ES2949865T3 - Intercambio combinatorio de cadena de receptores de células T gamma 9 delta 2 - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona métodos para identificar el receptor de células 39'2T (39'2TCR) que media las respuestas antitumorales. Sorprendentemente se ha descubierto ahora que las regiones CDR3 de la cadena del receptor de células T 39 y de la cadena del receptor de células T '2 (cadena '2TCR) son importantes. Con base en estos hallazgos, se propone el intercambio de cadenas combinatorio 3'TCR (CTE) como un método eficaz para identificar 39'2TCR que median las respuestas antitumorales. Utilizando el método de la invención, se identificaron secuencias específicas de las respectivas cadenas y9TCR y '2TCR que median las respuestas antitumorales. Por lo tanto, la invención proporciona además 39'2TCR específicos, o fragmentos de los mismos, que pueden usarse, p. en el diagnóstico o tratamiento del cáncer. La invención proporciona además secuencias de ácidos nucleicos, construcciones genéticas y vectores retrovirales que pueden usarse para expresar los 3TCR según la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Intercambio combinatorio de cadena de receptores de células T γ9δ2
Campo de la invención
[0001] La invención pertenece al campo de la medicina. Se refiere a la inmunología y la terapia celular para el tratamiento del cáncer. La invención se refiere además a céulas apT que expresan receptores de células T específicos que median respuestas antitumorales y a sus usos en el tratamiento del cáncer.
Estado de la técnica
[0002] Hasta el momento, el transplante alogénico de células madre (allo-SCT) es la única terapia celular curativa bien establecida y probada para pacientes que padecen cáncer. Esto se demuestra por la observación de que se pueden conseguir remisiones a largo plazo, en particular, en pacientes allo-SCT con un "riesgo pobre" de leucemia. Sin embargo, la cura tiene un precio de toxicidad grave, dando como resultado una mortalidad en general de aproximadamente 30% de pacientes tratados. Esto impide una implementación clínica extensa, ya que en particular pacientes con bajo riesgo de cánceres pueden tener una supervivencia buena en general que no justifica tales terapias agresivas. Por lo tanto, sigue existiendo el objetivo definitivo de desarrollar un método de transplante no agresivo. Esto significa la generación de productos celulares equipados con características moleculares que permiten actuar sobre la célula cancerosa de forma selectiva mientras se preservan los tejidos sanos. Esto permitiría un tratamiento curativo a un gran número de pacientes con necesidad médica, sin tener en cuenta la edad.
[0003] Para diseñar un transplante, que puede ser alogénico o autólogo, para facilitar la generación rápida de por ejemplo células T αβ reactivas al tumor, se ha propuesto reprogramar células T αβ con genes que codifican un receptor de células T αβ específicas del tumor (TCR) o un receptor antígeno quimérico. Varios de tales receptores ya se están usando para redirigir las células T αβ en los ensayos clínicos de fase I. Sin embargo, la reprogramación de las células T αβ con TCR αβ definidos se impide sustancialmente por su restricción a tipos HLA y así se limita el número de pacientes que pueden estar tratados con un TCR ap. Además, el emparejamiento de cadenas TCR αβ introducidas con cadenas TCR αβ endógenas puede inducir una autoreactividad que ponga en riesgo la vida del paciente.
[0004] Se ha propuesto mediar una reactividad antitumoral selectiva con una alta afinidad TCR utilizando la capacidad de las células T γ9δ2 de mediar en la reactividad antitumoral mientras se ignora el ambiente sano (Fisch et al., 1990, Science 250,1269-1273). Las células T γ9δ2 aisladas pueden matar eficazmente células tumorales de neoplasias hematológicas y tumores sólidos (Kabelitz et al., 2007, Cancer Res. 67,5-8). Sin embargo, la función y capacidad de proliferación de células T γ9δ2 se ha dañado gravemente con frecuencia en pacientes con cáncer, de forma que las células T γ9δ2 autólogas se han vuelto menos atractivas para intervenciones inmunitarias. Las células T con un TCR y§ con una mutación en el residuo del aminoácido 97 puede enlazar células tumorales en concreto ováricas (Xi et al., 2010, Internacional Immunology, 22, 299-306).
[0005] En el documento WO2004/016225 se describen composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de tumores en mamíferos. En WO02/24718 se describen composiciones y métodos relacionados con genes y proteínas específicos de la próstata. En WO2005/016962 se describen composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. En WO94/12648 se describe un método para producir receptores T solubles mediante cotransfección y el uso de los productos resultantes. En US 5,723,309 se describe la producción de subunidades de receptores T solubles mediante cotransfección. Se ha propuesto transferir un TCR γ9δ2 definido en células T ap, que media enuna proliferación específica del tumor de células T αβ y redirige subconjuntos de células T αβ efectoras CD8+ y auxiliares CD4+ frente a un panel ancho de lineas celulares tumorales mientras se pueden ignorar células normales in vitro e in vivo (Marcu-Malina et al., 2011, Blood 118, 50-59). Sin embargo, no hay disponible mucha información acerca de cómo TCR γ9δ2 median la actividad diferente contra las células tumorales y qué estrategia se necesita usar para aislar t Cr y952 con actividad alta frente a las células cancerosas.
[0006] Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de proveer TCR y952 con actividad alta contra las células cancerosas y hay una necesidad en la técnica de proporcionar métodos mejorados para la selección tales TCR Y952 altamente activos.
Resumen de la invención
[0007] La presente invención proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T y952 como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden dicha célula. La invención proporciona además una célula y/o composiciones
para su uso en el tratamiento del cáncer. Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan métodos para identificar receptores de células T γ9δ2 (γ9δ2TCR) que median en las respuestas antitumorales.
[0008] Como se ha dicho, se sabe poco sobre los requisitos moleculares de un TCR γ9δ2 para mediar la reactividad antitumoral. Especialmente, la aportación de la variabilidad en las regiones de determinación complementaria (CDR) del TCR γ9δ2 para mediar respuestas antitumorales se consideró como insignificante en la técnica. Sorprendentemente, se descubrió que las CDR3 regiones de la cadena receptora de célula T y9T (cadena TCR y9) y la cadena receptora de célula T 62 (cadena TCR 62) son de importancia. Basado en estas conclusiones, el intercambio combinatorio de cadena y6TCR (CTE) se propone como un método eficaz para la identificación de TCR γ9δ2 que median respuestas antitumorales. En los métodos de la divulgación, las regiones CDR3 de la cadena receptora de célula T y9T y la cadena receptora de la célula T 62 se modifican y se combinan de forma aleatoria para formar un nuevo TCR γ9δ2. El recién modificado TCR γ9δ2 se proporciona y preferiblemente se integra en células T, que se expresa posteriormente un TCR γ9δ2 en la superficie celular. Por consiguiente, se determina la respuesta antitumoral de las células T modificadas de CTE. De esta manera, se pueden evaluar combinaciones múltiples y para cada combinación se puede determinar la respuesta antitumoral. Después de la determinación de la respuesta antitumoral, los receptores celulares T γ9δ2 que median respuestas antitumorales altamente activas se pueden identificar. Utilizando el método de la divulgación, tal como se describe en los ejemplos, ya se identificaron diferentes TCR γ9δ2 sensibles que median respuestas antitumorales aumentadas en comparación con la referencia TCR γ9δ2 G115wt. Por lo tanto, como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan t Cr γ9δ2 o fragmentos de los mismos, que se pueden utilizar, por ejemplo, en el diagnóstico o el tratamiento del cáncer. La divulgación proporciona además secuencias de ácidos nucleicos, construcciones genéticas y vectores retrovirales que pueden utilizarse para expresar los TCR γ9δ2 en las células apT, preferiblemente células T, según la invención.
Figuras
[0009]
Figura 1: reactividad antitumoral mediada por TCR γ9δ2. Las células T de sangre periféricas fueron transducidas de forma vírica con TCR γ9δ2 indicados tipo salvaje o CTE TCR γ9δ2 modificados y evaluados frente a Daudi (A; C) en un ensayo de liberación 51Cr (E:T 3:1). La lisis específica se indica como cambio múltiplo de liberación 51Cr medida en el sobrenadante después de 5h. El cambio múltiplo fue calculado cuando se compara con reactividad de Y9-G115wt/62-G115wt células T modificadas. (B; D) en un IFNy ELISA en presencia de cantidades indicadas de pamidronato o proporciones (E) diferentes E:T. (F) Los porcentajes de conjugados de célula-célula de Daudi y células T modificadas con TCR γ9δ2 indicado se determinaron por citometría de flujo. Los datos representan el medio±SD. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 por 1-vía ANOVA.
Figura 2: expresión TCR γ9δ2 y avidez funcional de células T transducidas que expresan cadena L2 única de alanina de clon G115. Las células T de sangre periférica fueron transducidas de forma vírica con cadenas indicadas TCR y9 y 62 y (A) analizadas por citometría de flujo utilizando un anticuerpo de cadena 62 específica. Se muestra el cambio múltiplo en el medio de intensidad fluorescente (MFI) en comparación con la expresión de control de tipo salvaje 62-G115wt. (C) La actividad lítica de transductantes fue evaluada en un ensayo de liberación 51Cr contra el tumor diana Daudi (E:T 10:1). La lisis específica se indica como liberación de cambio múltiplo 51Cr medida en el sobrenadante después de 5h. El cambio múltiplo se calculó en comparación con la reactividad de tipo salvaje no mutada (62-G115wt). Las flechas indican mutaciones en 62-G115 que alteraron la expresión receptora (flechas discontinuas) o avidez funcional (flechas sólidas). (B; D) Estructura de cristal de tCr γ9δ2 G115 indica los aminoácidos pertinentes (flechas).
Figura 3: expresión TCR γ9δ2 y avidez funcional de células T transducidas que expresan TCR γ9δ2 G115 con mutaciones de longitud 62-CDR3. La expresión (A) TCR γ9δ2 de transductantes indicados fue analizada por citometría de flujo utilizando un anticuerpo pan TCR y6. Se muestra el cambio múltiplo en la intensidad fluorescente media (MFI) en comparación con la expresión de control de tipo salvaje 62-G115w t. (B) La secreción IFNy de células T transducidas 62-G115l m contra el tumor diana Daudi (E:T 1:1) se midió por ELISA después de 24h de incubación en presencia de pamidronato de 100μM. Se muestra el cambio múltiplo en producción IFNy cuando se compara con la reactividad de expresión de transductantes peso 62-G1l5wt. (C) Los transductantes que expresan 62-G115l m 0,1,4,12 fueron evaluados en un ensayo de titulación frente al tumor diana Daudi con cantidades en aumento de pamidronato como se ha indicado. La producción IFNy se midió después de 24h por ELISA. (D) 62-G115LM generados se unieron en una búsqueda BLAST con TCR γ9δ2 descritos en la base de datos IMGT. Mostrado está el número de citas en comparación con 62-G115l m de longitud 6CDR3 similar. (E) Transductantes con 62-G115l m 2,4,6 fueron comparados uno junto a otro con transductantes que expresan TCR γ9δ2 individuales de la misma longitud 6CDR3. La secreción de células T transducidas IFN y contra el el tumor diana Daudi (E:T 1:1) se midió por ELISA después de 24h en presencia al pamidronato de 100μM. Se muestra el cambio múltiplo en la producción IFN y en comparación con la reactividad de transductantes que expresan wt 62-G115w t. Los datos representan el medio±SD. **p<0,01; **p<0,001 por 1-vía ANOVA. (F) estructura cristalina de TCR γ9δ2 G115; la región que fue usada
para extensiones de alanina dentro de 5CDR3 se muestra en blanco, 5CDR3 residual en verde, cadena 5 en azul, cadena y en marrón.
Figura 4: avidez funcional de células T transducidas de expresión TCR y952 G115 con mutaciones de longitud CDR3 y9. (A) células T de sangre periférica fueron de forma vírica transducidas con cadenas TCR Y9 y 52 indicadas. La actividad lítica de transductantes fue comparada una con otra para células T que expresan TCR y952 individual de la misma longitud y9CDR3. La lisis específica se indica como cambio múltiplo liberación 51Cr medida en el sobrenadante después de 5h. Los datos representan el medioiSD. **p<0,01 por 1-vía ANOVA. (B) Estructura cristalina de Tc R y952 G115 indica y9Cd R3 en gris incluyendo los aminoácidos y9-G115ai09; y9-G115q ii0 y y9-G115qiii (flechas rojas), 5CDR3 se muestra en verde; cadena 5 en azul; cadena y en marrón.
Figura 5: reactividad antitumoral de células T transducidas con TCR y952 modificadas por CTE in vitro. Las células T de sangre periféricas fueron transducidas de forma vírica con TCR y952 indicados y evaluados contra las líneas celulares tumorales indicadas y tejido de control sano. (A) Los transductantes fueron incubados con células diana (E:T 1:1) en presencia de pamidronato de 10μM. La producción IFN y se midió después de 24h por ELISA. Los datos representan el medioiSD. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 por 1-vía ANOVA. (B) Los transductantes fueron incubados con dianas marcadas como tumores llenadas con 51Cr (E:T 10:1). El porcentaje de lisis específica se determinó por liberación 51Cr medida en el sobrenadante después de 5h. (C) Las células T modificadas por CTE fueron evaluadas contra los blastos AML primarios y células originales sanas en un ensayo de ELISPOT IFN y (E:T 3:1) en presencia de pamidronato de 10μM. Los datos representan el medioiSD. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 por 1-vía ANOVA.
Figura 6: la reactividad antitumoral de las células T transducidas con TCR y952 modificadas por CTE in vivo. La avidez funcional de células T que expresan TCR y952 CTE Y9-G115wt/52-cI5wt o control TCR y952 (y9-G115wt/52-G115wt fue estudiada en Rag2' / 'Yc' / ' doble ratones noqueados (4-7 ratones por grupo). Después de la irradiación del cuerpo total (2Gy) en el día 0, los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 0.5x106 Daudi-luciferasa o 5x106 células RPMI8226/S-luciferasa y 107 células T transducidas y95TCR CTE a día 1. Adicionalmente, 6x105 UI IL2 en el IFA y pamidronato (10mg/kg de peso corporal) fueron inyectados a día 1 y cada 3 semanas hasta que el fin del experimento. (A,B) El crecimiento tumoral fue evaluado in vivo por formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) por medición de toda el área de ratones en ambos lados. Los datos representan el medio de todos los animales medidos (Daudi: n=4, RPMI8226/S: n=7). *p<0,05; **p<0,01 por 1-vía ANOVA (Daudi: día 42; RPMI8226/S: día 35). (C) En general la supervivencia de ratones Daudi tratados fue monitoreada durante 72 días. *p<0,05; **p<0,01 por prueba de rango logarítmico.
Figura 7. Intercambio combinatorio de cadena TCR y5 (CTE)
Los clones celulares T y952 individuales están aislados (A) y la secuencia de la cadena TCR y9 y TCR 52 está determinada (B). Por el nuevo intercambio de cadena combinatorio TCRy5, TCR y952 están modificados donde regiones y9 y 52CDR3 están modificadas de forma aleatoria (por ejemplo mediante sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones y/o encogimiento o extensión de la c DR3 longitud) (C) y recién combinado (D). Posteriormente, nuevos TCR y952 se introducen en células, preferiblemente, células T tales como células T αβ (por ejemplo mediante transducción utilizando un vector retroviral que codifica las cadenas TCR y9 y TCR 52) y células T modificadas por CTE se proporcionan (E). Finalmente, las células T modificadas por CTE se evalúan contra las células tumorales en ensayos funcionales para determinar TCR y952 que median altas respuestas antitumorales. Por lo tanto, TCR y952 por ejemplo con la respuesta antitumoral máxima y/o efectos secundarios mínimos se pueden seleccionar (F).
Definiciones:
[0010] En la siguiente descripción y se usan ejemplos de un número de términos. Para proporcionar una comprensión clara y consistente de las especificaciones y reivindicaciones, con el alcance que se le da a tales términos, se proporcionan las definiciones siguientes. A menos que se defina aquí de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo sentido como se ha entendido comúnmente por un técnico en la materia a la que pertenece esta invención y divulgación.
[0011] Los métodos de realización de las técnicas convencionales usados en métodos de la invención y divulgación serán evidentes para el experto. La práctica de técnicas convencionales en la biología molecular, bioquímica, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante, bioinformática, genómicos, secuenciación y campos relativos son bien conocidos para los expertos en la técnica y se exponen, por ejemplo, en las siguientes referencias bibliográficas: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2° edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Speing Harbor, N. y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; and the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.
[0012] En este documento y en sus reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus conjugaciones se usan en un sentido no limitativo para indicar que los aspectos que siguen a la palabra están incluidos, pero los aspectos no
mencionados en concreto no están excluidos. Abarca las estructuras "consiste esencialmente en" al igual que "consiste en".
[0013] Como se utiliza en este caso, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, un método para aislamiento "una" molécula de ADN, como se ha usado antes, incluye el aislamiento de una pluralidad de moléculas (por ejemplo 10, 100, 1000, decenas de miles, 100 de miles, millones o más moléculas).
[0014] Alineación y alineamiento: el término "alineación" y "alineamiento" significa la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos basadas en la presencia de extensiones cortas o largas de nucleótidos idénticos o similares. Diferentes métodos para el alineamiento de secuencias de nucleótidos se conocen en la técnica, como serán adicionalmente explicados a continuación. El término "alineación" y "alineamiento" también significa la comparación de dos o más secuencias de aminoácidos basadas en la presencia de extensiones cortas o largas de aminoácidos idénticos o similares. Diferentes métodos para el alineamiento de secuencias de aminoácidos se conocen en la técnica, como serán adicionalmente explicadas a continuación.
[0015] "Expression de un gen" se refiere al proceso donde una región de ADN, que está operativamente enlazada a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en un ARN, que es activo biológicamente, es decir, que es capaz de ser traducido en una proteína activa biológicamente o péptido (o fragmento de péptido activo) o que es activo por sí mismo (por ejemplo en el silenciamiento de gen postranscripcional o ARNi). Una proteína activa en ciertos ejemplos de realización se refiere a una proteína que es constitutivamente activa. La secuencia codificante es preferiblemente en la orientación de sentido y codifica una proteína activa deseada biológicamente o péptido, o un fragmento de péptido activo.
[0016] Como se utiliza en este caso, el término "operativamente enlazado" se refiere a una conexión de elementos de polinucleótido en una relación funcional. Un ácido nucleico es "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o más bien una secuencia reguladora de transcripción está operativamente enlazada a una secuencia codificante si esta afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que son enlazadas son contiguas típicamente y, donde es necesario unir dos o más regiones de codificación de proteína, contiguos y en el marco de lectura.
[0017] El término "construcción genética" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que es transcrita en una molécula de ARN (por ejemplo un ARNm) en una célula, operativamente enlazada a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Así, una construcción genética puede comprender diferentes secuencias operativamente enlazadas, tal como un promotor, una secuencia líder 5' que comprende por ejemplo secuencias implicadas en la iniciación de traducción, una región de codificación de (proteína), donador de empalme y sitios aceptores, secuencias intrónicas y exónicas, y una secuencia no traducida 3' (conocida también como secuencia 3' no traducida o 3'UTR) que comprende por ejemplo sitios de secuencia de terminación de transcripción.
[0018] La "identidad" es una medida de la identidad de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de modo que se obtiene la correspondencia de orden de máximo. "Identidad" de por sí tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando técnicas publicadas. Ver, por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOlOgY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Mientras un número de métodos existen para medir la identidad entre dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, el término "identidad" lo conocen bien los expertos (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073). Los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero de forma no limitativa, aquellos descritos en la GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informáticos. Los métodos de programa informático preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero de forma no limitativa, paquete de programa GCS (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1 ):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403).
[0019] Como una ilustración, por un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido de una secuencia determinada se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia polipeptídica de referencia. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos a una secuencia de nucleótidos de referencia se debe calcular sobre
la longitud total de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar y/o sustituir con otro nucleótido, y/o un número de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, dispersadas bien individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.
[0020] De forma similar, por un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" a una secuencia de aminoácidos de referencia de la SEQ ID N.°: 1 o 2 se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia de la SEQ ID N.°: 1 o 2. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de referencia se debe calcular sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede eliminar o sustituir con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta 5% de los residuos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones de amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, dispersadas bien individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia.
[0021] Como se usa en este documento, un "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" puede incluir cualquier polímero u oligómero de pirimidina y bases de purina, preferiblemente citosina, timina, y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (ver Alberto L. Lehninger, Principles of Biochemistry, a 793-800 (Worth Pub.
1982).Se contempla cualquier desoxirribonucleótido, ribonucleótido o componente de ácido nucleico de péptido, y cualquier variante química de los mismos, tal como, formas metiladas, hidroximetiladas o glicosiladas de estas bases, y similar. Los polímeros u oligómeros pueden ser heterogéneos u homogéneos en la composición, y se pueden aislar de fuentes de origen natural o se pueden producir artificialmente o sintéticamente. Además, los ácidos nucleicos pueden ser de ADN o de ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir permanentemente o transicionalmente en forma monocatenaria o bicatenaria, con homodúplex, heteroduplex y estados híbridos.
[0022] Como se utiliza en este caso, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, arriba situados con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de transcripción del gen, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente del ADN, sitios de iniciación de transcripción y cualquiera de las otras secuencias de ADN, que incluyen, pero no están limitadas a sitios de unión de factor de transcripción, represor y sitios de unión a proteínas activadoras, y cualquiera de las otras secuencias de nucleótidos conocidas por un experto en la técnica para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Opcionalmente, el término "promotor" incluye aquí también la región 5' UTR (5 región no codificante) (por ejemplo, el promotor puede aquí incluir una o más partes aguas en dirección hacia el extremo 5' del codón iniciador de traducción de un gen, ya que esta región puede tener un papel en transcripción de reglaje y/o traducción). Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en más tejidos con muchas condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se regula fisiológicamente (por ejemplo por aplicación externa de ciertos compuestos) o de desarrollo. Un promotor de "tejido específico" solo es activo en tipos específicos de tejidos o células. Un "promotor activo in a particular tipo célula, por ejemplo, en células T" se refiere a la capacidad general del promotor para dirigir la transcripción dentro de tal tipo celular. No tiene ninguna implicación sobre la actividad espaciotemporal del promotor.
[0023] Los términos "secuencia de aminoácido" o "proteína" o "péptido" se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo específico de acción, tamaño, estructura de 3 dimensiones u origen. Un "fragmento" o "porción" del mismo se puede referir todavía como una "secuencia de aminoácido" o "proteína" o "péptido". Una "secuencia de aminoácido aislada" se utiliza para referirse a una secuencia de aminoácidos que ya no está en su ambiente natural, por ejemplo in vitro o en una célula bacteriana recombinante o huésped humana.
[0024] "Células modificadas" se refiere aquí a células que han sido modificadas, por ejemplo, por la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos exógena o alteración específica de una secuencia de gen endógeno. Tal célula ha sido genéticamente modificada por ejemplo por la introducción de por ejemplo una o más mutaciones, inserciones y/o deleciones en el gen endógeno y/o inserción de una construcción genética en el genoma. Una célula modificada puede referirse a una célula en el aislamiento o en el cultivo. Las células modificadas pueden ser "células transducidas" donde las células han sido infectadas con por ejemplo un virus modificado, por ejemplo, se puede utilizar un retrovirus, tal como se describe en los ejemplos, pero otros virus adecuados también se pueden contemplar como tales lentivirus. Los métodos no víricos también pueden ser usados, tales
como transfecciones. Así, las células modificadas también pueden ser "células transfectadas de forma estable" o "células transfectadas de forma transitoria". La transfección se refiere a métodos no víricos para transferir ADN (o ARN) a células de manera que un gen sea expresado. Los métodos de transfección son ampliamente conocidos en la técnica, tal como transfección de fosfato cálcico, transfección PEG y transfección liposómica o lipoplex de ácidos nucleicos. Tal transfección puede ser transitoria, pero también pueden ser una transfección estable donde se pueden seleccionar células que tienen la construcción de gen integrada en su genoma.
[0025] "Modificación aleatoria" incluye secuencias aleatorias generadoras y también incluye la selección de regiones de codificación CDR3 62 y/o regiones de codificación y9-CDR-3 que se producen en la naturaleza y pueden derivar de secuencias de receptor de células T γ9δ2 derivadas de sujetos, por ejemplo de seres humanos, tal como las descritas en la sección de ejemplo donde tales secuencias CDR3 y9 y CDR3 62 fueron seleccionadas a partir de una base de datos. La generación de secuencias aleatorias incluye la modificación uno o más aminoácidos en un inicio de secuencia CDR-3 y9 y CDR362, hasta el punto donde todos los aminoácidos de las secuencias de inicio pueden ser modificados. La modificación de secuencias de aminoácidos se puede realizar por el cambio de secuencias de nucleótidos de un codón de manera que el aminoácido codificado por ese codón se altera.
[0026] El término "corresponde a" con respecto a secuencias de aminoácidos significa que cuando una secuencia se alinea con una secuencia de referencia que comprende una secuencia correspondiente, por ejemplo residuos de aminoácidos 50-70, los aminoácidos en alineación con los residuos de aminoácidos de ejemplo 50-70 son los residuos de aminoácidos de la una secuencia que corresponden. Un ejemplo de un alineamiento donde aminoácidos correspondientes se alinean de regiones CDR3 y9 y CDR362 se representa en la tabla 3.
[0027] El término "marcador seleccionable" es un término familiar para un experto en la materia y se utiliza en este caso para describir cualquier entidad genética que, cuando se ha expresado, puede utilizarse para seleccionar una célula o células que contienen el marcador seleccionable. Los productos de gen marcador seleccionable confieren por ejemplo resistencia antibiótica u otra característica seleccionable o un requisito nutricional. Los marcadores seleccionables tal como se conocen bien en la técnica incluyen proteína verde fluorescente (GFP), eGFP, luciferasa, GUS y similar.
Descripción detallada de la invención
[0028] En un primer aspecto, En un primer aspecto, la invención proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2 que comprende A y/o B, o que comprende C, o que comprende D:
A. un receptor de células T y9 representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y en el que se cumple al menos una de las siguientes características:
(i) donde la secuencia de aminoácidos de la región y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 122-124 de la SEQ ID NO: 1 es IQ y
(ii) donde la secuencia de aminoácidos de la región y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 118-132 de la SEQ ID NO: 1 tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 16, y/o
B. un receptor de células T 62 representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y en el que se cumple al menos una de las siguientes características:
(i) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 115-122 de la SEQ ID NO: 2 tiene una identidad de al menos 99 % con la SEQ ID NO: 15 o LLGY y
(ii) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 112-127 de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o
C. un receptor de células T γ9δ2 que comprende:
- un receptor de células T y9 según A, y
- un receptor de células T 62 representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y en el que se cumple al menos una de las siguientes características:
a) donde la secuencia de aminoácidos de la región 82T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 115-122 de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 19,
b) donde la secuencia de aminoácidos de la región 82T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 112-127 de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4,
c) donde la secuencia de aminoácidos de la región 82T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 112-114 de la SEQ ID NO: 2 es ACD y
d) donde la secuencia de aminoácidos de la región 82T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 123-127 de la SEQ ID NO:2 tiene al menos un 80 % de identidad con TDKLI, o
D. un receptor de células T γ9δ2 que comprende:
- un receptor de células T 82 según B, y
- un receptor de células T y9, donde el receptor de células T y9 está representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y donde se cumple al menos una de las siguientes características:
a) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 122-124 de la SEQ ID NO: 1 es AQQ, b) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 118-132 de la SEQ ID NO: 1 tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 3,
c) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 118-121 de la SEQ ID NO: 1 comprende ALWE y d) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 125-132 de la SEQ ID NO:1 tiene al menos un 80 % de identidad con ELGKKIKV.
[0029] Sin formar parte de la invención reivindicada, la divulgación también proporciona un método para identificar receptores celulares T γ9δ2 que median respuestas antitumorales que incluye las etapas de:
a) provisión de células T;
b) proporción de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 que comprende una región de codificación CDR3 y9, donde la región de codificación CDR3 y9 se modifica de forma aleatoria y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica de una cadena receptora de célula T 82 que comprende una región de codificación CDR382, donde la región de codificación CDR382 se modifica de forma aleatoria;
c) introducción de las secuencias de ácidos nucleicos de la etapa b) en las células T para proveer unas células T modificadas con un receptor de células T γ9δ2 que comprende la cadena receptora de célula T y9 de la etapa b) y la cadena receptora de célula T 82 de la etapa b);
d) opcionalmente, repetición de las etapas b) y c);
e) determinación de la respuesta antitumoral de las células T modificadas previstas en las etapas c) y d); f) identificación de los receptores de células T γ9δ2 de las células T modificadas que median respuestas antitumorales.
[0030] Las células T o linfocitos T pertenecen a un grupo de células blancas llamadas linfocitos, que juegan un papel en la inmunidad mediada de célula. Las células T se originan de células madre hematopoyéticas en la médula ósea, maduras en el timo (que es de donde T se deriva) y ganan su función completa en tejidos linfoides periféricos. Durante el desarrollo de células T, células T CD4-CD8-(negativas para el correceptor CD4 y CD8) son cometidas bien a un destino αβ o y8 como resultado de un reordenamiento de gen TCR p o 8 inicial. Las células que padecen un reordenamiento de cadena temprano p expresan una estructura pre-TCR compuesta por una cadena completa p y una cadena pre-TCR a en la superficie celular. Tales células cambian a un estado CD4+CD8+, reordenan el locus de cadena TCRa y expresan un TCR αβ maduro en la superficie. Las células T CD4'CD8‘ que exitosamente completan el reordenamiento de gen y antes de que el reordenamiento de gen p exprese un TCR y8 funcional y permanezca CD4'CD8‘. (Claudio Tripodo et al. Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6, 707-717 (December 2009). El receptor de células T se asocia con el complejo de proteína CD3. Las células T maduras, es decir, la expresión de un TCRap o un TCRy8, expresan el complejo de receptor de células T en la superficie celular. Las células Ty8, que constituyen aproximadamente 1-5% de la población total de células T, se puede dividir en subpoblaciones adicionales. Una sub-población de células Ty8 constituye células T γ9δ2, que expresan un TCR γ9δ2. En el dominio extracelular de un receptor de células T se localizan tres regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2; CDR3). Estas regiones son en general los dominios más variables y contribuyen significativamente a la diversidad entre TCR. Las regiones
CDR están compuestas durante el desarrollo de una célula T donde los denominados segmentos de gen Variables-(V), Diversos-(D) y de unión-(J) se combinan de forma aleatoria para generar diversos TCR.
[0031] Las células T αβ se pueden definir con respecto a la función como linfocitos T que expresan un TCRap, que reconoce péptidos limitados a moléculas MHC (complejo mayor de histocompatibilidad), que se expresan en la superficie de varias células. Los MHC presentan péptidos derivados de las proteínas de una célula. Cuando por ejemplo una célula se infecta con un virus, el MHC presentará péptidos víricos y la interacción entre el complejo TCRap y MHC activa tipos específicos de células T que inician respuestas inmunológicas para eliminar la célula infectada. Por lo tanto, las células T αβ se pueden definir funcionalmente como que son células capaces del reconocimiento de péptidos unidos a moléculas MHC. Las células T αβ se pueden seleccionar de sangre periférica por ejemplo mediante el antígeno CD3 como se describe a continuación y en los ejemplos, ya que la mayoría de células T tienen el TCRap. Las células T αβ también se pueden seleccionar con un anticuerpo específico para el TCRap, tal como se ha descrito a continuación. De tales células seleccionadas, la secuencia de ácido nucleico (o aminoácido) que corresponde con la cadena de receptor de células Ta y la cadena de receptor de células Tp se puede determinar. Por lo tanto, las células T αβ también se pueden definir como que son células que comprenden una secuencia de ácido nucleico (o aminoácido) que corresponde a la cadena de receptor de células Ta y/o la cadena de receptor de células Tp.
[0032] Las células T γ9δ2 pueden ser funcionalmente definidas en que estas se activan en concreto y rápidamente por un conjunto de precursores de isoprenoide fosforilado no peptídicos, nombrados colectivamente fosfoantígenos. Los fosfoantígenos se producen por prácticamente todas las células vivas. El fosfoantígeno más común encontrado en células animales y humanas (con células cancerosas) es pirofosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP). La activación de células T γ9δ2 comprende expansión clonal, actividad citotóxica y expresión de citocina. Las células T γ9δ2 se definen también por expresión del receptor de células T y952. Por ejemplo, las células se pueden seleccionar utilizando un anticuerpo específico para el receptor de células T γ9δ2 tal como descritas a continuación. De tales células seleccionadas, se puede determinar la secuencia de ácido nucleico (o secuencia de aminoácidos) que corresponde con el receptor de cadena celular Ty9 y/o el receptor de cadena celular T 62. Por lo tanto, las células T γ9δ2 también se pueden definir como que son células que comprenden una secuencia de ácido nucleico (o aminoácido) que corresponde a un receptor de cadena celular T y9 y/o un receptor de cadena celular T 62.
[0033] El experto en la técnica es bien capaz de seleccionar y/o identificar poblaciones celulares caracterizadas por el hecho de que la expresión de un antígeno o receptor en la superficie de la célula tal como se ha descrito en todo el documento. Se entiende que con respecto a la expresión en la superficie de las células, tal como CD3, CD4, CD8, TCRap, TCR y6 y TCR γ9δ2, se hace típicamente en una población de células de las cuales una porción de células tiene un nivel mucho más alto de expresión del antígeno cuando se compara con células con un nivel inferior de expresión. Por lo tanto, los términos positivo o negativo se deben entender como que son relativos, es decir, las células positivas tienen un nivel de expresión mucho más alto en comparación con células que son negativas. Las células que son negativas en este sentido pueden así todavía tener un nivel de expresión que se puede detectar. La expresión en la superficie de las células se puede analizar usando la selección de célula activada por fluorescencia (FACS) y muchos anticuerpos específicos están disponibles comercialmente, por ejemplo tal como para CD3, CD4, CD8, TCRap, TCRy6 y TCRγ9δ2, que se adecuan a este tipo de análisis FACS, tal como se ha descrito en los ejemplos y como está disponible. Las células T γ9δ2 pueden por lo tanto también ser definidas y seleccionadas como que son positivas para TCR γ9δ2 en FACS. Los anticuerpos adecuados para FACS o técnicas de separación similares (tal como por ejemplo anticuerpos conjugados para perlas magnéticas) están ampliamente disponibles. Las condiciones son seleccionadas, tal como se proporciona por el fabricante de anticuerpos que permite la selección de células negativas y/o positivas. Los ejemplos de anticuerpos que se pueden adecuar para selección de células T γ9δ2 o células modificadas T γ9δ2 tales como están disponibles de BD Pharmingen (BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA) son Vy9-PE (clon B3; #555733), V62-FITC (clon B6, # 555738), y6TCR-APC (clon B1; #555718) o tal como disponible de Beckman Coulter es pan-Y6TCR-PE (clon IMMU510, # IM1418U). De forma similar, los anticuerpos adecuados para la selección celular T BD, tal como anticuerpos de anti-CD3 pueden ser tales como están disponibles en BD Pharmingen es CD3-FITC (#345763) o tal como anti-TCRap anticuerpos tal como los disponibles en Beckman Coulter is pan-TCRap-PE (#A39499) o pan-TCRap-PC5 (#A39500).
[0034] Por consiguiente, en el método de la divulgación, se proporcionan primeras células T. Las células T pueden ser células primarias, por ejemplo a partir de un sujeto, tal como se describe en los ejemplos para un sujeto humano. Las células T pueden ser células T ap. Las células T también pueden ser líneas celulares, tales como SupT-1, Jurkat o células Raji o cualquier otra línea celular ampliamente disponible. Cualquier tipo celular, siendo una célula primaria o cualquier otra línea celular bastará, siempre y cuando la población celular o una parte sustancial de la misma exprese el receptor de células T, es decir, tal como que es positivo para el receptor de células T αβ en una selección FACS o similar como se ha descrito anteriormente, tal población celular se puede contemplar. También, cualquier célula o población celular se puede contemplar que, cuando está provista de un receptor TCR γ9δ2 según la divulgación es capaz de formar un complejo TCR funcional y ejercer por ejemplo una respuesta citóxica funcional y/o producción de citocina. La célula que está provista también puede ser una célula original, preferiblemente, una célula original sanguínea tal como un timocito o una célula madre
sanguínea, que después se ha provisto con los estímulos adecuados puede desarrollar en células T o células T modificadas. Por lo tanto, se entiende que la provisión de células T y provisión de estas con el receptor TCR Y962 según la divulgación también puede comprender la provisión de células originales, provisión de estas con el receptor TCR γ9δ2 y estimular estas células originales de manera que estas se desarrollen en células T modificadas.
[0035] La divulgación, pero no la invención reivindicada, también proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 donde la región de codificación CDR3 y9 es de forma aleatoria modificada y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica de una cadena receptora de célula T 62 donde la región de codificación CDR362 se modifica de forma aleatoria. Preferiblemente, la cadena receptora de célula T Y9 y la cadena receptora de célula T 62 son de origen humano. Las regiones humanas CDR3 y9 y 62 son bien definidas. Por ejemplo, la región humana CDR3 de la TCR y9 cadena de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.1 corresponde a residuos de aminoácidos 118-132, que corresponde a residuos de aminoácidos y105-y117 según el sistema de información internacional Immunogenetics (IMGT). La región humana CDR3 de la cadena TCR 62 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2 corresponde a residuos de aminoácidos 112-127 que corresponde a residuos de aminoácidos 6105-6117 según el IMGT. Según el sistema de información internacional Immunogenetics (IMGT) (Lefranc MP. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. 2003,31:307-31 0) la región humana CDR3 se puede delimitar por, pero no incluye, las posiciones de anclaje C104 y F118, ver también la tabla 3, que se refieren para cada cadena como yC104 y yF118 y yC104 y YF118. La posición de anclaje yC104 corresponde a C117 en la SEQ ID NO.1 y yF 118 corresponde a F133 en la SEQ ID NO.1. La posición de anclaje 6C104 corresponde a C111 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2 y la posición de anclaje 6F118 corresponde a F128 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2. El IMGT proporciona un acceso común para secuencia, genoma y estructura por ejemplo de receptores de células T de diferentes especies con receptores de célula humana T y permite la identificación de una cadena receptora de célula T y9 y una cadena receptora de célula T 62 con las regiones CDR3, por ejemplo mediante las posiciones de anclaje.
[0036] Según el IMGT, el CDR3 se delimita por (pero no incluye) las posiciones de anclaje segunda-CYS 104 y Phe de J o Trp de J 118. La juntura incluye segunda CYS 104 y Phe de J o Trp de J 118 y es por lo tanto dos aminoácidos más larga que el CDR3. La CDR3 numeración va de 105 a 117 y, si es necesario, se agregan espacios o posiciones adicionales en la parte superior del bucle. Cabe destacar que, el J-Phe o J-Trp pertenece al motivo de J-REGION característico 'HW-G-X-G' a posiciones 118-121 y que la CDR3 se delimita por las mismas posiciones de anclaje (segunda-CYS 104 y J-Phe o J-Trp 118), sea el tipo receptor (IG o TR), el tipo de cadena (pesada o ligera para IG; alfa, beta gamma o delta para TR) o las especies. Ver también http://www.imgt.ORG/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTIGVLsuperfamily.html para una explicación de la numeración IMGT. Esta numeración IMGT también se usa en los ejemplos.
[0037] Por lo tanto, usando las posiciones de anclaje, según los estándares IMGT, las regiones CDR3 pueden fácilmente ser identificadas. Por ejemplo, entrando una secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácidos nucléicos) usando herramientas disponibles en línea tales como las proporcionadas por IMGT (por ejemplo IMGT/V-QUEST) una secuencia de cadena receptora de célula T y9 o una secuencia de cadena receptora de célula T 62 pueden fácilmente ser identificadas como las regiones CDR3 exactas. Alternativamente, las secuencias de cadena receptora de célula T y9 o secuencias de cadena receptora de célula T 62 ya disponibles públicamente pueden encontrarse en el IMGT y por lo tanto, las regiones CDR3 se pueden identificar fácilmente de ahí. Alternativamente, usando la SEQ ID NO.1 y SEQ ID No.2 como una secuencia de referencia y las posiciones de residuo de aminoácido de anclaje en estas, las regiones CDR3 de otras cadenas receptoras celulares T y9 y celulares T 62 se identifican fácilmente mediante un alineamiento, tal como se ha representado para diferente región CDR3 en la tabla 3. Por lo tanto, la persona experta puede fácilmente identificar cualquier región CDR3 de cualquier secuencia de cadena receptora T y9 que corresponde con la región CDR3 de la SEQ ID NO.1 y también la persona experta puede fácilmente identificar cualquier región CDR3 de cualquier secuencia de cadena receptora de célula T 62 que corresponde con las regiones CDR3 de la SEQ ID NO.2. Por lo tanto, la persona experta sabe que secuencia de aminoácidos de cualquier cadena receptora de célula T y9 y/o T62 necesita modificar de forma aleatoria.
[0038] Por lo tanto, la modificación de la región de codificación CDR362 en una secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T 62 puede comprender el alineamiento de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO.4 a la secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T 62 de interés, identificando los codones en la secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T 62 que corresponde con los codones que codifican las posiciones de anclaje en la SEQ ID NO.4, y de forma aleatoria modifican la secuencia de ácidos nucleicos entre los codones de posiciones de anclaje identificados en la secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T 62 de interés. También, la modificación de la región de codificación CDR3 y9 en una secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T y9 puede comprender el alineamiento de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO.4 a la secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T y9 de interés, identificando los codones en la secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T y9 que corresponde con los codones que codifican las posiciones de anclaje en la SEQ ID NO.3, y de forma aleatoria modifican la secuencia de ácidos nucleicos entre los codones de posiciones de anclaje
identificados en el secuencia de ácidos nucleicos de cadena receptora de célula T y9 de interés. La modificación aleatoria de la secuencia de ácidos nucleicos de las regiones de codificación CDR3 es de manera que la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos se modifica, es decir, al menos un residuo de aminoácido se cambia a otro residuo de aminoácido o al menos un residuo de aminoácido está insertado o eliminado.
[0039] En el método de la divulgación, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la cadena receptora de célula T y9 y la cadena receptora de célula T62 se pueden introducir en células T para proveer a unas células T modificadas con un receptor de células T y 962 que comprende la cadena receptora de célula T y9 y la cadena receptora T 62. Por expresión de la cadena receptora de célula T y9 y la cadena receptora de célula T62 de la cual las regiones CDR3 han sido modificadas de forma aleatoria, un receptor de células T γ9δ2 específico se expresa en la célula. Opcionalmente, los pasos de proporcionar una cadena receptora de célula T y9 modificada de forma aleatoria CDR3 y la cadena receptora de célula T62 e introducción posterior en células T se pueden repetir. Por ejemplo, cada vez que se ha hecho, se usa una combinación diferente de regiones modificadas de forma aleatoria CD3. También está previsto que las etapas de repetición de los pasos, por ejemplo con combinaciones diferentes de regiones CD3 modificadas de forma aleatoria se puedan realizar, al menos en parte, simultáneamente. Por ejemplo, una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 donde la región de codificación CDR3 y9 se modifica de forma aleatoria y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T 62 donde la región de codificación CDR362 se modifica de forma aleatoria, puede estar prevista y esta pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos se puede introducir en células T proporcionando así una pluralidad de células T modificadas.
[0040] Se identifica la respuesta antitumoral de la expresión de células T modificadas previstas de un receptor de células T γ9δ2 o un receptor de células T γ9δ2 modificado que median respuestas antitumorales. En el caso de que los pasos de provisión de las secuencias de ácidos nucleicos e introducción en las células T se realicen en pasos separados, el paso de determinación de las respuestas antitumorales e identificación del receptor de célulasmodificada T γ9δ2 se pueden combinar porque se sabe qué secuencias de ácidos nucleicos fueron introducidas en cada una de la célula modificada T y 962. Determinar las respuestas antitumorales puede por lo tanto realizarse para cada célula T γ9δ2 modificada separadamente. Alternativamente, por ejemplo cuando las células T γ9δ2 están modificadas se combinan, por ejemplo cuando la repetición de los pasos tal como anteriormente descritos se realiza simultáneamente, y se proporciona una pluralidad de células T modificadas, las células T modificadas se pueden separar y la respuesta antitumoral se determina para cada una de las células T modificadas separadas. Las células T modificadas se pueden separar sobre compartimentos diferentes y en cada uno de los compartimentos se puede determinar la respuesta antitumoral. En tal escenario, la etapa de identificar las células T modificadas que median respuestas antitumorales puede implicar la determinación de la secuencia, por ejemplo mediante secuenciación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica cada una de las regiones CDR3 del TCR γ9δ2. Por lo tanto, opcionalmente como un paso final, identificación de células T modificadas que median respuestas antitumorales implica la determinación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena receptora de célula T y9 que comprende la región de codificación CDR3 Y9y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la cadena receptora de células T62 que comprende la región de codificación CDR3 62. También puede estar previsto solo para determinar la secuencia de ácidos nucleicos de ambas regiones de codificación CDR3 y9y CDR362, es decir, no se requiere para determinar las secuencias de ácidos nucleicos completas de la cadena receptora de célula T y9 y/o la cadena receptora de célula T 62. Como una alternativa para determinar la secuencia de ácidos nucleicos, las secuencias de aminoácidos de la región CDR3 Y9 y CDR362 también se pueden determinar.
[0041] La secuencia de ácidos nucleicos divulgada que codifica una cadena receptora de célula T y9 que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 y donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T 62 codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 comprende preferiblemente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica de una secuencia de aminoácidos con al menos 70, 80, 90,95 o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T 62 comprende preferiblemente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 70, 80, 90,95 o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2. La persona experta es capaz de definir un receptor de células T γ9δ2 respecto a la función. Preferiblemente, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula sobre toda la longitud de la SEQ ID NO.1 o la SEQ ID NO.2.
[0042] La modificación aleatoria de las regiones CDR3 del CDR3 y9y CDR362 pueden comprender la selección arbitraria de residuos de aminoácidos. Tal selección arbitraria se puede realizar generando secuencias aleatorias in vitro, por ejemplo por síntesis química aleatoria, tal como se ha previsto por Sloning Biotechnology usando síntesis química (Sloning Biotechnology GmbH - A Division of MorphoSys, Zeppelinstrasse 4, 82178 Puchheim, Germany). La modificación aleatoria de las regiones CDR3 de las CDR3 y9 y CDR3 62 también puede comprender la selección arbitraria de secuencias encontradas en regiones naturales CDR3. Tales secuencias de
aminoácidos naturales CDR3 se generan de forma aleatoria, es decir seleccionadas de forma arbitraria, por naturaleza.
[0043] Con respecto a la modificación aleatoria, la región de codificación modificada de forma aleatoria CDR3 y9 puede preferiblemente ser modificada en la secuencia de aminoácidos que corresponde con residuos de aminoácidos 118-132 de la SEQ ID N.° 1. Con respecto a la modificación aleatoria, la región de codificación modificada de forma aleatoria CDR3 y9 puede preferiblemente ser modificada en la secuencia de aminoácidos que corresponde con residuos de aminoácidos 122-124 de la SEQ ID N.° 1. Como se ha dicho, una CDR3 y9 región de codificación se ha identificado fácilmente, por ejemplo, mediante alineamiento y/o información como se ha proporcionado por IMGT y, por lo tanto, los residuos de aminoácidos a partir de una región de codificación CDR3 y9 que corresponde también a los residuos de aminoácidos 118-132 de la SEQ ID NO.1. Opcionalmente, los residuos de aminoácidos C117 y F133 de la SEQ ID NO.1 se pueden usar además para identificar los residuos de aminoácidos correspondientes. En un alineamiento, tal como en la tabla representada 3, los residuos de aminoácidos de una región de codificación CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 118-132 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.1 pueden fácilmente ser identificados y así también los residuos de aminoácidos que corresponden a residuos de aminoácidos 122-124 de la SEQ ID N.° 1. Por lo tanto, una secuencia correspondiente puede ser fácilmente identificada alineando la secuencia de aminoácidos de interés a la secuencia de aminoácidos de referencia (SEQ ID NO.1) e identificando los residuos de aminoácidos de anclaje C117 y F133, de modo que se identifica la región CDR3. Después, las regiones CDR3 se alinean y los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que corresponden a 118-132 de la SEQ ID NO.1 se identifican. Con respecto a la modificación aleatoria, la región de codificación modificada de forma aleatoria CDR3 62 se puede modificar en la secuencia de aminoácidos que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2. Con respecto a la modificación aleatoria, la región de codificación modificada de forma aleatoria CDR3 62 se puede modificar en la secuencia de aminoácidos que corresponde con residuos de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID NO.2. Una región de codificación CDR362 puede ser fácilmente identificada, por ejemplo mediante alineamiento y/o de información como se ha proporcionado por IMGT y, por lo tanto, también los residuos de aminoácidos a partir de una región de codificación CDR3 62 que corresponde a los residuos de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID NO.2. Opcionalmente, los residuos de aminoácidos C111 y F128 de la SEQ ID NO.2 pueden ser además usados para identificar los residuos de aminoácidos correspondientes. En un alineamiento, tal como en la tabla representada 3, los residuos de aminoácidos de una región de codificación CDR362 que corresponde con residuos de aminoácidos 112-127 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2 se pueden identificar fácilmente. Por lo tanto, una secuencia correspondiente se puede identificar fácilmente mediante alineando la secuencia de aminoácidos de interés a la secuencia de aminoácidos de referencia (SEQ ID NO.2) e identificando los residuos de aminoácidos de anclaje C111 y F128, de manera que la región CDR3 se identifique. Después, las regiones CDR3 se alinean y los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que corresponden a 112-127 de la SEQ ID NO.2 se pueden identificar y así también la secuencia de aminoácidos que corresponde a residuos de aminoácidos 115-122.
[0044] En una forma de realización de la divulgación, la modificación de forma aleatoria de la secuencia de aminoácidos que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2 comprende una modificación en la longitud.
[0045] En una forma de realización de la divulgación, la modificación de forma aleatoria de la secuencia de aminoácidos que corresponde con residuos de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID NO.2 comprende una modificación en la longitud.
[0046] En una forma de realización de la divulgación, la modificación de forma aleatoria de la secuencia de aminoácidos comprende la introducción de sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones.
[0047] Con respecto a la modificación aleatoria, esta puede incluir cualquier modificación tal como sustitución de aminoácido, deleción y/o inserción. Por lo tanto, la modificación aleatoria puede incluir una modificación en la secuencia y/o longitud. Así, las regiones CDR3 pueden variar en longitud que varía de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21 o 22 residuos de aminoácido. Preferiblemente, la región de codificación CDR3 62 puede variar en la longitud que varía de 5-7 aminoácidos entre posiciones 6L109 y 6T113 según la anotación IGMT. Por lo tanto, preferiblemente la región de codificación CDR3 62 que corresponde con la secuencia de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID NO.2 se modifica de forma aleatoria entre L116 y T123 de la SEQ ID NO.2 de manera que esta contiene 5-7 aminoácidos en esta región. Por lo tanto, toda la región de codificación CDR3 62 varía preferiblemente en la longitud que varía de 15-17 residuos de aminoácidos. La sustitución de aminoácidos puede incluir cualquier sustitución tal como sustituciones conservadas donde un aminoácido a partir de un grupo se cambia por otro residuo de amino ácido del grupo, por ejemplo un residuo de aminoácido alifático se intercambia por otro residuo de aminoácido alifático, o una sustitución no conservada donde un aminoácido a partir de un grupo se cambia por otro residuo de aminoácido de un grupo diferente, por ejemplo un residuo de aminoácido alifático se intercambia por un residuo de aminoácido básico.
[0048] Con respecto a la provisión de un ácido nucleico, se entiende que el ácido nucleico se proporciona de manera que cuando se introduce en una célula que se puede expresar, de manera que la secuencia de
aminoácidos que codifica se exprese en la superficie de la célula. Preferiblemente, esto se ha hecho por integración del ácido nucleico o ácidos nucleicos en el genoma de la célula. Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 se proporciona en una construcción genética y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T 62 se proporciona en una construcción genética. Las construcciones genéticas pueden estar previstos en vectores separados. Las construcciones genéticas también pueden estar previstos en un vector único. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica de una cadena receptora de célula T 62 también puede estar prevista en una única construcción genética. Por ejemplo, una única construcción genética puede expresar un ARNm único que incluye un sitio interno de entrada ribosomal, tal como se ha descrito en el ejemplo, de manera que cada cadena receptora pueda ser transcrita del mismo ARNm.
[0049] La construcción genética y/o vectores también pueden comprender marcadores seleccionables. Un marcador seleccionable se puede definir como cualquier secuencia de ácidos nucleicos y/o secuencia de aminoácidos que permita seleccionar las células que se proporcionan con ellas. Por ejemplo, los marcadores seleccionables pueden ser genes de resistencia a neomicina o puromicina tal como se describe en los ejemplos. La selección de células a la que la construcción genética y/o vector ha sido transferida puede ser realizada por incubación en presencia de neomicina o puromicina. Otros marcadores seleccionables pueden ser por ejemplo cualquier proteína verde, roja y amarilla fluorescente. La selección se puede realizar usando fAc S. No se requiere tener un marcador seleccionable, ya que la célula cuando se expresa el receptor de células T γ9δ2 se puede seleccionar basada en esa expresión en sí misma, por ejemplo, mediante selección con un anticuerpo dirigido a ella tal como se ha descrito anteriormente. Se puede prever que la célula huésped no exprese una cantidad sustancial del receptor de células T γ9δ2 para permitir la selección de las células T γ9δ2 modificadas, es decir, la expresión del receptor de células T γ9δ2 endógeno debe ser muy inferior en comparación con el receptor de células T γ9δ2 modificado.
[0050] Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 se proporciona en un vector retroviral y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T 62 se proporciona en un vector retroviral y los pasos de introducción de las secuencias de ácidos nucleicos en las células T comprende la transducción de vector retroviral de las células T. La transducción se puede realizar simultáneamente o en pasos posteriores. Alternativamente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T y9 y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena receptora de célula T 62 se proporciona en un único vector retroviral y los pasos de introducir las secuencias de ácidos nucleicos en las células T comprenden la transducción de vector retroviral de las células T. Los vectores retrovirales tal como están descritos en los ejemplos son altamente eficaces para la transferencia de las secuencias de ácidos nucleicos a las células T de manera que se pueden prever las células T modificadas. Muchos vectores retrovirales y lentivirales se conocen o son tal como se describe en los ejemplos. Los vectores retrovirales tienen un genoma de ARN que, cuando se ha introducido en una célula, está transcrito inverso en el ADN que está posteriormente integrado en el genoma huésped. La integración es ventajosa, ya que esta permite la proliferación de células transducidas mientras se mantiene el genoma de vector vírico que comprende la construcción genética. Las secuencias de ácido nucleico, las construcciones genéticas y/o los vectores descritos anteriormente pueden introducirse en las células apT de la invención utilizando los métodos descritos anteriormente.
[0051] En una forma de realización, la etapa de determinar la reactividad antitumoral comprende contactar las células con células tumorales. Las células tumorales pueden ser cualquier tipo de células tumorales. Por ejemplo, células tumorales primarias de un paciente. Las células tumorales pueden ser células tumorales de líneas celulares, tales como las líneas celulares enumeradas en los ejemplos nombrados Daudi, RPMI8226/S, OPM2, LME1; K562, Saos2, MZ1851RC, SCC9, Fadu, MDA-MB231, MCF7; BT549; SW480, que son bien conocidos en la técnica. Líneas celulares tumorales pueden fácilmente ser obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, Virginia) y similar. La etapa de determinación de actividad antitumoral puede incluir cualquier ensayo donde un efecto antitumoral puede ser determinado, tal como con un efecto en el índice de división de la célula tumoral, es decir, la velocidad con la cual las células tumorales se dividen, muerte celular, unión a las células tumorales, etc.
[0052] La determinación de las respuestas antitumorales incluye el contacto de las células T modificadas con una célula tumoral y medición de su capacidad para lisar la célula tumoral y/o inducir la producción IFN-y. La capacidad para lisar las células tumorales incluye proporcionar una cantidad fija de células tumorales con la cual la célula modificada T γ9δ2, es decir, una célula T modificada de expresión de TCR γ9δ2 se contacta y se cuenta después de un periodo de incubación del número de células tumorales viable. Cuando el número de células viables contado se compara con un control no contactado con la célula modificada T γ9δ2 y el número es inferior, tal célula modificada Tγ9δ2 se puede considerar que tiene una respuesta antitumoral. Además de contar las células viables, también se puede realizar un ensayo de liberación de cromo51 de forma similar a lo que se describe en los ejemplos. La cantidad de liberación de cromo51 es una medida del número de células que han sido lisadas.
[0053] De forma similar, también se puede determinar la producción IFN-y, por ejemplo mediante coloración de anticuerpo, ELISA y/o PCR cuantitativo para el ARNm expresado. Los ensayos para determinación IFN-y están muy disponibles comercialmente, tal como los descritos en el ejemplo. Las células T γ9δ2 modificadas se contactan con las células tumorales. El contacto puede ser en presencia de un fosfoantígeno, tal como pamidronato. Por lo tanto, cuando la cantidad de IFN-y producida es más alta en comparación con cuando las células no se contactan con la célula T γ9δ2 modificada, tal célula T γ9δ2 modificada se puede considerar como que tiene una respuesta antitumoral. Además de la comparación con un control, es decir, con células no contactadas con la célula T γ9δ2 modificada, también se puede comparar con un valor de referencia. En cualquier caso, se puede contemplar cualquier ensayo donde se puede determinar un efecto en las células tumorales que implique contactar la célula T γ9δ2 con la célula tumoral. En tanto que se puede determinar un efecto antitumoral, tal como inducción de muerte celular, viabilidad celular, unión a la célula tumoral y/o producción IFN-y.
[0054] Además, con respecto a los métodos anteriormente descritos, las células T se pueden expandir antes o después de la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican el receptor de células T γ9δ2 modificadas, es decir con las regiones CDR3 modificadas de forma aleatoria. Preferiblemente, la expansión después de la transferencia es de tal manera que relativamente pocos ácidos nucleicos necesitan ser transferidos. Esta expansión de las células T se puede realizar por estimulación con a-CD3/CD28 Dynabeads en presencia de IL-2. Un protocolo de expansión rápida tal como se ha descrito en los ejemplos también se puede usar. Las células expandidas que comprenden el receptor de células T γ9δ2 modificada, que se puede seleccionar por ejemplo, mediante un marcador seleccionable tal como anteriormente se ha descrito, puede ser adicionalmente seleccionado para la presencia del antígeno CD4 y el antígeno CD8, por ejemplo utilizando el sistema de separación mAcS como se describe en los ejemplos. Las células T modificadas se pueden expandir además posteriormente utilizando el protocolo REP como se describe por Riddel y Greenberg, 1990 J Immunol Methods.
128(2):189-201 o usando métodos de expansión adicionales similares a ellos. Brevemente, el método de expansión implica el uso de anticuerpos dirigidos contra las moléculas de activación de célula T, tal como TCR, CD3 y CD28 y/o células alimentadoras y/o citocinas estimulantes. En consecuencia, la determinación de la respuesta antitumoral de las células apT de la invención se puede realizar como se ha descrito anteriormente.
[0055] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T y952 que comprende una cadena receptora de células T y9 que comprende una región y9-CDR3, donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 122 124 de la SEQ ID NO.1 se modifica y una cadena receptora de célula T 62 que comprende una región CDR362 donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 115 122 de la SEQ ID NO.2 se modifica, donde las combinaciones de las modificaciones de aminoácido en el receptor de células T γ9δ2 o un fragmento del mismo, son enumeradas como en la tabla 1. Las sustituciones pueden comprender las combinaciones tal como se enumeran en la tabla 1. Las secuencias de aminoácidos de las regiones respectivas CDR3 y9 y CDR3 62 se sustituyen con secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en combinaciones de secuencias de aminoácidos AQQ (y9) y ALKRTD (62); AQQ (y9) y LLGY(62); CI (y9) y ALKRTD (62); y; CI (y9) y TLGMGGEY(62). Estos receptores de células T γ9δ2 o fragmentos de los mismos, que comprenden estas combinaciones particulares de regiones CDR3 fueron identificados utilizando los métodos según la invención tal como anteriormente descritos y como se describe en los ejemplos.
[0056] Las combinaciones de secuencias de aminoácidos de regiones CDR3 y9 y CDR3 62 que pueden ser preferiblemente combinadas se enumeran en la tabla 1 siguiente, ya que muestran un efecto antitumoral.
[0057] Tabla 1. Combinaciones de secuencias de aminoácidos de regiones CDR3 y9 y CDR362. La región que corresponde con residuos de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con número 122-124 de la SEQ ID NO.1 que ha sido sustituida, es decir, ha sido modificada, enumerada y la región que corresponde con residuos de aminoácidos de la región CDR3 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2 que ha sido sustituida también se enumeran. Las combinaciones diferentes de CDR3 y9 y CDR3 62 se numeran de 1-4. Por ejemplo, el número 2 corresponde a un TCR γ9δ2 con una cadena receptora de célula T y9 donde la región CDR3 y9 que corresponde con el número 122-124 de la SEQ ID NO.1 ha sido sustituida por AQQ y una cadena receptora de célula T 62 donde la región CDR3 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2 ha sido sustituida con ALKRTD.
Tabla 1: combinaciones de secuencias de aminoácidos modificadas de regiones CDR3 y9 y CDR382, donde las secuencias de aminoácidos enumeradas sustituyen los residuos de aminoácidos CDR3 y9 correspondientes a 122-124 de la SEQ ID NO.1 y sustituyen residuos de aminoácidos CDR382 correspondientes a 115-122 de la
SEQ ID NO.2.
[0058] En otra forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2 que comprende una cadena de receptor de células T y9 que comprende una región CDR3 y9, donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 118 132 de la SEQ ID NO.1 se modifica y una cadena receptora de célula 82 que comprende una región CDR382 donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 82 que corresponde con residuos de aminoácidos 112 127 de la SEQ ID NO.2 se modifica, donde las combinaciones de las modificaciones de aminoácido en el receptor de células T γ9δ2 o un fragmento del mismo se enumeran como en la tabla 2. Las sustituciones pueden comprender las combinaciones tal como se enumeran en la tabla 2. Las secuencias de aminoácidos de las respectivas CDR3 y9 y CDR382 regiones se sustituyen con secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en combinaciones de secuencias de aminoácidos ALWEIQELGKKIKV (y9) y ACDALKRTDTDKLI (82); ALWEAQQELGKKIKV (y9) y ACDALKRTDTDKLI (82); ALWEIQELGKKIKV (y9) y ACDTLGMGGEYTDKLI (82); ALWEAQQELGKKIKV (y9) y ACDLLGYTDKLI (82). Estos receptores de células T γ9δ2 o fragmentos de los mismos, que comprenden estas combinaciones particulares de regiones CDR3 fueron identificados utilizando los métodos según la invención tal como anteriormente se han descrito y como se describen en los ejemplos.
[0059] Las combinaciones de secuencias de aminoácidos de regiones CDR3 y9 y CDR3 82 que pueden ser preferiblemente combinadas se enumeran debajo en la tabla 2, ya que muestran un efecto fuerte antitumoral.
[0060] Tabla 2. Combinaciones de secuencias de aminoácidos de las regiones CDR3 y9 y CDR382. La región que corresponde con residuos de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con el número 118-132 de la SEQ ID NO.1 que ha sido sustituida, es decir, se ha modificado, enumerado y la región que corresponde con residuos de aminoácidos de la región CDR3 82 que corresponde con residuos de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID NO.2 que se ha sustituido, es decir, modificado, también se ha enumerado. Las combinaciones diferentes de CDR3 y9 y CDR382 son numeradas de 1-4 en la tabla 2. Por ejemplo, el número 2 corresponde a un TCR γ9δ2 con una cadena receptora de célula T y9 donde la región CDR3 y9 que corresponde con el número 118-132 de la SEQ ID NO.1 se ha modificado para (sustituido con) ALWEAQQELGKKIKV y una cadena receptora de célula T 82 donde la región CDR382 que corresponde con residuos de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID NO.2 ha sido modificado para (sustituido con) ACDALKRTDTDKLI.
T 2: m in i n n i min i m ifi m l r i n DR DR 2
[0061] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2 que comprende una cadena de receptor de células T y9 que comprende una región CDR3 y9, donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 122 124 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 es AQQ y una cadena receptora de célula T 82 que comprende una región CDR382 donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR382 que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 es ALKRTD. En otra forma de realización de la invención, dicho receptor de células T γ9δ2 de la invención comprende una cadena receptora de célula T y9 que comprende una región CDR3 y9, donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 118-132 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 es ALWEAQQELGKKIKV y una cadena receptora de célula T 82 que comprende una región CDR3 82 donde la secuencia de aminoácidos de la región c DR382 que corresponde con residuos de aminoácidos 112 128 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 es ACDALKRTDTDKLI. Esta combinación particular de regiones CDR3 en el receptor de células T γ9δ2 ha mostrado una actividad antitumoral particularmente alta y, por lo tanto, se puede preferir.
[0062] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2 según la invención, donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 118-121 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 es ALWE y donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 125-132 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 es ELGKKIKV y donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 62 que corresponde a residuos de aminoácidos 112-114 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2. es ACD y donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 123-127 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 es TDKLI. Se entiende que estas secuencias de aminoácidos corresponden a las secuencias que flanquean las secuencias de aminoácidos que se deben sustituir con las secuencias de aminoácidos como se ha enumerado antes.
[0063] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2, donde la cadena receptora de célula T y9 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 1 y/o donde la cadena receptora de célula T 62 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2. Se entiende que la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con el número de residuos de aminoácidos 122-124 de la SEQ ID NO.1 y la secuencia de aminoácidos de la región CDR362 que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2 en esta forma de realización se sustituyen conforme a la tabla 1.
[0064] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2, donde la cadena receptora de célula T y9 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 1-121 y 125-315 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 y donde los residuos de aminoácidos modificados 122-124 son tal y como se define en la tabla 1 y donde la cadena receptora de célula T 62 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 1-114 y 123-292 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 y donde los residuos de aminoácidos modificados 115-122 son tal y como se define en la tabla 1. Se entiende que la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con número de residuos de aminoácidos 122-124 de la SEQ ID NO.1 y la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2 están en esta forma de realización sustituidas conforme a la tabla 1.
[0065] Se entiende que la SEQ ID de secuencias de aminoácidos NO.1 y SEQ ID NO.2 comprenden cada una una secuencia líder. La secuencia líder de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.1 es de aminoácido n° 1-20 de la SEQ ID NO.1. La secuencia líder de la SEQ ID de secuencia de aminoácidos NO.2 es de aminoácido n° 1 19 de la SEQ ID NO.2. La secuencia líder puede dirigir la cadena de aminoácidos a la superficie de la célula. La secuencia líder se puede dividir desde la naciente cadena de aminoácidos y no está presente en la proteína final. Por lo tanto, se proporciona, en una forma de realización de la invención, una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2, donde la cadena receptora de célula T y9 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21-121 y 125-315 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 y donde los residuos de aminoácidos modificados 122-124 son tal y como se define en la tabla 1, y donde la cadena receptora de célula T 62 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20-114 y 123-292 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2 y donde los residuos de aminoácidos modificados 115-122 son tal y como se define en la tabla 1. Se entiende que la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con un número de residuos de aminoácidos 122-124 de la SEQ ID NO.1 y la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID NO.2, están en esta forma de realización sustituidos conforme a la tabla 1. También se entiende que puede ser opcional usar secuencias líder alternativas y también se entiende que estas secuencias líder de la SEQ ID NO.1 y la SEQ ID NO.2 pueden ser desatendidas, por ejemplo, cuando se comparan las secuencias y/se determinan las secuencias correspondientes y/o el alineamiento y/o se determinan los porcentajes de identidad.
[0066] En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2, donde el receptor de células T y9T está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 12.
[0067] En una forma de realización preferida de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2, donde el receptor de células T 62 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 14.
[0068] En otra forma de realización preferida de la invención, se proporciona una célula T αβ capaz de mediar una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2, donde:
(i) el receptor de células T y9 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 12, y
(ii) el receptor de células T 62 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:14.
[0069] Como parte de la divlgación, pero no de la invención reivindicada, un conjugado se proporciona que comprende un fragmento soluble del receptor de células T γ9δ2 según cualquiera de los receptores de células T Y9ó2 como se ha descrito anteriormente. El dominio extracelular del receptor de células T γ9δ2 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena receptora de célula T y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 21-263 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1 y la secuencia de aminoácidos de la cadena receptora de célula T 62 que corresponde con residuos de aminoácidos 20-249 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2. El conjugado se puede enlazar a un agente. Preferiblemente, el agente se selecciona del grupo que consiste en un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, un agente de anticancerígeno, una sustancia química, una nanopartícula, un agente quimioterapéutico o un fluorocromo. Tales conjugados que se puede enlazar a sustratos (por ejemplo productos químicos, nanopartículas) se pueden utilizar por ejemplo para dirigir quimioterapia a una diana de interés. Además, en la expresión de diagnósticos de ligandos definidos se puede evaluar tomando la ventaja de los TCR solubles enlazados a fluorocromos que se usan luego como herramienta de coloración o para el aislamiento bioquímico del ligando.
[0070] Además, como parte de la divlgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican la cadena receptora de célula T 62 o fragmento de la misma, según la invención, donde la región CDR3 62 que corresponde a residuos de aminoácidos 115-122 de la SEQ ID de la secuencia de aminoácidos NO.2 se sustituye por residuos de aminoácidos ALKRTD o LLGY. Por lo tanto, la región CDR3 62 que corresponde a residuos de aminoácidos 112-127 de la SEQ ID de secuencia de aminoácidos NO.2 se sustituye entre D114 y T123 de la SEQ ID NO.2 con residuos de aminoácidos ALKRTD o LLGY. Como parte de la divlgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica la cadena receptora de célula T y9 o fragmento de la misma, según la divulgación, donde la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 122-124 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.1 se sustituye con residuos de aminoácidos IQ. Por tanto, la región CDR3 y9 que corresponde con residuos de aminoácidos 118-132 de la SEQ ID NO.1 de secuencia de aminoácidos se sustituye entre E121 y E 125 de la SEQ ID N.° 1 con residuos de aminoácidos IQ.
[0071] También como parte de la divlgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan construcciones genéticas que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos aisladas según la invención y vectores retrovirales que comprenden la construcción genética.
[0072] Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos aisladas se enumeran como la SEQ ID NO.3 y la SEQ ID NO.4 y corresponden respectivamente para abrir marcos de lectura de la cadena receptora de célula T y9 (codificación de secuencia de aminoácidos correspondiente SEQ ID NO.1) y la cadena receptora de célula T 62 (codificación de secuencia de aminoácidos correspondiente de la SEQ ID NO.2) del clon G115wt , tal como se describe en los ejemplos. Estas secuencias de ácidos nucleicos aisladas, cuando son parte de un casete de expresión se pueden dispersar por ejemplo por secuencias de codificación intrónica y tienen regiones 5' y 3' no codificantes. Cuando tales secuencias se expresan, la cadena receptora de célula T y9 correspondiente y las secuencias de aminoácidos de cadena receptora de célula T 62 se hacen en la célula. Por lo tanto, la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO.3 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1. La secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO.4 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2. Las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID No: 1 y SEQ ID NO.2, ya que estas se forman en la célula cada una comprende una secuencia líder. La secuencia líder de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.1 es de aminoácido n° 1-20 de la SEQ ID NO.1. La secuencia líder de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.2 es de aminoácido n° 1-19 de la SEQ ID NO.2. La secuencia líder puede dirigir la cadena de aminoácidos a la superficie de la célula. La secuencia líder se puede dividir desde la naciente cadena de aminoácidos y no está presente en la proteína final. El dominio constante de un receptor de células T γ9δ2 modificado puede tener secuencias de conexión corta donde los residuos de cisteína forman un enlace de disulfuro, que forma una conexión entre la cadena TCR y9 y la cadena TCR 62. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos C263 SEQ ID NO.1 y la secuencia de aminoácidos C249 SEQ ID NO.2, que corresponde con la cadena TCR y9 y la cadena TCR 62 de G115wt puede formar un enlace de disulfuro. Un enlace de disulfuro es un enlace covalente formado por el acoplamiento de dos grupos de tiol de las cisteínas.
[0073] Como parte de la divlgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el receptor de células T γ9δ2 o fragmento del mismo, según la divulgación, al igual que una secuencia de ácidos nucleicos que comprende construcciones genéticas o una construcción genética que codifica el receptor de células T γ9δ2 según la divulgación. Se entiende que en esta forma de realización, las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican el receptor de células T γ9δ2 deben estar comprendidas en una única secuencia de ácidos nucleicos. Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos que comprende la construcción genética o las construcciones está comprendida en un vector retroviral. Dicha secuencia de ácido nucleico, construcción genética y/o vector retroviral pueden estar comprendidos en la célula T αβ de la invención.
[0074] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ que expresa el fragmento soluble del receptor de células T γ9δ2 según la invención.
[0075] En una forma de realización de la invención, se proporciona una célula T αβ que comprende el receptor de células T γ9δ2 según la divulgación, es decir, que corresponde con los receptores de células T γ9δ2 específicos de los cuales las regiones CDR3 se sustituyen con las secuencias de aminoácidos específicas, tal como se enumeran e indican antes. En otra forma de realización de la invención, la célula T αβ comprende las secuencias de ácidos nucleicos aisladas como se ha enumerado antes, el construcción genética o construcciones genéticas según se ha enumerado antes o el vector retroviral o vectores retrovirales como se ha enumerado antes.
[0076] Además, el receptor de céula T γ9δ2 o fragmento del mismo, según la divulgación, como se ha descrito anteriormente, o un conjugado, una secuencia de ácidos nucleicos aislada o una construcción genética o un vector retroviral de la invención, como se ha enumerado antes, es para uso como un medicamento. Preferiblemente, el receptor de células T γ9δ2 o fragmento del mismo, según la divulgación, como se ha descrito anteriormente, o un conjugado, una secuencia de ácidos nucleicos aislada o una construcción genética, o un vector retroviral de la divulgación, como se ha enumerado antes es para uso como un medicamento en el tratamiento contra el cáncer.
[0077] En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula T ap según la invención.
[0078] En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica o una célula T αβ según la invención para su uso como medicamento. En una forma de realización, la composición farmacéutica o la célula T αβ según la invención es para su uso en el tratamiento del cáncer.
[0079] Se entiende que los receptores de células T αβ de la invención que expresan los receptores γ9δ2 específicos o fragmentos de los mismos, según la invención, es decir, que corresponden con los receptores de células T γ9δ2 específicos de los cuales las regiones CDR3 se sustituyen con las secuencias de aminoácidos específicas tal como se enumeran e indican antes, en particular son útiles en tratamientos médicos y/o en diagnósticos. Por ejemplo, las células inmunes se pueden redirigir contra las células cancerosas por ejemplo por transferencia ex vivo de uno de los receptores de células T γ9δ2 específicos como se ha enumerado en células T ap de un paciente seguido de expansión y transferencia adoptiva de estas células T modificadas de nuevo en el paciente. Por lo tanto, las células inmunes se pueden redirigir contra las células cancerosas. Esto también se puede hacer en combinación con cualquiera de los otros receptores (por ejemplo NKG2D) en células inmunitarias para aumentar la reactividad anticancerígena.
Ejemplos
Materiales y métodos
Células y líneas celulares
[0080] PBMC fueron aislados de capas leucocitarias obtenidas de Sanquin Bood Bank (Amsterdam, Países Bajos). Los blastos AML primarios fueron recibidos después de la obtención del consentimiento informado del biobanco LML Utrecht UMC y una donación en especie de Matthias Teobald (Mainz; Alemania) y fueron recogidos según los reglamentos GCP y Helsinki. Las líneas celulares se describen en Material suplementario y métodos.
Mutagénesis TCR, clonación y secuenciación
[0081] Las TCR γ9δ2 modificaciones se basan en genes optimizados por codón de cadena TCR y9 o 62 G115 flanqueada por sitios de restricción de por Ncol y BamHI (sintetizados por GeneArt, Regensburg, Alemania). Para generar mutaciones de alanina, mutagénesis dirigida al sitio se realizó por extension de superposición PCR 21 o mutagénesis de plásmido entero 22,23, utilizando una polimerasa de lectura y corrección (Phusion, Bioké). Las cadenas TCR y9 o 62 digeridas de Ncol-BamHI mutado fueron ligadas en el vector retroviral pBullet y secuenciadas por BaseClear (Leiden, Países Bajos).
Citometría de flujo
[0082] La expresión TCR γ9δ2 fue analizada por citometría de flujo utilizando un anticuerpo V62-FITC (clon B6, BD) o un anticuerpo pan TCRy§-PE (clon IMMU510, Beckman Coulter). El cambio múltiplo se calculó en base a valores MFI de células T transducidas Y9-G115wt/62-G115wt establecidas en 1 y células T transducidas como control a 0.
Ensayos de células T funcionales
[0083] El ensayo de liberación de cromo 51 para citotoxicidad mediada por células se ha descrito previamente. Las células diana se marcaron durante toda la noche con 100pCu 51 Cr (150pCu para células primarias) y se incubaron durante 5h con células T transducidas en cinco proporciones efector a diana (E:T) entre 30:1 y 0.3:1. El cambio múltiplo se calculó cuando se comparó con la reactividad células T modificadas de expresión de TCR Y962 no mutado. IFN-y ELISPOT fue realizado utilizando anti-huIFN-YmAb1-D1K (I) y mAb7-B6-1 (II) (Mabtech-Hamburg; Alemania) después del procedimiento recomendado del fabricante. Las células diana y efectoras (E:T 3:1) fueron incubadas durante 24h en presencia de pamidronato (Calbiochem; Alemania) donde se ha indicado. IFNy ELISA fue realizado utilizando el equipo ELISA-ready-go! (eBioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células efectoras y diana (E:T 1:1) fueron incubadas durante 24h en presencia de pamidronato como se ha indicado. Donde se ha especificado, el cambio múltiplo se calculó cuando se comparó con la reactividad de células T modificadas de expresión de TCR γ9δ2 no mutado.
Transducción retrovírica de células T
[0084] TCR γ9δ2 fueron transducidos en células T αβ tal y como se ha descrito anteriormente (Marcu-Malina et al., 2011). En resumen, las células empaquetadoras (foenix-amfo) fueron transfectadas con gag-pol (pHIT60), env (pCOLT-GALV) (Stanislawski et al., 2001) y dos construcciones retrovirales (pBullet) que contienen bien y9-cadena-IRES-neomicina o 62-cadena-IRES-puromicina, usando el reactivo Fugene6 (Takara, Gennevilliers, Francia). Las PBMC humanas activadas con aCD3 (30ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, Tilburg, el Países Bajos) e IL2 (50 lU/ml) (Proleukin, Novartis, Arnhem, el Países Bajos) fueron dos veces transducidos con sobrenadante vírico dentro de 48 horas en presencia de 50 lU/ml IL-2 y 4 μg/ml polibreno (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, el Países Bajos). Las células T transducidas fueron expandidas por estimulación con aCD3/CD28 Dynabeads (0.5x106perlas/106 células) (Invitrogen) e IL-2 (50 lU/ml) y seleccionadas con 800 μg/ml geneticina (Gibco, Karlsruhe, Alemania) y 5 μg/ml puromicina (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, el Países Bajos) durante una semana. Donde CD4+ policlonal indicada y CD8+ células T transducidas TCR con las fueron clasificadas en base a la expresión CD4 o CD8 usando sistema de separación CD4 y CD8 MACS (Miltenyi Biothech, Bergish Gladbach, Alemania). Después de la selección, las células T transducidas TCR fueron expandidas in vitro en base a un protocolo REP previamente descrito (Riddell y Greenberg, 1990).
Ensayos de células T funcionales
[0085]
Ensayo de liberación de cromo 51para citotoxicidad mediada por células fue previamente descrito (Kuball et al., 2004). Las células diana fueron marcadas durante toda la noche con 100 pCu 51Cr (150pCu para células primarias) y posteriormente incubadas con células T transducidas en cinco proporciones efector a diana (E:T) entre 30:1 y 0.3:1. Después de 4-6h la liberación de 51Cr se midió en el sobrenadante. El cambio múltiplo fue calculado en base a la liberación 51Cr de Y9-G115wt/69-G115wt células T transducidas normalizadas a 1; para experimentos lado a lado basados en Y9-3wt/69-3wt, 69-5wt/Y9-5wt o y9-G115wt/69-G115wt normalizados a 1.
[0086] El IFNy ELISPOT fue realizado utilizando anti-hu IFN-y mAb1-D1K (I) y mAb7-B6-1 (II) de Mabtech (Hamburgo; Alemania) seguido del procedimiento recomendado por los fabricantes (Besold et al., 2007). En todos los ensayos, las células diana y efectoras (E:T 3:1) fueron incubadas durante 24h en presencia de pamidronato (Calbiochem; Alemania) donde se ha indicado.
[0087] El IFN- y ELISA fue realizado utilizando el equipo ELISA-readi-go! (eBioscienc) después de las instrucciones de los fabricantes. Las células efectoras y diana (E:T 1:1) fueron incubadas durante 24h en presencia de pamidronato como se ha indicado. Donde se ha especificado, el cambio múltiplo se calculó en base a la secreción IFN-y Y9-G115wt/59-G115wt células T transducidas normalizadas a 1; para los experimentos lado a lado basados en Y9-3wt/ 69-3wt, Y9-5wt/69-5wt o Y9-G115wt/69-G115wt normalizados a 1.
Modelos animales
[0088] Para inducir xenotransplantes tumorales, el cuerpo total subletal irradiado (2Gy), a ratones de 11- 17 semanas RAG-2-Hyc-/--BALB/c se les inyectó I.v. con células 0.5x106 Daudi-Luc (una donación en especie de
Genmab Utrecht, el Países Bajos) o 5x106 células RPMI8226/S-Luc (Anton Martens, Utrecht, el Países Bajos) junto con 107 células T y9S2 TCR transducidas. Los ratones RAG-2-/-/yc-/--BALB/C fueron originalmente obtenidos de AMCAS B.v. (Amsterdam, Países Bajos). Los ratones fueron criados y alojados en la unidad de cultivo libre de patógenos específica (SPF) de la Instalación Animal Central de la Universidad de Utrecht. Todos los experimentos animales fueron conducidos según las pautas institucionales después de adquirir permiso del comité ético local para experimentación animal y conforme a las leyes holandesas actuales en la experimentación animal. Todos los tumores desarrollados de ratones, que principalmente crecen en la médula ósea in vivo visualizada una vez a la semana por formación de imágenes bioluminescente Biospace. Los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano antes de que estos hayan recibido una inyección intraperitoneal de 100|jl de 25 mg/ml Beetle Luciferin (Promega, USA). Las imágenes de bioluminiscencia fueron adquiridas usando una tercera generación de cámara del dispositivo acoplado de carga intensificado, GaAs enfriado, controlado por el software Photo Vision y analizada con software M3Vision (todos de Photon Imager; Biospace Laboratory). Los ratones recibidos 0.6x106 UI de IL2 (Proleukin®; Novartis) en IFA S.c. en el día 1 (juntos con células tumorales) y cada 21 días hasta el fin del experimento. El pamidronato (10mg/kg peso corporal) se aplicó en los grupos indicados el día 1 i.v. y cada 21 días i.p. Los tumores de superación fueron visualizados in vivo por formación de imágenes bioluminescentes Biospace (BLI). Los ratones fueron anestesiados por isoflurano antes de que estos recibieran una inyección intraperitoneal (100jl) de 25mg/ml (Promega) de Beetle Luciferin. Las imágenes de bioluminiscencia fueron adquiridas y analizadas con el software M3Vision (Photon Imager, Biospace Laboratory).
Resultados
Reactividad antitumoral de clones individuales de célula T y952
[0089] Para investigar si los clones individuales de célula T y9S2 median la actividad diferencial contra las células tumorales en comparación con la población celular parental T y9S2, celulas T y9S2 a partir de un donante sano fueron clonadas por dilución limitante y evaluadas contra un panel ancho de células tumorales en un IFNy ELISPOT. La alta variabilidad en el reconocimiento tumoral en cuanto a especificidad y avidez funcional fue observada entre clones individuales celulares T y9S2 (cl); en comparación con la población en original de masa, cl5 y cl13 producida doble, ya que muchos puntos iFNy en respuesta a Daudi y cantidades significativas generadas selectivamente IFNy cuando se han estimulado con K562; BT549 y MCF-7. En cambio, cl3 y cl15 reconocieron solamente células Daudi. La expresión de superficie de TCR γ9δ2, NKG2D, CD158a, NKAT-2 y NκΒ-1 fue examinada.
Reactividad antitumoral mediada por TCR y9S2 individuales
[0090] Para dilucidar diferencias entre TCR y9S2 de clones reactivos al tumor, secuencias de cadenas (wt) TCR Y9 y 82 tipo salvaje de cl3 (Y9-cl3wt/S2-cl3wt) y cl5 (Y9-cl5wt /S2-cl5wt) se determinaron y alinearon con TCR y9S2 G ll5. Los tres t Cr y9S2 difirieron en sus CDR3 dominios: 1-3 aminoácidos entre la posición y109 y y111 en YCDR3 y 4-8 aminoácidos entre S108 y S112 en SCDR3. Para determinar si diferentes TCR y9S2 median la reactividad antitumoral diferencial intermedia, cadenas individuales TCR y9S2 fueron clonadas en el vector retroviral pBullet y enlazadas a un marcador de selección como se describe. Las combinaciones de tipo salvaje Y9-cl3wt/S2-cl3w t, Y9-cl5wt /S2-cl5wt y Y9-G115wt /S2-G115wt fueron transducidas en las células T αβ de sangre periféricas, seleccionadas por antibióticos y además expandidas. TCR y9S2 G115 (y9-G115w /S2-G115wt) servidas como control, como hicieron las células transducidas con un casete de vector vacío (control). Las células TTCR y9S2 transducidas mostraron TCR y9S2 expresión similar y se evaluaron para su actividad lítica contra el tumor diana Daudi en un ensayo de liberación 51Cr (figura 1A). La expresión de células T Y9-cl3wt/S2-cl3wt tuvo un 50 por ciento reducido de capacidad para lisar células tumorales (p<0.01), mientras que las células T con Y9-cl5wt/S2-cl5wt fueron casi dos veces tan potentes (p<0.01) como el control y9-G115w /S2-G115wt. Para determinar si los fenotipos de células TCR y9S2 transducidas con avidez funcional disminuida o aumentada están también presentes en el nivel de citocina se realizó un ensayo de titulación de pamidronato. El tratamiento de pamidronato de células Daudi bloquea la vía de mevalonato aguas abajo para IPP causando la acumulación de IPP y una secreción de citocina mejorada de células T sensibles. Para excluir la activación tipo NK CD4+ células T transducidas TCR y9S2, que carecen de la expresión de receptores NK mayores tipo n KG2D, fueron seleccionadas por clasificación MACS. Los transductantes fueron evaluados a concentraciones diferentes de pamidronato contra el tumor diana Daudi. Las células T transducidas con control que fueron sometidas a estimulación equivalente pero expresan un irrelevante TCRap sirvieron como control. La IFNy secreción se midió por ELISA y el medio concentración eficaz máximo (EC50) fue calculado (figura 1B). De acuerdo con los cambios observados para capacidad lítica, las células T transducidas con S 9-cl3wt/S2-cl3wt cantidades inferiores segregadas de IFN (max. 600μg/ml), mientras las células expresan T Y9-cl5wt/S2-cl5wt produjeron niveles más altos de IFNy (max. 1300μg/ml) en todas las concentraciones de pamidronato, con respecto al control y9-G115wt/S2-G115wt (max. 800μg/ml). A pesar de los niveles más altos diferentes en la secreción IFN y, todos los mutantes seleccionados y el control de tipo salvaje tuvo un comparable pamidronato EC50 (<30μg/ml). Estos resultados indican que los clones diferentes y 9S2TCR median avidez funcional diferente y la variabilidad alta entre clones parentales de célula T y 9S2 en el reconocimiento tumoral parece ser regulada sustancialmente por los dominios CDR3 de receptores individuales de célula T y9S2.
Intercambio combinatorio de cadena y5 TCR (CTE) como método rápido para modular la avidez funcional de células T modificadas
[0091] Para realizar la determinación anterior, concebimos una estrategia nombrada intercambio combinatorio de cadena y5TCR (CTE), que produce la expresión de cadenas recién combinadas TCR y9 y 52 en células T modificadas. Durante este proceso, Y9-G115wt fue combinado con 52-cl3wt o 52-cl5wt y 52-G115wt con Y9-cl3wt o Y9-cl5wt. Estas combinaciones fueron retroviralmente transducidas en células T ap. En todos los transductantes equivalentes la expresión TCRy5 fue detectada mientras el endógeno apTCR fue claramente regulado a la baja. Esto resultó no solo en una alorreactividad casi abolida de expresión de células T αβ Y9-G115wt/52-G115wt pero también de células T αβ modificadas de CTE seleccionadas cuando se compara con células transducidas como control. Así, la reactividad de células T modificadas de CTE principalmente depende de los expresados TCRy5 y no en endógenos residuales TCRap. Después, los transductantes fueron evaluados funcionalmente contra el tumor diana Daudi en un ensayo de liberación de 51Cr (figura 1C). El intercambio de cadenas y9- o 52 de hecho causó diferencias notables. En comparación con el TCR original Y9-G115wt/52-G115wt, la combinación de y9-G115wt/52-cl3w t, Y9-G115wt/52-cl5wt o Y9-cl5wt/52-G115wt medió 40 a 70 por ciento de lisis específica aumentada de células tumorales (todos p<0.05). La misma magnitud de reconocimiento se observó cuando la IFNy producción de células T transducidas CD4+ TCRy5 fue evaluada en un ensayo de titulación de pamidronato (figura 1D). Además, solo la combinación Y9-cl3wt/52-G115wt llevada a la IFNy producción disminuida de células transducidas en todas las concentraciones de pamidronato (max. 100μg/ml), mientras todos los otros TCR y952 CTE mediados una secreción de IFNy aumentada (max. >1000μg/ml) en comparación con el control TCR y9-G115wt/52-G115wt(max. 800μg/ml). Los pamidronatos EC50 iguales de <30μg/ml fueron calculados para todas las células TCR y952 transducidas sensibles.
[0092] Para determinar si la interacción célula-célula influye en la respuesta cinética diferentemente de la estimulación de pamidronato, CTE-TCR y952 Y9-G115wt /52-cl5wt que media enla avidez funcional mejorada y controla TCR Y9-G115wt/52-G115wt fueron evaluados en el ensayo de titulación a una proporción efector a diana (E:T) (figura 1E) y se calculó un E:T-50. De manera interesante, las células T con Y9-G115wt/52-cl5wt respondieron diferentemente con un E:T-50 de 0.3:1, en comparación con un E:T-50 de 1:1 calculado para las células de control que expresan Y9-G115wt/52-G115w t. Para probar si la interacción entre diferentes TCR y ligandos - así la afinidad - es de hecho aumentada, los conjugados célula-célula entre células Daudi y T que expresan afinidad potencialmente alta (Y9-G115wt/52-cl5wt) o baja (Y9-cl3wt/52-G115w t) TCR fueron medidos por citometría de flujo. Significativamente más interacciones de célula-célula fueron observadas cuando y9-G115wt/52-cl5wt fue expresado en comparación con Y9-cl3wt/52-G115wt y células T transducidas como control (figura 1F). Este efecto no dependió de la presencia de pamidronato. Por lo tanto, G115wt/52-cl5wt es una alta afinidad TCR y952. Por lo tanto, CTE es un método eficaz para rápidamente diseñar TCR y952 con afinidad aumentada, mediante avidez funcional mejorada en células T transducidas.
Los residuos en 5CDR3 y J51 están implicados en estabilidad TCR y952 y en la mediación deavidez funcional de células T αβ modificadas
[0093] Para dilucidar los requisitos moleculares de 5CDR3 para mediar la avidez funcional óptima, mutagénesis de alanina de un modelo 5CDR3 (clon G115) fue realizada con el segmento entero J51, ya que los residuos importantes también han sido proporcionados dentro de Jy1. Durante un cribado inicial, cinco áreas de secuencia fueron descubiertas para influir la expresión TCR o avidez funcional de TCR células T y952 transducidas. Para clarificar el grado al que los únicos residuos son responsables de la expresión perjudicada TCR y952 y avidez funcional mediada TCR inferior, se generaron mutaciones de alanina únicas. Las cadenas tipo salvaje y mutadas 52-G115 fueron expresadas en combinación con Y9-G115wt en células T αβ y evaluadas para TCR y952 expresión utilizando un anticuerpo específico de cadena 52 (figura 2A). Tres mutaciones de alanina únicas provocaron un 70 por ciento de expresión TCR inferior cuando se compara con el 52-G115wt no mutado, es decir 52-G115L116A, 52-G115F118A y 52-G115v 124a (tabla 3). Los resultados comparables fueron observados utilizando anticuerpos dirigidos contra la cadena y9 o el dominio constante del TCRy5, indicando la importancia de 52-G115l 116; 52-G115f 118 y 52-G115v 124 para expresión TCR estable. La estructura cristalina de TCR y952 G115 sostiene nuestras conclusiones: 52-G115l 116; 52-G115f 118 y 52-G115v 124 se sitúan en núcleos hidrofóbicos (figura 2B) y podrían ser así cruciales para la estabilidad estructural del TCR y952 G115.
[0094] Para dirigir el impacto de mutaciones de alanina únicas en la avidez funcional, se realizó un ensayo de liberación 51Cr (figura 2C). Los transductantes con baja expresión TCR (52-G115l 116a , 52-G115f 118a y 52-G115v 124a ) podrían no lisar células tumorales eficazmente, ya que estas han demostrado un 80 por ciento de capacidad lítica inferior cuando se compara con células transducidas con 52-G115wt. Las células T con mutación 52-G115l 109a y 52-G115m 7 A (tabla 3) debidamente expresadas el TCR sin embargo mostraron un 70 por ciento de actividad lítica reducida cuando se comparó con 52-G115wt células de expresión. Resultados similares fueron obtenidos cuando los mutantes TCR fueron transducidos en células Jurkat CD4+ y la producción IL-2 fue medida (datos no mostrados). La reducción de actividad lítica también se vio cuando las sustituciones de alanina 52-G115l 109a y 52-G115i117a fueron introducidas en la cadena 52 de clon y5TCR 3. Estos resultados indican que no solo el residuo 5L109, sino también 5I117 en 5CDR3 pueden ser importantes generalmente para TCR y952 para
mediar avidez funcional (figura 2D). Los alineamientos de secuencia entre cadenas 82 de clones 3,5 y G115 indicaron que 8L109 y 8I117 se pueden conservar (tabla 2).
Tabla 3: secuencia CDR3 de TCR y 952 G115, clon 3 y clon 5
yCDR3 JyP
cadena y9
104 105 106 107 108 109 110 111 111.1 112.1 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127
y 9 -c !3 „ , c A L w E E L G K K I K V F G p G T K L I I T
yS-cíSm c A L w E E L G K K I K V F G p G T K L I I T
y9-G 115w t c A L w E E L G K K I K V F G p G T K L I I T
cadena 52 6CDR3 J51
104 105 106 107 108 109 110 111 111*1 112.2 112.1 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128
52-cl3w i c A c D T D K L 1 F G K G T R V T V E P 52-cl5w i c A c O T D K L 1 F G K G T R V T V E P 52-G115wt c A c D T D K L 1 F G K G T R V T V E p 
[0095] La tabla anterior muestra un alineamiento de tres clones y la numeración enumerada es conforme a IGMT. La secuencia y9 G115wt enumerada corresponde a aminoácidos C117-T142 de la SEQ ID de secuencia de aminoácidos NO.1.Y112.1L, de cualqueir clon 3,5 o G115wt así corresponde a L126 de la SEQ ID de secuencia de aminoácidos NO.1. La 82-G115wt secuencia enumerada corresponde a aminoácidos C111-C138 de la SEQ ID de secuencia de aminoácidos NO.2. Por lo tanto, como muestra este alineamiento, las regiones CDR3 correspondientes de clones 3 y 5 pueden fácilmente ser identificadas mediante alineamiento.
Influencia de longitud CDR3 en la avidez funcional de TCR células T γ9δ2 transducidas
[0096] Las sustituciones de alanina durante mutagénesis de escaneado de alanina de TCR γ9δ2 G115 podrían reemplazar partes grandes del dominio 8CDR3 sin consecuencias funcionales. Esto aumenta la posibilidad de que el factor crucial para las diferentes avidencias funcionales que difieren de TCR γ9δ2 combinaciones diferentes también pueda implicar la longitud relativa entre los residuos importantes funcionalmente 82-G115l 109 y el residuo importante estructuralmente 52-G115um Por lo tanto, diferentes 8 2-G115 mutantes de longitud fueron generados. Ya que el triple 82-G115t h 3-k h 5 es importante también para la expresión de superficie estable (datos no mostrados), nueve mutantes de longitud (82-G115LM) con 0 a 12 alanina entre 82-G115l 109 y 82-G115t 113 fueron generados e igualmente expresados en células T ap, nuevamente en combinación con y9-G115wt (figura 3A). Para probar la avidez funcional de células T 82-G115l m transducidas, células T transducidas TCR CD4+ fueron seleccionadas por clasificación MACS y un IFNy ELISA en respuesta a Daudi fue realizado en presencia de pamidronato (figura 3B). Células T modificadas que expresan 82-G115l m 0 y 82-G115l m 1 fueron incapaces de producir IFNy y las células T que expresan 8-G115l m 4 o 8-G115l m 12 segregadas solo sobre la mitad de la cantidad de IFNy en comparación con células 82 G115wt transducidas. Los otros mutantes (82-G115l m 2, 3, 5, 6, 9) indujeron cantidades comparables de IFNy en células T modificadas con respecto a la expresión de transductantes 82-G115w t. Los mutantes con degradación funcional (82-G115l m 0,1,4,12, Tabla 4) fueron además evaluados contra las concentraciones de pamidronato en aumento y un EC50 fue calculado. A pesar de los niveles más altos diferentes en máxima secreción IFNy, todas las células transducidas seleccionadas 82-G115lm y el control de tipo salvaje tuvo un pamidronato-EC50 comparable (<30μg/ml) (figura 3C). Las mutaciones de longitud fueron también estudiadas en yCDR3 de TCR γ9δ2 G115 diseñando extensiones de 1-6 alaninas entre Y9-G115E108 y y9-G115e 111.1 (y9-G115l m 1-6). Sin embargo, esto no ha afectado a la avidez funcional.
[0097] Esto indica que las extensiones de alanina considerables dentro de dominios y9 y 82CDR3 se pueden tolerar. Sin embargo, las extensiones de alanina demasiado cortas y demasiado largas entre 82-G115L109 y 82-G115T113 en particular, al igual que extensiones con cuatro alaninas pueden estar asociadas con una función reducida o ausente de un TCR γ9δ2 (figura 3B y 3C).
Consecuencias para el repertorio fisiológico de célula T y9S2
[0098] La base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) fue buscada para extensiones proporcionadas entre y9-G115e i 09 y y9-G115e i i i .i al igual que S2-G115l 109 y S2-G115t 113. Una longitud preferencia! para cadenas proporcionadas y9 fue descubierta para regiones c DR3 correspondientes a y9-G115l m 2 y y9-Gi 15l m 3, pero extensiones más cortas fueron proporcionadas también. En cambio, las cadenas 82 con dominios cortos SCDR3, tales como S2-G115l m 1 o S2-G115l m 0, no se proporcionaron (figura 3D), de acuerdo con nuestra observación que tales cadenas no pueden ser funcionales. La mayoría de y 9S2TCR enumerados contienen SCDR3 longitudes que corresponden a S2-G115l m 5 ,6,7. Estas conclusiones sostienen una preferencia para seleccionar TCR y9S2 con una longitud SCDR3 de 5-7 residuos entre S2-G115l 109 y S2-G115t 113. Sin embargo, las diferencias de secuencia individual pueden todavía jugar un papel en TCR y9s2 avidez funcional mediada.
Influencia de la CDR3 secuencia en avidez funcional mediada TCR y9S2
[0099] Para probar la longitud y secuencia de SCDR3 para mediar la avidez funcional óptima, TCR y9S2 mutantes de longitud S2-G115l m 2 , S2-G115l m 4 , y S2-Gi 15l m 6 fueron transducidos en células T αβ en combinación con S9-G115wt. La secreción IFN y de transductantes en respuesta a Daudi se comparó con células transducidas con secuencias de tipo salvaje de S2-cl3wt (corresponde con la longitud a S2-g 115l m 2), S2-cl5wt (corresponde en longitud a S2-G115l m 4) y S2-G115wt (corresponde en longitud a S2-G115l m 6) (tabla 3). Las células T transducidas con S2-G115l m 6 y S2-G115wt no han diferido en la cantidad de secreción de citocina, todas las otras combinaciones de cadenas de tipo salvaje mostraron un aumento de más de dos múltiplos en IFNy cuando se compara con el mutante de longitud que contenía selectivamente alaninas (figura 3E). Estos resultados fueron confirmados cuando la capacidad lítica de células transducidas fue evaluada. La secuencia en S CDR3 puede por lo tanto también ser un factor significativo para el funcionamiento de un TCR y9S2.
[0100] Por consiguiente, la importancia secuencial de yCDR3 fue estudiada. Así, y9-G115l m 1-3 fueron transducidos en células T en combinación con S2-G115wt. La secreción IFNy de transductantes en respuesta a Daudi se comparó con células transducidas con Y9-cl3wt (corresponde en longitud a y9-G115l m 1), Y9-cl5wt (corresponde en longitud a y9-G115l m 2) y Y9-G115wt (correspondiente a y9-G115l m 3) (tabla 3). La expresión de células T Y9-cl3wt/S2-G115wt cantidades inferiores producidas selectivamente de IFNy cuando se compara con su equivalente y9-G115l m 1 (figura 4A). Previamente, la misma combinación TCR y9S2 se descubrió también para mediar la avidez funcional reducida (figura 1 C y 1D). La pérdida de actividad podría ser restaurada para niveles normales (referida a TCR y9S2 G115wt) mediante mutación yCDR3e 109 en Y9-cl3wt a yCDR3a 109, que demuestra que un cambio único en la secuencia variable de y9CDR3 puede ser suficiente para regular avidez funcional de TCR células T y9S2 transducidas evaluadas aquí.
[0101] En resumen, la longitud y secuencia del dominio entre L109 y T113 (tabla 3) puede jugar un papel en avidez funcional TCR y9S2 mediada. Además, la secuencia individual entre E108 y E111.1 en y9CDR3 puede ostaculizar la actividad de un TCR y9S2 y en G115 SCDR3a 109 puede ser de importancia para interacción de ligando (tabla 3 y figura 4B). Combinada, esta proporciona una razón fundamental para TCR y9S2 modificadas por CTE pero también para mutagénesis aleatoria dentro de ambas y9 y S2CDR3.
Células T modificadas por CTE como herramienta para inmunoterapia contra el cáncer
[0102] TCR y9S2 modificadas por CTE con actividad aumentada contra las células tumorales son candidatos interesantes para estrategias terapéuticas de gen TCR. Cambios en la avidez funcional mediada por CTE-TCR Y9S2 pueden constituir un fenómeno único de un par definido TCR y9S2 en respuesta a la línea celular B-linfoblástica Daudi o pueden ser una respuesta general para más dianas tumorales. Por lo tanto, CTE-TCR y9S2 que mediaron la actividad aumentada (Y9-G115wt/S2-cl5wt) o reducida (Y9-cl3wt/S2-G115wt) fueron evaluados contra varios tumores en un IFNy ELISA en presencia de concentraciones farmacológicas de pamidronato (10μM) (figura 5A). La reactividad tumoral se aumentó significativamente contra una gama entera de diferentes entidades tumorales con otros cánceres hematológicos tal como RPMI8226/S, OPM2, LME1 (todo mieloma múltiple), K562 (leucemia mielógena) al igual que líneas celulares de cáncer sólido tal como Saos2 (osteosarcoma), MZ1851 RC (carcinoma de célula renal), SCC9, Fadu (cáncer de cuello y de cabeza), MDA-MB231, MCF7; BT549 (todo cáncer de pecho), y SW480 (carcinoma de colon) cuando se toma ventaja de y9-G115wt/S2-cl5wt, en comparación con Y9-G115wt/S2-G115wt y se redujo significativamente o incluso se eliminó para todas las otras dianas utilizando Y9-cl3wt/S2-G115wt. Además, las células T modificadas de CTE con actividad aumentada contra las células tumorales todavía no mostró cualquier reactividad hacia el tejido sano tal como PBMC y fibroblastos. La actividad lítica superior de células T modificadas con Y9-G115wt/S2-cl5wt también se observó para células cancerosas hematológicos como RPMI8226/S, OPM2; L363 al igual que líneas celulares de cáncer sólido Saos2; MZ1851 RC, SCC9; MDA-MB231 y SW480 cuando se comparó con células T de control que expresan Y9-G115wt/S2-G115wt (figura 5B). Por lo tanto, CTE TCR y9S2 modificados pueden proporcionar una respuesta antitumoral más alta contra un panel ancho de células tumorales mientras no afecten al tejido normal y así tienen el potencial para aumentar la eficacia de células T modificadas TCR.
[0103] Para valorar el impacto clínico potencial de TCR γ9δ2 modificados de CTE se evaluó si una eficacia aumentada de CTE-TCR γ9δ2 también puede estar presente cuando blastos primarios de pacientes AML se eligen como dianas. Por lo tanto, las células T transducidas CTE-TCR γ9δ2 fueron evaluadas contra 11 blastos AML primarios y células originales sanas CD34+ en un IFNY-ELISpot (figura 5C). Los transductantes que expresan Y9-G115wt/62-cl5wt reconocieron 8 de 11 muestras AML primarias igualmente o superiormente en comparación con y9-G115wt/62-G115wt de control. Además, CD34+ células originales no se reconocieron por expresión de células T Y9-G115wt/62-cl5wt o Y9-G115wt/62-G115wt. A consecuencia de estas conclusiones, TCR modificado de CTE Y9-G115wt/62-cl5wt parece ser un candidato prometedor para aplicación clínica.
[0104] Finalmente, para demostrar que CTE-TCR γ9δ2 son seguros y funcionan con eficacia aumentada cuando se compara con las construcciones originales in vivo, transferencia adoptiva de células T modificadas con CTE-TCR se estudió en un modelo de ratón humanizado: protección contra el crecimiento de Daudi o RPMI8226/S en Rag2'/'Yc'/' ratones noqueados dobles. Por lo tanto, las células T αβ de sangre periféricas fueron transducidas con CTE-TCR Y9-G115wt/62-cl5wt o control TCR Y9-G115wt/62-G115wt. Las células T transducidas CTE-TCR mostraron la expresión similar de marcadores de referencia con L-selectina y CCR7. Los ratones Rag2'/'YC/' irradiados recibieron Daudi transducidos de luciferasa (0.5x106) o células RPMI8226/S (5x106) y 107 células T modificadas de CTE por inyección intravenosa. La frecuencia de infusión de células T fue reducida a una inyección intravenosa con respecto a nuestro modelo proporcionado previamente donde se proporcionaron dos infusiones para probar la superioridad de células T transducidas CTE-TCR bajo condiciones subóptimas. Consecuentemente, esto resultó en la pérdida de protección con células T TCR G115wt modificadas cuando el crecimiento del tumor se midió por formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) (figura 6A y 6B). Sin embargo, las células T modificadas de CTE que expresan Y9-G115wt/62-cl5wt claramente redujeron el crecimiento del tumor para Daudi (20.000 cuentas/min, día 42; n=4) y RPMI8226/S (80.000 cuentas/min, día 35; n=7) en comparación con TCR G115wt células T modificadas (Daudi: 180.000 cuentas/min, día 42; RPMI8226/S: 210.000 cuentas/min, día 35). Las células T se podrían encontrar en la periferia hasta 1-2 semanas después de infusión en ratones, pero la frecuencia de células T no correlacionó con la regresión del tumor. Finalmente, en el modelo Daudi rápidamente letal solo ratones tratados con células T modificadas de CTE tuvieron una supervivencia aumentada significativa en general de <2 meses con respecto a ratones tratados con las células T que expresan Y9-G115wt/62-G115wt (figura 6C). Estos resultados indican que CTE TCR γ9δ2 modificados median eficazmente la reactividad antitumoral in vivo, que señala a CTE como una herramienta potencial para optimizar TCR γ9δ2 para aplicación clínica.
[0105] En la tabla 4 siguiente, se muestran los resultados con respecto a células T αβ obtenidas como se ha descrito. El dominio delta-CDR3 se evaluó para función TCR por mutagénesis de alanina (tabla 3, mutación) del domino CDR3 (con el J-segmento entero) del clon G115 bien estudiado y se han descubierto aminoácidos que pueden ser relevantes para estabilidad TCR y función TCR. Además, se evaluó la longitud de secuencia de aminoácidos (tabla 3, mutaciones de longitud) entre yE108 y yE111.1 de la cadena y9 y entre 6L109 y 6T113 de la cadena 62. Las secuencias individuales de dominios CDR3 y9 y CDR362 son de importancia para la función (tabla 3, secuencia). Diseñando CTE las cadenas TCR y9 y 62 de clon G115 fueron combinadas con cadenas TCR y9 y 62 de clon 3 y clon 5, respectivamente. CTE modificado resultó en 4 TCR y6 nuevamente modificadas. Las TCR originales y las nuevas TCR modificadas por CTE (tabla 3, combinación) fueron transducidos en células T αβ y se evaluó su función
Tabla 4: el efecto de mutaciones combinaciones de cadena en función 52-TCR
Claims (6)
1. Célula T αβ capaz de mediar en una respuesta antitumoral, expresando dicha célula una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T γ9δ2 que comprende A y/o B, o que comprende C, o que comprende D:
A. un receptor de células T y9 representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y donde se cumple al menos una de las siguientes características:
(i) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 122-124 de la SEQ ID NO: 1 es IQ y
(ii) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 118-132 de la SEQ ID NO: 1 tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 16, y/o
B. un receptor de células T 62 representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y donde se cumple al menos una de las siguientes características:
(i) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 115-122 de la SEQ ID NO: 2 tiene una identidad de al menos 99 % con la SEQ ID NO: 15 o LLGY y
(ii) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 112-127 de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o
C. un receptor de células T γ9δ2 que comprende:
- un receptor de células T y9 según A, y
- un receptor de células T 62 representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y donde se cumple al menos una de las siguientes características:
a) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 115-122 de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 19,
b) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 112-127 de la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4,
c) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 112-114 de la SEQ ID NO: 2 es ACD y
d) donde la secuencia de aminoácidos de la región 62T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 123-127 de la SEQ ID NO:2 tiene al menos un 80 % de identidad con TDKLI, o
D. un receptor de células T γ9δ2 que comprende:
- un receptor de células T 62 según B, y
- un receptor de células T y9, donde el receptor de células T y9 está representado por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y donde se cumple al menos una de las siguientes características:
a) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 122-124 de la SEQ ID NO: 1 es AQQ, b) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 118-132 de la SEQ ID NO: 1 tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 3,
c) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 118-121 de la SEQ ID NO: 1 comprende ALWE y d) donde la secuencia de aminoácidos de la región Y9T-CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos número 125-132 de la SEQ ID NO:1 tiene al menos un 80 % de identidad con ELGKKIKV.
2. Célula T según la reivindicación 1, donde el receptor de células T y9 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 12.
3. Célula T según la reivindicación 1 o 2, donde el receptor de células T 62 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:14.
4. Célula T según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que:
(i) el receptor de células T y9 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 12, y
(ii) el receptor de células T 62 está representado por una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO:14.
5. Composición farmacéutica que comprende la célula T de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Célula T como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o composición farmacéutica según la reivindicación 5, para usar en el tratamiento del cáncer.
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