ES2953687T3 - Aislamiento de oleocantal y tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Un método para extraer S (-)-oleocantal de aceite de oliva que comprende mezclar un primer volumen de agua con un segundo volumen de aceite de oliva para formar una mezcla de aceite de oliva/agua; dejar reposar la mezcla de aceite de oliva y agua; eliminar una fracción acuosa de la mezcla de aceite de oliva/agua dejando un aceite de oliva que contiene S (-) - oleocantal reducido; y filtrar la fracción acuosa para crear S(-)-oleocantal acuoso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aislamiento de oleocantal

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS/PRIORIDAD

La presente invención reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional de Estados Unidos número 62/365,148 presentada el 21 de julio de 2016.

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O EL DESARROLLO CON FONDOS FEDERALES

El trabajo que se describe a continuación recibió la subvención 1R15CA167475-01, concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

Se estima que aproximadamente 1.685 millones de pacientes contraerán cáncer en 2016, de los cuales >234.000 serán casos de cáncer de mama (CM). El CM es el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en mujeres, que probablemente se cobrará la vida de más de 41.000 mujeres en 2017. Sin el descubrimiento de una nueva terapia preventiva o eficaz, se espera que 846.241 mujeres mueran de CM en todo el mundo en 2035. La mayoría de la mortalidad por CM se atribuye a metástasis en órganos vitales, por ejemplo, los pulmones, el hígado y el cerebro. Los principales subtipos moleculares de CM se clasifican en luminal A, luminal B, que sobreexpresa HER2 y de tipo basal, según los criterios clínicos, histopatológicos y de microarray. En Estados Unidos, el 73 % de los tumores son ER+ (que expresan ER-a) y/o PR+/HER2-, el 12 % son triple negativos, el 10 % son ER+ y/o PR+/HER2+, y el 5 % son ER-/HER2+. Las opciones de tratamiento actuales incluyen quimioterapia, que presentan un alto grado de riesgo de morbilidad y mortalidad. Sin embargo, la cirugía seguida de quimioterapia mejoró las tasas de supervivencia, casi ~70 % de los pacientes con enfermedad avanzada sufrirán posteriormente recurrencia del tumor, lo que justifica la necesidad de descubrir nuevos inhibidores de la recurrencia. Varias mujeres de las que se ha indicado que han sobrevivido durante 5 años tendrán recurrencia del CM. A pesar de los avances en la quimioterapia endocrina, varias pacientes con CM tienen bajas tasas de supervivencia y libre de recurrencia con un comportamiento de metástasis temprano y agresivo independientemente del tamaño del tumor, el grado y el número de ganglios linfáticos positivos. Los agentes quimioterapéuticos que se dirigen a los receptores de hormonas son inicialmente efectivos, pero rápidamente desarrollan resistencia y pueden causar efectos secundarios graves. Los fármacos antihormonales, incluidos los antagonistas de ER, como tamoxifeno, o las entidades que bloquean la producción de estrógenos, como los inhibidores de la aromatasa, son la principal opción de tratamiento adyuvante y metastásico, pero la resistencia adquirida se desarrolla rápidamente, lo que restringe significativamente su aplicación terapéutica. La resistencia se puede desarrollar a través de la alteración de la regulación de ciertos factores de crecimiento, como EGFR, HER2, PI3/AKT y Ras/Raf/MAPK, lo que puede dar como resultado una activación independiente del ligando de ER. La resistencia, el alto coste y los efectos secundarios de la mayoría de la clases de quimioterapéuticos ER+ y la falta de fármacos preventivos de la recurrencia y antimetastásicos motivaron el descubrimiento de nuevos preventivos de la recurrencia del CM.

La extirpación quirúrgica de los tumores primarios del CM y la quimioterapia y/o radioterapia son las estrategias terapéuticas más habituales para el control de los tumores sólidos. Los agentes quimioterapéuticos por lo general no pueden prevenir y controlar el CM metastásico debido a la complejidad de la cascada metastásica. La industria farmacéutica generalmente se desanima a invertir en medicamentos antimetastásicos porque los ensayos clínicos de prevención de metástasis en pacientes con cáncer en etapa temprana con criterio de valoración de supervivencia y reducción de metástasis no son económicamente factibles y gratificantes, ya que, por ejemplo, tales juicios son extremadamente largos. Sin embargo, sigue siendo importante para los pacientes con cáncer y precáncer descubrir los inhibidores de la recurrencia de CM.

Además de su contenido en ácidos grasos insaturados, el aceite de oliva virgen extra (AOVE) contiene compuestos fenólicos bioactivos menores, tales como fenoles simples, lignanos y secoiridoides. El (-)-oleocantal (OC) es un secoiridoide fenólico natural presente en el (AOVE), que los inventores han descubierto es eficaz en el tratamiento de, entre otras enfermedades, la recurrencia del cáncer de mama. En la actualidad, existe una gran necesidad de llevar a cabo ensayos clínicos completos sobre la eficacia preventiva y curativa del OC en diferentes estados de enfermedad y pre-enfermedad. Por lo tanto, existe una gran demanda para que el OC esté fácilmente disponible en grandes cantidades para permitir dicha investigación clínica. La publicación de Estados Unidos n.° 2009/076142 A1 se refiere a métodos para sintetizar los enantiómeros purificados de oleocantal. La presente invención proporciona además métodos para el uso de oleocantales en diversas formulaciones, que incluyen, aditivos alimentarios; productos farmacéuticos; cosméticos; repelentes de animales; y herramientas de descubrimiento para genes de receptores de irritación de mamíferos, productos génicos, alelos, variantes de corte y empalme, transcritos alternativos y similares.

Las características estructurales únicas de OC hicieron que su aislamiento del AOVE suponga un reto. Los métodos disponibles para aislar o extraer OC del AOVE todavía tienen serios inconvenientes que incluyen la necesidad de instrumentos sofisticados, consumo masivo de disolventes orgánicos y en la mayoría de los casos son costosos, tediosos y lentos. De manera importante, la mayoría de las técnicas de aislamiento de OC tienen un bajo rendimiento, lo que dificulta el progreso de OC a través de la cartera de productos en validación clínica. Para evitar los diferentes inconvenientes asociados con el aislamiento de OC, los recientes esfuerzos de síntesis total lograron obtener (±)-oleocantal en ocho etapas, sin embargo, la síntesis total de OC no fue estereoselectiva ni regioselectiva, dando como resultado una mezcla racémica con un rendimiento global extremadamente bajo (9 %). Los métodos de extracción de OC anteriores también usaban lavado con n-hexanos, siendo el rendimiento total insuficiente y el proceso lento y con una pérdida significativa de OC debido a la formación de acetal cíclico. Por lo tanto, hay una gran necesidad de desarrollar un protocolo sostenible, rentable en costes y en tiempo que puede garantizar el aislamiento rápido a gran escala de OC del AOVE y permitir su progreso en el desarrollo clínico en áreas terapéuticas de necesidades médicas no cubiertas.

Sumario de la invención

Por tanto, es un objeto de la presente invención superar las deficiencias y los inconvenientes mencionados anteriormente asociados con la tecnología actual.

El estudio divulgado estableció dos modelos de prevención de recurrencia del CM: 1) Inducción de tumores primarios mediante la inoculación de células de CM en la almohadilla de grasa mamaria, creando un crecimiento de xenoinjerto ortotópico en ratones desnudos atímicos hembra. Una vez que el volumen del tumor alcanza los 200 mm3, se evaluará el tumor primario extirpado quirúrgicamente y se evaluará la capacidad de los tratamientos compuestos para inhibir la recurrencia del tumor durante varias semanas. 2) Una vez establecido el modelo de xenoinjerto ortotópico en ratones desnudos, el fármaco quimioterapéutico adyuvante o neoadyuvante se usa durante un período estándar y se suspende. Se evaluará la capacidad de los tratamientos compuestos probados para revertir la quimiorresistencia e inhibir la recurrencia del tumor.

Por lo tanto, uno de los objetivos de este estudio fue desarrollar técnicas novedosas de aislamiento de OC útiles para el uso práctico a gran escala sin perder tiempo y rentables, además de respetuosas con el medio ambiente. Para imitar los entornos clínicos, la emulsión generada de OC se probó en cuanto a eficacia y capacidad para prevenir la recurrencia del CM en dos modelos.

Oleocantal ejerció excepcionalmente una potente eficacia in vivo en múltiples modelos de xenoinjerto de CM de ratón desnudo atímico. Basado en la investigación de los inventores, los inventores creen que el OC tarde o temprano se convertirá en un suplemento dietético importante para tratar y prevenir el cáncer, la enfermedad de Alzheimer y trastornos inflamatorios. En el presente estudio, se han desarrollado múltiples métodos novedosos para aislar OC del AOVE, lo que demuestra un rendimiento mejorado en comparación con los métodos existentes que generalmente no son prácticos para el aislamiento de OC a gran escala. Un primer método consistía en una técnica sencilla de ultracongelación, seguida de una extracción líquido-líquido de AOVE con un único disolvente orgánico. Un segundo método reveló la exitosa capacidad del agua para extraer eficientemente OC del AOVE, lo que llevó al descubrimiento de una novedosa autoemulsión rica en OC de valor añadido. Después de la extracción de agua, el atrapamiento de resina permitió la eliminación rápida de agua y ácidos grasos residuales, recuperando OC con un rendimiento elevado y buena pureza. La extracción directa de agua seguida de atrapamiento de resina logró reducir al mínimo el proceso de purificación de OC; ya que solo se necesitaba una única etapa de cromatografía de exclusión por tamaño para obtener OC con una pureza >95 %. El método de agua propuesto (o método de nanoemulsión de agua) se aplicó a múltiples muestras de AOVE de diferentes fuentes. Se estudió la caracterización, estabilidad y almacenamiento adecuados de le emulsión de OC. La eficacia oral in vitro e in vivo de la emulsión OC reveló una actividad significativa contra el CM invasivo. La emulsión de OC oral previno eficazmente la recurrencia del CM en dos modelos diferentes: 1- después de la escisión del tumor primario y 2- después de completar el régimen de quimioterapia, lo que sugirió el potencial de la emulsión de OC como al menos un suplemento dietético novedoso y primero de su clase para prevenir la recurrencia del CM, además de prevención y/o tratamiento de otras enfermedades y estados pre-enfermedad.

La presente invención es el método como se define en las reivindicaciones.

Diversos objetivos, características, aspectos y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención, junto con los dibujos adjuntos en los que números iguales representan componentes iguales.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en la memoria descriptiva y constituyen parte de la misma, ilustran varias realizaciones de la invención y junto con el general Descripción de la invención general expuesta anteriormente y la descripción detallada de los dibujos que se da a continuación, sirven para explicar los principios de la invención. Debe apreciarse que los dibujos adjuntos no están necesariamente a escala ya que, en su lugar, el énfasis se pone en ilustrar los principios de la invención. A continuación, se describirá la invención, a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 es una representación esquemática de la estructura química de (-)-oleocantal (OC).

La figura 2 es un diagrama de flujo fotográfico de un método de aislamiento de (-)-oleocantal con acetonitrilo. El AOVE se somete a extracciones simples con acetonitrilo seguidas de ultracongelación inmediata repetida y finalmente liofilización para obtener cantidades de OC en escala de gramos.

La figura 3 es una representación esquemática del proceso que se muestra en la Figura 2 en el que la ultracongelación con acetonitrilo para la extracción de Oc del AOVE. El método de extracción se aplicó a varias marcas, lotes y fuentes de AOVE y análisis de cromatografía en capa fina (TLC), HPLC y RMN 1H para la cuantificación de OC y validación del método de extracción (Figuras 2-5 y Tabla 1).

La figura 4 es un gráfico que muestra una comparación del rendimiento de OC utilizando los tres métodos de aislamiento de metanol, ultracongelación en acetonitrilo y nanoemulsión de agua. El rendimiento de OC mejoró significativamente utilizando el método de ultracongelación en acetonitrilo y nanoemulsión de agua.

La figura 5 es un diagrama de flujo fotográfico de un método de nanoemulsión de agua para el aislamiento de OC. La figura 6 es un diagrama de flujo fotográfico parcial de un método de nanoemulsión de agua modificada de aislamiento de OC usando atrapamiento de resina.

La figura 7 es una representación esquemática del proceso que se muestra en la figura 5. El método de extracción de nanoemulsión de agua se aplicó a varias marcas y fuentes de AOVE y utilizó análisis de cromatografía en capa fina (TLC), HPLC y RMN H1 (Figuras 2-5) para validar el método de extracción. Los resultados de las extracciones de oleocantal se presentan en la tabla que se muestra en la Figura 9.

Las Figuras 8A - 8H son documentación del método de aislamiento de nanoemulsión de agua-OC. La figura 8A muestra un espectro de RMN 1H del residuo orgánico extraído por CH₂Cl2 del extracto de agua. Las señales de aldehído de la característica clave de OC indican claramente que el OC se solubilizó en una capa de agua cuando se agitó con AOVE. La figura 8B muestra un cromatograma de HPLC en una columna C-18 RP usando un sistema de CH3CN-H₂O que muestra un pico de OC característico con un Rt = 2,8 min. La figura 8C muestra un cromatograma de TLC durante la purificación final de OC en Spehadex LH-20 que muestra la mancha activa UV de OC a 254 nm (panel superior) y la mancha marrón característica cuando se rocía con reactivo de pulverización de 1 % de p-anisaldehído (panel inferior). La figura 8D muestra un espectro de RMN 1H de OC de una pureza >95 % después de la purificación por cromatografía en columna de exclusión por tamaño Sephadex LH-20 de una sola etapa. La figura 8E muestra un pico de OC puro en la columna HPLC C-18 RP después de la purificación con Sephadex LH-20. La figura 8F muestra la curva de calibración estándar de HPLC utilizada para cuantificar los contenidos de OC en diferentes lotes y fracciones de AOVE. La figura 8G muestra un espectro de RMN 1H de varias muestras puras de OC utilizadas para hacer la curva de calibración estándar usando análisis de RMN 1H, que se muestra en la Figura 8H.

La figura 9 es una tabla de validación y reproducibilidad del método de extracción de nanoemulsión de agua utilizando varios lotes de AOVE, muestras etiquetadas 1-8. EA: Extracción de agua; Ex: Extracción; AOVE: Aceite de oliva virgen extra; NP: No procedió debido a la baja cantidad de aceite disponible; ND: No disponible; NN: No necesario porque no había contenido de OC. La cantidad se considera en base a la proporción (1:3) de AOVE:agua. Se observó que los lotes de AOVE con alta concentración de OC utilizaban preferentemente 2-3 ciclos de extracción adicionales para alcanzar el 95 % de recuperación. Cantidad pura considerada después de la purificación usando cromatografía en columna Sephadex LH-20.

La figura 10 es una representación esquemática del proceso que se muestra en la figura 6, utilizando resinas (SP-70, XAD-7 y Diaion hP-20) para eliminar agua y purificar OC. Las Figuras

11A-11F son la monitorización guiada por RMN 1H de atrapamientos de OC en varias resinas usando JEOL ECS-400 en CDCb. La figura 11A muestra un espectro de RMN 1H de la fracción eluida con acetona SP-70 que contiene OC. La figura 11B muestra un espectro de RMN 1H de la fracción eluida con agua SP-70 extraída con CH₂Cl2 y el residuo se disolvió en CDCb y se usó para análisis. La fracción eluida con agua contiene solo ácidos hidroxigrasos e insaturados y no mostró contenido de OC. La figura 11C muestra un espectro de RMN 1H de la fracción eluida con acetona XAD-7 que contiene OC. La figura 11D muestra un espectro de RMN 1H del extracto CH₂Cl2 XAD-7 de la fracción eluida con agua. La fracción eluida con agua contiene solo ácidos hidroxigrasos e insaturados y no mostró contenido de OC. La figura 11E muestra un espectro de RMN 1H de la fracción eluida con acetona Diaion HP-20 que contiene OC. La figura 11F muestra un espectro de RMN 1H del extracto CH₂Cl2 Diaion HP-20 de la fracción eluida con agua. La fracción eluida con agua contiene solo ácidos hidroxigrasos e insaturados sin ningún contenido de OC.

Las figuras 12A-12C son diagramas de flujo esquemáticos que representan métodos de aislamiento de OC con la Figura 12A que muestra extracción de metanol, La figura 12B que muestra extracción de ultracongelación con acetonitrilo y la figura 12C que muestra extracción con nanoemulsión de agua.

La figura 13 es un gráfico de barras de la medición del tamaño de partícula de la nanoemulsión de OC de las Muestras 1-6 de la Figura 9.

La figura 14 es un gráfico de barras del índice de polidispersidad de las seis muestras de nanoemulsión de OC de la Figura 13.

La figura 15 es un gráfico de barras de la medición del potencial zeta de las seis muestras de nanoemulsión de OC de la Figura 13.

La figura 16 es un gráfico de barras de las mediciones del tamaño de partícula de las seis muestras de nanoemulsión de OC de la Figura 13, con una parte de cada muestra almacenada a temperatura ambiente durante un mes y otra parte de cada muestra almacenada a 4 °C durante un mes.

La figura 17 es un gráfico de barras de un índice de polidispersidad para cada una de las partes de muestra almacenadas durante un mes de la Figura 16.

La figura 18 es un gráfico de barras de la medición del potencial zeta para cada una de las partes de muestra almacenadas durante un mes de la Figura 16.

La figura 19 es un gráfico de barras que muestra el efecto de la nanoemulsión de OC en diferentes CM MDA-MB-231 dependiente de c-Met, MDA-MB-468, Células BT-474 y MCF-7 después de un período de tratamiento de 72 horas, en comparación con el control de vehículo. El recuento de células viables se determinó utilizando el ensayo MTT. Las células se sembraron a una densidad de 1 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se mantuvieron en medio suplementado con FBS al 10 % y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS, se dividieron en diferentes grupos de tratamiento. Las células se alimentaron con medio de tratamiento fresco cada dos días durante el período de tratamiento de 72 horas. El recuento de células viables se determinó mediante ensayo MTT. Las barras verticales indican el recuento medio de células ± SEM en cada grupo de tratamiento, n=3/dosis de tratamiento. *P<0,05 en comparación con los controles tratados con vehículo.

Las Figuras 20, 21A y 21B, 22 y 23 muestran que el tratamiento oral con nanoemulsión de (-)-oleocantal suprime el crecimiento de células CMTN MDA-MB-231 humanas en un modelo de xenoinjerto de ratón ortotópico. Se cultivaron células de cáncer de mama humano MDA-MB-231/GFP y se resuspendieron en medio DMEM sin suero (20 |jl). Después de la anestesia, se inocularon suspensiones celulares (1 x 1o6 células/20 j l ) por vía subcutánea en la segunda almohadilla de grasa de la glándula mamaria justo debajo del pezón de cada ratón desnudo atímico para generar tumores de mama ortotópicos. A las 48 horas de la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: i) el grupo de control tratado con vehículo (n=5), ii) el grupo tratado con emulsión de (-)-oleocantal (n=5). El tratamiento comenzó 07 días antes de la inoculación con administración oral utilizando control de vehículo por sonda oral o 10 mg/kg de emulsión de (-)-oleocantal todos los días. La figura 20 es un gráfico de líneas que muestra que el tamaño del tumor se evaluó periódicamente durante el tratamiento en los días indicados después de la inoculación. El volumen tumoral (V) se calculó mediante V=L/2 x W2, donde L era la longitud y W la anchura de los tumores. Puntos, el volumen medio del tumor en mm3 de varios tumores (n=5) durante el transcurso del período de tratamiento; las figuras 21A y 21B muestran dos ratones que albergan cáncer de mama humano y sus tumores de mama asociados. La figura 21a es una fotografía de un ratón de control tratado con vehículo. La figura 21 B es una fotografía de un ratón con supresión del crecimiento tumoral con tratamiento con emulsión de (-)-oleocantal (10 mg/kg/día). La figura 22 es un gráfico de líneas que muestra que no se observaron cambios significativos en el peso corporal entre los animales tratados, lo que indica la seguridad del tratamiento de emulsión de (-)-oleocantal. La figura 23 es un gráfico de barras en el que las barras verticales indican el peso medio del tumor al final del experimento.

Las figuras 24A y 24B muestran que la nanoemulsión de OC oral inhibe la recurrencia de CMTN después de la cirugía de escisión del tumor primario. La figura 24A son cinco fotografías de ratones utilizados en un experimento anterior de eficacia oral que se sometieron a una cirugía de escisión del tumor primario el día 35 de tratamiento. La figura 24B son cinco fotografías de ratones tratados por vía oral con 10 mg/kg de nanoemulsión de OC durante 30 días más, luego se les sacrificó y cinco fotografías de sus tumores (n=5), junto con dos fotografías de ratones del grupo de control tratado con vehículo y dos fotografías de sus tumores. Como se muestra, el tratamiento con OC inhibió la recurrencia de CMTN en 4 de 5 ratones.

Las figuras 25 - 27 muestran que la nanoemulsión oral de OC inhibió eficazmente la recurrencia de CMTN sin efectos adversos sobre el peso de los ratones. La figura 25 es un gráfico de líneas que muestra que el tratamiento oral adicional de 30 días con nanoemulsión de OC inhibía la recurrencia de CMTN en 4 de 5 ratones con una inhibición de la recurrencia tumoral >95 después de la escisión del tumor primario el día 35 del tratamiento inicial. La figura 26 es un gráfico de barras que compara el peso tumoral medio de los ratones tratados y de control. La figura 27 es un gráfico de líneas que muestra que el tratamiento oral diario con nanoemulsión de Oc de 10 mg/kg durante 65 días no afectó al peso corporal de los ratones.

Las figuras 28A - 28C muestran actividad de OC in vivo contra la neoplasia de mama HER2+-ER+. 5x106 células/20 j l de células de CM humanas BT-474 se inocularon s.c. en la segunda almohadilla de grasa de la glándula mamaria de ratón desnudo atímico (Foxn1nu/Foxn1). Los ratones se dividieron al azar en el grupo de control tratado con vehículo, que se muestra en la figura 28A, y los grupos tratados con OC (n = 6, cada uno) a 5 mg, que se muestra en la figura 28B, y 10 mg/kg, que se muestra en la figura 28C, tratamientos i.p. (3X/ semana, 60 días). Los paneles superiores muestran fotografías de animales intactos representativos de cada grupo. Los paneles inferiores muestran fotografías del tumor primario extirpado al final del experimento.

Las figuras 29 - 32 muestran actividad de OC in vivo contra la neoplasia de mama HER2+-ER+. 5 mg y 10 mg/kg de OC, 3X/semana durante 60 días inhibieron de forma significativa y dependiente de la dosis, en comparación con los controles de vehículo y lapatinib, el peso del tumor BT-474, como se muestra en el gráfico de barras de la figura 29 y el volumen del tumor como se muestra en los gráficos de líneas de la figura 30 y la figura 31, teniendo la figura 31 los mismos datos que la figura 30, sin la línea de control. En la figura 31, en la marca de 60 días, la línea superior es lapatinib a 12,5 mg/kg, la segunda línea más alta es OC a 5 mg/kg, la tercera línea más alta es lapatinib a 50 mg/kg, la cuarta línea más alta es OC a 10 mg/kg, la quinta línea más alta es una combinación de OC 10 mg/kg y lapatinib 12,5 mg/kg, y la línea más baja es una combinación de OC 5 mg/kg y lapatinib 50 mg/kg. La figura 32 es un gráfico de líneas que muestra que los tratamientos con OC no afectaron significativamente al peso corporal promedio de los ratones durante el período del experimento de 2 meses.

Las figuras 33 - 35 muestran que OC inhibe la recurrencia de cáncer de mama HER2+-ER+ in vivo después de una escisión del tumor primario realizada el día 60. La figura 33 es un gráfico de barras que muestra que OC 10 mg/kg, 3X/semana durante 54 días adicionales inhibía significativamente la recurrencia del peso del tumor BT-474 en comparación con los controles de vehículo y lapatinib a 50 mg/kg. La figura 34 es un gráfico de líneas que muestra que el mismo tratamiento inhibió significativamente el volumen del tumor recurrente en comparación con los controles de vehículo y lapatinib a 50 mg/kg. La figura 35 es un gráfico de líneas que muestra que los tratamientos con OC no afectaron significativamente al peso corporal promedio de los ratones durante el período del experimento de 54 días adicionales.

Las figuras 36A - 36C muestran que OC inhibe la recurrencia de neoplasia de mama HER2+-ER in vivo después del régimen de 50 mg/kg de lapatinib. La figura 36A es una fotografía de animales representativos del grupo de control con vehículo y dos fotografías que muestran el desarrollo de un tumor en un círculo durante el período adicional de 54 días. La figura 36B son dos fotografías de animales representativos que completaron el grupo de 50 mg/kg de lapatinib oral de 60 días y dos fotografías de tumores en círculo desarrollados después de 54 días adicionales. La figura 36C son dos fotografías de animales representativos de 10 mg de OC i.p., grupo 3X/semana, y dos fotografías que muestran que no se desarrolló ningún tumor durante el régimen adicional de 54 días.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención se entenderá con referencia a la siguiente descripción detallada, que debe leerse junto con los dibujos adjuntos. Se debe apreciar que la siguiente descripción detallada de varias realizaciones es solo a modo de ejemplo y no pretende limitar, de ningún modo, el alcance de la presente invención que se define en las reivindicaciones.

La expresión "al menos" seguida de un número se utiliza en el presente documento para indicar el comienzo de un intervalo que comienza con ese número (que puede ser un intervalo que tenga un límite superior o que no tenga límite superior, dependiendo de la variable que se esté definiendo). Por ejemplo, "al menos 1" significa 1 o más de 1. La expresión "como máximo" seguida de un número se utiliza en el presente documento para indicar el final de un intervalo que termina con ese número (que puede ser un intervalo que tiene 1 o 0 como límite inferior o un intervalo que no tiene límite inferior, dependiendo de la variable que se esté definiendo). Por ejemplo, "como máximo 4" significa 4 o menos de 4 y "como máximo 40 %" significa 40 % o menos del 40 %. Cuando, en la presente memoria descriptiva, un intervalo se da como "(un primer número) a (un segundo número)" o "(un primer número) -(un segundo número)", esto significa un intervalo cuyo límite inferior es el primer número y cuyo límite superior es el segundo número. Por ejemplo, de 25 a 100 mm significa un intervalo cuyo límite inferior es de 25 mm y cuyo límite superior es de 100 mm. Las realizaciones expuestas a continuación representan la información necesaria para permitir que los expertos en la técnica pongan en práctica la invención e ilustren el mejor modo de poner en práctica la invención. Asimismo, la invención no requiere que todas las características ventajosas y todas las ventajas deban incorporarse en cada realización de la invención.

Volviendo ahora a las Figuras 1 - 36C, ahora se tratará brevemente una breve descripción relativa a los diversos componentes de la presente invención.

Métodos de extracción de OC mejorados

Método de extracción de (-)-oleocantal con ultracongelación en acetonitrilo a partir de AOVE.

El contenido mayoritario del AOVE está representado por glicerol, triglicéridos y ácidos grasos (99 %), mientras que el 1 % restante está compuesto por varios compuestos fenólicos bioactivos menores, incluido OC. La estructura química de OC se muestra en la figura 1. Por lo tanto, aislar tales fenoles menores en forma pura y con un rendimiento aceptable supone un reto. En intentos anteriores, el OC se aisló del AOVE mediante el tedioso y laborioso procedimiento de extracción líquido-líquido utilizando grandes cantidades de metanol y n-hexanos en las extracciones posteriores. A continuación, la fracción metanólica seca se sometió a cromatografía líquida de presión media repetida en Sephadex LH20 lipofílica seguido de análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para aislar O^c en forma pura pero con un rendimiento bajo. Los inventores se dieron cuenta de que había al menos tres limitaciones importantes con respecto a este procedimiento; en primer lugar, el gran consumo de disolventes orgánicos, en segundo lugar, el escaso rendimiento debido a la pérdida de OC durante la acetalización por metanol y, finalmente, la falta de tiempo y rentabilidad.

En un intento de mejorar el método anterior, los inventores intentaron con éxito dos modificaciones efectivas. En primer lugar, la evaporación del metanol y la reconstitución del extracto en cloroformo dan de nuevo de forma reversible la forma aldehídica de OC. No hay estadísticas de recuperación exactas para confirmar si esta reacción es cuantitativa y, en última instancia, se pierde algo de OC en esta reacción, independientemente de las condiciones de la reacción. Para eliminar la posibilidad de pérdida de OC debido a la formación esperada de acetal o hemiacetal, los inventores reemplazaron el metanol con acetonitrilo durante el procedimiento de extracción. Los inventores son conscientes de que el acetonitrilo no reacciona con ningún analito cuando se utiliza como disolvente para la extracción de AOVE. Para asegurar una extracción exhaustiva, la muestra de AOVE se extrajo tres veces consecutivas con acetonitrilo para sacar la mayor parte del contenido de OC presente en el AOVE. Véanse las figuras 2 y 3. En segundo lugar, se aplicó un protocolo de ultracongelación a la fracción de acetonitrilo almacenándola a -80 °C durante una hora, durante tres ciclos consecutivos (Figura 3). Los inventores plantearon la hipótesis de que la fracción grasa principal del extracto de acetonitrilo se solidificaría y formaría un precipitado en condiciones de ultracongelación, mientras que los compuestos fenólicos menores permanecerán en forma líquida. Como se esperaba, una enorme cantidad de la fracción de ácidos grasos se solidificó y precipitó por completo en el fondo del recipiente (Figura 2). A través de un sencillo procedimiento de filtración, la fracción grasa solidificada se retiene en el papel de filtro, se eliminó y se recogió una solución oleosa transparente que contenía OC después de cada ciclo de ultracongelación (Figura 2 y 3). El análisis de RMN 1H y HPLC del extracto de acetonitrilo seco mostró claramente una reducción significativa en la cantidad de fracción grasa en comparación con el extracto seco inicial sin ultracongelación (Figura 2). Dado que más del 50 % de la fracción de ácidos grasos se eliminó durante el proceso de ultracongelación, una sola etapa de purificación final usando cromatografía en columna Sephadex l H20 con elución isocrática en CH₂Ch fue suficiente para obtener OC puro de manera oportuna y rentable (> 99 % de pureza). Cabe señalar que el rendimiento de los OC se ha mejorado significativamente al aplicar el protocolo de extracción con ultracongelación con acetonitrilo, lo que confirmó su eficiencia superior sobre el método inicial de extracción a temperatura ambiente con metanol (Figura 4).

Nuevo método de extracción autoemulsionante de oleocantal a partir de AOVE y propuesta de producto de valor añadido "Agua de oleocantal"

Aunque el método de ultracongelación con acetonitrilo es eficaz para extraer OC del AOVE, todavía tiene algunos inconvenientes. En primer lugar, la capacidad del espacio en la instalación de -800 °C puede ser limitada y puede no ser adecuada para el aislamiento a gran escala de OC. En segundo lugar, el método de ultracongelación con acetonitrilo adolece de una gran cantidad de consumo de disolvente orgánico que tiene dos inconvenientes graves; una, los disolventes orgánicos pueden no ser ecológicos y, dos, es probable que el AOVE agotado después de la extracción con disolventes orgánicos no se pueda reutilizar. Los inventores sabían que el OC tiene la capacidad de disolverse en disolventes polares y no polares. Por tanto, el OC parece poseer una propiedad anfifílica. Los inventores saben que el OC experimenta una interacción espontánea con el agua que conduce a la formación de mezclas reversibles de hemiacetales o acetales, mediante la adición de la molécula de D2O a uno de los aldehídos de OC, caracterizado usando espectros de RMN 1D y 2D, de los cuales se puede recuperar OC después de la eliminación de D2O. Consecuentemente, los inventores observaron la desaparición de uno de los picos de protones aldehídicos característicos de OC cuando el espectro de RMN 1H se pasó por agua deuterada (89,41). Mientras tanto, el espectro de RMN 1H de OC en CDCb muestra ambos picos aldehídicos distintivos (89,20 y 9,41), cuando la misma muestra se seca y se usa para el análisis. Basándose en estos datos, los inventores plantearon la hipótesis de que el OC podría interactuar reversiblemente con el agua de manera similar para formar reversiblemente su forma de acetal anfifílica más polar. Dado que el agua es un disolvente fácilmente disponible, rentable, así como ecológico y teniendo en cuenta su interacción espontánea y reversible propuesta con OC, los inventores plantearon la hipótesis de que el agua puede ser el disolvente adecuado para la extracción a gran escala de OC del AOVE. En otras palabras, los inventores decidieron utilizar la interacción reversible agua-OC para aislar selectivamente el OC de su AOVE de fuente original que contiene ácidos grasos en bruto. Por consiguiente, el AOVE se extrajo tres veces consecutivas con agua mediante un sencillo protocolo de extracción líquido-líquido y se recogieron las fracciones de agua (Figuras 5 y 7). Como se esperaba, una vez que el AOVE se mezcló con agua se formó una emulsión. Por tanto, el proceso puede considerarse como un método de extracción autoemulsionante (Figura 5). A continuación se realizó un estudio cuantitativo para determinar la cantidad de OC en la emulsión resultante así como en el AOVE antes y después de la extracción con agua mediante HPLC (Figuras 8A-8H y 9). Como esperaban los inventores, el OC se desplazó principalmente a la capa de agua, con una cantidad insignificante de ácidos grasos, eliminando la mayoría de las grasas en la capa de aceite, Figuras 8A-8H y 9. Después de tres ciclos de extracción de agua, el 5-10 % del contenido de OC permaneció en el AOVE, en comparación con el lote de AOVE fresco, y casi el 90-95 % de OC se ha desplazado hacia la capa de agua según lo determinado por HPLC (Figura 9). Después, la cantidad residual de OC que queda en el AOVE puede ser arrastrada por ciclos adicionales de extracción de agua. Adicionalmente, la emulsión resultante se sometió a liofilización durante 24-48 horas para identificar sus ingredientes mediante análisis TLC y RMN 1H (Figuras 5, 7 y 8A-8H). El extracto acuoso produjo ~80-85 % de oleocantal puro con ~15 % de ácidos grasos monoinsaturados, que contiene principalmente ácido oleico y el resto son compuestos fenólicos menores de AOVE, como se demuestra mediante TLC, q-RMN 1H y confirmado mediante análisis HPLC (Figura 8A-8H). Asimismo, se calculó el porcentaje de recuperación de OC usando el método de autoemulsión en agua y se encontró que estaba alrededor del 90-100 % después de la quinta ronda de extracción (Figura 9). Estos resultados confirman fuertemente la eficiencia del método de extracción con agua y apoyan la hipótesis propuesta sobre la extracción selectiva de OC a partir de AOVE cuando se utiliza agua como disolvente de extracción. Dado que se utilizó agua como disolvente de extracción, este novedoso método de extracción autoemulsionante de OC tiene una ventaja significativa sobre todos los métodos publicados anteriormente, donde se han utilizado disolventes orgánicos. El AOVE resultante tras la extracción del agua se puede reutilizar en la industria alimentaria; al mismo tiempo, tendrá un sabor mucho menos amargo y picante debido a la eliminación de OC, el ingrediente principal responsable del sabor picante del AOVE. En otras palabras, el método divulgado no solo extraerá OC del AOVE en un porcentaje de recuperación ventajoso, pero permite que el AOVE sin OC y menos picante se utilice más en la industria alimentaria.

El atrapamiento en resina como alternativa adecuada para la liofilización

El método de extracción autoemulsionante de OC descrito anteriormente utiliza preferentemente varias horas de liofilización para evaporar el agua y obtener un extracto rico en OC (Figura 7). Sin embargo, este proceso requiere mucho tiempo y puede afectar levemente al rendimiento de OC durante horas prolongadas de liofilización. Para superar estos inconvenientes potenciales y hacer que el método de extracción de agua OC sea más práctico a gran escala, se utilizaron perlas adsorbentes de resina de paquete húmedo como alternativa a la liofilización para eliminar el agua y mejorar la pureza (Figura 10). Se han utilizado tres tipos diferentes de resina en los experimentos, incluyendo: las resinas SP-70, Amberlite XAD-7 y Diaion HP-20. Simplemente, la emulsión que contenía OC se pasó por una columna rellena con cada tipo de resina en agua y el eluyente se recogió después de usar agua como fase móvil (Figura 10). El agua eluyente se extrajo con CH₂Cl2 para probar cualquier contenido de OC escapado, secado y sometido a análisis RMN 1H (Figuras 10 y 11A-11F). Los tres tipos de resina utilizados en el presente documento lograron atrapar completamente el OC con éxito, como lo demuestra la falta de señales de RMN 1H características de OC en sus correspondientes eluyentes de agua (Figuras 11A-11F), pero también se pueden usar otras resinas. Curiosamente, las fracciones de agua contenían solo ácidos hidroxigrasos e insaturados como se muestra en sus correspondientes espectros de RMN 1H, lo que también puede implicar la eficiencia de las perlas de resina para conferir una mayor purificación de la fracción de OC (Figuras 3d y Figuras 11A-11F). Finalmente, las columnas rellenas de resina se lavaron con acetona, para permitir la elución del OC atrapado y las fracciones de acetona se recogieron, secaron y analizaron utilizando RMN 1H (Figuras 10 y 11A-11F). Se seleccionó acetona para la elución de OC porque es un compuesto no halogenado, biodegradable, miscible en agua, respetuoso con el medio ambiente e inerte y no acetaliza el OC. Como se esperaba, los espectros de RMN 1H de las fracciones de acetona demostraron la recuperación completa de OC (Figuras 11A-11F), lo que sugiere la eficiencia de los tres tipos de resina para atrapar selectivamente OC y eliminar el agua y las impurezas de ácidos grasos residuales y, por lo tanto, presentan una alternativa a la etapa de liofilización. Las fracciones de acetona mostraron una mejora significativa en la pureza de OC (80-90 %), con eliminación casi completa de impurezas de ácidos grasos, con >90 % de recuperación de OC basado en el análisis de RMN 1H y HPLC de las fracciones eluidas de acetona y agua (Figuras. 9 y 11A-11F). SP-70 fue la resina más eficiente para atrapar OC, seguida de Amberlite XAD-7 y, finalmente, la resina Diaion HP-20. En conjunto, estos resultados sugieren que cualquiera o todas las tres resinas, por ejemplo, se pueden utilizar con éxito para eliminar rápidamente agua y ácidos grasos y recuperar OC con un alto rendimiento. Vale la pena señalar que el método de extracción de agua junto con el atrapamiento de resina lograron reducir el proceso de purificación de OC dramáticamente, como, por ejemplo, en una realización, solo se usó una sola columna cromatográfica de exclusión por tamaño Sephadex lH-20, con elución isocrática en CH₂Cl2, para obtener OC con una pureza >99 % (Figura 12C). Asimismo, el método de extracción de agua propuesto para OC a partir de AOVE mostró un rendimiento mejorado, en términos de rendimiento y pureza de OC, en comparación con los métodos que implican el uso de disolventes orgánicos como el metanol y el acetonitrilo (Figura 3). El método de aislamiento de agua OC divulgado (también llamado protocolo de extracción de agua, método de nanoemulsión de agua, el método de nanoemulsión o el método de autoemulsión) ofrece una eliminación rentable y efectiva en el tiempo de agua y ácidos grasos con un posible uso práctico futuro para el AOVE libre de OC y para la producción a gran escala de OC.

Caracterización de OC autoemulsionado

La emulsión recién formada utilizando el protocolo de extracción de agua OC autoemulsionante se sometió a una caracterización adicional en términos de análisis de tamaño de partícula, potencial zeta e índice de polidispersidad (Figuras 13-15). Se sabe que el tamaño de partícula es una función de la distribución de volumen y peso. Los resultados experimentales mostraron que el extracto acuoso de diferentes muestras de AOVE en solución presenta una excelente distribución volumen-peso del nanosistema de 2,87 nm. La similitud del tamaño de partícula entre el extracto de agua de múltiples muestras de AOVE de diferentes fuentes confirmó claramente el potencial de autoemulsión de OC en soluciones acuosas (Figura 13). Para confirmar la estabilidad de la nanoemulsión formada, se ha determinado el potencial zeta de cada muestra de extracto de agua (Figura 14). El potencial zeta sirve como un indicador fiable de la carga de partículas y la estabilidad de la emulsión. Refleja la diferencia de potencial entre el medio de dispersión y la capa estacionaria de fluido unido a la partícula dispersa. Se descubrió que casi todas las muestras tenían un potencial zeta superior a 40 mV, lo que sugiere que el OC autoemulsionado en agua es una nanoemulsión altamente estable (Figura 14). Para evaluar la heterogeneidad y exactitud de las mediciones del tamaño de partícula, se determinó el índice de polidispersidad (IP) para cada muestra de extracto de agua (Figura 15). El extracto acuoso mostró un IP promedio de 0,3, lo que sugiere la uniformidad del tamaño de partícula medido e implica la menor susceptibilidad de la nanoemulsión de OC a la dispersión (Figura 15). En conjunto, estos resultados confirman la capacidad de los extractos de agua bruta de OC obtenidos de diferentes muestras de AOVE para formar nanoemulsiones estables en soluciones acuosas. Estos extractos de agua OC todavía contienen ~15 % de ácido oleico, el principal ácido graso monoinsaturado del AOVE, que también puede actuar como agente emulsionante, facilitando la formación de una nanoemulsión estable.

Validación del método de extracción de agua OC utilizando diferentes fuentes de AOVE

En un intento de validar el nuevo método de extracción de agua para OC a partir de AOVE y confirmar su reproducibilidad, se adoptó el mismo protocolo de extracción de agua utilizando siete muestras de AOVE de diferentes fuentes. Asimismo, se utilizó una muestra de aceite de maíz como control negativo para evaluar la selectividad del protocolo de extracción de OC (Figura 9). Se utilizaron análisis RMN 1H y HPLC para la detección y cuantificación de OC entre diferentes muestras analizadas. Las curvas de calibración estándar se establecieron usando OC puro como patrón externo (Figuras 8E-8H) y los resultados se resumen en la Figura 9. El protocolo de extracción de agua divulgado pudo extraer de forma sólida OC de muestras de AOVE de diferentes fuentes, incluidas Grecia, Italia y Florida, lo que sugiere la eficiencia y reproducibilidad del protocolo. Los resultados cuantitativos de OC para cada muestra fueron reproducibles al usar análisis RMN 1H y HPLC (Figura 9). La muestra 4 de AOVE de Florida Olive Systems, así como la muestra de aceite de maíz, no demostraron ninguna cantidad apreciable de OC, incluso antes del protocolo de extracción de agua. Al extraer el agua, las muestras de AOVE que contenían OC se sometieron a una mayor caracterización de sus propiedades de emulsión, incluidos el tamaño de partícula, el potencial zeta y el índice de polidispersidad (Figura 13 - 15). Fue interesante observar que las diferentes muestras analizadas pudieron formar nanoemulsiones estables con valores similares del tamaño de partícula, potencial zeta e índice de polidispersidad, sugiriendo la reproducibilidad del protocolo de extracción de OC y eliminando la posibilidad de cualquier resultado específico de la fuente de AOVE para este método. Mientras tanto, es importante destacar que la frecuencia de extracción y el volumen de agua utilizada se corresponderán preferentemente con la cantidad de OC contenido en cada lote de AOVE. Las muestras que contienen cantidades de OC de bajas a medias utilizarán preferentemente de tres a cuatro extracciones, pero las muestras de AOVE ricas en OC (>80 mg de OC/AOVE kg) tendrán preferentemente más de cuatro extracciones con agua para asegurar una extracción completa de OC. Usando atrapamiento de resina, como alternativa a la liofilización, el volumen adicional de agua utilizado para los ciclos de extracción no afectará negativamente al proceso de extracción de OC divulgado en términos de tiempo, pureza del resultado y rentabilidad.

Estabilidad de la nanoemulsión rica en OC

La estabilidad de las nanoemulsiones de OC de diferentes fuentes de AOVE se evaluó mediante análisis RMN 1H antes y después de almacenar cada muestra durante un mes a temperatura ambiente o a 4 °C. Además, el tamaño de partícula, el potencial zeta y el índice de polidispersidad se determinaron para cada nanoemulsión de OC después de un mes para validar los resultados de ^r Mⁿ 1H. El extracto de agua OC liofilizado conservado sobre gas nitrógeno fue un 100 % estable a temperatura ambiente durante >6 meses, como lo demuestra su RMN 1H. En cambio, las nanoemulsiones ricas en OC tienden a degradarse en el plazo de un mes de almacenamiento a temperatura ambiente, como se muestra mediante análisis HPLC (Figura 9) y análisis RMN 1H. Consecuentemente, La nanoemulsión rica en OC almacenada a temperatura ambiente durante un mes reveló un descenso significativo del potencial zeta junto con un aumento concomitante en el tamaño de partículas y el índice de polidispersidad en todas las muestras de AOVE investigadas, lo que sugiere la inestabilidad y posible degradación de la nanoemulsión de OC a temperatura ambiente en cuestión de días (Figuras 16-18). Por el contrario, las muestras de nanoemulsión de OC refrigeradas a 4 °C mostraron un mejor perfil de estabilidad que las almacenadas a temperatura ambiente, sin cambios significativos en el potencial zeta, el tamaño de partícula y el índice de polidispersidad en comparación con sus respectivos valores iniciales antes del almacenamiento (Figuras 16-18). Consecuentemente, el análisis de HPLC mostró que la refrigeración ralentizó la degradación de OC en las muestras de nanoemulsión refrigeradas en comparación con las muestras almacenadas a temperatura ambiente (Figura 9). En conjunto, este experimento de estabilidad sugiere que las nanoemulsiones de OC son menos estables a temperatura ambiente y pueden degradarse en cuestión de días, mientras que su estabilidad mejora con el almacenamiento a 4 °C durante un mes, mientras que el OC liofilizado extraído por el método del agua se puede almacenar congelado en nitrógeno durante más de seis meses. El extracto seco rico en OC liofilizado o purificado con resina se puede reconstituir recientemente en un volumen de agua apropiado para formar, por ejemplo, un producto de agua de oleocantal de valor añadido que puede ser consumido por seres humanos para mejorar la salud y prevenir el cáncer y la enfermedad de Alzheimer, ya que se correlaciona con las actividades biológicas del OC. La estabilidad de la auto-nanoemulsión de OC se puede mejorar aún más en el futuro con, por ejemplo, el uso de tensioactivos aprobados para alimentos.

Efecto de la nanoemulsión de OC en la proliferación de células de cáncer de mama

Se evaluó la capacidad de las nanoemulsiones de OC para inhibir la proliferación de líneas celulares de CM humanas clave utilizando el ensayo MTT. Las líneas celulares han sido seleccionadas para representar diferentes fenotipos de CM. Las células triple negativas MDA-MB-231 y MDA-MB-468 de CM carecen de la expresión del receptor de estrógenos (ERa), un objetivo importante para la terapia del CM humano, mientras que sobreexpresan c-Met, un receptor de tirosina quinasa bien establecido que participa en la supervivencia y la motilidad del CM y se sabe que es el objetivo molecular del OC en el CM. En cambio, las células de cáncer de mama MCF-7 y BT-474 expresan ERa y c-Met, sin embargo, este último se expresa a niveles relativamente más bajos en comparación con las células de CM triple negativas. Los efectos antiproliferativos de diferentes dosis de nanoemulsión de OC sobre el crecimiento de las líneas celulares MDA-MB-231, MdA-MB-468, MCF-7 y BT-474 BC después de un período de cultivo de 48 horas se muestran en la Figura 19. El tratamiento con nanoemulsión de OC inhibió de forma dependiente de la dosis la proliferación de las cuatro líneas celulares de CM (Figura 19). La nanoemulsión de OC fue más potente contra las células de CM triple negativas MDA-MB-231 más dependientes de c-Met en comparación con las otras tres líneas celulares. Los valores de CI50 para la nanoemulsión de OC fueron 19,4, 25,2, 24,4 y 20,1 μM en células MDA-MB-231, MDA-MB-468, BT-474 y MCF-7, respectivamente (figura 19). Vale la pena mencionar que: 1) existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos tratamientos para los subtipos agresivos de CM triple negativo, que actualmente carecen de terapia dirigida, que confieren una ventaja adicional a la nanoemulsión de OC propuesta; y 2) a pesar de su modesta actividad in vitro, el OC muestra una actividad in vivo significativamente potente que incluso puede compararse con la quimioterapia estándar. Los resultados indicaron claramente que la nanoemulsión de OC casi mantuvo la actividad antiproliferativa del OC puro contra las mismas líneas celulares de CM, lo que sugiere el potencial de esta nanoemulsión como futuro suplemento quimiopreventivo dietético y/o quimioterapéutico y/o terapéutico posterior a la extirpación del tumor.

Actividad antitumoral oral in vivo de la nanoemulsión de OC contra CMTN

Los experimentos previos de los inventores mostraron que la administración intraperitoneal de 5 mg/kg de OC puro, 3 veces a la semana, mostraron una inhibición del crecimiento tumoral del 65 % en el xenoinjerto MDA-MB-231 de cáncer de mama triple negativo (CMTN) en ratones desnudos atímicos hembra. Esos resultados sugieren una mayor potencia de OC cuando se usa en modos de tratamiento tempranos en lugar de tardíos.

Volviendo a las Figuras 20-23, en la presente divulgación, como futuro candidato dietético OC, se evaluó la eficacia antitumoral de la nanoemulsión de OC in vivo usando el mismo modelo de ratón usando las células de CM humanas MDA-MB-231/GFP. La nanoemulsión de OC se administró en modo de tratamiento preventivo/temprano por vía oral a 10 mg/kg todos los días, comenzando siete días antes de la inoculación de células tumorales y continuando durante 4 semanas. Los ratones fueron monitorizados midiendo el peso corporal y observando su comportamiento físico durante todo el estudio. Se siguió la progresión del tumor mediante la medición directa del volumen del tumor a partir de 14 días después de la inoculación del tumor ortotópico. Curiosamente, los resultados demostraron una reducción significativa tanto en el volumen del tumor como en el peso del tumor del grupo tratado con nanoemulsión de OC, en comparación con el grupo de control tratado con vehículo. Los tratamientos con nanoemulsión de OC de 10 mg/kg diarios por vía oral suprimieron significativamente el crecimiento del tumor MDA-MB-231 en un 90 % el último día del estudio, en comparación con el grupo de control negativo con vehículo, sin afectar negativamente al peso corporal de los ratones tratados o su comportamiento. Los resultados indicaron que la nanoemulsión de OC demuestra una sólida eficacia antitumoral a través de la vía de administración oral, contra el CM en un modelo de ratón ortotópico clínicamente relevante, lo que implica su biodisponibilidad y tolerabilidad oral como suplemento dietético en perspectiva para prevenir la progresión invasiva del CM

OC como inhibidor de la recurrencia del CM

La escisión quirúrgica de los tumores confinados en etapa temprana es una estrategia clínica común utilizada para minimizar la metástasis de malignidad posterior, que representan un peligro mortal para el paciente. La relación entre el tumor primario y la metástasis posterior no se comprende completamente. Casi el 4-10 % de los pacientes con CM recién diagnosticado tienen enfermedad metastásica concurrente. La simplificación excesiva de la metástasis como la migración de células desde los órganos primarios a los órganos diana carece de la profundidad necesaria para prevenir la propagación del cáncer. La "diáspora", personas que se dispersan de la patria establecida, es un concepto que se demostró aplicable a la metástasis. La siembra metastásica está asociada con el crecimiento tardío del tumor primario y las fases de invasión, pero recientemente se demostró que la diseminación sistémica es un acontecimiento temprano. De manera similar, se demostró que la propagación direccional del tumor desde los sitios primarios a los secundarios es complicada e interactúa dinámicamente. Por lo tanto, los tumores primarios y secundarios pueden crecer de forma lineal/paralela y diseminarse a órganos distantes o puede ocurrir una resiembra metastásica bidireccional en el sitio original del tumor primario, induciendo la recurrencia.

El desarrollo de herramientas de detección temprana ayudó a clasificar el estadio del tumor primario y los tratamientos prequirúrgicos (neoadyuvantes) o posquirúrgicos (adyuvantes) posteriores para minimizar el potencial metastásico. Numerosos pacientes con CM desarrollan quimiorresistencia que da como resultado en una recurrencia resistente a la quimioterapia. Posterior al uso de quimioterapia, la muerte celular apoptótica debería ser la mejor respuesta esperada de las células tumorales. Sin embargo, las células tumorales pueden permanecer viables después de la quimioterapia a través de la senescencia celular y la autofagia citoprotectora, generando secretomas que pueden potenciar directamente el fenotipo maligno. Este desafío resaltó la necesidad de enfocarse en las vías de supervivencia no apoptóticas para mejorar la eficacia quimioterapéutica y revertir o evitar esta resistencia a la quimioterapia.

La prometedora actividad in vivo de la nanoemulsión de OC contra CMTN y los extensos resultados preliminares que muestran su actividad como inhibidor de la activación de c-Met motivaron los experimentos actualmente divulgados de los inventores para evaluar la capacidad de las nanoemulsiones de OC para prevenir la recurrencia de CM y extender las duraciones sin recurrencia después de la escisión quirúrgica del tumor primario y el uso prolongado de quimioterapia neoadyuvante en un modelo de ratón clínicamente relevante.

La nanoemulsión oral de OC inhibe la recurrencia de CMTN

Volviendo a las figuras 24A-27, los cinco ratones utilizados en la actividad oral del experimento de nanoemulsión de OC se utilizaron para el modelo de recurrencia. Dado que cuatro de estos cinco ratones desarrollaron tumores, estos cuatro animales se sometieron a cirugías de escisión del tumor primario el día 35 del tratamiento inicial con nanoemulsión de OC oral (Figura 24A). El tratamiento diario oral con nanoemulsión de OC a 10 mg/kg continuó durante 30 días más y se comparó con el grupo de control tratado con vehículo (n=5). Solo uno de los cinco ratones desarrolló un pequeño tumor, que representa >95 % de inhibición de la recurrencia de CMTN (Figuras 24B, 25 y 26). Los ratones tratados no mostraron cambios en el peso corporal ni de los órganos, ni anomalías morfológicas después del sacrificio (Figura. 24B y 27) ni cambios de comportamiento.

OC inhibe el crecimiento de cáncer de mama HER2+/ER in vivo

Volviendo a las figuras 28A-32, el CM HER2+ representa > 15 % del total de casos de CM con perfil metastásico agresivo y altamente resistente. Para ampliar el alcance de la actividad in vivo de la nanoemulsión de OC contra varios CM, los inventores probaron la actividad de OC In vivo en modelo de ratón desnudo a dos dosis diferentes, 5 mg/kg y 10 mg/kg, 3X/semana, por vía intraperitoneal durante 60 días. Ambas dosis de OC pudieron inhibir de forma significativa y dependiente de la dosis un 88,2 % y un 93,2 %, respectivamente, del peso del tumor HER2+/ER+ BT-474 in vivo en ratones desnudos (Figuras 28A - 28C), en comparación con los grupos de control tratados con vehículo. Ambas dosis de OC mostraron una inhibición superior del peso y volumen tumoral de BT-474 en comparación con 12,5 mg/kg y 50 mg/kg de lapatinib (Figuras 29-31). Ambas dosis no cambiaron significativamente el peso corporal de los animales analizados durante el período de tratamiento de 2 meses (Figura 32). Cabe señalar que el inhibidor dual estándar de la HER2-EGFR quinasa lapatinib a dosis orales de 12,5 y 50 mg, 5X/semana, estaban inhibiendo el 85,9 % y el 89,9 % del crecimiento tumoral BT-474 en el mismo modelo de ratón y ambos OC combinado 5 mg/kg de lapatinib a una dosis oral de 50 mg y OC combinado a 10 mg/kg y lapatinib a 12,5 mg/kg fueron los que funcionaron mejor (Figura 29), lo que sugiere un efecto sinérgico de OC y el inhibidor de la quinasa en la lucha contra el crecimiento de células cancerosas

OC inhibe la recurrencia de la neoplasia de mama HER2+/ER+ in vivo después de la escisión quirúrgica del tumor primario

Volviendo a las Figuras 33-35, los animales tratados con OC durante 60 días en el experimento anterior fueron sometidos a escisión quirúrgica del tumor primario. El tratamiento con OC a 10 mg/kg, i.p., 3X/semana continuó durante 54 días más y se comparó con el control negativo tratado con vehículo y el tratamiento oral con lapatinib (LAP) 50 mg/kg, 5X/semana como control positivo. El OC inhibió el 86,2 % del peso del tumor HER2+-ER+ recurrente mientras que el lapatinib inhibió el 81,4 % del peso del tumor recurrente de este tumor (Figura 33). De manera similar, el tratamiento con OC mostró una inhibición significativa del volumen tumoral recurrente en comparación con lapatinib a 50 mg/kg, 3X/semana (Figura 34). Los ratones tratados con OC no mostraron cambios en el peso corporal o de los órganos ni anomalías en la morfología de los órganos después del sacrificio, a diferencia de los animales tratados con lapatinib, que mostraron una disminución significativa del peso durante el período de tratamiento adicional de 54 días (Figura 35). Como se muestra en el gráfico, el día 114, el peso corporal promedio de mayor a menor, era el control de vehículo; OC a 10 mg/kg; LAP a 50 mg/kg que se suspendió después del día 60; LAP a 50 mg/kg hasta el día 60 y luego OC a 10 mg/kg hasta el día 114; y el más bajo fue LAP a 50 mg/kg que se administró desde el inicio hasta el día 114.

OC inhibe la recurrencia de la neoplasia de mama CMTN y HER2+/ER+ in vivo después de completar el régimen neoadyuvante de paclitaxel y lapatinib

Se documenta la correlación entre la vía c-Met/HGF y la resistencia tumoral. El tratamiento con OC a 10 mg/kg, i.p., 3X/semana durante 54 días adicionales inhibió la recurrencia de las células de CM HER2+-ER+ BT-474 después del régimen neoadyuvante con lapatinib a 50 mg/kg, 3X/semana, durante 60 días (Figura 36A-36C). De manera similar, los tratamientos orales diarios con OC a 10 mg/kg inhibieron efectivamente la recurrencia in vivo e invirtió la quimiorresistencia de las células de CM CMTN MDA-MB-231 B a paclitaxel neoadyuvante. Esto fue consistente con la actividad inhibitoria de OC c-Met y previamente mostró efectos de crecimiento y recurrencia.

Conclusión

Oleocantal ha demostrado ser un excepcional producto natural bioactivo in vivo derivado del AOVE. Tarde o temprano se convertirá en un fármaco y/o suplemento dietético comercial para el control y prevención del cáncer, enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias. La química única de OC hizo que su aislamiento fuera un reto y, por lo tanto, existe una necesidad imperiosa de encontrar un método de aislamiento confiable y rentable para satisfacer las futuras necesidades esperadas del mercado. La presente divulgación establece nuevos métodos de aislamiento de OC. Los protocolos propuestos han demostrado, por ejemplo, la exitosa capacidad del agua para extraer OC del AOVE conduce al descubrimiento de un novedoso producto alimenticio de valor añadido que contiene OC. Los resultados fomentan la extracción de agua como una química verde tanto ecológica como alternativa altamente eficiente a todos los demás disolventes orgánicos para la extracción a gran escala de OC. Una ventaja importante de este método es mantener el AOVE remanente después de la extracción de OC para su comercialización a los consumidores que preferirán usar AOVE sin picante ni amargor. El estudio de estabilidad a corto plazo a pequeña escala divulgado proporcionó información preliminar sobre la estabilidad de la emulsión de OC y sugiere su reconstitución preferentemente inmediatamente antes del uso, o combinación con estabilizadores químicos apropiados. El residuo seco rico en OC resultante de este método, que es estable a temperatura ambiente durante períodos prolongados, se puede reconstituir en agua a una dosis equivalente al promedio de aparición natural de OC en el AOVE, 100 mg/l, para hacer un "agua de oleocantal" de valor añadido o puede administrarse por vía oral en forma de píldora tanto seca como en una cápsula líquida, por ejemplo, a concentraciones iguales o superiores, para uso público para el control del cáncer, incluyendo cáncer de mama, y la quimioprevención y para las personas con riesgo de enfermedad de Alzheimer para mejorar la cognición. Los estudios in vitro e in vivo revelaron la actividad significativa de la nanoemulsión de OC como un nuevo inhibidor del crecimiento y la recurrencia de múltiples neoplasias malignas mamarias invasivas.

Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), a menos que se indique de otra manera. El (-)-oleocantal se aisló del AOVE utilizando un método de extracción con agua similar al descrito en la sección de preparación de muestras. Metanol, acetonitrilo, diclorometano y acetato de etilo se adquirieron en VWR (Suwanee, Ga ). El agua desionizada se obtuvo de un sistema de ultrapurificación en la Universidad de Louisiana en Monroe.

Muestras de aceite de oliva virgen extra

Las muestras de AOVE utilizadas en el estudio fueron proporcionadas generosamente por Florida Olive Systems, Inc. o disponibles comercialmente y comprados en las cadenas Sam's Club y Brookshire en Monroe, LA. Se incluyeron muestras de ocho variedades diferentes, incluidas muestras de Florida Olive Systems y comercialmente disponibles (Brookshire: L183TE-241, L245TE-241 y Sam's Club Daily Chef: LO₂2RE-565, Tabla 1) en el estudio. La mayor parte del origen de los AOVE disponibles comercialmente era Italia. La producción de aceite de oliva se realizaba en molinos bifásicos o trifásicos. Todas las muestras fueron proporcionadas por pequeños productores que pudieron garantizar su origen monovarietal.

Procedimientos experimentales generales

El análisis de TLC se llevó a cabo en placas de TLC de gel de Si 60 F254 de 500 μm prerrecubiertas (EMD Chemicals), utilizando n-hexano-EtOAc (8:2) como sistema de desarrollo. Para la cromatografía en columna, se usó Sephadex LH-20 (Sigma Aldrich, tamaño de perla 25-100 m) con diclorometano isocrático como fase móvil. Como reactivo de visualización se utilizó vainillina al 1 % en H₂SO₄ concentrado. Los espectros de RMN 1H y 13C se registraron en CDCl3, utilizando tetrametilsilano (TMS) como patrón interno, en un espectrómetro JEOL Eclipse-ECS NMR que opera a 400 MHz para RMN 1H y 100 MHz para RmN 13C. El análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HplC) se llevó a cabo utilizando un sistema HpLC Simadzu equipado con un detector UV/visible de longitud de onda variable ajustado a 230 nm. Generalmente, en todas las purificaciones por cromatografía de líquidos se utilizaron proporciones de 1:100 de las mezclas a cromatografiar frente a la fase estacionaria utilizada.

Compuestos de referencia

Se aisló S (-)-oleocantal (OC) a partir de aceite de oliva virgen extra (>95 % de pureza) para utilizarlo como patrón externo en estudios cuantitativos. La separación se realizó en una columna Phenomenex Cosmosil 5C18-AR-II (250 mm x 4,6 mm, 5 μm; Phenomenex Inc., Torrance, CA) a 25 °C. La elución isocrática se realizó utilizando H₂O-CH3CN (6:4) como fase móvil. Se usaron un caudal de 1 ml/min, un volumen de inyección de 25 μl y una concentración de muestra de 1 mg/ml. La identidad de OC fue indudablemente definida por un extenso análisis de RMN 1D y 2D y la comparación de sus datos de RMN 1H y RMN 13C con literatura. La muestra de OC puro se mantuvo congelada en un vial de vidrio ámbar en gas N₂.

Extracción de AOVE y preparación de muestras

Método de extracción de acetonitrilo

Se mezclaron aproximadamente 100 ml de AOVE (B#LO₂2RE-565, Italia) y 100 ml de CH3CN en un embudo de decantación de 500 ml, se ahitó enérgicamente y se dejó que se separara (Figura 2). El proceso se repitió dos veces más; cada uno con 100 ml de CH3CN. Las capas de acetonitrilo orgánico se combinaron en un matraz Pyrex de 1 l y se sometieron a ultracongelación durante 1,5-2,5 horas a -80 °C. A continuación, la mezcla se filtró inmediatamente en un papel de filtro Whatmann n.° 1. Se repitió la ultracongelación dos veces más seguido de filtración para proporcionar una solución oleosa transparente que contenía OC. A continuación, esta solución oleosa se secó y se sometió a una purificación adicional usando Sephadex LH-20 lipofílica.

Método de extracción de agua

Se mezcló AOVE (100 ml) con agua desionizada (5 x 150 ml) en un embudo de decantación de 500 ml, se agitó enérgicamente tres veces (aunque es preferible tres veces, también se prevé agitar más o menos veces) y dejó pasar 10-15 minutos para la separación de fases (es posible una separación de fases más prolongada, incluidos 20, 30, 45 y 60 min.). Las capas acuosas inferiores se combinaron y se sometieron a ultracongelación durante alrededor de 30­ 60 minutos a, preferentemente, -80 °C (también están previstas temperaturas de, por ejemplo, -100 °C a -60 °C). A continuación, el extracto acuoso se filtró preferentemente inmediatamente en un papel de filtro Whatmann n.° 1 seguido de liofilización hasta que se secó preferentemente por completo (Figura 5). Para que el proceso sea rápido y rentable, la liofilización se reemplazó con una columna de relleno en húmedo utilizando 45 g de Sorbtech (Sorbent technology Sepabeads resin Styrenic adsorbent, Sp-70-01) (Esquema 3). La columna se lavó con 150 ml de agua y luego se eluyó con 300 ml de acetona. La fracción eluida de acetona rica en OC se recogió y se secó. Mientras tanto, el eluyente de agua se sometió a agitación con CH₂Cb seguido de la recolección de la fracción de CH₂Cb, evaporación al vacío y análisis RMN H1. La purificación final de OC se logró sometiendo la fracción de acetona seca a cromatografía de exclusión por tamaño Sephadex LH-20 utilizando CH₂cCb isocrático como fase móvil. Las fracciones eluidas se controlaron usando análisis TLC para determinar la presencia de OC.

Análisis del espectro qRMN 1H

El residuo rico en OC, obtenido de acuerdo con el procedimiento de extracción anterior, se disolvió en CDCI3 (750 |jl) y se transfirió un volumen medido con precisión de la solución (550 j l) al tubo de RMN de 5 mm. Se registraron los espectros de RMN H1 y C13 usando tetrametilsilano (TMS) como patrón interno, en un espectrómetro JEOL Eclipse-ECS NMR que funciona a 400 MHz para RMN 1H y 1 O0 MHz para R^m N 13C. Normalmente, se recolectaron 50 barridos en 32K puntos de datos sobre un ancho del espectro de 0 -l6 ppm con un retraso de relajación de 1 s y un tiempo de adquisición de 2.1 min para RMN 1H. Para el análisis de RMN H1 cuantitativa, las curvas de calibración se establecieron usando concentraciones conocidas de OC puro como patrón externo (Figuras 8F-8H). La cuantificación se basó en la relación de integración de la señal de protones aldehídicos clave de OC a 9,23 ppm y el pico residual de CHCb en el CDCl3 a 7,24 ppm. El OC utilizado para las curvas de calibración se preparó recientemente.

Análisis HPLC

La identificación y cuantificación del oleocantal se confirmó adicionalmente mediante análisis HPLC en un sistema HPLC Simadzu equipado con detector de longitud de onda variable UV/visible. En resumen, el OC se disolvió en acetonitrilo al 50 % v/v en agua como fase móvil. A continuación, se inyectaron muestras (20 j l ) en la columna analítica Eclipse YD5 C18-RP (4,6 mm x 15 cm) que se había precalentado a 40 °C. El caudal de la fase móvil fue de 1,0 ml/min y los analitos se detectaron simultáneamente utilizando el detector UV a 230 y 254 nm de A con un tiempo de retención de 2,8 min. La adquisición y el análisis de datos se realizaron utilizando el software de cromatografía Lab Solution™. Cuantitativamente, las curvas de calibración se prepararon utilizando concentraciones conocidas de OC puro, como patrón externo y calculando el área bajo el pico (AUC) para cada concentración (Figuras 8E y 8F).

Análisis del potencial zeta y del tamaño de partícula del OC autoemulsionado

El tamaño de partícula medio de las estructuras autoensambladas de OC en agua se midió mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS) usando un analizador de tamaño de partículas submicrométricas NicompTM380 ZLS (Particle Sizing System, Port Richey, FL) a 25 °C y dispersión de luz láser de 90 °. Las muestras se diluyeron con agua desionizada para evitar la dispersión múltiple y lograr una intensidad de dispersión de 300 kHz. El diámetro medio ponderado por volumen de las partículas se calculó en base a la ley de Stokes-Einstein mediante el ajuste de la curva de la función de correlación. El potencial Zeta de las estructuras autoensambladas de OC en agua se midió utilizando el mismo instrumento en el modo Zeta.

Estudio de estabilidad a corto plazo

Se realizó un estudio de estabilidad a corto plazo manteniendo las muestras de emulsión de OC a dos temperaturas diferentes; ya sea a temperatura ambiente (TA) o 4 °C. Después de un mes, las muestras se analizaron usando HPLC como se ha descrito anteriormente. Asimismo, el tamaño de partícula y el potencial zeta se calcularon para las muestras almacenadas y se compararon con los de las muestras iniciales antes del almacenamiento para evaluar la estabilidad de las emulsiones de OC en diferentes condiciones de almacenamiento y temperatura.

Líneas celulares y condiciones de cultivo

Las líneas celulares de cáncer de mama humano se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Todas las líneas celulares de cáncer se mantuvieron en RPMI-1640 (GIBCO-Invitrogen, NY) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % (Gemini BioProducts), 100 U/ml de penicilina, 100 jg/m l de estreptomicina y 2 mmol/l de glutamina. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada en CO₂ al 5 %. Se preparó una emulsión de OC fresca agitando enérgicamente una cantidad conocida de oleocantal con agua para proporcionar una solución madre de concentración 10 mM para todos los ensayos. Las soluciones de trabajo en sus concentraciones finales para cada ensayo se prepararon en un medio de cultivo apropiado inmediatamente antes de su uso. El control del vehículo se preparó añadiendo el máximo volumen de agua, utilizado en la preparación de concentraciones de tratamiento de oleocantal. Se usó oleocantal puro como control positivo a una dosis de 10 jM en base a estudios previos de los inventores.

Ensayo de proliferación de MTT

En resumen, las células MDA-MB-231, MDA-MB-468, BT474 y MCF-7, en crecimiento exponencial, se sembraron a una densidad de 1x104 células por pocillo (6 pocillos/grupo) en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10 % y se les permitió adherirse durante la noche a 37 °C en CO₂ al 5 % en una incubadora humidificada. Al día siguiente, las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS), se dividieron en diferentes grupos de tratamiento y luego se alimentaron con medio RPMI-1640 definido sin suero que contenía 0,5 % de FBS, para mantener la viabilidad de las células durante todo el experimento, y los tratamientos experimentales, que contienen concentraciones designadas de oleocantal o medios de control tratados con vehículo y la incubación se reanuda a 37 °C en CO₂ al 5 % durante 48 horas. Luego se retiraron los medios de control y tratamiento, se reemplazaron con medio recién preparado y a cada pocillo se añadieron 50 j l de solución MTT recién preparada (1 mg mM) y las placas se volvieron a incubar durante 4 horas a 37 °C. La reacción de color se detuvo retirando el medio y añadiendo 100 |jl de DMSO en cada pocilio para disolver los cristales de formazán formados. Se reanudó la incubación a 37 °C durante un máximo de 20 minutos para garantizar la disolución completa de los cristales. La absorbancia se determinó a A de 570 nm utilizando un microlector de placas ELISA (BioTek, VT, EE.UU.). El % de supervivencia celular se calculó de la siguiente manera: % de supervivencia celular = (n.° de células en tratamiento/n.° de células vehículo) x 100.

Estudios in vivo

Animales

Los ratones desnudos atímicos hembra (Foxn1nu/Foxn1+, 4-5 semanas de edad) se adquirieron de Harlan (Indianapolis, IN). Los animales se aclimataron a las instalaciones de alojamiento para animales y se mantuvieron en condiciones de sala limpia en jaulas estériles con filtro superior con lecho Alpha-Dri y se alojaron en rejillas ventiladas con filtro de aire de partículas de alta eficiencia a una temperatura de 18-25 °C, con una humedad relativa del 55 al 65 % y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, durante al menos una semana antes del estudio. Los ratones tenían libre acceso a agua potable y alimento granulado para roedores (n.° 7012, Harlan/Teklad, Madison, WI). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité institucional de atención y uso de animales, University of Louisiana en Monroe y se manejaron en estricta conformidad con las buenas prácticas con animales definidas por las pautas de los NIH.

Modelo de xenoinjerto en ratones atímicos

Se recolectaron células de cáncer de mama humano MDA-MB-231/GFP, se sedimentaron mediante centrifugación a 850 xg durante 5 minutos y se resuspendieron en medio DMEM estéril sin suero (20 jl). Se añadió xilazina (1 ml de xilazina a 20 mg/ml) a 10 ml de ketamina a 100 mg/ml para preparar 11,0 ml a 92 mg/ml de solución madre. Aproximadamente 1 ml de esta solución se diluyó con 9 ml de solución salina normal estéril para preparar una solución de 9,2 mg/ml. Se utilizaron aproximadamente 10 ml de esta solución/kg para la anestesia, lo que equivale a 10 jl/g. La suspensión de células tumorales (1 x 106 células/20 j l ) se inoculó por vía subcutánea en la segunda almohadilla de grasa de la glándula mamaria justo debajo del pezón de cada animal después de la anestesia para generar tumores de mama ortotrópicos. A las 48 horas de la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: i) el grupo de control tratado con vehículo (n = 5), ii) el grupo tratado con emulsión OC (n = 5). El tratamiento (7X/semana) comenzó 7 días después de la inoculación con control de vehículo administrado por vía oral (p.o.) (agua/solución salina) o emulsión de OC de 10 mg/kg recién preparada. Los ratones fueron monitorizados midiendo el volumen del tumor, el peso corporal y observación clínica. El volumen tumoral (V) se calculó mediante V = L/2 x W2, donde L era la longitud y W la anchura de los tumores. Los resultados se presentan como el promedio ± SEM. Las diferencias entre varios grupos de tratamiento se determinaron mediante el análisis de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Dunnett utilizando la versión 18 de las estadísticas de PASW. Una diferencia de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control tratado con vehículo.

Prevención de la recurrencia después del experimento de escisión del tumor primario

Se anestesió a los ratones desnudos atímicos hembra utilizados en el experimento anterior antes del procedimiento de escisión quirúrgica con una combinación i.p. de ketamina/xilazina (100 mg/kg/15 mg/kg). 15-20 minutos después de administrar el anestésico, se probaron los reflejos de los animales golpeando suavemente las patas traseras con una aguja de jeringa estéril y, finalmente, sus tumores se extirparon quirúrgicamente y cada herida se cerró con uno o dos puntos con ketoprofeno, se utilizó 1 mg/kg 12 horas antes y 12 horas después de la cirugía para lograr una analgesia eficaz. Durante la cirugía se utilizó lubricante oftálmi

bupivicaína (0,25 %, 1-2 gotas), dos veces al día, por vía tópica en el sitio de la herida de escisión, con infiltración local a lo largo del sitio de la cirugía durante el cierre con una dosis máxima de 2 mg/kg. Los tratamientos con OC, vehículo y control positivo del fármaco continuaron como se describe para cada grupo.

Datos adicionales

OC inhibió la viabilidad celular y la expresión de COX-2 mediante la activación de vías mediadas por AMPK en células HT-29, lo que explica plausiblemente en parte el potencial preventivo y quimioterapéutico de este compuesto contra el cáncer de colon. Los inhibidores conocidos de AMPK y caspasa-3 bloquearon la capacidad de OC para inhibir la formación de colonias de células HT-29. Los resultados de un ensayo de membrana corioalantoidea también mostraron que el OC puede inhibir la angiogénesis in vivo.

La actividad antiinflamatoria del oleocantal está mediada, al menos en parte, por la inhibición de la proteína inflamatoria de macrófagos 1-a (MIP-1a), la expresión y secreción de IL-6 y la 5-lipoxigenasa. Oleocantal mostró una potente actividad inhibidora de HSP90, una chaperona molecular esencial involucrada en varias características del cáncer; OC inhibió la actividad ATPasa y cambió el estado de oligomerización de HSP90, estimulando la pérdida de la función chaperona molecular HSP90.

El oleocantal indujo tanto la muerte celular necrótica primaria como la apoptótica a través de la mejora de la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP) al inhibir la actividad de la esfingomielinasa ácida, que desestabiliza la interacción entre proteínas necesarias para la estabilidad de la membrana lisosomal. Se descubrió que las células cancerosas tenían una fragilidad mucho mayor a la LMP inducida por oleocantal que las células normales.

Los estudios realizados por los inventores identificaron al oleocantal como un inhibidor competitivo de c-Met ATP. De acuerdo con este hallazgo, el oleocantal inhibió selectivamente la proliferación de células de varias líneas de cáncer de mama y próstata humanas, sin afectar negativamente a las células epiteliales mamarias humanas no tumorigénicas. Los estudios de los inventores demostraron que el oleocantal inhibía la proliferación celular de varias líneas de cáncer de mama humano in vitro e in vivo. Los inventores también conocen la actividad del oleocantal como inhibidor de mTOR. Oleocantal comparte nueve de diez interacciones de unión críticas con un potente inhibidor natural dual de PIK3-Y/mTOR. El oleocantal inhibe la actividad enzimática de mTOR, con un valor de CI50 valor de 708 nM. Oleocantal provoca una marcada regulación por disminución de mTOR fosforilado en las células CMTN MDA-MB-231. Es muy probable que este sea un efecto posterior debido a la inhibición de c-Met del oleocantal. La proteómica química demostró que HSP70 y HSP90, eran los principales compuestos de interacción de oleocantal en los sistemas vivos.

Además de su actividad anticancerosa, el oleocantal ha demostrado una actividad anti-Alzheimer. El oleocantal mejora la eliminación de la beta-amiloide (Ap) distintiva neurodegenerativa de la enfermedad de Alzheimer del cerebro a través de la regulación positiva de las proteínas de transporte Ap in vitro e in vivo. Estos hallazgos proporcionan evidencia del potencial del oleocantal para reducir el riesgo de enfermedad de Alzheimer, lo que hará que el producto a base de oleocantal sea muy popular incluso para personas sanas normales con fines preventivos y de mejora de la salud.

La invención divulgada de forma ilustrativa en el presente documento puede ponerse en práctica de forma explícita en ausencia de cualquier elemento que no se divulgue de forma específica en el presente documento. Aunque se han descrito con detalle varias realizaciones de la presente invención, es evidente que a los expertos en la técnica se les ocurrirán y serán fácilmente evidentes diversas modificaciones y alteraciones de dichas realizaciones. Sin embargo, se debe entender expresamente que tales modificaciones y alteraciones están dentro del alcance de la presente invención, como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Además, la invención es susceptible de otras realizaciones y de ponerse en práctica o llevarse a cabo de otras diversas maneras relacionadas. Asimismo, debe entenderse que la fraseología y la terminología utilizadas en el presente documento son por motivos descriptivos y no deben considerarse como limitantes. El uso de "que incluye/n", "que comprende/n", o "que tiene/n" y variaciones de los mismos en el presente documento pretende abarcar los elementos enumerados a continuación y sus equivalentes, así como elementos adicionales, mientras que solo los términos "que consiste/n en" y "que consiste/n solo en" deben interpretarse en sentido limitativo.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para extraer S (-)-oleocantal de aceite de oliva que comprende:

mezclar un primer volumen de agua con un segundo volumen de aceite de oliva para formar una mezcla de aceite de oliva/agua;

dejar reposar la mezcla de aceite de oliva/agua;

eliminar una fracción acuosa de la mezcla de aceite de oliva/agua dejando un aceite de oliva que contiene S(-)-oleocantal reducido; y

filtrar la fracción acuosa para crear S(-)-oleocantal acuoso.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de separar el agua del S (-)-oleocantal acuoso para crear un residuo de S (-)-oleocantal seco.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el aceite de oliva es aceite de oliva virgen extra.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el primer volumen de agua se mezcla con el segundo volumen de aceite de oliva mediante sacudidas o agitación enérgicas.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad total de agua mezclada con el aceite de oliva es al menos tres veces el segundo volumen de aceite de oliva.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de ultracongelar la fracción acuosa después de retirarla de la mezcla de aceite de oliva/agua.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el agua se separa de la fracción acuosa mediante liofilización.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el agua se separa de la fracción acuosa pasando la fracción acuosa sobre resina, atrapando el S (-)-oleocantal y eluyendo el S (-)-oleocantal de la resina.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la resina es una resina de perlas poliméricas estirénicas macroporosas que permite aplicaciones a escala del proceso de adsorción/desorción y que tiene una matriz que proporciona una superficie no polar aromática.

10. El método de la reivindicación 8, que comprende además las etapas de lavar la resina con agua y eluir con acetona.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende además la etapa de recolectar una primera porción de elución de acetona separada de una segunda porción de elución de acetona, en donde la primera porción de elución con acetona está entre el 15 % y el 25 % de la segunda porción de elución con acetona.

12. El método de la reivindicación 11, que realiza cromatografía de exclusión por tamaño.

13. El método de la reivindicación 12, en donde CH₂Ch se utiliza como eluyente isocrático.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

mezclar un segundo volumen de agua con el aceite de oliva que contiene S(-)-oleocantal reducido para formar otra mezcla de aceite de oliva/agua;

dejar reposar la otra mezcla de aceite de oliva/agua;

eliminar una fracción acuosa adicional de la mezcla de aceite de oliva/agua dejando un aceite de oliva que contiene S (-)-oleocantal reducido adicionalmente; y

añadir la fracción acuosa adicional a la fracción acuosa.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además las etapas de

mezclar un tercer volumen de agua con el aceite de oliva que contiene S(-)-oleocantal reducido adicionalmente para formar una mezcla adicional de aceite de oliva/agua;

dejar reposar la mezcla adicional de aceite de oliva/agua;

retirar otra fracción acuosa adicional de la mezcla adicional de aceite de oliva/agua dejando otro aceite de oliva que contiene S (-)-oleocantal reducido adicionalmente; y añadir la otra fracción acuosa adicional a la fracción acuosa.

16. El método de la reivindicación 2, que comprende además la etapa de congelación estable en nitrógeno del residuo seco de S (-)-oleocantal.