ES2958335A2

ES2958335A2 - Polinucleótido basado en el gen dapB que tiene actividad promotora y uso del mismo

Info

Publication number: ES2958335A2
Application number: ES202390215A
Authority: ES
Inventors: Jibin Sun; Jiao Liu; Ping Zheng; Wenjuan Zhou; Guannan Sun; jiuzhou Chen
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2024-02-07
Also published as: CN115449519B; WO2022257757A1; CN115449519A; BR112023024799A2

Abstract

Se divulga un mutante de un promotor del gen de la dihidrodipicolinato reductasa (dapB) de Corynebacterium glutamicum. En comparación con el promotor de un gen dapB de tipo silvestre, la actividad promotora del mutante mejora significativamente. También se divulgan un casete de expresión de transcripción que comprende el mutante del promotor, un vector de expresión recombinante, una célula hospedadora recombinante y un método para construir un mutante del promotor, un método para regular y controlar la transcripción de un gen diana, un método para preparar una proteína y un método para producir un compuesto objetivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Polinucleótido basado en el gendapBque tiene actividad promotora y uso del mismo

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación pertenece al campo de la biotecnología e ingeniería genética, y en particular se refiere a un polinucleótido que tiene actividad promotora, y un casete de expresión de transcripción, un vector de expresión recombinante y una célula hospedadora recombinante que comprende el polinucleótido que tiene actividad promotora, así como un método para construir un mutante del promotor, un método para regular la transcripción de un gen diana, y un método para preparar una proteína y un método para producir un compuesto objetivo.

ANTECEDENTES

La fermentación microbiana puede producir una variedad de compuestos objetivo, como aminoácidos y ácidos orgánicos, que pueden utilizarse ampliamente en medicina, alimentación, alimentos para animales y cosmética, y tienen un gran valor económico. En los últimos años, con el aumento de la demanda del mercado de aminoácidos, ácidos orgánicos y demás, la forma de aumentar la producción de un compuesto objetivo y realizar la producción industrial a gran escala del compuesto objetivo es un problema importante que debe resolverse con urgencia.

El cultivo de microorganismos de fermentación de alto rendimiento es un medio importante para mejorar el rendimiento industrial de los compuestos objetivo. En comparación con la tecnología tradicional de cultivo por mutación, la tecnología de cultivo de ingeniería genética se ha utilizado ampliamente por su gran pertinencia y alta eficiencia. Numerosos estudios han demostrado que la expresión eficiente de un gen clave en la vía de síntesis de un compuesto objetivo es la clave para mejorar el rendimiento y la tasa de conversión del compuesto objetivo.

Se trata de un método importante para mejorar el rendimiento de la fermentación de un compuesto objetivo mediante la transformación de un gen clave en la vía metabólica microbiana a través de ingeniería genética. El promotor es un importante elemento regulador que afecta a la expresión genética y una regulación fina del promotor puede optimizar la tasa de conversión del compuesto objetivo. Promotores con intensidades de expresión diferentes pueden satisfacer las necesidades de intensidades de expresión diferentes de distintos genes, mejorando así el rendimiento y la tasa de conversión del compuesto objetivo.

Por lo tanto, es un problema importante que debe resolverse urgentemente en el campo de la fermentación microbiana desarrollar más promotores con alta actividad con el fin de mejorar la expresión de genes clave en la vía de síntesis de compuestos objetivos, mejorar el rendimiento de los compuestos objetivo y mejorar la competitividad de la industria de la biofermentación.

SUMARIO

Problema técnico

En vista del problema técnico existente en el estado de la técnica previa, por ejemplo, es necesario desarrollar más promotores con alta actividad con el fin de mejorar la expresión de genes clave en la vía de síntesis de compuestos objetivo, la presente divulgación proporciona un polinucleótido que tiene actividad promotora, que es un mutante del polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1. El mutante proporcionado por la presente divulgación tiene actividad promotora significativamente mejorada en comparación con el promotor de tipo silvestre, y proporciona un elemento regulador de expresión con gran potencial de aplicación para la transformación de un gen diana. Al ligar operablemente el mutante con el gen diana, se puede mejorar eficazmente la expresión del gen diana, mejorando así eficazmente el rendimiento y la tasa de conversión de un compuesto objetivo.

Solución al problema

La presente divulgación proporciona un polinucleótido que tiene actividad promotora, donde el polinucleótido se selecciona de entre el grupo que se muestra en cualquiera de los siguientes (i)-(iv):

(i) un mutante de un polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, que comprende un nucleótido mutado en una o más posiciones entre la posición 75 y la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1;

(ii) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos tal como se establece en (i);

(iii) un polinucleótido que comprende una secuencia inversamente complementaria de una secuencia capaz de hibridar con la secuencia de nucleótidos tal como se establece en (i) o (ii) bajo condiciones de hibridación altamente estrictas o en condiciones de hibridación muy altamente estrictas;

(iv) un polinucleótido que tenga al menos un 90%, opcionalmente al menos un 95%, preferiblemente al menos un 97%, más preferiblemente al menos un 98%, y lo más preferiblemente al menos un 99% de identidad de secuencia en comparación con la secuencia de nucleótidos tal como se establece en (i) o (ii);

donde el polinucleótido, tal como se establece en cualquiera de los puntos de (i) a (iv), tiene una secuencia de nucleótidos que no es TCTGAACGGGTACGTCTAGAC en la posición de la 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1; y el polinucleótido tal como se establece en cualquiera de de (i) a (iv) tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización, de acuerdo con el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación, donde el mutante tiene de 3 a 12 veces más o más actividad promotora mejorada en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización, de acuerdo con el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación, donde la secuencia de nucleótidos del mutante correspondiente a de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 se selecciona de cualquiera del grupo que consiste en lo siguiente (P<dapB>-1) a (P<dapB>-3):

(P<dapB>-1) CTCTGATGTGATAGTATAATT;

(P<dapB>-2) ATCATTTGGTGTATACTAAAT;

(P<dapB>-3) GTCCTGTGGTAAACTTTAGCG.

En algunas formas de realización, de acuerdo con el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación, donde la secuencia de nucleótidos del mutante se selecciona de entre secuencias tal como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: de 2 a 4.

La presente divulgación proporciona además un casete de expresión de transcripción, que comprende el polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con la presente divulgación; opcionalmente, el casete de expresión de transcripción contiene además un gen diana que está ligado operablemente con el polinucleótido que tiene actividad promotora; preferentemente, el gen diana es un gen codificador de proteínas.

La presente divulgación proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación, o el casete de expresión de transcripción de la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona además una célula hospedadora recombinante que comprende el casete de expresión de transcripción de la presente divulgación, o el vector de expresión recombinante de la presente divulgación.

En algunas formas de realización, de acuerdo con la célula hospedadora recombinante de la presente divulgación, donde la célula hospedadora es del géneroCorynebacterium,del géneroBrevibacterium,del géneroArthrobacterium,del géneroMicrobacteriumo del géneroEscherichia; preferentemente, la célula hospedadora esCorynebacterium glutamicumoEscherichia coli;más preferiblemente, la célula hospedadora esCorynebacterium glutamicumATCC 13032,Corynebacterium glutamicumATCC 13869,Corynebacterium glutamicumATCC 14067 o cepas derivadas deCorynebacterium glutamicum.

La presente divulgación proporciona además el uso del polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con la presente divulgación, el casete de expresión de transcripción de acuerdo con la presente divulgación, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente divulgación, y la célula hospedadora recombinante de acuerdo con la presente divulgación en al menos uno de entre los siguientes:

a) mejorar el nivel de transcripción de un gen, o preparar un reactivo o kit para mejorar el nivel de transcripción de un gen;

b) preparar una proteína, o preparar un reactivo o kit para preparar una proteína;

c) producir un compuesto objetivo, o preparar un reactivo o kit para producir un compuesto objetivo.

En algunas realizaciones, de acuerdo con el uso de la presente divulgación, en donde la proteína se selecciona de entre una proteína reguladora de la expresión genética, una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, o una proteína relacionada con el transporte de membrana.

En algunas formas de realización, de acuerdo con el uso de la presente divulgación, donde el compuesto objetivo incluye al menos uno de aminoácidos, ácidos orgánicos;

opcionalmente, los aminoácidos incluyen uno o una combinación de dos o más de los siguientes: prolina, hidroxiprolina, lisina, ácido glutámico, treonina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, cisteína, glutamina, metionina, ácido aspártico, asparagina, arginina, histidina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido 5-aminolevulínico o derivados de cualquiera de los aminoácidos anteriores;

opcionalmente, los ácidos orgánicos incluyen uno o una combinación de dos o más de los siguientes: ácido cítrico, ácido succínico, ácido láctico, ácido acético, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oxálico, ácido oxalacético, ácido tartárico, ácido propiónico, ácido hexenoico, ácido decanoico, ácido caprílico, ácido valérico, ácido málico o derivados de cualquiera de los ácidos orgánicos anteriores.

La presente divulgación proporciona además un método de construcción de un mutante del promotor, que incluye las siguientes etapas:

Etapa de mutación: mutación de un polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, de manera que haya nucleótidos mutados en una o más posiciones de la posición 75 a la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1;

Etapa de cribado: cribado de un mutante de un polinucleótido que tiene actividad promotora mejorada en comparación con el polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, para obtener un mutante del promotor.

En algunas formas de realización, de acuerdo con el método de construcción de la presente divulgación, donde la etapa de mutación incluye: mutar el polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, de manera que los nucleótidos de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 son mutados a una secuencia de nucleótidos tal como se establece a continuación: NNNNNNNNNNNNNNNNTANNN, en donde N se selecciona de entre A, T, C o G;

preferiblemente, el mutante del promotor tiene de 3 a 12 veces más o más actividad promotora mejorada en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

La presente divulgación proporciona además un método para regular la transcripción, donde el método incluye una etapa de ligar operablemente el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación a un ARN diana o a un gen diana. Opcionalmente, el ARN diana incluye al menos uno de entre ARNt, ARNs; el gen diana incluye al menos uno de entre un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, un gen codificador de una proteína reguladora de la expresión genética y un gen codificador de una proteína relacionada con el transporte de membrana;

opcionalmente, el gen diana incluye al menos uno de entre los siguientes: gen de la piruvato carboxilasa, gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, gen de la Y-glutamil quinasa, gen de la glutamato semialdehído deshidrogenasa, gen de la pirrolina-5-carboxilato reductasa, gen de la proteína transportadora de aminoácidos, gen relacionado con el sistema ptsG, gen de la piruvato deshidrogenasa, gen de la homoserina deshidrogenasa, gen de la ácido oxalacético descarboxilasa, gen represor del ácido glucónico, gen de la glucosa deshidrogenasa, gen de la aspartato quinasa, gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, gen de la aspartato amoniaco liasa, gen de la dihidrodipicolinato sintasa, gen del ácido dihidropiridínico reductasa, gen de la succinil diaminopimelato aminotransferasa, gen de la tetrahidrodipicolinato succinilasa, gen de la succinil diaminopimelato desacilasa, gen del ácido diaminopimélico epimerasa, gen del ácido diaminopimélico desacilasa, gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, gen de la transcetolasa, gen de la diaminopimelato deshidrogenasa.

La presente divulgación proporciona además un método para preparar una proteína, donde el método incluye una etapa de expresar la proteína utilizando el casete de expresión de transcripción de la presente divulgación, el vector de expresión recombinante de la presente divulgación, o la célula hospedadora recombinante de la presente divulgación; opcionalmente, la proteína es una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, una proteína relacionada con el transporte de membrana, o una proteína reguladora de la expresión genética;

opcionalmente, el método incluye además una etapa de aislamiento o purificación de la proteína.

La presente divulgación proporciona además un método para producir un compuesto objetivo, donde el método incluye una etapa de expresión de una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, una proteína relacionada con el transporte de membrana, o una proteína reguladora de la expresión genética mediante el uso del casete de expresión de transcripción de la presente divulgación, el vector de expresión recombinante de la presente divulgación, o la célula hospedadora recombinante de la presente divulgación, y producir el compuesto objetivo en presencia de la proteína asociada con la síntesis del compuesto objetivo, la proteína relacionada con el transporte de membrana o la proteína reguladora de la expresión genética;

opcionalmente, el compuesto objetivo incluye al menos uno de entre aminoácidos, ácidos orgánicos;

opcionalmente, los aminoácidos incluyen uno o una combinación de dos o más de entre los siguientes: lisina, ácido glutámico, treonina, prolina, hidroxiprolina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, cisteína, glutamina, metionina, ácido aspártico, asparagina, arginina, histidina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido 5-aminolevulínico o derivados de cualquiera de los aminoácidos anteriores;

opcionalmente, los ácidos orgánicos incluyen uno o una combinación de dos o más de entre los siguientes: ácido cítrico, ácido succínico, ácido láctico, ácido acético, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oxálico, ácido oxalacético, ácido tartárico, ácido propiónico, ácido hexenoico, ácido decanoico, ácido caprílico, ácido valérico, ácido málico o derivados de cualquiera de los ácidos orgánicos anteriores;

opcionalmente, la proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo es una proteína relacionada con la síntesis de un L-aminoácido; opcionalmente, la proteína relacionada con la síntesis de un L-aminoácido incluye una o una combinación de dos o más de entre: piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, Y-glutamil quinasa, glutamato semialdehído deshidrogenasa, pirrolina-5-carboxilato reductasa, proteína transportadora de aminoácidos, sistema ptsG, piruvato deshidrogenasa, homoserina deshidrogenasa, ácido oxalacético descarboxilasa, represor del ácido glucónico, glucosa deshidrogenasa, aspartato quinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, aspartato amoníaco liasa, dihidrodipicolinato sintasa, dihidrodipicolinato reductasa, ácido dihidropiridínico reductasa, succinil diaminopimelato aminotransferasa, tetrahidrodipicolinato succinilasa, succinil diaminopimelato deacilasa, ácido diaminopimélico epimerasa, ácido diaminopimélico deacilasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, transcetolasa, diaminopimelato deshidrogenasa.

Opcionalmente, el método incluye además una etapa de aislar o purificar el compuesto objetivo.

Efectos

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora proporcionado por la presente divulgación es un mutante del promotor del gen de la dihidrodipicolinato reductasa (gendapB),y el mutante tiene una actividad promotora significativamente mejorada en comparación con el gendapBde tipo silvestre. Después de que el mutante se haya ligado operablemente con un gen diana, la eficiencia de expresión del gen diana puede mejorarse significativamente, proporcionando así un elemento de expresión que tiene un gran potencial de aplicación para la modificación de un gen clave en la vía de síntesis de un compuesto objetivo. Cuando el mutante se aplica a la producción de un compuesto objetivo, la tasa de conversión del compuesto objetivo puede mejorar significativamente, proporcionando un promotor fuerte que tiene un gran potencial para la fermentación industrial de compuestos objetivo, como aminoácidos y ácidos orgánicos.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora proporcionado por la presente divulgación tiene de 3 a 12 veces más o más actividad promotora mejorada en comparación con la actividad promotora del promotor del gendapBde tipo silvestre.

En algunas formas de realización, la presente divulgación proporciona un casete de expresión de transcripción, un vector de expresión recombinante y una célula hospedadora recombinante que comprenden el polinucleótido mencionado que tiene actividad promotora. En el casete de expresión de transcripción, el vector de expresión recombinante y la célula hospedadora recombinante, el polinucleótido que tiene actividad promotora se liga operablemente con un gen diana, y puede realizarse la expresión eficiente de un gen clave en la vía de síntesis de un compuesto objetivo.

En algunas formas de realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una proteína capaz de aumentar el nivel de expresión de una proteína relacionada con la síntesis de aminoácidos, ácidos orgánicos o proteínas reguladoras de la expresión genética, permitiendo así una producción eficiente de un compuesto objetivo.

En algunas formas de realización, la presente divulgación proporciona un método para producir un compuesto objetivo capaz de mejorar la eficiencia de expresión de una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo mediante el uso del polinucleótido mencionado que tiene actividad promotora, y, así, el rendimiento y la tasa de conversión del compuesto objetivo se pueden mejorar de manera eficiente, y se puede realizar la producción industrial a gran escala del compuesto objetivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra un perfil plasmídico de pEC-XK99E-PdapB-rfp;

La FIG. 2 muestra un resultado fluorescente de clones mutantes cultivados en una placa de cultivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Cuando se utiliza en combinación con el término «que comprende» en las reivindicaciones y/o en la especificación, las palabras «un» o «una» pueden referirse a «uno», o referirse a «uno o más», «al menos uno» y «uno o más de uno».

Tal como se utiliza en las reivindicaciones y en la especificación, el término «comprender», «tener», «incluir» o «contener» pretende ser inclusivo o abierto, y no excluye elementos o etapas del método adicionales o no citados.

A lo largo del presente documento de divulgación, el término «aproximadamente» significa que un valor incluye la desviación estándar del error de un dispositivo o método utilizado para medir el valor.

Es aplicable al contenido divulgado en el presente documento que el término «o» se define únicamente como alternativas e «y/o», pero el término «o» utilizado en el presente documento se refiere a «y/o», a menos que se indique expresamente lo contrario como meras alternativas o exclusión mutua entre alternativas.

El «intervalo numérico» seleccionado/opcional/preferido, cuando se utiliza en las reivindicaciones o en la especificación, incluye no solamente los puntos finales numéricos en ambos extremos del intervalo, sino también todos los números naturales comprendidos entre los puntos finales numéricos precedentes con respecto a estos puntos finales numéricos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «dihidrodipicolinato reductasa» cataliza la reducción dependiente de NAD(P)H del ácido dihidropiridina dicarboxílico para producir ácido hexahidropiridina dicarboxílico. La dihidrodipicolinato reductasa está codificada por el gendapB.En algunas formas de realización, el gendapBen la presente divulgación procede deCorynebacterium glutamicum.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «fosfopiruvato carboxilasa» cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato (PEP, por sus siglas en inglés) en ácido oxalacético y está codificada por el genppc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «piruvato carboxilasa» cataliza la carboxilación reversible del ácido pirúvico para formar acetil oxalato y está codificado por el genpyc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «polinudeótido» se refiere a un polímero compuesto de nucleótidos. El polinucleótido puede tener la forma de un fragmento individual o de un componente de una estructura de secuencia de nucleótidos mayor, y se deriva de una secuencia de nucleótidos separada al menos una vez en cantidad o concentración y puede reconocerse, manipularse y restaurarse a partir de la secuencia y sus secuencias de nucleótidos componentes mediante métodos estándar de biología molecular (como el uso de un vector de clonación). Cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C), donde «U» sustituye a «T». En otras palabras, «polinucleótido» se refiere a un polímero de nucleótidos que ha sido separado de otros nucleótidos (un fragmento individual o un fragmento entero), o puede ser una parte constituyente o un componente de una estructura de nucleótidos mayor, como un vector de expresión o una secuencia policistrónica. El polinucleótido incluye secuencias de ADN, ARN y ADNc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «silvestre» se refiere a un objeto que puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o una secuencia de polinucleótidos presente en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el ser humano en el laboratorio se produce de manera natural. Tal como se utiliza en el presente documento, «producirse de manera natural» y «de tipo silvestre» (abreviado como WT) son sinónimos. En algunas formas de realización, el promotor de tipo silvestre de la presente divulgación se refiere al promotor del gendapBde tipo silvestre, es decir, el polinucleótido que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «mutante» se refiere a un polinucleótido o polipéptido que, en relación con el polinucleótido o polipéptido "de tipo silvestre" o "comparativo", comprende alternancia(s) (es decir, sustitución, inserción y/o supresión de un polinucleótido) en una o más (por ejemplo, varias) posiciones, en donde la sustitución se refiere a una sustitución de un nucleótido diferente por un nucleótido que ocupa una posición; la supresión se refiere a la eliminación de un nucleótido que ocupa cierta posición; y la inserción se refiere a una adición de un nucleótido tras el nucleótido adyacente a e inmediatamente después de la posición ocupada.

En algunas formas de realización, la «mutación» en la presente divulgación es una «sustitución», que es una mutación causada por una sustitución de una base en el nucleótido por otra base diferente, que también se denomina sustitución de base o mutación puntual.

Concretamente, la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 es la secuencia de un promotor de gendapB,que comprende una región core de promotor que tiene una secuencia de nucleótidos de “ACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCTTCTGAACGGGTACGTCTAGACTGGTGGGC G”, en donde la parte subrayada es la secuencia de la región -10. El mutante de la presente divulgación introduce nucleótidos mutados en las proximidades de la región -10, y se observa que la actividad promotora de los mutantes tras la introducción de las mutaciones en las posiciones mencionadas aumenta significativamente, y se obtiene un nuevo promotor fuerte, que proporciona abundantes elementos reguladores de la expresión para la síntesis eficiente de los compuestos objetivo.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora se refiere a un mutante del polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, el mutante tiene nucleótido(s) mutado(s) en una o más posiciones de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 y no comprende el polinucleótido que muta a TCTGAACGGGTACGTCTAGAC en la posición de la 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1. El mutante tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización, el mutante del polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 tiene una actividad promotora de 3 a 12 veces más o más mejorada en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización más específicas, el mutante tiene 3,7; 3,8; 11,2 veces más actividad promotora mejorada en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que comprende la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «promotor» se refiere a una molécula de ácido nucleico, que se sitúa típicamente aguas arriba de la secuencia codificadora del gen diana, proporcionando un sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa, y se sitúa aguas arriba en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción del ARNm. Se trata de una secuencia de ácido nucleico no traducida a la que se une la ARN polimerasa y que inicia la transcripción del gen diana. En la síntesis del ácido ribonucleico (ARN), el promotor puede interactuar con los factores de transcripción y regular la transcripción del gen y controlar el tiempo de inicio y el grado de expresión genética (transcripción), y comprende una región promotora core y una región reguladora, funciona como un «interruptor», determina la actividad del gen y, a continuación, controla qué tipo de proteína empieza a producir la célula.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «región core promotora» se refiere a una secuencia de ácido nucleico ubicada en la región promotora de procariotas, y es la región de secuencia core que desempeña el papel de promotor, incluyendo principalmente la región -35, la región -10, y la región entre la región -35 y la región -10, y el sitio de inicio de la transcripción, siendo la región -35 el sitio de reconocimiento de la ARN polimerasa, y siendo la región -10 el sitio de unión de la ARN polimerasa. En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación es un mutante que comprende una región core promotora del gendapBe introduce mutación en las proximidades de la región -10 de la región core promotora, con el fin de obtener una actividad promotora significativamente mejorada en comparación con la actividad promotora del promotor del gendapB.

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «identidad de secuencia» y «porcentaje de identidad» se refieren al porcentaje de nucleótidos o aminoácidos que son iguales (es decir, idénticos) entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos. La identidad de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos puede determinarse alineando las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de los polinucleótidos o polipéptidos, puntuando el número de posiciones en las que los residuos de nucleótidos o aminoácidos son idénticos en los polinucleótidos o polipéptidos alineados, y comparando el número de estas posiciones con el número de posiciones en las que los residuos de nucleótidos o aminoácidos son diferentes en los polinucleótidos o polipéptidos alineados. Los polinucleótidos pueden ser diferentes en una posición, por ejemplo, por contener un nucleótido diferente (es decir, sustitución o mutación) o supresión de un nucleótido (es decir, inserción de nucleótidos o supresión de nucleótidos en uno o dos polinucleótidos). Los polipéptidos pueden ser diferentes en una posición, por ejemplo, por contener un aminoácido diferente (es decir, sustitución o mutación) o supresión de un aminoácido (es decir, inserción de aminoácidos o supresión de aminoácidos en uno o dos polipéptidos). La identidad de secuencia puede calcularse dividiendo el número de posiciones en las que los residuos de nucleótidos o aminoácidos son idénticos por el número total de residuos de nucleótidos o aminoácidos en el polinucleótido o el polipéptido. Por ejemplo, el porcentaje de identidad puede calcularse dividiendo el número de posiciones en las que los residuos de nucleótidos o aminoácidos son idénticos por el número total de residuos de nucleótidos o aminoácidos en el polinucleótido o polipéptido, y multiplicando el resultado por 100.

En algunas formas de realización, dos o más secuencias o subsecuencias, cuando se comparan y alinean a máxima correspondencia por el algoritmo de alineación de secuencias o por la medición de inspección visual, tienen al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de «identidad de secuencia» o «porcentaje de identidad» de nucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia es sustancialmente idéntica en toda la longitud de cualquiera o ambos biopolímeros comparados (p. ej.,polinucleótidos).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «complementario» se refiere a hibridación o emparejamiento de bases entre nucleótidos y nucleótidos,p. ej.,entre dos cadenas de una molécula de ADN bicatenario o entre un cebador oligonucleotídico y un sitio de unión del cebador en un nucleótido monocatenario que se va a secuenciar o amplificar.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «condiciones altamente estrictas» significa que, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de ADN, una sonda de al menos 100 nucleótidos de longitud se prehibridiza o hibrida entre 12 y 24 horas a 42°C en 5X SSPE (EDTA de fosfato sódico salino ), 0,3% SDS, 200 ^g/ml de ADN de esperma de salmón escindido y desnaturalizado, y formamida al 50%. Por último, el material vectorial se lava tres veces a 65°C con 2X SSC y 0,2% SDS, cada una durante 15 min.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «condiciones muy altamente estrictas» significa que, siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de ADN, una sonda de al menos 100 nucleótidos de longitud se prehibridiza o hibrida entre 12 y 24 horas a 42°C en 5X SSPE (EDTA de fosfato sódico salino ), 0,3% SDS, 200 ^g/ml de ADN de esperma de salmón escindido y desnaturalizado, y formamida al 50%.Por último, el material vectorial se lava tres veces a 70°C con 2X SSC y 0,2% SDS, cada una durante 15 min.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación puede utilizarse para iniciar la expresión de genes codificadores de proteínas. En algunas otras formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación puede utilizarse para iniciar la expresión de genes no codificadores.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «expresión» incluye cualquier etapa que implique la producción de ARN y la producción de proteínas, incluyendo pero no limitándose a la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «casete de expresión de transcripción» se refiere a un elemento de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que tiene actividad promotora. En algunas formas de realización, un elemento regulador de la transcripción que regula el gen diana puede comprender elementos como un potenciador, un silenciador, un aislante, además del polinucleótido que tiene actividad promotora. En algunas formas de realización, el gen diana de la presente divulgación es específicamente un gen codificador de proteínas. «Ligar operablemente» un gen diana a un polinucleótido que tiene actividad promotora significa que un polinucleótido que tiene actividad promotora se liga funcionalmente con un gen diana para iniciar y mediar la transcripción del gen diana, y la ligadura operable puede realizarse de cualquiera de las formas descritas por los expertos en la técnica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «vector» se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN ligada operablemente con secuencias reguladoras adecuadas, con el fin de expresar un gen diana en un huésped adecuado. «Vector de expresión recombinante» se refiere a una estructura de ADN utilizada para expresar, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido deseado. El vector de expresión recombinante puede incluir, por ejemplo, i) un conjunto de elementos genéticos que tienen funciones reguladoras de la expresión genética, como promotores y potenciadores; ii) una estructura o secuencia codificadora transcrita en ARNm y traducida en una proteína; y iii) subunidades de transcripción que transcriben y traducen adecuadamente las secuencias de inicio y parada. El vector de expresión recombinante se construye de cualquier forma adecuada. La propiedad del vector no es crítica, y puede utilizarse cualquier vector, incluidos plásmidos, virus, fagos y transposones. Los posibles vectores para su uso en la presente divulgación incluyen, entre otros, secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, como plásmidos bacterianos, ADN de fagos, plásmidos de levadura y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, y ADN de virus como el virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, baculovirus, SV40 y virus de la pseudorrabia, etc. En la presente divulgación, «vector de expresión recombinante» y «vector recombinante» pueden utilizarse indistintamente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «ARN diana» incluye ARN funcionales que desempeñan un papel en procesos como la codificación genética, la traducción, la regulación, la expresión genética, etc. En la presente divulgación, el ARN diana ligado con un polinucleótido que tiene actividad promotora puede ser cualquier ARN funcional de la técnica.

En algunas formas de realización, el ARN diana es ARNt o ARNs. En algunas otras formas de realización, el ARN diana también puede ser otros tipos de ARN, tales como ARNsg, ARNcr, ARNtracr, ARNml, ARNsi, etc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término «gen diana» se refiere a cualquiera de los genes que se ligan con el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación para regular su nivel transcripcional.

En algunas formas de realización, el gen diana es un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo. En algunas formas de realización, el gen diana es un gen codificador de una proteína reguladora de la expresión genética. En algunas formas de realización, el gen diana es un gen codificador de una proteína relacionada con el transporte de membrana.

A modo de ejemplo, el gen diana es un gen codificador de una enzima relacionada con la biosíntesis de un compuesto objetivo, un gen codificador de una enzima relacionada con el poder reductor, un gen codificador de una enzima relacionada con la glucólisis o el ciclo TCA , o un gen codificador de una enzima relacionada con la liberación de un compuesto objetivo, etc.

A modo de ejemplo, el gen diana incluye al menos uno de los siguientes genes: gen de la piruvato carboxilasa, gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, gen de la Y-glutamil quinasa, gen de la glutamato semialdehído deshidrogenasa, gen de la pirrolina-5-carboxilato reductasa, gen de la proteína transportadora de aminoácidos, gen relacionado con el sistema ptsG, gen de la piruvato deshidrogenasa, gen de la homoserina deshidrogenasa, gen del ácido oxalacético descarboxilasa, gen represor del ácido glucónico, gen de la glucosa deshidrogenasa, gen de la aspartato quinasa, gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, gen de la aspartato amoniaco liasa, gen de la dihidrodipicolinato sintasa, gen del ácido dihidropiridínico reductasa, gen de la succinil diaminopimelato aminotransferasa, gen de la tetrahidrodipicolinato succinilasa, gen de la succinil diaminopimelato desacilasa, gen de la ácido diaminopimélico epimerasa, gen del ácido diaminopimélico desacilasa, gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, gen de la transcetolasa, gen de la diaminopimelato deshidrogenasa. Tal como se utiliza en el presente documento, el término «compuesto objetivo» se puede seleccionar de entre aminoácidos, ácidos orgánicos, y también pueden seleccionarse de entre otros tipos de compuestos que pueden obtenerse por biosíntesis en la técnica.

En algunas formas de realización, el compuesto objetivo es un «aminoácido» o «L-aminoácido». «Aminoácido» o «L-aminoácido» se refiere, generalmente, a una unidad constituyente básica de una proteína en la que el grupo amino y el grupo carboxilo están unidos al mismo átomo de carbono. A modo de ejemplo, el aminoácido se selecciona de entre uno o más de los siguientes: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, treonina, serina, cisteína, glutamina, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, fenilalanina, tirosina, triptófano, prolina, hidroxiprolina, ácido 5-aminolevulínico o derivados de cualquiera de los aminoácidos anteriores. Además, el aminoácido también puede ser otros tipos de aminoácidos de la técnica.

En algunas formas de realización, el compuesto objetivo es un ácido orgánico. El ácido orgánico puede ser un compuesto orgánico ácido, p. ej., aquellos compuestos que contienen un grupo carboxilo y un grupo ácido sulfónico. A modo de ejemplo, el ácido orgánico incluye uno o más de entre los siguientes: ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oxálico, ácido oxalacético, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido hexenoico, ácido decanoico, ácido caprílico, ácido valérico, ácido málico o derivados de cualquiera de los ácidos orgánicos anteriores. Además, el ácido orgánico también puede ser otro tipo de ácidos orgánicos de la técnica.

El término «gen codificador de proteínas» de la presente divulgación se refiere a una molécula de ADN capaz de dirigir la síntesis de una proteína mediante ciertas reglas, y el proceso por el cual un gen codificador de proteínasque dirige la síntesis de proteínas generalmente incluye un proceso de transcripción utilizando ADN bicatenario como plantilla y la traducción utilizando ARNm como plantilla. El gen codificador de proteínas contiene una secuencia CDS (secuencia codificadora) que dirige la producción del ARNm codificador de proteínas.

A modo de ejemplo, el gen codificador de proteínas incluye, pero no se limita a, genes codificadores de proteínas relacionadas con la síntesis de un compuesto objetivo, y en algunas formas de realización, el gen codificador de proteínas se refiere a genes codificadores de proteínas relacionadas con la síntesis de L-aminoácido. A modo de ejemplo, las proteínas relacionadas con la síntesis de L-aminoácido incluyen, pero no se limitan a, una o una combinación de dos o más de entre: piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, Y-glutamil quinasa, glutamato semialdehído deshidrogenasa, pirrolina-5-carboxilato reductasa, proteína transportadora de aminoácidos, sistema ptsG, piruvato deshidrogenasa, homoserina deshidrogenasa, ácido oxalacético descarboxilasa, proteína represora del ácido glucónico, glucosa deshidrogenasa. En algunas formas de realización, la proteína relacionada con la síntesis de L-aminoácido es una proteína relacionada con la síntesis de L-lisina, que incluye una o una combinación de dos o más de entre: aspartato quinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, aspartato amonio liasa, dihidrodipicolinato sintasa, dihidrodipicolinato reductasa, ácido dihidropiridínico reductasa, succinil diaminopimelato aminotransferasa, tetrahidrodipicolinato succinilasa, succinil diaminopimelato deacilasa, ácido diaminopimélico epimerasa, ácido diaminopimélico deacilasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, proteína transportadora de lisina, transcetolasa, diaminopimelato deshidrogenasa y piruvato carboxilasa.

En algunas formas de realización, el gen codificador de proteínas se refiere a un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de ácidos orgánicos. A modo de ejemplo, el gen codificador de proteínas se utiliza para codificar una proteína relacionada con la síntesis de ácido oxalacético, una proteína relacionada con la síntesis de ácido cítrico, o se utiliza para codificar una proteína relacionada con la síntesis de ácido succínico.

En algunas formas de realización, el gen codificador de proteínas se refiere a un gen codificador de una enzima relacionada que favorece la síntesis de ácido oxaloacético. A modo de ejemplo, el gen codificador de proteínas es un gen codificadorppcde la fosfoenolpiruvato carboxilasa, o un gen codificadorpycde la piruvato carboxilasa. Como se indica en la literatura existente[1], la expresión mejorada de la enzima relacionada que promueve la síntesis de ácido oxaloacético puede aumentar el rendimiento del ácido 5-aminolevulínico.

En la presente divulgación, el término «proteína reguladora de la expresión genétca» incluye, pero no se limita a, proteínas herramienta reguladoras de la expresión genética exógena, como la proteína dCas9 y la proteína dCpf1 necesarias para la regulación CRISPRi, la proteína Hfq necesaria para la regulación sRNA, y factores reguladores de la transcripción endógenos o exógenos, con el fin de regular la expresión de genes clave en las vías metabólicas.

En la presente divulgación, el término «célula hospedadora» se refiere a cualquier tipo celular que, fácilmente, se pueda transformar, transfectar, transducir, etc., con un elemento de iniciación de transcripción o vector de expresión que comprenda el polinucleótido de la presente divulgación. El término «célula hospedadora recombinante» cubre una célula hospedadora que difiere de la célula parental tras la introducción de un elemento de iniciación de transcripción o de un vector de expresión recombinante, y la célula hospedadora recombinante se realiza específicamente por transformación.

En la presente divulgación, el término «transformación» tiene el significado generalmente entendido por los expertos en la técnica, es decir, el proceso de introducir ADN exógeno en una hospedadora. El método de transformación incluye cualquier método para introducir ácido nucleico en una célula, incluidos, pero sin limitarse a, la electroporación, la precipitación de fosfato cálcico (CaPO4), la precipitación de cloruro cálcico (CaCl2), la microinyección, el método de polietilenglicol (PEG), el método DEAE-dextrano, el método de liposomas catiónicos y el método de acetato de litio-DMSO.

La célula hospedadora de la presente divulgación puede ser una célula procariota o eucariota, siempre que se trate de una célula en la que pueda introducirse el polinucleótido que tiene actividad promotora de la presente divulgación. En una forma de realización, la célula hospedadora se refiere a una célula procariota. Concretamente, la célula hospedadora procede de un microorganismo apto para producir aminoácidos, ácidos orgánicos por fermentación, como el géneroCorynebacterium,el géneroBrevibacterium,el géneroArthrobacterium,el géneroMicrobacteriumo el géneroEscherichia.Preferiblemente, la célula hospedadora esCorynebacterium glutamicumdel géneroCorynebacterium.Entre ellos, Corynebacterium glutamicum puede serCorynebacterium glutamicumATCC 13032,Corynebacterium glutamicumATCC 13869, oCorynebacterium glutamicumATCC 14067, y una cepa mutante productora de aminoácidos, especialmente lisina, o una cepa derivada deCorynebacterium glutamicumpreparada a partir de las cepas anteriores. En algunas formas de realización, la célula hospedadora de la presente divulgación puede ser de cualqueir tipo de cepas que tengan la capacidad de producir aminoácidos, incluyendo cepas de tipo silvestre y cepas recombinantes.

A modo de ejemplo, la célula hospedadora es una célula hospedadora que produce lisina. En algunas formas de realización, la célula hospedadora que produce lisina puede ser una cepa que expresa aspartato quinasa que alivia la retroinhibición sobre la base deCorynebacterium glutamicumATCC 13032. Además, la célula hospedadora que produce lisina también puede ser otro tipo de cepas que tengan la capacidad de producir lisina.

En algunas formas de realización, en la célula hospedadora que produce lisina, uno o más genes seleccionados de entre los siguientes está o están atenuados o tiene o tienen una expresión reducida:

a. genadhEque codifica la etanol deshidrogenasa;

b. genackAque codifica la acetato quinasa;

c. genptaque codifica la fosfato acetiltransferasa;

d. genIdhAque codifica la lactato deshidrogenasa;

e. genfocAque codifica el transportador de formiato;

f. genpflBque codifica la piruvato formiato liasa;

g. genpoxBque codifica la piruvato oxidasa;

h. genthrAque codifica la enzima bifuncional aspartato quinasa I/ homoserina deshidrogenasa I;

i. genthrBque codifica la homoserina quinasa;

j. genIdcCque codifica la lisina descarboxilasa; y

h. gencadAque codifica la lisina descarboxilasa.

En algunas formas de realización, en la célula hospedadora de lisina, se potencian o sobreexpresan uno o más genes seleccionados de entre los siguientes:

a. gendapAque codifica la dihidrodipiridina sintasa que alivia la retroinhibición de la lisina; b. gendapBque codifica la dihidrodipicolinato reductasa;

c. genddhque codifica la diaminopimelato deshidrogenasa;

d.dapDque codifica la tetrahidrodipicolinato succinilasa ydapEque codifica la succinil diaminopimelato deacilasa

e. genasdque codifica la aspartato-semialdehído deshidrogenasa;

f. genppcque codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa;

g. genpntABque codifica la nicotinamida adenina dinucleótido transhidrogenasa;

i. genlysEque codifica la proteína transportadora de lisina.

A modo de ejemplo, la célula hospedadora es una célula hospedadora que produce treonina. En algunas formas de realización, la célula hospedadora que produce treonina es una cepa que expresa el genLysCde la aspartato quinasa que alivia la retroinhibición sobre la base deCorynebacterium glutamicumATCC 13032. En algunas otras formas de realización, la célula hospedadora que produce treonina también puede ser de otros tipos de cepas que tengan capacidad de producir treonina.

En algunas formas de realización, en la célula hospedadora que produce treonina, se potencian o sobreexpresan uno o más genes seleccionados de entre los siguientes :

a. genthrABCque codifica el operón de la treonina;

b. genhomque codifica la homoserina deshidrogenasa que alivia la retroinhibición ;

c. gengapque codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa;

d. genpycque codifica la piruvato carboxilasa;

e. genmqoque codifica el malato: quinona oxidorreductasa;

f. gentktque codifica la transcetolasa;

g. gengndque codifica la 6-fosfogluconato deshidrogenasa;

h. genthrEque codifica el exportador de treonina;

i. genenoque codifica la enolasa

A modo de ejemplo, la célula hospedadora es una célula hospedadora que produce isoleucina. En algunas formas de realización, la célula hospedadora que produce isoleucina es una cepa que produce L-isoleucina mediante la sustitución de alanina por el aminoácido en la posición 323 del gen ilvA de la L-treonina deshidratasa . En algunas otras formas de realización, la célula hospedadora que produce isoleucina también puede ser de otros tipos de cepas que tengan capacidad de producir isoleucina.

A modo de ejemplo, la célula hospedadora es una célula hospedadora que produce O-acetilhomoserina. En algunas formas de realización, la célula hospedadora que produce O-acetilhomoserina es una cepa que produce O-acetilhomoserina inactivando la O-acetilhomoserina (tiol)-liasa. En algunas otras formas de realización, la célula hospedadora que produce O-acetilhomoserina también puede ser de otros tipos de cepas que tengan capacidad de producir O-acetilhomoserina.

A modo de ejemplo, la célula hospedadora es una célula hospedadora que produce metionina. En algunas formas de realización, la célula hospedadora que produce metionina es una cepa que produce metionina inactivando los reguladores de transcripción de metionina y cisteína. En algunas otras formas de realización, la célula hospedadora que produce metionina puede ser de otros tipos de cepas que tengan capacidad de producir metionina.

En la presente divulgación, el cultivo de la célula hospedadora puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos convencionales en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el cultivo en placa de pocillos, cultivo por agitación, cultivo por lotes, cultivo continuo y cultivo descontinuo, etc., y diversas condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el tiempo y el valor de pH del medio de cultivo pueden ajustarse adecuadamente de acuerdo con las situaciones reales.

A menos que se defina o se indique claramente lo contrario, todos los términos técnicos y científicos de la presente divulgación tienen el mismo significado que suelen tener para los expertos en la técnica a la que se refiere la presente divulgación

Mutante de la región core del promotor del gendapB

La presente divulgación utiliza la secuencia de la región core del promotor del gendapBe introduce una mutación en las proximidades de la región -10 (en la región -10 y los 16 pb anteriores a la región -10) del promotor del gendapB,para obtener un mutante de la región core del promotor del gendapBque comprende una región -10 mutada.

Para el polinucleótido que tiene actividad promotora en la presente divulgación, mutando la región core del promotor del gendapB,específicamente, introduciendo mutaciones a (TCTGAACGGGTACGTCTAGAC) en las proximidades de la región -10 de la región core del promotor del gendapB,el mutante de la presente divulgación tiene una actividad promotora significativamente mejorada en comparación con el promotor de tipo silvestre que comprende una región core del promotor del gendapB,y es un nuevo promotor fuerte; el mutante, cuando se aplica a la fermentación de un compuesto objetivo, exhibe una mayor tasa de conversión y rendimiento del compuesto objetivo en comparación con el promotor de tipo silvestre.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora en la presente divulgación tiene nucleótidos mutados en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 posiciones de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, y tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el promotor del gendapBde tipo silvestre que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora en la presente divulgación incluye además un polinucleótido que es inversamente complementario a la secuencia de nucleótidos del mutante del promotor del gendapBcomo se establece en SEQ ID NO: 1. Además, el polinucleótido tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el promotor del gendapBde tipo silvestre que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora en la presente divulgación incluye además un polinucleótido que es inversamente complementario a la secuencia que hibrida con la secuencia de nucleótidos de un mutante del promotor del gendapBcomo se establece en SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación altamente estrictas o en condiciones de hibridación muy altamente estrictas. Además, el polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos que no es TCTGAACGGGTACGTCTAGAC de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1; y el polinucleótido tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el promotor del gendapBde tipo silvestre que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora en la presente divulgación tiene al menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia (incluyendo todos los rangos y porcentajes entre estos números) en comparación con el polinucleótido antes mencionado. Además, el polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos que no es TCTGAACGGGTACGTCTAGAC de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1; y el polinucleótido tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el promotor del gendapBde tipo silvestre que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1.

En algunas formas de realización específicas, la secuencia de nucleótidos del mutante correspondiente a de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 se selecciona de entre cualquiera de los grupos que consisten en lo siguiente (P<dapB>-1) a (P<dapB>-3):

(P<dapB>-1) CTCTGATGTGATAGTATAATT;

(P<dapB>-2) ATCATTTGGTGTATACTAAAT;

(P<dapB>-3) GTCCTGTGGTAAACTTTAGCG.

En algunas formas de realización específicas, la secuencia de nucleótidos del mutante se selecciona de la secuencia tal como se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 2 a 4.

En algunas formas de realización, el polinucleótido que tiene actividad promotora en la presente divulgación tiene una actividad promotora mejorada de 3 a 12 veces más o más en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 y además tiene una actividad promotora 3,7, 3,8, 11,2 veces mejorada en comparación con la actividad promotora de un polinucleótido que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1.

Vector de expresión recombinante y célula hospedadora recombinante

En algunas formas de realización, la amplificación se lleva a cabo en la presente divulgación utilizando el genoma ATCC13032 (Corynebacterium glutamicumATCC 13032, identificación del gen (Gene ID): 2830649) como plantilla, ydapB-1ydapB-2como cebadores para obtener un fragmento de ADN del promotor del gendapB,y un fragmento N-terminal de 180 pb del gendapB;el esqueleto de plásmido pEC-XK99E se amplifica utilizando el plásmido PEC-XK99E-rfp como plantilla[2], y pEC-1 y pEC-2 como cebadores; los fragmentos de ADN del gen de la proteína fluorescente roja que comprenden un péptido enlazador se amplifican utilizando RFP-1/2 como cebadores, y el plásmido PEC-XK99E-rfp como plantilla. El citado fragmento promotor del gendapB,el fragmento N-terminal de 180 pb, fragmentos de ADN del gen de la proteína fluorescente roja que comprenden un péptido enlazador, y el esqueleto del plásmido pEC-XK99E se ligan recombinantemente, para obtener un vector de expresión recombinante pEC-XK99E- PdapB- rfp.

En algunas formas de realización, utilizando pEC-XK99E-PdapB-rfpcomo plantilla, se amplifica un fragmento que comprende una región de mutación utilizando el cebador PdapB-1 y el cebador pEC-3, se amplifica un fragmento de esqueleto de plásmido utilizando el cebador pEC-4 y el cebador pEC-5 de la presente divulgación, y se ligan recombinantemente los dos tipos de fragmentos mencionados, para obtener un vector recombinante pEC-XK99E-PdapB-1- rfp.

En algunas formas de realización, utilizando pEC-XK99E-PdapB-rfpcomo plantilla, se amplifica un fragmento que comprende una región de mutación utilizando el cebador PdapB-2 y el cebador pEC-3, se amplifica un fragmento de esqueleto de plásmido utilizando el cebador pEC-4 y el cebador pEC-5 de la presente divulgación, y se ligan recombinantemente los dos tipos de fragmentos mencionados, para obtener un vector recombinante pEC-XK99E-PdapB-2- rfp.

En algunas formas de realización, utilizando pEC-XK99E-PdapB-rfp como plantilla, se amplifica un fragmento que comprende una región de mutación utilizando el cebador PdapB-3 y el cebador pEC-3, se amplifica un fragmento de esqueleto de plásmido utilizando el cebador pEC-4 y el cebador pEC-5 de la presente divulgación, y se ligan recombinantemente los dos tipos de fragmentos mencionados, para obtener un vector recombinante pEC-XK99E- PdapB-3- rfp.

En algunas otras formas de realización, el vector recombinante requerido también puede construirse utilizando un mutante del promotor mostrado en cualquiera de (PdapB-1) a (PdapB-3) en la presente divulgación de acuerdo con las necesidades específicas de clonación.

En algunas formas de realización,Corynebacterium glutamicumATCC13032 se transforma utilizandopEC-XK99E-P dapB-rfp, pEC-XK99E-PdapB-i-rfp, pEC-XK99E-PdapB-2-rfpand pEC-XK99E-PdapB-3-rfp,respectivamente, para obtener una célula hospedadora recombinante en la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la amplificación se lleva a cabo utilizando un plásmido de la biblioteca de mutantes del promotor del gendapBcomo plantilla, ydapB-P1, dapB-P2como cebadores para obtener fragmentos de los respectivos mutantes del promotor del gendapBde la presente divulgación; fragmentos del genppcson amplificados utilizando el genoma deCorynebacterium glutamicumATCC 13032 como plantilla, y ppc-1/ppc-2 como cebadores; un esqueleto de plásmido se amplifica utilizando el plásmido pEC-XK99E como plantilla, y PEC-1/PEC-2 como cebadores. Los respectivos fragmentos de mutante del promotor se ligan recombinantemente con los fragmentos del genppcy el esqueleto del plásmido, para obtener plásmidos de mutante del promotor del gendapB.

En algunas formas de realización específicas, los plásmidos de mutante del promotor del gendapBincluyen cualquiera de entre los siguientes: pEC-PdapB-1- ppc,pEC-PdapB-2- ppc, pEC-PdapB-3-ppc.

En algunas formas de realización, con respecto a una cepa SCgL30 deCorynebacteriumglutamicumen la presente divulgación, la treonina en la posición 311 del aspartato quinasa (codificada por el gen lysC) en el genoma deCorynebacterium glutamicumATCC 13032 es mutada en isoleucina, para construir una cepa SCgL30 que tiene cierta capacidad de síntesis de lisina.

En algunas formas de realización específicas, un vector de expresión recombinante, tal como se establece en cualquiera de pEC- PdapB-1- ppca pEC- PdapB-3- ppc,se transforma en una cepa SCgL30 para obtener una célula hospedadora recombinante de la presente divulgación. En algunas otras formas de realización específicas, un vector recombinante que comprende el mutante del promotor como se establece en cualquiera de (PdapB-1)a (PdapB-3)también puede transformarse en una cepa SCgL30 para obtener una célula hospedadora recombinante en la presente divulgación.

Proceso de producción de un compuesto objetivo

(1) Un polinucleótido con actividad promotora se liga operablemente con un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo o con un gen codificador de una proteína reguladora de la expresión genética, para obtener un vector de expresión recombinante de la proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo o de la proteína reguladora de la expresión genética, y el vector de expresión recombinante se utiliza para transformar una célula hospedadora, para obtener una célula hospedadora recombinante.

(2) La célula hospedadora recombinante está sujeta a cultivo de fermentación y el compuesto objetivo se recoge de la célula hospedadora recombinante o del caldo de cultivo de la célula hospedadora recombinante para completar el proceso de producción del compuesto objetivo.

En el proceso de producción mencionado, como el polinucleótido tiene una actividad promotora mejorada, en la célula hospedadora recombinante, aumenta la actividad de transcripción del gen codificador de la proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo o de la proteína reguladora de la expresión genética, y aumenta el nivel de expresión de la proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo o de la proteína reguladora de la expresión genética, con lo que aumenta significativamente el rendimiento del compuesto objetivo.

En algunas formas de realización, el compuesto objetivo es un aminoácido, y el gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo se refiere a un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de un aminoácido. En algunas formas de realización, el compuesto objetivo es L-aminoácido, y el gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de un aminoácido se refiere a un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de L-aminoácido.

En algunas formas de realización específicas, la proteína relacionada con la síntesis de un aminoácido es el fosfoenolpiruvato carboxilasa. El aumento de la expresión deppcmediante el uso de un polinucleótido que tiene actividad promotora puede mejorar la síntesis de fosfoenolpiruvato (PEP) a ácido oxalacético, que a su vez promueve la producción de un compuesto objetivo dependiente del suministro de precursores de ácido oxalacético, incluyendo aminoácidos de la familia del ácido aspártico (lisina, treonina, isoleucina, metionina), y aminoácidos de la familia del ácido glutámico (ácido glutámico, prolina, hidroxiprolina, arginina, glutamina), etc.

En algunas formas de realización específicas, la célula hospedadora esCorynebacterium glutamicum,una cepa importante para producir compuestos objetivo como aminoácidos, ácidos orgánicos, etc., y tras la modificación deCorynebacterium glutamicumutilizando un polinucleótido, un casete de expresión de transcripción o un vector de expresión recombinante que tiene una fuerte actividad promotora constitutiva, el nivel de expresión de la proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo enCorynebacterium glutamicumaumenta significativamente, lo que da lugar a una capacidad mucho mayor de acumulación fermentativa a largo plazo del compuesto objetivo enCorynebacterium glutamicum.

En algunas formas de realización específicas, la célula hospedadora esCorynebacteriumglutamicummodificada de la siguiente manera: la treonina en la posición 311 del aspartato quinasa (codificada por el genlysC)en el genoma delCorynebacterium glutamicumATCC 13032 muta en isoleucina.

En algunas formas de realización específicas, las condiciones de cultivo de células hospedadoras recombinantes son las siguientes: las células hospedadoras recombinantes se inoculan en un medio líquido TSB y se cultivan, y el cultivo se inocula como semilla en una placa de 24 pocillos en la que cada pozo contiene un medio de fermentación, y se cultiva a 30°C durante 18 horas a una velocidad de rotación del agitador de placas de 800 rpm. El rendimiento de la producción de L-lisina se detecta después de la fermentación.

Los ingredientes del medio de fermentación para lisina son los siguientes: glucosa, 80 g/L; levadura en polvo, 1 g/L; peptona de soja, 1 g/L; NaCl, 1 g/L; sulfato de amonio, 1 g/L; urea, 10 g/L; K2HPO43 H2O, 1 g/L; MgSO4-7 H2O, 0,45 g/L; FeSO4-7 H2O, 0,05 g/L; biotina, 0,4 mg/L; vitamina B1, 0,1 mg/L; MOPS, 40 g/L; pH inicial 7,2. Se añaden 25 ^g/mL de Kanamicina al medio.

En algunas formas de realización específicas, los compuestos objetivo pueden recuperarse de células hospedadoras recombinantes o caldos de cultivo de células recombinantes por métodos comúnmente utilizados en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización y cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés).

En la técnica, son conocidos los métodos para manipular los microorganismos, como se explica en las publicaciones, tal comoCurrent Protocols in Molecular Biology(ISBN digital: 9780471142720, John Wiley and Sons, Inc.),Microbial Metabolic Engineering: Methods and Protocols(Qiong Cheng Ed.,Springer) ySystems Metabolic Engineering: Methods and Protocols(Hal S.Alper Ed.,Springer).

Ejemplos

Otros objetos características y ventajas de la presente divulgación resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, cabe entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos (aunque indiquen formas de realización específicas de la presente divulgación) se proporcionan con fines solamente explicativos, porque diversas variaciones y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente divulgación resultarán obvias para los expertos en la técnica al leer la descripción detallada.

Las técnicas y métodos experimentales utilizados en los ejemplos son métodos técnicos convencionales a no ser que se especifique lo contrario. Por ejemplo, los métodos experimentales, cuyas condiciones específicas no se indican en los ejemplos siguientes, suelen estar en concordancia con las condiciones convencionales, como los descritos enMolecular Cloning: Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), de Sambrooket al.,o los sugeridos por los fabricantes. A menos que se especifique lo contrario, los materiales y reactivos utilizados en los ejemplos pueden obtenerse a través de canales comerciales formales.

Ejemplo 1. Construcción del plásmido de caracterización de la intensidad del promotor del gen d a p B de C o ry n e b a c te r iu m g lu ta m ic u m

En la presente divulgación, se seleccionó el promotor del gen de la dihidrodipicolinato reductasadapBdeCorynebacterium glutamicumpara llevar a cabo la caracterización de la intensidad, y se introdujo además una mutación de región específica para mejorar la actividad del promotor, con el fin de obtener mutantes del promotor que tuvieran una intensidad de expresión mejorada. En las bacterias, la secuencia reguladora de la expresión y la región codificadora N-terminal de un gen son las regiones clave que afectan a la expresión genética. En la presente divulgación, se caracterizó la intensidad de expresión de un promotor diana basándose en la intensidad de fluorescencia, utilizando un método consistente en ligar secuencialmente un promotor aguas arriba del gendapB, la región codificante N-terminal de 180 pb del gendapB,un péptido enlazador flexible y un gen de proteína fluorescente rojarfp.

El ejemplo presente primero construyó un vector de caracterización del promotor del gendapBdeCorynebacterium glutamicum.Basándose en el esqueleto de un plásmido pEC-XK99E, se expresaron 60 aminoácidos en el extremo N-terminal de un gen seleccionado, un péptido enlazador y un gen de proteína fluorescente roja mediante una región reguladora de expresión que comprende un promotor aguas arriba del gen. La construcción específica fue la siguiente:

(1) Amplificación de fragmentos de promotor y secuencia de N-terminal

Se diseñaron cebadores de amplificación de acuerdo con la secuencia de genoma publicada deCorynebacterium glutamicumATCC13032 (ID del gen:2830649) y la información de anotación del gendapBdeCorynebacterium glutamicum.Los fragmentos de un promotordapBde tipo silvestre (la secuencia es tal como se establece en SEQ ID NO: 1) y la secuencia N-terminal de 180 pb se amplificaron utilizando dapB-1/2 como cebadores y el genoma ATCC13032 como plantilla.

(2) Amplificación del esqueleto del plásmido y del fragmento derfp

Utilizando como plantilla el plásmido pEC-XK99E-/fp[2] descrito en la literatura, se amplificó el esqueleto del plásmido pEC-XK99E utilizando pEC-1/2 como cebadores, y el fragmento de ADN del gen de la proteína roja fluorescente que comprende un péptido enlazador (la secuencia de ADN es GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCT) se amplificó utilizando RFP-1/2 como cebadores.

El fragmento promotor del gendapBobtenido anteriormente y el fragmento N-terminal de 180 pb se clonaron y ligaron con el fragmento de ADN del gen de la proteína fluorescente roja que comprende un péptido enlazador, el esqueleto del plásmido pEC-XK99E, respectivamente, mediante el kit de clonación de un paso de Vazyme, para obtener un vector de caracterización pEC-XK99E-PdapB-rfp,cuyo mapa del plásmido se muestra en la FIG. 1. Las secuencias de los cebadores utilizados anteriormente se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo 2 Modificación del promotor del gen d a p B p ara mejorar la intensidad de expresión

(1) Construcción del plásmido mutante del promotor del gendapB

En este ejemplo, se modificó la región core del promotordapB(la secuencia en las posiciones 75 a 95 de SEQ ID NO: 1) del plásmido pEC-XK99E-P<dapB>-/fp. La secuencia de la región core del promotordapBde tipo silvestre se muestra más adelante, donde la negrita TAGACT es la secuencia principal de la región -10 del promotor.

ACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCTTCTGAACGGGTACGTCTAGACTGGTGGGC G

La región core del promotordapBde tipo silvestre se modificó en las siguientes secuencias, respectivamente:

ACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCTCTCTGATGTGATAGTATAATTTGGTGGGCG

ACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCTATCATTTGGTGTATACTAAATTGGTGGGCG

ACGGTCAGTTAGGTATGGATATCAGCACCTGTCCTGTGGTAAACTTTAGCGTGGTGGGC G

Las secuencias de polinucleótidos que tienen actividad promotora obtenida después de la modificación se muestran en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. La construcción específica fue la siguiente: se amplificaron tres fragmentos que incluían tres regiones modificadas, respectivamente, utilizando el plásmido pEC-XK99E-PdapB-fpcomo plantilla yPdapB-i/pEC-3,PdapB-2/pEC-3 yPdapB-3/pEC-3 como cebadores. El esqueleto del plásmido se amplificó utilizando el plásmido pEC-XK99E-/fp-2 como plantilla y pEC-4/5 como cebador. Los tres fragmentos anteriores, que incluían tres regiones modificadas, se clonaron y ligaron con el esqueleto del plásmido, respectivamente, mediante el kit de clonación de un solo paso de Vazyme, para obtener los vectores de caracterización pEC-XK99E-PdapB-i-fp, pEC-XK99E-PdapB-2-/fpypEC-XK99E-PdapB-3-fp,respectivamente. Los plásmidos obtenidos se sometieron a secuenciación, que verificó que los promotores en los vectores de caracterización pEC-XK99E- PdapB-1- fp ,pEC-XK99E-PdapB-2- /fpy pEC-XK99E-PdapB-3- /fphabían sido sustituidos con éxito por los promotores mostrados en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las secuencias de los cebadores utilizados en este ejemplo se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

(2) Caracterización de la intensidad de los mutantes del promotor del gendapB

Para caracterizar la intensidad de la expresión mejorada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, los plásmidospEC-XK99E-P daPB-i-rfp,pEC-XK99E-PdapB-2- rfpy pEC-XK99E-PdapB-3-rfpy un plásmido de controlpEC-XK99E-P dapB-rfpse transformaron enCorynebacterium glutamicumATCC13032, respectivamente, para obtener las cepas ATCC13032 (pEC-XK99E-PdapB-i-fp), ATCC13032 (pEC-XK99E-PdapB-2-fp), ATCC13032 (pEC-XK99E-PdapB-3-/fp) y ATCC13032 (pEC-XK99E-PdapB-rfp).Se midió la intensidad de fluorescencia de las cepas mencionadas anteriormente y de la cepa de control, respectivamente.

Los ingredientes (g/L) del medio líquido TSB, es decir, el medio de medición, son los siguientes: glucosa, 5 g/L; levadura en polvo, 5 g/L; peptona de soja, 9 g/L; urea, 3 g/L; ácido succínico, 0,5 g/L; K2HPO43H2O, 1 g/L; MgSO47H2O, 0,1 g/L; biotina, 0,01 mg/L; vitamina B1, 0,1 mg/L; MOPS, 20 g/L. Se añadieron 25 ^g/mL de Kanamicina al medio de cultivo. Las cepas activadas en placa se inocularon con palillos en una placa de 96 pocillos que contenía 200 ^l de medio de cultivo líquido TSB en cada pocillo, con tres cepas paralelas para cada cepa. A una velocidad de rotación del agitador de placas de 800 rpm, después del cultivo a 30 °C durante 24 horas, se detectaron las intensidades de fluorescencia de las cepas mediante un ELISA. La medición de la fluorescencia mostró que la longitud de onda de excitación era de 560 nm y la longitud de onda de emisión era de 607 nm. Mientras tanto, se determinó la OD600 del líquido bacteriano y se calculó la intensidad de fluorescencia de las cepas. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Las intensidades de fluorescencia de las cepas ATCC13032 (pEC-XK99E-P dapB-i-rfp),ATCC13032 (pEC-XK99E-PdapB-^ rfp)y ATCC13032 (pEC-XK99E-PdapB-3-rfp)mejoraron 3,7 veces, 3,8 veces y 11,2 veces la del control, lo que indica que la transformación de la región core del promotor puede potenciar aún más la actividad del promotor del gendapBy puede utilizarse para potenciar la expresión del gendapB.

Tabla 3

Ejemplo 3 Aplicación de mutantes del promotor del gen d a p B de C o ry n e b a c te r iu m

g lu ta m ic u m en la producción de L-lisina

(1) Construcción de cepas de mutantes del promotor del gendapB parasu aplicación en la producción de L-lisina.

En la presente divulgación, primero se introdujo la mutación puntual T311I en el genlysCdel aspartato quinasa de la cepaCorynebacterium glutamicumATCC13032, con el codón mutado de ACC a ATC, para obtener una cepa SCgL30. En la presente divulgación, el mutante del promotor del gendapBse aplicó además para sobreexpresar la fosfonopiruvato carboxilasa (PPC, ID de gen NCBI: 1019553, ID de proteína NCBI: NP_600799) para probar su efecto en la producción de L-lisina.

El genPpcse sobreexpresó utilizando el mutante del promotorPdapB-3sobre la base del esqueleto del plásmido pEC-XK99E. El plásmido de sobreexpresión se construyó como sigue: un fragmento de mutante del promotor se amplificó utilizando el plásmido de mutante del promotor correspondiente analizado en el Ejemplo 2 como plantilla, y dapB-P1/dapB-P2 de los genes correspondientes como cebadores; un fragmento del genppcse amplificó utilizando el genoma deCorynebacterium glutamicumATCC 13032 como plantilla, y ppc-1/ppc-2 como cebadores; un esqueleto de plásmido se amplificó utilizando el plásmido pEC-XK99E como plantilla, y PEC-1/2 como cebadores. El fragmento de mutante del promotor obtenido anteriormente, el fragmento del genppcy el fragmento del esqueleto del plásmido se clonaron y ligaron mediante el kit de clonación de un solo paso de Vazyme para obtener un plásmido pEC-PdapB-3-ppc. El plásmido de control pEC-XK99E y el plásmido anteriormente mencionado se transformaron en cepas SCgL30, respectivamente, para obtener una cepa SCgL 30 de control (pEC-XK99E) y una cepa de sobreexpresión de mutante del promotor SCgL30 (pEC-PdapB-3-ppc). Las secuencias de los cebadores utilizados anteriormente se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4

(2) Evaluación de la capacidad de producción de L-lisina de una cepa de sobreexpresión de mutante del promotor.

Para comprobar el efecto de la sobreexpresión del genppcpor el mutante del promotorPdapB-3enCorynebacterium glutamicumsobre la producción de L-lisina por la cepa, se realizaron pruebas de fermentación en SCgL30 (pEC-XK99E) y SCgL30 (pEC- PdapB-3- PPC),respectivamente. Los ingredientes del medio de fermentación fueron los siguientes: glucosa, 80 g/L; levadura en polvo, 1 g/L; peptona de soja, 1 g/L; NaCl, 1 g/L; sulfato de amonio, 1 g/L; Urea, 10 g/L; K2HPO43 H2O, 1 g/L; MgSO4-7 H2O, 0,45 g/L; FeSO4-7 H2O, 0,05 g/L; biotina, 0,4 mg/L; vitamina B1, 0,1 mg/L; MOPS, 40 g/L; pH inicial 7,2. Se añadieron 25 jg/mL de Kanamicina al medio. En primer lugar, las cepas se inocularon en medio líquido TSB para someterlas a cultivo durante 8 horas, los cultivos se inocularon como semillas en una placa de 24 pocillos que contenía 800 |jl de medio de fermentación en cada pocillo, y la cantidad de inoculación fue de 12 jl. La OD600 inicial se controló en torno a 0,1, y el cultivo se llevó a cabo a 30 °C durante 17 horas a una velocidad de rotación del agitador de placas de 800 rpm, con tres cepas paralelas para cada cepa. Tras la fermentación, el rendimiento de L-lisina se detectó mediante un biosensor SBA y la OD600 se midió con un lector de microplacas. Los resultados se muestran en la Tabla 5. El rendimiento de L-lisina utilizando la cepa de sobreexpresión del mutante del promotor PdapB-3 se incrementó en un 30 %. Los resultados anteriores indican que los mutantes del promotor de la presente divulgación pueden utilizarse para mejorar la expresión del genppcy pueden aplicarse a la producción de L-lisina.

Tabla 5

Como se muestra por los resultados anteriores, los mutantes del promotor del gendapBde la presente divulgación se pueden utilizar para mejorar la expresión de PPC enCorynebacterium glutamicum,y por lo tanto la mejora de la síntesis de fosfoenolpiruvato (PEP) a ácido oxalacético, por lo tanto se puede aplicar a la producción de un producto objetivo dependiente del suministro del precursor de ácido oxalacético , incluyendo aminoácidos de la familia del ácido aspártico (lisina, treonina, isoleucina, metionina), aminoácidos de la familia del ácido glutámico (ácido glutámico, prolina, hidroxiprolina, arginina, glutamina), y a la producción biológica de aminoácidos como el ácido 5-aminolevulínico para el que el ácido oxaloacético es un importante precursor metabólico.

Dado que la mejora de la expresión y la actividad de PPC se puede utilizar para aumentar el rendimiento de un compuesto objetivo como el ácido 5-aminolevulínico[1], aunque todos los mutantes del promotor del gendapBde la presente divulgación se pueden utilizar para mejorar la expresión y la actividad de PPC, los promotores mutantes de la presente divulgación también se pueden aplicar a la producción de ácido 5-aminolevulínico.

Se ha verificado que los mutantes del promotor de la presente divulgación pueden mejorar la expresión de una proteína de fusión del N-terminal de DapB y RFP, y pueden utilizarse para mejorar la expresión de PPC, y los mutantes del promotor del gendapBde la presente divulgación también pueden utilizarse para expresar otros genes y aplicarse a la producción de diversos productos.

PdapB-WT(SEQ ID NO: 1):

gaacggaacaaactgatgaacaatcgttaacaacacagaccaaaacggtcagttaggtatggatatcagcaccttctga acgggtacgtctagactggtgggcgtttgaaaaactcttcgccccacgaaaatgaaggagcata

PdapB- 1(SEQ ID NO: 2):

gaacggaacaaactgatgaacaatcgttaacaacacagaccaaaacggtcagttaggtatggatatcagcacctctctga tgtgatagtataatttggtgggcgtttgaaaaactcttcgccccacgaaaatgaaggagcata

PdapB- 2(SEQ ID NO: 3):

gaacggaacaaactgatgaacaatcgttaacaacacagaccaaaacggtcagttaggtatggatatcagcacctatcatt tggtgtatactaaattggtgggcgtttgaaaaactcttcgccccacgaaaatgaaggagcata

PdapB- 3(SEQ ID NO: 4):

gaacggaacaaactgatgaacaatcgttaacaacacagaccaaaacggtcagttaggtatggatatcagcacctgtcctg tggtaaactttagcgtggtgggcgtttgaaaaactcttcgccccacgaaaatgaaggagcata

Referencias:

[1] CN103981203A

[2] Wang, YCet al., Screening efficient constitutive promoters inCorynebacterium glutamicumbased on time-series transcriptome analysis.Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(11):1760 -1771

Todas las características técnicas divulgadas en esta especificación pueden combinarse de cualquier forma. Cada una de las características descritas en esta especificación también puede sustituirse por otra característica que tenga la misma función, igual o similar. Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, cada una de las características aquí expuestas no es más que un ejemplo de una serie de características iguales o similares.

Además, de acuerdo con la descripción anterior de la presente divulgación, los expertos en la técnica pueden entender fácilmente las características clave de la presente divulgación, y se pueden hacer muchas modificaciones en la invención para adaptarla a diversos fines y condiciones de uso sin apartarse del espíritu y alcance de la presente divulgación, y, por lo tanto, dichas modificaciones también están incluidas en el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que tiene actividad promotora, donde el polinucleótido se selecciona de entre el grupo que se muestra en cualquiera de las siguientes (i)-(iv):

(iv) un polinucleótido que tiene al menos un 90%, opcionalmente al menos un 95%, preferiblemente al menos un 97%, más preferiblemente al menos un 98%, y lo más preferiblemente al menos un 99% de identidad de secuencia en comparación con la secuencia de nucleótidos tal como se establece en (i) o (ii);

donde el polinucleótido tal como se establece en cualquiera de (i) a (iv) tiene una secuencia de nucleótidos que no es TCTGAACGGGTACGTCTAGAC en la posición de la 75 a la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1; y el polinucleótido tal como se establece en cualquiera de (i) a (iv) tiene una actividad promotora mejorada en comparación con el polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

2. El polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mutante tiene de 3 a 12 veces más o más actividad promotora mejorada en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

3. El polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 2, donde la secuencia de nucleótidos del mutante correspondiente a de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 se selecciona de entre cualquiera del grupo que consiste en lo siguiente (PdapB-1)a (P dapB-3):

(PdapB-1) CTCTGATGTGATAGTATAATT;

(PdapB-2) ATCATTTGGTGTATACTAAAT;

(PdapB-3) GTCCTGTGGTAAACTTTAGCG.

4. El polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, donde la secuencia de nucleótidos del mutante se selecciona de entre secuencias tal como se establecen en cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 4.

5. Un casete de expresión de transcripción, que comprende el polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 4; opcionalmente, el casete de expresión de transcripción contiene además un gen diana que está ligado operablemente con el polinucleótido que tiene actividad promotora; preferiblemente, el gen diana es un gen codificador de proteínas.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, o el casete de expresión de transcripción de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora recombinante que comprende el casete de expresión de transcripción de acuerdo con la reivindicación 5, o el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.

8. La célula hospedadora recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, donde la célula hospedadora es del géneroCorynebacterium,géneroBrevibacterium,géneroArthrobacterium,géneroMicrobacteriumo géneroEscherichia; preferiblemente, la célula hospedadora esCorynebacterium glutamicumoEscherichia coli;más preferiblemente, la célula hospedadora esCorynebacterium glutamicumATCC 13032,Corynebacterium glutamicumATCC 13869,Corynebacterium glutamicumATCC 14067 o cepas derivadas deCorynebacterium glutamicum.

9. Uso del polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, del casete de expresión de transcripción de acuerdo con la reivindicación 5, del vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, y de la célula hospedadora recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en al menos uno de los siguientes:

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la proteína se selecciona de entre una proteína reguladora de la expresión genética, una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, o una proteína relacionada con el transporte de membrana.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, donde el compuesto objetivo incluye al menos uno de entre aminoácidos, ácidos orgánicos:

opcionalmente, los aminoácidos incluyen uno o una combinación de dos o más de entre los siguientes: prolina, hidroxiprolina, lisina, ácido glutámico, treonina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, cisteína, glutamina, metionina, ácido aspártico, asparagina, arginina, histidina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido 5-aminolevulínico o derivados de cualquiera de los aminoácidos anteriores;

opcionalmente, los ácidos orgánicos incluyen uno o una combinación de dos o más de entre los siguientes: ácido cítrico, ácido succínico, ácido láctico, ácido acético, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oxálico, ácido oxalacético, ácido tartárico, ácido propiónico, ácido hexenoico, ácido decanoico, ácido caprílico, ácido valérico, ácido málico o derivados de cualquiera de los ácidos orgánicos anteriores.

12. Un método de construcción de un mutante del promotor, que incluye las siguientes etapas:

etapa de mutación: mutación de un polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1, de manera que haya nucleótidos mutados en una o más posiciones de la posición 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1;

13. El método de construcción de acuerdo con la reivindicación 12, donde la etapa de mutación incluye:

mutar el polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 de modo que los nucleótidos en la posición de la 75 hasta la posición 95 de la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1 se mutan a una secuencia de nucleótidos tal como se establece a continuación: NNNNNNNNNNNNNNNNTANNN, en donde N se selecciona de entre A, T, C o G;

preferiblemente, el mutando del promotor tiene de 3 a 12 veces más o más actividad promotora mejorada en comparación con la actividad promotora del polinucleótido que tiene la secuencia tal como se establece en SEQ ID NO: 1.

14. Un método para regular la transcripción, donde el método incluye una etapa de ligar operablemente el polinucleótido que tiene actividad promotora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, a un ARN diana o a un gen diana; opcionalmente, el ARN diana incluye al menos uno de entre ARNt, ARNs, el gen diana incluye al menos uno de entre un gen codificador de una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, un gen codificador de una proteína reguladora de expresión genética y un gen codificador de una proteína relacionada con el transporte de membrana;

opcionalmente, el gen diana incluye al menos uno de entre los siguientes: gen de la piruvato carboxilasa, gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, gen de la Y-glutamil quinasa, gen de la glutamato semialdehído deshidrogenasa, gen de la pirrolina-5-carboxilato reductasa, gen de la proteína transportadora de aminoácidos, gen relacionado con el sistema ptsG, gen de la piruvato deshidrogenasa, gen de la homoserina deshidrogenasa, gen de la ácido oxalacético descarboxilasa, gen represor del ácido glucónico, gen de la glucosa deshidrogenasa, gen de la aspartato quinasa, gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, gen de la aspartato amoniaco liasa, gen de la dihidrodipicolinato sintasa, gen del ácido dihidropiridínico reductasa, gen de la succinil diaminopimelato aminotransferasa, gen de la tetrahidrodipicolinato succinilasa, gen de la succinil diaminopimelato desacilasa, gen de la ácido diaminopimélico epimerasa, gen del ácido diaminopimélico desacilasa, gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, gen de la transcetolasa, gen de la diaminopimelato deshidrogenasa.

15. Un método de preparación de una proteína, donde el método incluye una etapa de expresión de la proteína utilizando el casete de expresión de transcripción de acuerdo con la reivindicación 5, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, o la célula hospedadora recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8; opcionalmente, la proteína es una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, una proteína relacionada con el transporte de membrana o una proteína reguladora de expresión genética;

16. Un método de producción de un compuesto objetivo, donde el método incluye una etapa de expresión de una proteína relacionada con la síntesis de un compuesto objetivo, una proteína relacionada con el transporte de membrana o una proteína reguladora de expresión genética utilizando el casete de expresión de transcripción de acuerdo con la reivindicación 5, el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o la célula hospedadora recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, y producción de un compuesto objetivo en presencia de la proteína asociada con la síntesis del compuesto objetivo, una proteína relacionada con el transporte de membrana o la proteína reguladora de expresión genética;

opcionalmente, la proteína relacionada con la síntesis del compuesto objetivo es una proteína relacionada con la síntesis de un L-aminoácido; opcionalmente, la proteína relacionada con la síntesis de un L-aminoácido incluye uno o una combinación de dos o más de entre: piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, Y-glutamil quinasa, glutamato semialdehído deshidrogenasa, pirrolina-5-carboxilato reductasa, proteína transportadora de aminoácidos, sistema ptsG, piruvato deshidrogenasa, homoserina deshidrogenasa, ácido oxalacético descarboxilasa, represor del ácido glucónico, glucosa deshidrogenasa, aspartato quinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, aspartato amoníaco liasa, dihidrodipicolinato sintasa, dihidrodipicolinato reductasa, ácido dihidropiridínico reductasa, succinil diaminopimelato aminotransferasa, tetrahidrodipicolinato succinilasa, succinil diaminopimelato deacilasa, ácido diaminopimélico epimerasa, ácido diaminopimélico deacilasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, transcetolasa, diaminopimelato deshidrogenasa;