ES2959132T3 - Nueva proteína de fusión bifuncional recombinante y preparación y aplicación de la misma - Google Patents

Abstract

Se proporciona una proteína de fusión recombinante. La proteína de fusión recombinante contiene una primera región de muestra de Ig (SIRPαD1) en un extremo de la membrana externa de una proteína alfa reguladora de señales humana (SIRPα) y un segmento Fc de una IgG1 humana. También se proporcionan un polinucleótido que codifica la proteína de fusión, un vector de expresión que contiene el polinucleótido, un método para preparar la proteína de fusión y un método para tratar enfermedades causadas por la sobreexpresión de CD47. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva proteína de fusión bifuncional recombinante y preparación y aplicación de la misma

Campo de la invención

La invención se refiere a una proteína de fusión bifuncional recombinante, preparación y uso de la misma, especialmente su uso en terapias tumorales.

Antecedentes de la invención

Las células cancerosas han desarrollado algunos mecanismos para evadir la vigilancia inmunitaria del hospedador y así poder crecer más rápidamente. Entre los mecanismos, los tres siguientes son bien conocidos.

1) Evadir la vigilancia inmunitaria de los linfocitos T. Las células cancerosas suelen expresar un alto nivel de las proteínas de membrana PD-Ll y PD-L2, que se unen a PD-1 en la superficie de las células T, induciendo la apoptosis de las células T. 2) Evadir la vigilancia inmunitaria de las células asesinas naturales (NK). La proteína NKG2D de la superficie de las células NK, al unirse a las proteínas MICA/MICB de la superficie de las células cancerosas, puede activar las células NK para destruir las células cancerosas. Sin embargo, las células cancerosas han desarrollado un mecanismo que favorece el desprendimiento de MICA/MICB de las membranas celulares. La MICA/MICB desprendida se une a la NKG2D en la superficie de las células NK, bloqueando la unión de la NKG2D a la MICA/MICB en la superficie de las células cancerosas. 3) Evadir la vigilancia inmunitaria de los macrófagos (M$). Casi todas las células cancerosas expresan en su superficie un alto nivel de CD47, que se une a la proteína reguladora de señales (SIRPa) en la superficie de M$, induciendo así la producción de una señal inhibitoria, que inhibe la fagocitosis de las células cancerosas por M$. Se puede observar que las células cancerosas son bastante "inteligentes" y se reproducen rápidamente en función de sus mecanismos de evasión desarrollados. De acuerdo con lo anterior, el desarrollo de fármacos anticancerígenos eficaces para eliminar todas las células cancerosas debe dirigirse a estos mecanismos.

La presente invención está dirigida a la proteína reguladora de señales SIRPa. La proteína reguladora de señales (SIRP) es una glicoproteína transmembrana, que incluye tres miembros de la familia, SIRPa (CD172a), SIRPp (CD172b) y SIRPγ (CD172g). Las tres proteínas tienen regiones extracelulares similares pero regiones citoplasmáticas distintas (Figura 1A). La región extracelular contiene tres dominios de inmunoglobulina (Ig): un dominio del grupo IgV y dos dominios del grupo IgC. La región citoplasmática de SIRPa (CD172a) contiene dos dominios que transmiten señales inhibitorias para inhibir la(s) función(es) correspondiente(s) de la célula. SIRPp (CD172b) y SIRPγ (CD172g) tienen regiones citoplasmáticas muy cortas sin ningún dominio transmisor de señales. Sin embargo, SIRPp (CD172b) puede transmitir las señales activadoras a través de su asociación con proteínas adaptadoras tales como DAP12 (Figura 1). Las SIRP se expresan principalmente en macrófagos (M$), células dendríticas (DC) y neuronas.

CD47 es también una glicoproteína transmembrana perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y se expresa en la superficie de todos los tipos celulares, incluidos los glóbulos rojos. Los ligandos de CD47 incluyen integrinas, trombospondina-1 y SIRP. CD47 tiene muchas funciones biológicas, como la migración celular, la activación de células T y DC y el desarrollo de axones. Además, CD47, al interactuar con SIRPa, puede inhibir la fagocitosis por los macrófagos. Al emitir una señal de "no me comas", CD47 protege a las células normales, como las sanguíneas, del ataque de los macrófagos.

Los estudios han demostrado que muchas células tumorales o cancerosas sobreexpresan CD47, que, al unirse a la SIRPa en la superficie celular de los macrófagos, impiden la fagocitosis de las células cancerosas por los macrófagos. Se considera que éste es uno de los mecanismos adoptados por los tumores para eludir la vigilancia inmunitaria del hospedador. Entre los cánceres que sobreexpresan CD47 figuran la leucemia mieloide aguda (AML), la leucemia mieloide crónica (CML), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el linfoma no Hodgkin (NHL), el mieloma múltiple (MM), el cáncer de vejiga, el cáncer de ovario, el cáncer de próstata, el cáncer de pulmón, el cáncer de colon, el cáncer de mama y el cáncer de páncreas.

Otros estudios mostraron que la inyección de un anticuerpo específico de CD-47 que bloquea la unión de CD47 a SIRPa puede inhibir significativamente el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores. Las células tumorales o cancerosas se eliminaron por completo cuando se inyectó el mismo anticuerpo en los ratones portadores de células de leucemia humana (Theocharides APA, et al., 2012).

El documento WO2014/094122A1 divulga una proteína de fusión que comprende un dominio IgV de la variante 2 de SIRPa humana y un Fc que tiene función efectora, para tratar células cancerosasCD47+. La proteína de fusión se une a CD47 humana con una afinidad que es al menos cinco veces mayor que la afinidad de toda la región extracelular de SIRPa humana.

Un receptor Fc es una proteína que se encuentra en la superficie de ciertas células, incluidos los linfocitos B, las células dendríticas foliculares, las células asesinas naturales, los macrófagos, los neutrófilos, los eosinófilos, los basófilos y los mastocitos. Estas células contribuyen a las funciones protectoras del sistema inmunitario. El receptor Fc se une a anticuerpos adheridos a células infectadas, patógenos invasores o células cancerosas, y estimula a las células fagocíticas o citotóxicas para que destruyan los microbios, las células infectadas o las células cancerosas mediante fagocitosis mediada por anticuerpos o citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos.

Se ha informado de la actividad de unión de SIRPa-Fc o SIRPaD1-Fc a CD47 (Lee WY et al., 2007), pero ambas tienen una afinidad insuficiente a CD47.

Sumario de la invención

La presente invención divulga una proteína de fusión recombinante capaz de eliminar tumores mediante i) el bloqueo de la producción inducida por las células tumorales de señales inhibitorias para macrófagos, y ii) la estimulación directa de la fagocitosis por macrófagos. La proteína de fusión comprende un primer dominio extracelular de tipo Ig de la proteína reguladora de señal alfa (SIRPaDI), unido a un fragmento Fc de una inmunoglobulina, en el que la SIRPaDI contiene la mutación N89A en la posición 89 según SEQ ID NO: 6, en la que la proteína de fusión bifuncional recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 6, y en la que la proteína de fusión bifuncional recombinante puede unirse a CD47s y los receptores Fc, bloquear la unión de CD47 a SIRP en superficies de macrófagos y estimular la fagocitosis de células tumorales por los macrófagos. La proteína de fusión tiene una mejor actividad de unión a las dianas, en comparación con una proteína recombinante que contiene toda la región extracelular de SIRPa (SIRPa-Fc). Los presentes inventores han descubierto además que la actividad de unión a las dianas puede mejorarse aún más cuando se elimina el sitio de glucosilación en SIRPaDI (N89A); y la actividad de unión de Fc a receptores Fc puede mejorar significativamente la actividad antitumoral de SIRPaD1-Fc.

Se ha obtenido por cribado una línea celular de células de ovario de hámster chino (CHO) de expresión estable, y las proteínas se producen cultivando la línea celular en un lecho de agitación. Los experimentosin vitrohan demostrado que la proteína de la presente invención puede unirse a CD47 con una actividad de unión evidentemente mejorada en comparación con SIRPa-Fc. Si se elimina el sitio de glucosilación "NIT" en SIRPaDI mediante ingeniería genética (N89A) (SIRPaD1-Fc (N89A), designado como HY03M), se mejora la actividad de unión a CD47. En otro aspecto, cuando el 192° residuo de aminoácido en la región Fc se convierte de ácido aspártico a alanina (D192A) (SIRPaD1-Fc (N89A/D192A), designado como HY03MM), la actividad de unión a receptores Fc (CD16a, CD32, CD64) disminuye evidentemente. Se ha estudiado el efecto antitumoralin vivodel HY03M usando modelos de ratón portadores de leucemia linfoblástica aguda humana y leucemia promielocítica aguda, lo que indica que el HY03M tiene una actividad antitumoral extremadamente buena. El crecimiento tumoral se inhibe completamente en los ratones tratados con HY03M, y en algunos ya no se detecta tumor. Para confirmar la contribución de Fc a la actividad antitumoral, se han probado los efectos terapéuticosin vivode HY03M y HY03MM en ratones portadores de linfoma humano en comparación con Rituximab. Resulta que el HY03M tiene un efecto antitumoral evidente en comparación con el grupo de control negativo, y su efecto es también mucho mejor que el del Rituximab. A pesar de un buen efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral, la actividad de HY03MM es inferior a la de HY03M, lo que sugiere que la región Fc está involucrada en la inhibición tumoral al unirse a los receptores Fc de los macrófagos.

En una realización, la proteína recombinante de la presente invención es HY03M (SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6). HY03M tiene una elevada actividad antitumoral, e inhibe el crecimiento tumoral mediante i) el bloqueo de la interacción entre CD47 y SIRPa; y/o ii) la activación de macrófagos mediante la unión de Fc a receptores Fc. HY03M puede tratar diversos tumores CD47+.

La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión bifuncional recombinante y un vector de expresión que expresa la proteína, un procedimiento de producción de la proteína y un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que sobreexpresa CD47.

La proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende un dominio extracelular de tipo Ig de la proteína reguladora de señales (SIRP), unido a un fragmento Fc de IgG1 humana, en el que la proteína se une a CD47 para bloquear la unión de CD47 a SIRP en la superficie de los macrófagos con el fin de estimular la fagocitosis de células tumorales por los macrófagos.

La proteína reguladora de señal en la proteína de fusión bifuncional recombinante es SIRPa, y el dominio extracelular de tipo Ig de la proteína reguladora de señal es SIRPaDI.

La proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende un fragmento Fc, una parte de una molécula de inmunoglobulina. Aunque un fragmento Fc no tiene ningún sitio de unión al antígeno, estimula funciones efectoras. Por ejemplo, el fragmento Fc facilita la unión del anticuerpo con receptores Fc o proteínas del complemento. En una realización, el fragmento Fc es un fragmento Fc de IgG1.

En una realización, la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO: 6. En una realización, la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad con SEQ ID NO.: 6. En una realización, la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad con SEQ ID NO.: 6. En una realización, la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6.

La molécula polinucleotídica de la presente invención codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante que comprende SIRPaD1.

La molécula polinucleotídica de la presente invención codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante que comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina, preferentemente un fragmento Fc de IgG1 humana.

En una realización, la molécula polinucleotídica de la presente invención codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a SEQ ID NO: 6. En una realización, la molécula polinucleotídica de la presente invención codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % idéntica a SEQ ID NO.: 6. En una realización, la molécula polinucleotídica de la presente invención codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO.: 6. En una realización, la molécula polinucleotídica de la presente invención codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO.: 6.

En una realización, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende la molécula polinucleotídica de la presente invención, la molécula polinucleotídica que codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante.

En una realización, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención, y al menos un adyuvante.

En una realización, la presente invención proporciona la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad causada por la sobreexpresión de CD47.

En una realización, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielocítica aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin (NHL), mieloma múltiple (MM), cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de páncreas y carcinoma de células renales. En una realización, la enfermedad se selecciona entre la enfermedad de Crohn, el asma alérgica y la artritis reumatoide.

Descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático de las estructuras y el mecanismo de acción de las SIRP y la SIRPaDI.

La figura 2 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de la SIRPa-Fc.

La figura 3 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de SIRPaDI -Fc.

La figura 4 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de HY03M.

La figura 5 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos de HY03MM.

La figura 6 muestra el análisis SDS-PAGE de cuatro proteínas de fusión.

La figura 7 muestra las actividades de unión de SIRPa -Fc y SIRPaDl -Fc a las dianas en células PC-3, respectivamente.

La figura 8 muestra el bloqueo de las dianas marcadas con fluorescencia por proteínas no marcadas.

La figura 9 muestra la actividad de unión a receptores Fc y la fagocitosis inducida de células tumorales por macrófagos.

La figura 10 muestra la eficacia terapéuticain vivode cuatro proteínas de fusión en tumores, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a una proteína de fusión recombinante, que puede eliminar tumores a través de dos enfoques, es decir, para bloquear la producción inducida por células tumorales de señales inhibitorias a los macrófagos, y para estimular directamente la fagocitosis por macrófagos. La proteína comprende un primer dominio extracelular de tipo Ig de la proteína reguladora de señales alfa (SIRPaD1), unido a un fragmento Fc de una inmunoglobulina, en el que la SIRPaD1 contiene la mutación N89A en la posición 89 según SEQ ID NO: 6, en la que la proteína de fusión bifuncional recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 6, y en la que la proteína de fusión bifuncional recombinante puede unirse a CD47 y los receptores Fc, bloquear la unión de CD47 a SIRP en superficies de macrófagos y estimular la fagocitosis de células tumorales por los macrófagos. La proteína de fusión es un homodímero con un peso molecular de 90 kDa. Se ha obtenido por cribado una línea celular de células de ovario de hámster chino (CHO) con expresión estable, y se producen 100 mg de las proteínas cultivando la línea celular en un lecho de agitación. Los experimentosin vitrohan demostrado que las proteínas pueden unirse a CD47 con una actividad de unión evidentemente mejorada en comparación con SIRPa-Fc. Si se elimina el sitio de glucosilación ("NIT") en SIRPaDI mediante ingeniería genética (N89A) (SIRPaD1-Fc (N89A), designado como HY03M), se mejorará la actividad de unión a CD47. En otro aspecto, cuando el 211° residuo de aminoácido en la región Fc se convierte de ácido aspártico a alanina (D192A) (SIRPaD1-Fc (N89A/D192A), designado como HY03MM), la actividad de unión a receptores Fc (CD16a, CD32, CD64) disminuye evidentemente. Se ha estudiado el efecto antitumoralin vivodel HY03M usando modelos de ratón portadores de leucemia linfoblástica aguda humana y leucemia promielocítica aguda, lo que indica que el HY03M tiene una actividad antitumoral extremadamente buena. El crecimiento tumoral se inhibe completamente en los ratones tratados con HY03M, y en algunos ya no se detecta tumor. Para confirmar la contribución de Fc a la actividad antitumoral, se han ensayado las eficacias terapéuticasin vivode HY03M y HY03MM en ratones portadores de linfoma humano en comparación con Rituximab. Resulta que el HY03M tiene un efecto antitumoral evidente en comparación con el grupo de control negativo, y su efecto es también mucho mejor que el del Rituximab. A pesar de un buen efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral, la actividad de HY03MM es inferior a la de HY03M, lo que sugiere que la región Fc está involucrada en la inhibición tumoral al unirse a los receptores Fc distribuidos en los macrófagos.

La proteína de fusión de la presente invención contiene dos fragmentos, es decir, el fragmento de unión a la diana (SIRPaDI) y el fragmento Fc.

La proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención puede unirse además a moléculas no polipeptídicas con el fin de conferir propiedades deseadas tales como reducir la degradación y/o aumentar la semivida, reducir la toxicidad, reducir la inmunogenicidad y/o aumentar la actividad biológica. Las moléculas ejemplares incluyen, entre otras, polímeros como el polietilenglicol (PEG), la polilisina, un dextrano; un lípido; un grupo colesterol (tal como un esteroide); un carbohidrato o una molécula de oligosacárido.

El fragmento Fc puede tener un tamaño de 232 aminoácidos y comprende una cisteína en la región bisagra, dos cisteínas en la región CH2y dos cisteínas en la región CH3. La cisteína de la región bisagra contribuye a la formación de enlaces disulfuro entre dos monómeros, generando así un homodímero, mientras que las cisteínas de las regiones CH2y CH3 pueden formar enlaces disulfuro intracadena para estabilizar la proteína.

El dominio Ig extracelular de SIRPaDI capaz de unir CD47 se usa en la proteína de fusión.

Preferentemente, las secuencias derivadas de humanos pueden usarse en terapias contra el cáncer en humanos, ya que la fuerte inmunogenicidad de las proteínas o péptidos de animales no humanos puede provocar alergias y otros efectos adversos. Sin embargo, en la presente invención también pueden usarse otras proteínas o péptidos animales en función de diferentes fines de aplicación.

En la presente divulgación, puede usarse el fragmento Fc de cualquier inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas incluyen IgG, IgA, IgM, IgD e IgA, entre las cuales la IgG es la más abundante y relativamente estable. En la presente invención se prefieren el fragmento Fc de IgG, el fragmento Fc de IgGl y el fragmento Fc de IgG1 humana, ya que estos fragmentos Fc presentan la mayor actividad de unión con la proteína A de estafilococo y, por tanto, pueden purificarse fácilmente.

En una realización, la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención comprende un primer dominio extracelular tipo Ig de SIRPa humana, unido a un fragmento Fc de IgG1 humana.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión bifuncional recombinante de la presente invención se muestra en la figura 4B (SEQ ID NO.: 6). En otra realización, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6. En otra realización, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido es capaz de unirse a CD47 y es capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión bifuncional recombinante, en la que, la proteína de fusión bifuncional recombinante comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6. El polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 6, en la que el polipéptido es capaz de unirse a CD47 y es capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales.

La presente invención también divulga una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión bifuncional recombinante antes mencionada, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Si es necesario, también pueden incluirse en la composición farmacéutica uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los portadores incluyen diluyentes, excipientes, agentes de carga, agentes aglutinantes, agentes humectantes, agentes desintegrantes, potenciadores de la absorción, tensioactivos, portadores de sorción, lubricantes y similares habituales en la industria farmacéutica.

Tales composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del polipéptido o proteína en mezcla con materiales farmacéuticamente aceptables y materiales de formulación fisiológicamente aceptables. La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, el olor, la esterilidad, la isotonicidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, entre otros, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito sódico o hidrogenosulfito sódico); tampones (tales como borato, bicarbonato de amonio, Tris-HCl, citratos, fosfatos y otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); rellenos; monosacáridos; disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas) proteínas (tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas); colorantes; agentes aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tales como el sodio); conservantes (tales como el cloruro de benzalconio, el ácido benzoico, el ácido salicílico, el timerosal, el alcohol fenetílico, el metilparabeno, el propilparabeno, la clorhexidina, el ácido sórbico o el peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como la glicerina, el propilenglicol o el polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como el manitol o el sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como PLURONICS, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (sacarosa o sorbitol) agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferentemente cloruro sódico o potásico, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos.

El experto en la técnica determinará la composición farmacéutica óptima en función, por ejemplo, de la vía de administración prevista, el formato de administración y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberaciónin vivoy la velocidad de eliminaciónin vivodel polipéptido. Por ejemplo, las composiciones apropiadas pueden ser agua para inyección y solución salina fisiológica.

El vehículo primario o portador en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador apropiado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales habituales en inyección. Por ejemplo, el vehículo o portador puede ser solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden tampones Tris, o tampones de acetato, que pueden incluir además sorbitol o un sustituto apropiado del mismo. En una realización de la presente invención, las composiciones pueden prepararse para su almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tenga el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, la composición terapéutica puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como la sacarosa.

Las formulaciones pueden administrarse por mediante una variedad de procedimientos, por ejemplo, mediante terapia de inhalación, por vía oral o por inyección. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que comprende el polipéptido deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo especialmente apropiado para la inyección parenteral es el agua destilada estéril en la que se formula un polipéptido como solución isotónica estéril, debidamente conservada. Otra preparación más puede consistir en la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerodibles, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), microesferas o liposomas, que permita la liberación controlada o sostenida del producto, que puede administrarse mediante una inyección de depósito. También puede usarse ácido hialurónico, que puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios apropiados para la introducción de la molécula deseada son los dispositivos implantables de administración de fármacos.

En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas apropiadas para la administración inyectable pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer o la solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetilcelulosa sódica, el sorbitol o el dextrano. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas de inyección apropiadas. Entre los disolventes o vehículos lipofílicos apropiados se encuentran los aceites grasos, tales como el aceite de sésamo, o los ésteres sintéticos de ácidos grasos, tales como el oleato de etilo, los triglicéridos o los liposomas. También pueden usarse para la administración aminopolímeros policatiónicos no lipídicos. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes apropiados para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En otra realización, puede formularse una composición farmacéutica para inhalación. Las soluciones para inhalación también pueden formularse con un propelente para su administración en aerosol; en otra realización, las soluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe con más detalle en la Solicitud PCT No. PCT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente.

También se contempla que ciertas formulaciones puedan administrarse por vía oral. En una realización de la presente invención, las moléculas que se administran de este modo pueden formularse con o sin los portadores usados habitualmente en la composición de formas farmacéuticas sólidas tales como comprimidos y cápsulas.

Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la molécula terapéutica. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de comprimidos y aglutinantes. Las composiciones farmacéuticas para administración oral también pueden formularse usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones apropiadas para la administración oral. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para su ingestión por el paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para su uso oral pueden obtenerse combinando compuestos activos con excipientes sólidos y procesando la mezcla resultante de gránulos (opcionalmente, después de molerlos) para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Si se desea, pueden agregarse auxiliares adecuados. Entre los excipientes adecuados se incluyen rellenos de carbohidratos o proteínas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, tales como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; gomas, incluyendo arable y tragacanto; y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden agregarse agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, el agar y el ácido algínico o una sal del mismo, tal como el alginato sódico.

Los núcleos de grageas pueden usarse junto con recubrimientos apropiados, tales como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos apropiados o mezclas de disolventes. Pueden agregarse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para identificar el producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral también incluyen cápsulas a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas y selladas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas Push-fit pueden contener principios activos mezclados con cargas o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos apropiados, tales como aceites grasos, líquido o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.

Composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, como las formulaciones que incluyen polipéptidos en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen las técnicas para formular otros medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores liposómicos, micropartículas bioerodibles o microesferas porosas e inyecciones de depósito. Véase, por ejemplo, el documento PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Ejemplos adicionales de preparados de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidos (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etileno acetato de vinilo (Langer et al., supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Eppstein et al., PNAS (EE.UU.), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.

La composición farmacéutica que se usará para la administraciónin vivonormalmente debe ser estéril. Esto puede lograrse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización mediante este procedimiento puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez formulada la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiera reconstitución antes de la administración.

La cantidad eficaz de una composición farmacéutica que se empleará terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que se usa el polipéptido, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y el estado (edad y salud general) del paciente. De acuerdo con lo anterior, el médico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede oscilar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Las composiciones polipeptídicas pueden inyectarse o administrarse preferentemente por vía intravenosa. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada tres o cuatro días, cada semana o quincenalmente, dependiendo de la semivida y la tasa de eliminación de la formulación concreta. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polipéptido en la formulación utilizada. Por lo general, una composición se administra hasta alcanzar una dosificación que logre el efecto deseado. Por lo tanto, la composición puede administrarse como dosis única, o como dosis múltiples (a la misma o a diferentes concentraciones/dosificaciones) a lo largo del tiempo, o como infusión continua. La dosificación adecuada se afina de forma rutinaria. Las dosificaciones adecuadas pueden determinarse mediante el uso de datos apropiados de dosis-respuesta.

La vía de administración de la composición farmacéutica se ajusta a los procedimientos conocidos, por ejemplo por vía oral, mediante inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea o intraperitoneal; así como por vía intranasal, enteral, tópica, sublingual, uretral, vaginal o rectal, por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. Si se desea, las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de forma continua por infusión, o mediante un dispositivo de implantación. Alternativa o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se haya absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano apropiado, y la administración de la molécula deseada puede realizarse mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua.

En algunos casos, la proteína de fusión bifuncional de la presente invención puede administrarse implantando ciertas células que han sido modificadas genéticamente, usando procedimientos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Para disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Por lo general, los materiales de encapsulación suelen ser envolturas o membranas poliméricas biocompatibles y semipermeables que permiten la liberación del producto o productos polipeptídicos pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

También se prevé una terapia génicain vivoen la que una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión bifuncional de la presente invención, o un derivado de la misma, se introduce directamente en el sujeto. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión bifuncional de la presente invención se introduce en las células diana mediante la inyección local de una construcción de ácido nucleico con o sin un vector de administración adecuado, tal como un vector de virus adeno-asociado. Los vectores virales alternativos incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus del herpes simple y vectores del virus del papiloma. La transferencia física del vector del virus puede lograrsein vivomediante la inyección local de la construcción de ácido nucleico deseada u otro vector de administración adecuado que contenga la secuencia de ácido nucleico deseada, la transferencia mediada por liposomas, la inyección directa (ADN desnudo) o el bombardeo de micropartículas (pistola de genes).

Las composiciones de la presente divulgación pueden usarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos para potenciar sus efectos terapéuticos o disminuir los posibles efectos secundarios.

Se divulga un procedimiento de preparación de la proteína de fusión bifuncional recombinante anterior y la composición farmacéutica que comprende la misma. En una realización, el procedimiento comprende (1) proporcionar una molécula polinucleotídica codificante de proteínas; (2) construir un vector de expresión que comprenda la molécula polinucleotídica de (1); (3) transfectar o transformar células hospedadoras apropiadas con el vector de expresión de (2) y cultivar las células hospedadoras para expresar la proteína; y (4) purificar la proteína. La preparación puede ser llevada a cabo con tecnologías bien conocidas por un artesano normalmente experto.

Otro objeto de la presente invención es la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad causada por la sobreexpresión de CD47, que comprende la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada a los pacientes o sujetos que la necesitan. En una realización, la composición farmacéutica se usa para tratar tumores o cánceres con sobreexpresión de CD47, incluidos, pero no se limitan a, la leucemia mieloide aguda (AML), la leucemia mieloide crónica (CML), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el linfoma no Hodgkin (NHL), el mieloma múltiple (MM), el cáncer de vejiga, el cáncer de ovario, el cáncer de próstata, el cáncer de pulmón, el cáncer de colon, el cáncer de mama, el cáncer de páncreas y el cáncer renal.

En una realización, las enfermedades relacionadas con la sobreexpresión de CD47 incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Crohn, el asma alérgica y la artritis reumatoide.

También, la presente invención proporciona una molécula polinucleotídica que codifica la proteína de fusión bifuncional recombinante y un vector de expresión que expresa la proteína de fusión bifuncional recombinante. Los ejemplos de vectores incluyen, entre otros, plásmidos, vectores virales, cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales competentes para la transformación (TAC), cromosomas artificiales de mamífero (MAC) y cromosomas episómicos artificiales humanos (HAEC).

La presente invención proporciona células hospedadoras que comprenden los vectores de expresión anteriores. Las células hospedadoras pueden transformarse o transfectarse con los vectores de expresión. Las células hospedadoras apropiadas incluyenEscherichia coli,levaduras y otros eucariotas. Preferentemente, se usan líneas celulares deEscherichia coli,levaduras o mamíferos (tales como COS o CHO).

La presente invención se describe a continuación con ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Método y material

1.1 Construcción de vectores que expresan SIRPa-Fc y SIRPaD1-Fc respectivamente

Se empleó Pig-Tail (R&D Systems) como vector de expresión. Las secuencias codificantes de los dominios extracelulares de SIRPa y SIRPaDI se amplificaron a partir de células THP-1 (ATCC®TIB-202™), respectivamente, usando el cebador 1 (SEQ ID NO.: 9) con el cebador 2 (SEQ ID NO.:10), y el cebador 1 (Se Q ID NO: 9) con el cebador 3 (SEQ ID n O.: 11). Los productos de la PCR se clonaron en el sitio HindIII/EcoRI de un Plg-Tail modificado, generando de este modo los vectores de expresión pSIRPa-Fc y pSIRPaD1-Fc.

1.2 Construcción de vectores que expresan HY03M y HY03MM respectivamente

La secuencia codificante de SIRPaD1 con mutación N89A fue sintetizada por Nanjing Jinsirui biotechnology Co., Ltd (Programa NO.: 7009323-1) y luego se clonó en el sitio HindIII/EcoRI del vector Plg-Tail para generar un vector de expresión HY03M. Usando el cebador 4 (SEQ ID NO.: 12) y el cebador 5 (SEQ ID NO.: 13), la secuencia de nucleótidos (GAC) que codifica el ácido aspártico, el 192° residuo aminoácido de HY03M en el extremo Fc, se mutó para codificar la alanina (GCC) mediante mutagénesis dirigida al sitio, generando de este modo un vector de expresión HY03MM.

Tabla 1 Cebadores PCR

Notas: Las secuencias específicas de genes se muestran en cursiva y los sitios de reconocimiento de endonucleasas se subrayan.

2. Expresión y purificación de proteínas

El medio de cultivo celular completo DMEM (con 10 % de FBS) que contenía células CHO se agregó en una placa de 24 pocillos, 0,5 ml por pocillo, y la placa se mantuvo en una incubadora durante 24 horas. Para la transfección, se disolvieron por separado 0,5 |jg de ADN plasmídico y 2 j l de lipofectamina 2000 (Cat#11668-027, invitrogen) en 50 j l de medio de cultivo sin suero, que luego se combinaron y se dejaron inmóviles a temperatura ambiente durante 20 minutos. En lo sucesivo, se vertió lentamente el medio en los pocillos de la placa y ésta se colocó en la incubadora durante 24 horas. Al día siguiente, se tomaron 100 j l de sobrenadante y se analizó la expresión de proteínas mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA).

3. Ensayo de expresión de proteínas

La expresión de proteínas se probó mediante ELISA. En concreto, se disolvió en tampón PBS un anticuerpo IgG antihumano de cabra, fragmento F(ab')2(Biosource international inc), que se agregó en una placa ELISA de 96 pocillos, 20 ng por pocillo. La placa ELISA se colocó en un frigorífico a 4 °C, durante la noche. Tras la prueba, la placa se bloqueó con solución de bloqueo (PBS, 0,05 % de Tween-20, 3 % de leche desnatada) durante 1 hora y, a continuación, se agregó suero diluido y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

Tras lavarla 5 veces con una solución de lavado (PBS, 0,05%de Tween-20), se agregó a la placa un anticuerpo IgG antihumano de conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch Lab) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras 5 lavados, se agregó el sustrato para HRP. Dos minutos después, se usó la solución (H2SO41N) para detener el desarrollo del color y terminar la reacción cromogénica. La densidad óptica se midió a 450 nm.

4. Cribado de líneas celulares de expresión estable

Las células transfectadas se sometieron a un cribado antibiótico de concentración creciente (Geneticin, Cat#10131035, Invitrogen). Las células inestables se eliminaron gradualmente, y las células supervivientes se diluyeron y se colocaron en cinco placas de 96 pocillos, de 0,5 a 1 célula por pocillo. Las placas se colocaron en una incubadora durante 10-15 días. Los pocillos que contenían cada uno un único clon se analizaron mediante ELISA y, a continuación, las células con expresión proteica positiva se propagaron y se cultivaron habitualmente con medios de cultivo Ex-CELL CD C<h>O libre de suero (Cat#14361C-1000ML, SIGMA). Tras un nuevo cribado, se seleccionaron las células con los niveles de expresión más altos y se congelaron para su uso.

5. Producción y purificación de proteínas

La línea celular de expresión estable (3*105/ml) se inoculó en un matraz agitador de 2 L que contenía 300 ml de medio de cultivo sin suero, y el matraz se colocó en un lecho de agitación para el cultivo. Una vez alcanzada una densidad celular de 5*106/ml, se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se purificó usando una columna de proteína A. La proteína purificada se transfirió a PBS (pH 7,0) con diálisis. Se empleó la electroforesis de proteínas para obtener proteínas con una pureza de al menos el 98 %.

6. Actividad de unión a la diana

Las actividades de unión de SIRPa-Fc, SIRPaDl-Fc e HY03M a CD47 se probaron mediante citometría de flujo.

Se usaron dos líneas celulares, PC-3 (cáncer de próstata humano) y Jurkat (leucemia de linfocitos T), para probar la actividad de unión de cada proteína a CD47. Tras lavarlas con PBS, las células se suspendieron en PBS con una concentración de 1*10<6>/ml. A la suspensión celular se le agregó hlgG (1 μg/ml) y después se incubó en un frigorífico a 4 °C, durante 1 hora. Después de los lavados con PBS, las células se transfirieron a una placa de cultivo celular de 96 pocillos en forma de U (Cat#163320, NUNC), 100 μl por pocillo. A continuación, se agregaron a las células proteínas purificadas con diferentes concentraciones y se incubaron en un frigorífico a 4 °C, durante 1 hora. Las células se lavaron con y luego se suspendieron en PBS. En lo sucesivo, las células se incubaron junto con anticuerpo anti-IgG-Fc humana marcado con FITC (Cat#F9512, Sigma). Después de 1 hora, las células se analizaron en una citometría de flujo (Guava easyCyte 6HT-2L, Millipore).

7. Ensayo de bloqueo de la diana

Para probar si las proteínas purificadas pueden bloquear la unión de CD47 a SIRPa, se mezcló SIRPa-Fc marcado con FITC (Cat#4546-SA-050, R&D Systems, 100 nM) con SIRPa-Fc no marcado, SIRPaD1-Fc, HY03M, HY03MM o hIgG-Fc de diferentes concentraciones. A continuación, se introdujo cada mezcla en una placa de 96 pocillos en forma de U con células Jurkat y se incubó en un frigorífico a 4 °C, durante 1 hora. Después de los lavados con PBS, las células se volvieron a suspender en 200 ml de PBS y se analizó la proporción de células fluorescentes en una citometría de flujo.

8. Unión a FcyRs

Las actividades de unión de proteínas de la presente invención a FcyRs se probaron por ELISA como sigue.

CD64 (FcyRI) (Cat: 1257-FC-050, R&D Systems), CD32a (FcyRIIa) (Cat: 1330-CD-050/CF, R&D Systems), CD32b (FcyRIIb) (Cat: 1875-CD-050, R&D Systems),y CD16a (FcyRIIIa) (Cat: 4325-FC-050, R&D Systems) se diluyeron con una solución tampón de recubrimiento (CBS) (Sigma-Aldrich Co., Código de producto: 1001329288 C3041-100CAP) a una concentración de 1000 ng/ml, y se agregaron 100 μl de cada solución en una placa ELISA (Cat#442404, Nunc™), 100 ng por pocillo. La placa se dejó en el frigorífico a 4 °C, durante toda la noche. Inmediatamente antes de la prueba, la placa se lavó con PBS-T al 0,05 % y después se bloqueó con leche desnatada al 3 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Las soluciones diluidas de HY03M y HY03MM (800, 400 y 200 nM) se agregaron a la placa, 100 μl por pocillo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se desecharon los líquidos de la placa. La placa se lavó con PBS-T al 0,05 % durante 5 veces y, a continuación, se agregaron 100 μl de IgG Fc anti-humana de conejo con HRP (Cat#: 309-036-008, Jackson ImmunoResearch Lab) diluido a 1:20000. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se lavó con las soluciones de lavado durante 5 veces. A continuación, se agregaron a la placa sustratos de HRP y se dejó la placa para la reacción colorimétrica de 10 a 20 minutos en la oscuridad. La reacción colorimétrica se terminó posteriormente utilizando H<2>SO<4>1 N, y el valor OD450 se obtuvo en un lector de placas.

9. Ensayo de fagocitosis

Se agregaron macrófagos de ratón (Raw264.7) en una placa de 96 pocilios, 5*105 células por pocilio, y se incubaron durante 2 horas en una incubadora a 37 °C. Las células Jurkat marcadas con CFSe (2,25 j M) se incubaron con 2,5 jg/m l de HY03M, HY03MM o IgG-Fc durante 30 minutos a 37°C y luego se transfirieron a la placa que contenía los macrófagos Raw264.7 mencionados anteriormente. La placa se incubó a 37 °C, durante otras 3 horas. Con los lavados con PBS durante 3 veces, se eliminaron las células Jurkat libres en la solución. A continuación, las células Raw264.7 se observaron en una citometría de flujo a través de la CFSE contenida en estas células.

10. Ensayo antitumoral

La actividad antitumoralin vivode HY03M se estudió en un modelo de tumor subcutáneo HL- 60. Se inyectaron por vía subcutánea células leucémicas (HL60) a 20 ratones desnudos Balb/c, 4*10® células por ratón. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 a 150 mm3 , los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos. Al primer grupo se le inyectó por vía intraperitoneal PBS, mientras que al segundo grupo se le inyectó por vía intraperitoneal un inhibidor del VEGF. Al tercer grupo se le inyectó h Y03M por vía intraperitoneal. A cada grupo se le administró dicho agente durante 6 veces a una dosis de 10 mg/kg, dos veces por semana. El volumen y el peso de los tumores se midieron dos veces por semana.

Para saber si la región Fc contribuía al efecto antitumoral, se probaron las actividades antitumorales de HY03M y HY03MM usando un modelo de linfoma, respectivamente, en comparación con Rituximab. Se inyectaron por vía subcutánea células Daudi a 38 ratones desnudos Balb/c, 1*107 células por ratón. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 a 150 mm3 , los ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos. El primer grupo fue inyectado intraperitonealmente con PBS, mientras que del segundo al quinto grupo fueron inyectados intraperitonealmente con HY03M, HY03MM, Rituximab, e HY03MM más Rituximab, respectivamente. A cada grupo se le administró dicho agente durante 8 veces a una dosis de 5 mg/kg, dos veces por semana. El volumen y el peso de los tumores se midieron dos veces por semana.

Resultados experimentales

1. Construcción de vectores de expresión

La estructura de SIRPaD1-Fc se mostró en la figura 1B y la figura 1D, en la que SIRPaD1 se unió al extremo N de IgG1-Fc. La secuencia de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de cada proteína se mostraron en las figuras 2 a la figura 5. La secuencia codificante de SIRPa-Fc consistió en 1752 nucleótidos (Figura 2A, SEQ ID No.:1), codificando 583 aminoácidos (Figura 2B, SEQ ID No.:2). Entre los 1752 nucleótidos, 1047 codificaban SIRPa, 696 codificaban Fc y los 6 restantes formaban el sitio EcoRI. La secuencia codificante de SIRPaD1-Fc consistió en 1131 nucleótidos (Figura 3A, SEQ ID No.:3), codificando 376 aminoácidos (Figura 3B, SEQ ID No.:4), en la que, 426 nucleótidos codificaron SIRPaD1, 696 codificaron Fc, y los 6 restantes formaron el sitio EcoRI. HY03M y HY03MM contenían 1125 nucleótidos, en los que HY03M tenía una mutación N89A (Figura 4A y 4B, SEQ ID No.:5 y 6), mientras que HY03MM contenía una mutación N89A y una mutación D192A (Figura 5A y 5B, SEQ ID No. :7 y 8).

2. Análisis de expresión de proteínas

Teóricamente, las cuatro proteínas, SIRPa-Fc, SIRPaD1-Fc, HY03M y HY03MM, tenían pesos moleculares de -128 kDa, -82,7 kDa, -82,3 kDa y -82,3 kDa, respectivamente. Con la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE), se comprobó que todos los pesos moleculares eran mayores que los predichos teóricamente en condiciones no reductoras (Figura 6), lo que podría deberse a la glucosilación de la proteína en un sitio de glucosilación en relación con un residuo Asn en SIRPaD1. La glucosilación irregular en este sitio puede dar lugar a la presencia de dos bandas en el gel SDS-PAGE en condiciones no reductoras (Figura 6B). Si se eliminaba el sitio de glucosilación, como en HY03M y HY03MM, sólo se encontraba una banda en lugar de dos (Figura 6C y 6D).

3. Ensayo de actividad de unión a la diana

Mediante citometría de flujo, se analizaron las actividades de unión de SIRPa-Fc y SIRPaD1-Fc a las células PC-3 (Figura 7A). Se observó que la actividad de unión de SIRPaD1-Fc (EC50=6,57 nM) era significativamente superior a la de SIRPa-Fc (EC50=12,63 nM). Como estudios previos mostraron que la glucosilación no tenía efecto sobre la unión de D1 a CD47 (Lee WY et al., 2007), N89 en la región D1 se mutó a A (la variante de proteína se designó como HY03M). La actividad de unión de HY03M a CD47 se comparó con la de SIRPaD1-Fc. El resultado indicó que HY03M con el sitio de glucosilación eliminado tenía una actividad de unión a las dianas evidentemente mayor (EC50=0,5 nM) que SIRPaD1-Fc (EC50=1,0 nM), como se muestra en la figura 7B. El presente estudio sugiere que la proteína que contiene sólo la región D1 tiene una mejor actividad de unión a la diana que la proteína que contiene dominios extracelulares completos, y eliminar el sitio de glucosilación en D1 promueve aún más la actividad de unión (la actividad de unión a la diana: HY03M>SIRPaD1-Fc>SIRPa-Fc).

4. Ensayo de bloqueo de la diana

Con citometría de flujo, se estudió el efecto de las proteínas no marcadas, SIRPa-Fc, SIRPaD1-Fc, HY03M y HY03MM, sobre la unión de SIRPa-Fc marcada fluorescentemente con dianas. Los resultados mostraron que, como en la figura 8, estas cuatro proteínas pueden bloquear la unión de la proteína marcada con fluorescencia a las células Jurkat diana de forma dependiente de la dosis, siendo SIRPaD1-Fc e HY03M las que presentan los mejores efectos de bloqueo (véase la tabla en la parte inferior de la figura 8).

5. Efecto de la actividad de unión de HY03M o HY03MM con FcyRs sobre la fagocitosis por macrófagos

El residuo de aminoácido 265° de la IgG1-Fc humana, el ácido aspártico (D), era clave para la función del anticuerpo. Si el ácido aspártico se convirtiera en alanina (D265A), la IgG perdería su actividad de unión a los FcyR (FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA) (Shields RL, et al., 2001) y las correspondientes ADCC, CDC y similares. Para confirmar si la parte Fc en HY03M contribuía a la actividad antitumoral, el ácido aspártico en la región Fc de HY03M se convirtió en alanina (HY03MM, D192A, Figura 5B), y se analizó la actividad de unión de HY03M a FcyRs (FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA) en comparación con HY03MM. Los resultados mostraron que, como en la figura 9A, la actividad de unión de la variante proteica (HY03MM) a los FcyRs disminuyó significativamente, en especial la actividad de unión a FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA.

Para probar el efecto de la mutación del residuo de aminoácido en las actividades de los macrófagos, se incubaron células Jurkat diana marcadas con fluorescencia (CFSE) junto con macrófagos (Raw264.7) y HY03M o HY03MM. Resultó que HY03M promovía evidentemente la fagocitosis por los macrófagos en comparación con el grupo de control negativo (IgG), y HY03MM perdía tal función y no mostraba diferencias en comparación con IgG, como se muestra en la figura 9B.

El estudio sugirió que el bloqueo de la unión CD47-SIRPa mediante, por ejemplo, HY03MM, no era suficiente para inducir la fagocitosis de las células diana por los macrófagos. La interacción entre Fc y FcyRs en las superficies de los macrófagos, cuando se combina con el bloqueo de la unión CD47-SIRPa, estimulará la fagocitosis.

6. Actividad antitumoralin vivode HY03M y HY03MM

La actividad antitumoralin vivode HY03M se estudió en un modelo de tumor subcutáneo HL- 60. Como se muestra en la figura 10A, tras el tratamiento con el inhibidor del VEGF, el crecimiento tumoral no se inhibió de forma evidente en los ratones portadores de tumores. En el grupo tratado con HY03M, se inhibió significativamente el crecimiento tumoral, cuyo tamaño disminuyó gradualmente desde 100 mm3 al inicio del tratamiento, hasta casi desaparecer al final del experimento. En el grupo de control negativo, el tamaño del tumor aumentó con el tiempo y llegó a 1000 mm3 al final del experimento. Los resultados sugirieron que la inhibición de la actividad del VEGF por sí sola no tenía un efecto de tratamiento evidente en el tumor HL60, lo que indicaba que el crecimiento de los tumores HL60 no dependía mucho de los VEGF. Sin embargo, si se eliminara el efecto inhibidor sobre la fagocitosis de los macrófagos, se fomentaría la fagocitosis de las células tumorales por parte de los macrófagos, lo que eliminaría las células tumorales.

Para probar si la región Fc estaba involucrada en la actividad antitumoral de HY03M, se estudiaron los efectos terapéuticos de HY03M, HY03MM y Rituximan en el linfoma usando un modelo de linfoma (Daudi). Se puede observar (Figura 10B) que el crecimiento tumoral se inhibió significativamente en el grupo con tratamiento con HY03M (TGI=72,5 %), que fue mucho mejor que el del grupo con Rituximab (TGI=45,6 %). Sin embargo, HY03MM con la región Fc con una mutación tuvo un efecto inhibidor mucho más atenuado sobre el crecimiento tumoral (TGI=26,4 %), lo que sugiere que la región Fc estaba involucrada en la actividad antitumoral de HY03M.

Los datos anteriores indicaban que HY03M trataba los tumores i) inhibiendo la unión de CD47 con SIRPa de modo que se bloqueaban las señales inhibitorias transmitidas por SIRPa y se activaban los macrófagos; y ii) uniendo Fc a FcyRs a macrófagos activos.

Conclusiones

Nuestros estudios indicaron que la proteína recombinante SIRPaD 1-Fc tenía una buena actividad de unión a diana que era mejor que la de SIRPa-Fc. Si se eliminaba el sitio de glucosilación, como en HY03M, la actividad de unión a la diana mejoraba aún más. Los estudiosin vivodemostraron que el HY03M tenía una buena actividad antitumoral y eliminaba por completo los tumores en el modelo HL60. La proteína combatió los tumores i) inhibiendo la unión de CD47 con SIRPa, de modo que se bloquearon las señales inhibitorias transmitidas por SIRPa y se activaron los macrófagos; y ii) uniendo Fc a FcyRs a macrófagos activos. Los dos mecanismos produjeron un efecto sinérgico, estimulando suficientemente la fagocitosis de las células tumorales por los macrófagos. Los macrófagos activados pueden además presentar antígenos tumorales a los linfocitos T (Tseng D, et al., 2013) y eliminar finalmente las células tumorales.

Como se describió anteriormente, para la actividad de unión de SIRPa-Fc o SIRPaD1-Fc a CD47, se informó una vez (Lee WY et al., 2007) que las afinidades de estas dos proteínas a CD47 no eran diferentes. Nuestros estudios mostraron que la afinidad de SIRPaD1-Fc con CD47 (en células PC-3) (EC50=6,57 nM) era mucho mayor que la de SIRPa-Fc (EC50=12,63 nM). Con el análisis de aminoácidos, se encontró que SIRPaD1-Fc tenía 9 residuos de aminoácidos más (SCAWSGVAG) en el extremo N en comparación con el construido por Lee WY et al., lo que podría contribuir al aumento de la actividad de unión a la diana. Estudios adicionales descubrieron que la actividad de unión a la diana mejoraba aún más cuando se eliminaba el sitio de glucosilación (N89A) en la región D1. Además, con la mutagénesis dirigida al sitio (D192A) en la región Fc, se descubrió que el Fc ayudaba a la purificación de la proteína (mediante cromatografía de proteína A) y mejoraba la estabilidad de la proteína, y también estaba involucrado en la actividad antitumoral de HY03M, ya que la actividad antitumoral de la proteína variante con D192A disminuía considerablemente.

Referencias

1. Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC, Janssen WJ, Starefeldt A, Murphy-Ullrich JE, Bratton DL, Oldenborg PA, Michalak M, Henson PM. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte. Cell. 2005; 123:321-334

2. Obeid M, Panaretakis T, Joza N, Tufi R, Tesniere A, van Endert P, Zitvogel L, Kroemer G. Calreticulin exposure is required for the immunogenicity of gamma-irradiation and UVC light induced apoptosis. Cell Death Differ. 2007; 14:1848-1850.

3. Orr AW, Pedraza CE, Pallero MA, Elzie CA, Goicoechea S, Strickland DK, Murphy-Ullrich JE. Low density lipoprotein receptor-related protein is a calreticulin coreceptor that signals focal adhesion disassembly. J Cell Biol. 2003; 161:1179-1189.

4. Theocharides, A.P.A. ; Jin, L.Q. ; Cheng, P.Y. ; Prasolava, T.K. ; Malko, A.V. ; Ho, J.M. ; Poeppl, A.G. ; Rooijen, N. van ; Minden, M.D. ; Danska, J.S. ; Dick, J. ; Wang, J.C.Y. J. Exp. Med. 2012 Vol. 209 No. 10 1883-1899

5. Lee WY et al. Novel Structural Determinants on SIRPa that Mediate Binding to CD47. J Immunol 2007; 179:7741-7750.

6. Shields RL et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcyRI, FcyRII, FcyRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcgR. JBC. 2001,276:6591-6604. 7. Tseng D, et al. Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumor T-cell response. PNAS. 2013, 110:11103-11108

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión bifuncional recombinante, que comprende el primer dominio extracelular tipo Ig de la proteína reguladora de señal alfa (SIRPaD1), unido a un fragmento Fc de una inmunoglobulina, en la que la SIRPaDI contiene la mutación N89A en la posición 89 según SEQ ID NO: 6, en la que la proteína de fusión bifuncional recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 8o %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 6, y en la que la proteína de fusión bifuncional recombinante puede unirse a CD47 y los receptores Fc, bloquear la unión de CD47 a SIRP en superficies de macrófagos y estimular la fagocitosis de células tumorales por los macrófagos.

2. La proteína de fusión bifuncional recombinante de la reivindicación 1, en la que el fragmento Fc es un fragmento Fc de IgG1.

3. La proteína de fusión bifuncional recombinante de la reivindicación 2, en la que la IgG1 es una IgG1 humana.

4. La proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6.

5. Un homodímero de la proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el homodímero comprende dos proteínas de fusión unidas por uno o más enlaces disulfuro.

6. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 6.

8. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.

9. Una composición farmacéutica, que comprende la proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y al menos un adyuvante farmacéutico.

10. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad causada por la sobreexpresión de CD47, que comprende administrar a un paciente o sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica, comprendiendo la composición farmacéutica la proteína de fusión bifuncional recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un adyuvante farmacéutico.

11. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 10, en la que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielocítica aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin (NHL), mieloma múltiple (MM), cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de páncreas y carcinoma de células renales.

12. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 10, en la que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Crohn, asma alérgica y artritis reumatoide.