ES2612782T3 - Procedimiento de lavado y de conservación de un órgano con vistas a su trasplante y solución utilizada en este procedimiento - Google Patents

Procedimiento de lavado y de conservación de un órgano con vistas a su trasplante y solución utilizada en este procedimiento Download PDF

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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
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Abstract

Procedimiento para el acondicionamiento de un órgano con vistas a un trasplante que comprende las etapas sucesivas de: lavado del órgano, y conservación del órgano en una solución normopotásica, cuya concentración en potasio es inferior a 10 mM y que comprende una cantidad comprendida entre 15 y 20 g/L de polietileno glicol de un peso molecular de 20.000 Da, caracterizado por que el lavado se realiza con una solución de composición idéntica a la utilizada en la etapa de conservación, teniendo dicha solución una viscosidad comprendida entre 0,8 y 1,4 mm2/s a 20ºC.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de lavado y de conservacion de un organo con vistas a su trasplante y solucion utilizada en este procedimiento
La invencion se refiere a un procedimiento para el acondicionamiento de un organo con vistas a su trasplante asf como a una solucion utilizada en este procedimiento y a un contenedor esteril que comprende tal solucion.
Se aplica en el caso de que un organo, tal como hngado, rinon, corazon y/o pulmon sea ex^do de un donante. En el curso de la extraccion, los organos son lavados habitualmente por perfusion in situ y ex situ con una solucion de perfusion, cultivados in vitro y conservados en una solucion de conservacion. Antes del trasplante al receptor, el organo es lavado eventualmente de nuevo.
Existe un cierto numero de soluciones utilizadas en el marco del trasplante. Por ejemplo, la solucion UW (comercializada bajo el nombre Viaspan® por Fresenius), cuya especificidad es la presencia del coloide HES, es la referencia para la conservacion de los organos, tales como hngado, rinon, pancreas e intestino.
Esta solucion tiene una concentracion elevada en potasio, que compensa la perdida en potasio del organo conservado a baja temperatura en el estado de hipotermia. No obstante, el exceso de potasio debe ser eliminado del organo antes del trasplante con el fin de evitar una parada cardfaca.
La solucion de conservacion de los organos y tejidos, comercializada por Maco Pharma es una solucion normopotasica que contiene polietileno glicol (PEG). Esta solucion ha sido desarrollada para permitir la conservacion de los organos. Debido a su bajo contenido en potasio, no es necesario efectuar un nuevo lavado antes del implante.
No obstante, esta solucion no esta adaptada para el lavado del organo en el curso de la extraccion. En efecto, se crean zonas hipoperfusionadas, nefatas para la recuperacion del injerto en el receptor.
El procedimiento segun la invencion propone, por lo tanto, mejorar esta solucion de conservacion de organos, adaptandola al lavado del organo. La solucion conserva sus propiedades de conservacion, principalmente limitando las lesiones de isquemia reperfusion.
La invencion propone igualmente un procedimiento de acondicionamiento de un organo que optimiza las condiciones de lavado del organo, manteniendo buenas condiciones de conservacion.
A este efecto, la invencion propone un procedimiento para el acondicionamiento de un organo con vistas a un trasplante que comprende las etapas sucesivas de:
- lavado del organo, y
- conservacion del organo en una solucion normopotasica, cuya concentracion en potasio es inferior a 10 mM y que comprende una cantidad comprendida entre 15 y 20 g/L de polietileno glicol de un peso molecular de 20.000 Da, caracterizado por que el lavado se realiza con una solucion de composicion identica a la utilizada en la etapa de conservacion, teniendo dicha solucion una viscosidad comprendida entre 0,8 y 1,4 mm2/s a 20°C.
El documento WO02/41 696 describe un procedimiento de conservacion, en el que el organo es lavado con la misma solucion, en la que es conservada. La solucion normopotasica propuesta contiene PEG (20.000 Da) en una cantidad equivalente a 26 g/L.
El trasplante es la transferencia de un organo de un individuo donante a un individuo receptor. El individuo donante es un animal humano o no. Los organos que pueden ser trasplantados son los organos abdominales tales como el fngado, rinon, pancreas y colon, pero tambien los otros organos tales como el corazon y el pulmon. Los organos son extrafdos principalmente de un cadaver o de un voluntario sano.
El procedimiento de la invencion es un procedimiento in vitro, es decir, que se refiere al organo, una vez que este ha sido extrafdo del donante.
El exito de trasplante depende, entre otras cosas, de la calidad del organo a trasplantar, de su lavado y de su conservacion, con el fin de limitar las lesiones formadas durante las fases de isquemia y perfusion.
Para preparar un organo con vistas a un trasplante, el organo es lavado en primer lugar con una solucion de lavado con el fin de eliminar la sangre residual del injerto.
El lavado de realiza por perfusion del organo por la solucion, segun las condiciones de temperatura que van desde la hipotermia hasta la normotermia. Ventajosamente, el lavado se realiza con una solucion refrigerada a 4°C para refrigerar el organo.
A continuacion el organo es sumergido en una solucion de conservacion apta para prevenir las lesiones provocadas por la isquemia.
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Ventajosamente, el organo es conservado a baja temperatura, principalmente a 4°C, para mantenerlo en hipotermia.
Segun la invencion, las soluciones de lavado y la solucion de conservacion tienen una composicion identica.
La solucion es normopotasica, es decir, que comprende una concentracion baja de iones de potasio, principalmente proxima a la existente en el plasma.
La solucion utilizada en la invencion comprende polietileno glicol (PEG) de alto peso molecular, es decir, de 20.000 Da. Esta molecula coloidal, ejerciendo una presion oncotica en el interior de los vasos, es particularmente eficaz para luchar contra el edema celular e intersticial. De esta manera, no se forman necrosis localizadas.
Ademas, el PEG disminuye la inmunogenicidad del injerto, ligada a las lesiones de la isquemia - reperfusion.
No obstante, el PEG es un compuesto viscoso que aumenta la viscosidad de la solucion. Incluso aunque soluciones de viscosidad elevada, tal como la solucion UW, estan adaptadas para el lavado de los organos, la presencia de una cantidad demasiado grande de PEG en una solucion de conservacion la vuelve inadaptada para esta utilizacion.
Segun la invencion, la solucion de lavado y conservacion posee una viscosidad comprendida entre 0,8 y 1,4 mm2/s a 20°C, principalmente entre 1 y 1,3 mm2/s a 20°C.
Esta viscosidad particular es suficientemente debil para que el organo lavado no contenga ninguna zona hipoperfusionada, es decir, que la descoloracion del organo debida a la perfusion de la solucion es homogenea. Estas zonas hipoperfusionadas dan lugar a una necrosis de conservacion focalizada, con liberacion citolftica.
Una solucion utilizada en la invencion comprende entre 0,8 y 1,4 mm2/s a 20°C, principalmente entre 1 y 1,3 mm2/s, inducida por la presencia y las propiedades del polietileno glicol en concentraciones dadas.
Estas caractensticas confieren a la solucion propiedades reologicas adaptadas a una perfusion optima de los organos y principalmente del fugado. La viscosidad permanece inferior a la de la sangre y, por lo tanto, puede circular en todo el sistema vascular del organo a trasplantar. La solucion mantiene, sin embargo, las buenas propiedades de conservacion.
Para el PEG 20.000 Da, una cantidad de 15 g/L permite obtener una viscosidad de aproximadamente 1,05 mm2/s a 20°C.
Esta viscosidad particular se obtiene utilizando una concentracion definida de PEG, suficiente para garantizar sus propiedades anti-edema y de inmunocamuflaje.
Principalmente, la solucion se utiliza para el lavado y la conservacion del corazon.
En este caso, la solucion utilizada en la invencion puede comprender, ademas, un agente cardioprotector, tal como la 2,3-butanodiona monoxima.
La solucion utilizada en la invencion, comprende, ademas: un agente impermeante, un tampon,
una solucion de electrolitos, agua para fines de inyeccion.
El agente impermeante puede ser el acido lactobionico, el acido gluconico o una de sus sales o un sacarido, tal como la rafinosa, la sucrosa o la glucosa. Impide el paso del agua a traves de las membranas celulares y evita asf el edema celular.
El tampon se selecciona, por ejemplo, entre los tampones fisiologicos (sulfato o carbonato) o sintetico (HEPES), con el fin de mantener la solucion de perfusion y de conservacion a un pH fisiologico, comprendido entre 7 y 8, principalmente aproximadamente 7,5.
La solucion de electrolitos contiene iones de sodio, potasio, calcio y/o magnesio y/u otros iones.
Ventajosamente, la solucion utilizada en la invencion es del tipo extracelular, su concentracion de iones de sodio es elevada, principalmente superior a 40 mM, principalmente superior a 115 mM.
La solucion es normopotasica, es decir, que su concentracion en potasio es inferior a 10 mM. Asf, no es necesario lavar el organo antes del implante en el receptor.
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La solucion utilizada en la invencion posee una osmolaridad fisiologica proxima a la del plasta comprendida entre 300 y 380 mOsm/kg H2O, principalmente 320 mOsm/kg H2O.
En un ejemplo particular, la solucion de lavado y conservacion comprende PEG 20.000 Da en una solucion de Krebs, cuya composicion para 1 L de solucion es la siguiente:
0,45 g de cloruro de potasio
0,24 g de cloruro de magnesio hexahidrato
6,94 g de cloruro de sodio
0,17 g de cloruro de calcio dihidrato
2.2 g de D-glucosa monohidrato 2,1 g de carbonato de sodio agua para fines de inyeccion.
Cuando la solucion comprende 20 g/L de PEG 20.000, posee una viscosidad de 1,19 mm2/s a 20°C. Con 15 g/L de PEG 20.000, la solucion posee una viscosidad de 1,05 mm2/s a 20°C.
La solucion de lavado y de conservacion se vuelve esteril por filtracion en un contenedor tal como un frasco o una bolsa flexible, ventajosamente impermeable al oxfgeno.
El contenedor comprende una boca provista de un tapon amovible. Una vez retirado el tapon de la boca, la solucion utilizada en la invencion es vertida facil y rapidamente en un recipiente que contiene el organo a conservar.
Segun una variante, el contenedor comprende un conector para lmea de perfusion. Despues de la conexion de una lmea de perfusion sobre el conector del contenedor, la solucion contenida en el contenedor es perfusionada facilmente en el organo a lavar.
Segun otra variante, el contenedor comprende una boca provista de un tapon amovible y un conector para lmea de perfusion para realizar sucesivamente las operaciones de lavado y conservacion con la misma solucion.
La solucion utilizada en la invencion se utiliza para el lavado y la conservacion de los organos segun el procedimiento de la invencion.
Esta solucion esta adaptada a todos los organos abdominales. Para el corazon, la solucion comprende, ademas,
3.03 g de 2,3-butanodiona como agente cardioprotector.
Se puede utilizar igualmente pata la conservacion de los tejidos o injertos vasculares, tales como las venas, arterias, valvulas, vasos. En combinacion con dimetil sulfoxido, glicerol o cualquier otra molecula protectora, la solucion se puede utilizar tambien para la crioconservacion de los tejidos.
Ejemplo 1: Composicion y viscosidad de diferentes soluciones de conservacion.
Las viscosidades de las diferentes soluciones utilizadas en la invencion (Tabla 1) asf como soluciones comerciales de Maco Pharma (S7) y UW han sido determinadas a 20°C con la ayuda de un viscosfmetro Cannon-Fenske (Schott tipo 511-01) y estan registradas en la Tabla 2.
Tabla 1
S5-S7
Cantidad
Cloruro de potasio
0,45 g
Cloruro de magnesio hexahidrado
0,24 g
Cloruro de sodio
6,94 g
Cloruro de calcio dihidrato
0,17 g
D-glucosa, H20
2,2 g
Carbonato de sodio
2,1 g
Polietileno glicol
Variable
Agua para fines de inyeccion
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Tabla 2
Soluciones
Viscosidad (mm2/s)
SS- PEG 20 kDa - 1Sg/L
1,0S
S6- PEG 20 kDa - 20 g/L
1,19
S7- PEG 20 kDa - 20g/L
1,SS
UW (Viaspan®)
2,38
La solucion S7 no es representativa de la invencion.
Ejemplo 2: Estudio del efecto protector de una solucion de conservacion utilizada en la invencion sobre el injerto hepatico.
En el estudio siguiente, el hngado, debido a su sensibilidad a la isquemia y a la geograffa de su red vascular, ha sido tomado como norma para ensayar la eficacia del lavado de una solucion utilizada en la invencion.
El modelo porcino ha sido elegido para realiza la experimentacion antes de contemplar cualquier aplicacion clmica en el hombre.
Los animales utilizados para el alotrasplante son cochinillos (Large White = cerdo blanco grande ingles) de aproximadamente 30 kg.
El injerto hepatico es extrafdo de un donante segun un protocolo quirurgico adaptado y colocado en un contenedor lleno de solucion S5, S6 o S7 a 4°C.
Una perfusion ex-vivo del injerto por las vfas intra-portal e intra-arterial se realiza entonces con 500 ml de la solucion SS, S6 u S7.
El injerto es implantado entonces en el animal receptor, se observa la recoloracion homogenea del injerto hepatico, sin ninguna correlacion erronea de la anastomosis.
Resultados
Los criterios para evaluar la eficacia de la solucion en un modelo de trasplante hepatico en el cerdo son la funcion del injerto y la supervivencia de los animales el 7° dfa despues del trasplante.
Los estudios histologicos se realizan por la observacion microscopica de los cortes como sigue:
- hngado 1: hngado despues de 8 h de conservacion y antes del trasplante
- hngado 2: hngado trasplantado extrafdo despues de 1 h de revascularizacion
- hngado 3: hngado a la muerte del animal Los resultados se resumen a continuacion:
- Solucion S7 (9 animales alo trasplantados) : muy malas tasas de supervivencia de los animales - muerte de los animales algunas horas despues del trasplante, un solo animal superviviente el D7.
- Solucion S6 (7 animales alo trasplantados): masa media de supervivencia de los animales: muerte algunas horas o dfas despues del trasplante, 3 animales supervivientes el D7, o sea, el 43 % de supervivencia con una buena funcion del injerto.
- Solucion S5 (7 animales alo trasplantados): muy buena tasa de supervivencia de los animales el D7 (86%), una sola muerte por causa quirurgica con una buena funcion del injerto.
En conclusion, el estudio preclmico no muestra diferencias significativas entre el grupo de animales, cuyo hngado ha sido lavado con la solucion S5 frente a la solucion UW (8 animales alo trasplantados segun el grupo historico) en terminos de funcion del injerto y de supervivencia de los animales.
Las observaciones macroscopicas de los animales han revelado un lavado eficaz con la solucion S5 y una recoloracion homogenea en el curso de la revascularizacion.
Los examenes anatomo-patologicos
- despues de 8 h de conservacion hipotermica muestran un tejido hepatico normal
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- despues de 1 h de revascularizacion despues del trasplante no muestran congestion, ni endotelio, ni necrosis hepatocitaria,
- el D7 despues de eutanasia del animal, no muestran infiltracion de la estructura portal,
En dos casos, se ha observado un rechazo celular moderado.
Este estudio muestra la posibilidad de efectuar un lavado rapido con ausencia de hematies evacuados durante una conservacion de 24 h en la solucion S5. La reperfusion es rapida y homogenea.
Ejemplo 3: Conservacion del rinon
El animal elegido fue el cerdo Large White. Por razones practicas, se utilizaron machos, cuyo peso variaba entre 35 y 50 kilogramos (INRA, Domaine du Magneraud, Surgeres, Francia.
El rinon extrafdo fue sumergido en suero fisiologico a 4°C. Un cateter (galga 14) se introdujo en la arteria renal, permitiendo el lavado por 300 a 500 ml de solucion S5 o S6. Despues de pesarlo, se coloco el rinon en un recipiente esteril que contema la solucion de conservacion S5 o S6, y se conservo a 4°C.
Los animales donadores o bien fueron trasplantados al cabo de 30 minutos de isquemia fna o bien aislados en jaulas y trasplantados al cabo de 24 h de isquemia fna con su propio rinon.
Resultados de los estudios histomorfologicos durante la conservacion
Las extracciones se realizaron a partir de rinones conservados, despues del lavado con las soluciones estudiadas.
La evolucion de las lesiones se determino segun una clasificacion relacionada esencialmente con el Desprendimiento de las celulas Endoteliales en la Luz tubular (DEL) y la Perdida de Borde en Cepillo (PBB).
Esta clasificacion ha sido establecida segun 5 clases de 1 a 5.
1: ninguna lesion
2: < 10 %
3: entre 11 y 25 %
4: entre 26 y 50 %
5: > 50 %
Las extracciones se realizaron en 6 animales (3 para cada grupo tratado son S5 y 3 para el grupo tratado con S6 en el tiempo 0, despues de 1 h, 6h, 20h, 24h y 48h de conservacion.
Los resultados de la graduacion de las lesiones se resumen en la tabla 3
PEG 15 g/L (S5) PEG 20 g/L (S6)
DEL PBB DEL PBB
Animal
N° 1 N° 2 N° 3 N° 1 N° 2 N° 3 N° 1 N° 2 N° 3 N° 1 N° 2 N°3
0h
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1h
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6h
1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 1
20h
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
24
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2
48h
3 4 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4
infiltracion, ni lesiones del ni necrosis, ni congestion.
Resultados de los estudios funcionales durante la primera semana despues del auto trasplante
Dos grupos de 4 animales fueron trasplantados con su propio rinon perfusionado y conservado en las soluciones S5 y S6, respectivamente.
Los resultados muestran que las soluciones S5 y S6 no fueron rechazadas por el organo y que la disminucion de concentracion de PEG 20000 a 15 g/L tiene una influencia favorable con una produccion de orina mas precoz y una disminucion de la creatininemia mas rapida.
De esta manera se demuestran las cualidades de lavado y de conservacion de una solucion utilizada en la invencion.

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. - Procedimiento para el acondicionamiento de un organo con vistas a un trasplante que comprende las etapas sucesivas de:
    lavado del organo, y
    conservacion del organo en una solucion normopotasica, cuya concentracion en potasio es inferior a 10 mM y que comprende una cantidad comprendida entre 15 y 20 g/L de polietileno glicol de un peso molecular de 20.000 Da,
    caracterizado por que el lavado se realiza con una solucion de composicion identica a la utilizada en la etapa de conservacion, teniendo dicha solucion una viscosidad comprendida entre 0,8 y 1,4 mm2/s a 20°C.
  2. 2. - Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el lavado del organo se realiza por perfusion de la solucion.
  3. 3. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que el organo se elige entre los organos abdominales.
  4. 4. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que el organo es el corazon y la solucion comprende, ademas, un cardioprotector.
  5. 5. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la solucion posee una viscosidad comprendida entre 1 y 1,3 mm2/s.
  6. 6. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la solucion comprende, ademas:
    un agente impermeante, un tampon,
    una solucion de electrolitos, agua para fines de inyeccion.
  7. 7. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la solucion posee una osmolaridad comprendida entre 300 y 380 mOsm/kg H2O.
  8. 8. - Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la solucion comprende en un 1 L de agua para fines de inyeccion:
    0,45 g de cloruro de potasio
    0,24 g de cloruro de magnesio hexahidrato
    6,94 g de cloruro de sodio
    0,17 g de cloruro de calcio dihidrato
    2,2 g de D-glucosa monohidrato
    2,1 g de carbonato de sodio
    15 g de PEG
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