CN107047542B - 一种无血清细胞冻存液 - Google Patents

一种无血清细胞冻存液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无血清细胞冻存液，由氨基酸组分、无机盐组分、白蛋白、细胞外冷冻保护剂等组成。本发明的细胞冻存液，含有双重保护成份，从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤，大大提高了细胞的复苏率，适应广泛的细胞系保存(可用于细胞长期的保存，可应用于细胞库的建立，科研细胞株保存，临床间充质干细胞、单核细胞、免疫细胞以及所涉及到的所有哺乳动物细胞的长期保存)，同时本发明的细胞冻存液中为完全无血清冻存液，避免了临床应用中引入的异种外源成份，更加安全。

Description

一种无血清细胞冻存液
技术领域
本发明涉及一种无血清细胞冻存液。
背景技术
细胞冻存液在保存细胞时，通过冷冻保护剂在冻存过程对细胞进行保护，传统的细胞保护剂仅为细胞内保护剂，细胞受冻存时容易受到冰晶的损伤，细胞复苏率低，无法有效保护细胞。另外，现有技术中的细胞冻存液通常含有动物源性物质，成分复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种无血清细胞冻存液，可用于细胞长期的保存，可应用于细胞库的建立，科研细胞株保存，临床间充质干细胞、单核细胞、免疫细胞以及所涉及到的所有哺乳动物细胞的长期保存。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种无血清细胞冻存液，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸100～300；
CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；
L-天门冬酰胺25～75；
L-天门冬氨酸10～30；
L-谷氨酸10～30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002；
L-谷氨酰胺0～500；
ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；
甘氨酸5～15；
CoCl2·6H2O 0.001～0.008；
L-组氨酸10～30；
NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；
L-异亮氨酸25～75；
Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；
L-赖氨酸盐酸20～60；
SnC12·2H2O 0.00001～0.0001；
L-蛋氨酸10～30；
Na2SeO3 0.002～0.01；
L-苯丙氨酸10～30；
FeSO4·7H2O 0.2～1.6；
L-脯氨酸10～30；
葡萄糖1000～4000；
L-丝氨酸15～45；
维生素C O.176～0.704；
L-苏氨酸10～30；
对羟基苯甲酸0.5～1.5；
L-色氨酸5～15；
丙酮酸钠55～550；
L-缬氨酸1O～30；
亚油酸0.01～0.05；
L-亮氨酸25～75；
β-巯基乙醇0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠144～432；
L-胱氨酸二盐酸25～75；
人白蛋白1000～10000；
DMSO(二甲基亚砜)50～100mL/L；
细胞外冷冻保护剂1000～5000；
余量为水。
所述细胞外冷冻保护剂选自羟乙基淀粉，可购自sigma。
本发明的无血清细胞冻存液的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
本发明的细胞冻存液，含有双重保护成份，从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤，大大提高了细胞的复苏率，适应广泛的细胞系保存，同时本发明的细胞冻存液中为完全无血清冻存液，避免了临床应用中引入的异种外源成份，更加安全。
本发明的细胞冻存液，提高了细胞冻存的复苏率，细胞冻存适应性更广泛，冻存复苏率平均达到90％以上，同时该产品可保存于2～8℃，冻存细胞时无需程序降温，可直接置于-80℃冻存，12h后直接置于液氮保存，在操作上简化了大量的冻存程序，同时产品更稳定，无需担心反复冻融对产品的影响。
附图说明
图1：采用本发明的细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片。
图2：采用传统细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片。
图3：采用本发明的细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏48小时后的照片。
图4：采用传统细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏48小时后的照片。
图5：采用本发明的细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片。
图6：采用传统细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片。
图7：采用本发明的细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片。
图8：采用传统细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片。
图9：采用本发明的细胞冻存液冻存A549(肺癌细胞)并复苏的照片。
图10：采用传统细胞冻存液冻存A549(肺癌细胞)并复苏的照片。
图11：采用本发明的细胞冻存液冻存A549(肺癌细胞)并复苏48小时后的照片。
图12：采用传统细胞冻存液冻存A549(肺癌细胞)并复苏48小时后的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1制备细胞冻存液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸200；
CuSO4·5H2O 0.001；
L-天门冬酰胺50；
L-天门冬氨酸20；
L-谷氨酸20；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0001；
L-谷氨酰胺250；
ZnSO4·7H2O 0.3；
甘氨酸10；
CoCl2·6H2O 0.004；
L-组氨酸20；
NaSiO3·9H2O 0.005；
L-异亮氨酸50；
Na3VO4·12H2O 0.002；
L-赖氨酸盐酸40；
SnC12·2H2O 0.00005；
L-蛋氨酸20；
Na2SeO3 0.006；
L-苯丙氨酸20；
FeSO4·7H2O 1.0；
L-脯氨酸20；
葡萄糖2500；
L-丝氨酸30；
维生素C O.500；
L-苏氨酸20；
对羟基苯甲酸1.0；
L-色氨酸10；
丙酮酸钠300；
L-缬氨酸20；
亚油酸0.03；
L-亮氨酸50；
β-巯基乙醇2.0；
二水L-酪氨酸二钠300；
L-胱氨酸二盐酸50；
人白蛋白5000；
DMSO(二甲基亚砜)80mL/L；
细胞外冷冻保护剂2500；
余量为水。
所述细胞外冷冻保护剂为羟乙基淀粉，购自sigma，下同。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实施例2制备细胞冻存液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸100；
CuSO4·5H2O 0.0005；
L-天门冬酰胺75；
L-天门冬氨酸30；
L-谷氨酸10；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002；
L-谷氨酰胺500；
ZnSO4·7H2O 0.6；
甘氨酸5；
CoCl2·6H2O 0.001；
L-组氨酸30；
NaSiO3·9H2O 0.01；
L-异亮氨酸25；
Na3VO4·12H2O 0.0005；
L-赖氨酸盐酸60；
SnC12·2H2O 0.0001；
L-蛋氨酸10；
Na2SeO3 0.002；
L-苯丙氨酸30；
FeSO4·7H2O 0.1.6；
L-脯氨酸10；
葡萄糖1000；
L-丝氨酸45；
维生素C 0.704；
L-苏氨酸10；
对羟基苯甲酸0.5；
L-色氨酸15；
丙酮酸钠550；
L-缬氨酸1O；
亚油酸0.01；
L-亮氨酸75；
β-巯基乙醇4.0；
二水L-酪氨酸二钠144；
L-胱氨酸二盐酸25；
人白蛋白10000；
DMSO(二甲基亚砜)100mL/L；
细胞外冷冻保护剂1000；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实施例3制备细胞冻存液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸300；
CuSO4·5H2O 0.005；
L-天门冬酰胺25；
L-天门冬氨酸10；
L-谷氨酸30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0002；
L-谷氨酰胺100；
ZnSO4·7H2O 0.06；
甘氨酸15；
CoCl2·6H2O 0.008；
L-组氨酸10；
NaSiO3·9H2O 0.001；
L-异亮氨酸75；
Na3VO4·12H2O 0.005；
L-赖氨酸盐酸20；
SnC12·2H2O 0.00001；
L-蛋氨酸30；
Na2SeO3 0.01；
L-苯丙氨酸10；
FeSO4·7H2O 0.2；
L-脯氨酸30；
葡萄糖4000；
L-丝氨酸15；
维生素C O.176；
L-苏氨酸30；
对羟基苯甲酸1.5；
L-色氨酸5；
丙酮酸钠55；
L-缬氨酸30；
亚油酸0.05；
L-亮氨酸25；
β-巯基乙醇0.8；
二水L-酪氨酸二钠432；
L-胱氨酸二盐酸75；
人白蛋白1000；
DMSO(二甲基亚砜)50mL/L；
细胞外冷冻保护剂5000；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装(避免不稳定性成分被氧化)。
实验本发明的细胞冻存液的性能考察
利用本发明的细胞冻存液(实施例1制备)，冻存细胞，冻存方式为：将细胞加入细胞冻存液中，直接置于-80℃冻存，12h后直接置于液氮保存。细胞复苏时，快复苏，加新鲜培养液，离心取出保护液。
同时，以传统细胞冻存液(传统冻存液配方为：70％的DMEM+10％DMSO+20％的胎牛血清)为对照。也与日本ZENOAQ(厂家ZENOAQ，商品名称:cellbanker，商品号cellbanker2，)做对比。
使用方法的对比如表1所示(日本Q的使用方法同传统细胞冻存液)。细胞复苏率对比如表2所示。
表1
Figure BDA0001330182690000081
Figure BDA0001330182690000091
表2
细胞系名称 传统冻存液 YOCON冻存液 日本Q
A549(肺癌) 85％ 95％ 90％
MDCK(犬肾细胞) 90％ 95％ 90％
3T3(小鼠胚胎成纤维细胞) 90％ 93％ 92％
hepG2(肝癌细胞) 86％ 93％ 90％
MK2(恒河猴肾细胞) 80％ 95％ 91％
杂交瘤细胞 80％ 90％ 90％
MSC(间充质干细胞) 80％ 95％ 90％
单个核细胞(原代分离) 50％ 90％ 85％
CIK细胞 80％ 95％ 90％
由表2可见，采用本发明的细胞冻存液，可以不用梯度降温。细胞复苏率可达到90％以上，明显优于传统细胞冻存液和日本Q。
NK2细胞的复苏对比图如图1、图2所示，图1为采用本发明的细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片，图2为采用传统细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片，复苏48小时后的照片如图3、图4所示。由对比可见，本发明的细胞冻存液的复苏率(90％)明显优于传统细胞冻存液(80％)(通过复苏48小时后的照片可以得出细胞冻存后的存活率更高)。
外周血单个核细胞的复苏对比图如图5、图6所示，图5为采用本发明的细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片，图6为采用传统细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片。由对比可见，本发明的细胞冻存液的复苏率(90％)明显优于传统细胞冻存液(50％，碎片较多)。
杂交瘤细胞的复苏对比图如图7、图8所示，图7为采用本发明的细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片，图8为采用传统细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片。由对比可见，通过复苏48小时后的照片可以得出细胞冻存后的存活率更高。
A549(肺癌细胞)的复苏对比图如图9、图10所示，图9为采用本发明的细胞冻存液冻存A549(肺癌细胞)并复苏的照片，图10为采用传统细胞冻存液冻存A549(肺癌细胞)并复苏的照片，复苏48小时后的照片如图11、图12所示。由对比可见，本发明的细胞冻存液的复苏率(95％)明显优于传统细胞冻存液(85％)，通过复苏48小时后的照片可以得出细胞冻存后的存活率更高。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸100～300；
CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；
L-天门冬酰胺25～75；
L-天门冬氨酸10～30；
L-谷氨酸10～30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002～0.0002；
L-谷氨酰胺0～500；
ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；
甘氨酸5～15；
CoCl2·6H2O 0.001～0.008；
L-组氨酸10～30；
NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；
L-异亮氨酸25～75；
Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；
L-赖氨酸盐酸20～60；
SnC12·2H2O 0.00001～0.0001；
L-蛋氨酸10～30；
Na2SeO3 0.002～0.01；
L-苯丙氨酸10～30；
FeSO4·7H2O 0.2～1.6；
L-脯氨酸10～30；
葡萄糖1000～4000；
L-丝氨酸15～45；
维生素C O.176～0.704；
L-苏氨酸10～30；
对羟基苯甲酸0.5～1.5；
L-色氨酸5～15；
丙酮酸钠55～550；
L-缬氨酸1O～30；
亚油酸0.01～0.05；
L-亮氨酸25～75；
β-巯基乙醇0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠144～432；
L-胱氨酸二盐酸25～75；
人白蛋白1000～10000；
DMSO 50～100mL/L；
细胞外冷冻保护剂1000～5000；
余量为水；
无血清细胞冻存液的pH值为7.1～7.4。
2.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：所述细胞外冷冻保护剂选自羟乙基淀粉。
3.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸200；
CuSO4·5H2O 0.001；
L-天门冬酰胺50；
L-天门冬氨酸20；
L-谷氨酸20；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0001；
L-谷氨酰胺250；
ZnSO4·7H2O 0.3；
甘氨酸10；
CoCl2·6H2O 0.004；
L-组氨酸20；
NaSiO3·9H2O 0.005；
L-异亮氨酸50；
Na3VO4·12H2O 0.002；
L-赖氨酸盐酸40；
SnC12·2H2O 0.00005；
L-蛋氨酸20；
Na2SeO3 0.006；
L-苯丙氨酸20；
FeSO4·7H2O 1.0；
L-脯氨酸20；
葡萄糖2500；
L-丝氨酸30；
维生素C O.500；
L-苏氨酸20；
对羟基苯甲酸1.0；
L-色氨酸10；
丙酮酸钠300；
L-缬氨酸20；
亚油酸0.03；
L-亮氨酸50；
β-巯基乙醇2.0；
二水L-酪氨酸二钠300；
L-胱氨酸二盐酸50；
人白蛋白5000；
DMSO(二甲基亚砜)80mL/L；
细胞外冷冻保护剂2500；
余量为水。
4.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸100；
CuSO4·5H2O 0.0005；
L-天门冬酰胺75；
L-天门冬氨酸30；
L-谷氨酸10；
Ni(NO3)2·6H2O 0.00002；L-谷氨酰胺500；
ZnSO4·7H2O 0.6；
甘氨酸5；
CoCl2·6H2O 0.001；
L-组氨酸30；
NaSiO3·9H2O 0.01；
L-异亮氨酸25；
Na3VO4·12H2O 0.0005；
L-赖氨酸盐酸60；
SnC12·2H2O 0.0001；
L-蛋氨酸10；
Na2SeO3 0.002；
L-苯丙氨酸30；
FeSO4·7H2O 0.1.6；
L-脯氨酸10；
葡萄糖1000；
L-丝氨酸45；
维生素C 0.704；
L-苏氨酸10；
对羟基苯甲酸0.5；
L-色氨酸15；
丙酮酸钠550；
L-缬氨酸1O；
亚油酸0.01；
L-亮氨酸75；
β-巯基乙醇4.0；
二水L-酪氨酸二钠144；
L-胱氨酸二盐酸25；
人白蛋白10000；
DMSO(二甲基亚砜)100mL/L；
细胞外冷冻保护剂1000；
余量为水。
5.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸300；
CuSO4·5H2O 0.005；
L-天门冬酰胺25；
L-天门冬氨酸10；
L-谷氨酸30；
Ni(NO3)2·6H2O 0.0002；
L-谷氨酰胺100；
ZnSO4·7H2O 0.06；
甘氨酸15；
CoCl2·6H2O 0.008；
L-组氨酸10；
NaSiO3·9H2O 0.001；
L-异亮氨酸75；
Na3VO4·12H2O 0.005；
L-赖氨酸盐酸20；
SnC12·2H2O 0.00001；
L-蛋氨酸30；
Na2SeO3 0.01；
L-苯丙氨酸10；
FeSO4·7H2O 0.2；
L-脯氨酸30；
葡萄糖4000；
L-丝氨酸15；
维生素C O.176；
L-苏氨酸30；
对羟基苯甲酸1.5；
L-色氨酸5；
丙酮酸钠55；
L-缬氨酸30；
亚油酸0.05；
L-亮氨酸25；
β-巯基乙醇0.8；
二水L-酪氨酸二钠432；
L-胱氨酸二盐酸75；
人白蛋白1000；
DMSO(二甲基亚砜)50mL/L；
细胞外冷冻保护剂5000；
余量为水。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的无血清细胞冻存液的制备方法，其特征在于：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1～5中任一项所述，调节pH值至7.1～7.4，即得。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的无血清细胞冻存液在冻存细胞中的应用。
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