ES2950284T3 - Dispositivo fluídico - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para determinar la difusión de uno o más componentes, comprendiendo el método las etapas de (i) proporcionar un flujo de fluido componente que comprende uno o más componentes; (ii) proporcionar un flujo de fluido en blanco; (iii) poner el flujo (i) en contacto con el flujo (ii) en un canal de gran sección transversal, para generar de este modo dos flujos laminares; (iv) permitir que los flujos laminares generados en (iii) fluyan desde el canal de sección transversal grande hacia un canal de sección transversal pequeña; (v) medir la difusión lateral de uno o más componentes desde el flujo de componentes hacia el flujo de fluido en blanco en el canal de sección transversal pequeña. También se proporciona un método de difusión que comprende las etapas de medir la difusión lateral de uno o más componentes desde el flujo de componentes hacia el flujo de fluido blanco en una pluralidad de tiempos de difusión. También se proporciona un método para determinar la composición de un fluido que comprende una pluralidad de componentes (i) proporcionar uno o más perfiles de difusión medidos para el fluido que comprende la pluralidad de componentes; (ii) proporcionar una serie de distribuciones previstas para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos; y (iii) desconvolucionar los perfiles de difusión lateral medidos de uno o más componentes usando un enfoque de regularización de entropía más alta con referencia a la serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo fluídico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de difusión de flujo para analizar mezclas de componentes, tales como mezclas de polipéptidos.

Antecedentes

Muchos sistemas de importancia fundamental o tecnológica existen como mezclas polidispersas de componentes heterogéneos. La elucidación de las propiedades características de los componentes individuales en dichas mezclas es un problema crucial en campos que van desde la química analítica hasta la biofísica.

La medición del tamaño de partículas en mezclas heterogéneas de partículas es un problema común en campos que se extienden desde productos farmacéuticos, en donde las mediciones de tamaño diagnostican la solubilidad y pureza de los agentes terapéuticos, hasta pinturas, tintas y recubrimientos, para todos los cuales el tamaño de los componentes a nano y microescala tiene que ser controlado y monitorizado de cerca para asegurar la funcionalidad deseada.

Un campo en donde los tamaños de los componentes a nanoescala son particularmente cruciales y de gran importancia definitoria es el de la asociación y el autoensamblaje de proteínas; la gran mayoría de las proteínas cumplen su función biológica no como especies monoméricas sino como parte de complejos funcionales más grandes; si el ensamblaje de proteínas en dichos complejos no se produce de la manera deseada y se forman especies aberrantes, este ensamblaje anormal conduce con frecuencia a mal funcionamiento y enfermedad. Las técnicas biofísicas actuales comúnmente adoptadas para medir el tamaño de los polipéptidos funcionan mejor para preparaciones homogéneas de componentes purificados, mientras que el estudio cuantitativo de mezclas heterogéneas características de muchos sistemas biológicos sigue siendo un desafío.

Las técnicas actuales de dimensionamiento basadas en la difusión microfluídica [1] se han dirigido principalmente a encontrar el tamaño de una única especie en una solución homogénea [5] o medir la interacción entre dos especies discretas, normalmente utilizando especies marcadas con fluorescencia [8, 7, 3, 11, 12, 19]. También se han informado técnicas que no requieren el marcaje fluorescente de la muestra [4].

Por ejemplo, Yager et al. [11] describen un sensor T para uso en la medición óptica de la difusión molecular transversal en un microcanal. El sensor T tiene dos puertos de entrada a través de los cuales se proporcionan un fluido que contiene analito y un fluido tampón. Las dos corrientes de fluido se ponen en contacto en la unión en T y se les permite fluir lado a lado a lo largo de un canal de detección. El analito se difunde desde el fluido del analito hacia el fluido tampón a medida que los flujos avanzan a lo largo del canal. Los autores utilizan varias proteínas marcadas con fluorescencia como analitos de prueba, y la difusión de estas proteínas se detecta mediante microscopía de fluorescencia en una ubicación de medición en dirección descendente de la unión. Los métodos descritos se centran en el análisis de soluciones de analitos monodispersos.

Yager et al. indican que los valores del coeficiente de difusión calculados a partir de los datos de difusión experimental registrados incluyen un error que se relaciona con la suposición en los cálculos de que los fluidos tienen un perfil de velocidad completamente desarrollado a través de todo el canal de detección. Esta suposición no es correcta, como explican los autores. De hecho, se observa que la velocidad de los fluidos se acelera a lo largo del canal desde un punto de estancamiento en donde los fluidos se ponen en contacto por primera vez (una región de flujo cero en la unión) hasta la velocidad completamente desarrollada en un punto adicional en dirección descendente. Para compensar esta región de flujo de fluido más lento, los autores describen métodos computacionales para explicar y cuantificar el desarrollo del flujo. Según la propia admisión de los autores, las soluciones a los cálculos computacionales son toscas, son lentas de calcular (aprox. 1 día de tiempo computacional) y solo pueden dar una idea de la magnitud de los efectos de difusión en la llamada región de desarrollo de flujo. De ello se deduce que los coeficientes de difusión calculados a partir de los datos registrados no compensan adecuadamente el estancamiento de fluidos en la junctiori T

El documento US 2006/263903 describe el uso de una red de microcanales en forma de más (+) para determinar el peso molecular y la difusividad de un soluto de muestra. En el presente documento, un solo flujo de fluido de analito se pone en contacto con un solo flujo de fluido de blanco en un punto de cruce. Posteriormente, los flujos se separan, dejando cada flujo la zona de contacto en un canal de salida separado. La cantidad de analito que se ha difundido en el flujo de fluido en blanco en la zona de contacto se determina para un rango de diferentes caudales de analito y fluido en blanco. La difusividad y el peso molecular del analito se determinan mediante la comparación de los perfiles de difusión registrados con un conjunto de datos de perfil de difusividad generado a partir de la difusión de moléculas estándar. Los métodos descritos se centran en el análisis de soluciones de analitos monodispersos.

También se conocen en la técnica métodos fluídicos alternativos para la determinación de las características de difusión basados en la dispersión de Taylor de una especie en un canal de fluido. Por ejemplo, del documento US 2011/264380 describe métodos para determinar el radio hidrodinámico de una especie polidispersa. La especie que se va a analizar se mezcla con un estándar monodisperso. La mezcla resultante se agrega a un fluido portador que fluye a lo largo de un tubo capilar y se registra el perfil de Taylor de la mezcla a medida que sale del capilar.

Como en el documento US 2011/264380 indica, los métodos de dispersión de Taylor no son adecuados para uso con mezclas polidispersas, ya que los resultados obtenidos son simplemente una señal promedio que refleja las propiedades globales de la mezcla en lugar de las contribuciones individuales de cada componente en la mezcla. El documento US 2011/264380 aborda parcialmente este punto al utilizar un estándar interno dentro de una muestra polidispersa, cuyo estándar proporciona una contribución conocida a la señal promedio. Por ejemplo, cuando se analiza un producto de polímero polidisperso, puede estar presente un estándar interno que es un precursor de monómero. Luego se puede deducir la contribución de las especies polidispersas a la señal general y se puede determinar el radio hidrodinámico medio de las especies polidispersas. No obstante, este método solo puede proporcionar el radio hidrodinámico medio para una mezcla polidispersa. Más aún, los métodos basados en la dispersión de Taylor requieren una medición de la difusión resuelta en el tiempo, que normalmente tiene una sensibilidad más baja en comparación con los métodos de estado estacionario descritos por Yager et al. [11].

Costin et al. [4] informan sobre un esquema de detección basado en microchip para determinar el coeficiente de difusión y la masa molecular (en la medida en que se correlacione con el tamaño molecular) de los analitos de interés. El dispositivo funciona al medir simultáneamente el gradiente del índice de refracción (RIG) entre flujos laminares adyacentes en dos posiciones diferentes a lo largo de un microcanal.

Los presentes inventores han desarrollado métodos de análisis que tienen en cuenta los problemas de análisis de la difusión de componentes en canales de flujo.

Resumen de la invención

La presente invención generalmente proporciona un método para determinar el coeficiente de difusión de dos o más componentes. En particular, el método se puede utilizar para determinar el radio hidrodinámico de un componente, preferiblemente dos o más componentes, dentro de una mezcla. El presente método es particularmente adecuado para analizar mezclas de polímeros, tal como mezclas de proteínas.

El método de la presente invención se puede utilizar para determinar el coeficiente de difusión y el radio hidrodinámico de un componente con una precisión mejorada con respecto a los métodos existentes. En algunos aspectos, el método de la presente invención aborda el problema del estancamiento de fluidos en un microcanal y minimiza la región de desarrollo de flujo que se extiende desde el punto de estancamiento, permitiendo de este modo que se forme un flujo estable en un tiempo reducido.

El método de la invención permite medir la difusión de uno o más componentes en el tiempo. De esta forma, el método se puede utilizar para estudiar cambios en la composición de los fluidos, y más particularmente para estudiar la interacción de un componente con otro componente idéntico o con un componente diferente. Por ejemplo, la presente invención se puede utilizar para monitorizar la agregación de componentes en los fluidos, tal como la agregación de polipéptidos. Los cambios en los perfiles de difusión de una mezcla a lo largo del tiempo se pueden utilizar para seguir la generación y separación de agregados de componentes.

Una ventaja general adicional de utilizar métodos de difusión es la oportunidad de estudiar moléculas biológicas, tal como proteínas, en su estado nativo.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para determinar el coeficiente de difusión de dos o más componentes, el método comprende las etapas de:

(i) proporcionar un flujo de fluido de componente que comprende una pluralidad de componentes;

(ii) proporcionar un flujo de fluido en blanco;

(iii) poner el flujo (i) en contacto con el flujo (ii) en un canal, para generar de este modo dos flujos laminares;

(iv) medir la difusión lateral de los dos o más componentes desde el flujo de componente hacia el flujo de fluido en blanco en una pluralidad de tiempos de difusión para determinar el coeficiente de difusión de cada componente.

En una realización, el flujo de fluido de componente y el flujo de fluido en blanco son flujos acuosos.

En una realización, la difusión lateral se mide en tres o más tiempos de difusión.

En una realización, se proporcionan dos flujos en blanco en la etapa (ii), y los flujos en blanco se proporcionan a cada lado del flujo de componente en el canal de sección transversal grande, para generar de este modo tres flujos laminares en el canal de sección transversal grande en la etapa (iii).

También se puede proporcionar un dispositivo fluídico, que no forma parte de la invención reivindicada, para uso en el método mencionado anteriormente, el dispositivo comprende un canal de sección transversal grande en comunicación fluida con dos canales de suministro en dirección ascendente, y un canal de sección transversal pequeña en dirección descendente en comunicación fluida con el canal de sección transversal grande.

Los canales de suministro se pueden proporcionar para un flujo de fluido de componente y un flujo de fluido en blanco en el método del primer aspecto de la invención. El dispositivo fluídico está adaptado para uso con un dispositivo analítico para la detección de uno o más componentes en los flujos de fluido. El dispositivo analítico es para uso para en la medición de la difusión de uno o más componentes en un canal de sección transversal pequeña.

Cuando hay más de un componente presente en un fluido, los métodos descritos en el presente documento permiten determinar el coeficiente de difusión de cada componente, en lugar de un coeficiente de difusión promedio para la mezcla de componentes. La deconvolución de los perfiles de difusión registrados se puede lograr al registrar una pluralidad de perfiles de difusión en diferentes tiempos de difusión, lo que tiene la ventaja de reducir los niveles de ruido en los datos registrados.

La referencia a una pluralidad de tiempos de difusión es una referencia a las mediciones de difusión lateral registradas en diferentes posiciones a lo largo del canal de flujo. De este modo, un segundo punto de medición se puede ubicar en dirección descendente en el canal de un primer punto de medición. Se pueden ubicar puntos de medición adicionales en posiciones adicionales en dirección descendente en el canal.

En una realización, la etapa (i) en el método proporciona un flujo de fluido de componentes que comprende dos o más componentes. De este modo, la etapa (iv) comprende medir la difusión lateral de dos o más componentes desde el flujo de componente hacia el flujo de fluido en blanco en una pluralidad de tiempos de difusión.

En una realización, el flujo de fluido de componente y el flujo de fluido en blanco son flujos acuosos. En una realización, la etapa (ii) proporciona dos flujos de fluido en blanco, y los flujos de fluido en blanco se ponen en contacto con y se proporcionan a cada lado del flujo de fluido de componente, para generar de este modo tres flujos de fluido.

En una realización, se proporcionan dos flujos en blanco en la etapa (ii), y los flujos en blanco se proporcionan a cada lado del flujo de componente en el canal de sección transversal grande, para generar de este modo tres flujos laminares en el canal de sección transversal grande en la etapa (iii).

En una realización, el método comprende además la etapa (v) en la que se determina un valor de coeficiente de difusión para un componente a partir de las mediciones de difusión lateral de la etapa (iv), y opcionalmente se determina un radio hidrodinámico a partir de un valor de coeficiente de difusión.

En una realización, la etapa (v) incluye comparar los perfiles de difusión lateral medidos de uno o más componentes de la etapa (iv) con una serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos, para determinar de este modo los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes.

En una realización, la etapa (v) comprende deconvolucionar los perfiles de difusión lateral medidos del uno o más componentes de la etapa (iv) utilizando un enfoque de regularización de entropía más alta con referencia a una serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos o coeficientes de difusión conocidos, de este modo para determinar los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes. En esta realización, se puede utilizar un análisis de mínimos cuadrados. La serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos o coeficientes de difusión conocidos puede ser una serie de distribuciones previstas.

En una realización, el componente o componentes es un polímero.

En una realización, el polímero es o contiene un biopolímero seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos.

En una realización, se proporciona un método para determinar el coeficiente de difusión de uno o más componentes, cada uno de los cuales tiene un radio hidrodinámico en el rango de 0.5 a 200 nm.

En una realización, la difusión de uno o más componentes en la etapa (v) se determina mediante mediciones de fluorescencia.

Como ejemplo, que no forma parte de la invención, se puede proporcionar además un método para determinar la composición de un fluido que comprende una pluralidad de componentes, el método comprende las etapas de: (i) proporcionar uno o más perfiles de difusión medidos para el fluido que comprende la pluralidad de componentes;

(ii) proporcionar una serie de distribuciones previstas para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos; y

(iii) deconvolucionar los perfiles de difusión lateral medidos del uno o más componentes utilizando un enfoque de regularización de entropía más alta con referencia a la serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos, para determinar de este modo los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, el método para determinar la composición de un fluido proporciona un perfil de composición basado en los radios hidrodinámicos de cada componente del fluido.

Los perfiles de difusión medidos en la etapa (i) se pueden obtener u obtenerse mediante un método como el descrito anteriormente.

Como un ejemplo, que no forma parte de la invención, se puede proporcionar además un método para analizar un cambio en la composición de un fluido que comprende uno o más componentes, el método comprende la etapa de tomar una primera muestra en un primer tiempo del fluido y realizar un análisis de acuerdo con el primer o tercer aspecto de la invención, para determinar de este modo la composición del fluido en el primer tiempo; y tomar una segunda muestra del fluido en un segundo tiempo después de del primer tiempo, y realizar un análisis de acuerdo con el primer o tercer aspecto de la invención, para determinar de este modo la composición del fluido en el segundo tiempo.

El método puede incluir tomar muestras adicionales, tales como una tercera y una cuarta, en tiempos posteriores, y realizar un análisis de acuerdo con el primer o tercer aspectos.

El método permite detectar la generación de agregados de componentes y detectar la separación de componentes. Las tasas de reacción se pueden determinar a partir de los resultados.

Otros aspectos de la invención, y varias realizaciones de la invención, son como se describen en el presente documento.

Resumen de las figuras

La Figura 1a es una ilustración de una parte de un dispositivo fluídico de acuerdo con una realización de la invención en uso, con imágenes que muestran la distribución de un flujo de fluido de componente (en este caso, una mezcla de Albúmina de Suero Bovino y Beta Lactoglobulina en agua) en la boquilla, y las tres regiones de medición a 1 mm, 3 mm y 9 mm a lo largo del canal de medición (el canal de sección transversal pequeña). Los flujos en blanco (negro) se proporcionan a cada lado del flujo de componente (blanco).

La Figura 1b es un dibujo en plano de la ilustración de la Figura 1b.

La Figura 2 incluye gráficos que se relacionan con la calibración del dispositivo fluídico de la Figura 1 utilizando una mezcla 50:50 (0.1 % en volumen) de componentes marcados con fluorescencia (coloides) con radios de 25 nm y 100 nm. A: El espectro de tamaño generado por un análisis de mínimos cuadrados de los datos de distribución registrados con regularización de máxima entropía (espectro inferior), y se compara con los espectros de tamaño de soluciones homogéneas de cada uno de estos coloides (espectro superior y segundo desde la parte superior). En el presente documento también se muestra una comparación entre los espectros de tamaño generados a partir de los datos registrados en tres puntos de medición (espectro inferior) y un único punto de medición (segundo desde el espectro inferior). El uso de una pluralidad de puntos de medición proporciona espectros resueltos que tienen mayor precisión y mayor resolución. B: La distribución de la mezcla de componentes en los tres puntos de medición diferentes a 1 mm, 3 mm y 9 mm a lo largo del canal, así como los ajustes a estas distribuciones generados por el algoritmo de mínimos cuadrados.

La Figura 3 muestra la distribución de tamaños de los agregados de Ap(1-42) que crecen a partir del monómero durante 120 minutos. A: Intensidad de fluorescencia de ThT a lo largo del tiempo, se tomaron alícuotas de muestra a los 0 minutos, antes de cualquier agregación, a los 30 y 50 minutos, antes y durante la fase de crecimiento, y a los 120 minutos después de que se agotara el monómero. B: Las distribuciones de tamaño encontradas utilizando el ajuste de mínimos cuadrados con regularización de máxima entropía. La solución es inicialmente monomérica, antes de formar oligómeros, fibrillas y, finalmente, “grumos” de fibrillas macroscópicas.

La Figura 4 muestra la unión, el punto donde un flujo de fluido de componente (blanco) se encuentra con dos flujos de fluido en blanco (negro), en tres boquillas diferentes, o canales de sección transversal grande, con anchos desde la izquierda, 300 μm, 1000 μm y 3000 μm, en donde el ancho se refiere a la sección transversal más grande en la boquilla, que es diez veces más ancha que el ancho del flujo de fluido de componente en la unión (es decir, con anchos de 30 |jm, 100 |jm y 300 |jm). El canal de sección transversal grande permite establecer un flujo de componente limpio y definido, que tiene un tiempo de residencia reducido (estancamiento reducido) en la unión. El caudal es de 4 jiLh-1 y el componente es un coloide con un radio de 25 nm.

La Figura 5 muestra la estimación numérica de la resolución de la espectrometría de difusión microfluídica en donde (A) es el error fraccional en la posición de un solo pico al resolver una sola especie con niveles variables de ruido aleatorio, y (B) es la diferencia fraccional mínima entre dos especies antes de que se resuelvan en diferentes niveles de ruido aleatorio.

La Figura 6 muestra las distribuciones de tamaño, expresadas como radios hidrodinámicos, de A, Glucagón, B, Beta lactoglobulina y C, BSA, en soluciones homogéneas individuales y D, como una mezcla 1:1:1 de las tres especies. Las muestras se iluminaron a 365 nm utilizando una fuente de luz LED sobre un microscopio invertido y se detectaron con una cámara CCD de alto rendimiento cuántico. Las mediciones de la distribución en estado estacionario de una muestra tuvieron una duración de 10 s. El caudal total a la salida fue de 40 jiLh-1.

La Figura 7 muestra el radio hidrodinámico de BSA en solución en tampón de pH 7 y en DMSO al 80 %, según se determina a partir de un método de la presente invención.

La Figura 8 muestra (a) análisis SDS-PAGE de alfa B-cristalina purificada. La banda que corresponde a aproximadamente 20 kDa que se produce bajo condiciones de desnaturalización es consistente con la masa molecular esperada de 20,159 Da para la alfa B-cristalina puramente monomérica; y (b) análisis MALDI-MS de alfa B-cristalina no tratada y marcada con OPA. El desplazamiento m/z que se produce con el marcaje con OPA corresponde a aproximadamente 2,200 Da. Dado un aumento de masa de 176 Da por modificación de marca, los resultados confirman el marcaje completo de 11 aminas (10 aminas primarias y amina N-terminal) por molécula de alfa B-cristalina.

La Figura 9 muestra (a) los perfiles de difusión de alfa B-cristalina 30 jM en un aparato fluídico de la invención. Los datos experimentales (línea continua) y el ajuste asociado (línea discontinua) de la intensidad de fluorescencia frente a la posición del canal se representan para los datos de difusión en tres puntos de medición, a 1, 3 y 9 cm, en donde los perfiles desde arriba hasta abajo en la posición del canal de 90 jm corresponden a las mediciones del perfil de 1, 3 y 9 cm; y (b) la distribución de tamaños de alfa B-cristalina 30 jM . Las dos poblaciones representan alfa B-cristalina monomérica y oligomérica.

La Figura 10 muestra la distribución de tamaño de alfa B-cristalina 30 jM medida con DLS (líneas oscuras) y un dispositivo microfluídico del presente caso (líneas claras). La espectroscopía de difusión permitió la detección de una especie de tamaño pequeño (alrededor de 2 nm) así como especies oligoméricas (alrededor de 6 nm). DLS reveló exclusivamente un pico de distribución de tamaño amplio que reflejaba formas oligoméricas de alfa B-cristalina (centrada en alrededor de 8 nm).

La Figura 11 muestra (a) las trazas actuales de un experimento de translocación de proteínas utilizando alfa B-cristalina. Los experimentos se realizaron a un voltaje negativo de -500 mV utilizando un filtro Bessel de 50 kHz; y (b) un gráfico de dispersión bidimensional que muestra la relación entre la corriente media del evento y la duración del evento en el experimento de translocación. La frecuencia de los eventos está representada por el sombreado mostrado en la escala lateral.

La Figura 12 muestra la distribución de tamaños de alfa B-cristalina a concentraciones de proteína monomérica de (a) 15 jM , (b) 30 jM , (c) 50 jM y (d) 125 jM , como se mide mediante espectroscopía de difusión de acuerdo con la presente invención.

La Figura 13 muestra la distribución de tamaño de los liposomas medida por espectroscopía de difusión de acuerdo con la presente invención, en donde los liposomas tienen radios de extrusión de (a) 15 nm y (c) 50 nm y (e) una mezcla 1:1 de los dos. Cada perfil representa la difusión en diferentes puntos de medición a lo largo del canal de difusión (a 1, 3 y 9 cm, en donde los perfiles desde arriba hasta abajo en la posición del canal de 90 jm corresponden a las mediciones del perfil de 1, 3 y 9 cm). Para los tres puntos de medición, se representa el perfil de intensidad de fluorescencia a través del microcanal (línea discontinua) junto con el ajuste de mínimos cuadrados correspondiente (línea continua). Distribuciones de tamaño de liposomas con (b) radios de extrusión de 15 nm y (d) 50 nm, y (f) una mezcla 1:1 de los dos, según se mide con DLS (líneas oscuras) y difusión microfluídica (líneas claras). El pico en aproximadamente 4 nm corresponde a lípidos marcados libres. Solo las mediciones de espectroscopía de difusión identifican a esta especie.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para analizar la difusión de un componente de un flujo de fluido a otro flujo de fluido. Los presentes inventores han descubierto que los cambios en un dispositivo de flujo de unión en T estándar permiten medir la difusión del componente con mayor precisión. En particular, los inventores han encontrado una manera de minimizar o eliminar el estancamiento de fluidos cuando se ponen en contacto en la unión.

Como se describe en el presente documento, los inventores han encontrado que el uso de un canal de sección transversal grande en la unión en donde el componente y los flujos en blanco hacen contacto minimiza los efectos nocivos del estancamiento de fluidos en el análisis de difusión. Como se describe a continuación, el canal de sección transversal grande puede estar en la región de diez veces más ancho, por ejemplo, que el ancho del canal en dirección descendente en donde se realizan las mediciones de difusión. Los presentes inventores han establecido que un canal de sección transversal grande proporciona un flujo de componente limpio y definido en la unión. Por lo tanto, los presentes inventores han introducido un canal de sección transversal grande en un dispositivo fluídico para la medición de la difusión de componentes. En dirección descendente del canal de sección transversal grande hay un canal de sección transversal pequeña, que es el canal de detección.

Se considera que el uso de un canal de flujo de sección transversal grande proporciona una serie de beneficios. En primer lugar, la región donde se establece el flujo se acorta debido a la velocidad de flujo relativamente más baja para un caudal dado. En segundo lugar, una proporción más pequeña del componente entra en la región de flujo cero ya que disminuye el tamaño relativo de la unión al canal de flujo pequeño. En tercer lugar, el efecto neto de la difusión en relación con el ancho del canal, w, disminuye ya que la velocidad escala con 1/Vw, y por lo tanto la distancia de difusión con Vw.

El resultado de estos efectos es proporcionar una configuración inicial bien definida para los componentes en el flujo de componente, a medida que el flujo de componente y el flujo en blanco ingresan al canal de sección transversal pequeña. Por lo tanto, el uso de un canal de flujo grande es una forma efectiva de minimizar la difusión de partículas antes del establecimiento de un perfil de velocidad constante a lo largo del canal en dirección descendente, por ejemplo, en el canal de ancho pequeño, en donde se llevan a cabo las mediciones de difusión.

El método de la invención incluye la etapa de medir la difusión lateral de componentes desde un flujo de componente hacia un flujo en blanco vecino. A partir de estas mediciones, en última instancia, es posible determinar el coeficiente de difusión de un componente en la muestra. Si bien es posible determinar un coeficiente de difusión para un componente o una mezcla de componentes a partir de una única medición, los presentes inventores han descubierto que múltiples mediciones de difusión a lo largo de un canal de sección transversal pequeña proporcionan valores de coeficiente de difusión precisos.

Cuando el flujo de componente comprende dos o más componentes, la deconvolución de un único perfil de difusión es particularmente desafiante en vista de la casi degeneración en la transformada inversa con respecto a las combinaciones de coeficientes de difusión. Para lograr una resolución de los componentes individuales, se mide la dispersión difusiva de los componentes en el flujo en blanco en una pluralidad de ubicaciones, por ejemplo, en tres o más ubicaciones. Por lo tanto, cada medición corresponde a un tiempo de difusión diferente. El uso de una pluralidad de perfiles de difusión reduce la degeneración entre funciones de base. Los inventores han establecido que el uso de una pluralidad de puntos de medición proporciona espectros de tamaño resuelto que tienen una mayor precisión (es decir, el tamaño predicho de los componentes coincide más estrechamente con el tamaño real de los componentes en el fluido) y tienen una mayor resolución (por ejemplo, se puede diferenciar los componentes que tienen radios más cercanos).

Los métodos de flujo de la invención permiten medir la distribución espacial de los componentes simultáneamente en diferentes tiempos de difusión. De esta forma, es posible resolver completamente los espectros de las distribuciones de los coeficientes de difusión de los componentes individuales en mezclas complejas. Esto lleva a la presente invención más allá de los métodos descritos anteriormente, que han proporcionado sólo valores de coeficiente de difusión promedio para mezclas de componentes polidispersos.

Debido al uso de pequeños canales fluídicos, particularmente canales microfluídicos, se pueden analizar volúmenes de muestra muy pequeños. Por lo tanto, los componentes proporcionados en fluidos de menos de un microlitro de volumen se pueden analizar mediante los métodos descritos en el presente documento. Además, las técnicas de flujo de fluidos también se pueden utilizar para analizar muestras muy diluidas, mediante aumentos apropiados en los tiempos de medición.

Más aún, el enfoque de la espectrometría de difusión es en gran medida insensible a la naturaleza de las condiciones del solvente utilizado en los flujos. Por lo tanto, es posible estudiar moléculas biológicas, tal como proteínas, bajo sus condiciones nativas. De esta forma, las mediciones de difusión pueden proporcionar valores de tamaño absolutos para el componente biológico y no es necesario que el análisis incluya una etapa de calibración para convertir una medición de tamaño obtenida en condiciones externas a un tamaño esperado bajo condiciones naturales.

Se conocen microdispositivos que tienen canales de diferentes tamaños, sin embargo, dichos dispositivos no están adaptados para uso en la medición de la difusión de uno o más componentes a través de un canal. Los presentes inventores han encontrado que el desarrollo de un flujo laminar en un canal de sección transversal grande, seguido del paso del flujo laminar a un canal de sección transversal pequeña, proporciona un método mejorado para estudiar el movimiento de los componentes a través del flujo laminar.

El documento EP 1,481,723 describe un microdispositivo para uso en la mezcla y reacción de fluidos. El microdispositivo comprende una serie de conductos de suministro de fluido que están dispuestos en una construcción cilíndrica múltiple concéntrica. El fluido fluye dentro de los canales concéntricos del dispositivo, y se permite que estos flujos se unan en una ruta de flujo de reacción para formar un flujo laminar en forma de capa delgada. En dirección descendente, el ancho de la trayectoria del flujo de reacción se reduce para contraer el flujo.

El documento EP 1,481,723 no describe métodos para medir el movimiento de componentes entre flujos laminares, y no describe métodos para determinar el coeficiente de difusión de esos componentes. La disposición de los canales en el dispositivo del documento EP 1,481,723 es permitir la rápida difusión de todos los componentes desde un flujo hasta otro, con el objetivo de lograr una distribución homogénea de todos los componentes en poco tiempo. Se dice que esto es importante para evitar rutas de reacción no homogéneas. Dentro de un dispositivo para la medición de coeficientes de difusión, la difusión rápida de todas las especies no es deseable, ya que no permite la discriminación entre múltiples componentes de diferente tamaño (es decir, diferentes coeficientes de difusión). Más aún, la difusión rápida puede no permitir que se tome una medición de difusión antes de que un componente se haya difundido al borde del canal. La enseñanza del documento EP 1,481,723 por lo tanto, no es pertinente para el desarrollo de sistemas de medición de difusión mejorados.

Difusión

El desplazamiento cuadrático promedio exhibido por una partícula en movimiento browniano es directamente proporcional a su coeficiente de difusión D e inversamente proporcional a su radio hidrodinámico rh, la relación de Einstein que permite obtener estimaciones simples de tamaños moleculares a partir de desplazamientos cuadráticos medios. La situación es más compleja cuando una mezcla de especies está presente en solución, cada una con un coeficiente de difusión diferente.

Se puede considerar que la forma del perfil de difusión resultante contiene la información sobre el espectro completo de los radios hidrodinámicos de todas las especies presentes en solución como una superposición lineal. Sin embargo, la transformada inversa de dicho perfil en una suma de núcleos de Gauss-Weierstrass correspondientes a especies discretas es muy sensible al ruido experimental. En consecuencia, este enfoque generalmente no es práctico como base para mediciones en mezclas heterogéneas.

Para superar esta dificultad, los presentes inventores han desarrollado un enfoque que permite que el perfil de difusión resultante del movimiento browniano de los componentes del analito, inicialmente localizados en el espacio (dentro del flujo de fluido de componente), se mida simultáneamente durante múltiples tiempos de difusión a medida que se dispersan a través del canal de sección transversal pequeña en el flujo de fluido en blanco.

Un aspecto del presente caso se relaciona con el uso de un canal de sección transversal grande, que aborda el problema del flujo cero en la unión donde el flujo de componente y el flujo en blanco entran en contacto por primera vez. Una ventaja del canal de sección transversal grande es que obliga a los componentes a adoptar una configuración inicial bien definida. El posicionamiento preciso de los componentes de esta manera asegura que los datos de difusión registrados sean más representativos de un perfil de difusión previsto.

Un aspecto adicional del presente caso, que se puede combinar ventajosamente con el primer aspecto, es el uso de múltiples puntos de medición analíticos a lo largo de un canal de difusión. La medición de la difusión a diferentes tiempos de difusión reduce la degeneración entre las funciones de base y permite determinar los coeficientes de difusión con mayor precisión y certeza.

En un aspecto general del método de la invención, se permite que un componente se mueva desde el flujo de componente en el flujo de tampón en el canal de sección transversal pequeña. Esto se puede denominar movimiento lateral del componente a través de un canal.

En una realización, se permite que un componente se difunda desde el flujo de componente, un área de alta concentración de componentes, hacia el flujo de tampón y un área de baja concentración de componentes. En el presente documento, el movimiento del componente es simplemente transporte difusivo.

En una realización alternativa, el movimiento de un componente desde el flujo de componente hasta el flujo de tampón es una respuesta a un campo eléctrico aplicado. Por lo tanto, la difusión se puede denominar difusión electroforética del componente. El flujo de componente dentro del canal se desvía como respuesta al campo eléctrico aplicado. El grado de desviación está relacionado con el campo aplicado y la carga neta del componente. Se apreciará que los componentes que tienen diferentes cargas se pueden separar a través del canal por sus diferentes desviaciones en respuesta al campo aplicado. En esta realización, también es ventajoso minimizar la región de desarrollo del flujo, ya que esto minimiza el estancamiento del fluido. Con el conocimiento del campo aplicado y el grado de desviación (a partir del perfil de difusión electroforética), el experto es capaz de determinar la movilidad electroforética y la carga de los componentes en el fluido.

El uso general de técnicas de difusión electroforética en un dispositivo microfluídico se describen por Herling et al.

[37].

El método de la invención es adecuado para uso con otras técnicas que permiten el movimiento lateral de un componente a través del canal. Esto se puede denominar ampliamente como difusión. En una realización, la difusión se refiere al transporte por difusión descrito anteriormente.

Métodos generales

El método del primer aspecto de la invención generalmente busca determinar los coeficientes de difusión de uno o más componentes, tales como polímeros, en una solución. Un flujo de fluido que comprende el uno o más componentes se pone en contacto con un flujo de fluido en blanco en un canal de sección transversal grande. Se permite que los flujos laminares fluyan desde el canal de sección transversal grande hacia un canal de sección transversal pequeña. La difusión lateral de uno o más componentes en el flujo de fluido en blanco se mide en una o más ubicaciones a lo largo del canal de sección transversal pequeña. A partir de uno o más perfiles de difusión es posible determinar el coeficiente de difusión y el tamaño y/o peso molecular del uno o más componentes.

Los canales de sección transversal grande y sección transversal pequeña son partes de un dispositivo fluídico. El dispositivo fluídico está adaptado para uso con un detector para los componentes.

El caudal de cada flujo se mantiene a un nivel sustancialmente constante durante las etapas de análisis. El análisis se puede llevar a cabo solo cuando se establece un flujo estable en el canal de sección pequeña.

El método del tercer aspecto de la invención generalmente busca determinar los coeficientes de difusión de uno o más componentes, tales como polímeros, en una solución. Un flujo de fluido que comprende el uno o más componentes se pone en contacto con un flujo en blanco en un canal. La difusión de uno o más componentes se mide en una pluralidad de ubicaciones a lo largo del canal. A partir de la pluralidad de perfiles de difusión es posible determinar el coeficiente de difusión y el tamaño y/o peso molecular del uno o más componentes.

El canal es una parte de un dispositivo fluídico. El dispositivo fluídico está adaptado para uso con un detector de los componentes en una pluralidad de ubicaciones en el canal. El canal está en comunicación fluida con los canales de suministro para el flujo en blanco y el flujo de componente.

El caudal de cada flujo se mantiene a un nivel sustancialmente constante durante las etapas de análisis. El análisis se puede llevar a cabo solo cuando se establece un flujo estable en el canal.

En otros aspectos de la invención, se puede utilizar un dispositivo fluídico para determinar la concentración total de componentes en el fluido de componente. En el presente documento, la intensidad de la señal de difusión registrada (obtenida por los métodos descritos en el presente documento) se puede utilizar para obtener directamente una concentración total de los componentes. En algunas realizaciones, puede ser necesario proporcionar reactivos adicionales para permitir que se tomen lecturas de concentración precisas. Por ejemplo, cuando el fluido de componente comprende polipéptidos, puede ser beneficioso desnaturalizar los polipéptidos antes de la medición analítica. Se puede proporcionar un agente desnaturalizante, tal como DMSO, en el flujo de tampón para este propósito.

Otro aspecto busca monitorear los cambios (o no) en un componente, como la agregación y la separación, a lo largo del tiempo al tomar muestras de fluido que contiene ese componente y obtener los perfiles de difusión para cada muestra. Los cambios en los perfiles de difusión a lo largo del tiempo pueden ser indicativos de eventos de agregación o separación.

Dispositivo fluídico

El método del primer aspecto de la presente invención hace uso de un dispositivo fluídico que comprende un canal de sección transversal grande en comunicación fluida con un canal de sección transversal pequeña. La sección transversal de cada uno de los canales grande y pequeño está normalmente en el rango de micrómetros y, por lo tanto, el dispositivo fluídico para uso en el método del primer aspecto de la invención se puede denominar dispositivo microfluídico.

La presente invención también proporciona el dispositivo microfluídico como se describe en el presente documento.

El uso de canales microfluídicos para contener el componente y los flujos en blanco garantiza que los flujos tengan lugar con números de Reynolds bajos y, en consecuencia, la convección y la difusión son los únicos mecanismos relevantes de transporte de masa dentro del sistema. De acuerdo con lo anterior, esto permite realizar cálculos numéricos precisos para cada componente de un tamaño dado.

Las dimensiones generales de los canales en el dispositivo se seleccionan para proporcionar tasas de movilización y tiempos de análisis razonables. Las dimensiones del dispositivo también se pueden seleccionar para reducir la cantidad de fluido requerida para una ejecución de análisis suficiente.

Los canales de sección transversal grande y pequeña son aquellos canales que tienen dimensiones adecuadas que permiten al generación y mantenimiento de un flujo laminar de dos (o tres) corrientes en su interior. El flujo laminar de dos corrientes significa que los flujos están uno al lado del otro y son estables. Por lo tanto, normalmente no hay regiones en donde los fluidos recirculen y la turbulencia sea mínima. Normalmente, dichas condiciones las proporcionan pequeños canales, tales como los microcanales.

Los dispositivos para uso en mediciones dispersivas son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, por Yager et al. [11]. Los presentes inventores han introducido un canal de sección transversal grande en la unión de dichos dispositivos.

El canal de sección grande es la región en donde el flujo de la solución componente se pone en contacto con el flujo de la solución en blanco. Los flujos son luego dirigidos por el canal de sección transversal grande al canal de sección transversal pequeña. Es en el canal de sección transversal pequeña en donde se monitoriza la difusión del uno o más componentes en el flujo en blanco. El canal de sección transversal grande está en comunicación fluida con el canal de sección transversal pequeña.

El canal de sección transversal grande está en comunicación fluida con uno o más depósitos para el suministro de fluido en blanco.

El canal de sección transversal grande está en comunicación fluida con un depósito para el suministro del fluido de componente.

Se puede proporcionar fluido al canal de sección transversal grande desde un depósito mediante un canal de suministro. Por lo tanto, el dispositivo puede incluir un canal de suministro de flujo de fluido de componente y un canal de suministro de flujo de fluido en blanco.

Una referencia a un canal en el presente documento es una referencia a un canal que tiene una sección transversal sustancialmente rectangular. Por lo tanto, el canal puede estar formado por una base sustancialmente plana con paredes que se extienden sustancialmente verticalmente desde allí y, opcionalmente, una cubierta superior. Normalmente, la base y las paredes se forman en un sustrato de silicona. La cubierta puede ser una cubierta de vidrio, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio estándar o una oblea de borosilicato.

El canal de sección grande se puede denominar boquilla convergente.

El canal de sección transversal grande puede tener una región de ancho máximo sustancialmente constante seguida en dirección descendente por una región convergente en donde el ancho del canal se estrecha hasta que el ancho coincide con aquel del canal de sección transversal pequeña.

Alternativamente, el canal de sección transversal grande puede comprender solo una región convergente, en donde el ancho del canal se estrecha desde un ancho máximo hasta que el ancho coincida con el del canal de sección transversal pequeña.

La tasa a la que se estrecha la región convergente puede ser constante.

La tasa precisa a la que se estrecha la región convergente (el ángulo de la boquilla) no está particularmente limitada ya que el estrechamiento suele estar muy alejado del flujo de componente. Sin embargo, generalmente los presentes inventores han encontrado que las boquillas tienen un ángulo en el rango de 40° a 70°, tal como 50° a 70°, tal como 55° a 65°. En el presente documento, el ángulo es con respecto a la dirección de flujo de componente de flujo en el canal de sección transversal ancha.

Una referencia al ancho es una referencia a la dimensión de difusión en el canal (que se denomina como d en algunas referencias de la técnica anterior).

El ancho máximo, w, del canal de sección transversal grande es mayor que el ancho del canal de sección pequeña. En una realización, no hay ninguna sección en el canal de sección transversal grande que tenga un ancho menor que el ancho del canal de sección transversal pequeña. En una realización, el ancho mínimo del canal de sección transversal grande es la misma que el ancho del canal de sección transversal pequeña.

El ancho máximo, w, del canal de sección grande puede ser como máximo de 500 μm, como máximo de 700 μm, como máximo de 1,000 μm, como máximo de 2,000 μm, como máximo de 5,000 μm o como máximo de 1,0000 μm.

Generalmente, los anchos de canal de más de 10,000 |jm no son prácticos, ya que es probable que se combe el material del que está hecho el dispositivo, normalmente PDMS.

El ancho máximo, w, del canal de sección grande puede ser de al menos 50 jm , al menos 100 jm , al menos 200 jm o al menos 500 jm .

En una realización, el ancho máximo del canal de sección transversal grande puede estar en un rango seleccionado de los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, el ancho puede estar en el rango de 200 a 5.000 jm , tal como 200 a 1,000 jm , o tal como 1,000 a 5,000 jm .

La longitud del canal de sección grande es como de máximo de 500 jm , como máximo de 700 jm o como máximo de 1.000 jm

La longitud del canal de sección grande es de al menos 10 jm , al menos 50 jm , al menos 100 jm o al menos 200 jm . En una realización, la longitud del canal de sección transversal grande puede estar en un rango seleccionado de los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, la longitud puede estar en el rango de 50 a 500 jm , tal como de 100 a 500 jm .

Cuando el canal de sección transversal grande comprende una región de ancho máximo sustancialmente constante y una región en dirección descendente en donde el ancho converge con el ancho del canal de sección transversal pequeña, la región de ancho máximo sustancialmente constante puede ser al menos 50 %, al menos 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de la longitud total del canal de sección transversal grande.

El canal de sección pequeña tiene un ancho sustancialmente constante en toda su longitud.

El ancho del canal de sección pequeña puede ser como máximo de 500 jm , como máximo de 700 jm , como máximo de 1,000 jm o como máximo de 2,000 jm .

El ancho del canal de sección pequeña puede ser de al menos 5 jm , al menos 10 jm , al menos 50 jm , al menos 100 jm o al menos 200 jm .

En una realización, el ancho de la sección transversal pequeña puede estar en un rango seleccionado de los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, el ancho puede estar en el rango de 10 a 500 jm .

En una realización, el ancho máximo del canal de sección grande es al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces el ancho del canal de sección pequeña.

En una realización, el ancho máximo del canal de sección grande es como de máximo 20 veces, como máximo 50 veces, como máximo 100 veces el ancho del canal de sección pequeña.

En una realización, el ancho máximo del canal de sección transversal grande en relación con el canal de sección pequeña puede estar en un rango seleccionado desde los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, el ancho máximo del canal de sección transversal grande puede estar en el rango de 5 a 20 veces el ancho del canal de sección pequeña.

La longitud del canal de sección pequeña puede ser de una longitud adecuada para permitir la difusión del componente más grande en el flujo de componente hacia el borde del canal que forma la delimitación para el flujo en blanco. Por lo tanto, cuando los flujos de fluido han alcanzado el final del canal de sección pequeña, todos los componentes presentes en el flujo de componente han alcanzado la configuración entrópica máxima.

En otras realizaciones, el canal de sección pequeña tiene una longitud suficiente para permitir la detección del componente más grande en el flujo en blanco. En el presente documento no es necesario que el componente más grande haya alcanzado su configuración entrópica máxima.

La longitud del canal de sección grande es la distancia desde el punto en el que los flujos de fluido en blanco y componente entran en contacto hasta el punto en el que el ancho del canal de sección grande coincide con el del canal de sección pequeña.

El canal de sección pequeña recibe el flujo de fluido en blanco y de componente del canal de sección transversal grande. El fluido que sale del canal de sección transversal pequeña se puede recolectar para un análisis adicional. Por tanto, el canal de sección transversal pequeña está en comunicación fluida con un depósito de recolección de muestras.

La longitud del canal de sección pequeña es suficiente para permitir que las moléculas más grandes se difundan desde el flujo hacia el flujo en blanco. Para los polímeros que tienen los pesos moleculares descritos en el presente documento, generalmente son suficientes longitudes de canal de sección pequeña de 1 mm de longitud o más.

En una realización, el canal de sección pequeña tiene al menos 0.5 mm, al menos 1 mm, al menos 2 mm o al menos 5 mm de largo.

En una realización, el canal de sección pequeña tiene como máximo 10 mm, como máximo 20 mm o como máximo 50 mm de largo.

En una realización, la longitud del canal de sección pequeña puede estar en un rango seleccionado desde los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, la longitud del canal de sección pequeña puede estar en el rango de 0.5 a 50 mm, tal como de 1 a 20 mm.

El flujo de los fluidos es a lo largo del eje longitudinal del canal de sección transversal pequeña. La difusión de componentes en el flujo de componente hacia el flujo en blanco es transversal al eje longitudinal del flujo, a lo ancho del canal.

El canal de sección transversal pequeña puede ser sustancialmente recto y alineado con el canal de sección transversal grande. En algunas realizaciones, al menos una parte del canal de sección pequeña está convolucionado. De este modo, el canal de sección pequeña puede incluir un giro o una serie de giros, por ejemplo. El uso de una geometría convolucionada permite minimizar el tamaño del dispositivo. El uso de una ruta convolucionado también puede proporcionar múltiples canales de flujo dentro de una única zona de detección. En una única zona de detección, múltiples canales (que corresponden a diferentes distancias de flujo y, por lo tanto, diferentes tiempos de difusión) pueden pasar a través de un detector, lo que permite realizar mediciones múltiples y simultáneas.

El canal de sección transversal pequeña puede estar en combinación fluida con un canal fluido de un dispositivo fluídico secundario. El dispositivo fluídico secundario puede ser un dispositivo para analizar una propiedad física o química de los componentes en el flujo.

Por lo tanto, la presente invención se puede utilizar en línea con otros dispositivos fluídicos para obtener datos para la caracterización de los componentes en los flujos de fluidos.

El dispositivo microfluídico se puede proporcionar con canales de suministro que proporcionen una comunicación fluida entre el depósito y el canal de sección transversal grande. Cuando se van a proporcionar dos flujos en blanco en el canal de sección transversal grande, cada uno de los flujos en blanco se puede suministrar independientemente desde diferentes depósitos. Sin embargo, cada uno de los flujos de fluido en blanco se puede proporcionar desde un solo depósito que está vinculado al canal de sección transversal grande a través de dos canales de suministro.

Cada depósito puede ser una jeringa que está conectada a una línea de suministro del dispositivo microfluídico. La jeringa puede estar bajo el control de un ordenador adecuadamente programado que sea capaz de controlar indecentemente el caudal de fluido desde el depósito hasta el canal de sección grande. El control de dichos dispositivos es bien conocido en la técnica.

Alternativamente, cada depósito se puede proporcionar como parte del dispositivo microfluídico.

En otras realizaciones, el flujo de fluido desde uno o más depósitos puede ser alimentado por gravedad.

Un dispositivo fluídico de acuerdo con la presente invención y para uso en los métodos descritos en el presente documento se puede preparar utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Por lo tanto, la fotolitografía se puede utilizar para generar canales de fluidos y, opcionalmente, depósitos de fluidos, en un sustrato apropiado, tales como un sustrato de silicona. Las técnicas descritas en Yager et al. [11] se pueden utilizar con las adaptaciones apropiadas a la máscara fotolitográfica para acomodar la introducción de un canal de sección transversal grande y canales de flujo en blanco adicionales, cuando corresponda.

Los canales fluídicos preparados mediante técnicas fotolitográficas se pueden terminar al proporcionar puertos de acceso y salida fluidos, por ejemplo, al perforar en el sustrato para proporcionar acceso a los canales relevantes. Cuando se utilicen depósitos externos, tales como jeringas, para suministrar fluidos directamente al canal de sección transversal grande o a un canal de suministro, se puede utilizar un colector adecuado.

El dispositivo fluídico se puede utilizar en combinación con un ordenador adecuadamente programado y programable para controlar los flujos en el canal de sección transversal grande y para manejar el dispositivo de detección. El ordenador también puede analizar los datos registrados y proporcionar valores de difusión en tiempo real.

El dispositivo es adecuado para la integración con un detector para medir la difusión lateral de uno o más componentes en el canal de sección transversal pequeña.

La profundidad del canal se puede seleccionar para reducir la escala de tiempo para la difusión del analito a través del ancho del canal (para reducir de este modo el tiempo tomado para acercarse a la solución de estado estacionario). La profundidad del canal se puede seleccionar para minimizar o eliminar los artefactos que se asocian con los canales más profundos (véase Yager et al. Biophysical). La profundidad del canal se puede seleccionar para minimizar o eliminar los problemas de carga y la alta resistencia a los fluidos que se asocian con canales muy poco profundos (ibídem).

En algunas referencias de la técnica anterior, la altura o profundidad del canal se denomina como el ancho, w.

La relación de aspecto, la relación del ancho del canal con la altura del canal, puede ser de 100 o menos, 50 o menos, 25 o menos, o 10 o menos.

La relación de aspecto puede ser de 1 o más, 2 o más, 4 o más o 5 o más.

En una realización, la relación de aspecto puede estar en un rango seleccionado de los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, la relación de aspecto puede estar en el rango de 5 a 100.

En general, se prefieren relaciones de aspecto más grandes, tales como 4 o más, se prefieren como los perfiles de velocidad completamente desarrollados que serán parabólicos a través de la altura del canal y aproximadamente romos en el ancho del canal (véase Yager et al. Biophysical).

La altura del canal (o la profundidad del canal) del canal de sección grande y/o del canal de sección pequeña no está particularmente limitada, salvo por las consideraciones discutidas anteriormente. La altura del canal de los canales de sección transversal grande y pequeña puede ser la misma. La altura del canal es sustancialmente constante a lo largo de los canales de sección transversal grande y pequeña.

En una realización, la altura del canal es de al menos 5 μm, al menos 10 μm o al menos 15 μm.

En una realización, la altura del canal es como de máximo de 30 μm, como máximo de 50 μm, como máximo de 100 μm o como máximo de 500 μm.

En una realización, la altura del canal puede estar en un rango seleccionado de los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, la altura del canal puede estar en el rango de 10 a 50 μm.

Los canales conocidos de la técnica anterior suelen tener una profundidad en el rango de 10 a 100 μm (véase Yager et al. [8, 11 y 12]).

Como se indicó anteriormente, la profundidad del canal se puede seleccionar en relación con el ancho del canal para proporcionar una relación de aspecto adecuada.

No es necesario separar los flujos laminares entre sí para realizar el análisis analítico. La medición analítica se puede registrar a través de tanto el flujo de componente como el flujo en blanco.

El método del tercer aspecto de la presente invención hace uso de un dispositivo fluídico que comprende un canal en comunicación fluida con canales de suministro para el flujo en blanco y el flujo de componente. Las dimensiones del canal en este aspecto de la invención pueden corresponder a las dimensiones del canal de sección transversal pequeña en los métodos y dispositivos del primer y segundo aspectos de la invención.

El dispositivo de la invención puede incluir canales de suministro en combinación fluida con el canal de sección transversal grande. Las dimensiones de cada canal de suministro no están particularmente limitadas y pueden ser similares o iguales al canal de sección transversal pequeña. En una realización, cada canal de suministro tiene un ancho que es mayor que el ancho del canal de sección transversal pequeña. En una realización, cada canal de suministro tiene un ancho que es menor que el ancho del canal de sección transversal pequeña.

En una realización, los métodos del presente caso hacen uso de la difusión electroforética para permitir el movimiento de un componente a través del flujo de fluido, por ejemplo, desde el flujo de componente al flujo de tampón. Por ejemplo, el dispositivo fluídico se puede proporcionar con electrodos dispuestos adyacentes al canal de difusión (el canal de sección transversal pequeña) y los electrodos pueden estar adaptados para comunicación eléctrica con una fuente de alimentación y un controlador para controlar el voltaje y la corriente. Un aparato adecuado para dirigir el movimiento de los componentes en un canal de fluido se describe por Herling et al. [37].

Detección

Ciertos métodos de la invención incluyen la etapa de determinar la distribución de un componente o componentes a través de un canal fluídico. No existen restricciones particulares sobre la forma en que se mide la difusión de un polímero en el flujo en blanco, y el método de detección empleado se puede basar en la naturaleza del componente que se va a detectar.

El detector es uno que es adecuado para uso con canales de flujo de fluidos y, particularmente, canales microfluídicos. Los métodos de detección por difusión son bien conocidos en la técnica y, por ejemplo se describen por Yager et al.

[11]. Los ejemplos incluyen métodos espectroscópicos UV-vis, fluorescentes o luminiscentes, entre otros.

La distribución del componente o componentes se puede determinar en una ubicación en el canal de sección transversal pequeña. Sin embargo, particularmente cuando están presentes dos o más componentes, la distribución del componente se puede determinar en dos o más, tal como tres, cuatro o cinco, ubicaciones a lo largo del canal de sección transversal más pequeña. Como se indicó anteriormente, el método puede incluir la etapa de determinar el perfil de difusión de los componentes en una pluralidad de ubicaciones en el canal de ancho pequeño.

Se debe registrar al menos una medición de difusión antes de que un componente en el flujo de componente se haya difundido al borde del canal que es la delimitación del dispositivo al flujo de fluido en blanco. El componente que se difundirá más rápidamente hacia el borde del canal es el componente más pequeño en el flujo de componente. Para una muestra de composición desconocida, se puede establecer un flujo de prueba para determinar en qué punto el primer componente alcanza el borde de la delimitación. Por lo tanto, la primera medición de difusión se puede tomar en dirección ascendente de este punto.

Alternativamente, se puede realizar una primera medición de difusión en un punto muy temprano en el canal de sección transversal pequeña.

Cuando se realizan múltiples mediciones de difusión a lo largo del canal de sección transversal pequeña, la ubicación de cada una de la segunda y posterior ubicación a lo largo del canal no está particularmente limitada. Normalmente, las mediciones subsiguientes se toman a distancias suficientemente mayores a lo largo del canal de sección pequeña para dar perfiles de difusión de diferencia útil con respecto a las mediciones anteriores.

En los métodos de la presente invención, se establece un flujo laminar del flujo de componente y del flujo en blanco y se proporciona en el canal de sección transversal pequeña. Cuando se establece el flujo, se proporciona un gradiente de difusión a lo largo del canal de sección transversal pequeña. Por lo tanto, los datos para diferentes tiempos de difusión se pueden obtener simultáneamente al analizar el perfil de difusión en dos o más ubicaciones a lo largo del canal de sección transversal pequeña.

Los métodos de la presente invención no requieren la separación del flujo en blanco desde el flujo de componente. De este modo, el perfil de difusión de uno o más componentes se puede medir mientras el flujo de componente y el flujo del banco están en contacto.

Yager et al. [11] describen la medición del perfil de difusión en una única ubicación de medición en un canal que tiene un flujo de componente (con un único componente) y un flujo en blanco.

En el sistema fluídico del documento US 2006/263903, un flujo en blanco se desvía del flujo de componente después de un período de contacto en una región de canal transversal. En el punto de contacto, un componente en el flujo de componente se puede difundir en el flujo en blanco. Se analiza el flujo en blanco separado y se cuantifica la cantidad de componente. Para obtener un valor de coeficiente de difusión para el componente, es necesario tomar varias mediciones a lo largo del tiempo a una variedad de caudales diferentes para el flujo en blanco, el flujo de componente o ambos.

Antes del análisis, los componentes de interés se pueden marcar para permitir su detección en el método de la invención. La marca puede adoptar la forma de un grupo químico que es, por ejemplo detectable mediante espectroscopía estándar UV-vis, fluorescente o luminiscente.

Componente y flujo de componente

La presente invención se puede utilizar para determinar el coeficiente de difusión y, por lo tanto, el radio hidrodinámico de un componente. En una realización preferida de la invención, el componente es o comprende un polímero.

La presente invención se puede utilizar para determinar el coeficiente de difusión de un único componente, por ejemplo, en solución. Sin embargo, la presente invención se puede utilizar ventajosamente para determinar los coeficientes de difusión de dos o más componentes en un fluido.

Cada componente se puede disolver en el fluido. Sin embargo, la presente invención también se puede utilizar para estudiar componentes que se dispersan dentro de un fluido. De este modo, el fluido utilizado en el método puede ser coloidal y puede ser un sol o una emulsión, en donde el componente es la fase dispersa.

Los fluidos acuosos se utilizan normalmente en los métodos de la invención. El componente o componentes se pueden tomar en solución con el propósito de realizar el método de la invención. Los componentes pueden estar ya en solución y esta solución se puede utilizar directamente como el fluido. Alternativamente, dicha solución se puede concentrar o diluir según corresponda para un análisis óptimo. La solución también puede contener reactivos adicionales con el propósito de estabilizar los componentes en solución, por ejemplo, para mantener la integridad estructural del componente o para retener los componentes en solución. Por ejemplo, los componentes se pueden proporcionar en una solución tamponada.

El flujo de fluido acuoso puede estar a un pH adecuado para mantener la integridad de los componentes dentro del flujo. El pH puede estar en un rango de pH 4 a 10, tal como 5 a 9, tal como 6 a 8.

El pH puede ser un pH fisiológico.

Alternativamente, el pH de la mezcla acuosa se puede elegir para provocar cambios en la composición de la mezcla, tales como eventos de agregación y separación, que se pueden monitorizar utilizando los métodos de la invención.

Un flujo de fluido acuoso puede comprender adicionalmente un solvente orgánico miscible. Esto se puede proporcionar para retener los componentes en solución o suspensión. Por ejemplo, se puede utilizar DMSO junto con agua. El solvente orgánico puede estar presente hasta en un 25 %, hasta un 20 %, hasta un 10 %, hasta un 5 % o hasta un 1 % v/v.

La cantidad de componente requerida para realizar un análisis de acuerdo con el método de la invención no es grande y pueden pasar cantidades muy pequeñas de material a través del dispositivo microfluídico. También es posible recolectar el fluido que sale del canal de sección pequeña, y este se puede volver a analizar, por ejemplo, después de la concentración apropiada del flujo de fluido recolectado.

Una referencia a una mezcla de componentes es una referencia a una solución de dos o más componentes que tienen diferentes pesos moleculares y/o diferentes difusividades. La mezcla de componentes puede tener tres, cuatro, cinco o más componentes, cada uno con pesos moleculares diferentes y/o difusividades diferentes.

Una referencia a un componente puede ser una referencia a un polímero

Un polímero puede ser o comprender un polipéptido.

Las referencias a polipéptidos incluyen referencias a proteínas, anticuerpos

Un polímero puede ser o comprender un polisacárido.

Un polímero puede ser o comprender un polinucleótido.

En una realización, un componente puede comprender un polímero unido a otro compuesto. El otro componente puede ser un componente como se describe en el presente documento. En una realización, un componente puede comprender dos o más polímeros que se mantienen en agregación. Por ejemplo, el componente puede comprender dos o más polipéptidos. Como se describe en el presente documento, los presentes métodos se pueden utilizar para detectar la formación de agregados, tales como agregados de polipéptidos.

Cuando un componente comprende dos o más polímeros, los polímeros pueden mantenerse unidos mediante enlaces covalentes o enlaces no covalentes, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de enlaces covalentes entre polímeros pueden incluir enlaces éster, amida y disulfuro. Los ejemplos de enlaces no covalentes incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos e interacciones n-n, entre otros.

En una realización, el componente es una nanopartícula, por ejemplo, una partícula que tiene una dimensión mayor en el rango de 1 a 500 nm, tal como de 5 a 100 nm. La partícula puede ser una nanopartícula metálica. El metal puede ser o incluir oro o plata.

La presente invención es adecuada para determinar la difusividad de moléculas de polímero que tienen un peso molecular de 300 Da o más, 500 Da o más, 1000 Da (1 kDa) o más, o 2 kDa o más.

La presente invención es adecuada para determinar la difusividad de moléculas de polímero que tienen un peso molecular de 5 kDa o menos, 10 kDa o menos, 50 kDa menos o 100 kDa o menos.

La presente invención es adecuada para determinar los coeficientes de difusión de moléculas de polímeros que tienen radios de al menos 0.05 nm, al menos 0.1 nm, al menos 0.5 nm, al menos 1 nm o al menos 5 nm.

La presente invención es adecuada para determinar los coeficientes de difusión de moléculas de polímeros que tienen radios de como máximo 10 nm, como máximo 15 nm, como máximo 25 nm, como máximo 50 nm, como máximo 100 nm, o como máximo 200 nm, o como máximo 500 nm.

En particular, la presente invención es particularmente adecuada para determinar los coeficientes de difusión de biopolímeros, tales como polipéptidos que tienen radios en el rango de 0.5 a 500 nm, tal como 0.5 a 200 nm, como de 0.5 a 15 nm.

El método de la invención incluye la etapa de medir la difusión de los componentes en el flujo en blanco. Los componentes pueden detectarse utilizando técnicas analíticas estándar tales como espectroscopía fluorescente, espectroscopía luminiscente, espectroscopía UV-vis, entre otras. Cuando el componente es un polipéptido, por ejemplo, el polipéptido se puede detectar mediante espectroscopía fluorescente.

En algunas realizaciones, puede ser necesario marcar un componente para permitir que se detecte en el canal de sección pequeña. La marca es un átomo o grupo detectable analíticamente.

En una realización, la marca puede ser un marcador UV-vis, fluorescente o luminiscente que se adhiere covalentemente al componente. Dichas marcas se utilizan comúnmente con moléculas biológicas tales como polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos. Un ejemplo de una marca para utilizar en la presente invención es la fluoresceína. Las marcas que se utilizan en la presente invención normalmente son relativamente pequeñas en comparación con el componente al que están adheridas. Por lo tanto, la marca no altera sustancialmente las propiedades de difusión del componente.

Cuando sea apropiado, un componente puede tener una pluralidad de marcas para ayudar a la detección.

Una referencia a un componente puede considerarse como una referencia a un componente que tiene una marca analítica.

Una ventaja de la presente invención es que cada componente de un fluido de componente se puede marcar de forma idéntica. Los métodos de la invención son capaces de distinguir e identificar componentes en base al perfil de difusión del componente. No es necesario marcar los componentes de interés utilizando marcas separadas y distintas.

El caudal del flujo de componente se puede alterar independientemente del caudal del flujo en blanco.

El flujo de componente se puede generar a partir de una muestra de analito que contiene uno o más componentes. La muestra de analito se puede diluir o concentrar según corresponda para proporcionar un fluido de componente que sea adecuado para fluir a través de un dispositivo como se describe en el presente documento, y que sea adecuado para la detección.

Las concentraciones de los componentes en el fluido se pueden seleccionar para asegurar que los propios componentes no tengan efecto sobre la viscosidad del fluido. Las concentraciones de los componentes en el fluido se pueden seleccionar para asegurar que los componentes sean fácilmente detectables dentro del flujo de fluido.

En principio, la concentración máxima para uso en los métodos puede ser la concentración a la que el fluido se satura con los componentes.

Los inventores han encontrado que los fluidos que tienen una concentración de un componente tan bajo como 0.1 μM, por ejemplo tan baja como 0.5 μM, incluso tan baja como 1 μM, se pueden utilizar en los métodos de la invención. A estas concentraciones, es posible obtener perfiles de distribución significativos. A concentraciones más bajas, los componentes pueden ser difíciles de detectar en el canal de sección transversal pequeña y la relación señal a ruido puede ser pobre.

Por supuesto, es posible que no se conozca la composición precisa de la muestra de analito, y la generación del fluido se puede basaren una serie inicial de pruebas que se ejecutan para establecer las condiciones de uso. La preparación del fluido también se puede basar en un análisis preliminar de la muestra para proporcionar al menos una indicación aproximada de la concentración.

Fluido en blanco y Flujo de fluido en blanco

El método de la invención incluye la etapa de monitorizar la difusión de uno o más componentes desde un flujo de componente hacia un flujo en blanco.

En una realización, el fluido en blanco puede ser el mismo que el flujo de componente sin los componentes.

En una realización, el fluido en blanco es un tampón.

Normalmente, el flujo de fluido en blanco y el flujo de componente son flujos acuosos.

En una realización, el fluido en blanco puede comprender reactivos adicionales, en donde dichos reactivos son para la interacción con uno o más componentes en el fluido de componente. En algunas realizaciones de la invención, se proporciona un ensayo de unión para determinar una concentración de analito. En el presente documento, por ejemplo, la interacción de una concentración conocida de un reactivo en el flujo en blanco con un compañero del flujo de componente permite determinar la concentración del componente a partir de la fracción del componente unido al reactivo. Dichos métodos son particularmente adecuados para uso en donde el reactivo es un anticuerpo y el componente es un antígeno.

El caudal del flujo en blanco se puede alterar independientemente del caudal del flujo de componente.

En algunas realizaciones, se proporcionan dos flujos en blanco a cada lado del flujo de componente. Por lo tanto, el método de la invención puede contemplar la difusión de componentes en el componente en cualquiera o ambos de los flujos en blanco. El uso de dos flujos en blanco es ventajoso ya que se pueden utilizar para proporcionar una presión de equilibrio estable en todo el flujo de componente.

Normalmente, la composición de los dos flujos en blanco es idéntica. Normalmente, el caudal de los dos flujos en blanco es idéntico.

Análisis y determinación del coeficiente de difusión

La presente invención proporciona métodos para determinar el coeficiente de difusión de un componente o componentes en un fluido.

Cuando el fluido de componente contiene un componente monodisperso, es posible determinar el radio hidrofóbico del componente utilizando técnicas estándar. Dichas se describen, por ejemplo, por Yager et al. [8, 11 y 12]. El perfil de difusión registrado en el método del primer aspecto de la invención puede considerarse más representativo de la difusión del componente en vista del hecho de que el canal de sección transversal grande limita los efectos de estancamiento en la unión del dispositivo. De acuerdo con lo anterior, se puede considerar que el valor del coeficiente de difusión calculado y el radio hidrofóbico tienen mayor precisión.

Cuando el fluido de componente contiene una mezcla polidispersa de componentes, la presente invención proporciona un método para determinar los coeficientes de difusión de dos o más, o de cada componente en la mezcla. Esto contrasta con los métodos conocidos en la técnica que normalmente proporcionan solo un valor de difusión promedio para la mezcla global. En el método del tercer aspecto de la invención, se registra una pluralidad de mediciones de difusión durante diferentes tiempos de difusión.

Como se indica en el presente documento, los métodos de la invención proporcionan dos flujos de fluido laminares. Los métodos se realizan con números de Reynolds bajos, en donde la convección y la difusión son los únicos mecanismos relevantes de transporte de masa. Esto simplifica la simulación del movimiento de componentes dentro de un canal.

Generalmente, los espectros de difusión registrados se deconvolucionan con respecto a una serie de perfiles de difusión teóricos determinados para un rango de componentes que tienen radios hidrodinámicos (y por lo tanto coeficientes de difusión) a través del rango probable de radios para los componentes bajo investigación. La etapa de deconvolución ajusta los datos registrados al perfil global formado por la colección más probable de perfiles de difusión teóricos individuales. El ajuste se hace para la solución más simple consistente con el error experimental. En contexto, la referencia a la solución más simple es una referencia a una regularización de entropía más alta.

La deconvolución de los perfiles de difusión registrados se realiza en referencia a una función de base generada. La función base es una colección de perfiles de difusión teóricos en donde cada perfil teórico es para un componente que tiene un radio hidrodinámico particular. La colección se compone de perfiles para un rango de radios hidrodinámicos. Para muestras que contienen polipéptidos, por ejemplo, los perfiles abarcan el rango de radios probables para los componentes de polipéptido, tal como de 0.5 a 200 nm, como de 0.5 a 15 nm.

Se lleva a cabo un análisis de represión de los datos registrados, utilizando un ajuste de mínimos cuadrados, con una regularización de máxima entropía. En combinación con la función de base simulada, los perfiles espaciales registrados se pueden deconvolucionar en un espectro de perfiles de difusión individuales. Los métodos de deconvolución descritos anteriormente son ventajosos porque proporcionan la solución dentro del margen de error del mejor ajuste que contiene la menor información. Esto, a su vez, evita el llamado sobreajuste de los datos.

Más detalladamente, los presentes métodos permiten cálculos numéricos precisos para determinar núcleos para especies de tamaños dados. Los perfiles de difusión adquiridos en el experimento de flujo luego se ajustan globalmente a una superposición lineal de los núcleos predichos, en donde las amplitudes de cada núcleo se determinan a través de un ajuste de mínimos cuadrados restringido en donde los coeficientes se restringen al intervalo de 0 a 1 para garantizar su interpretación física como concentraciones fraccionarias. Los residuos en el ajuste proporcionan una estimación del error en la medición. Luego se realiza una segunda serie de ajustes por mínimos cuadrados, esta vez con regularización de máxima entropía. El término entrópico se incrementa gradualmente en magnitud hasta que el valor x2 del ajuste regularizado es diferente al del ajuste no regularizado por el nivel de error aleatorio. Los coeficientes para este ajuste final son entonces la solución más simple (mayor entropía) consistente con el error experimental.

Mientras que el ajuste de mínimos cuadrados proporciona una estimación del nivel de ruido en los datos experimentales, es útil tener una estimación de la precisión general de la técnica. En el presente documento, esto se obtiene al generar un gran conjunto de datos artificiales con niveles variables de ruido aleatorio agregado.

La Figura 5 describe las dos mediciones de precisión más relevantes, la precisión en la determinación del coeficiente de difusión de una sola especie y la diferencia mínima resoluble en el coeficiente de difusión entre dos especies discretas, para diferentes niveles de ruido aleatorio. Este método ignora cualquier error sistemático introducido, por ejemplo, durante la fabricación del dispositivo o por una iluminación desigual de la muestra.

El radio hidrodinámico de un componente se puede determinar a partir del coeficiente de difusión, como se conoce en la técnica.

Los perfiles de difusión también se pueden utilizar para determinar la concentración de componentes en el fluido de componente, como se conoce en la técnica.

Métodos de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar el coeficiente de difusión de un componente o de cada componente en una mezcla de componentes. El método se define en la reivindicación independiente 1.

Los métodos de la invención normalmente se realizan en flujos que tienen un número de Reynolds bajo. Por ejemplo, el número de Reynolds de un flujo puede ser 1 o menos, 0.5 o menos, 0.1 o menos, o 0.05 o menos.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, el caudal de fluido es al menos 1, al menos 5, al menos 10, al menos 50 o al menos 100 μLh-1.

En una realización, el caudal de fluido es como de máximo 200, como máximo 400, como máximo 500, como máximo 1,000, como máximo 2,000 o como máximo 5,000 μLh-1.

En una realización, el caudal es un valor seleccionado de un rango que tiene valores superior e inferior seleccionados de los valores anteriores. Por ejemplo, el caudal puede estar en el rango de 5 a 400 μLh-1.

El caudal de fluido es el caudal en estado estacionario.

El uso de dispositivos microfluídicos con caudales en el rango indicado anteriormente significa que se pueden utilizar cantidades relativamente pequeñas de fluido de componente en una serie analítica. Por ejemplo, los volúmenes en el rango son suficientes para establecer un flujo de estado estacionario en el canal de sección transversal pequeña con el propósito de obtener al menos una lectura del perfil de difusión.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, el volumen total de fluido utilizado en el flujo de fluido de componente es como de máximo 50, como máximo 100, como máximo 200, como máximo 500 o como máximo 1,000 μL.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, el volumen total de fluido utilizado en el flujo de fluido de componente es al menos 0.1, es al menos 0.5, es al menos 1, es al menos 5 o es al menos 10 μL.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, el volumen total de fluido utilizado en el flujo de fluido de componente es un valor seleccionado de un rango que tiene valores superior e inferior seleccionados de los valores anteriores. Por ejemplo, el volumen total puede estar en el rango de 1 a 50 μL.

Los métodos de la invención se pueden realizar a temperatura ambiente o alrededor de ella, por ejemplo, 15, 20 o 25 °C. Alternativamente, los métodos de la invención se pueden realizar a temperaturas más bajas, tales como 5 o 10 °C, o temperaturas más altas, tales como 35, 40 o 50 °C.

En una realización, la difusión lateral del uno o más componentes desde el flujo de componente hacia el flujo de fluido en blanco se mide en una pluralidad de tiempos de difusión. La separación entre los puntos de medición no está particularmente limitada, pero puede ser de una distancia suficiente para que los perfiles de difusión registrados hayan cambiado notablemente entre los puntos de medición.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, el método comprende repetir las etapas (i) a (v) después de un período de tiempo, para analizar así la composición de un fluido de componente a lo largo del tiempo. En esta realización, el método se puede utilizar para monitorizar un cambio en el fluido de componente, tal como la agregación de los componentes, o la separación de un componente, que puede ser una agregación, en partes más pequeñas. En el presente documento se describe un método para analizar la agregación de proteínas amiloides.

En una realización, el método comprende además la etapa (vi) en donde se determina un valor de coeficiente de difusión para un componente a partir de las mediciones de difusión lateral de la etapa (v), y opcionalmente se determina un radio hidrodinámico a partir de un valor de coeficiente de difusión.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, la etapa (vi) incluye comparar los perfiles de difusión lateral medidos de uno o más componentes de la etapa (v) con una serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos, para determinar de este modo los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, la etapa (vi) comprende deconvolucionar los perfiles de difusión lateral medidos de uno o más componentes de la etapa (v) utilizando un enfoque de regularización de entropía más alta con referencia a una serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos., para determinar de este modo los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes. En esta realización, se puede utilizar un análisis de mínimos cuadrados. La serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos puede ser una serie de distribuciones previstas.

En un ejemplo alternativo, que no forma parte de la invención, se proporciona un método para determinar el coeficiente de difusión de uno o más componentes, el método comprende las etapas de:

(i) proporcionar un flujo de fluido de componente que comprende uno o más componentes;

(ii) proporcionar un flujo de fluido en blanco;

(iii) poner el flujo (i) en contacto con el flujo (ii) en un canal, para generar de este modo dos flujos laminares;

(iv) medir la difusión lateral de uno o más componentes desde el flujo de componente hacia el flujo de fluido en blanco en una pluralidad de tiempos de difusión.

La separación entre los puntos de medición no está particularmente limitada, pero puede ser de una distancia suficiente para que los perfiles de difusión registrados hayan cambiado notablemente entre los puntos de medición.

Los caudales, volúmenes y temperaturas discutidos anteriormente también son aplicables a este método.

En un ejemplo, que no forma parte de la invención, las características del primer y tercer aspecto de la invención se pueden combinar ventajosamente para proporcionar un método para analizar un fluido de componente con precisión mejorada. Por lo tanto, el método puede comprender las etapas de:

(i) proporcionar un flujo de fluido de componente que comprende uno o más componentes;

(ii) proporcionar un flujo de fluido en blanco;

(iii) poner el flujo (i) en contacto con el flujo (ii) en un canal de sección transversal grande, generando de este modo dos flujos laminares;

(iv) permitir que los flujos laminares generados en (iii) fluyan desde el canal de sección transversal grande hacia un canal de sección transversal pequeña,

(v) medir la difusión lateral de uno o más componentes desde el flujo de componente hacia el flujo de fluido en blanco en una pluralidad de tiempos de difusión.

Por lo tanto, se pueden combinar las ventajas de utilizar un canal de sección transversal grande y las ventajas de registrar una pluralidad de perfiles de difusión.

Otras preferencias

Todas y cada una de las combinaciones compatibles de las realizaciones descritas anteriormente se divulgan explícitamente en el presente documento, como si todas y cada una de las combinaciones se enumeraran de forma individual y explícita.

Diversos aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención resultarán evidentes para aquellos expertos en la técnica a la vista de la presente divulgación.

“y/o” cuando se utiliza en el presente documento debe tomarse como una descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, “A y/o B” se debe tomar como divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se estableciera individualmente en el presente documento.

A menos que el contexto indique lo contrario, las descripciones y definiciones de las características establecidas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención y se aplican por igual a todos los aspectos y realizaciones que se describen.

Ciertos aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.

Experimental

Los canales microfluídicos se fabricaron utilizando técnicas estándar de litografía blanda [20, 14] en polidimetilsiloxano (PDMS; Dow Corning) con fotoprotector SU-8 en patrones de silicio. Los canales se unieron con plasma a portaobjetos de vidrio para crear dispositivos sellados. La altura del canal era de 25 μm. El ancho del canal variaba a través de las diferentes regiones del dispositivo, en el canal de sección transversal pequeña, el ancho fue de 300 μm, contrayéndose desde 3,000 μm en la boquilla (el canal de sección transversal grande). Los canales que introducían fluido tampón (blanco) y fluido analito en la boquilla tenían 100 μm de ancho. El dispositivo utilizado en los experimentos descritos en el presente documento se muestra en la Figura 1a y 1b. Detalles adicionales de preparación también se describen a continuación.

Se utilizaron bombas de jeringa (Harvard Apparatus) para controlar el flujo de fluido.

Los coloides de 25 nm y 100 nm utilizados en el presente caso eran coloides de poliestireno de Sigma Aldrich que se suministraron premarcados con fluoresceína. Los coloides se proporcionaron en agua desionizada. El caudal utilizado fue normalmente de 4 μl/h.

Las proteínas para uso en el presente caso fueron glucagón, beta-lactoglobulina y albúmina de suero bovino, todas disponibles de Sigma Aldrich. Las proteínas se marcaron con fluorescencia. Las proteínas se proporcionaron en tampón de fosfato 50 mM con DMSo al 20 % a pH 8. El caudal utilizado en los experimentos con proteínas fue normalmente de 40 μL/h.

La difusión de los componentes en el canal se midió mediante detección fluorescente a través del canal utilizando técnicas estándar (véase también Yager et al. [11] et al.). El tiempo de exposición fue normalmente de 10 s.

Se clonó Ap(1-42) en el plásmido “PetSacKan”, se expresó de forma recombinante en células BL21 de E. Coli y se purificó en modo discontinuo mediante cromatografía de intercambio aniónico. Este procedimiento permite la producción de grandes cantidades de péptidos de gran pureza [18]. El péptido resultante se dividió en alícuotas de 1 ml, se liofilizó y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

La aplicación de la espectrometría de difusión al estudio de procesos complejos de asociación de proteínas como aquellos descritos en el presente documento se basa en nuestro uso de una técnica de marcaje covalente no perturbativo recientemente informada en detalle. Dado que la principal ventaja de la espectrometría de difusión es su capacidad para obtener el espectro de tamaños de partículas en una mezcla heterogénea, al decidir sobre una técnica de marcaje que permita la visualización del flujo difusivo bajo observación, el marcaje covalente fluorescente es el método óptimo. El marcaje fluorescente facilita la recolección conveniente de imágenes de alta relación señal-ruido con una configuración de microscopía óptica de rutina. El marcaje covalente asegura que todas las especies dentro de la mezcla heterogénea estén marcadas y, por lo tanto, puedan ser detectadas. Históricamente, el marcaje fluorescente covalente de complejos de proteínas ha sido un desafío. Si los complejos de proteínas preformados se marcan con un tinte fluorescente, el tinte no unido se debe eliminar de la mezcla de reacción antes del análisis y las etapas de purificación necesarios alteran la estructura de las especies asociadas formadas transitoriamente.

Alternativamente, las proteínas individuales se pueden marcar y purificar a partir del colorante no unido antes de su asociación, pero incluso la instalación específica del sitio de un indicador fluorescente interrumpe la asociación compleja en mayor o menor grado. En el presente documento, marcamos complejos de proteínas preformadas con un fluoróforo latente. Debido a que solo las proteínas marcadas y los complejos de proteínas son fluorescentes, no se requieren etapas de purificación y la mezcla heterogénea de especies marcadas con fluorescencia se analiza directamente con espectrometría de difusión.

A pH alcalino, y en presencia de un tiol (en el presente documento, p-mercaptoetanol, BME), las aminas primarias expuestas sobre la superficie de las proteínas y los complejos de proteínas reaccionan con el o-ftalaldehído (OPA) para formar un fluoróforo bicíclico de tipo isoindol en situ [15, 16]. Aunque inicialmente se observó la rápida cinética de este proceso [2], su aplicación al análisis de mezclas de proteínas se ha limitado generalmente a los esfuerzos destinados a la derivatización de péptidos post o precolumna [13, 17], o la detección cuantitativa de pequeñas cantidades de aminoácidos dentro del tejido biológico [21, 6].

Dispositivo de ejemplo de la invención

Las Figuras 1a y 1b son ilustraciones de un dispositivo microfluídico de acuerdo con una realización de la invención. La Figura 1a es una representación en 3D de un dispositivo en uso, que tiene un flujo de fluido de componente y flujos de fluido en blanco, con imágenes insertadas de la distribución del analito en la boquilla, así como tres puntos de medición, a 1 mm, 3 mm y 9 mm desde el inicio del canal de sección transversal pequeña como se describe a continuación. La Figura 1b es una vista en plano del dispositivo.

La Figura 1a muestra la difusión de una mezcla de albúmina de suero bovino y beta lactoglobulina en el canal de sección transversal pequeña.

Un dispositivo 1 para uso en la presente invención puede incluir un canal 2 de suministro de flujo de fluido de componente que entra en contacto con un canal 3a de suministro de flujo de fluido en blanco en una unión dentro de una boquilla, que es un canal 4 de sección transversal grande. En realizaciones preferidas, se proporcionan dos canales 3a y 3b de suministro de flujo de fluido en blanco, como se muestra en la Figura 1b. El canal 2 de suministro de flujo de fluido de componente puede estar en comunicación fluida con un depósito 5 de fluido de componente en dirección ascendente, que puede incluir o ser parte de una jeringa controlable (no mostrada). Cada canal 3a y 3b de suministro de flujo de fluido en blanco puede estar en comunicación fluida con un depósito 6 de fluido en blanco en dirección ascendente, que puede incluir o ser parte de una jeringa controlable (no mostrada). Un depósito 6 puede suministrar dos canales 3a y 3b de flujo de fluido en blanco.

En dirección descendente y en comunicación fluida con el canal de sección transversal grande hay un canal 7 de sección transversal pequeña. El canal 7 de sección transversal pequeña puede tener una ruta serpenteante (convolucionada), como se muestra en la Figura 1b. El canal 7 de sección transversal pequeña está adaptado para uso con un detector analítico (no mostrado) que se puede disponer para analizar componentes en un fluido presente en el canal en uno o más ubicaciones a lo largo del canal 7 de sección transversal pequeña. El detector analítico se puede configurar para detectar simultáneamente componentes en un fluido a través de dos o más secciones del canal de sección transversal pequeña, como se muestra ilustrativamente por la zona 8 de detección. El canal de sección transversal pequeña puede estar en comunicación fluida con un depósito 9 de recolección en dirección descendente.

El canal 4 de sección transversal grande normalmente tiene una sección transversal que es diez veces mayor que la del canal 7 de sección transversal pequeña. Por lo tanto, en la Figura 1a, las imágenes insertadas muestran que el ancho del canal 7 de sección transversal pequeña es de 300 μm (esto es evidente en la imagen de 9 mm, en donde el componente se ha difundido hacia el borde del flujo de fluido en blanco, en donde el fluido entra en contacto con la pared del canal). El canal 4 de sección transversal grande tiene un ancho mayor de 3,000 μm.

El canal 4 de sección transversal grande tiene una región de ancho constante que se extiende desde la unión. Luego, el canal se estrecha (en un ángulo de aproximadamente 60° con respecto a la dirección del flujo de fluido) hasta que el canal tiene el ancho del canal 7 de sección transversal pequeña. La longitud del canal 7 de sección transversal grande desde la unión (en donde se unen el canal de suministro de fluido de componente y los canales de suministro de fluido en blanco) hasta el inicio del canal 7 de sección transversal pequeña puede ser de alrededor de 100 μm.

El ancho del canal 7 de sección transversal pequeña permanece sustancialmente constante a lo largo de su ruta. La longitud del canal 7 de sección transversal pequeña, comenzando desde el punto en donde el canal 4 de sección transversal grande termina en el depósito 9, puede estar en la región de 10 mm.

El dispositivo de la invención se utiliza para analizar los radios de un componente tal como un polipéptido, y preferiblemente los radios individuales de los componentes, en un fluido. El fluido de componente se proporciona como un flujo en un dispositivo fluídico y se mide la difusión de cada componente en el flujo de fluido en un flujo de fluido en blanco vecino. El fluido en blanco es un fluido que carece del componente.

El dispositivo 1 fluídico se puede preparar utilizando técnicas estándar de litografía blanda utilizando, por ejemplo, polidimetilsiloxano como material base. Se pueden preparar fotoprotectores adecuados de acuerdo con la forma y las dimensiones deseadas de los canales y depósitos de flujo de fluido.

En uso, se proporciona un fluido de componente en el depósito 5 y se le permite fluir a través del canal 2 de suministro de fluido de componente al canal 4 de sección transversal grande, en donde entra en contacto con flujos de fluido en blanco. Los fluidos en blanco se proporcionan en el depósito 6 y se le permite fluir a través de los canales componente 3a y 3b de suministro de fluido de al canal 4 de sección transversal grande. El caudal se puede controlar mediante bombas de jeringa que suministran los canales 2, 3a y 3b de suministro. Alternativamente, el flujo es una alimentación por gravedad del fluido desde los depósitos 5 y 6.

El flujo de fluido de componente y los flujos de fluido en blanco entran en contacto en el canal 4 de sección transversal grande y formar un flujo laminar del flujo de fluido de componente entre los flujos de fluido en blanco. Se permite que los flujos fluyan en dirección descendente hacia el canal 7 de sección transversal pequeña desde el canal 4 de sección transversal grande. Se permite que los componentes dentro del flujo de fluido de componente se difundan desde el flujo de fluido de componente hacia los flujos de fluido en blanco. La difusión de los componentes se puede medir en una o más ubicaciones a lo largo del canal 7 de sección transversal pequeña, por ejemplo en la zona 8 de detección. Normalmente, la primera medición se toma antes de que un componente (como el componente más pequeño) haya alcanzado el borde del flujo de fluido en blanco, donde el fluido entra en contacto con la pared del canal. Una vez que se realiza el número apropiado de mediciones de difusión, los flujos de fluido se pueden recolectar en un depósito 9, 0 se puede permitir que fluya hacia un segundo dispositivo analítico, que está en comunicación fluida con el dispositivo 1 de fluido. Los perfiles de difusión a lo largo del canal 7 de sección transversal pequeña se muestran en la Figura 1a, en donde se ve que los componentes blancos se difunden en el flujo de fluido en blanco más oscuro.

Los inventores han establecido que el uso de un canal de sección transversal grande en un dispositivo fluídi detectar la difusión de componentes proporciona ciertos beneficios que permiten determinar con mayor precisión los radios de los componentes en un fluido. El uso del dispositivo da como resultado una configuración inicial bien definida para los componentes en el flujo de componente desde el punto en donde el flujo de componente y el flujo en blanco ingresan al canal 7 de ancho pequeño. El uso de un canal 4 de flujo grande minimiza la difusión de componentes antes del establecimiento de un perfil de velocidad constante a través del canal en dirección descendente, por ejemplo, en el canal 7 de sección transversal pequeña, en donde se llevan a cabo las mediciones de difusión.

La Figura 4 muestra que el uso de un canal de sección transversal grande, diez veces más ancho que el canal de sección transversal pequeña, da como resultado un flujo de componente limpio y definido. En la Figura 4, se muestran tres imágenes de un flujo de fluido de componente (blanco) que ingresa a un canal de sección transversal grande desde un canal de suministro de fluido de componente. El flujo de fluido de componente en el canal de sección transversal grande parece estar relativamente limpio y definido desde el punto en el que el fluido de componente entra en contacto por primera vez con el flujo de fluido en blanco (gris).

A continuación se muestra un ejemplo práctico que describe la preparación del dispositivo microfluídico de las Figuras 1a y 1b en los experimentos de Alfa-B Cristalina.

Análisis de la mezcla multicomponente

Se analizó una mezcla acuosa que comprendía cantidades iguales (0.02 % en volumen) de coloides de 25 nm y 100 nm utilizando el dispositivo microfluídico descrito anteriormente. También se prepararon soluciones individuales de cada uno de los coloides. Las soluciones se hicieron fluir a través del dispositivo a 40 μLh'1, e iluminado a 480 nm utilizando una fuente de luz LED. Se tomaron tres exposiciones de 10 s utilizando una cámara CCD de alto rendimiento cuántico, una en cada uno de los tres puntos de medición.

El perfil de difusión se midió en tres tiempos de difusión diferentes a 1 mm, 3 mm y 9 mm desde el inicio del canal de sección transversal pequeña (véase la Figura 2, gráfico inferior). La combinación de perfiles de difusión se deconvolucionó utilizando un enfoque de regularización de entropía más alta como se describe en el presente documento, para mostrar la presencia de los dos componentes que tienen diferentes radios hidrodinámicos (Figura 2, espectro inferior), que coincidieron muy de cerca con los valores derivados experimentalmente determinados para los coloides individuales (superior y segundo desde los espectros superiores). A modo de comparación, se realizó una deconvolución de un único perfil de difusión (segundo desde el espectro inferior). Como se puede ver, esta deconvolución sugirió erróneamente la presencia de tres componentes diferentes en la mezcla, en donde el componente que tenía un radio más pequeño se resolvió como dos señales separadas. Más aún, el componente que tenía un radio mayor se resolvió como una señal que tenía un radio mayor. Por lo tanto, el uso de múltiples puntos de medición proporciona una mayor precisión y una mayor resolución en la deconvolución de los perfiles de difusión.

Las técnicas de difusión microfluídica también se pueden utilizar para resolver mezclas de proteínas de múltiples componentes. Se realizó una segunda calibración sobre una mezcla de las proteínas glucagón, beta-lactoglobulina y albúmina de suero bovino (BSA). Cada proteína se preparó como una solución homogénea en tampón de fosfato que contenía DMSO al 20 %, así como una mezcla 1:1:1 (en masa) de las tres proteínas. Se utilizó DMSo para garantizar que todas las proteínas permanecieran en el estado monomérico durante el experimento y que no se formaran complejos desconocidos.

Las tres proteínas se marcaron con fluorescencia. En el presente documento, los complejos de proteínas preformados se marcaron con un fluoróforo latente, es decir, uno que es fluorescente solo cuando se une y no se detecta si está libre en solución. Debido a que solo las proteínas marcadas y los complejos de proteínas son fluorescentes, no se requieren etapas de purificación y la mezcla heterogénea de especies marcadas con fluorescencia se puede analizar directamente con espectrometría de difusión. A pH alcalino, y en presencia de un tiol (en el presente documento, pmercaptoetanol, BME), las aminas primarias expuestas sobre la superficie de las proteínas y los complejos de proteínas reaccionan con el o-ftalaldehído (OPA) para formar un fluoróforo bicíclico de tipo isoindol in situ.

Los experimentos de difusión se realizaron de la misma manera como anteriormente. La longitud de onda de iluminación utilizada en los experimentos fue de 365 nm. La Figura 6 muestra los resultados de la medición de difusión sobre las soluciones de prueba individual y combinada. Tres especies se resuelven en la mezcla en tamaños similares a los de las soluciones homogéneas, aunque los picos correspondientes a beta lactoglobulina y albúmina de suero bovino se desplazan ligeramente más juntos. Es probable que esto sea un efecto de los errores aleatorios y sistemáticos en el experimento, y estos dos picos se acercan al poder de resolución del experimento de difusión microfluídica a este nivel de señal-ruido.

Análisis de BSA

Al caracterizar soluciones monodispersas tales como proteínas únicas, las técnicas de difusión microfluídica tienen el potencial de ser extremadamente precisas. Como demostración, se utilizó difusión microfluídica para estudiar el cambio en el radio hidrodinámico de la proteína albúmina de suero bovino (BSA) disuelta en tampón de pH 7 y disuelta en el mismo tampón con DMSO al 80 %. Se disolvió BSA a 5 mg/ml en tampón de fosfato de pH 7 (por ejemplo, tampón HEPES 5 mM), antes de marcar con OPA en presencia de p-mercapto etanol (BME). La mezcla de marcaje estándar fue una solución de OPA 12 mM, BME 18 mM, SDS al 4 % y carbonato 200 mM a un pH en el rango de 9.5­ 10.5. La solución se preparó previamente y se mezcló en una relación de volumen de 1:1 con la solución de proteínas.

A continuación, esta solución madre de BSA marcada se diluyó a 1 mg/ml en el mismo tampón y en DMSO (con una concentración final de DMSO del 80 % en volumen). El radio hidrodinámico de BSA en cada una de las soluciones (tampón y DMSO al 80 %) se midió utilizando técnicas experimentales idénticas a aquellas para la mezcla multicomponente detallada anteriormente.

La Figura 7 muestra los coeficientes de difusión calculados para cada una de las soluciones de BSA. El coeficiente de difusión de la BSA en tampón acuoso corresponde a un radio hidrodinámico de 3.5 nm, comparable con los valores de la literatura. En DMSO al 80 %, la proteína se despliega dramáticamente, con un radio hidrodinámico de 6 ± 0.5 nm.

Análisis de eventos de agregación de insulina

Los métodos de la invención se pueden utilizar para estudiar la coexistencia de insulina en formas monoméricas, diméricas y hexámeras. La insulina (disponible de fuentes comerciales) se puede marcar covalentemente a pH fisiológico. El cambio en la composición de una muestra de insulina se puede medir con el tiempo. Por lo tanto, se pueden eliminar alícuotas desde la muestra y probarlas utilizando un método de difusión de la invención. Los cambios en el perfil de difusión pueden estar relacionados con cambios en la composición de la muestra, por ejemplo, una mayor agregación. Los cambios en la agregación también se pueden monitorizar con cambios en el pH de la muestra de insulina. Por ejemplo, la agregación se puede determinar a pH 2 y pH 4. Se pueden comparar las poblaciones de varias especies en las muestras.

Análisis de eventos de agregación de Ap(1-42)

La espectrometría de difusión se puede utilizar para analizar mezclas muy heterogéneas de complejos de proteínas. Un tipo particularmente desafiante de proceso de asociación biomolecular para el estudio es el de la formación de agregados ricos en láminas p aberrantes: comúnmente conocidos como fibrillas de amiloide. El amiloide-p, particularmente en forma oligomérica, ha sido implicado como uno de los principales factores patogénicos en la enfermedad de Alzheimer. La obtención de una distribución de tamaño para la solución de proteína a medida que se agrega es importante para comprender tanto la patología de la enfermedad como los mecanismos subyacentes a la agregación.

Las distribuciones de tamaño de los agregados de amiloide se obtienen comúnmente mediante microscopía de fuerza atómica. Sin embargo, las técnicas AFM generalmente requieren que se reduzca la concentración de la muestra, lo que significa que los complejos dinámicos pueden disociarse antes de que se pueda realizar una medición. AFM también tiene problemas para encontrar una distribución de tamaño real, ya que la distribución del analito sobre una superficie rara vez es uniforme. La espectrometría de difusión es una técnica de volumen, y los tiempos de difusión son lo suficientemente cortos como para que la composición de la solución de muestra permanezca sin cambios a lo largo de su paso por el canal de difusión. De hecho, cada molécula pasa solo del orden de 10 o 20 segundos dentro del dispositivo. Además, las especies para el análisis solo se diluyen como máximo en un factor de diez, lo que minimiza la disociación.

La Figura 3 muestra la distribución de tamaño de los agregados de Ap (1-42) en cuatro puntos de tiempo diferentes en una reacción de agregación que comienza con la proteína monomérica. Los detalles de las mediciones de difusión son idénticos a los de las otras soluciones de proteínas detalladas anteriormente, aunque se utilizó un tiempo de exposición de 100 s en cada punto de medición en lugar de 10 s.

Al comienzo de la reacción, el péptido es monomérico, como se esperaba. Curiosamente, un pico de especies más grandes comienza a aparecer solo 30 minutos después del transcurso del tiempo, antes de que la intensidad de fluorescencia de ThT haya aumentado apreciablemente. Estas especies más grandes tienen un rango de tamaño que va desde los oligómeros hasta las fibrillas pequeñas, y dada la falta de señal ThT asociada, parece probable que gran parte del pico comprenda los oligómeros negativos ThT pequeños que se cree que están asociados con la enfermedad. Después de 50 minutos, al comienzo de la fase de crecimiento de la reacción, todavía hay una fracción significativa de monómero, así como la mezcla de oligómeros y fibrillas observada anteriormente. Ahora hay poblaciones significativas de fibrillas en tamaños más grandes de hasta aproximadamente 20 nm en el radio hidrodinámico, y es en este momento cuando se produce por primera vez la aparición de fibrillas agregadas (el pico en alrededor de 400 nm). En el momento en que se ha consumido todo el monómero, a los 120 minutos, todos los agregados están contenidos en estos grandes grupos de fibrillas.

Experimental

Se clonó Ap(1-42) en el plásmido “PetSacKan”, expresado recombinantemente en Células BL21 de E. coli y purificadas en modo discontinuo mediante cromatografía de intercambio aniónico. Este procedimiento permitió la producción de grandes cantidades de péptido con una pureza relativamente alta. El péptido resultante se dividió en alícuotas de 1 ml, se liofilizó y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior. Aunque la obtención de datos cinéticos reproducibles para la agregación del péptido Ap(1-42) históricamente ha sido un desafío [10], recientemente se demostró que realizar una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño para separar el monómero de proteína pura de los intermedios oligoméricos inmediatamente antes de la reacción de agregación mejora notablemente la calidad de los datos cinéticos obtenidos [9]. De acuerdo con lo anterior, se solubilizó una sola alícuota en cloruro de guanidinio 6 M y se pasó a través de una columna de filtración de gel Superdex 75 10/300. Se rechazó el “pico” del oligómero que eluyó justo antes del pico del monómero de proteína, y se recogió el monómero puro que eluyó entre aproximadamente 13 y 15 ml. Se eluyó aproximadamente 1.3 μM de monómero de proteína en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 8.0, EDTA 200 μM y azida sódica al 0.02 % y se mantuvo en hielo.

Se utilizó un ensayo cinético de tioavina T (ThT) para controlar el proceso de fibrilación, con 4 réplicas de Ap(1-42) 1.2 μM, ThT 20 μM, en el tampón anterior. La fibrilización se controló en tiempo real y, en los puntos de tiempo correspondientes al comienzo de la reacción de agregación, el final del tiempo de retraso, la primera parte de la fase de crecimiento y el establecimiento de la fase de equilibrio, se extrajeron alícuotas de 4 pocillos adicionales. y se combinó con 10 μl de un stock de marcaje OPA-BME, también en el tampón de cinética anterior. Las alícuotas, que contenían aproximadamente Ap(1-42) 1.0 μM, OPA 600 μM y BME 900 μM, se mantuvieron en hielo y luego se analizaron rápidamente en los dispositivos de difusión.

Análisis de Alpha-B Crystallin

La oligomerización de alfa B-cristalina se estudió mediante espectroscopía de difusión.

Aunque todavía está en debate [22], ha surgido un amplio consenso de que la alfa B-cristalina en su estado nativo se ensambla como oligómeros que varían en tamaño de 10 a 40 subunidades [23], y la dinámica del equilibrio de la oligomerización podría ser de crucial importancia para la función de las proteínas. Es esta heterogeneidad la que ha complicado el estudio de la proteína. Existe cierta información estructural sobre el dominio cristalino de una variante truncada que afirma que el oligómero consta de elementos fundamentales de hoja p dimérica de 7 hebras [24], y los intentos de describir la polidispersidad de los oligómeros de alfa B-cristalina se lograron con éxito mediante espectrometría de masa [23], [25], [26]. Sin embargo, hasta el momento no ha sido posible rastrear especies monoméricas en cantidades significativas dentro de mezclas polidispersas.

La alfa B-cristalina se expresó y purificó como se describe a continuación. Después de la última etapa de purificación, se verificó la identidad de la alfa B-cristalina mediante SDS-PAGE (ver Figura 8(a)). Una sola banda a 20 kDa confirmó la presencia de alfa B-cristalina monomérica pura en condiciones desnaturalizantes. Se obtuvo una prueba adicional de la pureza de la alfa B-cristalina mediante espectrometría de masas (Figura 8(b), panel superior). Se encontró que la masa experimental de 20.160 Da coincide muy de cerca con la masa teórica esperada de 20.159 Da.

Para los experimentos de espectroscopía de difusión, se marcó alfa B-cristalina con ortoftalaldehído (OPA), como se describió anteriormente. Se probó el marcaje completo con espectrometría de masas (ver Figura 8(b), panel inferior). El cambio en m/z de aproximadamente 2200 Da corresponde al marcaje OPA de 12.5 aminas, casi igualando el marcaje completo de 10 aminas primarias y la amina N-terminal en la secuencia de alfa B-cristalina. Los análisis DLS y de nanoporos de vidrio (que se describen más adelante) se realizaron con alfa B-cristalina sin marcar.

Se midió el tamaño de la alfa B-cristalina mediante espectroscopía de difusión para identificar poblaciones de proteínas monoméricas y oligoméricas diferentes. El dispositivo de difusión utilizado se describe con más detalle a continuación. Los datos de difusión en diferentes puntos de medición se trazaron como intensidad de fluorescencia a lo largo del microcanal, lo que produjo un perfil de difusión (Figura 9(a)), y los datos experimentales se ajustaron a un modelo teórico como se describe en el presente documento, lo que dio como resultado la distribución de tamaño de la alfa B-cristalina. (Figura 9(b)). De hecho, dos poblaciones fueron resueltas por espectroscopía de difusión: una pequeña población de una especie con un radio hidrodinámico medio de aproximadamente 2 nm y una población más grande de una especie con un radio hidrodinámico medio de alrededor de 7 nm.

La pequeña población, que representaba menos del 20 % de la mezcla, representaba la alfa B-cristalina monomérica, y la población muy abundante, que representaba más del 80 % de la muestra, incluía formas oligoméricas de la proteína. No fue posible sacar conclusiones sobre la distribución oligomérica. Sin embargo, la especie de tamaño pequeño se identificó como una especie aislada en cantidades significativas por primera vez, y la cuantificación de las poblaciones relativas de las dos especies permite el estudio del equilibrio de oligomerización de alfa B-cristalina.

A modo de comparación, se analizó con DLS alfa B-cristalina 30 μM sin etiqueta. Se encontró que una distribución de tamaños amplia, superpuesta con la distribución de tamaños medida por espectroscopia de difusión, representaba cristalina alfa B oligomérica (Figura 10). La buena concordancia de ambas técnicas sugirió que no hubo un impacto directo del marcador covalente en la oligomerización. Sin embargo, utilizando DLS no se detectó señal para las especies de tamaño pequeño a 2 nm. A medida que las partículas más grandes dispersan significativamente más luz, las intensidades mediciones por DLS estaban sesgadas hacia las proteínas oligoméricas y, por lo tanto, los oligómeros grandes podrían haber enmascarado la alfa B-cristalina monomérica pequeña y débilmente dispersa. Por lo tanto, DLS no es una técnica adecuada para investigar el equilibrio de oligomerización de alfa B-cristalina.

Se realizó otro intento de cuantificar el equilibrio monómero-oligómero de la alfa B-cristalina libre de etiquetas utilizando la detección de una sola molécula a través de un nanoporo de vidrio (en colaboración con Nicholas Bell y el Dr. Ulrich Keyser en el Laboratorio Cavendish, Universidad de Cambridge). La técnica y su aplicación a la detección de una sola molécula de proteína se describen en [27] y [28]. Debido a la coexistencia de alfa B-cristalina monomérica y oligomérica en la muestra, se esperaba una distribución bimodal de eventos como características de translocación de la muestra polidispersa a través del nanoporo de vidrio. Antes de la medición, el pH de la muestra se ajustó a 10.5 para evitar la pegajosidad y la adherencia a los lados del nanoporo de vidrio y para asegurar el viaje balístico de las proteínas a través del nanoporo. Se produjo flujo electroosmótico con la aplicación de un voltaje de -500 mV a través del poro y se registraron los eventos de transporte.

Los picos en las trazas de corriente iónica (Figura 11 (a)) ilustraron eventos de cambio de corriente iónica y, por lo tanto, reflejaron la etapa de moléculas de analito individuales a través del nanoporo. El mapa de calor disperso (Figura 11 (b)) de la corriente media del evento frente a la duración del evento, donde los colores representan el número de translocaciones, mostró un grupo de eventos en el tiempo de corte del filtro (aproximadamente 10 ps para el filtro de 50 kHz), el límite de duración del evento impuesto por la frecuencia del filtro. La mayoría de las translocaciones estaban cerca del umbral detectable, pero, sin embargo, era probable que el agrupamiento principal correspondiera a proteínas que viajan balísticamente, como se informó para muestras de proteínas individuales monodispersas [28]. La presencia de proteína se detectó sin duda, pero con la resolución actual, la asignación de eventos de translocación a poblaciones monoméricas y oligoméricas seguía siendo inviable debido a la superposición de estadísticas de translocación.

El impacto de la concentración de proteína monomérica en el equilibrio de oligomerización de la alfa B-cristalina también se estudió mediante espectroscopía de difusión. Las poblaciones relativas de alfa B-cristalina monomérica y oligomérica se examinaron utilizando MFD con una concentración monomérica que oscilaba entre 15 μM y 125 μM. Independientemente de la concentración de monómero de proteína, se identificaron dos especies en todos los ensayos. Las especies más pequeñas con un radio hidrodinámico medio de alrededor de 2 nm constituían del 10 al 20 % de la mezcla, y las especies con un radio de 7 nm mostraban una abundancia relativa del 80 al 90 %.

No se observó que la población relativa de monómero a oligómero dependiera de la concentración inicial de monómero. Dado el error del método, los pequeños cambios relativos en la abundancia significan que, en el orden de las concentraciones de monómero examinadas, no hay un impacto considerable de la concentración de monómero en el equilibrio de oligomerización.

El dimensionamiento de la alfa B-cristalina reveló dos especies distintas con diferentes radios hidrodinámicos, lo que representa la heterogeneidad de la muestra. Los radios hidrodinámicos medios de aproximadamente 2 nm y 7 nm para las proteínas monoméricas y oligoméricas, respectivamente, coincidían con los datos publicados anteriormente. El valor muy sensible del radio de oligómero promedio de 7 nm coincidió bien con los datos de espectrometría de masas [26], microscopía electrónica [22], dispersión de rayos X de ángulo pequeño y RMN de estado sólido [29].

La espectrometría de difusión microfluídica se puede utilizar para identificar, en una sola medición, la alfa B-cristalina monomérica como una especie aislada con un radio hidrodinámico pequeño que coexiste con formas oligoméricas de la proteína. Se descubrió que esta resolución de especies es exclusiva de la espectrometría de difusión, ya que ni los experimentos DLS ni los nanoporos revelan la presencia de especies monoméricas. En DLS, el sesgo hacia partículas más grandes y de mayor dispersión oscureció la presencia de partículas de menor tamaño, y las técnicas de nanoporos actuales no son lo suficientemente sensibles para detectar una distribución bimodal de eventos como se esperaba para una mezcla de poblaciones de monómeros y oligómeros. Además, los intentos anteriores de describir la distribución de tamaños de la chaperona con espectrometría de masas dieron como resultado una descripción detallada de las poblaciones individuales de oligómeros sin rastrear el monómero ([25] y [26]).

Experimental

El plásmido que codifica el gen de la alfa B-cristalina humana fue proporcionado amablemente por Andrew Baldwin (Universidad de Oxford, Reino Unido).

Expresión y purificación de proteínas. El plásmido que codifica el gen de la alfa B-cristalina humana se transformó en Células BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen). Overnight Express Instant TB Autoinduction Medium (500 ml, Novagen) suministrado con 1 % (v/v) de glicerol y 100 μg/mL de kanamicina se inoculó con 12 ml de un cultivo nocturno de las células transformadas. Se indujo la sobreexpresión de proteínas durante la noche, agitando vigorosamente a 30 °C. Las células se recogieron por centrifugación (6000 g, 15 min, 4 °C) y se resuspendieron en Tris-HCl 20 mM, pH 8.3 (20 ml/500 ml de cultivo) que contenía 1 mg/ml de lisozima (Sigma-Aldrich), un comprimido completo de cóctel de inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche) y una punta de espátula DNasel (Roche) por 500 ml de medio de cultivo. Las células se lisaron sonicando 20 x 15 s utilizando una salida de 6 en un sonicador Ultrasonic Processor XL (Misonix). El lisado se centrifugó (18.000 g, 30 min, 4 °C) para eliminar los restos celulares y se filtró a través de una jeringa de 0.45 μm. Filtro (Millipore). El lisado filtrado se cargó en una columna Q Sepharose (GE Healthcare) preequilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8.3) y se eluyó mediante una elución en gradiente lineal de NaCl de 0 a 200 mM en 4 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían proteínas se aplicaron a una columna de filtración en gel HiLoad 26/600 Superdex de 75 μg (GE Healthcare) para la purificación final en NaPi 20 mM (pH 8.5) y se eluyeron a un caudal de 1 ml/min. La identidad de las fracciones que contenían proteína se comprobó con SDS-PAGE y MALDI-MS.

Fabricación de dispositivos microfluídicos. El SU-83025 (Microchem) fotorresistente se revistió por rotación durante 7 s a 500 rpm y durante otros 30 s a 3000 rpm sobre obleas de silicio. Las obleas recubiertas por rotación se hornearon suavemente en una placa caliente a 95 °C durante 12 min, luego se recubrieron con la máscara y se expusieron a la luz ultravioleta durante 15 s. Después de la exposición, las obleas se hornearon durante otros 5 minutos antes de desarrollar el molde utilizando PGME. Los sellos de PDMS se produjeron vertiendo prepolímero líquido (elastómero de silicona 10:1 (v/v): reticulador) ennegrecido con nanopolvo de carbono (Sigma Aldrich) sobre el molde y curándolo durante 2 h a 60 °C. Los sellos de PDMS se cortaron con un bisturí y, después de perforar orificios de entrada y salida con una aguja de biopsia, los sellos se expusieron a un plasma de aire durante 10 s (presión parcial de O²4.0, potencia 4.0) y adheridos a cubreobjetos de vidrio (bordes esmerilados a 90°, Thermo Scientific). El dispositivo se formó con canales que tenían una altura de 25 μm y anchos que oscilaban entre 1000 (por ejemplo, en el canal de sección transversal grande) y 10 μm.

Espectrometría de difusión microfluídica. La alfa B-cristalina humana se marcó utilizando una solución colorante de ortoftalaldehído (OPA) (NaHCO³200 mM (pH 10.5), 60 mM orto-ftalaldehído, p-mercapto etanol 90 mM) en un exceso de 10 a 20 veces de OPA con respecto a las aminas primarias. La solución tampón y las proteínas marcadas con fluorescencia se añadieron en las entradas respectivas utilizando puntas de pipeta de carga de gel, y se ajustó un tubo conectado a una jeringa de vidrio de 250 μl (Hamilton) a la salida de flujo. Se utilizó una bomba de jeringa neMESYS (Cetoni) para establecer el caudal de extracción total en 80 μl/h. Se excitó alfa B-cristalina marcada con OPA con luz ultravioleta y se tomaron imágenes con un aumento de 10 veces con un cubo de filtro 49000 - ET - DAPI (Chroma Technology Corp) en un microscopio Axio Observer.D1 (Zeiss) utilizando una cámara Evolve 512 EMCCD (Photometrics). Los datos de la imagen se ajustaron a superposiciones lineales de un conjunto de funciones básicas que describen las distribuciones de soluciones de partículas homogéneas que van desde 0 nm a 800 nm de diámetro a distancias correspondientes a tres puntos de medición fluorescentes (a 1, 3 y 9 cm).

Dispersión dinámica de luz (DLS). Los experimentos de dispersión de luz dinámica se realizaron utilizando un Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments) con detección de retrodispersión en un ángulo de dispersión de 173°. La viscosidad y el índice de refracción del agua se utilizaron como parámetros para la solución tampón, y las propiedades del material del analito se establecieron en proteína. Todas las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa Millex de 0.22 μm (Millipore) antes del análisis. Los datos se analizaron utilizando el modo “múltiple estrecho” del software del instrumento Malvern para deconvolucionar la función de correlación en una distribución de tamaño.

Mediciones de detección de nanoporos. Los experimentos se realizaron en colaboración con Nicholas Bell y Ulrich Keyser en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge, como se describió previamente en [28]. Las mediciones se realizaron con alfa B-cristalina a una concentración de 1 μM a pH 10.5.

Espectrometría de masas MALDI. La masa de la alfa B-cristalina no marcada y marcada con OPA se midió mediante espectrometría de masas MALDI (Dr. Len Packman en las Instalaciones PNAC, Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge). La masa molecular teórica de 20.159 Da se utilizó para la comparación con las masas experimentales para la alfa B-cristalina sin marcar y marcada.

Concentraciones de proteínas. Las concentraciones de proteína monomérica se calcularon midiendo la absorbancia del material monomérico a 280 nm, utilizando un coeficiente de extinción molar de 13980 M'1cirr1.

Análisis de liposomas

Se estudiaron estructuras de liposomas de diferentes tamaños mediante espectroscopía de difusión.

Se ha demostrado que el tamaño de los liposomas es crucial para las características de los sistemas de biomembranas artificiales y para la farmacocinética adecuada en la administración de fármacos [30]. En los últimos años, se han discutido en la literatura diferentes métodos para dimensionar vesículas: microscopía electrónica [31], ultracentrifugación analítica [32], cromatografía de exclusión por tamaño analítica [33], fraccionamiento de flujo de campo de flujo [34], ensayos de cuantificación de lípidos enzimáticos [35] y la dispersión de luz dinámica (DLS) [36], siendo DLS la técnica de elección debido a su facilidad de uso. Sin embargo, el dimensionamiento preciso, confiable y reproducible de las vesículas lipídicas, particularmente en mezclas complejas de liposomas heterogéneos, sigue siendo un desafío debido al requisito de instrumentación sofisticada o limitaciones técnicas. La espectroscopía de difusión de microfluidos se utilizó para determinar el tamaño de los liposomas marcados con fluorescencia y para resolver los tamaños de las vesículas en una mezcla de liposomas con diferentes tamaños.

Se prepararon soluciones homogéneas de liposomas fluorescentes, de 30 nm y 100 nm de diámetro de poro de extrusión, para el dimensionamiento así como una mezcla 1:1 de los dos. Se utilizó espectrometría de difusión microfluídica para analizar los liposomas y calcular sus tamaños. Para todas las muestras, se midió la intensidad de fluorescencia a lo largo del microcanal en tres puntos de medición, cada uno correspondiente a un tiempo de difusión diferente, para producir los perfiles de difusión (Figuras 13 (a), (c) y (e)). Se utilizó un dispositivo fluídico microfluídico como el descrito anteriormente.

La pequeña vesícula extruida a través de una membrana con un radio de poro de 15 nm se difundió más rápido que las vesículas más grandes extruidas a un radio de 50 nm (como se esperaba de la relación de Stoked-Einstein). En cada punto de medición, la vesícula más pequeña se había extendido más a través del canal y la intensidad de la fluorescencia en la posición de entrada inicial en el medio del canal disminuyó más rápidamente en el caso del liposoma más pequeño. Las distribuciones de tamaño de mejor ajuste (Figuras 13 (b), (d) y (f)) se obtuvieron mediante el ajuste de mínimos cuadrados de los perfiles de difusión con superposiciones lineales de funciones básicas que describen el comportamiento de difusión de partículas de tamaños definidos.

Se confirmó un buen ajuste mediante valores bajos de chi-cuadrado de 0.05, 0.14 y 0.06 para las vesículas extruidas a 30 nm, 100 nm y una mezcla de las dos, respectivamente. Se determinó que el radio hidrodinámico medio de los liposomas extruidos a través de un filtro con poros de 15 nm de radio era de 22 nm, y se encontró que los liposomas con un radio de extrusión de 50 nm tenían un radio hidrodinámico medio de 45 nm. El análisis de la mezcla reveló poblaciones separadas de ambas especies con una clara separación de las dos.

La medición DLS de las mismas muestras reveló resultados en el mismo orden para los radios hidrodinámicos medios de los liposomas: 27 nm para las vesículas extruidas a un radio de 15 nm y 53 nm para las vesículas extruidas a un radio de 50 nm. Sin embargo, las distribuciones de tamaño encontradas por DLS se distribuyeron ampliamente, lo que dificultó la detección confiable de dos picos distintos en una mezcla. Mientras que la difusión de microfluidos diferenció explícitamente entre las dos especies de liposomas en la mezcla sin ninguna información a priori, DLS identificó dos picos parcialmente superpuestos solo cuando sesgó el análisis hacia una muestra heterogénea. Sin ningún información a priori sobre la polidispersidad de la muestra se encontró un único pico notablemente ancho con un tamaño medio que se desplazó ligeramente desde el radio medio de la vesícula más grande hacia el radio medio de la vesícula más pequeña (datos no mostrados). En ese caso, la precisión de la discriminación fue muy pobre y se alcanzaron los límites de detección. A diferencia de DLS, la espectroscopía de difusión no está sesgada hacia partículas más grandes y de mayor dispersión. Se considera que la precisión de los radios hidrodinámicos registrados de los liposomas puede mejorarse con adaptaciones adicionales de las técnicas de medición de difusión descritas en el presente documento.

Al igual que con los experimentos descritos anteriormente en relación con Alpha-B Crystallin, las técnicas de medición de difusión de microfluidos permiten el dimensionamiento de partículas en mezclas polidispersas complejas. Las mediciones de difusión se caracterizan porque tienen un consumo de muestra considerablemente bajo, mayor sensibilidad y reproducibilidad, y el dimensionamiento de partículas en mezclas heterogéneas se produce sin un sesgo significativo hacia especies con grandes radios hidrodinámicos.

Experimental

Preparación de liposomas fluorescentes. Se utilizaron lípidos fluorescentes de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-carboxiuoresceína (PE CF) en cloroformo (Avanti Polar Lipids) como etiquetas fluorescentes para los liposomas utilizados en los experimentos de tamaño. El cloroformo se evaporó utilizando nitrógeno seco para producir una película lipídica. Posteriormente, la película se volvió a suspender en agua bidestilada, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó durante la noche para su secado. Los lípidos fluorescentes secos se resuspendieron hasta un contenido final del 10 % de lípidos fluorescentes en lípidos de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) 1 mM (lípidos polares de Avanti) en NaPi 20 mM, NaN² al 0.01 %, y la suspensión se agitó a fondo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las grandes vesículas multilamelares resultantes se rompieron mediante cinco ciclos de congelación y descongelación, y se prepararon vesículas unilamelares de diferentes tamaños mediante extrusión a través de filtros de membrana de policarbonato con poros de diferentes tamaños (Avanti Polar Lipids) utilizando un Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids). Se prepararon soluciones madre de liposomas de 500 μM utilizando filtros de extrusión con diámetros de poro de 30 nm y 100 nm de diámetro. La concentración de medición real fue de 250 μM con lípidos fluorescentes de 25 μM.

Espectrometría de difusión microfluídica.

El dispositivo de difusión se llenó con solución tampón (NaPi 20 mM, NaN² al 0.01 %), y se añadieron vesículas marcadas con fluorescencia en la entrada respectiva. Se utilizó una bomba de jeringa neMESYS (Cetoni) como antes para ajustar el caudal de extracción total a 80 μl/h. Los fluoróforos incorporados en los liposomas se observaron con un cubo de filtro ET-GFP (modelo 49002, Chroma Technology) en un microscopio Axio Observer.DI (Zeiss) utilizando una cámara Evolve 512 EMCCD (Photometrics). Los datos de la imagen se ajustaron a superposiciones lineales de un conjunto de funciones básicas como se describió anteriormente.

Dispersión dinámica de luz (DLS). Los experimentos de dispersión de luz dinámica se realizaron como se describió anteriormente.

Referencias

Todos los documentos mencionados en esta especificación se enumeran a continuación.

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el coeficiente de difusión de dos o más componentes, comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar un flujo de fluido de componente que comprende una pluralidad de componentes;

(ii) proporcionar un flujo de fluido en blanco;

(iii) poner el flujo (i) en contacto con el flujo (ii) en un canal, para generar de este modo dos flujos laminares;

(iv) medir la difusión lateral de los dos o más componentes desde el flujo de componente hacia el flujo de fluido en blanco en una pluralidad de tiempos de difusión para determinar el coeficiente de difusión de cada componente.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la difusión lateral se mide en tres o más tiempos de difusión.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el método comprende además la etapa de determinar un radio hidrodinámico a partir del coeficiente de difusión de cada componente.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la determinación del coeficiente de difusión de cada componente incluye comparar los perfiles de difusión lateral medidos de los dos o más componentes de la etapa (iv) con una serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos conocidos, para determinar de este modo los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en el que la determinación del coeficiente de difusión de cada componente comprende deconvolucionar los perfiles de difusión lateral medidos de uno o más componentes de la etapa (iv) utilizando un enfoque de regularización de entropía más alta con referencia a una serie de distribuciones para componentes que tienen radios hidrodinámicos o coeficientes de difusión conocidos, para determinar de este modo los radios hidrodinámicos para cada uno del uno o más componentes.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa (ii) proporciona dos flujos de fluido en blanco, y los flujos de fluido en blanco se ponen en contacto con el flujo de fluido de componente y se proporcionan a cada lado del mismo, para generar de este modo tres flujos de fluido.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos uno de los componentes es un polímero.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el polímero es o contiene un biopolímero seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para determinar el coeficiente de difusión de dos o más componentes, cada uno de los cuales tiene un radio hidrodinámico en el rango de 0.5 a 200 nm.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la difusión de los dos o más componentes en la etapa (iv) se determina mediante mediciones de fluorescencia.