADN-4-YODO
Estructura molecular del material de partida ADN-4-YODO
Se lavaron 5000 pL de una suspensión de DEAE-Sepharose (DEAE Sephadex™ A-25, GE Healthcare 17-0170-02) con 10 mL de solución de unión a ADN (ácido acético 10 mM en agua Triton-X100 al 0,005 %).
A continuación, se añadieron 5000 uL de una solución de Oligo-Amina como solución (0,5 nmol/pL) (3,14 mg, 0,5 pmol) a la resina junto con 5 mL de solución de unión a ADN. Esta suspensión se agitó durante 2 min, a continuación se filtró y se lavó con agua (10 mL) y MeOH (10 mL). A continuación, la resina se lavó durante 2 min con 10 mL de 4-metilpiperidina al 5 % en MeOH para neutralizar y eliminar cualquier ácido acético remanente.
Se preparó una solución de ácido activado mezclando HOAt (CAS 39968-33-7) (100 mM en MeOH) (3000 pL, 300 pmol), ácido 4-yodobenzoico (100 mM en DMSO) (3000 pL, 300 pmol) y DIC (46,7 pL, 300 pmol). Esta solución se agitó 30 segundos antes de añadirla a la resina de DEAE-Sepharose. La resina se agitó 15 min con el ácido activado y este proceso se repitió una vez. A continuación, algunas microesferas se incubaron en 65 pL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5 M, tampón de fosfato 50 mM pH 8 en agua Triton-X100 al 0,005 %) y el A<d>N liberado se purificó mediante cromatografía en P6 (columnas de gel P-6 Micro Bio-Spin™) antes del análisis por HPLC-TOF. Tratamiento y purificación: En este estadio, la reacción se había completado y el ADN se liberó mediante un tratamiento con 2 mL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5 M, tampón de fosfato 50 mM pH 8, Triton-X al 0,005 %) durante 30 min, seguido de 3 tratamientos con 2000 pL de la misma solución durante 15 min. La mezcla se concentró utilizando un dispositivo de Ultrafiltración 3K MWc O (PALL, dispositivo de centrifugación Nanosep 3K-30K Omega, 5 mL, 5000 G, 40 °C, 30 min). La muestra concentrada se diluyó hasta 4 mL con agua y se concentró de nuevo (5000 G, 40 °C, 30 min) (dos veces). La solución final se purificó mediante HPLC de fase inversa (columna Xbridge® Prep C185 pm OBD™ 19 x 50 mm, disolvente A: HFIP 100 mM TEA 86 mM, disolvente B: MeOH/ACN 1/1). Las fracciones se combinaron y se concentraron utilizando un dispositivo de centrifugación 3K MWCO (5000 G, 40 °C, 30 min) y se ajustaron a 4 mL para obtener una solución que contenía 445 nmoles de producto puro ADN-4-YODO (89 %), lo que se determinó mediante la absorbancia UV a 260 nm.
UPLC/MS: Agilent serie 6200 TOF/serie 6500 Q-TOF, columna ACQUITY BEH OST C18 2,1 x 50 mm 1,7 um a 60 °C; flujo 0,6 mL/min, gradiente: 15-30 % de B en 2,7 min; 30-85 % de B en 0,95 min; 85-100 % de B en 0,05 min; 100 % durante 0,8 min siendo A = agua TEA 10 mM HFIP 200 mM y B= MeOH, tR = 1,90 min, m/z = 6515,97 uma (M tras deconvolución con Agilent MassHunter para análisis cualitativo 6,00) (calc. 6516,05), que se interpreta como compatible con la estructura del compuesto final ADN-4-YODO.
La distribución de isótopos predicha (ChemBioDraw Ultra 14,00) del producto (en rojo) se superpuso con la distribución de isótopos experimental (en azul) utilizando el complemento Calculadora de distribución de isótopos del paquete de software Agilent MassHunter 6,00.
Ejemplo 14
Efecto del agua añadida y el reemplazo de PEG-N<+>(Me)<3>por DEAE-Sepharose
Este experimento tenía como objetivo comparar PEG-N+(Me)3 con la resina de intercambio iónico disponible en el mercado DEAE-Sepharose (número CAS 57407-08-6) y demostrar que el agua añadida es perjudicial para las transformaciones orgánicas que son sensibles a la presencia de agua.
Condiciones estándar para acoplamientos cruzados descarboxilativos fotoquímicos en conjugados de ADN soportados en el soporte sólido PEG-N<+>(Me)<3>
El soporte sólido catiónico PEG-N+(Me)3 (o DEAE-Sepharose) ajustado a 20 mL con glicerol:agua 1:1 (200 pL, 0,00100 pmol) se lavó con 3x1 mL de H2O en una jeringa de 1 mL dotada de un filtro y a continuación se incubó durante 15 min con ADN-4-YODO (22,80 pL como solución en agua, 0,001 pmol) y 200 pL de H2O. La resina se lavó con DMSO 4 veces y se transfirió a un vial de vidrio de 2 mL que contenía un agitador magnético, utilizando DMSO (volumen: 500 pL). Se añadieron 500 pL de la siguiente Solución A a esta suspensión con una presión positiva de argón. El vial se colocó en un fotorreactor de luz azul (470 nm) y se irradió durante 60 min a temperatura ambiente.
(Solución A: se disolvió ácido 1-Boc-piperidin-4-carboxílico (22,93 mg, 0,100 mmol) en una solución de Cs2CO3 (16,29 mg, 0,05 mmol) en agua (250 pl). La solución se agitó durante 30 segundos y se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio. Después de la evaporación, la sal de cesio sólida del ácido 1-Boc-piperidin-4-carboxílico (22,93 mg, 0,100 mmol) se disolvió en DMSO (volumen: 2000 pL) y se añadió a una solución de NiCb(dme) (2,197 mg, 10 pmol), 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridina (2,68 mg, 10 pmol) y Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbbpy) PF6 (2,244 mg, 2 pmol) en DMSO (volumen: 3000 pL) en un vial para microondas de 20 mL. La Solución A se desgasificó burbujeando argón). Tratamiento: La resina se transfirió a una jeringa de 1 mL dotada de un filtro, se filtró el disolvente y la resina se lavó 5 veces con DMSO. La resina se incubó con 400 pL de H2O durante la noche y se filtró en un dispositivo de ultrafiltración 3K de 5 mL. A continuación, se añadieron 200 pL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5
M, tampón de fosfato de 50 mM pH 8, Triton-X al 0,005 %, 4-Me-piperidina al 5 %) a la resina, se incubaron durante 30 min a 50 °C y se filtraron en el mismo dispositivo de Ultrafiltración. A continuación, las muestras se diluyeron hasta 5mL con agua, se purificaron mediante ultrafiltración, se recuperaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se disolvió en 150 pL de H2O y se analizó mediante TOF LC-MS.
Columna: ACQUITY BEH OST C182,1 x 50 mm 1,7 um a 60 °C: eluyente A: agua TEA 10 mM HFIP 200 mM Vial:2:35 Gradiente: 8-40 % de B en 2,7 min; 40-85 % de B en 0,95 min; 85-100 % de B en 0,05 min; 100 % durante 0,8 min, eluyente B: 100 % de metanol, flujo: 0,6 mL/min. tR = 2,158, 6588,26 uma (M tras deconvolución con Agilent MassHunter para análisis cualitativo 6,00) (calc. 6588,548), que se interpreta como compatible con la estructura del compuesto final ADN-Boc-Pip.
Ejemplo 15
El oligonucleótido conjugado ADN-Br se preparó de acuerdo con el método utilizado para ADN-4-YODO.
Los diferentes soportes sólidos se evaluaron en las condiciones de reacción anteriores para la conversión de ADN-Br en ADN-Boc-Pip y condujeron a las conversiones que se resumen en la Tabla 1 a continuación:
Tabla 1.
Ejemplo 16
Comparación de diferentes resinas de PEG catiónicas
Este experimento tiene como objetivo demostrar que se pueden utilizar resinas con diferentes conectores y grupos catiónicos para realizar una transformación química de oligonucleótidos.
Equipo: jeringas de 1 mL dotadas de inserto de filtro, vial de vidrio de 5 mL, agitador magnético, fotorreactor (2 W, 470 nm).
Condiciones estándar para acoplamientos cruzados descarboxilativos fotoquímicos en conjugados de ADN soportados en el soporte sólido PEG-N<+>(Me)<3>
Se lavó PEG-N+(Me)3 (PEG-N+(Me)3 ajustado a 20 mL con glicerol:agua 1:1) (200 |jL, 0,00100 |jmol) con 3x1 mL de H2O en una jeringa de 1 mL dotada de un filtro y a continuación se incubó durante 15 min con ADN-4-YODO (6,52 jg , 0,001 jmol) como solución en agua y 200 jL de H2O. La resina se lavó con DMSO 4 veces y se transfirió a un vial de vidrio de 2 mL que contenía un agitador magnético, utilizando DMSO (volumen: 500 jL). Se añadieron 500 jL de la siguiente Solución A a esta suspensión al aire. El vial se colocó en un fotorreactor (470 nm) y se irradió durante 60 min.
Solución A: se disolvió ácido tetrahidrofuran-2-carboxílico (9,57 j L, 0,100 mmol) en MeOH (150 jL ) y se añadió a una solución de Cs2CO3 (16,29 mg, 0,05 mmol) en agua (150 jL). La solución se agitó durante 30 segundos y se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio. Esta sal de Cs del ácido tetrahidrofuran-2-carboxílico (9,57<j>L, 0,100 mmol) se disolvió en DMSO (volumen: 2000 jL ) y se añadió a una solución de NiCh(dme) (2,197 mg, 10 jmol), 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridina (2,68 mg, 10 jmol) y Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbbpy) PF6 (2,244 mg, 2 jmol) en DMSO (volumen: 3000 jL ) en un vial para microondas de 20 mL. La solución se desgasificó burbujeando argón. Tratamiento: La resina se transfirió a una jeringa de 1 mL dotada de un filtro, se filtró el disolvente y la resina se lavó 5 veces con DMSO. La resina se incubó 15 min a 50 °C con 100 jL de H2O y se filtró. A continuación, se añadieron 100 jL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5 M, tampón de fosfato de 50 mM pH 8, Triton-X al 0,005 %, 4-Me-piperidina al 5 %) a la resina, se incubaron durante 30 min a 50 °C y se filtraron en el mismo tubo. Las muestras se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se analizaron mediante TOF LC-MS.
TOF LC-MS: Columna: ACQUITY BEH OST C182,1 x 50 mm 1,7 um a 60 °C: eluyente A: agua TEA 10 mM HFIP 200 mM, gradiente: 8-40 % de B en 2,7 min; 40-85 % de B en 0,95 min; 85-100 % de B en 0,05 min; 100 % durante 0,8 min, eluyente B: 100 % de metanol, flujo: 0,6 mL/min. tR: 1,938, 6460,14 uma (M tras deconvolución con Agilent MassHunter para análisis cualitativo 6,00) (calc. 6460,373), que se interpreta como compatible con la estructura del compuesto final ADN-4-THF.
Los diferentes soportes sólidos evaluados dieron lugar a conversiones, en las condiciones estándar descritas anteriormente, y se resumen en la Tabla 2 a continuación:
Tabla 2
Ejemplo 17
Comparación de diferentes resinas de PEG catiónicas en un sustrato diferente
Este experimento tiene como objetivo demostrar que se pueden utilizar resinas con diferentes conectores y grupos catiónicos para realizar una transformación química de oligonucleótidos.
Diferentes soportes solidos de PEG catiomcos
Oligo-Amina
LED azul,<DMSO, CsCO:,.>
catalizadores de Ni Ir, ligando
ADN-4-YODO Temperatura ambiente, somin ADN-Boc-Pip
Equipo: jeringas de 1 mL dotadas de inserto de filtro, vial de vidrio de 5 mL, agitador magnético, fotorreactor (2 W, 470 nm).
Condiciones estándar para acoplamientos cruzados descarboxilativos fotoquímicos en conjugados de ADN soportados en el soporte sólido PEG-N<+>(Me)<3>
Se lavó PEG-N+(Me)3 (PEG-N+(Me)3 ajustado a 20 mL con glicerol:agua 1:1) (200 |<j>L, 0,00100 jm ol) con 3x1 mL de H2O en una jeringa de 1 mL dotada de un filtro y a continuación se incubó durante 15 min con ADN-4-YODO (6,52 jg , 0,001 jm ol) como solución en agua y 200 jL de H2O. La resina se lavó con DMSO 4 veces y se transfirió a un vial de vidrio de 2 mL que contenía un agitador magnético, utilizando DMSO (volumen: 500 jL). Se añadieron 500 jL de la siguiente Solución A a esta suspensión al aire. El vial se colocó en un fotorreactor (470 nm) y se irradió durante 60 min.
Solución A: se disolvió ácido Boc-piperidin-4-carboxílico (22,93 mg, 0,100 mmol) en MeOH (150 jL ) y se añadió a una solución de Cs2CO3 (16,29 mg, 0,05 mmol) en agua (150 jL). La solución se agitó durante 30 segundos y se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio. Esta sal de Cs del ácido Boc-piperidin-4-carboxílico (22,93 mg, 0,100 mmol) se disolvió en DMSO (volumen: 2000 jL ) y se añadió a una solución de NiCl2(dme) (2,197 mg, 10 jmol), 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridina (2,68 mg, 10 jm ol) y Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbbpy) PF6 (2,244 mg, 2 jm ol) en DMSO (volumen: 3000 jL ) en un vial para microondas de 20 mL. La solución se desgasificó burbujeando argón. Tratamiento: La resina se transfirió a una jeringa de 1 mL dotada de un filtro, se filtró el disolvente y la resina se lavó 5 veces con DMSO. La resina se incubó 15 min a 50 °C con 100 jL de H2O y se filtró. A continuación, se añadieron 100 jL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5 M, tampón de fosfato de 50 mM pH 8, Triton-X al 0,005 %, 4-Me-piperidina al 5 %) a la resina, se incubaron durante 30 min a 50 °C y se filtraron en el mismo tubo. Las muestras se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se analizaron mediante TOF LC-MS.
TOF LC-MS: Columna: ACQUITY BEH OST C182,1 x 50 mm 1,7 um a 60 °C: eluyente A: agua TEA 10 mM HFIP 200 mM, gradiente: 8-40 % de B en 2,7 min; 40-85 % de B en 0,95 min; 85-100 % de B en 0,05 min; 100 % durante 0,8 min, eluyente B: 100 % de metanol, flujo: 0,6 mL/min. tR: 1,938, 6573,21 uma (M tras deconvolución con Agilent MassHunter para análisis cualitativo 6,00) (calc. 6573,533), que se interpreta como compatible con la estructura del compuesto final ADN-Boc-Pip.
Se evaluaron los diferentes soportes sólidos y condujeron a la conversión de ADN-4-YODO en ADN-Boc-Pip, lo que se resume en la Tabla 3 a continuación:
Tabla 3
Ejemplo 18
Experimento para estudiar el efecto del contraión de la resina sobre la conversión de una transformación química
Equipo: placa de filtración PALL de 1 mL (placas de filtración de 96 pocillos AcroPrep™ Advance para filtración acuosa, PRODUCTO ID 8019), agitador magnético, fotorreactor dotado de lentes (Abon, 96 x 833 mW, 470 nm).
Procedimiento de lavado de la resina
Para reemplazar el contraión de la resina, la resina catiónica PEG-N+(Me)3 se dejó equilibrar con una solución acuosa de la sal sódica del contraión que se iba a introducir. Por ejemplo, se filtraron 100 jL de una suspensión de PEG-N+(Me)3 en agua en una placa de filtración PALL de 1 mL y se lavaron con 2 x 800 jL de agua. A continuación, la resina se incubó 30 min a 60 °C con 800 uL de yoduro de sodio (Nal) 1,5 M en agua. La suspensión se filtró y se lavó con 800 jL de la misma solución, seguidos de 2 x 800 jL de H2O. A continuación, la resina se incubó con 800 jL de agua y se lavó con 3 x 800 jL de agua.
Este procedimiento se repitió para reemplazar el contraión de bromuro por PF6' utilizando una solución 0,3 M de hexafluorofosfato de sodio (NaPF6) en agua.
Condiciones estándar para acoplamientos cruzados descarboxilativos fotoquímicos en conjugados de ADN soportados en el soporte sólido PEG-N<+>(Me)<3>
Se lavó PEG-N+(Me)3 (PEG-N+(Me)3 ajustado a 20 mL con glicerol:agua 1:1) (200<|j>L, 0,00100 jmol) con 3x1 mL de H<2>O en una jeringa de 1 mL dotada de un filtro y a continuación se incubó durante 15 min con ADN-4-YODO (6,52 jg, 0,001 jmol) como solución en agua y 200 jL de H<2>O. La resina se lavó con DMSO 4 veces y se transfirió a un vial de vidrio de 2 mL que contenía un agitador magnético, utilizando DMSO (volumen: 500 jL). Se añadieron 500 jL de la siguiente Solución A a esta suspensión al aire. El vial se colocó en un fotorreactor (470 nm) y se irradió durante 60 min. Solución A: se disolvió ácido Boc-piperidin-4-carboxílico (22,93 mg, 0,100 mmol) en MeOH (150 jL ) y se añadió a una solución de Cs2CO3 (16,29 mg, 0,05 mmol) en agua (150 jL). La solución se agitó durante 30 segundos y se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio. Esta sal de Cs del ácido Boc-piperidin-4-carboxílico (22,93 mg, 0,100 mmol) se disolvió en DMSO (volumen: 2000 jL ) y se añadió a una solución de NiCh(dme) (2,197 mg, 10 jmol), 4,4'-di-terc-butil-2,2'-bipiridina (2,68 mg, 10 jmol) y Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbbpy) PF6 (2,244 mg, 2 jmol) en DMSO (volumen: 3000 jL ) en un vial para microondas de 20 mL. La solución se desgasificó burbujeando argón. Tratamiento: La resina se transfirió a una jeringa de 1 mL dotada de un filtro, se filtró el disolvente y la resina se lavó 5 veces con DMSO. La resina se incubó 15 min a 50 °C con 100 jL de H<2>O y se filtró. A continuación, se añadieron 100 jL de solución de elución de ADN (NaCl 1,5 M, tampón de fosfato de 50 mM pH 8, Triton-X al 0,005 %, 4-Me-piperidina al 5 %) a la resina, se incubaron durante 30 min a 50 °C y se filtraron en el mismo tubo. Las muestras se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se analizaron mediante TOF LC-MS.
TOF LC-MS: Columna: ACQUITY BEH OST C182,1 x 50 mm 1,7 um a 60 °C: eluyente A: agua TEA 10 mM HFIP 200 mM, gradiente: 8-40 % de B en 2,7 min; 40-85 % de B en 0,95 min; 85-100 % de B en 0,05 min; 100 % durante 0,8 min, eluyente B: 100 % de metanol, flujo: 0,6 mL/min. tR: 1,938, 6573,22 uma (M tras deconvolución con Agilent MassHunter para análisis cualitativo 6,00) (calc. 6573,533), que se interpreta como compatible con la estructura del compuesto final ADN-Boc-Pip.
Los diferentes soportes sólidos se evaluaron en las condiciones estándar descritas anteriormente y condujeron a las conversiones que se resumen en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Estos resultados demuestran que los soportes sólidos de PEG anfifílicos de la invención son útiles para facilitar la transferencia de reacciones importantes de química orgánica a la elaboración de colecciones codificadas por ADN, con lo que se aumentan de este modo los límites del espacio químico que se pueden explorar con esta tecnología de generación de colecciones. Los resultados descritos en el presente documento demuestran que es posible realizar transformaciones que son difíciles en presencia de oligonucleótidos, tales como las que requieren carbaniones formales o la generación de radicales reactivos. Esto se ha conseguido a través de la adsorción de ADN sobre la matriz polimérica en un entorno relativamente lipófilo por medio de restos catiónicos, que protegen la cadena oligonucleotídica y dejan de este modo la molécula emergente de bajo peso molecular libre para reaccionar en la periferia de la microesfera. Esencialmente, estas metodologías de química de ADN con soporte sólido permiten la síntesis de colecciones codificadas por ADN de última generación.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para hacer reaccionar un compuesto conjugado a ADN utilizando uno o más disolventes no acuosos, en donde el método incluye los pasos de: i) absorber el compuesto marcado con ADN sobre un soporte sólido; y ii) hacer reaccionar el compuesto marcado con ADN soportado con un reactivo en un sistema de disolventes no acuoso, en donde el soporte comprende un cuerpo sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol, en donde el cuerpo sólido incluye al menos un resto catiónico, en donde el resto catiónico incluye un grupo de amonio cuaternario o un grupo de guanidinio.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, que incluye además el paso de liberar el producto del soporte sólido.
  3. 3. Un soporte sólido para su uso en reacciones de moléculas conjugadas a ADN no acuosas, en donde el soporte comprende un cuerpo sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol, en donde el cuerpo sólido incluye al menos un resto catiónico, en donde el resto catiónico incluye un grupo de amonio cuaternario o un grupo de guanidinio, y en donde el resto catiónico es un compuesto de acuerdo con la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III tal como se define a continuación: (I) un compuesto de acuerdo con la Fórmula I:
    en donde: el Cuerpo es el soporte sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol; R es hidrógeno; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C<8>); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; X es X<1>o X<2>, en donde X<I>es una cadena de alquileno C<1>-C<2 0>, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C<1>-C<8>, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C<3>-C<6>, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo; X<2>es -Z-X<1>-en donde Z se selecciona entre -(CH<2>)a-Rc-(CH<2>)a-NH-C(=O)-; -(CH<2>)a-CH((CH<2>)a-Rx<1>)NH-C(=O)-; -(CH<2>)a-(O)<0 -1>-Rx<2>-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH2)b-(0)0-1-(C H<2>)b-NH-C(=O)-a es un número entero de 0 a 6; b es un número entero de 1 a 6; Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C<3>-C<8>; -C(H)<2>-x((alquilo C<1>-C<6>)x)-; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquileno C<3>-C<8>, alquilo C<1>-C<6>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rxi se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C<3>-C<8>; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1,2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx<2>se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C<3>-C<8>; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquileno C<3>-C<8>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; RX3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C3-C6, donde el fenilo o cicloalquilo C<3>-C<6>están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C6, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; x es un número entero de 0 a 2; Y es C(O); y R1, R2, R3 se seleccionan cada uno independientemente entre hidroxi; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C8); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno; hidroxi; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C<8>); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; o II) un compuesto de acuerdo con la Fórmula II:
    en donde: el Cuerpo y R son cada uno como se han definido anteriormente; R10 es un alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros o R11; n es un número entero de 2 a 12; R12 es hidrógeno; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C<8>); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; y R6 y R11 son cada uno independientemente un grupo que tiene la fórmula IIa:
    en donde m es un número entero de 0 a 8; y R1, R2 y R3 son como se han definido anteriormente; O un grupo que tiene la fórmula IIb: Fórmula IIb en donde m es como se ha definido anteriormente; O un grupo que tiene la fórmula -(CH<2>)q-NHR7 en donde q es un número entero de 1 a 6; y R7 es un grupo que tiene la fórmula I Ic:
    en donde p es un número entero de 1 a 12; y R1, R2 y R3 son como se han definido anteriormente; o III) un compuesto de acuerdo con la Fórmula III: Fórmula III en donde el Cuerpo, R e Y son cada uno como se han definido anteriormente; r es un número entero de 1 a 6; y R8 es un grupo que tiene la fórmula IIIa:
    en donde Y' es C(O) o CH<2>; s es un número entero de 1 a 6; R7 es como se ha definido anteriormente; y R9 es H o alquilo C<1>-C<6>; O R8 es un grupo que tiene la fórmula IIIb:
    en donde Y' es C(O) o CH<2>; t es un número entero de 1 a 6; y R1, R2, R3 y R9 son como se han definido anteriormente.
  4. 4. Un soporte sólido de acuerdo con la Reivindicación 3, en donde el resto catiónico es un compuesto de acuerdo con la Fórmula I tal como se define a continuación: (I) un compuesto de acuerdo con la Fórmula I: Fórmula I en donde: el Cuerpo es el soporte sólido formado por una pluralidad de unidades de polietilenglicol; R es hidrógeno; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C<8>); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; X es X<1>o X<2>, en donde Xi es una cadena de alquileno C<1>-C<2 0>, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C<1>-C<8>, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C<3>-C<6>, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo; X<2>es -Z-X<1>-en donde Z se selecciona entre -(CH<2>)a-Rx-(CH<2>)a-NH-C(=O)-; -(CH<2>)a-CH((CH<2>)a-Rx<1>)NH-C(=O)-; -(CH<2>)a-(O)<0 -1>-Rx<2>-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH<2>)b-(O)<0 -1>-(CH<2>)b-NH-C(=O)-a es un número entero de 0 a 6; b es un número entero de 1 a 6; Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C<3>-C<8>; -C(H)<2>-x((alquilo C<1>-C<6>)x)-; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquileno C<3>-C<8>, alquilo C<1>-C<6>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx<1>se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C<3>-C<8>; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1,2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx<2>se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C<3>-C<8>; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquileno C<3>-C<8>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C<3>-C<6>, donde el fenilo o cicloalquilo C<3>-C<6>están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C6, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; x es un número entero de 0 a 2; Y es C(O); y R1, R2, R3 se seleccionan cada uno independientemente entre hidroxi; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C8); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros; R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno; hidroxi; alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con hidroxi, fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros u -Oalquilo C<1>-C<8>; cicloalquilo C<3>-C<8>; -C(O)(alquilo C<1>-C<8>); o un anillo heterocíclico de 5 a 10 miembros.
  5. 5. Un soporte sólido de acuerdo con la Reivindicación 3 o 4, en donde X es X<1>o X<2>, en donde X<I>es una cadena de alquileno C<1>-C<2 0>, en donde la cadena es lineal o ramificada y está opcionalmente sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, -OH, alcoxi C<1>-C<8>, nitro, ciano, -COOH, carbamoílo, -N(R4)R5, cicloalquilo C<3>-C<6>, un anillo heterocíclico de 3 a 7 miembros, fenilo, heteroarilo de 5 o 6 miembros, o (alquil C1-C4)fenilo; X<2>es -Z-X<1>-en donde Z se selecciona entre -(CH<2>)a-Rx-(CH<2>)a-NH-C(=O)-; -(CH<2>)a-CH((CH<2>)a-Rx<1>)NH-C(=O)-; -(CH<2>)a-(O)<0 -1>-Rx<2>-CH(Rx3)NH-C(=O)-; y -(CH<2>)b-(O)<0 -1>-(CH<2>)b-NH-C(=O) a es un número entero de 0 a 6; b es un número entero de 1 a 6; Rx se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C<3>-C<8>; -C(H)<2>-x((alquilo Ci-C6)x)-; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquileno C<3>-C<8>, alquilo C<1>-C<6>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx<1>se selecciona entre fenilo; cicloalquilo C<3>-C<8>; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquilo C<3>-C<8>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1,2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx<2>se selecciona entre fenilo; cicloalquileno C<3>-C<8>; naftilo; y antracilo, donde el fenilo, cicloalquileno C<3>-C<8>, naftilo o antracilo están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C<6>, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; Rx3 se selecciona entre hidrógeno; fenilo; y cicloalquilo C<3>-C<6>, donde el fenilo o cicloalquilo C<3>-C<6>están opcionalmente sustituidos 1, 2, 3 o 4 veces independientemente con alquilo C<1>-C6, alcoxi C<1>-C<6>, haloalquilo C<1>-C<6>o halo; x es un número entero de 0 a 2; Y es C(O); y R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente entre alquilo C<1>-C<8>opcionalmente sustituido con fenilo o cicloalquilo C<3>-C<8>; o cicloalquilo C<3>-C<8>.
  6. 6. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 5, en donde X<1>es una cadena de alquileno C<1>-C<20>en donde la cadena es lineal o ramificada y no está sustituida, preferentemente en donde X<1>es una cadena de alquileno C<1>-C<10>en donde la cadena es lineal y no está sustituida.
  7. 7. Un soporte sólido de acuerdo con la Reivindicación 3, en donde el resto catiónico es un compuesto de acuerdo con la Fórmula II o un compuesto de acuerdo con la Fórmula III.
  8. 8. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 7, en donde R es H.
  9. 9. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en donde R1, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C<1>-C<6>, preferentemente en donde R1, R2 y R3 son iguales, más preferentemente en donde R1, R2 y R3 son cada uno metilo.
  10. 10. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3, 8 o 9, en donde R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno y un alquilo C<1>-C<6>.
  11. 11. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3, 7 a 9, en donde R9 es hidrógeno.
  12. 12. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3, 7 a 9, en donde R10 es un alquilo C<1>-C<6>, preferentemente en donde R10 es metilo.
  13. 13. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 12, en donde el cuerpo sólido está formado por un polímero de polietilenglicol reticulado.
  14. 14. Un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 12, en donde el cuerpo sólido está formado de la resina NovaPEG de fórmula (IV)
    preferentemente en donde el cuerpo sólido está formado por la resina NovaPEG de fórmula (IV).
  15. 15. Uso de un soporte sólido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 14 para soportar un compuesto conjugado a ADN.
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