CN110868854A - 保存溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于保存细胞、组织和/或器官的保存溶液，所述溶液包括：(i)注射用水；(ii)至少一种糖；(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；条件是不存在乙酰胺，和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林。

Description

保存溶液
发明领域
本发明涉及用于在没有血液供应的情况下使细胞保持存活的保存溶液或冷藏保存溶液；其在移植、手术、实验和体外中用于防止细胞、组织和/或器官损害的用途；一种用于保存、冲洗或冲洗保存的方法；一种治疗方法；其制备方法以及包括该溶液的试剂盒。
更具体地，本发明涉及本文所述的保存溶液或冷藏保存溶液，其包含水杨酸和/或谷氨酸；及其盐。
发明背景
现在，器官移植可用于肾脏、肝脏、心脏、肺、胰脏和肠道。在摘取时，移植器官的脉管系统用保存溶液冲洗。此溶液旨在帮助降低器官温度，防止细胞肿胀，清除氧自由基，控制pH值，减少缺血性损伤，延长器官在体外保持的安全时间并在再灌注时促进器官恢复。
重要的冲洗溶液由Belzer于1967年和Collins于1969年提出，随后被修改为Euro-Collins(EC)、Marshall(1976)、Bretschneider(请参见Isemer等人，1988年)等。威斯康星大学溶液(UW)是所有溶液中最成功的一种，由Belzer及其同事于1988年提出。仍然需要改进的冲洗保存和冷藏保存。大量证据表明，高质量的移植物可提供更好的即时功能和更长的功能性移植物寿命。
Andrews和Coffey于1982年和Coffey和Andrews于1983年展示了一种仅含有磷酸钠和蔗糖的简单冲洗溶液，以保护肾小管的形态免受缺血性损害。
国际专利申请号WO 02/41696(Potts，Lodge)描述了一种冲洗保存溶液，其用于在没有血液供应的情况下保存细胞，其中所述溶液包括：
注射用水；
至少一种糖，例如单糖、二糖、三糖或多糖；
至少一种具有pH缓冲剂性质的组分(即pH缓冲剂)；
至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分(即钙转运阻断剂)；
任选的氨基酸，例如谷氨酰胺；和
任选的血栓烷抑制剂(例如阿司匹林)以防止凝血。
因此，仍然需要改进的商业上可行的和有效的保存溶液，其允许延长的细胞、组织和器官(包括工程化的细胞、组织和器官)的保存，该保存溶液在移植、在手术(包括任何热或冷局部缺血的情况下)中提供改进的多功能性、有效性和再灌注，例如在肝脏、肾脏、小肠和/或胰腺的移植；整个四肢、整个身体或实验中。
发明内容
我们发现，在WO 02/41696的现有技术溶液中，阿司匹林(阿司匹林是乙酰水杨酸的通用名称)降解产生水杨酸，而谷氨酰胺降解成谷氨酸。
阿司匹林的降解将产生水杨酸和乙酸，而谷氨酰胺的降解将产生谷氨酸和氨。而且，我们发现乙酸和氨在保存溶液中都是不希望的，因为它们都可能损害细胞、组织和器官；并可能产生有害气味，该气味在保存溶液的存储期间增大。此外，我们发现，在WO 02/41696的现有技术溶液中，随着时间的流逝，乙酸和氨会一起反应，形成乙酰胺。乙酰胺被认为是皮肤刺激物，并且被认为是可能损害肝脏的有害物质。
因此，通过用水杨酸代替阿司匹林和/或用谷氨酸或其盐代替谷氨酰胺，可将分别产生的乙酸和/或氨的量最小化或完全除去。在实施例中，证明了与对比溶液相比，使用本发明的溶液进行保存减少了细胞和组织在保存期间的损害。
在现有技术的溶液中，添加阿司匹林作为抗炎性血栓烷抑制剂。我们发现，如果省略阿司匹林而添加水杨酸，则水杨酸具有抗炎性质(即是抗炎性的)。同样，在现有技术的溶液中，添加谷氨酰胺作为可以提供能量的支持分子。我们已经发现，如果省略谷氨酰胺，则可以用谷氨酸代替，谷氨酸将作为细胞、组织和/或器官的替代能量底物。
此外，我们已经发现，由于本发明的新溶液不再具有和阿司匹林和/或谷氨酰胺降解有关的任何顾虑，因此替换组分例如水杨酸和/或谷氨酸的量可因此而减少。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种在没有血液供应的情况下用于保存细胞、组织和/或器官的保存溶液，所述溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖，例如单糖、二糖、三糖或多糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺；和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林。
本领域技术人员应将术语“不存在”或“基本上不存在”理解为是指低于药理活性浓度；或无法通过本领域已知的常规方法检测到。此类方法应包括但不限于比色测定和GCMS。
作为进一步的条件，如果仅存在阿司匹林和谷氨酰胺中的一种，则不存在另一种的降解产物，也就是说，如果存在阿司匹林，则不存在氨；如果存在谷氨酰胺，则不存在乙酸。
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林，适合用于防止凝血。适当地，保存溶液包含一定量的(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林以防止凝血。
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺，适合用作能量底物。适当地，保存溶液包含一定量的(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺，以用作能量底物。
在本发明的一个特定方面，本文所述的保存溶液包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺和/或不存在乙酸和氨中的至少一种。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于保存细胞、组织和/或器官的保存溶液，所述溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖，例如单糖、二糖、三糖或多糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
其中如果(v)是阿司匹林，则(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸；并且如果(vi)是谷氨酰胺，则(v)是游离形式或盐形式的水杨酸。
优选地，保存溶液包含本文所述的(i)至(vi)的混合物，从而提供不含乙酰胺的保存溶液。例如，存在阿司匹林和谷氨酰胺中的一种，但是不存在乙酰胺；和/或存在乙酸和氨中的一种但是不存在乙酰胺；或者不存在阿司匹林和谷氨酰胺，不存在乙酸和氨，并且不存在乙酰胺。
在本发明的一个方面，提供了如本文所述的用于在没有血液供应的情况下保存细胞、组织和/或器官的保存溶液。
在本文的实施方案中，提供了一种配制的保存溶液，其包含本文所述的保存溶液，其中不存在乙酰胺，例如存在阿司匹林和谷氨酰胺中的一种，并且不存在乙酰胺；和/或存在乙酸和氨中的一种，并且不存在乙酰胺；或者阿司匹林和谷氨酰胺均不存在，并且乙酸和氨均不存在，且乙酰胺不存在。
可以将制备的保存溶液例如在缺氧条件下，在没有紫外线的情况下包装起来进行储存。本文所述的配制的保存溶液是无菌的，并被包装以在缺氧条件下在不存在紫外线的情况下储存。
根据本发明的一个方面，该保存溶液是一种冲洗保存溶液。
根据本发明的另一方面，该保存溶液是冷藏保存溶液。
在一个实施方案中，
(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；和
(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
条件是不存在阿司匹林，优选不存在阿司匹林和乙酰胺；和/或不存在乙酸和乙酰胺。
在另一个实施方案中，
(v)是游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸；
条件是不存在谷氨酰胺，优选不存在谷氨酰胺和乙酰胺；和/或不存在氨和乙酰胺。
在另一个实施方案中，
(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；和
(vi)为游离形式或盐形式的谷氨酸；
条件是不存在谷氨酰胺和阿司匹林，优选额外不存在乙酰胺，和/或不存在乙酸，氨和乙酰胺。
在本发明的优选的保存溶液中，阿司匹林被游离形式或盐形式的水杨酸替代，而谷氨酰胺被游离形式或盐形式的谷氨酸替代，使得该溶液基本上不存在阿司匹林和谷氨酰胺，优选额外不存在乙酰胺，和/或不存在乙酸，氨和乙酰胺。
在本发明的另一个实施方案中，提供了本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和/或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和/或谷氨酰胺；
条件是如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；和/或其中如果存在阿司匹林和/或乙酰胺和/或乙酸，则水杨酸的存在量超过归因于来自阿司匹林降解而获得的量，例如由任何存在的乙酸和任何乙酰胺之和所确定的；和/或
其中如果存在谷氨酰胺和/或乙酰胺和/或氨，则所存在的谷氨酸的量超过归因于来自谷氨酰胺降解而获得的量，例如由任何存在的氨和任何乙酰胺之和所确定的。
特别地，提供了本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和/或阿司匹林；
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和/或谷氨酰胺；
条件是(v)是游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和/或
(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺；
条件是如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；和/或
其中如果存在阿司匹林和/或乙酰胺和/或乙酸，则水杨酸的存在量超过归因于来自阿司匹林降解而获得的量，例如由任何存在的乙酸和任何乙酰胺之和所确定的；和/或
其中如果存在谷氨酰胺和/或乙酰胺和/或氨，则所存在的谷氨酸的量超过归因于来自谷氨酰胺降解而获得的量，例如由任何存在的氨和任何乙酰胺之和所确定的。
还提供了本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，以及任选的额外的阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和/或谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；或者
其中如果存在阿司匹林和/或乙酰胺和/或乙酸，则水杨酸的存在量超过归因于来自阿司匹林降解而获得的量，例如由任何存在的乙酸和任何乙酰胺之和所确定的；和/或
其中如果存在谷氨酰胺和/或乙酰胺和/或氨，则所存在的谷氨酸的量超过归因于来自谷氨酰胺降解而获得的量，例如由任何存在的氨和任何乙酰胺之和所确定的。
还提供了本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，以及任选的额外的阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和/或谷氨酰胺；
条件是：(v)是游离形式或盐形式的水杨酸，且不存在阿司匹林；(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，以及任选的额外的阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和/或谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和/或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，以及任选地额外的谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；
或其中如果存在谷氨酰胺和/或乙酰胺和/或氨，则所存在的谷氨酸的量超过归因于来自谷氨酰胺降解而获得的量，例如由任何存在的氨和任何乙酰胺之和所确定的；和/或
其中如果存在阿司匹林和/或乙酰胺和/或乙酸，则水杨酸的存在量超过归因于来自阿司匹林降解而获得的量，例如由任何存在的乙酸和任何乙酰胺之和所确定的。
根据本发明的这个方面，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和/或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，以及任选地额外的谷氨酰胺；
条件是：当(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸，且不存在谷氨酰胺，(v)是游离形式或盐形式的水杨酸，以及阿司匹林。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，以及任选地额外的谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和/或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和谷氨酰胺。
根据本发明，提供了一种本文所述的保存溶液，其包括：
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸。
为了避免疑问，本领域技术人员将理解，本文中提及的细胞、组织和器官应包括工程化的细胞、组织和器官。
在本发明的一个方面，在本发明的保存溶液中存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
在本发明的另一方面，本发明的保存溶液中不存在具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
在本发明的保存溶液的一个方面，足以防止凝血的游离形式或盐形式的水杨酸的量为小于0.5mmol/L，例如约0.025至小于0.3mmol/L。或者，足以防止凝血的游离形式或盐形式的水杨酸的量为约0.025至约0.275mmol/L，优选约0.25mmol/L的水杨酸。
或者，阿司匹林，如果存在的话，合适地以约0.3mmol/L至约1.0mmol/L，例如0.5mmol/L的量存在。
在本发明的保存溶液的另一方面，以游离形式或盐形式存在的谷氨酸的量为小于20mmol/L。或者，以游离形式或盐形式存在的谷氨酸的量为约2至小于15，或约15至小于20，例如约2至约12mmol/L，优选约3mmol/L的谷氨酸。
或者，谷氨酰胺，如果存在的话，合适地以约15mmol/L至约30mmol/L，例如约20mmol/L的量存在。或者，存在的谷氨酰胺的量为约2至小于15mmol/L。
水杨酸和/或谷氨酸的盐可以相同或不同，它们是药理学上可接受的盐，即是具有所期望的母体化合物的药理活性的盐。特别地，此类盐应对细胞、组织和/或器官无毒。当水杨酸和/或谷氨酸中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子或碱土金属离子替代时，通常将形成此类盐。仅作为示例，碱金属盐包括钠或钾等。仅作为示例，碱土金属盐包括钙或镁，和类似物。
冲洗溶液可以仅由其适合于保存通用细胞类型和功能性的这些组分组成，特别是用于保存简单的细胞体系，或者这些组分可以与一种或多种其他替代物一起提供，这些替代物特别适合于保存细胞的期望类型或功能，特别是保存复杂的细胞体系(例如器官或活体组织)，更特别地是用于小型或大型动物，最特别的是人体器官(例如肝脏、肾脏、小肠和/或胰腺)；以及活体组织。
根据本发明的这个方面，提供了一种用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存的保存溶液，其包括以下的组合：
(i)注射用水；
(ii)二糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)至少一种钙转运或通道阻断剂；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；
(vi)如前定义的游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；以及如上文所定义的不透性的螯合阴离子、无机溶质、有效对抗氧自由基和胶体渗透的组分，以及任何任选的额外组分。
还提供了用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存的保存溶液，其包括以下的组合：
(i)注射用水；
(ii)蔗糖；
(iii)Na2HPO4和NaH2PO4；
(iv)地尔硫卓；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)如前定义的游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；以及如上文所定义的乳糖醛酸、KOH和NaOH、谷胱甘肽、别嘌呤醇和PEG，以及任何任选的额外组分。
本发明的保存溶液在改进现有溶液方面具有许多优点，其由于不存在有毒的氨和乙酸，保存过程中的损害减少，并且有可能延长保存时间，此外还提供试剂盒，由其获得特定的所需溶液，以及相关的便利性和成本影响，这将使这种溶液在商业上可行。
本发明已经发现，基于实验并且没有试图使潜在的保存机制合理化，本文定义的保存溶液是普遍可接受的。
在适用的情况下，本发明的保存溶液的所有组分均满足国家或国际药典纯度标准。通常在灭菌之前将注射用水纯化并进行去离子化。
糖选自蔗糖、棉籽糖和甘露醇；及其组合。优选的糖是蔗糖。糖的存在量可以为约50mmol/L至约150mmol/L，例如约100mmol/L。
pH缓冲剂选自磷酸钠缓冲剂和磷酸钾缓冲剂等，优选Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4和KH2PO4等，及其组合。pH缓冲剂的存在量可以为约15mmol/L至约75mmol/L，例如约15mmol/L至约20mmol/L或约40至约70mmol/L。
本发明的保存溶液优选配制为符合药理学可接受的物理性质的期望范围。优选地，溶液的pH在6.5-7.8的范围内，更优选6.5-7.0，最优选6.8-7.0。通常在室温下例如在约20℃下测量pH。
任选添加的钙转运阻断剂或抗钙活性剂选自任何已知的钙转运或通道阻断剂，例如尼卡地平、地尔硫卓、维拉帕米、尼索地平、氯丙嗪或三氟啦嗪；其组合及其代谢物。优选地，钙转运或通道阻断剂是尼卡地平和/或地尔硫卓；或其代谢物。钙转运或通道阻断剂可以约0.0005mmol/L至约1.0mmol/L，例如约0.005mmol/L的量存在。当钙转运或通道阻断剂是尼卡地平时，尼卡地平可以约0.0005mmol/L至约1.0mmol/L，例如约0.005mmol/L的量存在。当钙转运或通道阻断剂是地尔硫卓时，地尔硫卓的存在量可为0.0005mmol/L至约1.0mmol/L，例如约0.022mmol/L。
不受限于此理论，本文基于普遍接受的药理和生理活性，通过功能引用组分，但是为避免疑问，所列组分可贡献额外或与所赋予的不同的功能，这不应被视作其限制。此外，可以在本发明的范围内考虑与所列功能等效的功能。
保存溶液中可能还存在其他组分。除非另有说明，否则其他组分通常将以微量存在，例如以至多1mmol/L存在。
优选地，本发明的保存溶液包含一种或多种选自以下的额外组分：
-至少一种基本上不可渗透到细胞中的阴离子，优选是不透性的螯合阴离子；和
-至少一种具有胶体渗透性质(即胶体渗透性)的组分。
不透性的螯合阴离子优选包含乳糖醛酸根或乳糖醛酸。当存在不透性的螯合阴离子时，其量可以为约15mmol/L至约75mmol/L，例如约15mmol/L至约20mmol/L或约40mmol/L至约70mmol/L。
胶体渗透剂优选选自聚乙二醇(PEG)、琥珀酰化的明胶(如在Gelofusine中)、Ficoll(多糖)或淀粉产品；及其组合。当存在具有胶体渗透性质的组分时，其量可以为约0.5mmol/L至约3.0mmol/L，例如约0.75mmol/L至约1.33mmol/L，例如约1.0mmol/L，且为20,000MW。
可替代地或额外地，本发明的保存溶液可以包含一种或多种选自以下的组分：
-无机或有机溶质；
-一种或多种具有钙螯合性质的组分(即钙螯合剂)；和
-一种或多种具有铁螯合性质的组分(即铁螯合剂)。
优选地，无机或有机溶质包括无机溶质，并且是包括阳离子和/或阴离子(例如选自Na+、K+、Cl-和OH-等)的电解质；及其组合。在本发明的一个优选方面，溶质是无机溶质，例如NaCl。当存在无机或有机溶质时，其量可以为约15mmol/L至约75mmol/L，例如约15mmol/L至约20mmol/L，或约40mmol/L至约70mmol/L。
优选地，钙螯合剂包含柠檬酸盐或EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸)，铁螯合剂包含EDTA(乙二胺四乙酸)。
可替代地或额外地，本发明的保存溶液可包含一种或多种选自以下的组分：
-除谷氨酸和/或谷氨酰胺外，一种或多种(额外)氨基酸；
-至少一种有效对抗氧自由基或氧自由基产生的组分；
-至少一种能量供应体系的组分或影响能量供应体的组分系或酮体。
优选地，额外的氨基酸选自甘氨酸和正乙酰基半胱氨酸，及其组合。当存在额外的氨基酸组分时，其量可以为约1mmol/L至约30mmol/L，优选约3mmol/L至约12mmol/L，例如约10mmol/L。
优选地，氧自由基抑制剂选自别嘌呤醇和还原型谷胱甘肽，更优选其组合。当存在有效对抗氧自由基的组分时，其量可以为约0.2mmol/L至约5mmol/L，例如约3mmol/L至约5mmol/L。通常，本文定义的氧自由基抑制剂的量是指氧自由基抑制剂的总量。例如，当氧自由基抑制剂包含别嘌呤醇和还原型谷胱甘肽的组合时，氧自由基抑制剂的组合的量可以为约0.2mmol/L至约5mmol/L等。
优选地，能量供应体系部件包括腺苷。当存在能量供应组分时，其量可以高达约20mmol/L，例如约5至约20mmol/L，例如约5mmol/L。
优选地，酮体包含β-羟基丁酸酯。
低温保护剂是这样的化合物，其当暴露于低于0℃的温度的溶液中时能减少或抑制冰晶形成。因此，使用低温保护剂能够使细胞、组织或器官在约-20℃至约4℃的温度下存储。优选地，低温保护剂选自二醇，例如丙二醇；DMSO；糖；碳水化合物；脂质；糖脂例如木甘聚糖，糖蛋白；蛋白质或多肽或多元醇；或其组合。当存在低温保护剂时，低温保护剂的量可以为约5至约100mg/mL。
可替代地或额外地，本发明的保存溶液可包括用于特定功能的额外组分，所述额外组分选自：
-至少一种细胞内信号转导体系的组分或修饰该体系的组分，优选蛋白激酶抑制剂或钙调素蛋白抑制剂；和
-至少一种具有膜稳定化作用的组分，优选雷诺嗪等。
优选地，糖组分(ii)以50-150mmol/L范围内的量存在，例如约100mmol/L；
-pH缓冲剂组分(iii)的总量为15-75mmol/L，例如约15-20或40-70mmol/L；
-不透性的螯合阴离子的总量为15-75mmol/L，例如约15-20或40-70mmol/L；
-无机或有机溶质组分的总量为15-75mmol/L，例如约15-20或40-70mmol/L；
-额外的氨基酸组分以5-30mmol/L范围内的量存在，优选5-12mmol/L，例如约10mmol/L。
-有效对抗氧自由基的组分的总量为高达5mmol/L，例如约3-5mmol/L。
-能量供应组分以至多20mmol/L的量存在，例如5mmol/L；
-具有胶体渗透性质的组分以0.5-3.0mmol/L范围内的量存在，例如约0.75-1.33mmol/L，例如1.0mmol/L，和20,000MW。
当存在具有钙转运阻断性质的组分(iv)时，钙转运阻断剂可以是例如尼卡地平或地尔硫卓。尼卡地平以0.0005-1.0mmol/L范围内的量存在，例如0.005mmol/L；地尔硫卓以0.0005-1.0mmol/L范围内的量存在，例如0.022mmol/L。
在某些组分以两种或更多种类型存在的情况下，相对量可以是关键的或非关键的。优选的有效对抗氧自由基的组分是约3mmol/L的还原型谷胱甘肽和0.35至0.4，更优选0.4mmol/L的别嘌呤醇。
优选的无机或有机溶质组分包括如下电解质：
-Na+，15-150mmol/L，例如30mmol/L；
-K+，0-25mmol/L，例如15mmol/L；
-Cl-，0-100mmol/L；
-OH-，0-75mmol/L。
优选地，根据本发明的溶液在缺氧条件下且不存在紫外线的情况下制备和储存。
一个特别的优点是，所定义的包含组分(i)-(vi)的溶液可以长期保存，并且在其使用前立即添加临床使用所需的额外组分(例如肝素)。本发明的溶液的一个特别优点是该溶液可以长时间保存而不会产生不希望的降解产物。更特别地，可以在不产生乙酸和氨中的一种或两种且没有乙酰胺产生的情况下存储溶液。
或者，该溶液可以在乙酸和氨中的一种或两种的产生，和/或乙酰胺的产生下储存，产生量小于水杨酸和谷氨酸各自的摩尔当量。
如本文定义的本发明的保存溶液优选包含基本组分(i)-(vi)，以及用于特定功能的额外组分。用于保存器官的溶液比用于保存简单细胞体系的溶液特别地更加复杂，但是，我们发现，该溶液可能仍然相对简单。
优选用于腹腔内器官如肾脏、肝脏和胰腺，还有小肠、大肠等的保存溶液包含本文定义的组分(i)-(vi)，以及选自不透性螯合阴离子组分的至少一种组分；具有胶体渗透性质的组分；并且更优选地，额外地一种或多种选自以下的组分：
-无机或有机溶质组分；
-额外的氨基酸组分；
-有效对抗氧自由基的组分；和
-能量供应组分。
优选地，用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存的保存溶液包括以下组合：
(i)注射用水；
(ii)二糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)至少一种钙转运或通道阻断剂；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)如前定义的游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；以及不透性的螯合阴离子、无机溶质、有效对抗氧自由基和胶体渗透的组分以及本文定义的任何任选的额外组分；
更优选地是以下组合：
(ii)注射用水；
(ii)蔗糖；
(iii)Na2HPO4和NaH2PO4；
(iv)地尔硫卓或尼卡地平；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)如前定义的游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；以及如上文所定义的乳糖醛酸、KOH和NaOH、谷胱甘肽、别嘌呤醇和PEG，以及本文定义的任何任选的额外组分；更优选包含以下给出的组分类别的组合，更优选包含列出的特定类型，并且基本上按以下列出的量，以及如本文所述的任何任选的额外组分(当在水中定容时)：
Figure BDA0002365785110000171
条件是如果(v)是阿司匹林，则(vi)不是谷氨酰胺；
当在水中定容时，最优选基本上是以下所列的量，以及上文定义的任何任选的额外组分：
组分 类型 量(mmol/L)
不透性的螯合阴离子组分 乳糖醛酸 50
无机溶质组分 KOH 15
无机溶质组分 NaOH 35
有效对抗氧自由基的组分 谷胱甘肽 3
pH缓冲剂组分(iii) Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 26.45
pH缓冲剂组分(iii) NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 16.66
谷氨酸或谷氨酰胺(vi) 谷氨酸或谷氨酰胺 <20或19.9；或20
糖组分(ii) 蔗糖 100
水杨酸或阿司匹林(v) 水杨酸，或阿司匹林 <0.5或0.49,或0.5
有效对抗氧自由基的组分 别嘌呤醇 0.4
具有钙转运阻断性质的组分(iv) 地尔硫卓 0.0022
胶体组分 PEG(20,000MW) 1
条件是如果(v)是阿司匹林，则(vi)不是谷氨酰胺。
此外，我们惊讶地发现，通过用某些组分的主要降解产物代替某些组分，可以提高根据本发明的保存溶液的组分的有效性。不受限于该理论，似乎这种降解的副产物在单独使用或组合使用保存溶液期间会产生有害的毒性作用。例如，乙酸和氨形成乙酰胺，其可能会损害肝脏。通过消除这种毒性作用，提高了保存溶液的有效性。
因此，根据本发明的发现在于，某些可替代组分对于保存对于所有细胞类型而言必不可少的主要细胞功能是必不可少的，并且这些可替代组分已被确定为本文所定义的组分(i)至(vi)。尽管该溶液在保存简单的组织或细胞体系方面可能是非常有效或令人满意的，但是如果需要保存需要或提供异常或更复杂细胞功能的器官或细胞体系，则必须掺入专门用于保存必需或提供功能(无论是肌肉功能、电功能、特定的膜活动、能量供应等)的可替代组分。
因此，本发明特别提供了如本文所定义的用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存的保存溶液。
该溶液合适地通过本领域已知的方法在药学上可接受的条件下通过简单混合来制备。优选地，确定组分并以期望的摩尔浓度掺入。
应当理解，变化对于溶液的有效性可以是特定或非特定的，并且对流体性能没有影响的变化量被认为落入本发明的范围内。认为对于组分类型的选择和通过常规实验进行所需量的验证落入本发明的范围内。
在本发明的另一方面，提供了一种制备保存溶液的方法，该方法包括向水中依次添加组分(i)-(vi)，并添加除具有胶体渗透性质的组分和不稳定组分(如果有的话，例如阿司匹林或谷氨酰胺)以外的其他组分；并且溶解混合物；添加具有胶体渗透性质的组分，如果有的话；并使溶液几乎达到定容体积；最后定容以调节pH，灭菌并冷却至0-4℃。如果需要，可以将溶液储存起来，并随后在使用前立即加入任何不稳定组分(例如阿司匹林和/或谷氨酰胺)。根据本发明该方面的方法可以包括包装所制备的溶液以用于存储，优选在降低的温度下，更优选在0-12℃的范围内，最优选在0-4℃的温度下进行包装，例如在缺氧条件且没有紫外线的情况下包装制备好的溶液。
在另一方面，提供了通过本文所述的方法获得的保存溶液。
在本文的实施方案中，提供了通过包括向水中添加组分(i)-(vi)的方法获得的保存溶液。
在本发明的另一方面，提供了本文定义的保存溶液作为冲洗保存溶液或冷藏保存溶液用于在没有血液供应的情况下保存细胞，特别是防止器官、活体组织和细胞的损害的用途。该溶液适用于小型或大型动物或哺乳动物，特别是人类细胞、组织和器官。
该溶液可用于以下用途：在包括来自心脏跳动或非心脏跳动供体的器官的移植中的用途，在包括任何热或冷局部缺血的情况下的手术中的用途，在整个四肢或整个身体的保存中的用途，在活体组织实验中的用途，或在工程化细胞、组织和器官等的培养和保存中的用途。优选地，该溶液用作冲洗溶液，其通过血管体系与细胞、组织或器官、四肢或整个身体接触，并且任选地还用作用于储存经冲洗的细胞、组织和器官的保存溶液。该溶液适用于在低温静态存储和低温机器灌注体系中长期保存细胞、组织、器官。
因此，本发明特别提供了如本文所定义的用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存的保存溶液。
在本发明的另一方面，提供了一种用于冲洗、保存或冲洗保存细胞，特别是活体细胞、组织或器官的方法，其中使细胞、组织或器官与本文所定义的溶液接触。
根据本发明的这个方面，提供了一种用于简单低温保存细胞，特别是活体细胞、组织或器官的冲洗、保存或冲洗保存的方法，其中使细胞、组织或器官与保存溶液接触，所述保存溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖，例如单糖、二糖、三糖或多糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；更特别地，其中如果(v)是阿司匹林，则(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸；并且如果(vi)是谷氨酰胺，则(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；
其中用溶液冲洗细胞、组织或器官，将其从正常位点移开，冷却至通常在零至12℃之间的温度，并储存。
根据本发明的该方面，如果不存在乙酰胺，则不存在乙酸和氨中的至少一种。
根据本发明的一个方面，该方法包括活体细胞、组织或器官的冲洗保存。
根据本发明的另一方面，该方法包括活体细胞、组织或器官的冷藏保存。
在根据本发明该方面的优选方法中，阿司匹林被游离形式或盐形式的水杨酸代替，而谷氨酰胺被游离形式或盐形式的谷氨酸代替，使得溶液中基本上不存在阿司匹林和谷氨酰胺，优选额外地不存在乙酰胺和/或额外地不存在乙酸，氨和乙酰胺，更特别地，其中(v)为游离形式或盐形式的水杨酸，并且(vi)为游离形式或盐形式的谷氨酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于简单低温保存细胞，特别是活体细胞、组织或器官的保存方法，其中使细胞、组织或器官与保存溶液接触，该保存溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖，例如单糖、二糖、三糖或多糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；和
至少一种具有低温保护性质的组分(即低温保护剂)；
条件是不存在乙酰胺和/或额外地不存在乙酸和氨中的至少一种；更特别地，其中如果(v)是阿司匹林，则(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸；并且如果(vi)是谷氨酰胺，则(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；
其中用溶液冲洗细胞、组织或器官，将其从正常位点移开，冷却至通常在-20℃至12℃之间的温度，并储存。
根据本发明的该方面，如果不存在乙酰胺，则不存在乙酸和氨中的至少一种。
该方法可以用于简单的低温储存，其中用溶液冲洗细胞、组织或器官，将其从正常位点移开，冷却，优选冷却至通常在零至12℃之间的温度并储存。此外，如果存在低温保护剂，则组织或器官可以在约-20℃至约4℃的温度下存储。此外，溶液可以通过器官进行主动冲洗。我们已经发现，细胞、组织或器官的保存时间可以超过目前实际应用的时间，例如肾脏和肝脏可以保存48小时或更长时间。此外，或可替代地，该方法用于保存细胞，特别是组织或器官，其中将细胞、组织或器官进行冲洗并使其处于低温状态，并通过浸入或灌注与保存溶液接触。
优选地，本发明的方法包括以有效速率或有效浓度向细胞、组织、器官或供体施用生物学有效量的本发明溶液，以维持或增强其功能。优选地，该方法是用于以下所列的方法：保存某些细胞、组织或器官功能，例如细胞新陈代谢；和/或用于暂时停止某些功能，例如肌肉活动、基本细胞组分的分解或排泄等；和/或排泄产物，例如胆汁或尿液等形式。
局部缺血是由于血液停止流经器官而导致的情况。造成这种影响的原因是缺乏氧气和营养，以及二氧化碳和其他废物的积累。在体温下比在低温下更具破坏性，这就是为什么移植器官被冲洗和冷却的原因。器官供体经常遭受创伤，因此，由于创伤，供体器官可能经历了一段热局部缺血。实验上，在冲洗之前添加一段热局部缺血可以模仿这种情况。我们的溶液可保护使其免受这种热局部缺血的损害，这是一个优势。
优选地，冲洗灌注在至多300mmHg，更优选在大气压至200mmHg的范围内，更优选在至多160mmHg的范围内，更优选至多100mmHg，最优选至多50mmHg的压力下进行。
根据本发明该方面的方法包括使用本文定义的保存溶液。
在本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包括保存溶液，其在第一部分中具有如本文所述的组分(i)-(vi)；以及任选地在一个或多个其他部分中具有单独组分，所述单独组分选自如本文所述的一种或多种额外组分，其用于制备用于特定目的的一种或多种溶液；并用作通用保存溶液。
在实施方案中，本文的试剂盒包括保存溶液，该保存溶液在一个部分中具有如本文所定义的组分(i)-(vi)，在一个或多个其他部分中不存在一种或多种不稳定组分并且将该不稳定组分单独提供，以在使用前立即添加。
根据本发明的一个方面，试剂盒包括具有本文所述的具有组分(i)-(vi)的冲洗保存溶液。
根据本发明的另一方面，所述试剂盒包括具有本文所述的组分(i)-(vi)的冷藏保存溶液。
现在参考实施例并参考附图以非限制性方式说明本发明，其中：
图1示例了阿司匹林在保存溶液中的稳定性：利用HPLC方法以测量现有技术溶液中阿司匹林和水杨酸的浓度。在储存过程中，阿司匹林迅速水解为水杨酸和乙酸。8周后，没有任何母体化合物残留。
图2示例了与先前(现有技术)制剂相比，在肾脏保存于改良的保存溶液(本发明的溶液)中的血清肌酐。较低的血清肌酐表明减少了对器官的损害。
图3示例了猪肾脏在本发明的保存溶液中离体保存至多72小时。具有正常肾小球和肾小管的薄壁组织保存良好。H&E染色，放大40倍。
实施例1
1.1本发明中使用的冲洗保存溶液
表1、2、3和4列出了本研究中涉及的保存溶液，用量以mmol/L表示。溶液(SOLS)由一半装满水的烧瓶补足成，向其中依次添加以下任意物质或全部：乳糖醛酸、KOH、磷酸钠、谷氨酰胺或谷氨酸、蔗糖、阿司匹林或水杨酸、别嘌呤醇和地尔硫卓，并溶解。然后加入胶体(PEG)，溶液几乎达到定容。加入NaOH以设定pH。然后将溶液补足至定容。通过过滤将所有溶液灭菌，并在4℃下储存在玻璃瓶中。在制备过程中或使用前立即添加还原型谷胱甘肽。物质来源如上所述或在WO 02/41696中公开。
比较例
WO 02/41696中公开和描述了先前的制剂，其如本文表1所示。UW是标准的原始商业溶液(通过Span/BELZER UW，DU PONT PHARMA获得)。
比较例保存溶液的组成
比较例保存溶液的组成列于表1：
表1
Figure BDA0002365785110000241
Figure BDA0002365785110000251
本发明的冷藏保存溶液的组成
表2说明了本发明的冷藏保存溶液的组成：
表2
Figure BDA0002365785110000252
Figure BDA0002365785110000261
本发明的具有减少量的(v)和/或(vi)的冷藏保存溶液的组成
表3中示出了本发明的具有减少量的(v)和/或(vi)的冷藏保存溶液的组成：
表3
Mmol/L SOL2.1 SOL2.2 SOL2.3
乳糖醛酸 50 50 50
KOH 5 5 5
NaOH 45 45 45
谷胱甘肽 3 3 3
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 26.45 26.45 26.45
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 16.66 16.66 16.66
谷氨酸(vi) 12 0 12
谷氨酰胺(vi) 0 20 0
蔗糖 100 100 100
水杨酸(v) 0.3 0.3 0
阿司匹林(vi) 0 0 0.5
别嘌呤醇 0.4 0.4 0.4
地尔硫卓 0.022 0.022 0.022
PEG(20,000MW) 1 1 1
本发明的具有减少量的(v)和/或(vi)的冷藏保存溶液的组成
表4中示出了本发明的具有减少量的(v)和/或(vi)的冷藏保存溶液的组成：
表4
Figure BDA0002365785110000271
实施例2
在以下体系中研究了比较例溶液和本发明的冲洗保存溶液。
2.1.1现有技术的冲洗保存溶液产生的有毒代谢产物的产生和影响
发现在国际专利申请号WO 02/41696中描述的冲洗保存溶液在储存时产生代谢产物，所述代谢产物可能对储存的细胞/组织/器官有毒。例如，图1示例了将溶液储存8周会导致阿司匹林至水杨酸的100％转化，并产生等摩尔量的有害乙酸。在最初包含0.5mM阿司匹林的溶液中，这导致形成0.5mM乙酸(30mg/L)。乙酸是已知的刺激性物质，对人体组织有损害。
作为进一步的实例，通过比色测定显示了现有技术溶液中氨的存在。氨测定试剂盒(ab83360)提供了一种快速、简单、灵敏和可靠的测定方法，适用于氨和铵的研究和高通量测定。在测定中，氨和铵被转化为产物，该产物与OxiRed探针反应生成有色物质(λmax＝570nm)，其可通过酶标仪轻松定量。该试剂盒可检测到1nmol(～20μM)总量的氨和铵，这比使用基于NADPH来测量氨的测定法的灵敏度高得多。使用该方法，证明了现有技术溶液包含约2.6mM氨。这比已知的氨毒性大很多倍，已知300μM已对人细胞具有毒性1。与之相比，在本发明的溶液中，基本上不存在氨，低于该定量检测的下限，小于2nmol。
氨中毒会引起细胞吸收钾的紊乱。这会对所有器官和组织造成有害影响，改变pH、膜电位和代谢2。在体内，氨通常会通过肝素尿素循环解毒。然而，这在保存溶液的保存或使用期间不会发生，因为在低温保存过程中细胞的代谢活性被有意地抑制。这意味着现有技术溶液中的氨在保存期间一直保留，并且在再灌注时存在细胞受损的巨大风险。在本发明的溶液中，不存在氨，并且不会发生这种损害。
Figure DA00023657851161295
在最初包含20mM谷氨酰胺或约2.6mM氨和0.5mM阿司匹林或至多0.5mM乙酸的溶液中，这导致形成至多0.5mM的乙酰胺(30mg/L)。已知乙酰胺会损害人体组织。
2.1.2本发明的冲洗保存溶液中不存在有毒的代谢产物
在本发明的不含阿司匹林的溶液中：SOL 1.1、SOL 1.2、SOL 2.1、SOL 2.2、SOL3.1和SOL 3.2，即使在储存后也基本上不存在乙酸，低于定量检测的下限。
在本发明的另一溶液中，在使用前立即添加阿司匹林，在使用期间基本上不存在乙酸或乙酸的含量降低。
在本发明的不存在谷氨酰胺的溶液中：SOL 1.1、SOL 1.3、SOL 2.1、SOL 2.3、SOL3.1和SOL 3.3，即使在储存后也基本上不存在氨，低于定量检测的下限，小于2nmol。
在本发明的另一溶液中，在使用前立即刻添加谷氨酰胺，在使用期间基本上不存在氨或氨的含量降低。
此外，在本发明的所有溶液中：SOL 1.1、SOL 1.2、SOL 1.3、SOL 2.1、SOL 2.2、SOL2.3、SOL 3.1、SOL 3.2和SOL 3.3，均不存在阿司匹林或谷氨酰胺或两者都不存在，并且即使在储存后也基本上不存在乙酰胺。
2.2猪移植模型
为了真正评估保存溶液的质量，有必要采用整个动物模型来评估使用测试溶液进行移植的临床结果。猪模型最适合于此。简而言之，该方案包括摘取器官(肝脏、肾脏、小肠或胰腺)，在测试(本发明)或对照溶液(比较例)中进行冲洗保存，然后植入(根据所考虑的器官进行异体或自体移植)。手术后在临床上适当的时间长度内监测受体的器官功能和整体健康状况。
下表给出了用于评估受体动物中移植器官功能性的测量指标。此外，还要监测动物的整体健康状况(体重、食物消耗等)。在研究结束时，处死动物并收集关键器官以用于组织学分析。
Figure BDA0002365785110000301
肌酐是与肾脏功能直接相关的关键血液标志物。正常运作的肾脏将维持低的肌酐浓度；高水平表示肾脏功能不佳。移植后，如果/当肾脏功能恢复时，血清肌酐有望升高，并且仅会降至正常水平。上升的幅度反映了因保存而损害的幅度。肌酐水平恢复正常的速度反映了肾脏恢复正常功能的速度；这本身就是器官保存状况的关键指标。图2示例了最近的一项研究，其中本发明的保存溶液显著优于现有技术的溶液；肌酐峰值明显降低，肾脏功能更快地恢复正常。这证明本发明的溶液大大减少了组织损伤。
组织学
对从灌注了威斯康星大学(UW)(可作为
Figure BDA0002365785110000302
冷藏溶液市售获得)或本发明的保存溶液长达72小时的动物的腹腔器官(肝脏、肾脏、胰腺和小肠)收集的组织样品进行组织学检查。标准比较溶液(例如UW)通常能够保存组织长达约12-24小时。通过本发明的保存溶液保存了长达72小时后，由苏木精&曙红染色的组织样品(图3)显示了样品的正常形态和良好保存。在UW组中观察到更好地保留了细胞质内容物，并且核重影也存在，这在本发明的保存溶液中是不存在的。在48和72小时的UW样品中，其他核重影是明显的，而本发明的保存溶液中的样品却没有。这证明了本发明的保存溶液在延长的保存时间内大大减少了对于细胞的损伤。

Claims (102)

1.在没有血液供应的情况下用于保存细胞、组织和/或器官的保存溶液，所述溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林。
2.根据权利要求1所述的保存溶液，其中如果(v)是阿司匹林，则(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸。
3.根据权利要求1所述的保存溶液，其中如果(vi)是谷氨酰胺，则(v)是游离形式或盐形式的水杨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的保存溶液，其中所述溶液是冲洗保存溶液。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的保存溶液，其中所述溶液是冷藏保存溶液。
6.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中不存在阿司匹林。
7.根据权利要求6所述的保存溶液，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸或谷氨酰胺；并且不存在阿司匹林和/或其中不存在乙酸和/或乙酰胺。
8.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中不存在谷氨酰胺。
9.根据权利要求8所述的保存溶液，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸；并且不存在谷氨酰胺和/或其中不存在氨和/或乙酰胺。
10.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中不存在阿司匹林和谷氨酰胺。
11.根据权利要求10所述的保存溶液，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；(vi)为游离形式或盐形式的谷氨酸，条件是不存在乙酰胺和/或不存在乙酸和氨。
12.根据权利要求10所述的保存溶液，其中不存在乙酰胺和/或不存在阿司匹林和谷氨酰胺。
13.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的保存溶液，其中不存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
15.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中游离形式或盐形式的水杨酸的量为小于0.5mmol/L。
16.根据权利要求15所述的保存溶液，其中游离形式或盐形式的水杨酸的量为约0.025至约0.275mmol/L。
17.根据权利要求9所述的保存溶液，其中如果存在阿司匹林，则其量为约0.3mmol/L至约1.0mmol/L。
18.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中以游离形式或盐形式存在的谷氨酸的量为小于20mmol/L。
19.根据权利要求18所述的保存溶液，其中以游离形式或盐形式存在的谷氨酸的量为约2至约12mmol/L。
20.根据权利要求11所述的保存溶液，其中如果存在谷氨酰胺，则其量为约15mmol/L至约30mmol/L。
21.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述糖选自蔗糖、棉籽糖和甘露醇中的一种或多种。
22.根据权利要求21所述的保存溶液，其中所述糖是蔗糖。
23.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述pH缓冲剂选自磷酸钠缓冲剂和磷酸钾缓冲剂等。
24.根据权利要求23所述的保存溶液，其中所述pH缓冲剂选自Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4和KH2PO4等、及其组合。
25.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述钙转运阻断剂或抗钙活性剂选自任何已知的钙转运阻断剂或通道阻断剂，例如尼卡地平、地尔硫卓、维拉帕米、尼索地平、氯丙嗪或三氟啦嗪中的一种或多种。
26.根据权利要求25所述的保存溶液，其中所述钙转运阻断剂或抗钙活性剂是尼卡地平和/或地尔硫卓。
27.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包含至少一种很大程度上不可渗透到细胞中的阴离子。
28.根据权利要求27所述的保存溶液，其中很大程度上不可渗透到细胞中的阴离子是不透性的螯合阴离子。
29.根据权利要求27所述的保存溶液，其中所述不透性的螯合阴离子包括乳糖醛酸根或乳糖醛酸。
30.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括至少一种具有胶体渗透性质的组分。
31.根据权利要求30所述的保存溶液，其中具有胶体渗透性质的组分包括聚乙二醇(PEG)、琥珀酰化的明胶(如在Gelofusine中)、Ficoll(多糖)或淀粉产品。
32.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括无机或有机溶质。
33.根据权利要求32所述的保存溶液，其中所述无机或有机溶质是包括阳离子和/或阴离子，例如选自Na+、K+、Cl-、OH-等及其组合的电解质。
34.根据权利要求32所述的保存溶液，其中所述无机溶质是NaCl。
35.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包含至少一种具有钙螯合性质的组分。
36.根据权利要求35所述的保存溶液，其中具有钙螯合性质的组分包括柠檬酸盐或EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸)。
37.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括至少一种具有铁螯合性质的组分。
38.根据权利要求37所述的保存溶液，其中具有铁螯合性质的组分包括EDTA(乙二胺四乙酸)。
39.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液除谷氨酸和/或谷氨酰胺之外还包含一种或多种(额外的)氨基酸。
40.根据权利要求39所述的保存溶液，其中所述额外的氨基酸是甘氨酸或正乙酰基半胱氨酸或其组合。
41.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包含至少一种有效对抗氧自由基或氧自由基产生的组分。
42.根据权利要求41所述的保存溶液，其中所述有效对抗氧自由基或氧自由基产生的组分选自别嘌呤醇和还原型谷胱甘肽，或其组合。
43.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括至少一种能量供应体系的组分或影响能量供应体系的组分或酮体。
44.根据权利要求43所述的保存溶液，其中所述能量供应体系的组分包括腺苷。
45.根据权利要求43所述的保存溶液，其中所述酮体包含β-羟基丁酸酯。
46.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括在肌肉的横桥功能下可逆地起作用的组分。
47.根据权利要求46所述的保存溶液，其中在肌肉的横桥功能下可逆地起作用的组分是丁烷-二酮-单肟。
48.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括至少一种影响蛋白质向细胞膜中插入和从细胞膜中去除的组分。
49.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包括至少一种细胞内信号转导体系的组分或对该体系进行修饰的组分。
50.根据权利要求49所述的保存溶液，其中所述细胞内信号转导体系的组分或对该体系进行修饰的组分是蛋白激酶抑制剂或钙调素蛋白抑制剂。
51.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包含至少一种具有膜稳定化作用的组分。
52.根据权利要求51所述的保存溶液，其中所述具有膜稳定化作用的组分是雷诺嗪。
53.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述保存溶液包含至少一种具有低温保护作用的组分。
54.根据权利要求53所述的保存溶液，其中所述具有低温保护作用的组分是糖脂。
55.根据前述权利要求中任一项或多项所述的保存溶液，用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存，其包含以下的组合：
(i)注射用水；
(ii)二糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)至少一种钙转运或通道阻断剂；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺，其如上文所定义；以及不透性的螯合阴离子、无机溶质、有效对抗氧自由基和胶体渗透的组分，以及任何任选的如上文所定义的额外组分。
56.根据前述权利要求中任一项或多项所述的保存溶液，用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存，其包含以下的组合：
(i)注射用水；
(ii)蔗糖；
(iii)Na2HPO4和NaH2PO4；
(iv)地尔硫卓；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺，其如上文所定义；以及乳糖醛酸、KOH和NaOH、谷胱甘肽、别嘌呤醇和PEG，以及任何任选的如上文所定义的额外组分。
57.根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液，其中所述溶液的pH在6.5-7.8的范围内。
58.根据权利要求57所述的保存溶液，其中所述溶液的pH在6.5-7.0的范围内。
59.根据权利要求57所述的保存溶液，其中所述溶液的pH在6.8-7.0的范围内。
60.一种用于肝脏、肾脏、小肠和胰腺保存的保存溶液，其包括根据前述权利要求中任一项所述的保存溶液。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的保存溶液作为冲洗溶液、保存溶液或冲洗保存溶液用于在没有血液供应的情况下保存细胞，特别是防止器官、活体组织和细胞受损的用途。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述溶液是冲洗保存溶液。
63.根据权利要求61所述的用途，其中所述溶液是冷藏保存溶液。
64.根据权利要求61至63所述的保存溶液的用途，其包括以下用途：在包括来自心脏跳动或非心脏跳动供体的器官的移植中的用途，在包括任何热或冷局部缺血的情况下的手术中的用途，对整个四肢或整个身体的保存中的用途，在活体组织实验中的用途，或在工程化细胞、组织和器官、四肢或整个身体的培养和保存中的用途。
65.根据权利要求61至62所述的保存溶液的用途，其中所述保存溶液通过血管体系与细胞、活体组织、器官，四肢或整个身体接触，并且任选地还用作用于保存经冲洗的细胞、组织和器官的保存溶液。
66.根据权利要求61至63所述的保存溶液的用途，其包括在低温静态存储器中和在低温机器灌注体系中对细胞、组织、器官延长的保存。
67.根据权利要求61至64所述的保存溶液的用途，其中所述器官是肝脏、肾脏、小肠和/或胰腺。
68.一种用于简单地低温储存细胞，特别是活体细胞、组织或器官的保存方法，其中使细胞、组织或器官与保存溶液接触，该保存溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
条件是不存在乙酰胺和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺，并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；
其中用溶液冲洗细胞、组织或器官，将其从正常位点移开，冷却至通常在零至12℃之间的温度，并储存。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述方法包括活体细胞、组织或器官的冲洗保存。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述方法包括活体细胞、组织或器官的冷藏保存。
71.根据权利要求68至70所述的方法，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸。
72.根据权利要求68至71所述的方法，其中不存在阿司匹林。
73.根据权利要求68至72所述的方法，其中(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸。
74.根据权利要求68至72所述的方法，其中不存在谷氨酰胺。
75.根据权利要求68至74所述的方法，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；并且(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸。
76.根据权利要求68至74所述的方法，其中不存在阿司匹林和谷氨酰胺。
77.根据权利要求68至76所述的方法，其中存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
78.根据权利要求68至76所述的方法，其中不存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
79.一种用于简单地低温储存细胞，特别是活体细胞、组织或器官的冲洗、保存或冲洗保存的方法，其中使所述细胞、组织或器官与保存溶液接触，该保存溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；和
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；
至少一种具有低温保护性质的组分；
条件是不存在乙酰胺和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺，并且如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；
其中用溶液冲洗细胞、组织或器官，将其从正常位点移开，冷却至通常在-20℃至8℃之间的温度，并储存。
80.根据权利要求79所述的方法，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸。
81.根据权利要求79所述的方法，其中不存在阿司匹林。
82.根据权利要求79至81所述的方法，其中(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸。
83.根据权利要求79所述的方法，其中不存在谷氨酰胺。
84.根据权利要求79至86所述的方法，其中(v)是游离形式或盐形式的水杨酸；并且(vi)是游离形式或盐形式的谷氨酸。
85.根据权利要求79所述的方法，其中不存在阿司匹林和谷氨酰胺。
86.根据权利要求79至82所述的方法，其中存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
87.根据权利要求79至82所述的方法，其中不存在至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分。
88.根据权利要求79或84所述的方法，其中所述方法用于保存细胞，特别是组织或器官，其中所述细胞、组织或器官已被冲洗并置于低温状态，并通过浸入或灌注与所述保存溶液接触。
89.根据权利要求79或85中任一项所述的方法，其包括以有效速率或有效浓度向细胞、组织、器官或供体施用生物学有效量的保存溶液，以维持或增强其功能，其中所述方法是用于保存某些细胞、组织或器官功能，和/或用于暂时停止某些功能的方法。
90.根据权利要求79或89中任一项所述的方法，其中在高达300mmHg的压力下进行冲洗灌注。
91.根据权利要求79或89中任一项所述的方法，其中所述保存溶液如权利要求1至61中任一项所定义。
92.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至60中任一项所述的保存溶液，其在第一部分中具有组分(i)-(vi)；以及任选地在一个或多个其他部分中具有单独组分，所述单独组分选自一种或多种权利要求17至60所定义的额外组分；
或者，所述试剂盒在一部分中具有如本文所定义的组分(i)-(vi)，其中不存在一个或多个不稳定组分，且该一个或多个不稳定组分在一个或多个其他部分中单独提供以用于在使用前立即添加，
所述试剂盒用于制备一种或多种用于特定目的的冲洗溶液，并用作通用冲洗、保存或冲洗保存溶液。
93.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述保存溶液包括冲洗保存溶液。
94.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述保存溶液包括冷藏保存溶液。
95.根据权利要求1至60中任一项所述的保存溶液的制备方法，其包括向水中依次添加组分(i)-(vi)，并添加除具有胶体渗透性质的组分和不稳定组分以外的其他组分，如果有的话；并且溶解混合物；添加具有胶体渗透性质的组分，如果有的话；并使溶液几乎按体积补足；最后定容以调节pH，灭菌并冷却。
96.根据权利要求95所述的方法，其中在没有紫外线且在缺氧条件下制备和储存溶液。
97.根据权利要求95或96所述的方法，其中在不存在任何不稳定组分的情况下配制溶液并储存，随后在使用前立即添加此类不稳定组分。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述溶液在不产生氨和乙酸且不产生其任何反应产物如乙酰胺的情况下被存储。
99.通过权利要求95至98中任一项所述的方法获得的保存溶液。
100.通过包括向水中加入前述权利要求中任一项所述的组分(i)-(vi)的方法获得的保存溶液。
101.在没有血液供应的情况下用于保存细胞、组织和/或器官的保存溶液，所述溶液包括：
(i)注射用水；
(ii)至少一种糖；
(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；
(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；
(v)游离形式或盐形式的水杨酸，和/或阿司匹林；
(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，和/或谷氨酰胺；
条件是如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；和/或其中如果存在阿司匹林和/或乙酰胺和/或乙酸，则水杨酸的存在量超过归因于来自阿司匹林降解所得的量，例如由任何存在的乙酸和任何乙酰胺之和所确定的；和/或
其中如果存在谷氨酰胺和/或乙酰胺和/或氨，则所存在的谷氨酸的量超过归因于来自谷氨酰胺降解所得的量，例如由任何存在的氨和任何乙酰胺之和所确定的。
102.参照所附说明书并且如本文所述的保存溶液、用途、方法或试剂盒。
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