ES2966887T3 - Soluciones de conservación - Google Patents
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Abstract
Se describe una solución de conservación para la conservación de células, tejidos y/u órganos, comprendiendo dicha solución: (i) agua para inyección; (ii) al menos un sacárido; (iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH; (iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio; (v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y (vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina; siempre que la acetamida esté ausente y/o si la aspirina esté presente, la glutamina esté ausente y si la glutamina esté presente, la aspirina esté ausente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Soluciones de conservación
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una solución de conservación o una solución de conservación de almacenamiento en frío para mantener viables las células sin suministro de sangre, al uso de las mismas para prevenir daños a las células, tejidos y/u órganos en trasplantes, cirugía, experimentalmente ein vitro,a un método de conservación, lavado o conservación por lavado, a un método de tratamiento, a un método para su preparación y a un kit de piezas que comprende la solución.
Más particularmente, la presente invención se refiere a una solución de conservación o a una solución de conservación para almacenamiento en frío, comprendiendo dicha solución:
(i) agua para inyectables; (ii) al menos un sacárido; (iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH; (iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio; (v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y (vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina; con una cantidad reducida de productos de degradación de la aspirina y la glutamina, tal como acetamida, ácido acético y/o amonio.
Antecedentes de la invención
El trasplante de órganos ahora está disponible para riñón, hígado, corazón, pulmón, páncreas e intestino. En el momento de la extracción, el órgano trasplantado se lava a través de su vasculatura con una solución de conservación. Esta solución está diseñada para facilitar la reducción de la temperatura del órgano, prevenir la inflamación celular, eliminar los radicales libres de oxígeno, controlar el pH, reducir el daño isquémico, ampliar el tiempo seguro durante el cual los órganos pueden mantenerse fuera del cuerpo y facilitar la recuperación del órgano tras la reperfusión.
Belzer introdujo importantes soluciones de lavado en 1967 y Collins en 1969, posteriormente modificadas a Euro-Collins (CE), Marshall (1976), Bretschneider (véase Isemer et al. 1988) y otros. La solución de la Universidad de Wisconsin (UW), la más exitosa de todas las soluciones, fue introducida en 1988 por Belzer y sus colegas. Sigue existiendo la necesidad de mejorar la conservación para lavado y la conservación para el almacenamiento en frío. Una evidencia abrumadora indica que un injerto de alta calidad proporciona una mejor función inmediata y una vida útil más larga del injerto.
Andrews y Coffey en 1982 y Coffey y Andrews en 1983 demostraron que una solución de lavado simple que contenía sólo fosfato de sodio y sacarosa protegía la morfología de los túbulos renales del daño isquémico.
La solicitud de patente internacional n.° WO 02/41696 (Potts, Lodge) describe una solución de conservación de lavado para la conservación de células en ausencia de suministro de sangre, en donde dicha solución comprende:
agua para inyectables;
al menos un sacárido, tal como un monosacárido, disacárido, trisacárido o polisacárido;
al menos un componente con propiedades tampón de pH (es decir, un tampón de pH);
al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio (es decir, un bloqueante del transporte de calcio);
opcionalmente un aminoácido, tal como glutamina; y
opcionalmente un inhibidor de tromboxano para prevenir la coagulación de la sangre, tal como aspirina.
En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de una solución de conservación eficaz, comercialmente viable y mejorada que permita una conservación prolongada de las células, tejidos y órganos, incluyendo células, tejidos y órganos diseñados genéticamente, lo que proporciona una mayor versatilidad, efectividad y reperfusión en trasplantes, en cirugías, incluyendo cualquier situación de isquemia fría o caliente, tal como el trasplante de hígado, riñón, de intestino delgado y/o de páncreas; de extremidades completas, de cuerpo entero o en experimentación.
Sumario de la invención
Los inventores han descubierto que la aspirina (aspirina es el nombre común del ácido acetilsalicílico) en la solución de la técnica anterior del documento WO 02/41696 se degrada para producir ácido salicílico, mientras que la glutamina se degrada a ácido glutámico.
La degradación de la aspirina producirá ácido salicílico y ácido acético, mientras que la degradación de la glutamina producirá ácido glutámico y amoníaco. Asimismo, los inventores han descubierto que tanto el ácido acético como el amoníaco no son deseables en una solución de conservación, ya que ambos son potencialmente dañinos para las células, tejidos y órganos; y es probable que generen olores nocivos, lo que puede aumentar durante el almacenamiento de la solución de conservación. Adicionalmente, los inventores han descubierto que con el tiempo el ácido acético y el amoníaco pueden reaccionar juntos en la solución de la técnica anterior del documento WO 02/41696, para formar acetamida. La acetamida se reconoce como irritante de la piel y como una sustancia peligrosa que puede dañar el hígado.
Por lo tanto, reemplazando la aspirina con ácido salicílico y/o reemplazando la glutamina con ácido glutámico, o sus sales, la cantidad de ácido acético y/o amoníaco respectivamente generado, puede minimizarse o eliminarse por completo. En los ejemplos, se demuestra que el uso de la solución de la invención para conservación reduce el daño a las células y tejidos durante la conservación en comparación con soluciones comparativas.
En la solución de la técnica anterior, se añade aspirina como inhibidor antiinflamatorio del tromboxano. Los inventores han descubierto que si se omite la aspirina y se añade ácido salicílico, el ácido salicílico tiene propiedades antiinflamatorias (es decir, es un antiinflamatorio). Asimismo, en la solución de la técnica anterior, se añade glutamina como molécula de soporte que puede proporcionar energía. Los inventores han descubierto que si se omite la glutamina se puede sustituir por ácido glutámico que actuará como sustrato energético alternativo para las células, tejidos y/u órganos.
Adicionalmente, los inventores han descubierto que dado que la nueva solución de la presente invención ya no representa ninguna preocupación sobre la degradación de la aspirina y/o la glutamina, las cantidades de los componentes de sustitución, por ejemplo, ácido salicílico y/o ácido glutámico, se pueden reducir en consecuencia.
Por lo tanto, según un primer aspecto de la invención se proporciona una solución de conservación para la conservación de células, tejidos y/u órganos, en ausencia de suministro de sangre, comprendiendo dicha solución:
(i) agua para inyectables;
(ii) al menos un sacárido, tal como un monosacárido, disacárido, trisacárido o polisacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina; siempre que no hay acetamida y hay aspirina, hay glutamina y, si hay glutamina, no hay aspirina; y
si hay aspirina, entonces no hay amoníaco; y si hay glutamina, entonces no hay ácido acético.
El experto en la técnica entenderá que el término "ausente" o "sustancialmente ausente" significa por debajo de una concentración farmacológicamente activa; o ninguna detectable mediante métodos convencionales conocidos en la técnica. Dichos métodos incluirán, pero sin limitaciones, ensayos colorimétricos y GCMS.
El ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina, (v) sirve adecuadamente para prevenir la coagulación de la sangre. Adecuadamente, la solución de conservación comprende una cantidad de ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina (v) para prevenir la coagulación de la sangre.
El ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, (vi) sirve adecuadamente como sustrato energético. Adecuadamente, la solución de conservación comprende una cantidad de ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina (vi) para servir como sustrato energético.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una solución de conservación para la conservación de células, tejidos y/u órganos, comprendiendo dicha solución:
(i) agua para inyectables;
(ii) al menos un sacárido, tal como un monosacárido, disacárido, trisacárido o polisacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina;
en donde (v) es aspirina y (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o (vi) es glutamina y (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; ; y si hay aspirina, entonces no hay amoníaco; y si hay glutamina, entonces no hay ácido acético.
Preferentemente, la solución de conservación comprende una mezcla de (i) a (vi) como se describe en el presente documento, proporcionando así dicha solución de conservación en la que la acetamida está ausente. Por ejemplo, uno de aspirina y glutamina está presente y acetamida está ausente y/o uno de ácido acético y amoníaco está presente y acetamida está ausente, o ambos de aspirina y glutamina, y ambos de ácido acético y amoníaco están ausentes, y acetamida está ausente.
La invención proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento para la conservación de células, tejidos y/u órganos, en ausencia de suministro de sangre.
En realizaciones del presente documento se proporciona una solución de conservación preparada que comprende una solución de conservación como se describe en el presente documento, en donde la acetamida está ausente, por ejemplo uno de aspirina y glutamina está presente y acetamida está ausente y/o uno de ácido acético y amoníaco está presente y acetamida está ausente, o ambos de aspirina y glutamina, y ambos de ácido acético y amoníaco están ausentes, y acetamida está ausente.
La solución de conservación preparada puede envasarse para su almacenamiento, por ejemplo, en condiciones anóxicas, en ausencia de luz ultravioleta. La solución de conservación preparada descrita en el presente documento es estéril y se envasa para su almacenamiento en condiciones anóxicas en ausencia de luz ultravioleta.
Según un aspecto de la invención, la solución de conservación es una solución de conservación de lavado.
Según otro aspecto de la invención, la solución de conservación es una solución de conservación para almacenamiento en frío.
En una realización, (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; y
(vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina;
siempre que no haya aspirina, preferentemente, aspirina y acetamida están ausentes y/o ácido acético y acetamida están ausentes;
siempre que si hay glutamina presente, entonces el ácido acético no está presente.
En otra realización, (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal;
siempre que la glutamina esté ausente, preferentemente están ausentes glutamina y acetamida y/o están ausentes amoníaco y acetamida;
siempre que si hay aspirina presente, entonces no hay amoníaco presente.
En otra realización, (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; y
(vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal;
siempre que no hay glutamina ni aspirina presentes, preferentemente también está ausente acetamida y/o ácido acético, amoníaco y acetamida están ausentes.
En una solución de conservación preferida de la invención, la aspirina se reemplaza por ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y la glutamina se reemplaza por ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, de modo que tanto la aspirina como la glutamina están sustancialmente ausentes de la solución, preferentemente también está ausente acetamida y/o ácido acético, amoníaco y acetamida están ausentes.
En otra realización de la invención se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y/o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y/o glutamina;
siempre que si hay aspirina presente, la glutamina y el amoníaco estén ausentes y si hay glutamina presente, la aspirina y el ácido acético estén ausentes y/o en donde si hay aspirina y/o acetamida y/o ácido acético presentes, la cantidad de ácido salicílico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la aspirina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquier ácido acético y de cualquier acetamida presente; y en donde si hay glutamina y/o acetamida y/o amoníaco presentes, la cantidad de ácido glutámico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la glutamina, determinado por la suma de las cantidades de cualquiera de amoníaco y de acetamida presentes,
Concretamente, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y/o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y/o glutamina; siempre que (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y aspirina y/o
(vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina;
siempre que si hay aspirina presente, la glutamina está ausente y si hay glutamina presente, la aspirina está ausente; y/o
en donde si hay aspirina y/o acetamida y/o ácido acético presentes, la cantidad de ácido salicílico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la aspirina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquier ácido acético y de cualquier acetamida presente; y
en donde si hay glutamina y/o acetamida y/o amoníaco presentes, la cantidad de ácido glutámico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la glutamina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquiera de amoníaco y de acetamida presentes.
También se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y, opcionalmente además, aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y/o glutamina; siempre que hay acetamida ausente y/o si hay aspirina presente, la glutamina y el amoníaco están ausentes y si hay glutamina presente, la aspirina y el ácido acético estén ausentes; o
en donde si hay aspirina y/o acetamida y/o ácido acético presentes, la cantidad de ácido salicílico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la aspirina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquier ácido acético y de cualquier acetamida presente; y/o
en donde si hay glutamina y/o acetamida y/o amoníaco presentes, la cantidad de ácido glutámico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la glutamina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquiera de amoníaco y de acetamida presentes.
Se proporciona además una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y, opcionalmente además, aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y/o glutamina;
con la condición de que: cuando (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y la aspirina está ausente, (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y, opcionalmente además, aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y/o glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y/o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y opcionalmente además, glutamina;
siempre que la acetamida está ausente y/o si la aspirina está presente, la glutamina está ausente y si la glutamina está presente, la aspirina está ausente;
o en donde si está presente glutamina y/o acetamida y/o amoníaco, la cantidad de ácido glutámico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la glutamina, determinado por la suma de las cantidades de cualquier amoníaco y cualquier acetamida presentes y
en donde si hay aspirina y/o acetamida y/o ácido acético presentes, la cantidad de ácido salicílico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la aspirina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquier ácido acético y de cualquier acetamida presentes.
Según este aspecto de la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y/o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y opcionalmente además, glutamina;
con la condición de que: cuando (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal y la glutamina está ausente, (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y aspirina. Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y, opcionalmente además, glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y/o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y glutamina.
Según la invención, se proporciona una solución de conservación como se describe en el presente documento que comprende:
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal.
Para evitar dudas, el experto en la técnica entenderá que la referencia en el presente documento a células, tejidos y órganos, incluirá células, tejidos y órganos diseñados genéticamente.
En un aspecto de la invención, al menos un componente con propiedades de bloqueo del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio está presente en la solución de conservación de la invención.
En otro aspecto de la invención, el componente con propiedades de bloqueo del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio está ausente de la solución de conservación de la invención.
En un aspecto en la solución de conservación de la invención, la cantidad de ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, suficiente para prevenir la coagulación de la sangre, es inferior a 0,5 mmol/l, por ejemplo de aproximadamente 0,025 a menos de 0,3 mmol/l. De forma alternativa, la cantidad de ácido salicílico suficiente para prevenir la coagulación de la sangre, es de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 0,275 mmol/l, preferentemente aproximadamente 0,25 mmol/l de ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal.
De forma alternativa, la aspirina, si está presente, está adecuadamente presente en una cantidad de aproximadamente 0,3 mmol/l a aproximadamente 1,0 mmol/l, por ejemplo 0,5 mmol/l.
En otro aspecto en la solución de conservación de la invención, la cantidad de ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, presente es inferior a 20 mmol/l. De forma alternativa, la cantidad de ácido glutámico presente es de aproximadamente 2 a menos de 15 o de aproximadamente 15 a menos de 20, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 mmol/l, preferentemente aproximadamente 3 mmol/l de ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal.
Alternativamente, la glutamina, si está presente, está adecuadamente presente en una cantidad de aproximadamente 15 mmol/l a aproximadamente 30 mmol/l, por ejemplo aproximadamente 20 mmol/l. De forma alternativa, la cantidad de glutamina presente es de aproximadamente 2 a menos de 15 mmol/l.
Las sales del ácido salicílico y/o del ácido glutámico, que pueden ser iguales o diferentes, serán sales farmacológicamente aceptables, esto es, sales que poseen la actividad farmacológica deseada del compuesto original. Concretamente, dichas sales no serán tóxicas para las células, tejidos y/u órganos. Tales sales generalmente se formarán cuando un protón ácido presente en el ácido salicílico y/o el ácido glutámico se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino y un ion alcalinotérreo. A modo de ejemplo solamente, las sales de metales alcalinos incluyen sodio o potasio y similares. A modo de ejemplo solamente, las sales de metales alcalinotérreos incluyen calcio o magnesio y similares.
La solución de lavado puede consistir únicamente en estos componentes, en cuyo caso es adecuado para la conservación del funcionamiento y tipos de células universales, en particular para la conservación de sistemas celulares simples, alternativamente, puede proporcionarse junto con uno o más sustituyentes adicionales específicamente adecuados para la conservación de un tipo o función de célula deseada, en particular en la conservación de sistemas celulares complejos tales como órganos o tejidos vivos, más particularmente para animales pequeños o grandes, más particularmente órganos humanos, tales como el hígado, riñón, de intestino delgado y/o de páncreas; y tejido vivo.
Según este aspecto de la invención se proporciona una solución de conservación para conservación de hígado, riñón, intestino delgado y páncreas que comprende una combinación de
(i) agua para inyectables;
(ii) un disacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) al menos un bloqueador de canales o transporte de calcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento; junto con un anión secuestrante impermeable, solutos inorgánicos, componentes eficaces contra radicales libres de oxígeno y un osmótico coloidal, y cualquier componente adicional opcional como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Además se proporciona una solución de conservación para la conservación de hígado, riñón, intestino delgado y páncreas que comprende una combinación de
(i) agua para inyectables;
(ii) sacarosa;
(iii) Na2HPO4 y NaH2PO4;
(iv) diltiazem;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento; junto con ácido lactobiónico, KOH y NaOH, glutatión y alopurinol y PEG, y cualquier componente adicional opcional como se ha definido anteriormente en el presente documento.
La solución de conservación de la presente invención tiene una serie de ventajas en términos de mejorar las soluciones existentes, con daños reducidos durante la conservación, debido a la ausencia de amoníaco y ácido acético tóxicos, y a la posibilidad de ampliar los periodos de conservación, además de proporcionar un kit a partir del cual crear una solución particular deseada, con la conveniencia asociada y las implicaciones de costes que harán que dicha solución sea comercialmente viable.
La presente invención ha descubierto que la solución de conservación definida en el presente documento es universalmente aceptable, basado en experimentos y sin intentar racionalizar el mecanismo de conservación subyacente.
Todos los componentes de la solución de conservación de la presente invención satisfacen los estándares de pureza de la farmacopea nacional o internacional, cuando corresponda. El agua para inyectables normalmente se purifica y desioniza antes de la esterilización.
Se selecciona un sacárido de sacarosa, rafinosa y manitol; y combinaciones de los mismos. Un sacárido preferido es sacarosa. Un sacárido puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 50 mmol/l a aproximadamente 150 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 100 mmol/l.
Un tampón de pH se selecciona entre un tampón de fosfato sódico, un tampón de fosfato de potasio y similares, preferentemente Na2HPO4, NaH2PO4, K2HPO4, KH2PO4 y similares; y combinaciones de los mismos. Un tampón de pH puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 15 mmol/l a aproximadamente 75 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 15 mmol/l a aproximadamente 20 mmol/l o de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 mmol/l.
La solución de conservación de la invención se formula preferentemente para cumplir con un intervalo deseado de propiedades físicas aceptables por la farmacopea. Preferentemente, la solución tiene un pH en el intervalo de 6,5-7,8, más preferentemente 6,5-7,0, lo más preferentemente de 6,8-7,0. El pH generalmente se mide a temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente un 20 °C.
Un bloqueador del transporte de calcio o agente de actividad anticalcio opcionalmente añadido se selecciona de cualquier bloqueador del transporte o canal de calcio conocido, tal como nicardipino, diltiazem, verapamilo, nisoldipino, clorpromazina o trifluorperazina; y combinaciones de los mismos y metabolitos de los mismos. Preferentemente, un bloqueador de canales o transporte de calcio es nicardipino y/o diltiazem; o metabolitos de los mismos. Un bloqueador de canales o transporte de calcio puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,0005 mmol/l a aproximadamente 1,0 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 mmol/L. Cuando el transportador de calcio o bloqueador de canales es nicardipino, el nicardipino puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,0005 mmol/l a aproximadamente 1,0 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 mmol/L. Cuando el transportador de calcio o bloqueador de canales es diltiazem, diltiazem puede estar presente en una cantidad de 0,0005 mmol/l a aproximadamente 1,0 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 0,022 mmol/L.
Sin pretender quedar ligados a esta teoría, en el presente documento se hace referencia a los componentes por función, según la actividad farmacológica y fisiológica comúnmente aceptada, sin embargo, para evitar dudas, los componentes enumerados pueden contribuir con una función adicional o diferente a la atribuida, y esto no debe verse como una limitación de la misma. De manera adicional, se pueden considerar equivalentes funcionales a los enumerados dentro del alcance de la presente invención.
Otros componentes pueden estar presentes en la solución de conservación. Otros componentes, a menos que se indique de otro modo, normalmente estarán presentes en cantidades menores, por ejemplo en el intervalo de hasta 1 mmol/l.
Preferentemente, la solución de conservación de la invención comprende uno o más componentes adicionales seleccionados entre:
al menos un anión que es en gran medida impermeable al interior de las células, preferentemente es un anión secuestrante impermeable; y
al menos un componente con propiedades osmóticas coloidales (es decir, un osmótico coloidal).
Un anión secuestrante impermeable comprende preferentemente lactobionato o ácido lactobiónico. Cuando está presente un anión secuestrante impermeable, puede estar en una cantidad de aproximadamente 15 mmol/l a aproximadamente 75 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 15 mmol/l hasta aproximadamente 20 mmol/l o de aproximadamente 40 mmol/l hasta aproximadamente 70 mmol/l.
Un osmótico coloidal se selecciona preferentemente entre polietilenglicol (PEG), gelatina succinilada (como en Gelofusine), Ficoll (un polisacárido) y un producto de almidón; y combinaciones de los mismos. Cuando está presente un componente con propiedades osmóticas coloidales, puede estar en una cantidad de aproximadamente 0,5 mmol/L a aproximadamente 3,0 mmol/L, por ejemplo de aproximadamente 0,75 mmol/l a aproximadamente 1,33 mmol/l, tal como, aproximadamente 1,0 mmol/l y 20.000 de PM.
Como alternativa o adicionalmente, la solución de conservación de la invención puede comprender uno o más componentes seleccionados entre:
solutos inorgánicos u orgánicos;
un componente o componentes con propiedades quelantes de calcio (es decir, un quelante de calcio); y un componente o componentes con propiedades quelantes de hierro (es decir, un quelante de hierro).
Preferentemente, un soluto inorgánico u orgánico comprende un soluto inorgánico y es un electrolito que incluye cationes y/o aniones, por ejemplo seleccionados entre Na+, K+, Cl", OH- y similares; y combinaciones de los mismos. En un aspecto preferido de la invención, el soluto es un soluto inorgánico, tal como NaCl. Cuando está presente un soluto inorgánico u orgánico, puede estar en una cantidad de aproximadamente 15 mmol/l a aproximadamente 75 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 15 mmol/l hasta aproximadamente 20 mmol/l o de aproximadamente 40 mmol/l hasta aproximadamente 70 mmol/l.
Preferentemente, un quelante de calcio comprende citrato o EGTA (etilenglicol-bis(P-aminoetil éter)-ácido N,N,N',N'-tetraacético) y un quelante de hierro comprende EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).
Como alternativa o adicionalmente, la solución de conservación de la invención puede comprender uno o más componentes seleccionados entre:
uno o más aminoácidos (adicionales), además de ácido glutámico y/o glutamina;
al menos un componente que es eficaz contra los radicales libres de oxígeno o la producción de radicales libres de oxígeno;
al menos un componente del sistema de suministro de energía o que influye en el sistema de suministro de energía o en un cuerpo cetónico; y
al menos un componente que tiene una acción crioprotectora.
Preferentemente, un aminoácido adicional se selecciona entre glicina y n-acetilcisteína, y una combinación de los mismos. Cuando está presente un componente de aminoácido adicional, puede estar en una cantidad de aproximadamente 1 mmol/L a aproximadamente 30 mmol/L, preferentemente de aproximadamente 3 mmol/l a aproximadamente 12 mmol/l, por ejemplo aproximadamente 10 mmol/l.
Preferentemente, los inhibidores de radicales libres de oxígeno se seleccionan entre alopurinol y glutatión reducido, más preferentemente una combinación de los mismos. Cuando está presente un componente eficaz contra los radicales libres de oxígeno, puede estar en una cantidad de aproximadamente 0,2 mmol/L a aproximadamente 5 mmol/L, por ejemplo, de aproximadamente 3 mmol/l a aproximadamente 5 mmol/l. En general, la cantidad de inhibidores de radicales libres de oxígeno definida en el presente documento se refiere a la cantidad total de inhibidores de radicales libres de oxígeno. Por ejemplo, cuando los inhibidores de radicales libres de oxígeno comprenden una combinación de alopurinol y glutatión reducido, la cantidad de inhibidores de radicales libres de oxígeno combinados puede ser de aproximadamente 0,2 mmol/l a aproximadamente 5 mmol/l, etc.
Preferentemente, un componente del sistema de suministro de energía comprende adenosina. Cuando un componente de suministro de energía está presente, puede estar en una cantidad de hasta aproximadamente 20 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mmol/l, tal como de aproximadamente 5 mmol/l.
Preferentemente un cuerpo cetónico comprende beta-hidroxibutirato.
Los crioprotectores son compuestos que, cuando están presentes en solución, pueden reducir o inhibir la formación de cristales de hielo en soluciones expuestas a temperaturas inferiores a 0 °C. Por lo tanto, el uso de un crioprotector permite que las células, tejido u órgano que se va a almacenar a una temperatura de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 4 °C. Preferentemente un crioprotector se selecciona entre un glicol tal como propilenglicol, DMSO, un sacárido, un carbohidrato, un lípido, un glicolípido. tal como xilomanano, una glucoproteína, proteína o polipéptido o un poliol; o una combinación de los mismos. Cuando hay un crioprotector presente, puede estar en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg/ml.
Como alternativa o adicionalmente, la solución de conservación de la invención puede comprender componentes adicionales para una función específica seleccionada entre:
al menos un componente del sistema de transducción de señales intracelulares o que modifica este sistema, preferentemente un inhibidor de proteína quinasa o un inhibidor de calmodulina; y
al menos un componente que tiene una acción estabilizadora de membrana, preferentemente ranolazina y similares.
Preferentemente, un componente sacárido (ii) está presente en una cantidad en el intervalo de 50-150 mmol/l, por ejemplo, aproximadamente 100 mmol/l;
el componente tampón de pH (iii) está presente en una cantidad total en el intervalo de 15-75 mmol/l, por ejemplo aproximadamente 15-20 o 40-70 mmol/l;
el anión secuestrante impermeable está presente en una cantidad total en el intervalo de 15-75 mmol/l, por ejemplo aproximadamente 15-20 o 40-70 mmol/l;
el componente de soluto inorgánico u orgánico está presente en una cantidad total en el intervalo de 15-75 mmol/l, por ejemplo aproximadamente 15-20 o 40-70 mmol/l;
el componente de aminoácido adicional está presente en una cantidad en el intervalo de 5-30 mmol/l, preferentemente 5-12 mmol/l, por ejemplo aproximadamente 10 mmol/l;
el componente eficaz contra los radicales libres de oxígeno está presente en una cantidad total en el intervalo de hasta 5 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 3-5 mmol/l;
el componente de suministro de energía está presente en una cantidad en el intervalo de hasta 20 mmol/l, por ejemplo 5 mmol/l;
el componente con propiedades osmóticas coloidales está presente en una cantidad en el intervalo de 0,5 3,0 mmol/l, por ejemplo, de aproximadamente 0,75-1,33 mmol/l, tal como 1,0 mmol/l y 20.000 PM;
cuando el componente con propiedades bloqueadoras del transporte de calcio (iv) está presente, el agente bloqueador del transporte de calcio puede ser, por ejemplo, nicardipino o diltiazem. La nicardipino puede estar presente en una cantidad en el intervalo de 0,0005 a 1,0 mmol/l, por ejemplo, 0,005 mmol/l; y diltiazem puede estar presente en una cantidad en el intervalo de 0,0005-1,0 mmol/l, por ejemplo, 0,022 mmol/l.
En el caso de ciertos componentes presentes como 2 o más tipos, las cantidades relativas pueden ser críticas o no críticas. Un componente preferido eficaz contra los radicales libres de oxígeno es aproximadamente 3 mmol/l de glutatión reducido y de 0,35 a 0,4, más preferentemente 0,4 mmol/l de alopurinol.
Un componente de soluto inorgánico u orgánico preferido comprende electrolitos como sigue:
Na+ 15-150 mmol/l, por ejemplo, 30 mmol/l
K+ 0-25 mmol/L, por ejemplo, 15 mmol/L
Cl- 0-100 mmol/L
OH- 0-75 mmol/l
Preferentemente, una solución según la invención se prepara y almacena en condiciones anóxicas en ausencia de luz UV.
Es una ventaja particular que la solución definida que comprende los componentes (i)-(vi) se pueda almacenar durante períodos prolongados y que los componentes adicionales necesarios para uso clínico (por ejemplo, heparina) se puedan añadir inmediatamente antes de su uso. Es especialmente una ventaja de la solución de la presente invención que la solución puede almacenarse durante períodos prolongados sin que se generen productos de degradación indeseables. Más en particular, la solución puede almacenarse sin generar uno o ambos de ácido acético y amoníaco, y sin generar acetamida.
De forma alternativa, la solución puede almacenarse con la generación de uno o ambos de ácido acético y amoniaco, y/o con la generación de acetamida, en cantidad menor que el equivalente molar de ácido salicílico y ácido glutámico respectivamente.
La solución de conservación de la invención, tal como se define en el presente documento, comprende preferentemente los componentes básicos (i)-(vi) junto con componentes adicionales para una función específica. La solución para la conservación de órganos es particularmente más compleja que la utilizada para la conservación de sistemas celulares simples, sin embargo, los inventores han descubierto que la solución puede ser relativamente sencilla.
Preferentemente, una solución de conservación para órganos intraabdominales, tales como riñón, hígado y páncreas; y también intestino e intestino delgado y similares; comprende los componentes (i)-(vi) tal como se definen en el presente documento junto con al menos un componente seleccionado de un componente aniónico secuestrante impermeable; y un componente con propiedades osmóticas coloidales; y más preferentemente, adicionalmente uno o más componentes seleccionados entre:
componente de soluto inorgánico u orgánico;
un componente de aminoácido adicional;
un componente eficaz contra los radicales libres de oxígeno; y
un componente de suministro de energía.
Preferentemente, una solución de conservación para conservación del hígado, riñón, intestino delgado y páncreas comprende una combinación:
(i) agua para inyectables;
(ii) un disacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) al menos un bloqueador de canales o transporte de calcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento; junto con un anión secuestrante impermeable, solutos inorgánicos, componentes eficaces contra radicales libres de oxígeno y un osmótico coloidal, y cualquier componente adicional opcional como se define en el presente documento;
más preferentemente una combinación de
(ii) agua para inyectables;
(ii) sacarosa;
(iii) Na2HPO4 y NaH2PO4
(iv) diltiazem o nicardipino;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento; junto con ácido lactobiónico, KOH y NaOH, glutatión y alopurinol y PEG, y cualquier componente adicional opcional como se define en el presente documento; más preferentemente comprende una combinación de clases de componentes dadas a continuación, más preferentemente del tipo específico enumerado, y sustancialmente en la cantidad enumerada a continuación, junto con cualquier componente adicional opcional como se define en el presente documento, cuando se completa hasta el volumen en agua:
siempre que si (v) es aspirina, (vi) no es glutamina;
y lo más preferentemente sustancialmente en la cantidad enumerada a continuación, junto con cualquier componente adicional opcional como se ha definido anteriormente, cuando se completa hasta el volumen en agua:
siempre que si (v) es aspirina, (vi) no es glutamina.
Además, los inventores han descubierto sorprendentemente que la eficacia de los componentes de una solución de conservación según la invención se mejora mediante la sustitución de ciertos componentes por sus principales productos de degradación. Sin pretender quedar ligados a esta teoría, parece que los subproductos de dicha degradación pueden ejercer efectos tóxicos no deseados durante el uso de la solución de conservación tanto individualmente como en combinación. Por ejemplo, el ácido acético y el amoníaco forman acetamida, que es potencialmente dañina para el hígado. Al eliminar este efecto tóxico, se mejora la eficacia de la solución de conservación.
En consecuencia, el hallazgo según la presente invención es que ciertos sustituyentes son esenciales para la conservación de las funciones celulares principales esenciales para todos los tipos de células y estos se han identificado como los componentes (i) a (vi) como se definen en el presente documento. Si bien esta solución puede ser muy eficaz o satisfactoria para preservar sistemas celulares o tejidos simples, si se desea preservar órganos o sistemas celulares que requieran o proporcionen una función celular inusual o más compleja, es necesario incorporar sustituyentes específicamente dirigidos a preservar la función requerida o proporcionada, ya sea muscular, eléctrica, actividad específica de la membrana, suministro de energía y similares.
Por lo tanto, la invención proporciona particularmente una solución de conservación como se define en el presente documento para conservación de hígado, riñón, intestino delgado y páncreas.
La solución se prepara adecuadamente mediante métodos conocidos en la técnica mediante una simple mezcla en condiciones aceptables por la farmacopea. Preferentemente, los componentes se determinan e incorporan en una concentración molar deseada.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la preparación de una solución de conservación que comprende añadir los componentes (i) - (vi) en secuencia al agua, junto con cualquier componente adicional, con excepción del componente con propiedades osmóticas coloidales y componentes inestables, si los hubiere, por ejemplo, aspirina o glutamina, y disolver la mezcla; añadir el componente con propiedades osmóticas coloidales, si los hay, y hacer que la solución casi alcance su volumen; y finalmente completar el volumen para regular el pH, esterilizar y enfriar a 0-4 °C. La solución se puede almacenar si se desea con la posterior adición de cualquier componente inestable (por ejemplo, aspirina y/o glutamina) inmediatamente antes de su uso. El método según este aspecto de la invención puede incluir envasar la solución preparada para su almacenamiento, preferentemente a temperatura reducida, más preferentemente en el intervalo de 0-12 °C, lo más preferentemente 0-4 °C, por ejemplo, envasar la solución preparada en condiciones anóxicas y en ausencia de luz ultravioleta.
En un aspecto adicional, se proporciona una solución de conservación obtenida mediante el método descrito en el presente documento.
En realizaciones del presente documento se proporciona una solución de conservación obtenida mediante un método que comprende añadir los componentes (i) - (vi) al agua.
En un aspecto adicional de la invención se proporciona el uso de una solución de conservación como se define en el presente documento como una solución de conservación de lavado o una solución de conservación para almacenamiento en frío; para la conservación de las células en ausencia de suministro de sangre, en particular para prevenir daños a los órganos, tejidos vivos y células. La solución es adecuada para su uso con animales o mamíferos pequeños o grandes, particularmente, células humanas, tejidos y órganos.
El uso de la solución puede ser en trasplantes, incluidos órganos procedentes de donantes con corazón latiendo o sin corazón latiendo, en cirugía incluyendo cualquier situación de isquemia fría o caliente, conservación de toda la extremidad o del cuerpo entero, en experimentación con tejidos vivos, en el cultivo y conservación de células, tejidos y órganos modificados genéticamente y similares. Preferentemente, la solución se usa como una solución de lavado que se pone en contacto con las células, tejidos u órganos, las extremidades o todo el cuerpo a través del sistema vascular y, opcionalmente, también sirve como solución de conservación para el almacenamiento de células, tejidos y órganos lavados. La solución es adecuada para la conservación prolongada de las células, tejidos, órganos tanto en almacenamiento estático hipotérmico como con un sistema de perfusión de máquina hipotérmica.
Por lo tanto, la invención proporciona particularmente una solución de conservación como se define en el presente documento para conservación de hígado, riñón, intestino delgado y páncreas.
En un aspecto más de la invención se proporciona un método para lavar, conservar o conservación de lavado de células, en particular células vivas, tejidos u órganos, de modo que las células, tejidos u órganos se ponen en contacto con una solución como se define en el presente documento.
Según este aspecto de la invención, se proporciona un método para lavar, conservar o conservación de lavado de células para almacenamiento hipotérmico simple, en particular células vivas, tejidos u órganos, de modo que las células, tejidos u órganos se ponen en contacto con una solución de conservación que comprende:
(i) agua para inyectables;
(ii) al menos un sacárido, tal como un monosacárido, disacárido, trisacárido o polisacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina;
siempre que la acetamida está ausente y/o si la aspirina está presente, la glutamina está ausente y si la glutamina está presente, la aspirina está ausente; más particularmente en donde si (v) es aspirina (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y si (vi) es glutamina (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; ; y si hay aspirina, entonces no hay amoníaco; y si hay glutamina, entonces no hay ácido acético.
por lo que las células, tejidos u órganos se lavan con solución, se retiran de su sitio normal, se enfrían a temperaturas normalmente comprendidas entre cero y 12 °C y se almacenas.
Según este aspecto de la invención, si la acetamida está ausente, entonces al menos uno de ácido acético y amoníaco está ausente.
Según un aspecto de la invención, el método comprende la conservación de lavado de células vivas, tejidos u órganos.
Según otro aspecto de la invención, el método comprende la conservación para almacenamiento en frío de células vivas, tejidos u órganos.
En un método preferido según este aspecto de la invención, la aspirina se reemplaza por ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y la glutamina se reemplaza por ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, de modo que tanto la aspirina como la glutamina están sustancialmente ausentes de la solución, preferentemente también está ausente acetamida y/o ácido acético, además, el amoníaco y la acetamida están ausentes, más particularmente en donde (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal y (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal.
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la conservación de células para un almacenamiento hipotérmico simple, en particular células vivas, tejidos u órganos, de modo que las células, tejidos u órganos se ponen en contacto con una solución de conservación que comprende:
(i) agua para inyectables;
(ii) al menos un sacárido, tal como un monosacárido, disacárido, trisacárido o polisacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina; y
al menos un componente con propiedades crioprotectoras (es decir, un crioprotector);
siempre que esté ausente acetamida y/o además esté ausente al menos uno de ácido acético y amoníaco; más particularmente en donde si (v) es aspirina (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y si (vi) es glutamina (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; ; y si hay aspirina, entonces no hay amoníaco; y si hay glutamina, entonces no hay ácido acético.
por lo que las células, tejidos u órganos se lavan con solución, se retiran de su sitio normal, se enfrían a temperaturas normalmente en el intervalo entre -20 °C y 12 °C y se almacenan.
Según este aspecto de la invención, si la acetamida está ausente, entonces al menos uno de ácido acético y amoníaco está ausente.
El método puede ser para almacenamiento hipotérmico simple, por lo que las células, tejidos u órganos se lavan con solución, se retiran de su sitio normal, se enfría, preferentemente a temperaturas normalmente en el intervalo entre cero y 12 °C y se almacenan. Adicionalmente, si está presente un crioprotector, el tejido u órgano puede almacenarse a una temperatura de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 4 °C. Además, la solución puede ser lavada activamente a través del órgano. Los inventores han descubierto que las células, tejidos u órganos pueden almacenarse durante períodos prolongados superiores a los practicados actualmente, por ejemplo, riñón e hígado durante períodos del orden de 48 horas o más. Adicionalmente o como alternativa, el método es para la conservación de las células, particularmente tejidos u órganos, por lo que las células, tejidos u órganos se han lavado y puesto en un estado hipotérmico y se ponen en contacto con la solución de conservación mediante inmersión o perfusión.
Preferentemente, el método de la invención comprende administrar a las células, tejidos, órganos o a un donante una cantidad biológicamente eficaz de la solución de la invención, a una tasa efectiva o en una concentración efectiva para mantener o mejorar su función. Preferentemente, el método es un método para conservar cierta función de las células, tejidos u órganos, por ejemplo, el metabolismo celular y/o para detener temporalmente determinadas funciones, por ejemplo actividad muscular, degradación o excreción de componentes celulares esenciales y similares, y/o productos excretores, por ejemplo, en forma de bilis u orina y similares.
La isquemia es la situación que resulta de la parada del flujo sanguíneo a través de un órgano. Los efectos se deben a la falta de oxígeno y nutrientes; y acumulación de dióxido de carbono y otros productos de desecho. Es más dañino a la temperatura corporal que en el frío, por eso los órganos trasplantados se lavan y enfrían. Los donantes de órganos han sufrido frecuentemente traumatismos y, por tanto, el órgano donado puede haber sido sometido a un período de isquemia cálida como consecuencia del traumatismo. Añadiendo experimentalmente un período de isquemia caliente, antes del lavado imita esta situación. Es una ventaja que la solución de los inventores brinde protección contra una isquemia tan cálida.
Preferentemente, la perfusión de lavado se lleva a cabo a una presión de hasta 0,039 MPa (300 mmHg), más preferentemente en el intervalo atmosférico a 0,026 MPa (200 mmHg), más preferentemente en el intervalo de hasta 0,021 MPa (160 mmHg), más preferentemente hasta 0,013 MPa (100 mmHg), lo más preferentemente hasta 0,006 MPa (50 mmHg).
El método según este aspecto de la invención comprende el uso de la solución de conservación como se define en el presente documento.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit de piezas que comprende una solución de conservación que tiene, en una parte, componentes (i)-(vi) tal como se definen en el presente documento, opcionalmente junto con, en una o más piezas adicionales, componentes individuales seleccionados de uno o más de los componentes adicionales como se definen en el presente documento, para su uso en la preparación de una o más soluciones para fines específicos; y sirviendo como una solución de conservación universal.
En realizaciones, un kit de piezas del presente documento comprende una solución de conservación que tiene, en una parte, componentes (i)-(vi) tal como se definen en el presente documento, de los cuales uno o más componentes inestables están ausentes y se proporcionan por separado, en una o más piezas adicionales, para adición inmediatamente antes de su uso.
Según un aspecto de la invención, el kit de piezas comprende una solución de conservación de lavado que tiene los componentes (i)-(vi) tal como se definen en el presente documento.
Según otro aspecto de la invención, el kit de piezas comprende una solución de conservación para almacenamiento en frío que tiene los componentes (i)-(vi) tal como se definen en el presente documento.
La invención se ilustra ahora de manera no limitativa con referencia a los ejemplos y con referencia a las figuras adjuntas, en que:
la figura 1 ilustra la estabilidad de la aspirina en una solución de conservación: se desarrollaron métodos de HPLC para medir la concentración de aspirina y ácido salicílico en la solución de la técnica anterior. La aspirina se hidroliza rápidamente a ácido salicílico y ácido acético durante el almacenamiento. Después de 8 semanas, no queda nada del compuesto original.
La figura 2 ilustra la creatinina sérica después de la conservación del riñón en una solución de conservación mejorada (solución de la invención) frente a una formulación anterior (técnica anterior). La creatinina sérica más baja ilustra un daño reducido al órgano.
La figura 3 ilustra la conservaciónex vivode riñón porcino en solución de conservación de la invención hasta 72 horas fuera del organismo. El parénquima está bien conservado con glomérulos y túbulos normales. Tinción de H E, Aumento 40x.
Ejemplo 1
1.1 Soluciones de conservación de lavado utilizadas en la invención
Las soluciones de conservación implicadas en este estudio se muestran en las Tablas 1, 2, 3 y 4, las cantidades se dan en mmol/l. Las soluciones (SOLS) se prepararon a partir de un matraz lleno hasta la mitad con agua, al que se añadieron secuencialmente parte o todo el lactobionato, KOH, fosfato de sodio, glutamina o ácido glutámico sacarosa, aspirina o ácido salicílico, alopurinol y diltiazem, y se disolvieron. Luego se añadió el coloide (PEG) y la solución se llevó casi al volumen. Se añadió NaOH para ajustar el pH. Luego la solución se llevó a volumen. Todas las soluciones se esterilizaron mediante filtración y se almacenaron en botellas de vidrio a 4 °C. Se añadió glutatión reducido durante la preparación o inmediatamente antes de su uso. Las fuentes son las indicadas anteriormente o las divulgadas en el documento WO 02/41696.
Comparativo
La formulación anterior es como se divulga y describe en el documento WO 02/41696 y como se ilustra en la Tabla 1 del presente documento. UW es una solución comercial original estándar (viaSpan/BELZER UW, DU PONT PHARMA).
Composición de soluciones de conservación comparativas
La composición de las soluciones de conservación comparativas se ilustra en la Tabla 1:
Tabla 1
continuación
Composición de las soluciones de conservación en frío de la invención
La composición de las soluciones de conservación en frío de la invención se ilustra en la Tabla 2:
Tabla 2
Composición de las soluciones de conservación en frío de la invención con (v) y/o (vi) en cantidad reducidaLa composición de las soluciones de conservación en frío de la invención con (v) y/o (vi) en cantidad reducida se ilustra en la Tabla 3:
Tabla 3
Composición de las soluciones de conservación en frío de la invención con (v) y/o (vi) en cantidad reducidaLa composición de las soluciones de conservación en frío de la invención con (v) y/o (vi) en cantidad reducida se ilustra en la Tabla 4:
Tabla 4
Ejemplo 2
Las soluciones comparativas y las soluciones de conservación de lavado de la invención se estudiaron en los siguientes sistemas.
2.1.1 Generación e impacto de metabolitos tóxicos producidos por soluciones de conservación de lavado descritas en la técnica anterior
Se descubrió que la solución de conservación de lavado descrita en la solicitud de patente internacional n.° WO 02/41696 genera, tras el almacenamiento, productos metabólicos que tienen el potencial de ser tóxicos para las células/tejidos/órganos almacenados. Como un ejemplo, la Figura 1 ilustra que el almacenamiento de la solución durante 8 semanas da como resultado que el 100 % de la aspirina se convierta en ácido salicílico y la producción de cantidades equimolares de ácido acético dañino. En una solución que originalmente contiene aspirina 0,5 mM, esto da como resultado la formación de ácido acético 0,5 mM, 30 mg/l. El ácido acético es un irritante conocido y daña los tejidos humanos.
A modo de ejemplo adicional, la presencia de amoníaco en la solución de la técnica anterior se ha demostrado mediante ensayo colorimétrico. El kit de ensayo de amoníaco (ab83360) proporciona un ensayo rápido, simple, sensible y fiable adecuado para la investigación y ensayos de alto rendimiento de amoníaco y amonio. En el ensayo, el amoníaco y el amonio se convierten en un producto que reacciona con la sonda OxiRed para generar color (Amáx = 570 nm) que puede cuantificarse fácilmente mediante un lector de placas. El kit puede detectar 1 nmol (~20<j>M) de amoníaco total y amonio, que es mucho más sensible que medir el amoníaco con un ensayo basado en NADPH. Usando este protocolo, se demuestra que la solución de la técnica anterior contiene aproximadamente 2,6 mM de amoníaco. Esto es muchas veces mayor que la toxicidad conocida del amoníaco, se sabe que 300<j>M son tóxicos para las células humanas1. Por el contrario, en la solución de la invención, el amoníaco está sustancialmente ausente, por debajo del nivel inferior de cuantificación del ensayo, menos de 2 nmol.
La toxicidad del amoníaco puede ocurrir al causar una alteración en la absorción de potasio por las células. Esto puede provocar efectos perjudiciales en todos los órganos y tejidos; cambios en el pH, el potencial de membrana y el metabolismo2.In vivo,el amoníaco normalmente sería desintoxicado por el ciclo de la urea hepática.
1 Heeneman et al, Journal of Immunological Methods (1993) 166, 1, p85-91 2 Dasarathy, S., Mookerjee, R.P., Rackayova, V.et al.Metab Brain Dis (2017) 32: 529. https://doi.org/10.1007/s11011-016-9938-3. Sin embargo, esto no puede ocurrir durante el almacenamiento o uso de la solución de conservación, ya que la actividad metabólica de las células se reprime intencionadamente durante la conservación en frío. Esto significa que el amoníaco en la solución de la técnica anterior permanece durante la conservación y existe un potencial significativo de daño celular tras la reperfusión. En una solución de la presente invención, el amoníaco está ausente y este daño no puede ocurrir.
En una solución que contiene originalmente glutamina 20 mM o aproximadamente 2,6 mM de amoníaco y 0,5 mM de aspirina, o hasta 0,5 mM de ácido acético, esto da como resultado la formación de hasta 0,5 mM de acetamida, 30 mg/l. Se sabe que la acetamida es dañina para los tejidos humanos.
2.1.2 Ausencia de metabolitos tóxicos en las soluciones de conservación de lavado de la invención
En soluciones de la invención en las que la aspirina está ausente, SOL 1,1, SOL 1,2, SOL 2,1, SOL 2,2, SOL 3.1 y SOL 3.2, el ácido acético está sustancialmente ausente incluso después del almacenamiento, por debajo del nivel inferior de cuantificación del ensayo.
En soluciones adicionales de la invención en las que se añade aspirina inmediatamente antes de su uso, el ácido acético está sustancialmente ausente o está en niveles reducidos durante el período de uso.
En una solución de la invención en la que la glutamina está ausente, SOL 1,1, SOL 1,3, SOL 2,1, SOL 2,3, SOL 3.1 y SOL 3.3, el amoníaco está sustancialmente ausente incluso después del almacenamiento, por debajo del nivel inferior de cuantificación del ensayo, menos de 2 nmol.
En soluciones adicionales de la invención en las que se añade glutamina inmediatamente antes de su uso, el amoníaco está sustancialmente ausente o está en niveles reducidos durante el período de uso.
Además, en todas las soluciones de la invención está ausente aspirina o glutamina o ambas, SOL 1,1, SOL 1,2, SOL 1,3, SOL 2,1, SOL 2,2, SOL 2,3, SOL 3,1, SOL 3.2 y SOL 3.3, y la acetamida está sustancialmente ausente incluso después del almacenamiento.
2.2 Modelo de trasplante porcino
Para una verdadera evaluación de la calidad de las soluciones de conservación, es necesario emplear un modelo animal completo para evaluar los resultados clínicos del trasplante utilizando las soluciones de prueba. El modelo porcino es el más apropiado para esto. En resumen, el protocolo implica la recuperación del órgano (hígado, riñón, intestino delgado o páncreas), conservación de lavado en soluciones de prueba (invención) o de control (comparación) y luego implantación (alotrasplante o autotrasplante según el órgano considerado). La función de los órganos y la salud general del receptor se controlan después de la cirugía durante un período de tiempo clínicamente apropiado.
La siguiente tabla da una indicación de las medidas utilizadas para evaluar la funcionalidad del órgano trasplantado en el animal receptor. Adicionalmente, se controla la salud y el bienestar general del animal (peso corporal, consumo de alimentos, etc.). Al final del estudio, se sacrifica el animal y se extraen los órganos clave para el análisis histológico.
La creatinina es un marcador sanguíneo clave que está directamente relacionado con la función renal. Un riñón funcional mantendrá una concentración baja de creatinina; un nivel alto indica un riñón que no funciona correctamente. Después del trasplante, se espera que la creatinina sérica aumente y solo vuelva a caer a niveles normales si/cuando se restablezca la función renal. La magnitud del aumento refleja la magnitud del daño a la conservación. La velocidad a la que los niveles de creatinina vuelven a la normalidad refleja la rapidez con la que el riñón vuelve a su función normal; esto en sí mismo es una medida clave de lo bien que se ha conservado el órgano. La Figura 2 ilustra un estudio reciente en el que la solución de conservación de la invención supera significativamente a la solución de la técnica anterior; el pico de creatinina es significativamente menor y la función renal vuelve a la normalidad mucho más rápido. Esto es evidencia de un daño tisular mucho menor en la solución de la invención.
Histología
La histología se realizó a partir de muestras de tejido extraídas de órganos abdominales (hígado, riñón, páncreas e intestino delgado) de animales perfundidos con la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (disponible comercialmente como Belzer UW® solución de almacenamiento en frío) o la solución de conservación de la invención durante hasta 72 horas. Las soluciones de comparación estándar, tal como la UW, normalmente pueden conservar el tejido hasta aproximadamente 12-24 horas. Las muestras de tejido teñidas con hematoxilina y eosina (Figura 3) ilustran una morfología normal y una buena conservación de las muestras mediante la solución de conservación de la invención durante hasta 72 horas. Se observa una mejor retención del contenido citoplasmático y también estuvo presente una imagen fantasma nuclear en el grupo UW que estaba ausente en la solución de conservación de la invención. Es evidente una imagen fantasma nuclear adicional en las muestras de UW a las 48 y 72 horas, que están ausentes con la solución de conservación de las muestras de la invención. Esta es una prueba de que la solución de conservación de la invención produce un daño celular mucho menor durante tiempos de conservación prolongados.
Claims (15)
1. Una solución de conservación para la conservación de células, tejidos y/u órganos, en ausencia de suministro de sangre, comprendiendo dicha solución:
(i) agua para inyectables;
(ii) al menos un sacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina;
siempre que no hay acetamida y hay aspirina, hay glutamina y, si hay glutamina, no hay aspirina; y
si hay aspirina, entonces no hay amoníaco; y si hay glutamina, entonces no hay ácido acético.
2. Una solución de conservación según la reivindicación 1, en donde (v) es aspirina y (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal.
3. Una solución de conservación según la reivindicación 1, en donde (vi) es glutamina y (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal.
4. Una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la solución es una solución de conservación de lavado.
5. Una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la solución es una solución de conservación para almacenamiento en frío.
6. Una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la aspirina está ausente.
7. Una solución de conservación según la reivindicación 6, en donde (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal; y (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina; y en donde el ácido acético y/o la acetamida están ausentes;
siempre que si hay glutamina presente, entonces el ácido acético no está presente.
8. Una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la glutamina está ausente.
9. Una solución de conservación según la reivindicación 8, en donde (v) es ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y (vi) es ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal; y en donde el amoníaco y/o la acetamida están ausentes;
siempre que si hay aspirina presente, entonces no hay amoníaco presente.
10. Una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la aspirina y la glutamina están ausentes.
11. Una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sacárido se selecciona entre uno o más de sacarosa, rafinosa y manitol.
12. Una solución de conservación para la conservación de hígado, riñón, intestino delgado y páncreas según una cualquiera o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende una combinación de
(i) agua para inyectables;
(ii) un disacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) al menos un bloqueador de canales o transporte de calcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento; junto con un anión secuestrante impermeable, solutos inorgánicos, componentes eficaces contra radicales libres de oxígeno y un osmótico coloidal, y cualquier componente adicional opcional como se ha definido anteriormente en el presente documento.
13. Una solución de conservación para la conservación de hígado, riñón, intestino delgado y páncreas según una cualquiera o más de las reivindicaciones anteriores, que comprende una combinación de
(i) agua para inyectables;
(ii) sacarosa;
(iii) Na2HPO4 y NaH2PO4;
(iv) diltiazem;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, o glutamina, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento; junto con ácido lactobiónico, KOH y NaOH, glutatión y alopurinol y PEG, y cualquier componente adicional opcional como se ha definido anteriormente en el presente documento.
14. Un uso no terapéutico de una solución de conservación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como solución de lavado, solución de conservación o solución de conservación de lavado para la conservación de células en ausencia de suministro de sangre, en particular para prevenir daños a los órganos, tejidos vivos y células.
15. Una solución de conservación para la conservación de células, tejidos y/u órganos, en ausencia de suministro de sangre, comprendiendo dicha solución:
(i) agua para inyectables;
(ii) al menos un sacárido;
(iii) al menos un componente con propiedades tampón de pH;
(iv) opcionalmente al menos un componente con propiedades bloqueantes del transporte de calcio o una actividad de acción anticalcio;
(v) ácido salicílico, en forma libre o en forma de sal, y/o aspirina; y
(vi) ácido glutámico, en forma libre o en forma de sal, y/o glutamina;
siempre que si hay aspirina presente, la glutamina y el amoníaco estén ausentes y si la glutamina está presente, la aspirina y el ácido acético estén ausentes; y/o
en donde si hay aspirina y/o acetamida y/o ácido acético presentes, la cantidad de ácido salicílico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la aspirina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquier ácido acético y de cualquier acetamida presente; y
en donde si hay glutamina y/o acetamida y/o amoníaco presentes, la cantidad de ácido glutámico presente excede la que puede atribuirse a la degradación de la glutamina, según lo determinado por la suma de las cantidades de cualquier amoníaco y de cualquier acetamida.
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