JP2004513120A - タグ付け化合物およびaidaライブラリーにおける使用方法 - Google Patents
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Abstract
式A−B−D−X−D’−E、または式A−B−D−E−D’−X{式中、Aは固相および液相有機化学で適用される標準的な物質に由来する、固相支持体の残基であり、Bは式IIの化合物または式IIIの化合物を開裂させてそれぞれD−X−D’−E、またはD−E−D’−X断片を遊離する基を有するリンカー残基であり、DおよびD’は互いに独立に結合またはスペーサー残基であり、Eはコンビナトリアル・ケミストリーによって生成された検討分子の残基であり、かつ、Xは蛍光色素の残基である。}の化合物であって、少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式A−B−D−X−D’−E、または式A−B−D−E−D’−Xの化合物。
Description
【0001】
本発明は、例えば固相支持体上および均質液相での、蛍光に基づく、コード化されたコンビナトリアル化合物ライブラリーの超ハイスループットスクリーニングに有用な、また、それに続き、スクリーニングプロセスで用いる化合物のコードライブラリーに含まれる化学構造の解読に有用なタグ付け化合物およびその方法に関する。
【0002】
コンビナトリアル・ケミストリーは現代の創薬プロセスに適用される標準的な実験技術となるまでに進展を遂げている。コンビナトリアル・ケミストリーの有力かつ公知の方法論としては以下のステップが含まれる。
(a) 固相支持体ビーズ上での分割−混合合成(1ビーズ 1化合物)
(b)コンビナトリアル化合物ライブラリーのビーズ上スクリーニングとその後の溶液中、固相支持体上で得られた結合結果の確認(AIDA技術として知られる)、および
(c) 標的分子への結合を起こす独自の化学構造の解読。
【0003】
コンビナトリアル・ケミストリーは病態治療用途を検討する分子を合成するための有用な手段となる。
【0004】
包括的標識技術による固相支持体および均質液相での超ハイスループットスクリーニングプロセスを行う適当な方法は、例えばWO 00/37488に記載されている。この標識技術は、固相支持体への結合およびその後の化合物ライブラリーのコンビナトリアル合成の開始のための反応性化学官能価を有する、化学的に安定な蛍光団に基づくものである。WO 00/37488によれば、少なくとも二官能基型の1,3−ジフェニル−1H−インダゾール蛍光団(総じてAIDA−色素と呼ぶ)を開裂可能なリンカーを介して固相支持体へ結合させる。この蛍光団の第二の官能基はその後のライブラリー合成の開始に利用される。このように内部標識化合物ライブラリーは固相支持体または均質液相でのスクリーニングに使用できる。包括的蛍光標識ライブラリーの最も顕著な化学的特徴は、その化合物ライブラリーを構成する総ての構造が可変のスペーサーを介して蛍光色素に共有結合されるということである。これらのコンジュゲートは開裂可能なリンカーを介して固相支持体へ共有結合される。固定化コンジュゲートは固相支持体上での直接スクリーニングに使用することができる(ビーズ上スクリーニング)。これらの蛍光コンジュゲートはリンカーが開裂した後、液相に遊離する。その後、マイクロタイタープレートで用いるアッセイ量で従来の一連の平均蛍光分光光度技術を適用すれば、液相中の標的分子に対する蛍光コンジュゲートの親和性が測定できる。さらにまた、いわゆるナノキャリヤーにてマイクロタイター量で行う一回の分子分光光度技術も使用できる。このスクリーニング技術において最終的な鍵となるステップは、蛍光団色素とコンジュゲートした活性リガンドの化学構造を同定する(解読する)ことである。
【0005】
特にWO 00/37488によれば、式
A−B−D−X−D’−E II
および
A−B−D−E−D’−X III
{式中、
Aは固相支持体であり、
Bは式IIまたはIIIの蛍光コンジュゲートを開裂させてそれぞれD−X−D’−EまたはD−E−D’−X断片を遊離するリンカー残基であり、
Xは例えば式Iの化合物に由来する蛍光色素残基であり、
DおよびD’は互いに独立に結合またはスペーサー残基であり、かつ、
Eは検討分子、例えばコンビナトリアル・ケミストリーによってコンジュゲート内に形成される分子の残基である。}
のコンジュゲートが提供される。
【0006】
発明者らは今般、驚くことに、検討する、例えばまたリガンドとして設計する分子であって、例えば標的との結合が起こった後にかかるコンジュゲートの一部となる分子の解読を向上させる方法を見出した。本発明の方法は式IIまたは式IIIの化合物を含み、この化合物はタグ付けされ、例えばタグ残基と化学的に反応し、例えばタグ残基はその化学基と結合している所定の低分子量の化学化合物に由来するものであり、このタグ残基は例えば解読にMS−スペクトログラフィーを用いる場合には解読中に分割可能であって、タグ残基を断片として見出すことができる。好ましくは本発明の方法は蛍光色素、例えば、タグ残基でタグ付けされた、例えばタグ残基と反応した式Iの化合物を含み、例えばこのタグ残基としては、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルなど窒素と共有結合しうることが知られている基が窒素と共有結合したものが挙げられる。従って式I、式IIまたは式IIIのタグ付けされた化合物は、式IIまたはIIIの蛍光コンジュゲートのEに由来する分子、すなわち検討分子の解読に使用することができる。
【0007】
本発明の1つの態様において、式IIまたは式IIIの化合物が少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式
A−B−D−X−D’−E II
の化合物、または式
A−B−D−E−D’−X III
{式中、
Aは固相および液相有機化学で適用される標準的な物質に由来する、固相支持体の残基であり、
Bは式IIの化合物または式IIIの化合物を開裂させてそれぞれD−X−D’−E、またはD−E−D’−X断片を遊離する基を有するリンカー残基であり、
DおよびD’は互いに独立に結合またはスペーサー残基であり、
Eはコンビナトリアル・ケミストリーによって、例えば製造プロセスのいずれかの段階で生成された検討分子の残基であり、そして
Xは蛍光色素の残基である。}
化合物であって、
例えば、式IIまたは式IIIの化合物では、Xは第三級アミンによってタグ付けされ、例えば式IIまたは式IIIの化合物では、Xは第三級アミンと結合し、さらにタグ残基、例えばアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、およびD’(またはD’が結合であればE)あるいはD(またはDが結合であればE)と結合していることを特徴とする、
化合物が提供される。
【0008】
式IIの化合物および式IIIの化合物では好ましくは、
Aは固相支持体の残基、例えば官能基化ポリスチレン系樹脂、ポリアクリルアミド系ポリマー、ポリスチレン/ポリジメチルアクリルアミドコンポジット、PEGA樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエチレン系支持体、テンタゲル、PEG−ポリスチレングラフト重合支持体、ガラス面、官能基化面、官能基化面とグラフトした材料、ポリエチレングリコールをはじめ、Bと共有結合する能力を有し、例えばコンビナトリアル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド化学で固相支持体として有用であることが知られている固相支持体に由来するものである。
Bはリンカー残基、例えば酸に不安定、塩基に不安定、光に不安定、酸化還元に不安定でマスキングされたリンカー、例えばベンジル、ベンズヒドリル、ベンズヒドリリデン、トリチル、キサンテニル、ベンゾイン、珪素、またはアリル系リンカーをはじめ、DがスペーサーならばAとD、あるいはDが結合ならばAとXまたはEと共有結合する能力を含み、コンビナトリアル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド化学でリンカーとして有用であることが知られている基に由来するものである。
DおよびD’は互いに独立に結合、またはコンビナトリアル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド化学でスペーサーとして有用であることが知られており、それぞれBとXまたはE、あるいはEとXと共有結合する能力を有する基に由来するスペーサーの残基であり、例えば
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基により置換された、置換アルカン、シクロアルカンおよびシクロアルケン;
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基により置換された、置換シクロアルキルアルカン;
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基によりアルキル部分で置換された、置換アリールアルカン;
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基によりアルキル部分で置換された、置換アルキル芳香族化合物;
5から6員と、所望により別の環構造とアネレート(anellate)していてもよいN、またはアミノ酸から選択される少なくとも2個のヘテロ原子とを有する脂肪族複素環、
例えば、ジアミノアルカン、例えばα,ω−ジアミノアルカン;ジアミノシクロアルキル、例えばジアミノシクロヘキシル;ビス−(アミノアルキル)置換アリール、例えばビス−(アミノメチル)置換フェニル;アミノおよびヒドロキシにより置換されたアルカン、例えばα−アミノ−ω−ヒドロキシ−アルカン;アルキルアミン;環状アルキルジアミンまたはアミノ酸、例えば側鎖にさらなる官能価を含んでいないものまたは含んでいるものが挙げられ、該スペーサー残基は官能基、例えば水酸基、アミノ基を介して、D’がスペーサーである場合にはXとE、また、Dがスペーサーである場合にはBとXまたはBとEと結合する。
Eは検討する、コンビナトリアル・ケミストリーによって、例えば製造プロセスのいずれかの段階で形成された分子の残基、例えば低分子量化合物に由来し、D’が結合である場合にはD’またはXと、あるいはDが結合である場合にはDまたはBと、また、D’が結合である場合にはD’またはXと共有結合する能力を有するものであり、例えば、脂肪族、芳香族および/または複素環式化合物などの官能基を有する、例えばあらゆる種の化学官能価を有する炭水化物が含まれる。
Xは式
【化1】
{式中、
R1およびR2の一方、ならびにR3およびR4の一方が水素であり、もう一方のR1またはR2、およびR3またはR4が互いに独立に
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONRtag(CH2)nOH、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NHRtag、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12、Cl、Br、F、−CF3、アルコキシ(例えば非置換アルコキシおよび置換アルコキシ、例えばそのアルキル部分においてアリール、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたものを含む)、非置換または置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONRtagH、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたアルキルであり;
R5およびR6が水素であるか、あるいはR5およびR6の一方が水素であって、他方が水素、ハロゲン、非置換アルコキシ、置換アルコキシ、例えば
−アリール、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12
により置換されたもの、非置換アルキルまたは置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NHRtag、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNHRtag、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNHRtag
により置換されたものであり;
n=2〜8であり、
R7がカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基であり、
R8およびR9が、それらが結合している窒素原子とともにヘテロシクリルを形成し(ただし、ピペラジンは除く);
R10およびR11が互いに独立に水素またはRtagであり;
R12がアルキル、アリール、アラルキル、非保護もしくは保護アミノまたはハロゲンであり;
Rtagが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルであり(ただし、非置換メチルおよび非置換シクロプロピルメチルは除く);
ただし、式Iの化合物では、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
1つまたは2つのさらなる反応物と共有結合する能力を有する、R1、R2、R3、R4、R5およびR6の意味において少なくとも1つ、好ましくは2つの官能基が存在する。}
で示される化合物の残基である。
【0009】
本明細書で用いる「共有結合する能力」とは、1つまたは2ついずれかの反応相手、例えば式IIおよび式IIIの化合物の残基A、B、D、D’およびXが由来する反応相手などと化学反応が(容易に)可能な少なくとも1つ、好ましくは2つの官能基が存在することを意味する。
【0010】
本明細書において特に断りのない限り、アルキルまたはアルカンは、(C1−22)アルキルまたはアルカン、例えば(C1−8)アルキルまたはアルカン、例えば(C1−4)アルキルまたはアルカンを含む。シクロアルキル、シクロアルカンまたはシクロアルケンは、(C3−7)シクロアルキル、シクロアルカンまたはシクロアルケン、例えば(C5−6)シクロアルキル、シクロアルカンまたはシクロアルケン、例えば別の環(構造)とアネレートしたものを含む。アルコキシとしては、(C1−18)アルコキシ((C1−8)アルコキシなど、例えば(C1−4)アルコキシ)が挙げられる。アリールまたは芳香族化合物としては、(C5−18)アリールまたは芳香族化合物、例えばフェニルまたはベンゼン、例えば別の環(構造)とアネレートしたものが挙げられる。カルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基としては、適当な保護または活性化基、例えばそれぞれ分割が(容易に)可能な基、またはさらなる反応が(容易に)可能な基など、有機化学で通常の基が挙げられる。ヘテロシクリルとしては、5〜7員、好ましくは5〜6員と、例えばN、O、Sから選択される1〜4個のヘテロ原子を有し、例えば別の環(構造)とアネレートした環(構造)が挙げられる。本明細書で述べた基はいずれも置換されていなくても置換されていてもよく、例えば有機化学で通常の基、好ましくは本明細書で特に断りのない限り、化学的に不活性な基で置換されていてもよい。アミノ保護基としては、適当なアミノ保護基、例えば有機化学で通常の保護基、例えばtert−ブチルオキシカルボニル(BOC)、9−フルオレニル−メトキシカルボニル(Fmoc)、フタルイミド、トリフルオロメチルカルボニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルなどが挙げられる。
【0011】
式IIおよび式IIIの好ましい化合物としては式IIおよび式III{式中、A、B、D、D’およびEは上記定義の通りであり、Xは式I(式中、R1およびR2の一方は水素であって、他方は−CONRtag基であり、R3およびR4基の一方は水素であって、他方は−CONRtag基であり、R5およびR6は水素であり、かつ、Rtagは上記定義の通りである)の化合物の残基である。}の化合物が挙げられる。
【0012】
もう1つの態様では本発明は、少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式
D−X−D’−E IV、または
D−E−D’−X V、または
E−D’−X VI
{式中、EおよびXは上記定義の通りであり、DおよびD’は互いに独立にスペーサーの残基であるか、または結合であるか、または存在せず、例えばXは式Iの化合物の残基である。}
の化合物を提供する。
【0013】
好ましくは式IV、VまたはVIの化合物では、残基Xは式I{式中、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
残基R1、R2、R3、R4、R5およびR6の少なくとも1つがD、D’またはEのいずれかに結合している。}
の化合物の残基である。R1、R2、R3、R4、R5およびR6の少なくとも1つが−N−Rtag基を含む式Iの化合物が新規なものである。
【0014】
もう1つの態様では本発明は、R1およびR2の一方、ならびにR3およびR4の一方が水素であり、もう一方のR1またはR2、およびR3またはR4が互いに独立に
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONRtag(CH2)nOH、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NHRtag、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12、Cl、Br、F、−CF3、アルコキシ(例えば非置換アルコキシおよび置換アルコキシ、例えばそのアルキル部分においてアリール、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtaH
により置換されたものを含む)、非置換または置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONRtagH、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたアルキルであり;
R5およびR6が水素であるか、あるいはR5およびR6の一方が水素であって、他方が水素、ハロゲン、非置換アルコキシ、置換アルコキシ、例えば
−アリール、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12
により置換されたもの、非置換アルキルまたは置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NHRtag、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNHRtag、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNHRtag
により置換されたものであり;
n=2〜8であり、
R7がカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基であり、
R8およびR9が、それらが結合している窒素原子とともにヘテロシクリルを形成し(ただし、ピペラジンは除く);
R10およびR11が互いに独立に水素またはRtagであり;
R12がアルキル、アリール、アラルキル、非保護もしくは保護アミノまたはハロゲンであり;
Rtagが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルであり(ただし、非置換メチルおよび非置換シクロプロピルメチルは除く);
ただし、式Iの化合物では、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
1つまたは2つのさらなる反応物と共有結合する能力を有する、R1、R2、R3、R4、R5およびR6の意味において少なくとも1つ、好ましくは2つの官能基が存在する、式Iの化合物を提供する。
【0015】
好ましくはRtagとしては、非置換アルキル(ただしメチルは除く)、例えば(C2−22)アルキル((C2−6)アルキルなど、例えば3,3−ジメチルブチル)、および
シクロアルキル、例えば(C3−7)シクロアルキル(シクロヘキシルメチルなど、ただし2−シクロプロピルエチルは除く)、
アリール、例えばフェニル(4−メチルフェニルメチルフェニル、4−クロロフェニルメチル、4−ブロモフェニルメチル、4−トリフルオロメチルフェニルメチル、4−メトキシフェニルメチル、2−(2−クロロフェニル)エチル、2−(3,4−ジメトキシフェニル)メチル、3−フルオロフェニルメチル、2−(4−メトキシフェニル)エチル、3−フェニルプロピルなど)を含む、
アルコキシ、例えば(C1−4)アルコキシ(2−メトキシエチル、2−エトキシエチル、2−プロポキシエチル、2−イソプロポキシエチル、3−メトキシプロピル、3−エトキシプロピル、3−プロポキシプロピル、3−イソプロポキシプロピル、3−ブトキシプロピル、3−イソブトキシプロピル、3−(2−エチル−ヘキソキシ)プロピル、3−ヘキソキシプロピル、4−ヘキソキシブチルなど)を含む、
アルコキシアルコキシ(2−[2−(メトキシ)エトキシ]エチル、2−[2−(ドデシルオキシ)エトキシ]エチル、3−[2−(メトキシ)エトキシ]プロピル、3−[2−(エトキシ)エトキシ]プロピルなど)、
アルコキシアルコキシアルコキシ(ヘキソキシエトキシエトキシエチルなど)、
ヒドロキシアルコキシ(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルなど)、
アミノアルコキシ、アミノアルコキシアルコキシ、アミノアルコキシアルコキシアルコキシ、例えばそのアミン基が保護されていないもの、または保護されているもの、(2−アミノエトキシメチル、2−(2−アミノエトキシ)エチル、3−(2−アミノエトキシ)プロピル、2−(2−N−Fmoc−アミノエトキシ)エチル、3−(2−ジメチルアミノエトキシ)プロピル、2−(2−アミノエトキシ)エトキシエチル、3−(3−アミノプロポキシブトキシプロピル、3−(3−アミノプロポキシ)エトキシ−エトキシプロピルなど)、
アリールアルコキシ、例えばベンジルオキシ、
アリールオキシ、例えばフェニルオキシ(4−メトキシフェニルオキシメチル、3,4−ジメトキシフェニルオキシメチル、3,4,5−トリメトキシフェニルオキシメチル、2−フェニルオキシエチル、2−(4−メトキシフェニルオキシ)エチル、2−(3,4−ジメトキシフェニルオキシ)エチル、2−(2−メトキシフェニルオキシ)エチル、2−(4−メトキシフェニルオキシ)エチル、2−クロロフェニルオキシメチル、2−(3,4,5−トリメトキシフェニルオキシ)エチル、2−(2−クロロフェニルオキシ)エチル、2−(3−トリフルオロフェニルオキシ)エチル、2−(4−トリフルオロフェニルオキシ)エチル、3−(4−アセトキシアミノフェニルオキシ)プロピル、4−フェニルブチルなど)を含む、
ヘテロシクリルオキシ、例えば(4−アミノ−フラザン−5−イル)オキシを含む、
ヘテロシクリル、例えば4−ピリジルメチル、2−(2−チエニル)エチル、2−モルホリノエチル、3−(2−オキソピロリジン−1−イル)−プロピルを含む、
アミノ、例えば非保護アミノおよび保護アミノ(2−アミノエチル、3−アミノプロピル、2−N−アセトキシカルボニル−アミノエチル、2−(4−メトキシフェニル)カルボニルアミノエチル、3−N−アセトキシカルボニル−アミノプロピルなど)、
シクロアルキル、例えば(C3−7)シクロアルキル(シクロペンチルなど)
により置換されたアルキルが挙げられる。
【0016】
例えば式I、II、III、IV、VおよびVIの化合物を含む、本発明によって提供される化合物を以後、本発明の化合物と呼ぶ。本発明の化合物は化学コンビナトリアルスクリーニング法における解読ステップに有用である。本発明のこの解読ステップはRtag基により置換されている、すなわち部分的にコード化されている本発明の化合物中に窒素原子が存在することにより容易となる。
【0017】
もう1つの態様では本発明は、スクリーニングプロセスの解読ステップでの本発明の化合物の使用を提供する。
【0018】
本発明の化合物は適宜、例えば常法に従い、あるいは本明細書に記載のようにして製造することができる。
【0019】
もう1つの態様では本発明は、通常用いられる光開裂性リンカー上で包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)を合成する方法であって、蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが部分的にコード化され、少なくとも1つのタグ残基、例えばRtagと結合した化合物セットを提供し、例えばさらにスキーム1に従って反応させることを含み、その化合物セットが本発明の化合物からなり、そのタグ残基、例えばRtagが種々の分子量を有する方法を提供する。
【0020】
光開裂性リンカーはまたフォトリンカーとしても知られる。本発明のこの方法は例えば以下の反応スキーム1に従って行うことができる。
【化2】
【0021】
固相支持体A(例えば樹脂ビーズ)に固定された光に不安定な4−ブロモメチル−3−ニトロ−安息香酸リンカー上での蛍光標識AIDA−ライブラリーの合成は、例えば、式HNRtagの第一級アミンによる臭化ベンジルの求核置換(ステップa))によって始め、その後、例えばWO 00/37488から公知の、例えばFmoc保護AIDA−色素とのカップリング(ステップb))、さらには検討化合物とのリガンド反応(ステップc))および光による開裂(ステップd))を行えばよい。蛍光団とコンジュゲートしたライブラリー化合物はアミドとして液相に遊離する。AIDA分子の1−フェニル置換基の4位のアミド官能基は、蛍光団(AIDA)自体についてもそうではないが、合成されたライブラリー化合物の一体部分としては見られない。アミド官能基とリガンドの結合点との距離は>20オングストロームである。その結果、AIDA−コンジュゲートの末端アミド官能基は合成されたライブラリー化合物がとるコンホメーションにほとんど影響を及ぼさない可変エレメントである。
【0022】
ステップa)〜d)は適宜な方法、例えば常法に従って行うことができる。蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが用いた特定のRtagによってコードされた化合物セットが得られる。
【0023】
もう1つの態様では本発明は、通常用いられる酸開裂性リンカー上で包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)を合成する方法であって、蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが部分的にコード化され、少なくとも1つのタグ残基、例えばRtagと共有結合した本発明の化合物セットを提供することを含み、その化合物セットが請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物からなり、そのタグ残基、例えばRtagが種々の分子量を有する方法を提供する。
【0024】
通常用いられる強酸開裂性リンカーは例えばRinkリンカーとして知られている。本発明のこの方法は例えば常法に従い、または例えば以下のようにして行うことができる。
【0025】
酸不安定Rink Amide (RAM)リンカー上の蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップの(部分)コード化は対応するフォトリンカープロセスとは異なるプロセスに従う。RAM−リンカーの第一級アミンの、タグ付き第二級アミンへの直接的変換には例えば式Rtag−CHOのタグ付きアルデヒドのセット(なお、このセットでは蛍光団の結合前の異なるアルデヒドの分子量が異なる)での還元的アルキル化ステップが要される(例えば、Brown, E., G. et al, Tetrahedron Letters (1997), 38(49), p. 8457−8460参照)(ステップ a))。用いうる種々のステップは脱保護したRink Amide樹脂をブロモ酢酸と反応させた後、式Rtag−NH2のタグ付き第一級アミンのセット(なお、このセットでは異なるアミンの分子量が異なる)での求核置換を行うことを含む(ステップa1)およびステップa2))。ここで得られた第二級アミンを蛍光団試薬Fmoc−AIDA−OHと結合させる(ステップb)。第一のコンビナトリアルステップ(リガンド反応−ステップd))はFmoc−AIDAの脱保護の後に始める(ステップc)。酸、例えばトリフルオロ酢酸などの強酸によるリンカーの酸開裂(ステップe))によって、以下のスキーム2に示されるように蛍光団コンジュゲートリガンドのアミドまたはN−(カルバモイルメチル)置換アミドを生じる。
【0026】
ステップa)、a1)、a2)、b)、c)およびd)に記載の反応はそれ自体公知であり、例えば常法に従って行えばよい。
【化3】
【0027】
もう1つの態様では本発明は、MS−スペクトログラフィーの使用により、本発明の式I、IV、VまたはVIの化合物においてタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含んでなる、包括的標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の構成ブロックの解読方法を提供する。
【0028】
包括的標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の第一のコンビナトリアルステップの解読のためのタグの読み取りは例えば以下のスキーム3(リガンドは式IV、VまたはVIのE)に示されているものなどの、例えば開裂した蛍光団コンジュゲートリガンド分子のLC/MSを用いて行うことができる。この質量スペクトルにはかかるコンジュゲートの分子量に関する情報が含まれる(MSはESI+: [MH]+で示す)。蛍光団コンジュゲートリガンドの分子量に関する知見は、小分子ライブラリーでは化合物のいくつかが同時に同じ公称質量を有することがあるので、構造の解読に十分でない場合が多い。このような場合、蛍光団の構造に関する必要な情報は用いたRtagの分子量を示す質量分析計のフラグメント化された分子イオン([MH]+)から得られる。これらのコンジュゲートはイオン化後のフラグメンテーションの好ましい開始点であるアミド結合を含む。かかる一組のフラグメントイオンはAIDA−蛍光団上のタグに関する十分な情報を持つ。望まれる情報はタグ付き蛍光団コンジュゲートの質量スペクトルでは数倍分かりやすくなり、例えばAIDA−蛍光団のフラグメント例が以下のスキーム3に示されている。MS/MS(CDI:衝突誘起解離)を、例えばスキーム3に示されているように、それらの分子イオン[MH]+によりフラグメントイオンの確認に用いる。
【化4】
【化5】
【0029】
もう1つの態様では本発明は、包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の1を超えるコンビナトリアルステップによって得られた構成ブロックを解読する方法であって、1を超える、例えば4までのコンビナトリアルステップで包括的蛍光(AIDA)標識化合物ライブラリーの分割−混合−分配生産を行い、MS−スペクトログラフィーを用いて本発明に記載の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含む方法を提供する。
【0030】
1回めのコンビナトリアルステップの部分的コード化は小さなAIDA標識ライブラリーの作製に有用であるだけではない。本発明のタグ残基による蛍光団によるタグ付けは、例えばコンビナトリアル・ケミストリーの公知のデコンヴォルーション戦略と組み合わせると、より大きなライブラリーの解読の有効な手段ともなる。この態様は以下のスキーム4に例示されているように、4段階のコンビナトリアルステップで合成されたライブラリー(例えば、ビーズ上)の分割・混合・分配で概略が示される。3回の連続したコンビナトリアルステップ(R1xR2xR3)はマザーライブラリーを実際に作り出し、これは4回目のコンビナトリアルステップで作り出されるドーターライブラリー(R1xR2xR3xR4)のソースとなる。また、例えば多様性の付加を目的とした官能基の変換を達成するために非コンビナトリアルステップも行える。
【0031】
2回目のコンビナトリアルステップ(R2)で得られる構成ブロックは、種々の分子量を有する反応物を用いることで、得られる構成ブロックが種々の分子量を有するように選択される。得られた3回目のコンビナトリアルステップ(R3)のタグ付きAIDAコンジュゲート構成ブロックは個別のバイアル(混合していない)で維持されることから、R3は解読する必要がない。3回目のコンビナトリアルステップで用いる構成ブロックの数は全ライブラリーのサブライブラリーの数を規定しうる。3回目のコンビナトリアルステップで得られたライブラリーはアリコートセットに分配するが、このアリコート数は4回目のコンビナトリアルステップ(R4)(ライブラリー由来のライブラリーステップ)で用いようとする構成ブロックの数により規定されうる。R4は個別に維持されるマザーライブラリーに対して等しい構造のドーターライブラリーを作り出すことから、R4は解読する必要がない。マザーライブラリーとそれから得られる全てのドーターライブラリーは同数のサブライブラリーを含み、各サブライブラリーは同数の化合物を含むと考えられる。最初の反応ステップをタグ付けし、R2で同重体がなく、R3でサブライブラリーを個別に維持し、続いてR4で分配すると、最後のコンビナトリアルステップの後に得られるライブラリーに含まれる全ての構造が、例えば単一のビーズから開裂された物質から得られた質量スペクトルデータに存在する分子イオン([MH]+)およびタグ情報([MH]+から導き出されたフラグメントイオンとして、例えば上記スキーム3参照)によって同時に同じ分子量を有する場合であっても、その構造の解読が可能となる。
【0032】
もう1つの態様では本発明は、包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の構成ブロックを解読する方法であって、
a) 第一のコンビナトリアルステップをタグ残基、例えばRtag、例えばビーズ上でタグ付けし、得られると予測される各構成ブロックに対して異なるバイアル中で第一のコンビナトリアルステップを行い、
b) 第一のコンビナトリアルステップで得られ、異なる構成ブロックを含有するバイアルの内容物を混合し、
c) 個々のバイアルの各構成ブロックについて、例えば種々の分子量を有する反応物を選択して使用することで、第二のコンビナトリアルステップの後に得られた構成ブロックがb)で得られる混合物中に種々の分子量を有するように第二のコンビナトリアルステップを行い、さらに所望により
d) ステップc)で得られたバイアルの内容物を混合し、個々のバイアルの各構成ブロックについて、第三のコンビナトリアルステップを行い、さらに所望により
e) ステップd)で得られた少なくとも1つ、好ましくは各々のバイアル中の各構成ブロックについて第四のコンビナトリアルステップを行い、さらに
f) MS−スペクトログラフィー、例えばMS/MS(生得誘起解離=CID)を用いて本発明の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含む方法を提供する。
【0033】
例えばコンビナトリアルステップが2回しか望まれない場合には、ステップc)およびd)は行う必要はなく、ステップc)およびd)は省かれる。
【化6】
【0034】
本発明のタグ付けは例えば上記のように解読に有用なだけでなく、さらにまた、それ以外では同じ非タグ付き化合物に対して、包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド(例えば本発明の化合物)の物理化学的特性に影響を及ぼし、例えば包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド(例えば本発明の化合物)の物理化学的特性を変化させるようなタグ残基を選択することで、包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えば式IV、VおよびVIなどのAIDAコンジュゲートリガンドの物理化学的特性を改質するためにも使用できる。
【0035】
もう1つの態様では本発明は、包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの物理化学特性の改変における、本発明のタグ残基を含む化合物の使用を提供する。
【0036】
このような使用の重要な適用としては、例えば包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの溶解度の向上が挙げられる。すでに記載したように、次に、樹脂ビーズ上のAIDAコンジュゲートリガンドに対する標的のビーズ上結合の陽性結果は単離したビーズからのコンジュゲートの開裂後に液相で確認(同定)することができる(例えば、AIDA技術に相当)。このように用いる溶媒系、例えば水性バッファー系における包括的蛍光標識コンジュゲートリガンドの溶解度の向上はしばしば有利である。特にAIDA蛍光団の1,3−ジフェニル−1H−インダゾール核は芳香環の含量が高いがゆえの疎水性部分であり、これによりAIDAコンジュゲートリガンドは非コンジュゲート型のものに比べて水への溶解度が低くなる。本発明によれば、例えば Rtag−アミン、Rtag−アルデヒドをはじめとするタグ残基セットは、それ以外では同じ非タグ付き化合物に比べて本発明のタグ付き化合物の溶解度を向上させるようなRtag残基を選択することで作り出される。
【0037】
もう1つの態様では本発明は、例えば非水性および水性溶媒(系)を含む溶媒系において包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの溶解度を向上させる上での、本発明のタグ残基を含む化合物の使用を提供する。
【0038】
発明者らは包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの溶解度の特性として1−オクタノール/水の分配係数の対数計算値(clogP値)を用いた(例えば、Ghose, A. K., et al. J. Phys. Chem. A. (1998), 102(21), p. 3762−3772, o Chou, J. T., et al, J. Chem. Inf. Comput. Sci. (1979), 19(3), p. 172−178参照)。下記表1では、種々のタグ残基によるAIDA色素コンジュゲート(リガンドとしてジペプチドを有する)の水への溶解度の向上を示す。clogPが低いほど水に対する溶解度が高いことを意味する。
【表1】
【0039】
コンビナトリアル・ケミストリーは病態の治療用途を目的とした検討分子の合成のための有用な手段である。式IIおよびIIIの化合物は例えばタンパク質、例えば哺乳類において病態に影響を及ぼすことが分かっているタンパク質のビーズ上スクリーニングに使用できる。このようなタンパク質と結合することが見出された式IIおよびIIIの化合物は有用な医薬である。
【0040】
以下の実施例では、温度は全てセ氏度である。
また、以下の略号を用いる。
TFA:トリフルオロ酢酸
CID:衝突誘起解離
【0041】
実験
以下の表2に記載の化合物1〜26は以下に示すような式E1の化合物であり、実施例27〜30の化合物は以下に示すような式E2の化合物であり、化合物1〜3、5、8、9、15、24、26、27および29では、REはALA(β−アラニノイル)であり、化合物4、6、7、10〜14、16〜23、25、28および30では、REはLALA(L−アラニノイル)である。表2の化合物は、本明細書に記載のようにさらにRtagを導入すること以外はWO 00/37488に記載のものと同様にして製造することがきる。
【化7】
【表2】
【表3】
【表4】
【0042】
分析方法
用いたTentaGel樹脂(TentaGel S NH2; TentaGel S RAM; ビーズサイズ: 90μm;添加量:0.23〜0.26mmol/g樹脂)は公知のものであり、例えばRapp Polymere, Tuebingen, DEから入手できる。粗生成物の質量スペクトルはHewlett−Packard Series 1100 HPLCシステムに接続したFinnigan Thermo Quest Navigator LC/MSで測定すればよい。この質量分析計は(ESI+/ESI−)モードまたは(APCI+/APCI−)モードで行うオープンアクセスMSとして作動させればよい。サンプルのインジェクションはフローインジェクション分析モードで行えばよい。溶媒供給系はメタノール/アセトニトリル50/50(%v/v)であってもよい。HPLC分析は逆相Waters NovaPack RP18(5μm)カラム(3.9mm x 150mm)、254nm検出を用い、勾配は30分間で10〜100% B(A=H2O/0.1% TFA; B=CH3CN/0.1% TFA)、流速は1mL/分とし、Beckman System Goldにて行ってよい。これらの生成物はGeneVacエバポレーターシステムを用いて2ミリバールで真空乾燥させればよい。
【0043】
μ HPLC−MS/MS 分析
サンプルを溶媒、すなわち50%MeOH/50%H2O/0.05%TFAに再懸濁させる。これらのサンプルをFAMOSμ−サンプリングワークステーション(LC Packings, Amsterdam, NL)に入れ、そこからカラム、すなわちC18、2x0.8mmμ−ガードカラム(LC Packings)に接続したInertsil ODS−3、C18、5μm、50x0.8mmカラムへロードする。クロマトグラフィーは HP1100 HPLCシステム(Hewlett−Packard, Waldbronn, Germany)を用い、100μl/分で作動させて行う。HPLCポンプとFAMOSワークステーションのインジェクターの間にAcurateμ−フロープロセッサー(LC Packings)をインストールすることで流れを分割し、この逆相カラムに25μl/分の流れを作り出す。HPLC溶媒は、
A: 0.05% TFA/水
B: 96%アセトニトリル/0.05% TFA/水
である。12分間で10%〜80% Bの直線勾配をかけ、勾配の終わりに95%、3分の無勾配ステップを入れる。7分間の再平衡化ステップの後に次のサンプルをインジェクションする。カラム排出液を214nmに設定した検出器を備えたU−Z view 30nl flow cell(LC Packings)に通し、次にそこからフューズドシリカキャピラリー(外径340μmx内径50μm)を経て、エレクトロスプレーソースのLCQイオントラップ質量分析計(Finnigan Corp., San Jose, CA, USA)へ送り、3段階のスキャン内容からなる20分の一シリーズを行う(1:スキャンレンジを150〜2000amuに設定して質量測定を行うMSモード; 2: 最小要求シグナル100’000カウントの従属ズームスキャンモード; 3:衝突エネルギーを32%に設定し、単離幅を7amuに設定、選択イオン(最高イオンは約100’000カウント以上)のフラグメンテーションを行う従属MS/MSスキャンモード)。電源は4.5kVととし、加熱キャピラリーを220℃に、シース窒素ガスの流速を80に設定した。MSモードではイオン時間を500msに、目標イオン数を5x107に設定し、CIDモードではイオン時間を500msに、目標イオン数を2x107に設定した。両モードとも、マイクロスキャン/スペクトルを3回行う。電子増倍管は−1000Vに設定し、スペクトルは全て陽イオンモードでとる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例14の化合物のHPLC−spur(UV)を示す(保持時間:11.38分)
【図2】実施例14の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:0.05〜19.96分)。
【図3】実施例14の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:11.21〜11.61分)。
【図4】実施例14の化合物の分子イオン([MH+]=543)のMS/MSを示す(保持時間:11.61分)。
【図5】実施例15の化合物のHPLC−spur(UV)を示す(保持時間:11.76分;保持時間13.90分の化合物はTFA存在下の光化学開裂の際に形成された実施例15の化合物のトリフルオロアセチル化同族体である)。
【図6】実施例15の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:0.01〜19.93分)。
【図7】実施例15の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:11.53〜12.15分)。
【図8】実施例15の化合物の分子イオン([MH+]=557)のMS/MSを示す(保持時間:11.97分)。
【図9】AIDA技術を加えたビーズ上スクリーニングの原理を示す。第一のコンビナトリアルステップでタグ付けされたコンビナトリアル化合物ライブラリーの樹脂ビーズ(Rtag;1ビーズ1化合物)を蛍光色素で標識した標的(例えばタンパク質)に曝す。ビーズ検査中には標的上の色素の励起波長はAIDA蛍光団(サイレントAIDA)に対し直交させる。標識された標的に結合したビーズを回収する(単一ビーズ採取)。AIDA−Rtag−コンジュゲートライブラリー化合物(リガンド)をその単一ビーズから開裂させる。次にビーズ上結合の結果を、蛍光分光光度法で非標識標的とR−tag−AIDAコンジュゲート化合物との相互作用を調べることにより液相中で確認および定量する。確認された活性については、活性リガンドの構造の解読(MWとRtag読み取り)のために単一ビーズLC/MSを行う。
本発明は、例えば固相支持体上および均質液相での、蛍光に基づく、コード化されたコンビナトリアル化合物ライブラリーの超ハイスループットスクリーニングに有用な、また、それに続き、スクリーニングプロセスで用いる化合物のコードライブラリーに含まれる化学構造の解読に有用なタグ付け化合物およびその方法に関する。
【0002】
コンビナトリアル・ケミストリーは現代の創薬プロセスに適用される標準的な実験技術となるまでに進展を遂げている。コンビナトリアル・ケミストリーの有力かつ公知の方法論としては以下のステップが含まれる。
(a) 固相支持体ビーズ上での分割−混合合成(1ビーズ 1化合物)
(b)コンビナトリアル化合物ライブラリーのビーズ上スクリーニングとその後の溶液中、固相支持体上で得られた結合結果の確認(AIDA技術として知られる)、および
(c) 標的分子への結合を起こす独自の化学構造の解読。
【0003】
コンビナトリアル・ケミストリーは病態治療用途を検討する分子を合成するための有用な手段となる。
【0004】
包括的標識技術による固相支持体および均質液相での超ハイスループットスクリーニングプロセスを行う適当な方法は、例えばWO 00/37488に記載されている。この標識技術は、固相支持体への結合およびその後の化合物ライブラリーのコンビナトリアル合成の開始のための反応性化学官能価を有する、化学的に安定な蛍光団に基づくものである。WO 00/37488によれば、少なくとも二官能基型の1,3−ジフェニル−1H−インダゾール蛍光団(総じてAIDA−色素と呼ぶ)を開裂可能なリンカーを介して固相支持体へ結合させる。この蛍光団の第二の官能基はその後のライブラリー合成の開始に利用される。このように内部標識化合物ライブラリーは固相支持体または均質液相でのスクリーニングに使用できる。包括的蛍光標識ライブラリーの最も顕著な化学的特徴は、その化合物ライブラリーを構成する総ての構造が可変のスペーサーを介して蛍光色素に共有結合されるということである。これらのコンジュゲートは開裂可能なリンカーを介して固相支持体へ共有結合される。固定化コンジュゲートは固相支持体上での直接スクリーニングに使用することができる(ビーズ上スクリーニング)。これらの蛍光コンジュゲートはリンカーが開裂した後、液相に遊離する。その後、マイクロタイタープレートで用いるアッセイ量で従来の一連の平均蛍光分光光度技術を適用すれば、液相中の標的分子に対する蛍光コンジュゲートの親和性が測定できる。さらにまた、いわゆるナノキャリヤーにてマイクロタイター量で行う一回の分子分光光度技術も使用できる。このスクリーニング技術において最終的な鍵となるステップは、蛍光団色素とコンジュゲートした活性リガンドの化学構造を同定する(解読する)ことである。
【0005】
特にWO 00/37488によれば、式
A−B−D−X−D’−E II
および
A−B−D−E−D’−X III
{式中、
Aは固相支持体であり、
Bは式IIまたはIIIの蛍光コンジュゲートを開裂させてそれぞれD−X−D’−EまたはD−E−D’−X断片を遊離するリンカー残基であり、
Xは例えば式Iの化合物に由来する蛍光色素残基であり、
DおよびD’は互いに独立に結合またはスペーサー残基であり、かつ、
Eは検討分子、例えばコンビナトリアル・ケミストリーによってコンジュゲート内に形成される分子の残基である。}
のコンジュゲートが提供される。
【0006】
発明者らは今般、驚くことに、検討する、例えばまたリガンドとして設計する分子であって、例えば標的との結合が起こった後にかかるコンジュゲートの一部となる分子の解読を向上させる方法を見出した。本発明の方法は式IIまたは式IIIの化合物を含み、この化合物はタグ付けされ、例えばタグ残基と化学的に反応し、例えばタグ残基はその化学基と結合している所定の低分子量の化学化合物に由来するものであり、このタグ残基は例えば解読にMS−スペクトログラフィーを用いる場合には解読中に分割可能であって、タグ残基を断片として見出すことができる。好ましくは本発明の方法は蛍光色素、例えば、タグ残基でタグ付けされた、例えばタグ残基と反応した式Iの化合物を含み、例えばこのタグ残基としては、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルなど窒素と共有結合しうることが知られている基が窒素と共有結合したものが挙げられる。従って式I、式IIまたは式IIIのタグ付けされた化合物は、式IIまたはIIIの蛍光コンジュゲートのEに由来する分子、すなわち検討分子の解読に使用することができる。
【0007】
本発明の1つの態様において、式IIまたは式IIIの化合物が少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式
A−B−D−X−D’−E II
の化合物、または式
A−B−D−E−D’−X III
{式中、
Aは固相および液相有機化学で適用される標準的な物質に由来する、固相支持体の残基であり、
Bは式IIの化合物または式IIIの化合物を開裂させてそれぞれD−X−D’−E、またはD−E−D’−X断片を遊離する基を有するリンカー残基であり、
DおよびD’は互いに独立に結合またはスペーサー残基であり、
Eはコンビナトリアル・ケミストリーによって、例えば製造プロセスのいずれかの段階で生成された検討分子の残基であり、そして
Xは蛍光色素の残基である。}
化合物であって、
例えば、式IIまたは式IIIの化合物では、Xは第三級アミンによってタグ付けされ、例えば式IIまたは式IIIの化合物では、Xは第三級アミンと結合し、さらにタグ残基、例えばアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキル、およびD’(またはD’が結合であればE)あるいはD(またはDが結合であればE)と結合していることを特徴とする、
化合物が提供される。
【0008】
式IIの化合物および式IIIの化合物では好ましくは、
Aは固相支持体の残基、例えば官能基化ポリスチレン系樹脂、ポリアクリルアミド系ポリマー、ポリスチレン/ポリジメチルアクリルアミドコンポジット、PEGA樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエチレン系支持体、テンタゲル、PEG−ポリスチレングラフト重合支持体、ガラス面、官能基化面、官能基化面とグラフトした材料、ポリエチレングリコールをはじめ、Bと共有結合する能力を有し、例えばコンビナトリアル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド化学で固相支持体として有用であることが知られている固相支持体に由来するものである。
Bはリンカー残基、例えば酸に不安定、塩基に不安定、光に不安定、酸化還元に不安定でマスキングされたリンカー、例えばベンジル、ベンズヒドリル、ベンズヒドリリデン、トリチル、キサンテニル、ベンゾイン、珪素、またはアリル系リンカーをはじめ、DがスペーサーならばAとD、あるいはDが結合ならばAとXまたはEと共有結合する能力を含み、コンビナトリアル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド化学でリンカーとして有用であることが知られている基に由来するものである。
DおよびD’は互いに独立に結合、またはコンビナトリアル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド化学でスペーサーとして有用であることが知られており、それぞれBとXまたはE、あるいはEとXと共有結合する能力を有する基に由来するスペーサーの残基であり、例えば
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基により置換された、置換アルカン、シクロアルカンおよびシクロアルケン;
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基により置換された、置換シクロアルキルアルカン;
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基によりアルキル部分で置換された、置換アリールアルカン;
少なくとも1以上、例えば2個のアミノ基により、または少なくとも1個のアミノ基と少なくとも1個の水酸基によりアルキル部分で置換された、置換アルキル芳香族化合物;
5から6員と、所望により別の環構造とアネレート(anellate)していてもよいN、またはアミノ酸から選択される少なくとも2個のヘテロ原子とを有する脂肪族複素環、
例えば、ジアミノアルカン、例えばα,ω−ジアミノアルカン;ジアミノシクロアルキル、例えばジアミノシクロヘキシル;ビス−(アミノアルキル)置換アリール、例えばビス−(アミノメチル)置換フェニル;アミノおよびヒドロキシにより置換されたアルカン、例えばα−アミノ−ω−ヒドロキシ−アルカン;アルキルアミン;環状アルキルジアミンまたはアミノ酸、例えば側鎖にさらなる官能価を含んでいないものまたは含んでいるものが挙げられ、該スペーサー残基は官能基、例えば水酸基、アミノ基を介して、D’がスペーサーである場合にはXとE、また、Dがスペーサーである場合にはBとXまたはBとEと結合する。
Eは検討する、コンビナトリアル・ケミストリーによって、例えば製造プロセスのいずれかの段階で形成された分子の残基、例えば低分子量化合物に由来し、D’が結合である場合にはD’またはXと、あるいはDが結合である場合にはDまたはBと、また、D’が結合である場合にはD’またはXと共有結合する能力を有するものであり、例えば、脂肪族、芳香族および/または複素環式化合物などの官能基を有する、例えばあらゆる種の化学官能価を有する炭水化物が含まれる。
Xは式
【化1】
{式中、
R1およびR2の一方、ならびにR3およびR4の一方が水素であり、もう一方のR1またはR2、およびR3またはR4が互いに独立に
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONRtag(CH2)nOH、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NHRtag、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12、Cl、Br、F、−CF3、アルコキシ(例えば非置換アルコキシおよび置換アルコキシ、例えばそのアルキル部分においてアリール、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたものを含む)、非置換または置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONRtagH、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたアルキルであり;
R5およびR6が水素であるか、あるいはR5およびR6の一方が水素であって、他方が水素、ハロゲン、非置換アルコキシ、置換アルコキシ、例えば
−アリール、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12
により置換されたもの、非置換アルキルまたは置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NHRtag、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNHRtag、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNHRtag
により置換されたものであり;
n=2〜8であり、
R7がカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基であり、
R8およびR9が、それらが結合している窒素原子とともにヘテロシクリルを形成し(ただし、ピペラジンは除く);
R10およびR11が互いに独立に水素またはRtagであり;
R12がアルキル、アリール、アラルキル、非保護もしくは保護アミノまたはハロゲンであり;
Rtagが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルであり(ただし、非置換メチルおよび非置換シクロプロピルメチルは除く);
ただし、式Iの化合物では、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
1つまたは2つのさらなる反応物と共有結合する能力を有する、R1、R2、R3、R4、R5およびR6の意味において少なくとも1つ、好ましくは2つの官能基が存在する。}
で示される化合物の残基である。
【0009】
本明細書で用いる「共有結合する能力」とは、1つまたは2ついずれかの反応相手、例えば式IIおよび式IIIの化合物の残基A、B、D、D’およびXが由来する反応相手などと化学反応が(容易に)可能な少なくとも1つ、好ましくは2つの官能基が存在することを意味する。
【0010】
本明細書において特に断りのない限り、アルキルまたはアルカンは、(C1−22)アルキルまたはアルカン、例えば(C1−8)アルキルまたはアルカン、例えば(C1−4)アルキルまたはアルカンを含む。シクロアルキル、シクロアルカンまたはシクロアルケンは、(C3−7)シクロアルキル、シクロアルカンまたはシクロアルケン、例えば(C5−6)シクロアルキル、シクロアルカンまたはシクロアルケン、例えば別の環(構造)とアネレートしたものを含む。アルコキシとしては、(C1−18)アルコキシ((C1−8)アルコキシなど、例えば(C1−4)アルコキシ)が挙げられる。アリールまたは芳香族化合物としては、(C5−18)アリールまたは芳香族化合物、例えばフェニルまたはベンゼン、例えば別の環(構造)とアネレートしたものが挙げられる。カルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基としては、適当な保護または活性化基、例えばそれぞれ分割が(容易に)可能な基、またはさらなる反応が(容易に)可能な基など、有機化学で通常の基が挙げられる。ヘテロシクリルとしては、5〜7員、好ましくは5〜6員と、例えばN、O、Sから選択される1〜4個のヘテロ原子を有し、例えば別の環(構造)とアネレートした環(構造)が挙げられる。本明細書で述べた基はいずれも置換されていなくても置換されていてもよく、例えば有機化学で通常の基、好ましくは本明細書で特に断りのない限り、化学的に不活性な基で置換されていてもよい。アミノ保護基としては、適当なアミノ保護基、例えば有機化学で通常の保護基、例えばtert−ブチルオキシカルボニル(BOC)、9−フルオレニル−メトキシカルボニル(Fmoc)、フタルイミド、トリフルオロメチルカルボニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルなどが挙げられる。
【0011】
式IIおよび式IIIの好ましい化合物としては式IIおよび式III{式中、A、B、D、D’およびEは上記定義の通りであり、Xは式I(式中、R1およびR2の一方は水素であって、他方は−CONRtag基であり、R3およびR4基の一方は水素であって、他方は−CONRtag基であり、R5およびR6は水素であり、かつ、Rtagは上記定義の通りである)の化合物の残基である。}の化合物が挙げられる。
【0012】
もう1つの態様では本発明は、少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式
D−X−D’−E IV、または
D−E−D’−X V、または
E−D’−X VI
{式中、EおよびXは上記定義の通りであり、DおよびD’は互いに独立にスペーサーの残基であるか、または結合であるか、または存在せず、例えばXは式Iの化合物の残基である。}
の化合物を提供する。
【0013】
好ましくは式IV、VまたはVIの化合物では、残基Xは式I{式中、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
残基R1、R2、R3、R4、R5およびR6の少なくとも1つがD、D’またはEのいずれかに結合している。}
の化合物の残基である。R1、R2、R3、R4、R5およびR6の少なくとも1つが−N−Rtag基を含む式Iの化合物が新規なものである。
【0014】
もう1つの態様では本発明は、R1およびR2の一方、ならびにR3およびR4の一方が水素であり、もう一方のR1またはR2、およびR3またはR4が互いに独立に
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONRtag(CH2)nOH、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NHRtag、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12、Cl、Br、F、−CF3、アルコキシ(例えば非置換アルコキシおよび置換アルコキシ、例えばそのアルキル部分においてアリール、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtaH
により置換されたものを含む)、非置換または置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONRtagH、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたアルキルであり;
R5およびR6が水素であるか、あるいはR5およびR6の一方が水素であって、他方が水素、ハロゲン、非置換アルコキシ、置換アルコキシ、例えば
−アリール、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12
により置換されたもの、非置換アルキルまたは置換アルキル、例えば好ましくは末端の炭素原子において
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NHRtag、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNHRtag、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNHRtag
により置換されたものであり;
n=2〜8であり、
R7がカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基であり、
R8およびR9が、それらが結合している窒素原子とともにヘテロシクリルを形成し(ただし、ピペラジンは除く);
R10およびR11が互いに独立に水素またはRtagであり;
R12がアルキル、アリール、アラルキル、非保護もしくは保護アミノまたはハロゲンであり;
Rtagが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルであり(ただし、非置換メチルおよび非置換シクロプロピルメチルは除く);
ただし、式Iの化合物では、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
1つまたは2つのさらなる反応物と共有結合する能力を有する、R1、R2、R3、R4、R5およびR6の意味において少なくとも1つ、好ましくは2つの官能基が存在する、式Iの化合物を提供する。
【0015】
好ましくはRtagとしては、非置換アルキル(ただしメチルは除く)、例えば(C2−22)アルキル((C2−6)アルキルなど、例えば3,3−ジメチルブチル)、および
シクロアルキル、例えば(C3−7)シクロアルキル(シクロヘキシルメチルなど、ただし2−シクロプロピルエチルは除く)、
アリール、例えばフェニル(4−メチルフェニルメチルフェニル、4−クロロフェニルメチル、4−ブロモフェニルメチル、4−トリフルオロメチルフェニルメチル、4−メトキシフェニルメチル、2−(2−クロロフェニル)エチル、2−(3,4−ジメトキシフェニル)メチル、3−フルオロフェニルメチル、2−(4−メトキシフェニル)エチル、3−フェニルプロピルなど)を含む、
アルコキシ、例えば(C1−4)アルコキシ(2−メトキシエチル、2−エトキシエチル、2−プロポキシエチル、2−イソプロポキシエチル、3−メトキシプロピル、3−エトキシプロピル、3−プロポキシプロピル、3−イソプロポキシプロピル、3−ブトキシプロピル、3−イソブトキシプロピル、3−(2−エチル−ヘキソキシ)プロピル、3−ヘキソキシプロピル、4−ヘキソキシブチルなど)を含む、
アルコキシアルコキシ(2−[2−(メトキシ)エトキシ]エチル、2−[2−(ドデシルオキシ)エトキシ]エチル、3−[2−(メトキシ)エトキシ]プロピル、3−[2−(エトキシ)エトキシ]プロピルなど)、
アルコキシアルコキシアルコキシ(ヘキソキシエトキシエトキシエチルなど)、
ヒドロキシアルコキシ(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチルなど)、
アミノアルコキシ、アミノアルコキシアルコキシ、アミノアルコキシアルコキシアルコキシ、例えばそのアミン基が保護されていないもの、または保護されているもの、(2−アミノエトキシメチル、2−(2−アミノエトキシ)エチル、3−(2−アミノエトキシ)プロピル、2−(2−N−Fmoc−アミノエトキシ)エチル、3−(2−ジメチルアミノエトキシ)プロピル、2−(2−アミノエトキシ)エトキシエチル、3−(3−アミノプロポキシブトキシプロピル、3−(3−アミノプロポキシ)エトキシ−エトキシプロピルなど)、
アリールアルコキシ、例えばベンジルオキシ、
アリールオキシ、例えばフェニルオキシ(4−メトキシフェニルオキシメチル、3,4−ジメトキシフェニルオキシメチル、3,4,5−トリメトキシフェニルオキシメチル、2−フェニルオキシエチル、2−(4−メトキシフェニルオキシ)エチル、2−(3,4−ジメトキシフェニルオキシ)エチル、2−(2−メトキシフェニルオキシ)エチル、2−(4−メトキシフェニルオキシ)エチル、2−クロロフェニルオキシメチル、2−(3,4,5−トリメトキシフェニルオキシ)エチル、2−(2−クロロフェニルオキシ)エチル、2−(3−トリフルオロフェニルオキシ)エチル、2−(4−トリフルオロフェニルオキシ)エチル、3−(4−アセトキシアミノフェニルオキシ)プロピル、4−フェニルブチルなど)を含む、
ヘテロシクリルオキシ、例えば(4−アミノ−フラザン−5−イル)オキシを含む、
ヘテロシクリル、例えば4−ピリジルメチル、2−(2−チエニル)エチル、2−モルホリノエチル、3−(2−オキソピロリジン−1−イル)−プロピルを含む、
アミノ、例えば非保護アミノおよび保護アミノ(2−アミノエチル、3−アミノプロピル、2−N−アセトキシカルボニル−アミノエチル、2−(4−メトキシフェニル)カルボニルアミノエチル、3−N−アセトキシカルボニル−アミノプロピルなど)、
シクロアルキル、例えば(C3−7)シクロアルキル(シクロペンチルなど)
により置換されたアルキルが挙げられる。
【0016】
例えば式I、II、III、IV、VおよびVIの化合物を含む、本発明によって提供される化合物を以後、本発明の化合物と呼ぶ。本発明の化合物は化学コンビナトリアルスクリーニング法における解読ステップに有用である。本発明のこの解読ステップはRtag基により置換されている、すなわち部分的にコード化されている本発明の化合物中に窒素原子が存在することにより容易となる。
【0017】
もう1つの態様では本発明は、スクリーニングプロセスの解読ステップでの本発明の化合物の使用を提供する。
【0018】
本発明の化合物は適宜、例えば常法に従い、あるいは本明細書に記載のようにして製造することができる。
【0019】
もう1つの態様では本発明は、通常用いられる光開裂性リンカー上で包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)を合成する方法であって、蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが部分的にコード化され、少なくとも1つのタグ残基、例えばRtagと結合した化合物セットを提供し、例えばさらにスキーム1に従って反応させることを含み、その化合物セットが本発明の化合物からなり、そのタグ残基、例えばRtagが種々の分子量を有する方法を提供する。
【0020】
光開裂性リンカーはまたフォトリンカーとしても知られる。本発明のこの方法は例えば以下の反応スキーム1に従って行うことができる。
【化2】
【0021】
固相支持体A(例えば樹脂ビーズ)に固定された光に不安定な4−ブロモメチル−3−ニトロ−安息香酸リンカー上での蛍光標識AIDA−ライブラリーの合成は、例えば、式HNRtagの第一級アミンによる臭化ベンジルの求核置換(ステップa))によって始め、その後、例えばWO 00/37488から公知の、例えばFmoc保護AIDA−色素とのカップリング(ステップb))、さらには検討化合物とのリガンド反応(ステップc))および光による開裂(ステップd))を行えばよい。蛍光団とコンジュゲートしたライブラリー化合物はアミドとして液相に遊離する。AIDA分子の1−フェニル置換基の4位のアミド官能基は、蛍光団(AIDA)自体についてもそうではないが、合成されたライブラリー化合物の一体部分としては見られない。アミド官能基とリガンドの結合点との距離は>20オングストロームである。その結果、AIDA−コンジュゲートの末端アミド官能基は合成されたライブラリー化合物がとるコンホメーションにほとんど影響を及ぼさない可変エレメントである。
【0022】
ステップa)〜d)は適宜な方法、例えば常法に従って行うことができる。蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが用いた特定のRtagによってコードされた化合物セットが得られる。
【0023】
もう1つの態様では本発明は、通常用いられる酸開裂性リンカー上で包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)を合成する方法であって、蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが部分的にコード化され、少なくとも1つのタグ残基、例えばRtagと共有結合した本発明の化合物セットを提供することを含み、その化合物セットが請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物からなり、そのタグ残基、例えばRtagが種々の分子量を有する方法を提供する。
【0024】
通常用いられる強酸開裂性リンカーは例えばRinkリンカーとして知られている。本発明のこの方法は例えば常法に従い、または例えば以下のようにして行うことができる。
【0025】
酸不安定Rink Amide (RAM)リンカー上の蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップの(部分)コード化は対応するフォトリンカープロセスとは異なるプロセスに従う。RAM−リンカーの第一級アミンの、タグ付き第二級アミンへの直接的変換には例えば式Rtag−CHOのタグ付きアルデヒドのセット(なお、このセットでは蛍光団の結合前の異なるアルデヒドの分子量が異なる)での還元的アルキル化ステップが要される(例えば、Brown, E., G. et al, Tetrahedron Letters (1997), 38(49), p. 8457−8460参照)(ステップ a))。用いうる種々のステップは脱保護したRink Amide樹脂をブロモ酢酸と反応させた後、式Rtag−NH2のタグ付き第一級アミンのセット(なお、このセットでは異なるアミンの分子量が異なる)での求核置換を行うことを含む(ステップa1)およびステップa2))。ここで得られた第二級アミンを蛍光団試薬Fmoc−AIDA−OHと結合させる(ステップb)。第一のコンビナトリアルステップ(リガンド反応−ステップd))はFmoc−AIDAの脱保護の後に始める(ステップc)。酸、例えばトリフルオロ酢酸などの強酸によるリンカーの酸開裂(ステップe))によって、以下のスキーム2に示されるように蛍光団コンジュゲートリガンドのアミドまたはN−(カルバモイルメチル)置換アミドを生じる。
【0026】
ステップa)、a1)、a2)、b)、c)およびd)に記載の反応はそれ自体公知であり、例えば常法に従って行えばよい。
【化3】
【0027】
もう1つの態様では本発明は、MS−スペクトログラフィーの使用により、本発明の式I、IV、VまたはVIの化合物においてタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含んでなる、包括的標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の構成ブロックの解読方法を提供する。
【0028】
包括的標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の第一のコンビナトリアルステップの解読のためのタグの読み取りは例えば以下のスキーム3(リガンドは式IV、VまたはVIのE)に示されているものなどの、例えば開裂した蛍光団コンジュゲートリガンド分子のLC/MSを用いて行うことができる。この質量スペクトルにはかかるコンジュゲートの分子量に関する情報が含まれる(MSはESI+: [MH]+で示す)。蛍光団コンジュゲートリガンドの分子量に関する知見は、小分子ライブラリーでは化合物のいくつかが同時に同じ公称質量を有することがあるので、構造の解読に十分でない場合が多い。このような場合、蛍光団の構造に関する必要な情報は用いたRtagの分子量を示す質量分析計のフラグメント化された分子イオン([MH]+)から得られる。これらのコンジュゲートはイオン化後のフラグメンテーションの好ましい開始点であるアミド結合を含む。かかる一組のフラグメントイオンはAIDA−蛍光団上のタグに関する十分な情報を持つ。望まれる情報はタグ付き蛍光団コンジュゲートの質量スペクトルでは数倍分かりやすくなり、例えばAIDA−蛍光団のフラグメント例が以下のスキーム3に示されている。MS/MS(CDI:衝突誘起解離)を、例えばスキーム3に示されているように、それらの分子イオン[MH]+によりフラグメントイオンの確認に用いる。
【化4】
【化5】
【0029】
もう1つの態様では本発明は、包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の1を超えるコンビナトリアルステップによって得られた構成ブロックを解読する方法であって、1を超える、例えば4までのコンビナトリアルステップで包括的蛍光(AIDA)標識化合物ライブラリーの分割−混合−分配生産を行い、MS−スペクトログラフィーを用いて本発明に記載の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含む方法を提供する。
【0030】
1回めのコンビナトリアルステップの部分的コード化は小さなAIDA標識ライブラリーの作製に有用であるだけではない。本発明のタグ残基による蛍光団によるタグ付けは、例えばコンビナトリアル・ケミストリーの公知のデコンヴォルーション戦略と組み合わせると、より大きなライブラリーの解読の有効な手段ともなる。この態様は以下のスキーム4に例示されているように、4段階のコンビナトリアルステップで合成されたライブラリー(例えば、ビーズ上)の分割・混合・分配で概略が示される。3回の連続したコンビナトリアルステップ(R1xR2xR3)はマザーライブラリーを実際に作り出し、これは4回目のコンビナトリアルステップで作り出されるドーターライブラリー(R1xR2xR3xR4)のソースとなる。また、例えば多様性の付加を目的とした官能基の変換を達成するために非コンビナトリアルステップも行える。
【0031】
2回目のコンビナトリアルステップ(R2)で得られる構成ブロックは、種々の分子量を有する反応物を用いることで、得られる構成ブロックが種々の分子量を有するように選択される。得られた3回目のコンビナトリアルステップ(R3)のタグ付きAIDAコンジュゲート構成ブロックは個別のバイアル(混合していない)で維持されることから、R3は解読する必要がない。3回目のコンビナトリアルステップで用いる構成ブロックの数は全ライブラリーのサブライブラリーの数を規定しうる。3回目のコンビナトリアルステップで得られたライブラリーはアリコートセットに分配するが、このアリコート数は4回目のコンビナトリアルステップ(R4)(ライブラリー由来のライブラリーステップ)で用いようとする構成ブロックの数により規定されうる。R4は個別に維持されるマザーライブラリーに対して等しい構造のドーターライブラリーを作り出すことから、R4は解読する必要がない。マザーライブラリーとそれから得られる全てのドーターライブラリーは同数のサブライブラリーを含み、各サブライブラリーは同数の化合物を含むと考えられる。最初の反応ステップをタグ付けし、R2で同重体がなく、R3でサブライブラリーを個別に維持し、続いてR4で分配すると、最後のコンビナトリアルステップの後に得られるライブラリーに含まれる全ての構造が、例えば単一のビーズから開裂された物質から得られた質量スペクトルデータに存在する分子イオン([MH]+)およびタグ情報([MH]+から導き出されたフラグメントイオンとして、例えば上記スキーム3参照)によって同時に同じ分子量を有する場合であっても、その構造の解読が可能となる。
【0032】
もう1つの態様では本発明は、包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の構成ブロックを解読する方法であって、
a) 第一のコンビナトリアルステップをタグ残基、例えばRtag、例えばビーズ上でタグ付けし、得られると予測される各構成ブロックに対して異なるバイアル中で第一のコンビナトリアルステップを行い、
b) 第一のコンビナトリアルステップで得られ、異なる構成ブロックを含有するバイアルの内容物を混合し、
c) 個々のバイアルの各構成ブロックについて、例えば種々の分子量を有する反応物を選択して使用することで、第二のコンビナトリアルステップの後に得られた構成ブロックがb)で得られる混合物中に種々の分子量を有するように第二のコンビナトリアルステップを行い、さらに所望により
d) ステップc)で得られたバイアルの内容物を混合し、個々のバイアルの各構成ブロックについて、第三のコンビナトリアルステップを行い、さらに所望により
e) ステップd)で得られた少なくとも1つ、好ましくは各々のバイアル中の各構成ブロックについて第四のコンビナトリアルステップを行い、さらに
f) MS−スペクトログラフィー、例えばMS/MS(生得誘起解離=CID)を用いて本発明の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含む方法を提供する。
【0033】
例えばコンビナトリアルステップが2回しか望まれない場合には、ステップc)およびd)は行う必要はなく、ステップc)およびd)は省かれる。
【化6】
【0034】
本発明のタグ付けは例えば上記のように解読に有用なだけでなく、さらにまた、それ以外では同じ非タグ付き化合物に対して、包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド(例えば本発明の化合物)の物理化学的特性に影響を及ぼし、例えば包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド(例えば本発明の化合物)の物理化学的特性を変化させるようなタグ残基を選択することで、包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えば式IV、VおよびVIなどのAIDAコンジュゲートリガンドの物理化学的特性を改質するためにも使用できる。
【0035】
もう1つの態様では本発明は、包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの物理化学特性の改変における、本発明のタグ残基を含む化合物の使用を提供する。
【0036】
このような使用の重要な適用としては、例えば包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの溶解度の向上が挙げられる。すでに記載したように、次に、樹脂ビーズ上のAIDAコンジュゲートリガンドに対する標的のビーズ上結合の陽性結果は単離したビーズからのコンジュゲートの開裂後に液相で確認(同定)することができる(例えば、AIDA技術に相当)。このように用いる溶媒系、例えば水性バッファー系における包括的蛍光標識コンジュゲートリガンドの溶解度の向上はしばしば有利である。特にAIDA蛍光団の1,3−ジフェニル−1H−インダゾール核は芳香環の含量が高いがゆえの疎水性部分であり、これによりAIDAコンジュゲートリガンドは非コンジュゲート型のものに比べて水への溶解度が低くなる。本発明によれば、例えば Rtag−アミン、Rtag−アルデヒドをはじめとするタグ残基セットは、それ以外では同じ非タグ付き化合物に比べて本発明のタグ付き化合物の溶解度を向上させるようなRtag残基を選択することで作り出される。
【0037】
もう1つの態様では本発明は、例えば非水性および水性溶媒(系)を含む溶媒系において包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの溶解度を向上させる上での、本発明のタグ残基を含む化合物の使用を提供する。
【0038】
発明者らは包括的蛍光標識コンジュゲートリガンド、例えばAIDAコンジュゲートリガンドの溶解度の特性として1−オクタノール/水の分配係数の対数計算値(clogP値)を用いた(例えば、Ghose, A. K., et al. J. Phys. Chem. A. (1998), 102(21), p. 3762−3772, o Chou, J. T., et al, J. Chem. Inf. Comput. Sci. (1979), 19(3), p. 172−178参照)。下記表1では、種々のタグ残基によるAIDA色素コンジュゲート(リガンドとしてジペプチドを有する)の水への溶解度の向上を示す。clogPが低いほど水に対する溶解度が高いことを意味する。
【表1】
【0039】
コンビナトリアル・ケミストリーは病態の治療用途を目的とした検討分子の合成のための有用な手段である。式IIおよびIIIの化合物は例えばタンパク質、例えば哺乳類において病態に影響を及ぼすことが分かっているタンパク質のビーズ上スクリーニングに使用できる。このようなタンパク質と結合することが見出された式IIおよびIIIの化合物は有用な医薬である。
【0040】
以下の実施例では、温度は全てセ氏度である。
また、以下の略号を用いる。
TFA:トリフルオロ酢酸
CID:衝突誘起解離
【0041】
実験
以下の表2に記載の化合物1〜26は以下に示すような式E1の化合物であり、実施例27〜30の化合物は以下に示すような式E2の化合物であり、化合物1〜3、5、8、9、15、24、26、27および29では、REはALA(β−アラニノイル)であり、化合物4、6、7、10〜14、16〜23、25、28および30では、REはLALA(L−アラニノイル)である。表2の化合物は、本明細書に記載のようにさらにRtagを導入すること以外はWO 00/37488に記載のものと同様にして製造することがきる。
【化7】
【表2】
【表3】
【表4】
【0042】
分析方法
用いたTentaGel樹脂(TentaGel S NH2; TentaGel S RAM; ビーズサイズ: 90μm;添加量:0.23〜0.26mmol/g樹脂)は公知のものであり、例えばRapp Polymere, Tuebingen, DEから入手できる。粗生成物の質量スペクトルはHewlett−Packard Series 1100 HPLCシステムに接続したFinnigan Thermo Quest Navigator LC/MSで測定すればよい。この質量分析計は(ESI+/ESI−)モードまたは(APCI+/APCI−)モードで行うオープンアクセスMSとして作動させればよい。サンプルのインジェクションはフローインジェクション分析モードで行えばよい。溶媒供給系はメタノール/アセトニトリル50/50(%v/v)であってもよい。HPLC分析は逆相Waters NovaPack RP18(5μm)カラム(3.9mm x 150mm)、254nm検出を用い、勾配は30分間で10〜100% B(A=H2O/0.1% TFA; B=CH3CN/0.1% TFA)、流速は1mL/分とし、Beckman System Goldにて行ってよい。これらの生成物はGeneVacエバポレーターシステムを用いて2ミリバールで真空乾燥させればよい。
【0043】
μ HPLC−MS/MS 分析
サンプルを溶媒、すなわち50%MeOH/50%H2O/0.05%TFAに再懸濁させる。これらのサンプルをFAMOSμ−サンプリングワークステーション(LC Packings, Amsterdam, NL)に入れ、そこからカラム、すなわちC18、2x0.8mmμ−ガードカラム(LC Packings)に接続したInertsil ODS−3、C18、5μm、50x0.8mmカラムへロードする。クロマトグラフィーは HP1100 HPLCシステム(Hewlett−Packard, Waldbronn, Germany)を用い、100μl/分で作動させて行う。HPLCポンプとFAMOSワークステーションのインジェクターの間にAcurateμ−フロープロセッサー(LC Packings)をインストールすることで流れを分割し、この逆相カラムに25μl/分の流れを作り出す。HPLC溶媒は、
A: 0.05% TFA/水
B: 96%アセトニトリル/0.05% TFA/水
である。12分間で10%〜80% Bの直線勾配をかけ、勾配の終わりに95%、3分の無勾配ステップを入れる。7分間の再平衡化ステップの後に次のサンプルをインジェクションする。カラム排出液を214nmに設定した検出器を備えたU−Z view 30nl flow cell(LC Packings)に通し、次にそこからフューズドシリカキャピラリー(外径340μmx内径50μm)を経て、エレクトロスプレーソースのLCQイオントラップ質量分析計(Finnigan Corp., San Jose, CA, USA)へ送り、3段階のスキャン内容からなる20分の一シリーズを行う(1:スキャンレンジを150〜2000amuに設定して質量測定を行うMSモード; 2: 最小要求シグナル100’000カウントの従属ズームスキャンモード; 3:衝突エネルギーを32%に設定し、単離幅を7amuに設定、選択イオン(最高イオンは約100’000カウント以上)のフラグメンテーションを行う従属MS/MSスキャンモード)。電源は4.5kVととし、加熱キャピラリーを220℃に、シース窒素ガスの流速を80に設定した。MSモードではイオン時間を500msに、目標イオン数を5x107に設定し、CIDモードではイオン時間を500msに、目標イオン数を2x107に設定した。両モードとも、マイクロスキャン/スペクトルを3回行う。電子増倍管は−1000Vに設定し、スペクトルは全て陽イオンモードでとる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例14の化合物のHPLC−spur(UV)を示す(保持時間:11.38分)
【図2】実施例14の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:0.05〜19.96分)。
【図3】実施例14の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:11.21〜11.61分)。
【図4】実施例14の化合物の分子イオン([MH+]=543)のMS/MSを示す(保持時間:11.61分)。
【図5】実施例15の化合物のHPLC−spur(UV)を示す(保持時間:11.76分;保持時間13.90分の化合物はTFA存在下の光化学開裂の際に形成された実施例15の化合物のトリフルオロアセチル化同族体である)。
【図6】実施例15の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:0.01〜19.93分)。
【図7】実施例15の化合物の全MSを示す(保持時間範囲:11.53〜12.15分)。
【図8】実施例15の化合物の分子イオン([MH+]=557)のMS/MSを示す(保持時間:11.97分)。
【図9】AIDA技術を加えたビーズ上スクリーニングの原理を示す。第一のコンビナトリアルステップでタグ付けされたコンビナトリアル化合物ライブラリーの樹脂ビーズ(Rtag;1ビーズ1化合物)を蛍光色素で標識した標的(例えばタンパク質)に曝す。ビーズ検査中には標的上の色素の励起波長はAIDA蛍光団(サイレントAIDA)に対し直交させる。標識された標的に結合したビーズを回収する(単一ビーズ採取)。AIDA−Rtag−コンジュゲートライブラリー化合物(リガンド)をその単一ビーズから開裂させる。次にビーズ上結合の結果を、蛍光分光光度法で非標識標的とR−tag−AIDAコンジュゲート化合物との相互作用を調べることにより液相中で確認および定量する。確認された活性については、活性リガンドの構造の解読(MWとRtag読み取り)のために単一ビーズLC/MSを行う。
Claims (11)
- 式
A−B−D−X−D’−E II
の化合物、または式
A−B−D−E−D’−X III
の化合物
{式中、
Aは固相および液相有機化学で適用される標準的な物質に由来する、固相支持体の残基であり、
Bは式IIの化合物または式IIIの化合物を開裂させてそれぞれD−X−D’−E、またはD−E−D’−X断片を遊離する基を有するリンカー残基であり、
DおよびD’は互いに独立に結合またはスペーサー残基であり、
Eはコンビナトリアル・ケミストリーによって生成された検討分子の残基であり、かつ、 Xは蛍光色素の残基である。}
であって、少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式IIまたは式IIIの化合物。 - 式
D−X−D’−E IV、または
D−E−D’−X V、または
E−D’−X VI
{式中、EおよびXは請求項1に記載の通りであり、DおよびD’は互いに独立にスペーサーの残基であるか、または結合であるか、または存在しない。}
の化合物であって、少なくとも1つのタグ残基によってタグ付けされることを特徴とする、式IVまたは式Vまたは式VIの化合物。 - 式I
{式中、
R1およびR2の一方、ならびにR3およびR4の一方が水素であり、もう一方のR1またはR2、およびR3またはR4が互いに独立に
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONRtag(CH2)nOH、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NHRtag、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12、Cl、Br、F、−CF3、非置換アルコキシおよび
アリール、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtaH
により置換されたアルコキシ、非置換アルキルまたは
−COOH、−COOR7、−CONRtagH、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNRtagH、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNRtagH
により置換されたアルキルであり;
R5およびR6が水素であるか、あるいはR5およびR6の一方が水素であって、他方が水素、ハロゲン、非置換アルコキシまたは
−アリール、−NO2、−NR10R11、−NRtagCOR12
により置換されたアルコキシ、非置換アルキルまたは
−COOH、−COOR7、−CONHRtag、−CONR8R9、−CONRtag(CH2)nOH、−CH2OH、−CH2NHRtag、−N=C=O、−N=C=S、−SO3H、−SO2NRtag(CH2)nNH2、−SO2NH(CH2)nNHRtag、−CONRtag(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNHRtag
により置換されたアルキルであり;
n=2〜8であり、
R7がカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基であり、
R8およびR9が、それらが結合している窒素原子とともにヘテロシクリルを形成し(ただし、ピペラジンは除く);
R10およびR11が互いに独立に水素またはRtagであり;
R12がアルキル、アリール、アラルキル、非保護もしくは保護アミノまたはハロゲンであり;
Rtagが水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、ヘテロシクリルアルキルであり(ただし、非置換メチルおよび非置換シクロプロピルメチルは除く);
ただし、式Iの化合物では、
少なくとも1つのRtagが存在し、
少なくとも1つのRtagが水素以外のものであり、かつ、
1つまたは2つのさらなる反応物と共有結合する能力を有する、R1、R2、R3、R4、R5およびR6の意味において少なくとも1つの官能基が存在する。}
で示される化合物。 - スクリーニングプロセスの解読ステップにおける、請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 通常用いられる光開裂性リンカー上で包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)を合成する方法であって、蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが部分的にコード化され、少なくとも1つのタグ残基と結合した化合物セット(なおこの化合物セットは、タグ残基が種々の分子量を有する請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物からなる)を提供することを含む、方法。
- 通常用いられる酸開裂性リンカー上で包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)を合成する方法であって、蛍光標識ライブラリーの第一のコンビナトリアルステップが部分的にコード化され、少なくとも1つのタグ残基と共有結合した本発明の化合物セット(なおこの化合物セットは、タグ残基が種々の分子量を有する請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物からなる)を提供することを含む、方法。
- 包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の構成ブロックを解読する方法であって、MS−スペクトログラフィーを用いて請求項1から3のいずれか1項に記載の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基を読み取ることを含む、方法。
- 包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の1を超えるコンビナトリアルステップによって得られた構成ブロックを解読する方法であって、1を超えるコンビナトリアルステップで包括的蛍光(AIDA)標識化合物ライブラリーの分割−混合−分配生産を行い、MS−スペクトログラフィーを用いて請求項1から3のいずれか1項に記載の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基、例えばRtagを読み取ることを含む、方法。
- 包括的蛍光標識ライブラリー(AIDA−ライブラリー)の構成ブロックを解読する方法であって、
a) 第一のコンビナトリアルステップをタグ残基でタグ付けし、得られると予測される各構成ブロックに対して異なるバイアル中で第一のコンビナトリアルステップを行い、
b) 第一のコンビナトリアルステップで得られ異なる構成ブロックを含有するバイアルの内容物を混合し、
c) 個々のバイアルの各構成ブロックについて、第二のコンビナトリアルステップの後に得られた構成ブロックがb)で得られる混合物中に種々の分子量を有するように第二のコンビナトリアルステップを行い、さらに所望により
d) ステップc)で得られたバイアルの内容物を混合し、個々のバイアルの各構成ブロックについて、第三のコンビナトリアルステップを行い、さらに所望により
e) ステップd)で得られた少なくとも1つのバイアル中の各構成ブロックについて第四のコンビナトリアルステップを行い、さらに
f) MS−スペクトログラフィーを用いて請求項1から3のいずれか1項に記載の式I、IV、VまたはVIの化合物におけるタグ残基を読み取ることを含む、方法。 - 包括的蛍光標識コンジュゲートリガンドの物理化学特性の改変における、請求項1から3のいずれか1項に記載のタグ残基を含む化合物の使用。
- 包括的蛍光標識コンジュゲートリガンドの溶解度の向上における、請求項10に記載の使用。
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