ES2949394T3

ES2949394T3 - Moléculas de fusión novedosas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2949394T3
Application number: ES13795075T
Authority: ES
Inventors: Doron Lipson; Roman Yelensky; Joel Greenbowe; Jie He
Original assignee: Foundation Medicine Inc
Current assignee: Foundation Medicine Inc
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2023-09-28
Anticipated expiration: 2033-11-05
Also published as: AU2018203653A1; AU2022224823A1; EP4223770A3; EP2914622B1; AU2013337264A1; US11230589B2; US20160009785A1; CA2890346A1; WO2014071419A2; EP4223770A2; AU2013337264B2; AU2020202555B2; US20220169703A1; EP2914622A2; WO2014071419A3; HK1214831A1; EP2914622C0; AU2020202555A1

Abstract

Se describen nuevas moléculas de fusión y usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de fusión novedosas y usos de las mismas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 61/763.442, presentada el 11 de febrero de 2013, y de la solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 61/722.533, presentada el 5 de noviembre de 2012.

Antecedentes

El cáncer representa el criterio de valoración fenotípico de múltiples lesiones genéticas que dotan a las células de una gama completa de propiedades biológicas requeridas para la tumorogénesis. De hecho, un rasgo característico genómico distintivo de muchos cánceres, incluyendo, por ejemplo, cáncer de células B, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer de colon, es la presencia de numerosas anomalías cromosómicas estructurales complejas, incluyendo translocaciones, inversiones intracromosómicas, mutaciones puntuales, deleciones, cambios en el número de copias génicas, cambios en el nivel de expresión génica y mutaciones en la línea germinal, entre otras.

Todavía existe la necesidad de identificar lesiones genéticas novedosas asociadas con el cáncer. Tales lesiones genéticas pueden ser un enfoque eficaz para desarrollar composiciones, procedimientos y ensayos para evaluar y tratar a pacientes con cáncer.

Compendio

La presente invención y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento, incluyendo la administración a un paciente en un método de tratamiento, se debe interpretar como referencia a los compuestos (p. ej., agentes terapéuticos) y a las composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del organismo humano (o animal) mediante terapia, o para su uso en la administración a un paciente en un método de tratamiento. Cualquier referencia en la descripción a un método que entre dentro de las excepciones de patentabilidad de acuerdo con el artículo 53(c) del CPE no está dentro del alcance de las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de escrutinio in vivo de agentes llevados a cabo en un sujeto animal se debe interpretar como excluyente de sujetos humanos. Cualquier parte de la descripción que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención, pero sirve para la comprensión de la invención reivindicada.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de novedosos eventos de reordenamiento que dan origen a moléculas de fusión que incluyen un fragmento de un primer gen y un fragmento de un segundo gen, p. ej., una fusión que incluya un exón en 5' y un exón en 3' resumida en las FIG. 1A-1C. Los términos "fusión" o "molécula de fusión" se utilizan de forma genérica en el presente documento e incluyen cualquier molécula de fusión (p. ej., gen, producto génico (p. ej., ADNc, ARNm o polipéptido) y variantes de los mismos) que incluya un fragmento del primer gen y un fragmento del segundo gen descritos en el presente documento, incluyendo, p. ej., FGFR3-TACC3, TRIM24-BRAF, CNTL-RAF1 y así sucesivamente, resumidos en las FIGS. 1A-1C. Se detectó la expresión de las moléculas de fusión en tejidos cancerosos, lo que sugiere, por tanto, una asociación con el crecimiento neoplásico o cáncer (incluyendo el crecimiento premaligno, o maligno y/o metastásico).

En consecuencia, la invención proporciona, al menos en parte, lo siguiente: métodos para identificar, valorar o detectar una molécula de fusión como se describe en el presente documento; métodos para identificar, valorar, evaluar y/o tratar a un sujeto que tiene un cáncer, p. ej., un cáncer que tiene una molécula de fusión como se describe en el presente documento; moléculas de ácido nucleico de fusión aisladas, construcciones de ácido nucleico, células anfitrionas que contienen las moléculas de ácido nucleico; polipéptidos de fusión purificados y agentes de unión; reactivos de detección (p. ej., sondas, cebadores, anticuerpos, kits, que, p. ej., pueden detectar específicamente un ácido nucleico o proteína de fusión); ensayos de escrutinio para identificar moléculas que interactúan con, p. ej., inhiben, las fusiones, p. ej., novedosos inhibidores de cinasa; así como ensayos y kits para evaluar, identificar, valorar y/o tratar a un sujeto que tiene un cáncer, p. ej., un cáncer que tiene una fusión. Las composiciones y métodos identificados en el presente documento se pueden utilizar, por ejemplo, para identificar nuevos inhibidores; para evaluar, identificar o seleccionar a un sujeto, p. ej., un paciente, que tiene un cáncer; y para tratar o prevenir un cáncer.

Fusiones LMNA-NTRK1

En un caso, una fusión incluye una fusión en marco de un exón de lamina A/C (LMNA), p. ej., uno más exones de LMNA (p. ej., uno o más de los exones 1-5 de LMNA) o un fragmento de los mismos, y un exón del receptor tirosina cinasa neurotrófico de tipo 1 (NTRK1), p. ej., uno o más exones de un NTRK1 (p. ej., uno o más de los exones 12 17 de NTRK1) o un fragmento de los mismos. Por ejemplo, la fusión LMNA-NTRK1 puede incluir una fusión en marco dentro de un intrón de LMNA (p. ej., el intrón 5) o uno de sus fragmentos, con un intrón de NTRK1 (p. ej., el intrón 12) o uno de sus fragmentos. En una realización, la fusión de la fusión LMNA-NTRK1 comprende la secuencia de nucleótidos de: el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.844.787 (más o menos 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 100 o más nucleótidos) y del cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.105.353 (más o menos 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 100 o más nucleótidos). En una realización, la fusión LMNA-NTRK1 es una deleción, p. ej., una deleción de una porción del cromosoma 1.

La fusión LMNA-NTRK1 está en una configuración de 5'-LMNA a 3'-NTRK1 (también denominada en el presente documento "5'-LMNA-NTRK1-3')'\ El término "fusión" o "molécula de fusión" se puede referir a un polipéptido o a una fusión de ácido nucleico, dependiendo del contexto. Puede incluir una secuencia de longitud completa de una fusión o uno de sus fragmentos, p. ej., un punto de unión de fusión (p. ej., un fragmento que incluya una porción de LMNA y una porción de NTRK1, p. ej., una porción de la fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento). En un caso, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 incluye un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22), o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a estas. En otro caso, el ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 incluye un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG.

2A-2B (SEQ ID NO:19) y un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG. 4A-4B (SEQ ID NO:21), o una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a estas. El polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende suficiente secuencia de LMNA y suficiente de NTRK1 de modo que la fusión 5' LMNA-3' NTRK1 tenga actividad cinasa, p. ej., tenga actividad elevada, p. ej., actividad tirosina cinasa NTRK1, en comparación con el NTRK1 de tipo salvaje, p. ej., en una célula de un cáncer al que se hace referencia en el presente documento (p. ej., histiocitosis no Langerhans).

En ciertos casos, la fusión LMNA-NTRK1 comprende uno o más (o todos) los exones 1-5 de LMNA y uno o más (o todos) los exones 12-17 de NTRK1 (p. ej., uno o más de los exones mostrados en las FIG. 2A-2B (SEQ ID NO:19) y en las FIG. 4A-4B (SEQ ID NO:21). En otro caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende uno o más (o todos) los exones 1-5 de LMNA y uno o más (o todos) los exones 12-17 de NTRK1. En ciertos casos, la fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más exones (exones codificados) de LMNA y al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más exones (exones codificados) de NTRK1 (p. ej., de las secuencias de LMNA y NTRK1 mostradas en las FIG.

2A-2B y la FIG. 3 (SEQ ID NO:19 y 20) y las FIG. 4A-4B y la FIG. 5 (SEQ ID NO:21 y 22)).

En ciertos casos, la fusión LMNA-NTRK1 comprende el exón 5, o uno de sus fragmentos, de LMNA y el exón 12, o uno de sus fragmentos, de NTRK1 (p. ej., como se muestra en las FIG. 2A-2B (SEQ ID NO:19) y en las FIG. 4A-4B (SEQ ID NO:21)). En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos del exón 5 de LMNA (p. ej., de la secuencia de aminoácidos de LMNA como se muestra en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) (p. ej., de la secuencia de aminoácidos de LMNA que precede al punto de unión de fusión con NTRK1, y al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos del exón 12 de NTRK1 (p. ej., de la secuencia de aminoácidos de NTRK1 como se muestra en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22)). En otro caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 6, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más nucleótidos del exón 5 de LMNA (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de LMNA como se muestra en las FIG. 2A-2B (SEQ ID NO:19) (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de LMNA que precede al punto de unión de fusión con NTRK1); y al menos 6, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más nucleótidos del exón 12 de NTRK1 (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de NTRK1 como se muestra en las FIG.

4A-4B (SEQ ID NO:21).

Moléculas de ácido nucleico LMNA-NTRK1

En un caso, la divulgación presenta una molécula de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ácido nucleico aislada o purificada) que incluye un fragmento de un gen LMNA y un fragmento de un gen NTRK1. En un caso, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que incluye un dominio tirosina cinasa NTRK1 o un fragmento funcional del mismo. En otro caso, la secuencia de nucleótidos codifica un fragmento del polipéptido NTRK1 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22 o uno de sus fragmentos, o una secuencia sustancialmente idéntica a esta. En otros casos, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento del gen LMNA que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 o uno de sus fragmentos, o una secuencia sustancialmente idéntica a esta. En otros casos más, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20), o uno de sus fragmentos, y la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22) o uno de sus fragmentos, o una secuencia sustancialmente idéntica a estas.

En un caso, la molécula de ácido nucleico incluye una fusión, p. ej., una fusión en marco, entre un intrón de LMNA (p. ej., el intrón 5 o uno de sus fragmentos) y un intrón de NTRK1 (p. ej., el intrón 12 o uno de sus fragmentos). La fusión LMNA-NTRK1 puede comprender una fusión de la secuencia de nucleótidos de: el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.844.787 (más o menos 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 100 nucleótidos) y el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.105.353 (más o menos 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 100 nucleótidos), o uno de sus fragmentos. En una realización, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una fusión de la secuencia de nucleótidos de: el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.844.787 (más o menos 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 100 nucleótidos) y el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.105.353 (más o menos 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 100 nucleótidos), o uno de sus fragmentos.

En otro caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un fragmento de una secuencia de nucleótidos) mostrada en las FIG. 2A - 2B (SEQ ID NO:19) y una secuencia de nucleótidos (p. ej., un fragmento de una secuencia de nucleótidos) mostrada en las FIG. 4A - 4^b(SEQ ID NO:21), o un fragmento de la fusión. En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos (p. ej., un fragmento de una secuencia de nucleótidos) mostrada en las FIG. 2A - 2B (SEQ ID NO:19) y a la secuencia de nucleótidos (p. ej., un fragmento de una secuencia de nucleótidos) mostrada en las FIG. 4A - 4B (SEQ ID NO:21), o un fragmento de la fusión. En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de nucleótidos al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, al menos 99,5 o mayor, idéntica a la secuencia de nucleótidos (p. ej., un fragmento de una secuencia de nucleótidos) mostrada en las FIG. 2A - 2B (SEQ ID NO:19) y a la secuencia de nucleótidos (p. ej., un fragmento de una secuencia de nucleótidos) mostrada en las FIG. 4A - 4B (SEQ ID NO:21). En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 25, 50, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 o más nucleótidos de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG. 2A -2B (SEQ ID NO:19) y una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 25, 50, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 o más nucleótidos de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG. 4A - 4B (SEQ ID NO:21). En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 25, 50, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG. 2A - 2B (SEQ ID NO:19) y una secuencia de nucleótidos que contiene al menos 25, 50, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 o más casos, de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FⁱG. 4A - 4B (SEQ ID NO:21).

En otro caso, la molécula de ácido nucleico incluye una fusión, p. ej., una fusión en marco, de al menos el exón 5 de LMNA o uno de sus fragmentos (p. ej., uno o más de los exones 1 -5 de LMNA o un fragmento de los mismos), y al menos el exón 12 o uno de sus fragmentos (p. ej., uno o más de los exones 12-17 de NTRK1 o un fragmento de los mismos). En otros casos más, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG. 2A - 2B (SEQ ID NO:19) y un fragmento de la secuencia de nucleótidos mostrada en las FIG. 4A - 4B (SEQ ID NO:21) o un fragmento de la fusión, o una secuencia sustancialmente idéntica a estas.

En un caso, la molécula de ácido nucleico es complementaria a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, p. ej., se puede hibridar en condiciones rigurosas descrita en el presente documento a SEQ ID NO:19 y/o SEQ ID NO:21, o uno de sus fragmentos. En otro caso más, la molécula de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, p. ej., se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:19 y/o SEQ ID NO:21, o uno de sus fragmentos. La secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica una fusión 5' LMNA-3' NTRK1 ilustrativa se muestra en al menos el exón 5 (p. ej., los exones 1-5) de SEQ ID NO:19 y al menos en el exón 12 (p. ej., los exones 12-17) de SEQ ID NO:21, y la secuencia de aminoácidos predicha se muestra en los correspondientes exones codificados de SEQ ID NO:20 y en los correspondientes exones codificados de SEQ ID NO:22, respectivamente.

La molécula de ácido nucleico LMNA-NTRK1 comprende suficiente secuencia de LMNA y suficiente de NTRK1 de modo que la fusión 5' LMNA-3' NTRK1 codificada tenga actividad cinasa, p. ej., tenga actividad elevada, p. ej., actividad cinasa de NTRK1, en comparación con NTRK1 de tipo salvaje, p. ej., en una célula de un cáncer al que se hace referencia en el presente documento. En ciertas realizaciones, la fusión 5' LMNA-3' NTRK1 comprende los exones 1 -5 de LMNA y el exón 12-17 de NTRK1. En ciertos casos, la fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 1,2, 3, 4, 5 o más exones de LMNA y al menos 1,2, 3, 4, 5 o más exones de NTRK1. En ciertas realizaciones, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una fusión del exón 5 de LMNA y del exón 12 de NTRK1. En otro caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 1,2, 3, 4, 5 exones de LMNA; y al menos 1,2, 3, 4, 5 exones de NTRK1.

En un caso, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una fusión en marco del intrón 5 de LMNA (p. ej., NM_170707) con el intrón 12 de NTRK1 (p. ej., NM_002529). En otra realización, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye un punto de ruptura. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye el punto de unión de fusión entre el gen LMNA y el gen NTRK1, p. ej., el punto de ruptura entre el intrón 5 de LMNA y el intrón 11 de NTRK1. En otras realizaciones, las moléculas de ácido nucleico incluyen una secuencia de nucleótidos de uno o más del nucleótido 156.844.787 del cromosoma 1 acoplado a (p. ej., directa o indirectamente yuxtapuesto a) uno o más del nucleótido 156.105.353 del cromosoma 1. En una realización, la molécula de ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos de: el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.844.787 más o menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150 nucleótidos y el cromosoma 1 en uno o más del nucleótido 156.105.353 más o menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150 nucleótidos (correspondientes al punto de ruptura de una fusión LMNA-NTRK1), o uno de sus fragmentos, o una secuencia sustancialmente idéntica a esta. En un caso, la molécula de ácido nucleico es complementaria a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, p. ej., se puede hibridar en condiciones rigurosas descrita en el presente documento con SEQ ID NO:19 y/o SEQ ID NO:21, o uno de sus fragmentos. En otro caso más, la molécula de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, p. ej., se puede hibridar en condiciones rigurosas descrita en el presente documento con una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:19 o 21 o uno de sus fragmentos.

En otro caso, el ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 6, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más nucleótidos del exón 5 de LMNA (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de LMNA que precede al punto de unión de fusión con NTRK1, p. ej., de la secuencia LMNA mostrada en las FIG. 2A - 2B (S^eQ ID NO:19)), y al menos 6, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100 o más nucleótidos del exón 12 de NTRK1 (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de NTRK1 tras el punto de unión de fusión con LMNA, p. ej., de la secuencia NTRK1 mostrada en las FIG. 4A - 4B (SEQ ID NO:21)).

En otros casos, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que incluye un fragmento de un gen LMNA y un fragmento de un gen NTRK1. En un caso, la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que incluye, p. ej., un dominio tirosina cinasa NTRK1 o un fragmento funcional del mismo. En otros casos más, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 3 (p. ej., SEQ ID NO:20) y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 5 (p. ej., SEQ ID NO:22), o un fragmento de la fusión, o una secuencia sustancialmente idéntica a estas. En un caso, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 codificado incluye un dominio tirosina cinasa NTRK1 o un fragmento funcional del mismo.

En un caso, la divulgación presenta construcciones de ácido nucleico que incluyen las moléculas de ácido nucleico LMNA-NTRK1 descritas en el presente documento. En ciertos casos, las moléculas de ácido nucleico se conectan operativamente a una secuencia reguladora nativa o una heteróloga. También se incluyen vectores y células anfitrionas que incluyen las moléculas de ácido nucleico LMNA-NTRK1 descritas en el presente documento, p. ej., vectores y células anfitrionas adecuados para producir las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos descritos en el presente documento.

En un caso, también se describen métodos de producción de las moléculas de ácido nucleico y de los polipéptidos descritos en el presente documento.

En un caso, la divulgación presenta moléculas de ácido nucleico que reducen o inhiben la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento. Los ejemplos de dichas moléculas de ácido nucleico incluyen, p. ej., moléculas antisentido, ribozimas, ARNi, moléculas con triple hélice que hibridan con un ácido nucleico que codifica LMNA-NTRK1, o una región reguladora de la transcripción de LMNA-NTRK1, y bloquea o reduce la expresión de ARNm de LMNA-NTRK1.

Reactivos de detección y captura de ácidos nucleicos

La divulgación presenta una molécula de ácido nucleico, p. ej., fragmento de ácido nucleico, adecuada como sonda, cebador, cebo o miembro de la biblioteca que incluye, flanquea, hibrida con, que es útil para identificar, o de otro modo se basa en, las fusiones LMNA-NTRK1 descritas en el presente documento. En ciertos casos, la molécula de sonda, cebador o cebo es un oligonucleótido que permite la captura, detección o aislamiento de una molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento. El oligonucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a un fragmento de las moléculas de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 descritas en el presente documento. No es necesario que la identidad de secuencia entre el fragmento de ácido nucleico, p. ej., el oligonucleótido, y la secuencia de LMNA-NTRK1 diana sea exacta, siempre que las secuencias sean lo suficientemente complementarias para permitir la captura, detección o aislamiento de la secuencia diana. En un caso, el fragmento de ácido nucleico es una sonda o cebador que incluye un oligonucleótido de entre aproximadamente 5 y 25, p. ej., entre 10 y 20, o 10 y 15 nucleótidos de longitud. En otros casos, el fragmento de ácido nucleico es un cebo que incluye un oligonucleótido de entre aproximadamente 100 a 300 nucleótidos, 130 y 230 nucleótidos o 150 y 200 nucleótidos de longitud.

En un caso, el fragmento de ácido nucleico se puede utilizar para identificar o capturar, p. ej., por hibridación, una fusión LMNA-NTRK1. Por ejemplo, el fragmento de ácido nucleico puede ser una sonda, un cebador o un cebo, para su uso en la identificación o captura, p. ej., por hibridación, de una fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento. En un caso, el fragmento de ácido nucleico puede ser útil para identificar o capturar un punto de ruptura de LMNA-NTRK1, p. ej., la secuencia de nucleótidos de: el cromosoma 1 en el nucleótido 156.844.787 más o menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150 nucleótidos y el cromosoma 1 en el nucleótido 156.105.353 más o menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150 nucleótidos.

En un caso, el fragmento de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos dentro de un reordenamiento cromosómico que crea una fusión en marco del intrón 5 de LMNA con el intrón 11 de NTRK1. En un caso, el fragmento de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos en la región. En otros casos, las moléculas de ácido nucleico incluyen una secuencia de nucleótidos en la región de los nucleótidos 156.844.787 del cromosoma 1 acoplados (p. ej., yuxtapuestos a) a nucleótidos en la región de los nucleótidos 156.105.353 del cromosoma 1. En un caso, el fragmento de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos que incluye un punto de ruptura, p. ej., la secuencia de nucleótidos de: el cromosoma 1 en el nucleótido 156.844.787 más o menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150 o más nucleótidos y el cromosoma 1 en el nucleótido 156.105.353 más o menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150 o más nucleótidos. Por ejemplo, el fragmento de ácido nucleico puede hibridar con una secuencia de nucleótidos que incluye el punto de unión de fusión entre el gen LMNA y el gen NTRK1, p. ej., una secuencia de nucleótidos que incluye una porción de una secuencia de nucleótidos dentro de los intrones 5 de un gen LMNA y 11 de un gen NTRK1.

En otro caso, el fragmento de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 6, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o más nucleótidos del exón 5 de LMNA (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de LMNA que precede al punto de unión de fusión con NTRK1, p. ej., de la secuencia de LMNA mostrada en las FIG. 19A-19B (SEQ ID n O:19)), y al menos 6, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o más nucleótidos del exón 12 de NTRK1 (p. ej., de la secuencia de nucleótidos de NTRK1 tras el punto de unión de fusión con LMNA, p. ej., de la secuencia ⁿT^rK1 mostrada en las FIG. 21A-21B (SEQ ID NO:21)).

Las sondas o cebadores descritos en el presente documento se pueden utilizar, por ejemplo, para la detección por FISH o amplificación por PCR. En un caso ilustrativo, donde la detección se basa en PCR, la amplificación de el punto de unión de fusión LMNA-NTRK1 se puede realizar usando un cebador o un par de cebadores, p. ej., para amplificar una secuencia que flanquea los puntos de unión de fusión descritos en el presente documento, p. ej., las mutaciones o el punto de unión de un reordenamiento cromosómico descrito en el presente documento, p. ej., LMNA-NTRK1.

En un caso, un par de cebadores oligonucleotídicos aislados pueden amplificar una región que contiene o es adyacente a una posición en la fusión LMNA-NTRK1. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores directos para que hibriden con una secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia genómica o de ARNm de LMNA (p. ej., una secuencia de nucleótidos dentro del exón 5 de LMNA de SEQ ID NO: 19), y se pueden diseñar los cebadores inversos para que hibriden con una secuencia de nucleótidos de NTRK1 (p. ej., una secuencia de nucleótidos dentro del exón 12 de NTRK1, de SEQ ID NO:21).

En otro caso, los fragmentos de ácido nucleico se pueden utilizar para identificar, p. ej., por hibridación, una fusión LMNA-NTRK1. En un caso, el fragmento de ácido nucleico hibrida con una secuencia de nucleótidos que incluye un punto de unión de fusión entre el transcrito de LMNA y el transcrito de NTRK1.

En otros casos, el fragmento de ácido nucleico incluye un cebo que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida con una molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento y, de este modo, permite la captura o aislamiento de dicha molécula de ácido nucleico. En un caso, un cebo es adecuado para la hibridación en fase de solución. En otros casos, un cebo incluye una entidad de unión, p. ej., una etiqueta de afinidad, que permite la captura y separación, p. ej., uniéndose a una entidad de unión, de un híbrido formado por un cebo y un ácido nucleico hibridado al cebo.

En otros casos, el fragmento de ácido nucleico incluye un miembro de la biblioteca que comprende una molécula de ácido nucleico de LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento. En un caso, el miembro de la biblioteca incluye un reordenamiento que da como resultado una fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento.

El fragmento de ácido nucleico se puede marcar de forma detectable, p. ej., con una radiomarca, una marca fluorescente, una marca bioluminiscente, una marca quimioluminiscente, una marca enzimática, una marca de par de unión, o puede incluir una etiqueta de afinidad; una etiqueta o identificador (p. ej., un adaptador, código de barras u otro identificador de secuencia).

Polipéptidos de fusión LMNA-NTRK1

En otro caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y una secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22), o un fragmento de la fusión. En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y a la secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG.

5 (SEQ ID NO:22), o uno de sus fragmentos. En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, al menos al menos 99,5 o mayor, idéntica a la secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y la secuencia de aminoácidos (p. ej., un fragmento de la secuencia de aminoácidos) mostrada en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22). En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia que contiene al menos 10, 20, 50, 100, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y la FIG. 5 (SEQ ID NO:22). En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende una secuencia de aminoácidos que contiene al menos 5, 10, 20, 50, 100, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y al menos 5, 10, 20, 50, 100, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22). En un caso, el polipéptido de fusión 5' LMNA-3' NTRK1 incluye un dominio tirosina cinasa receptora NTRK1 o un fragmento funcional del mismo. En una realización, el polipéptido de fusión 5'LMNA-3'NTRK1 comprende suficiente secuencia de LMNA y suficiente de NTRK1 de modo que tenga actividad cinasa, p. ej., tenga actividad elevada, p. ej., actividad cinasa NTRK1, en comparación con NTRK1 de tipo salvaje, p. ej., en una célula de un cáncer al que se hace referencia en el presente documento.

En un caso, la divulgación presenta un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 (p. ej., un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 purificado), un fragmento biológicamente activo o antigénico del mismo, así como reactivos (p. ej., moléculas de anticuerpo que se unen a un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1), métodos para modular una actividad de un polipéptido LMNA-NTRK1 y la detección de un polipéptido LMNA-NTRK1.

El polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 tiene al menos una actividad biológica, p. ej., una actividad cinasa NTRK1. En una realización, al menos una actividad biológica del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 es reducida o inhibida por medio de un fármaco anticanceroso, p. ej., un inhibidor de cinasa (p. ej., un inhibidor de múltiples cinasas o un inhibidor específico de NTRK1). En una realización, al menos una actividad biológica del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 es reducida o inhibida por un inhibidor de cinasa NTRK1 elegido entre, p. ej., lestaurtinib (CEP-701); AZ-23; indenopirrolocarbazol 12a; oxindol 3; isotiazol 5n; tiazol 20h.

En otros casos más, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 es codificado por una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 es codificado por una fusión en marco del intrón 5 de LMNA con el intrón 11 de NTRK1 (p. ej., una secuencia en el cromosoma 1). En otra realización, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende un punto de unión de fusión entre el transcrito de LMNA y el transcrito de NTRK1.

En ciertos casos, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende uno o más de los exones 1-5 codificados de LMNA y uno o más de los exones 12-17 codificado de NTRK1. En ciertos casos, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 1,2, 3, 4, 5 o más exones codificados de LMNA y al menos 1,2, 3, 4, 5 o más exones codificados de NTRK1. En ciertas realizaciones, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende una fusión del exón 5 codificado de LMNA y del exón 12 codificado de NTRK1 (o un fragmento de los mismos). En otros casos, la fusión comprende al menos 1,2, 3, 4, 5 exones codificados de LMNA y al menos 1,2, 3, 4, 5 exones codificados de NTRK1. En ciertas realizaciones, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende los exones 1-5 codificados de LMNA y el exón 12-17 de NTRK1. En ciertas realizaciones, el polipéptido de fusión 5' LMNA-3' NTRK1 comprende un punto de unión de fusión de la secuencia del exón 5 de LMNA y de la secuencia del exón 12 de NTRK1.

En ciertos casos, la fusión LMNA-NTRK1 comprende la secuencia de aminoácidos correspondiente al exón 5, o uno de sus fragmentos, de LMNA, y la secuencia de aminoácidos correspondiente al exón 12, o uno de sus fragmentos, de NTRK1 (p. ej., como se muestra en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22)). En un caso, la fusión LMNA-NTRK1 comprende al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos del exón 5 de LMNA (p. ej., de la secuencia de aminoácidos de LMNA que precede al punto de unión de fusión con NTRK1, p. ej., de la secuencia de LMNA mostrada en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20)), y al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos del exón 12 de NTRK1 (p. ej., de la secuencia de aminoácidos de NTRK1 tras el punto de unión de fusión con LMNA, p. ej., de la secuencia NTRK1 mostrada en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22)).

En un caso, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 incluye un dominio tirosina cinasa NTRK1 o un fragmento funcional del mismo. En un caso relacionado, la divulgación presenta el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 o fragmentos conectados operativamente a polipéptidos heterólogos para formar proteínas de fusión.

En otro caso, el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 o fragmento es un péptido, p. ej., un péptido o proteína inmunogénicos, que contienen un punto de unión de fusión descrito en el presente documento. Tales péptidos o proteínas inmunogénicos se pueden utilizar para producir anticuerpos específicos para la proteína de fusión. En otros casos, tales péptidos o proteínas inmunogénicos se pueden utilizar para la preparación de vacunas. La preparación de vacunas puede incluir otros componentes, p. ej., un adyuvante.

En un caso, la divulgación presenta moléculas de anticuerpo que se unen a un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 o fragmento descrito en el presente documento. En casos, el anticuerpo puede distinguir NTRK1 (o LMNA) de tipo salvaje de LMNA-NTRK1.

Reactivos de detección y detección de mutaciones

En un caso, la divulgación presenta un reactivo de detección, p. ej., una preparación purificada o una aislada del mismo. Los reactivos de detección pueden distinguir una secuencia de ácido nucleico o de proteína que tenga un punto de ruptura, p. ej., un punto de ruptura LMNA-NTRK1; de una secuencia de referencia. En un caso, el reactivo de detección detecta (p. ej., detecta específicamente) un ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 o un polipéptido (p. ej., distingue un NTRK1 de tipo salvaje u otra fusión de NTRK1 (o de LMNA) de un ácido nucleico de LMNA-NTRK1 (p. ej., como se describe en el presente documento en las FIG. 2A-2B (SEQ ID NO: 19) y en las FIG. 4A-4B (SEQ ID NO:21); o un polipéptido de LMNA-NTRK1 (p. ej., como se describe en el presente documento en la FIG. 3 (SEQ ID NO:20) y en la FIG. 5 (SEQ ID NO:22).

Se pueden utilizar reactivos de detección, p. ej., reactivos de detección basados en ácido nucleico, para identificar mutaciones en un ácido nucleico diana, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, p. ej., en una muestra, p. ej., una muestra de ácido nucleico obtenido de una célula neoplásica o tumoral, p. ej., una neoplasia melanocítica, melanoma o célula metastásica. Se pueden utilizar reactivos de detección, p. ej., reactivos de detección basados en anticuerpos para identificar mutaciones en una proteína diana, p. ej., en una muestra, p. ej., una muestra de proteína obtenida de, o producida por, una célula neoplásica o tumoral, p. ej., una neoplasia melanocítica, melanoma o célula metastásica.

Método de tratamiento

NTRK1 codifica una tirosina cinasa receptora que desempeña un papel en el desarrollo del sistema nervioso al regular la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia de las neuronas. NTRK1 se activa tras la unión de su ligando NGF (Klein R, Jing SQ, Nanduri V, etal. (1991) The trk proto-oncogene encodes a receptor for nerve growth factor. Cell 65(1): 189-97) para promover varias vías de señalización aguas abajo, incluyendo GRB2-Ras-MAPK, NF-Kappa-B y Ras-PI3-cinasa AKT1 (Wooten MW, Seibenhener ML, Mamidipudi V, et al. (2001) The atypical protein kinase C-interacting protein p62 is a scaffold for NF-kappaB activation by nerve growth factor. J Biol Chem 276(11 ):7709-12, Stephens RM, Loeb DM, Copeland TD, et al. (1994) Trk receptors use redundant signal transduction pathways involving SHC and PLC-gamma 1 to mediate NGF responses. Neuron 12(3):691-705, Tacconelli A, Farina AR, Cappabianca L, et al. (2004) TrkA alternative splicing: a regulated tumor-promoting switch in human neuroblastoma. Cancer Cell 6(4):347-60). El reordenamiento detectado en este tumor da como resultado una fusión que contiene una porción N terminal de LMNA (lamina A, posiblemente los exones 1 -5) fusionada a la porción C terminal de NTRK1 (posiblemente los exones 11-17). No existen informes en la bibliografía de proteínas de fusión LMNA-NTRK1 (PubMed, sept. de 2012). Se espera que la proteína de fusión referida en el presente documento sea activa, ya que contiene un dominio cinasa NTRK1 completo (Indo Y, Mardy S, Tsuruta M, et al. (1997) Structure and organization of the human TRKA gene encoding a high affinity receptor for nerve growth factor. Jpn J Hum Genet 42(2):343-51); adicionalmente, puede tener actividad cinasa constitutiva, en comparación con otras fusiones de NTRK1 referidas en el carcinoma papilar de tiroides (Greco A, Mariani C, Miranda C, et al. (1993) Characterization of the NTRK1 genomic region involved in chromosomal rearrangements generating TRK oncogenes. Genomics 18(2):397-400, Greco A, Mariani C, Miranda C, et al. (1995) The DNA rearrangement that generates the TRK-T3 oncogene involves a novel gene on chromosome 3 whose product has a potential coiledcoil domain. Mol Cell Biol 15(11 ):6118-27, Greco A, Pierotti MA, Bongarzone I, et al. (1992) TRK-T1 is a novel oncogene formed by the fusion of TPR and TRK genes in human papillary thyroid carcinomas. Oncogene 7(2):237-42, Martin-Zanca D, Hughes SH, Barbacid M A human oncogene formed by the fusion of truncated tropomyosin and protein tyrosine kinase sequences. Nature 319(6056):743-8). No se ha informado de fusiones o reordenamientos que impliquen a NTRK1 en la histiocitosis no Langerhans. Se pueden utilizar inhibidores de NTRK1 para tratar los cánceres descritos en el presente documento.

En consecuencia, en un caso, se proporciona un método de inhibición, reducción o tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, p. ej., una neoplasia (incluyendo benigna, premaligna o maligna (p. ej., un cáncer), en un sujeto. El método incluye administrar al sujeto un agente terapéutico preseleccionado, p. ej., un agente anticanceroso (p. ej., un inhibidor de cinasa), como agente único, o combinado, en una cantidad suficiente para reducir, inhibir o tratar la actividad o expresión de LMNA-NTRK1 (p. ej., una fusión LMNA-NTRK1 descrita en el presente documento), inhibiendo, reduciendo o tratando, de este modo, el trastorno hiperproliferativo en el sujeto.

En una realización, el sujeto tratado tiene una fusión LMNA-NTRK1; p. ej., el sujeto tiene un tumor o cáncer que alberga una fusión LMNA-NTRK1. En otras realizaciones, el sujeto se ha identificado previamente por tener una fusión LMNA-NTRK1. En otras realizaciones más, se ha identificado previamente es probable o improbable que el sujeto responda al tratamiento con un inhibidor de proteína cinasa, p. ej., un sujeto que ha participado previamente en un ensayo clínico. En otras realizaciones, el sujeto se ha identificado previamente porque es probable o improbable que responda al tratamiento con un inhibidor de proteína cinasa basándose en la presencia de la fusión LMNA-NTRK1. En una realización, el sujeto es un mamífero, p. ej., un ser humano. En una realización, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, un cáncer en cualquier estadio de la enfermedad. En otras realizaciones, el sujeto es un paciente, p. ej., un paciente con cáncer.

En ciertos casos, la neoplasia o célula neoplásica es benigna, premaligna, maligna (cáncer) o metástasis. En ciertas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, un tumor de partes blandas o una lesión metastásica.

En un caso, la neoplasia o célula neoplásica es benigna, premaligna, maligna (cáncer) o metástasis. En ciertas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, un tumor de partes blandas o una lesión metastásica. En una realización, el cáncer es una histiocitosis no Langerhans. En una realización, el cáncer se elige entre un cáncer de pulmón, un cáncer de páncreas, melanoma, un cáncer colorrectal, un cáncer esofagogástrico, un cáncer de tiroides o un adenocarcinoma. En una realización, el cáncer es un adenocarcinoma de pulmón. En otra realización, el cáncer de pulmón se elige entre uno o más de los siguientes: carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de pulmón microcítico (CPM), carcinoma de células escamosas (CCE), adenocarcinoma de pulmón, carcinoma broncogénico o una combinación de los mismos. En una realización, el cáncer de pulmón es CPNM o CCE. En una realización, el cáncer es un neuroblastoma. En ciertas realizaciones, el cáncer es leucemia, p. ej., una leucemia mielógena.

En una realización, el agente anticanceroso es un inhibidor de cinasa. Por ejemplo, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de múltiples cinasas o un inhibidor específico de NTRK1. En una realización, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de NTRK1 que incluye, pero sin limitarse a, danusertib (PHA-739358); PHA-848125; CEP-2563; K252a; KRC-108; lestaurtinib (CEP-701); AZ-23; indenopirrolocarbazol 12a; oxindol 3; isotiazol 5n; tiazol 20h. En ciertos casos, el inhibidor es un inhibidor de HSP90. En ciertos casos, el inhibidor de HSP90 es 17-DMAG. En ciertas realizaciones, el inhibidor de NTRK1 es un inhibidor de NTRK1 descrito en el presente documento.

Moléculas de ácido nucleico

En un aspecto, la divulgación presenta una molécula de ácido nucleico aislada, o una preparación aislada de moléculas de ácido nucleico, que incluye una alteración o mutación genética, p. ej., un reordenamiento, divulgado en el presente documento, p. ej., en esta sección titulada Moléculas de ácido nucleico, o en la FIG. 1A o 1B. Tales moléculas de ácido nucleico o preparaciones de las mismas se pueden utilizar para detectar, p. ej., una secuencia, una alteración o mutación genética divulgadas en el presente documento y para caracterizar una muestra en la que están contenidas. El ácido nucleico aislado puede ser una secuencia genómica o una transcrita, p. ej., una secuencia de ADNc.

En otro aspecto, la divulgación presenta una molécula de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ácido nucleico aislada o purificada) que incluye un fragmento de un primer gen y un fragmento de un segundo gen, típicamente un gen que codifica una cinasa. En casos, el primer gen es un gen de la FIG. 1A o 1B y el segundo gen es un gen, p. ej., una cinasa de la FIG. 1A o 1B. En un caso, la proteína de fusión tiene los compañeros de fusión de una proteína de fusión descrita en la FIG. 1A o 1B.

La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender toda la secuencia del primer fragmento y toda la secuencia del segundo fragmento, p. ej., como se muestra en la FIG. 1A o 1B.

En casos, el ácido nucleico aislado es una molécula de ácido nucleico genómico que comprende la secuencia que codifica toda la secuencia, p. ej., desde la región de control o el comienzo del marco abierto de lectura, hasta el punto de ruptura, que puede estar en un intrón o un exón, del primer gen, fusionada a la secuencia para el segundo gen que comienza en su punto de ruptura y se extiende hasta el extremo del gen, p. ej., hasta el extremo del marco abierto de lectura de ese gen. En otros casos, el ácido nucleico aislado incluirá el punto de unión de fusión, pero solo una porción del fragmento del primer o segundo gen presente en el reordenamiento.

En casos, el ácido nucleico aislado es un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o un ARNm, y comprende una secuencia que codifica toda la secuencia, p. ej., desde el comienzo del ARNm hasta el punto de ruptura del primer gen fusionado a la secuencia para el segundo gen que comienza en su punto de ruptura y se extiende hasta el extremo del ARNm del segundo gen. En otros casos, el ácido nucleico aislado incluirá el punto de unión de fusión, pero solo una porción del fragmento del primer o segundo gen presente en el reordenamiento. En casos, un ácido nucleico transcrito tendrá uno o más exones del primer gen fusionados, en marco, a uno o más exones del segundo gen. En casos, un ácido nucleico transcrito comprenderá la fusión del extremo C del exón C terminal del primer fragmento génico con el extremo N del exón N terminal del segundo gen.

En casos, la fusión pone la actividad cinasa del segundo gen bajo el control del primer gen.

En casos, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende el punto de unión de fusión, p. ej., un punto de unión de fusión de la FIG. 1A o 1B, y tiene al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos de longitud, pero opcionalmente menos de 1000, 1500 o 2000 nucleótidos de longitud. En casos, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende el punto de unión de fusión, p. ej., un punto de unión de fusión de la FIG. 1A o 1B, y está entre 10 y 2000, 10 y 1500, 10 y 1000, 10 y 500, 10 y 400, 10 y 300, 10 y 200, 10 y 100, 20 y 2000, 20 y 1500, 20 y 1000, 20 y 500, 20 y 400, 20 y 300, 20 y 200, 20 y 100, 30 y 2000, 30 y 1500, 30 y 1000, 30 y 500, 30 y 400, 30 y 300, 30 y 200, 30 y 100 nucleótidos de longitud.

En un caso, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende una fusión, p. ej., una fusión en marco, de la FIG. 1B o una fusión transcrita a partir de una fusión genómica de la FIG.

1A.

En un caso, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende una fusión, p. ej., una fusión en marco, del extremo 3' de un exón de un fragmento del primer gen de la FIG. 1B al extremo 5' de un exón de un fragmento del segundo gen de la FIG. 1B. En un caso, la fusión es entre los exones enumerados en la FIG. 1B. En casos, la fusión no es entre los exones específicos encontrados en la FIG. 1B, pero es entre otros exones del primer gen a otros exones del segundo gen de una fusión de la FIG. 1B.

En un caso, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende una fusión, p. ej., una fusión en marco, del exón C terminal de un fragmento del primer gen de la FIG. 1B al extremo N de un exón de un fragmento del segundo gen distinto del exón del segundo gen mostrado en la FIG. 1B.

En un caso, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende una fusión, p. ej., una fusión en marco, del exón N terminal de un fragmento del segundo gen de la FIG. XI al extremo C de un exón de un fragmento del primer gen distinto del exón del primer gen mostrado en la FIG. XI.

En un caso del ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, el segundo gen es una cinasa y está presente suficiente secuencia exónica para conferir actividad cinasa. En un caso del ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARNm, está presente suficiente secuencia del primer gen para permitir la expresión de la actividad cinasa del compañero de fusión.

En un caso del ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, comprende un punto de unión de fusión entre:

LMNA y NTRK1;

en donde está presente suficiente secuencia exónica de la cinasa para conferir actividad cinasa y está presente suficiente secuencia del otro gen para permitir la expresión de la actividad cinasa del compañero de fusión.

También se incluyen fusiones genómicas que se pueden transcribir para proporcionar un ácido nucleico transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, descrito en el presente documento.

En un caso, el ácido nucleico aislado, p. ej., un ácido nucleico genómico, comprende una fusión de un primer y segundo gen de la FIG. 1A.

En casos, la fusión es entre genes que son compañeros de fusión en una fusión descrita en la FIG. 1A o 1B. En un caso, está presente suficiente secuencia del segundo gen para conferir actividad cinasa a una proteína codificada y está presente suficiente secuencia del primer gen para proporcionar la expresión de la actividad cinasa del compañero de fusión en una proteína codificada.

En un caso, el ácido nucleico aislado, p. ej., una secuencia genómica, comprende una fusión del extremo 3' de un fragmento de un primer gen con el extremo 5' de un fragmento de un segundo gen, mostrada en la FIG. 1A. En un caso, el extremo 3' del fragmento del primer gen está dentro de los 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos (en cualquier dirección) del extremo 3’ proporcionado en la FIG. 1A para el primer gen. En un caso, el extremo 5' del fragmento del segundo gen está dentro de los 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos (en cualquier dirección) del extremo 5’ proporcionado en la FIG. 1 para el segundo gen. A modo de ejemplo, para la fusión TRIM24-BRAF de una muestra de melanoma, el extremo 3' puede ser cr7:1.140.489.369 /- N nucleótidos y el extremo 5' es cr7:138.241.731 /- N nucleótidos, en donde N es independientemente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos. En casos, N es 50 nucleótidos.

No se necesita que la fusión sea entre los exones específicos encontrados en la FIG. 1A o 1B, pero pueden ser fusiones de otros exones del primer gen con otros exones del segundo gen, siempre que esté presente suficiente secuencia del segundo gen para conferir actividad cinasa a una proteína codificada y esté presente suficiente secuencia del primer gen para proporcionar la expresión de la actividad cinasa del compañero de fusión en una proteína codificada.

En otro aspecto, también se describen métodos de producción de las moléculas de ácido nucleico y de los polipéptidos descritos en el presente documento.

Reactivos de detección y detección de mutaciones

En otro aspecto, la divulgación presenta un reactivo de detección, p. ej., una preparación purificada o una aislada del mismo. Los reactivos de detección pueden distinguir un ácido nucleico, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, o una secuencia de proteína, que tenga un punto de ruptura o punto de unión de fusión descrito en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B, o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, de una secuencia de referencia, p. ej., una secuencia que no tenga el punto de ruptura o punto de unión de fusión.

En un caso, el reactivo de detección detecta (p. ej., detecta específicamente) un ácido nucleico de fusión o un polipéptido (p. ej., distingue una fusión de tipo salvaje u otra de una fusión descrita en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico.

Se pueden utilizar reactivos de detección, p. ej., reactivos de detección basados en ácido nucleico, para identificar mutaciones, p. ej., reordenamientos o puntos de unión de fusión descritos en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, en un ácido nucleico diana, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o un ácido nucleico transcrito, ADNc o ARN, p. ej., en una muestra, p. ej., una muestra de ácido nucleico obtenida de una célula neoplásica o tumoral, p. ej., una célula primaria o metastásica. En un caso, un reordenamiento o punto de unión de fusión descritos en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, se detecta en una muestra del correspondiente cáncer enumerado en la FIG. 1A. Se pueden utilizar reactivos de detección, p. ej., reactivos de detección basados en anticuerpos, para identificar las mutaciones descritas en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, en una proteína diana, p. ej., en una muestra, p. ej., una muestra de proteína obtenida de, o producida por, una célula primaria o metastásica.

Reactivos de detección basados en ácido nucleico

En un caso, el reactivo de detección comprende una molécula de ácido nucleico, p. ej., una molécula de ADN, ARN o ADN/ARN mixta, que comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico en un ácido nucleico diana, p. ej., un ácido nucleico que incluye el reordenamiento o punto de unión de fusión (la secuencia en el ácido nucleico diana que se une por el reactivo de detección se denomina en el presente documento "sitio de unión al reactivo de detección" y la porción del reactivo de detección que corresponde al sitio de unión al reactivo de detección se denomina "sitio de unión a la diana"). En un caso, el sitio de unión al reactivo de detección está dispuesto en relación con la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, de modo que la unión (o, en caso, la carencia de unión) del reactivo de detección al sitio de unión al reactivo de detección, o la proximidad de unión a sondas de un reactivo de detección a sus sitios de unión de detección, permita la diferenciación de secuencias mutantes y de referencia para un mutante descrito en el presente documento (p. ej., un reordenamiento que tiene un punto de ruptura descrito en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, de una secuencia de referencia. El reactivo de detección se puede modificar, p. ej., con una marca u otro radical, p. ej., un radical que permita la captura.

En casos, una mutación descrita en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, se distingue de la referencia por unión o carencia de unión de un reactivo de detección.

En casos, p. ej., con sondas basadas en proximidad, p. ej., sondas FISH, una mutación descrita en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, y una referencia se distinguen por la proximidad de la unión de dos sondas del reactivo de detección. Por ejemplo, un reordenamiento genómico que altera la distancia entre dos sitios de unión se puede detectar con sondas basadas en proximidad, p. ej., sondas FISH.

En un caso, el reactivo de detección comprende una molécula de ácido nucleico, p. ej., una molécula de ADN, ARN o ADN/ARN mixta, que, p. ej., en su sitio de unión a la diana, incluye la posición de interrogación, p. ej., uno o más de los nucleótidos que flanquean un punto de unión de fusión, y que puede distinguir (p. ej., por la afinidad de unión del reactivo de detección a un ácido nucleico diana, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, o la capacidad para una reacción, p. ej., una reacción de ligación o extensión con el reactivo de detección) entre una mutación, p. ej., una translocación descrita en el presente documento, y una secuencia de referencia. En casos, la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión puede corresponder a un extremo, p. ej., a un nucleótido terminal 3' o 5', un nucleótido inmediatamente adyacente a un nucleótido terminal 3' o 5', o a otro nucleótido interno, del sitio de unión al reactivo de detección o a la diana.

En casos, la diferencia en la afinidad del reactivo de detección por un ácido nucleico diana, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN, que comprende el mutante, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrito en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, y la de un ácido nucleico diana que comprende la secuencia de referencia permite la determinación de la presencia o ausencia de la secuencia de mutación (o de referencia). Típicamente, tales reactivos de detección, en condiciones de ensayo, presentarán niveles sustancialmente mayores de unión solo al mutante o solo a la secuencia de referencia, p. ej., presentarán niveles sustanciales de unión solo al mutante o solo a la secuencia de referencia.

En casos, la unión permite (o inhibe) una reacción posterior, p. ej., una reacción posterior que implique el reactivo de detección o el ácido nucleico diana. Por ejemplo, la unión puede permitir la ligación o la adición de uno o más nucleótidos a un ácido nucleico, p. ej., el reactivo de detección, p. ej., por la ADN polimerasa, que se puede detectar y utilizar para distinguir el mutante de la referencia. En casos, la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión se localiza en el extremo, o lo suficientemente cerca del extremo, del reactivo de detección o de su sitio de unión a la diana, de modo que la hibridación, o una reacción química, p. ej., la adición de uno o más nucleótidos al reactivo de detección, p. ej., por ADN polimerasa, solo se produzca, o se produzca a una tasa sustancialmente mayor, cuando exista un emparejamiento perfecto entre el reactivo de detección y el ácido nucleico diana en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión o en una posición de nucleótido dentro de 1, 2 o 3 nucleótidos de la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión.

En un caso, el reactivo de detección comprende un ácido nucleico, p. ej., una molécula de ADN, ARN o ADN/ARN mixta en donde la molécula, o su sitio de unión a la diana, es adyacente (o flanquea), p. ej., es directamente adyacente, a la posición de interrogación, p. ej., uno o más de los nucleótidos que flanquean un punto de unión de fusión, y que puede distinguir entre una mutación, p. ej., un mutante, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrita en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, y una secuencia de referencia, en un ácido nucleico diana, p. ej., un ácido nucleico genómico o transcrito, p. ej., un ADNc o ARN.

En casos, el sitio de unión al reactivo de detección es adyacente a la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, p. ej., el nucleótido terminal 5' o 3' del reactivo de detección, o su sitio de unión a la diana, es adyacente, p. ej., entre 0 (directamente adyacente) y 1000, 500, 400, 200, 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos desde la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión. En casos, el resultado de una reacción variará con la identidad del nucleótido en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, lo que permite distinguir entre secuencias mutantes y de referencia. Por ejemplo, en presencia de un primer nucleótido en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, se favorecerá una primera reacción sobre una segunda reacción. Por ejemplo, en una reacción de ligación o de extensión del cebador, el producto diferirá, p. ej., en carga, secuencia, tamaño o susceptibilidad a una reacción adicional (p. ej., escisión con restricción) dependiendo de la identidad del nucleótido en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión. En casos, el reactivo de detección comprende moléculas emparejadas (p. ej., cebadores directos e inversos), que permiten la amplificación, p. ej., por amplificación por PCR, de un dúplex que contiene la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión. En tales casos, la presencia de la mutación se puede determinar por una diferencia en la propiedad del producto de amplificación, p. ej., tamaño, secuencia, carga o susceptibilidad a una reacción, resultante de una secuencia que comprende la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión y una secuencia correspondiente que tiene un nucleótido de referencia en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean los puntos de unión de fusión. En casos, la presencia o ausencia de un producto de amplificación característico es indicativa de la identidad del nucleótido en el sitio de interrogación y, por tanto, permite la detección de la mutación.

En casos, el reactivo de detección, o su sitio de unión a la diana, es directamente adyacente a la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, p. ej., el nucleótido terminal 5' o 3' del reactivo de detección es directamente adyacente a la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión. En casos, la identidad del nucleótido en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, determinará la naturaleza de una reacción, p. ej., una reacción que implique el reactivo de detección, p. ej., la modificación de un extremo del reactivo de detección. Por ejemplo, en presencia de un primer nucleótido en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, se favorecerá una primera reacción sobre una segunda reacción. A modo de ejemplo, la presencia de un primer nucleótido en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, p. ej., un nucleótido asociado con una mutación, puede promover una primera reacción, p. ej., la adición de un nucleótido complementario al reactivo de detección. A modo de ejemplo, la presencia de una A en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, provocará la incorporación de una T, que tiene, p. ej., una primera marca colorimétrica, mientras que la presencia de una G en la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, provocarán la incorporación de una C, que tiene, p. ej., una segunda marca colorimétrica. En un caso, la presencia de un primer nucleótido en el nucleótido dará como resultado la ligación del reactivo de detección a un segundo ácido nucleico. Por ejemplo, un tercer ácido nucleico se puede hibridar al ácido nucleico diana lo suficientemente cerca del sitio de interrogación de modo que, si el tercer ácido nucleico tiene un emparejamiento exacto en el sitio de interrogación, se ligará al reactivo de detección. La detección del producto de ligación, o su ausencia, es indicativa de la identidad del nucleótido en el sitio de interrogación y, por tanto, permite la detección de la mutación.

Se puede emplear una variedad de lecturas. Por ejemplo, la unión del reactivo de detección a la secuencia mutante o de referencia puede estar seguida de un radical, p. ej., una marca, asociada con el reactivo de detección, p. ej., una marca radiactiva o enzimática. En casos, la marca comprende un agente de extinción y un agente de señalización y la hibridación da como resultado la alteración de la distancia entre esos dos elementos, p. ej., incrementando la distancia y activando el agente de señalización. En casos, el reactivo de detección puede incluir un radical que permita la separación de otros componentes de una mezcla de reacción. En casos, la unión permite la escisión del reactivo de detección unido, p. ej., por una enzima, p. ej., por la actividad nucleasa de la ADN polimerasa o por una enzima de restricción. La escisión se puede detectar por la aparición o desaparición de un ácido nucleico o por la separación de un agente de extinción y un agente de señalización asociado con el reactivo de detección. En casos, la unión protege, o hace que la diana sea susceptible, a otra reacción química, p. ej., marcaje o degradación, p. ej., por enzimas de restricción. En casos, la unión con el reactivo de detección permite la separación por captura o la manipulación física del ácido nucleico diana para permitir, de este modo, la identificación. En casos, la unión puede dar como resultado una localización detectada del reactivo de detección o diana, p. ej., la unión podría capturar el ácido nucleico diana o desplazar un tercer ácido nucleico. La unión puede permitir la determinación de la presencia de secuencias mutantes o de referencia con FISH, en particular, en el caso de reordenamientos. La unión puede permitir la extensión u otro cambio de tamaño en un componente, p. ej., el reactivo de detección, lo que permite la distinción entre secuencias mutantes y de referencia. La unión puede permitir la producción, p. ej., por PCR, de un amplicón que distinga la secuencia mutante de la de referencia.

En un caso, el reactivo de detección, o el sitio de unión a la diana, tiene entre 5 y 2000, 5 y 1000, 5 y 500, 5 y 300, 5 y 250, 5 y 200, 5 y 150, 5 y 100, 5 y 50, 5 y 25, 5 y 20, 5 y 15 o 5 y 10 nucleótidos de longitud. En un caso, el reactivo de detección, o el sitio de unión a la diana, tiene entre 10 y 2000, 10 y 1000, 10 y 500, 10 y 300, 10 y 250, 10 y 200, 10 y 150, 10 y 100, 10 y 50, 10 y 25, 10 y 20 o 10 y 15 nucleótidos de longitud. En un caso, el reactivo de detección, o el sitio de unión a la diana, tiene entre 10 y 2000, 10 y 1000, 20 y 500, 20 y 300, 20 y 250, 20 y 200, 20 y 150, 20 y 100, 20 y 50 o 20 y 25 nucleótidos de longitud. En un caso, el reactivo de detección, o el sitio de unión a la diana, es lo suficientemente largo para distinguir entre secuencias mutantes y de referencia y tiene menos de 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 y 2000 nucleótidos de longitud.

En casos, el reactivo de detección comprende dos sondas que se unirán con una primera proximidad entre sí si está presente una mutación descrita en el presente documento, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrito en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, y con una segunda proximidad si no está presente la mutación. Típicamente, una de las proximidades dará como resultado la producción de una señal y la otra no. Por ejemplo, una sonda puede comprender un generador de señales y la otra puede comprender un extintor de señales. Si la proximidad es cercana, no habrá señal y si la proximidad es menos cercana, se producirá la señal.

Preparaciones de ácido nucleico mutante y usos de las mismas

En otro aspecto, la divulgación presenta preparaciones purificadas o aisladas de un ácido nucleico de células tumorales o neoplásicas, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación descrita en el presente documento, útil para determinar si está presente una mutación divulgada en el presente documento. El ácido nucleico incluye la posición de interrogación y típicamente una secuencia de fusión adicional en uno o ambos lados de la posición de interrogación. Además, el ácido nucleico puede contener secuencias heterólogas, p. ej., secuencias de adaptador o cebador, típicamente fijadas a uno o ambos extremos del ácido nucleico. El ácido nucleico también incluye un marcador u otro radical, p. ej., un radical que permita la separación o localización.

En casos, el ácido nucleico tiene entre 20 y 1000, 30 y 900, 40 y 800, 50 y 700, 60 y 600, 70 y 500, 80 y 400, 90 y 300 o 100 y 200 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas). En un caso, el ácido nucleico tiene entre 40 y 1000, 50 y 900, 60 y 800, 70 y 700, 80 y 600, 90 y 500, 100 y 400, 110 y 300 o 120 y 200 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas). En otro caso, el ácido nucleico tiene entre 50 y 1000, 50 y 900, 50 y 800, 50 y 700, 50 y 600, 50 y 500, 50 y 400, 50 y 300, o 50 y 200 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas). En casos, el ácido nucleico tiene una longitud suficiente para permitir la secuenciación (p. ej., por secuenciación química o determinando una diferencia en la Tf entre las preparaciones de mutante y de referencia), pero opcionalmente tiene menos de 100, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos de longitud (con o sin secuencias heterólogas).

Se pueden utilizar tales preparaciones para secuenciar el ácido nucleico de una muestra, p. ej., una muestra neoplásica o tumoral. En un caso, la preparación purificada se proporciona por amplificación in situ de un ácido nucleico proporcionado en un sustrato. En casos, la preparación purificada es espacialmente distinta de otros ácidos nucleicos, p. ej., otros ácidos nucleicos amplificados, en un sustrato.

En un caso, la preparación purificada o aislada de ácido nucleico se obtiene de una neoplasia o tumor de un tipo descrito en el presente documento, p. ej., neoplasia y/o cáncer, p. ej., una neoplasia melanocítica, melanoma o cáncer metastásico. En un caso, el ácido nucleico de fusión se obtiene de una histiocitosis, p. ej., una histiocitosis de células no Langerhans.

Se pueden utilizar tales preparaciones para determinar si una muestra comprende una secuencia mutante, p. ej., una translocación como se describe en el presente documento. En un caso, la translocación incluye un punto de ruptura. Los ácidos nucleicos que incluyen el punto de ruptura mencionado anteriormente, p. ej., un punto de ruptura descrito en el presente documento, se denominan conjuntamente en el presente documento ácidos nucleicos de fusión.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de determinación de la secuencia de una posición de interrogación para una mutación descrita en el presente documento, que comprende:

proporcionar preparaciones purificadas o aisladas de ácido nucleico o ácido nucleico de fusión, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contenga una posición de interrogación descrita en el presente documento,

secuenciar, por un método que rompe o forma un enlace químico, p. ej., un enlace químico covalente o no covalente, p. ej., en un reactivo de detección o una secuencia diana, el ácido nucleico para determinar la identidad del nucleótido en una posición de interrogación. El método permite determinar si está presente una mutación descrita en el presente documento.

En un caso, la secuenciación comprende poner en contacto el ácido nucleico de fusión con un reactivo de detección descrito en el presente documento.

En un caso, la secuenciación comprende determinar una propiedad física, p. ej., la estabilidad de una forma dúplex del ácido nucleico de fusión, p. ej., la Tf, que puede distinguir la secuencia del mutante de la de referencia.

En un caso, el ácido nucleico de fusión se obtiene de una neoplasia o de un tumor de un tipo descrito en el presente documento, p. ej., una neoplasia melanocítica, melanoma o cáncer metastásico. En un caso, el ácido nucleico de fusión se obtiene de una histiocitosis, p. ej., una histiocitosis de células no Langerhans.

Mezclas de reacción y dispositivos

En otro aspecto, la divulgación presenta una mezcla de reacción que comprende:

a) una muestra, o ácido nucleico, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, p. ej., de un cáncer, que contiene:

una posición de interrogación para una mutación, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrita en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico; o

una mutación, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrita en la FIG. 1A o 1B o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico; y

b) un reactivo de detección descrito en el presente documento, p. ej., un reactivo de detección descrito en la sección en el presente documento titulada Reactivos de detección y detección de mutaciones, p. ej., en la sección en el presente documento titulada Reactivos de detección basados en ácido nucleico.

En un caso, la muestra comprende ácido nucleico de un cáncer.

En un caso, la muestra, o ácido nucleico en la muestra, es de un cáncer enumerado en la FIG. 1A, y el reactivo de detección detecta un mutante, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión divulgado en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico.

En un caso, la muestra, o ácido nucleico en la muestra, es de un cáncer enumerado en la FIG. 1A, y el reactivo de detección detecta un mutante, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión divulgado en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, en una fusión de los dos genes en la fusión asociada con ese cáncer en la FIG. 1A.

En un caso, la muestra, o ácido nucleico en la muestra, es de una histiocitosis no Langerhans, y el reactivo de detección es uno que detecta una fusión de los genes LMNA y NTRK1, p. ej., un reactivo de detección que detecta un mutante, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión descrito en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, para una fusión de LMNA y NTRK1.

En otro aspecto, la divulgación presenta preparaciones purificadas o aisladas de un ácido nucleico de fusión, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, descrito en el presente documento o una mutación, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrita en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico. En casos, la preparación es útil para determinar si está presente una mutación divulgada en el presente documento. En casos, la preparación se dispone en un dispositivo, p. ej., un dispositivo de secuenciación, o un portamuestras, para su uso en un dispositivo de este tipo. En un caso, el ácido nucleico de fusión se obtiene de una neoplasia o de un tumor de un tipo descrito en el presente documento, p. ej., un cáncer descrito en la FIG. 1 A. En un caso, el ácido nucleico es de un cáncer enumerado en la FIG. 1A. En un caso, el ácido nucleico es de un cáncer enumerado en la FIG. 1A y el dispositivo también incluye un reactivo de detección y es uno que detecta una fusión de los genes asociados con ese cáncer en la FIG. 1A, p. ej., un reactivo de detección que detecta un mutante, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión descrito en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, para una fusión de los genes que son los compañeros de fusión con la fusión asociada con el cáncer en la FIG. 1A.

En otro aspecto, la divulgación presenta preparaciones purificadas o aisladas de un ácido nucleico de fusión, p. ej., ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, que contiene una posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión, descrito en el presente documento o una mutación, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrita en la FIG. 1A o 1^bo en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico, útil para determinar si una mutación divulgada en el presente documento está presente, dispuestas en un dispositivo para determinar una propiedad física o química, p. ej., la estabilidad de un dúplex, p. ej., la Tf, o en un portamuestras para su uso en un dispositivo de este tipo. En un caso, el dispositivo es un calorímetro. En un caso, el ácido nucleico de fusión se obtiene de una neoplasia o de un tumor de un tipo descrito en el presente documento, p. ej., en la FIG. 1A.

Los reactivos de detección descritos en el presente documento se pueden utilizar para determinar si una mutación descrita en el presente documento está presente en una muestra. En casos, la muestra comprende un ácido nucleico que se obtiene de una célula neoplásica o una tumoral, p. ej., un cáncer descrito en la FIG. XA. La célula puede ser de una muestra neoplásica o una tumoral, p. ej., una biopsia tomada de la neoplasia o del tumor; de células tumorales circulantes, p. ej., de sangre periférica; o de una muestra de sangre o de plasma.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de preparación de una mezcla de reacción combinando:

una mutación, p. ej., un reordenamiento o punto de unión de fusión, descrita en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico; y

Una mutación descrita en el presente documento se puede distinguir de una referencia, p. ej., una secuencia no mutante o de tipo salvaje, por reacción con una enzima que reacciona de forma diferencial con la mutación y la referencia. Por ejemplo, se pueden distinguir por escisión con una enzima de restricción que tenga una actividad diferente para las secuencias mutantes y de referencia. Por ejemplo, la divulgación incluye un método de contacto de un ácido nucleico que comprende una mutación descrita en el presente documento con una enzima de este tipo y de determinación de si está presente un producto de esa escisión que puede distinguir la secuencia mutante de la de referencia.

En un aspecto, la divulgación proporciona una preparación purificada de un producto de escisión de enzima de restricción que puede distinguir entre una secuencia mutante y de referencia, en donde un extremo del producto de escisión se define por una enzima que escinde de forma diferencial entre la secuencia mutante y de referencia. En un caso, el producto de escisión incluye la posición de interrogación, p. ej., uno o ambos nucleótidos que flanquean el punto de unión de fusión.

Reactivos de detección basados en proteínas, métodos, mezclas de reacción y dispositivos

Una proteína mutante descrita en el presente documento se puede distinguir de una referencia, p. ej., una proteína no mutante o de tipo salvaje, por reacción con un reactivo, p. ej., un sustrato, p. ej., un sustrato para la actividad catalítica, p. ej., fosforilación u otra actividad de proteína de fusión, o un anticuerpo que reaccione de forma diferencial con la proteína mutante y de referencia. En un aspecto, la divulgación incluye un método de contacto de una muestra que comprende una proteína mutante descrita en el presente documento con dicho reactivo y de determinación de si la proteína mutante está presente en la muestra.

En consecuencia, en otro aspecto, la divulgación presenta una mezcla de reacción que comprende:

a) una muestra, p. ej., una muestra cancerosa, que comprende una proteína de fusión que tiene los compañeros de fusión descritos en la FIG. 1A, 1B o 1C, p. ej., una proteína de fusión codificada por una mutación descrita en la FIG. 1A, 1B o 1C o en la sección en el presente documento titulada Moléculas de ácido nucleico; y

b) un reactivo de detección, p. ej., un sustrato, p. ej., un sustrato para la actividad catalítica, p. ej., fosforilación u otra actividad de proteína de fusión, o un anticuerpo, que reaccione de forma diferencial con la proteína mutante y de referencia.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de preparación de una mezcla de reacción que comprende combinar:

Kits

En otro aspecto, la divulgación presenta un kit que comprende un reactivo de detección como se describe en el presente documento.

Métodos que reducen la actividad de una molécula de fusión

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de reducción de una actividad de una molécula de fusión descrita en el presente documento. El método incluye poner en contacto la molécula de fusión, o una célula que expresa la molécula de fusión, con un agente que inhibe una actividad o expresión de la molécula de fusión (p. ej., un inhibidor, p. ej., un inhibidor de cinasa). En un caso, la etapa de poner en contacto se puede efectuar in vitro, p. ej., en un producto lisado celular o en un sistema reconstituido. De forma alternativa, el método se puede realizar en células en cultivo, p. ej., in vitro o ex vivo. En otro caso, el método se puede realizar en células que expresan la molécula de fusión presentes en un sujeto, p. ej., como parte de un protocolo in vivo (p. ej., terapéutico o profiláctico). En un caso, el método se pone en práctica en un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo). En ciertos casos, la molécula de fusión es una molécula de ácido nucleico o un polipéptido como se describe en el presente documento.

En un aspecto relacionado, se proporciona un método de inhibición, reducción o tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, p. ej., una neoplasia (incluyendo benigna, premaligna o maligna (p. ej., un cáncer), en un sujeto. El método incluye administrar al sujeto un agente terapéutico preseleccionado, p. ej., un agente anticanceroso (p. ej., un inhibidor de cinasa), como agente único, o combinado, en una cantidad suficiente para reducir, inhibir o tratar la actividad o expresión de una molécula de fusión descrita en el presente documento), inhibiendo, reduciendo o tratando, de este modo, el trastorno hiperproliferativo en el sujeto. "Tratamiento" como se emplea en el presente documento incluye, pero no se limita a, la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de la masa tumoral, la reducción del tamaño o número de lesiones metastásicas, la inhibición del desarrollo de nuevas lesiones metastásicas, la prolongación de la supervivencia, la prolongación de la supervivencia sin progresión, el tiempo transcurrido hasta la progresión y/o la mejora de la calidad de vida.

En un caso, el inhibidor de cinasa se administra basándose en la determinación de que una molécula de fusión descrita en el presente documento está presente en un sujeto, p. ej., basándose en su presencia en la muestra de un sujeto. Por tanto, el tratamiento se puede combinar con un método de detección o evaluación de moléculas de fusión, p. ej., como se describe en el presente documento, o administrar en respuesta a una determinación realizada por un método de detección o evaluación de moléculas de fusión, p. ej., como se describe en el presente documento. En ciertos casos, el inhibidor de cinasa se administra en respuesta a la adquisición de conocimiento o información de la presencia de la molécula de fusión en un sujeto. En un caso, el inhibidor de cinasa se administra en respuesta a la adquisición de conocimiento o información sobre el genotipo del sujeto, p. ej., adquiriendo conocimiento o información de que el genotipo del paciente tiene una molécula de fusión. En otros casos, el inhibidor de cinasa se administra en respuesta a la recepción de una comunicación (p. ej., un informe) de la presencia de la molécula de fusión en un sujeto (p. ej., la muestra de un sujeto). En otros casos más, el inhibidor de cinasa se administra en respuesta a la información obtenida de una colaboración con otra parte que identifica la presencia de la molécula de fusión en un sujeto (p. ej., la muestra de un sujeto). En otros casos, el inhibidor de cinasa se administra en respuesta a la determinación de que la molécula de fusión está presente en un sujeto. En un caso, la determinación de la presencia de la molécula de fusión se lleva a cabo usando uno o más de los métodos, p. ej., los métodos de secuenciación, descritos en el presente documento. En otros casos, la determinación de la presencia de la molécula de fusión incluye recibir información sobre el genotipo de la molécula de fusión del sujeto, p. ej., de otra parte, o fuente.

Los métodos, opcionalmente, pueden incluir adicionalmente la etapa o etapas de identificación (p. ej., evaluación, diagnóstico, escrutinio y/o selección) de un sujeto en riesgo de tener, o que tiene, una molécula de fusión descrita en el presente documento. En un caso, el método incluye adicionalmente uno o más de: adquirir conocimiento o información de la presencia de la molécula de fusión en un sujeto (p. ej., la muestra de un sujeto); adquirir conocimiento o información sobre el genotipo del sujeto, p. ej., adquirir conocimiento o información de que el genotipo del paciente tiene una molécula de fusión; recibir una comunicación (p. ej., un informe) de la presencia de la molécula de fusión en un sujeto (p. ej., la muestra de un sujeto); o colaborar con otra parte que identifique la presencia de la molécula de fusión en un sujeto.

En un caso, el sujeto tratado tiene una molécula de fusión descrita en el presente documento; p. ej., el sujeto tiene un tumor o cáncer que alberga una molécula de fusión descrita en el presente documento. En otros casos, se ha identificado previamente que el sujeto tiene una molécula de fusión descrita en el presente documento. En otros casos más, se ha identificado previamente que es probable o improbable que el sujeto responda al tratamiento con un inhibidor de proteína cinasa, p. ej., un sujeto que ha participado previamente en un ensayo clínico. En otros casos, se ha identificado previamente que es probable o improbable que el sujeto responda al tratamiento con un inhibidor de proteína cinasa, basándose en la presencia de la molécula de fusión descrita en el presente documento. En un caso, el sujeto es un mamífero, p. ej., un ser humano. En un caso, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, un cáncer en cualquier estadio de la enfermedad. En otros casos, el sujeto es un paciente, p. ej., un paciente con cáncer.

En otros casos, el sujeto tratado es un paciente con cáncer que ha participado en un ensayo clínico. Por ejemplo, el sujeto participó en un ensayo clínico que evaluó un inhibidor de cinasa (p. ej., un inhibidor de múltiples cinasas, un inhibidor de cinasa específica). En otros casos, el sujeto participó en un ensayo clínico que evalúa las dianas aguas abajo o aguas arriba de la cinasa específica. En un caso, dicho paciente de cáncer respondió al inhibidor de cinasa evaluado.

En ciertos casos, la neoplasia o célula neoplásica es benigna, premaligna, maligna (cáncer) o metástasis. En ciertos casos, el cáncer es un tumor sólido, un tumor de partes blandas o una lesión metastásica. En un caso, el cáncer se elige entre adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de cuello uterino, adenocarcinoma de endometrio uterino, glioblastoma, melanoma, sarcoma fusocelular, fibrosarcoma ameloblástico, adenocarcinoma, colangiocarcinoma, carcinoma urotelial (de células de transición), carcinoma epitelial de ovario, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de próstata o adenocarcinoma ductal de páncreas. En un caso, el cáncer se elige entre un cáncer de pulmón, un cáncer de páncreas, melanoma, un cáncer colorrectal, un cáncer esofagogástrico, un cáncer de tiroides o un adenocarcinoma. En otros casos, el cáncer de pulmón se elige entre uno o más de los siguientes: carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de pulmón microcítico (CPM), carcinoma de células escamosas (CCE), adenocarcinoma de pulmón, carcinoma broncogénico o una combinación de los mismos. En un caso, el cáncer de pulmón es CPNM o CCE.

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de cinasa. Por ejemplo, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de múltiples cinasas o un inhibidor específico.

En otros casos, el agente anticanceroso es un antagonista de una molécula de fusión descrita en el presente documento que inhibe la expresión del ácido nucleico que codifica la molécula de fusión. Los ejemplos de tales antagonistas de moléculas de fusión incluyen moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas antisentido, ribozimas, ARNi, moléculas con triple hélice que hibridan con un ácido nucleico que codifica una molécula de fusión descrita en el presente documento, o una región reguladora de la transcripción, y bloquea o reduce la expresión de ARNm de la molécula de fusión.

En otros casos, el inhibidor, p. ej., inhibidor de cinasa, se administra combinado con un segundo agente terapéutico o una modalidad terapéutica diferente, p. ej., agentes anticancerosos, y/o combinado con procedimientos quirúrgicos y/o de radiación. Por ejemplo, el segundo agente terapéutico puede ser un agente citotóxico o uno citostático. Los agentes citotóxicos ilustrativos incluyen agentes antimicrotúbulos, inhibidores de topoisomerasa, o taxanos, antimetabolitos, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, agentes intercalantes, agentes que pueden interferir en una vía de transducción de señales, agentes que promueven la apoptosis y radiación. En otros casos más, los métodos se pueden utilizar combinados con agentes inmunomoduladores, p. ej., IL-1, 2, 4, 6 o 12, o interferón alfa o gamma, o factores de crecimiento de células inmunitarias, tales como GM-CSF.

Métodos de escrutinio

En otro aspecto, la divulgación presenta un método, o ensayo, para escrutar agentes que modulan, p. ej., inhiben, la expresión o actividad de una molécula de fusión descrita en el presente documento. El método incluye poner en contacto una molécula de fusión descrita en el presente documento, o una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento, con un agente candidato; y detectar un cambio en un parámetro asociado con una molécula de fusión descrita en el presente documento, p. ej., un cambio en la expresión o una actividad de la molécula de fusión. El método, opcionalmente, puede incluir comparar el parámetro tratado con un valor de referencia, p. ej., una muestra de control (p. ej., comparando un parámetro obtenido de una muestra con el agente candidato con un parámetro obtenido de una muestra sin el agente candidato). En un caso, si se detecta una disminución de la expresión o actividad de la molécula de fusión, el agente candidato se identifica como un inhibidor. En otro caso, si se detecta un incremento de la expresión o actividad de la molécula de fusión, el agente candidato se identifica como un activador. En ciertos casos, la molécula de fusión es una molécula de ácido nucleico o un polipéptido como se describe en el presente documento.

En un caso, la etapa de contacto se efectúa en un sistema libre de células, p. ej., un producto lisado celular o en un sistema reconstituido. En otros casos, la etapa de contacto se efectúa en una célula en cultivo, p. ej., una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En otros casos más, la etapa de contacto se efectúa en una célula in vivo (una célula que expresa la molécula de fusión presente en un sujeto, p. ej., un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo).

Los parámetros ilustrativos evaluados incluyen uno o más de:

(i) un cambio en la actividad de unión, p. ej., unión directa del agente candidato a un polipéptido de fusión descrito en el presente documento; una competencia de unión entre un ligando conocido y el agente candidato a un polipéptido de fusión descrito en el presente documento;

(ii) un cambio en la actividad cinasa, p. ej., niveles de fosforilación de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento (p. ej., un aumento o disminución de la autofosforilación); o un cambio en la fosforilación de una diana de una cinasa. En ciertos casos, se detecta un cambio en la actividad cinasa, p. ej., fosforilación, por cualquiera de transferencia Western (p. ej., usando un anticuerpo específico para cualquiera de los genes asociados con una molécula de fusión descrita en el presente documento; un anticuerpo fosforoespecífico, que detecta una variación en el peso molecular de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento), espectrometría de masas, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, cuentas inmunomagnéticas, entre otros;

(iii) un cambio en una actividad de una célula que contiene una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula tumoral o una célula recombinante), p. ej., un cambio en la proliferación, morfología o tumorogenia de la célula;

(iv) un cambio en el tumor presente en un sujeto animal, p. ej., tamaño, apariencia, proliferación del tumor; o

(v) un cambio en el nivel, p. ej., nivel de expresión, de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de fusión descritos en el presente documento.

En un caso, se evalúa un cambio en un ensayo libre de células en presencia de un agente candidato. Por ejemplo, se puede detectar una actividad de una molécula de fusión descrita en el presente documento, o la interacción de una molécula de fusión descrita en el presente documento con un ligando aguas abajo. En un caso, un polipéptido de fusión descrito en el presente documento se pone en contacto con un ligando, p. ej., en solución, y se supervisa un agente candidato para determinar una capacidad de modular, p. ej., inhibir, una interacción, p. ej., unión, entre el polipéptido de fusión y el ligando.

En otro caso, se detecta un cambio en una actividad de una célula en una célula en cultivo, p. ej., una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En un caso, la célula es una célula recombinante que se modifica para expresar un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento, p. ej., es una célula recombinante transfectada con un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento. La célula transfectada puede mostrar un cambio en respuesta a la molécula de fusión expresada, p. ej., aumento de proliferación, cambios en la morfología, aumento de tumorogenia y/o adquisición de un fenotipo transformado. Se puede detectar un cambio en cualquiera de las actividades de la célula, p. ej., la célula recombinante, en presencia del agente candidato. Por ejemplo, una disminución de una o más de: proliferación, tumorogenia, morfología transformada, en presencia del agente candidato puede ser indicativa de un inhibidor de una molécula de fusión descrita en el presente documento. En otros casos, se detecta un cambio en la actividad de unión o fosforilación como se describe en el presente documento.

En otro caso más, se detecta un cambio en un tumor presente en un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo). En un caso, el modelo animal es un animal que contiene un tumor o un xenoinjerto que comprende células que expresan una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., células tumorogénicas que expresan una molécula de fusión descrita en el presente documento). El agente candidato se puede administrar al sujeto animal y se detecta un cambio en el tumor. En un caso, se evalúa el cambio en el tumor que incluye uno o más de un crecimiento tumoral, tamaño tumoral, carga tumoral, supervivencia. Una disminución de uno o más de crecimiento tumoral, tamaño tumoral, carga tumoral o un aumento de supervivencia son indicativos de que el agente candidato es un inhibidor.

En otros casos, un cambio en la expresión de una molécula de fusión descrita en el presente documento se puede supervisar detectando los niveles de ácido nucleico o proteína, p. ej., usando los métodos descritos en el presente documento.

En ciertos casos, los métodos de escrutinio descritos en el presente documento se pueden repetir y/o combinar. En un caso, un agente candidato que se evalúa en un sistema libre de células o basado en células descrito en el presente documento se puede someter a prueba adicionalmente en un sujeto animal.

En un caso, el agente candidato es un compuesto de molécula pequeña, p. ej., un inhibidor de cinasa, un ácido nucleico (p. ej., antisentido, ARNip, aptámero, ribozimas, microARN), una molécula de anticuerpo (p. ej., un anticuerpo completo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un gen de una molécula de fusión descrita en el presente documento). El agente candidato se puede obtener de una biblioteca (p. ej., una biblioteca comercial de inhibidores de cinasa) o se puede diseñar racionalmente (p. ej., basándose en el dominio cinasa de una fusión descrita en el presente documento).

Métodos para detectar fusiones

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de determinación de la presencia de una fusión como se describe en el presente documento. En un caso, la fusión se detecta en una molécula de ácido nucleico o en un polipéptido. El método incluye detectar si una molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión está presente en una célula (p. ej., una célula circulante), un tejido (p. ej., un tumor) o una muestra, p. ej., una muestra tumoral, de un sujeto. En un caso, la muestra es una muestra de ácido nucleico. En un caso, la muestra de ácido nucleico comprende ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc, o ARN, p. ej., ARNm. En otros casos, la muestra es una muestra de proteína.

En un caso, la muestra se clasifica o se ha clasificado como no maligna usando otras técnicas de diagnóstico, p. ej., inmunohistoquímica.

En un caso, la muestra se adquiere de un sujeto (p. ej., un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un cáncer, p. ej., un paciente), o, de forma alternativa, el método incluye adicionalmente adquirir una muestra del sujeto. La muestra se puede elegir entre uno o más de: tejido, p. ej., tejido canceroso (p. ej., una biopsia tisular), sangre completa, suero, plasma, raspado bucal, esputo, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces, células tumorales circulantes, ácidos nucleicos circulantes o médula ósea. En ciertos casos, la muestra es un tejido (p. ej., una biopsia del tumor), una célula tumoral o ácido nucleico circulante.

En un caso, el cáncer se elige entre adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de cuello uterino, adenocarcinoma de endometrio uterino, glioblastoma, melanoma, sarcoma fusocelular, fibroscarcoma ameloblástico, adenocarcinoma, colangiocarcinoma, carcinoma urotelial (de células de transición), carcinoma epitelial de ovario, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de próstata o adenocarcinoma ductal de páncreas. En casos, el tumor es de un cáncer descrito en el presente documento, p. ej., se elige entre un cáncer de pulmón, un cáncer colorrectal, un cáncer esofagogástrico, un cáncer de tiroides, un adenocarcinoma o un melanoma. En un caso, el tumor es de un cáncer de pulmón, p. ej., un CPNM, un CPM, un CCE o una combinación de los mismos.

En un caso, el sujeto está en riesgo de tener, o tiene un cáncer (p. ej., un paciente con un cáncer descrito en el presente documento).

En otros casos, la molécula de fusión se detecta en una molécula de ácido nucleico por un método elegido entre uno o más de: ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos basados en amplificación (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), ensayo de PCR-RFLP, PCR en tiempo real, secuenciación, análisis de escrutinio (incluyendo análisis citogenético en metafase por métodos de cariotipo convencionales, FISH (p. ej., FISH de separación), cariotipificación espectral o MFISH, hibridación genómica comparativa), hibridación in situ, SSP, HPLC o genotipificación por espectrometría de masas.

En un caso, el método incluye: poner en contacto una muestra de ácido nucleico, p. ej., una muestra de ADN genómico (p. ej., una muestra cromosómica o una muestra fraccionada, enriquecida o de otro modo pretratada) o un producto génico (ARNm, ADNc), obtenido del sujeto, con un fragmento de ácido nucleico (p. ej., una sonda o cebador como se describe en el presente documento (p. ej., una sonda o cebador específico de exón) en condiciones adecuadas para la hibridación, y determinar la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico de fusión. El método, opcionalmente, puede incluir enriquecer una muestra en cuanto al gen o producto génico.

En un aspecto relacionado, se proporciona un método para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico de fusión descrita en el presente documento. El método incluye: adquirir una secuencia para una posición en una molécula de ácido nucleico, p. ej., secuenciando al menos un nucleótido de la molécula de ácido nucleico (p. ej., secuenciando al menos un nucleótido en la molécula de ácido nucleico que comprende la fusión), determinando, de este modo, que la molécula de fusión está presente en la molécula de ácido nucleico. Opcionalmente, la secuencia adquirida se compara con una secuencia de referencia o una secuencia de referencia de tipo salvaje. En un caso, la molécula de ácido nucleico es de una célula (p. ej., una célula circulante), un tejido (p. ej., un tumor) o cualquier muestra de un sujeto (p. ej., muestra de sangre o de plasma). En otros casos, se secuencia la molécula de ácido nucleico de una muestra tumoral (p. ej., una muestra tumoral o cancerosa). En un caso, la secuencia se determina por un método de secuenciación de nueva generación. El método además puede incluir adicionalmente adquirir, p. ej., adquirir directa o indirectamente, una muestra, p. ej., una muestra tumoral o cancerosa, de un sujeto (p. ej., un paciente). En ciertos casos, el cáncer se elige entre un cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer esofagogástrico o melanoma.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de análisis de un tumor o de una célula tumoral circulante. El método incluye adquirir una muestra de ácido nucleico del tumor o de la célula circulante; y secuenciar, p. ej., por un método de secuenciación de nueva generación, una molécula de ácido nucleico, p. ej., una molécula de ácido nucleico que incluya una molécula de fusión como se describe en el presente documento.

En otro caso más, se detecta un polipéptido de fusión. El método incluye: poner en contacto una muestra de proteína con un reactivo que se une específicamente a un polipéptido de fusión descrito en el presente documento; y detectar la formación de un complejo del polipéptido de fusión y el reactivo. En un caso, el reactivo se marca con un grupo detectable para facilitar la detección del reactivo unido y no unido. En un caso, el reactivo es una molécula de anticuerpo, p. ej., se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, y un derivado de anticuerpo, y un fragmento de anticuerpo.

En otro caso más, se evalúa el nivel (p. ej., nivel de expresión) o actividad de la molécula de fusión. Por ejemplo, el nivel (p. ej., nivel de expresión) o actividad de la molécula de fusión (p. ej., ARNm o polipéptido) se detecta y (opcionalmente) se compara con un valor predeterminado, p. ej., un valor de referencia (p. ej., una muestra de control).

En otro caso más, la molécula de fusión se detecta antes del inicio, durante o después de un tratamiento, p. ej., un tratamiento con un inhibidor de cinasa, en un sujeto que tiene una fusión descrita en el presente documento.

En un caso, la molécula de fusión se detecta en el momento del diagnóstico de un cáncer. En otros casos, la molécula de fusión se detecta en un intervalo predeterminado, p. ej., un primer punto de tiempo y al menos en un punto de tiempo posterior.

En ciertos casos, en respuesta a una determinación de la presencia de la molécula de fusión, el método incluye adicionalmente uno o más de:

(1) estratificar una población de pacientes (p. ej., asignar un sujeto, p. ej., un paciente, a un grupo o clase);

(2) identificar o seleccionar al sujeto como probable o improbable que responda a un tratamiento, p. ej., un tratamiento con inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento;

(3) seleccionar una opción de tratamiento, p. ej., administrar o no administrar un agente terapéutico preseleccionado, p. ej., un inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento; o

(4) pronosticar la evolución temporal de la enfermedad en el sujeto (p. ej., evaluar la probabilidad de aumento o disminución de supervivencia del paciente).

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de múltiples cinasas o un inhibidor específico.

En ciertos casos, en respuesta a la determinación de la presencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento, el sujeto se clasifica como candidato para recibir tratamiento con un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento. En un caso, en respuesta a la determinación de la presencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento, el sujeto, p. ej., un paciente, se puede asignar adicionalmente a una clase particular si se identifica una fusión en una muestra del paciente. Por ejemplo, un paciente identificado por tener una molécula de fusión descrita en el presente documento se puede clasificar como candidato para recibir tratamiento con un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa específico como se describe en el presente documento. En un caso, el sujeto, p. ej., un paciente, se asigna a una segunda clase si la mutación no está presente. Por ejemplo, se puede determinar que un paciente que tiene un tumor en el pulmón que no contiene ninguna molécula de fusión descrita en el presente documento no es candidato para recibir un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa específico como se describe en el presente documento.

En otro caso, en respuesta a la determinación de la presencia de la molécula de fusión, se identifica al sujeto como probable que responda a un tratamiento que comprende un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento.

En otro caso más, en respuesta a la determinación de la presencia de la molécula de fusión, el método incluye administrar al sujeto un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento.

Método de evaluación de un tumor o de un sujeto

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de evaluación de un sujeto (p. ej., un paciente), p. ej., en cuanto al riesgo de tener o desarrollar un cáncer, p. ej., un cáncer de pulmón, cáncer colorrectal o cáncer de piel. El método incluye: adquirir información o conocimiento de la presencia de una fusión como se describe en el presente documento en un sujeto (p. ej., adquirir información del genotipo del sujeto que identifique que una fusión está presente en el sujeto); adquirir una secuencia para una molécula de ácido nucleico identificada en el presente documento (p. ej., una molécula de ácido nucleico que incluya una secuencia de molécula de fusión descrita en el presente documento); o detectar la presencia de un ácido nucleico o polipéptido de fusión en el sujeto), en donde la presencia de la fusión se correlaciona positivamente con un aumento del riesgo de un cáncer, o tener un cáncer asociado con tal fusión.

El método puede incluir adicionalmente adquirir, p. ej., directa o indirectamente, una muestra de un paciente y evaluar la muestra para determinar la presencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento.

El método puede incluir adicionalmente la etapa o etapas de identificación (p. ej., evaluación, diagnóstico, escrutinio y/o selección) de que el sujeto se correlaciona positivamente con un aumento del riesgo de un cáncer, o tener un cáncer asociado con la molécula de fusión.

En otro caso, un sujeto identificado por tener una molécula de fusión descrita en el presente documento se identifica o selecciona porque es probable o improbable que responda a un tratamiento, p. ej., un tratamiento con inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento. El método puede incluir adicionalmente tratar al sujeto con un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento.

En ciertos casos, el sujeto es un paciente o población de pacientes que ha participado en un ensayo clínico. En un caso, el sujeto ha participado en un ensayo clínico para evaluar un inhibidor de cinasa (p. ej., un inhibidor de múltiples cinasas o un inhibidor de cinasa específico). En un caso, el ensayo clínico se interrumpe o termina. En un caso, el sujeto respondió favorablemente al ensayo clínico, p. ej., experimentó una mejoría en al menos un síntoma de un cáncer (p. ej., disminución del tamaño tumoral, tasa de crecimiento tumoral, aumento de supervivencia). En otros casos, el sujeto no respondió de modo detectable al ensayo clínico.

En un aspecto relacionado, se proporciona un método de evaluación de un paciente o de una población de pacientes. El método incluye: identificar, seleccionar u obtener información o conocimiento de que el paciente o población de pacientes han participado en un ensayo clínico; adquirir información o conocimiento de la presencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento en el paciente o población de pacientes (p. ej., adquirir información del genotipo del sujeto que identifique que está presente en el sujeto una molécula de fusión descrita en el presente documento); adquirir una secuencia para una molécula de ácido nucleico identificada en el presente documento (p. ej., una molécula de ácido nucleico que incluya una secuencia de fusión); o detectar la presencia de un ácido nucleico o polipéptido de fusión descritos en el presente documento, en el sujeto), en donde la presencia de la fusión identifica que el paciente o población de pacientes tienen un aumento del riesgo de un cáncer, o tener, un cáncer asociado con la molécula de fusión.

En algunos casos, el método incluye adicionalmente tratar al sujeto con un inhibidor de cinasa, p. ej., un inhibidor de cinasa como se describe en el presente documento.

Presentación de informes

Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir proporcionar un informe, tal como, en formato electrónico, basado en la web o impreso, al paciente o a otra persona o entidad, p. ej., un cuidador, p. ej., un médico, p. ej., un oncólogo, un hospital, clínica, tercera parte pagadora, compañía de seguros u oficina gubernamental. El informe puede incluir resultados del método, p. ej., la identificación de valores de nucleótidos, la indicación de presencia o ausencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento, o secuencia de tipo salvaje. En un caso, se genera un informe, tal como en formato impreso o electrónico, que identifica la presencia o ausencia de una alteración descrita en el presente documento y opcionalmente incluye un identificador para el paciente del que se obtuvo la secuencia.

El informe también puede incluir información sobre el papel de una molécula de fusión descrita en el presente documento, o de una secuencia de tipo salvaje, en la enfermedad. Tal información puede incluir información sobre el pronóstico, resistencia u opciones terapéuticas potenciales o sugeridas. El informe puede incluir información sobre la probable eficacia de una opción terapéutica, la aceptabilidad de una opción terapéutica o la conveniencia de aplicar la opción terapéutica a un paciente, p. ej., un paciente que tiene una secuencia, alteración o mutación identificada en la prueba, y en casos, identificada en el informe. Por ejemplo, el informe puede incluir información o una recomendación sobre la administración de un fármaco, p. ej., la administración a una dosificación preseleccionada o en una pauta de tratamiento preseleccionada, p. ej., combinado con otros fármacos, al paciente. En un caso, no todas las mutaciones identificadas en el método se identifican en el informe. Por ejemplo, el informe se puede limitar a mutaciones en genes que tienen un nivel preseleccionado de correlación con la aparición, el pronóstico, el estadio o la susceptibilidad del cáncer al tratamiento, p. ej., con una opción terapéutica preseleccionada. El informe se puede entregar, p. ej., a una entidad descrita en el presente documento, en el plazo de 7, 14 o 21 días desde la recepción de la muestra por la entidad que pone en práctica el método.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método para generar un informe, p. ej., un informe de tratamiento del cáncer personalizado, obteniendo una muestra, p. ej., una muestra tumoral, de un sujeto, detectando una molécula de fusión descrita en el presente documento en la muestra y seleccionando un tratamiento basado en la mutación identificada. En un caso, se genera un informe que anota el tratamiento seleccionado, o que enumera, p. ej., en orden de preferencia, dos o más opciones de tratamiento basadas en la mutación identificada. En otro caso, al sujeto, p. ej., un paciente, se le administra adicionalmente el método de tratamiento seleccionado.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Además, los materiales, métodos y el ejemplo solo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Los detalles de uno o más casos de la divulgación se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otros rasgos característicos, objetos y ventajas presentados en la invención serán evidentes a partir de la descripción y de los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las FIG. 1A-1C son tablas que resumen las moléculas de fusión y los eventos de reordenamiento descritos en el presente documento.

La FIG. 1A resume lo siguiente: el nombre de la fusión (denominada "fusión"); la fuente tisular (denominada "enfermedad"); las localizaciones aproximadas de los primer y segundo puntos de ruptura que dan origen a los eventos de reordenamiento (± 50 nucleótidos) (denominados "punto de ruptura 1" y "punto de ruptura 2", respectivamente); y el tipo de reordenamiento (denominado "reordenamiento").

La FIG. 1B resume lo siguiente: el nombre de la fusión (denominada "fusión"); el número de acceso de las secuencias de longitud completa que contienen las secuencias del exón en 5' y en 3' (denominadas "ID de transcrito en 5'" e "ID de transcrito en 3'", respectivamente); y la identidad del último exón del transcrito en 5' y del primer exón del transcrito en 3'. Las secuencias correspondientes a los números de acceso proporcionados en la FIG. 1B se exponen en las figuras adjuntas en el presente documento. De forma alternativa, las secuencias se pueden encontrar buscando en RefSeq Gene como base de datos en el buscador genómico de la UCSC (genome.ucsc.edu). Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente enlace: http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgc?hgsid=309144129&c=chr4&o=1795038&t=1810599&g=refGene&i=NM 000142 para buscar el número de acceso = NM_000142.

La FIG. 1C resume lo siguiente: el nombre de la fusión; los SEQ ID NO de las secuencias de nucleótidos (Nt) y de aminoácidos (Aa) de la fusión (si se muestra), el compañero en 5' y el compañero en 3'; y la figura en la que se muestra la secuencia.

Las FIG. 2A-2B representan la secuencia de nucleótidos del ADNc de LMNA (NM_170707, SEQ ID NO: 19). Los límites del exón se muestran en negrita y subrayados. El inicio del primer exón se muestra con un único subrayado. Otros exones (segundo, tercero, cuarto) se indican consecutivamente desde la orientación 5' a 3' por el subrayado de dos nucleótidos consecutivos. El codón de inicio se muestra en negrita y cursiva. El codón de parada se muestra en cursiva y subrayado.

La FIG. 3 representa la secuencia de aminoácidos de LMNA (SEQ ID NO: 20).

Las FIG. 4A-4B representan la secuencia de nucleótidos del ADNc de NTRK1 (NM_002529, SEQ ID NO: 21). Los límites del exón se muestran en negrita y subrayados. El inicio del primer exón se muestra con un único subrayado. Otros exones (segundo, tercero, cuarto) se indican consecutivamente desde la orientación 5' a 3' por el subrayado de dos nucleótidos consecutivos. El codón de inicio se muestra en negrita y cursiva. El codón de parada se muestra en cursiva y subrayado.

La FIG. 5 representa la secuencia de aminoácidos de NTRK1 (SEQ ID NO: 22).

Descripción detallada

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de novedosos eventos de fusión y en su asociación con el cáncer.

En primer lugar, se definen ciertos términos. Se definen términos adicionales a lo largo de la memoria descriptiva.

Como se emplea en el presente documento, los artículos "un", "uno" y "una" se refieren a uno o a más de uno (p. ej., a al menos uno) del objeto gramatical del artículo.

El término "o" se usa en el presente documento para significar, y se usa indistintamente con, el término "y/o", a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

"Aproximadamente" y "alrededor de" significarán, en general, un grado de error aceptable para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados ilustrativos de error están dentro de 20 por ciento (%), típicamente, dentro de 10%, y más típicamente, dentro de 5% de un valor o rango de valores dados.

"Adquirir" o "adquisición", como se emplean los términos en el presente documento, se refieren a obtener la posesión de una entidad física, o de un valor, p. ej., un valor numérico, al "adquirir directamente" o "adquirir indirectamente" la entidad física o valor. "Adquirir directamente" significa realizar un procedimiento (p. ej., realizar un método sintético o analítico) para obtener la entidad física o valor. "Adquirir indirectamente" se refiere a recibir la entidad física o el valor de otra parte o fuente (p. ej., un laboratorio externo que adquirió directamente la entidad física o valor). Adquirir directamente una entidad física incluye realizar un procedimiento que incluya un cambio físico en una sustancia física, p. ej., un material de partida. Los cambios ilustrativos incluyen preparar una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, separar o purificar una sustancia, combinar dos o más entidades separadas en una mezcla, realizar una reacción química que incluya romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente un valor incluye realizar un procedimiento que incluya un cambio físico en una muestra u otra sustancia, p. ej., realizar un procedimiento analítico que incluya un cambio físico en una sustancia, p. ej., una muestra, analito o reactivo (a veces denominado en el presente documento "análisis físico"), realizar un método analítico, p. ej., un método que incluya uno o más de los siguientes: separar o purificar una sustancia, p. ej., un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, o fragmento u otro derivado del mismo con otra sustancia, p. ej., un tampón, disolvente o reactivo; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, p. ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente entre un primer y un segundo átomo del analito; o cambiando la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado del mismo, p. ej., rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente entre un primer y un segundo átomo del reactivo.

"Adquirir una secuencia", como se emplea el término en el presente documento, se refiere a obtener la posesión de una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos, al "adquirir directamente" o "adquirir indirectamente" la secuencia. "Adquirir directamente una secuencia" significa realizar un procedimiento (p. ej., realizar un método sintético o analítico) para obtener la secuencia, tal como realizar un método de secuenciación (p. ej., un método de Secuenciación de Nueva Generación (NGS)). "Adquirir indirectamente una secuencia" se refiere a recibir información o conocimiento de, o recibir, la secuencia de otra parte o fuente (p. ej., un laboratorio externo que adquirió directamente la secuencia). No es necesario que la secuencia adquirida sea una secuencia completa, p. ej., la secuenciación de al menos un nucleótido o la obtención de información o conocimiento que identifiquen una molécula de fusión divulgada en el presente documento por estar presente en un sujeto constituyen la adquisición de una secuencia.

Adquirir directamente una secuencia incluye realizar un procedimiento que incluya un cambio físico en una sustancia física, p. ej., un material de partida, tal como una muestra tisular, p. ej., una biopsia, o una muestra de ácido nucleico aislado (p. ej., ADN o ARN). Los cambios ilustrativos incluyen preparar una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, cortar o fragmentar una sustancia, tal como un fragmento de ADN genómico; separar o purificar una sustancia (p. ej., aislar una muestra de ácido nucleico de un tejido); combinar dos o más entidades separadas en una mezcla, realizar una reacción química que incluya romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente un valor incluye realizar un procedimiento que incluya un cambio físico en una muestra u otra sustancia como se describe anteriormente.

"Adquirir una muestra", como se emplea el término en el presente documento, se refiere a obtener la posesión de una muestra, p. ej., una muestra tisular o muestra de ácido nucleico, al "adquirir directamente" o "adquirir indirectamente" la muestra. "Adquirir directamente una muestra" significa realizar un procedimiento (p. ej., realizar un método físico, tal como una cirugía o extracción) para obtener la muestra. "Adquirir indirectamente una muestra" se refiere a recibir la muestra de otra parte o fuente (p. ej., un laboratorio externo que adquirió directamente la muestra). Adquirir directamente una muestra incluye realizar un procedimiento que incluya un cambio físico en una sustancia física, p. ej., un material de partida, tal como un tejido, p. ej., un tejido en un paciente humano o un tejido que se aisló previamente de un paciente. Los cambios ilustrativos incluyen preparar una entidad física a partir de un material de partida, disecar o raspar un tejido; separar o purificar una sustancia (p. ej., una muestra de tejido o una muestra de ácido nucleico); combinar dos o más entidades separadas en una mezcla; realizar una reacción química que incluya romper o formar un enlace covalente o no covalente. Adquirir directamente una muestra incluye realizar un procedimiento que incluya un cambio físico en una muestra u otra sustancia, p. ej., como se describe anteriormente.

"Entidad de unión" significa cualquier molécula a la que se pueden fijar directa o indirectamente etiquetas moleculares que se pueden unir específicamente a un analito. La entidad de unión puede ser una etiqueta de afinidad en una secuencia de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la entidad de unión permite la separación del ácido nucleico de una mezcla, tal como una molécula de avidina, o un anticuerpo que se une al hapteno o a un fragmento de unión a antígeno del mismo. Las entidades de unión ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, una molécula de biotina, un hapteno, un anticuerpo, un fragmento de unión a anticuerpo, un péptido y una proteína.

"Complementario" se refiere a la complementariedad de secuencias entre regiones de dos hebras de ácido nucleico o entre dos regiones de la misma hebra de ácido nucleico. Es conocido que un resto de adenina de una primera región de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un resto de una segunda región de ácido nucleico que es antiparalela a la primera región si el resto es timina o uracilo. De forma similar, es conocido que un resto de citosina de una primera hebra de ácido nucleico se puede someter a emparejamiento de bases con un resto de una segunda hebra de ácido nucleico que es antiparalela a la primera hebra si el resto es guanina. Una primera región de un ácido nucleico es complementaria a una segunda región del mismo ácido nucleico o uno diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas en una forma antiparalela, al menos un resto nucleotídico de la primera región se puede someter a emparejamiento de bases con un resto de la segunda región. En ciertas realizaciones, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, con lo que, cuando las primera y segunda porciones están dispuestas en una forma antiparalela, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% de los restos nucleotídicos de la primera porción se pueden someter a emparejamiento de bases con restos nucleotídicos en la segunda porción. En otras realizaciones, todos los restos nucleotídicos de la primera porción se pueden someter a emparejamiento de bases con restos nucleotídicos en la segunda porción.

Los términos "cáncer" o "tumor" se utilizan indistintamente en el presente documento. Estos términos se refieren a la presencia de células que poseen características típicas de las células que provocan cáncer, tales como proliferación no controlada, inmortalidad, potencial metastásico, rápido crecimiento y tasa de proliferación, y determinados rasgos morfológicos característicos. Las células cancerosas a menudo están en la forma de un tumor, pero tales células pueden existir solas dentro de un animal, o pueden ser una célula cancerosa no tumorogénica, tal como una célula de leucemia. Estos términos incluyen un tumor sólido, un tumor de partes blandas o una lesión metastásica. Como se emplea en el presente documento, el término "cáncer" incluye cánceres premalignos, así como malignos. En ciertas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, un tumor de partes blandas o una lesión metastásica.

Los términos "neoplasia" o célula "neoplásica" se refieren a un estadio proliferativo anómalo, p. ej., un estadio hiperproliferativo, en una célula o tejido que puede incluir un estadio benigno, premaligno, maligno (cáncer) o metastásico.

El cáncer se "inhibe" si al menos un síntoma del cáncer se alivia, elimina, ralentiza o previene. Como se emplea en el presente documento, el cáncer también se "inhibe" si se reduce, ralentiza, retrasa o previene la recidiva o metástasis del cáncer.

"Agente quimioterapéutico" significa una sustancia química, tal como un agente citotóxico o citostático, que se usa para tratar una afección, en particular, cáncer.

Como se emplea en el presente documento, "terapia contra el cáncer" y "tratamiento contra el cáncer" son términos sinónimos.

Como se emplea en el presente documento, "quimioterapia" y "quimioterapéutico" y "agente quimioterapéutico" son términos sinónimos.

Los términos "homología" o "identidad", empleados indistintamente en el presente documento, se refieren a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótido o entre dos secuencias de polipéptido, siendo la identidad una comparación más estricta. Las frases "porcentaje de identidad u homología" y "% de identidad u homología" se refieren al porcentaje de similitud de secuencia encontrado en una comparación de dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. "Similitud de secuencia" se refiere al porcentaje de similitud en la secuencia de emparejamiento de bases (como se determina por cualquier método adecuado) entre dos o más secuencias de polinucleótidos. Dos o más secuencias pueden tener una similitud de 0-100%, o cualquier valor de número entero entre las mismas. La identidad o similitud se pueden determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear para propósitos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base nucleotídica o aminoácido, las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de polinucleótidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de polinucleótidos. Un grado de identidad de las secuencias de polipéptidos es una función del número de aminoácidos idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias de polipéptidos. Un grado de homología o similitud de las secuencias de polipéptidos es una función del número de aminoácidos en las posiciones compartidas por las secuencias de polipéptidos. El término "sustancialmente idéntica", como se emplea en el presente documento, se refiere a una identidad u homología de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más.

"Probable que" o "aumento de probabilidad", como se emplean en el presente documento, se refieren a un aumento de la posibilidad de que se produzca un asunto, objeto, cosa o persona. Por tanto, en un ejemplo, un sujeto que es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de cinasa, solo o combinado, tiene un aumento de la posibilidad de responder al tratamiento con el inhibidor solo o combinado, con relación a un sujeto o grupo de sujetos de referencia.

"Improbable que" se refiere a una disminución de la posibilidad de que se produzca un acontecimiento, asunto, objeto, cosa o persona con respecto a una referencia. Por tanto, un sujeto que es improbable que responda al tratamiento con un inhibidor de cinasa, solo o combinado, tiene una disminución de la posibilidad de responder al tratamiento con un inhibidor de cinasa, solo o combinado, con relación a un sujeto o grupo de sujetos de referencia.

La "secuenciación" de una molécula de ácido nucleico requiere determinar la identidad de al menos 1 nucleótido en la molécula. En realizaciones, se determina la identidad de menos de la totalidad de los nucleótidos en una molécula. En otras realizaciones, se determina la identidad de la mayoría o la totalidad de los nucleótidos en la molécula.

"Secuenciación de nueva generación o NGS o secuenciación NG", como se emplea en el presente documento, se refiere a cualquier método de secuenciación que determine la secuencia de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico individuales (p. ej., en la secuenciación de molécula única) o bien sustitutos expandidos clonalmente para moléculas de ácido nucleico individuales en una forma altamente paralela (p. ej., se secuencian simultáneamente más de 105 moléculas). En una realización, la abundancia relativa de las especies de ácido nucleico en la biblioteca se puede estimar contando el número relativo de apariciones de sus secuencias afines en los datos generados por el experimento de secuenciación. Son conocidos métodos de secuenciación de nueva generación en la técnica y son descritos, p. ej., por Metzker, M. (2010) en Nature Biotechnology Reviews 11:31-46. La secuenciación de nueva generación puede detectar una variante presente en menos de 5% de los ácidos nucleicos en una muestra.

"Muestra", "muestra tisular", "muestra del paciente" o "muestra celular o tisular del paciente" o "espécimen" se refieren cada uno a una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra tisular puede ser tejido sólido como de un órgano, muestra tisular, biopsia o producto aspirado recién obtenidos, congelados y/o conservados; sangre o cualquier componente de la sangre; líquidos corporales, tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; o células de cualquier momento de la gestación o desarrollo del sujeto. La muestra tisular puede contener compuestos que no estén naturalmente entremezclados con el tejido en la naturaleza, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares. En una realización, la muestra se conserva como una muestra congelada o como una preparación tisular fijada con formaldehído o paraformaldehído e incluida en parafina (FFPE). Por ejemplo, la muestra se puede incluir en una matriz, p. ej., un bloque FFPE o una muestra congelada.

Una "muestra de ácido nucleico tumoral", como se emplea en el presente documento, se refiere a moléculas de ácido nucleico de una muestra tumoral o cancerosa. Típicamente, es ADN, p. ej., ADN genómico o ADNc obtenido de ARN, de una muestra tumoral o cancerosa. En ciertas realizaciones, la muestra de ácido nucleico tumoral se purifica o aísla (p. ej., se retira de su estado natural).

Una "muestra de ácido nucleico" de "control" o de "referencia" como se emplea en el presente documento se refiere a moléculas de ácido nucleico de una muestra de control o de referencia. Típicamente, es ADN, p. ej., ADN genómico, o ADNc obtenido de ARN, que no contiene la alteración o variación en el gen o producto génico, p. ej., que no contiene ninguna molécula de fusión descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, la muestra de ácido nucleico de referencia o de control es una secuencia de tipo salvaje o una no mutada. En ciertas realizaciones, la muestra de ácido nucleico de referencia se purifica o aísla (p. ej., se retira de su estado natural). En otras realizaciones, la muestra de ácido nucleico de referencia es de una muestra no tumoral, p. ej., un control de sangre, un tumor adyacente normal (NAT) o cualquier otra muestra no cancerosa del mismo sujeto o uno diferente.

"Adyacente a la posición de interrogación", como se emplea en el presente documento, significa un sitio lo suficientemente próximo de modo que se pueda utilizar un reactivo de detección complementario al sitio para distinguir entre una mutación, p. ej., una mutación descrita en el presente documento, y una secuencia de referencia, p. ej., una secuencia no mutante o de tipo salvaje, en un ácido nucleico diana. Directamente adyacente, como se emplea en el presente documento, representa el caso en el que 2 nucleótidos no tienen nucleótidos intermedios entre ellos.

"Mutación asociada", como se emplea en el presente documento, se refiere a una mutación dentro de una distancia preseleccionada, en términos de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos primarios, desde una mutación definitoria, p. ej., un mutante como se describe en el presente documento, p. ej., una translocación, punto de ruptura o molécula de fusión descritos en el presente documento. En realizaciones, la mutación asociada está dentro de n, en donde n está a 2, 5, 10, 20, 30, 50, 100 o 200 nucleótidos desde la mutación definitoria (n no incluye los nucleótidos que definen las mutaciones asociadas y definitorias). En realizaciones, la mutación asociada es una mutación por translocación.

"Posición de interrogación", como se emplea en el presente documento, comprende al menos un nucleótido (o, en el caso de polipéptidos, un resto de aminoácido) que corresponde a un nucleótido (o resto de aminoácido) que está mutado en una mutación, que incluye, p. ej., en el caso de un reordenamiento, uno o ambos de los nucleótidos (o restos de aminoácido) que flanquean el punto de ruptura, u otro resto que se puede utilizar para distinguir la mutación de interés, p. ej., una mutación que se está identificando, o en un ácido nucleico (o proteína) que se está analizando, p. ej., secuenciando, o recuperando. A modo de ejemplo, la posición de interrogación en el punto de ruptura mostrado en la FIG. 1A, 1B o 1C incluye una, dos o más posiciones de nucleótido en el sitio de punto de unión.

Una "secuencia de referencia", como se emplea en el presente documento, p. ej., como un comparador para una secuencia mutante, es una secuencia que tiene un nucleótido o aminoácido diferente en una posición de interrogación que el mutantes o los mutantes que se están analizando. En una realización, la secuencia de referencia es de tipo salvaje para al menos la posición de interrogación.

Los encabezados, p. ej., (a), (b), (i), etc., se presentan meramente para facilitar la lectura de la memoria descriptiva y las reivindicaciones. El uso de encabezados en la memoria descriptiva o reivindicaciones no requiere que las etapas o elementos se realicen en orden alfabético o numérico o el orden en que se presentan.

Se describen diversos aspectos presentados en la divulgación con mayor detalle a continuación. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la memoria descriptiva.

Moléculas de ácido nucleico aisladas

Un aspecto presentado en la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que incluyen una molécula de fusión descrita en el presente documento, incluyendo ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de fusión o una porción de dicho polipéptido. Las moléculas de ácido nucleico incluyen aquellas moléculas de ácido nucleico que residen en regiones genómicas identificadas en el presente documento. Como se emplea en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (p. ej., ARNm) y análogos del ^aDⁿo ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra sencilla o de doble hebra; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico es ADN de doble hebra.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas también incluyen moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como cebadores o sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que corresponden a una molécula de fusión descrita en el presente documento, p. ej., aquellas adecuadas para su uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. En ciertos casos, una molécula de ácido nucleico "aislada" está libre de secuencias (tales como secuencias que codifican proteínas) que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se obtiene el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversos casos, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kB, menos de aproximadamente 4 kB, menos de aproximadamente 3 kB, menos de aproximadamente 2 kB, menos de aproximadamente 1 kB, menos de aproximadamente 0,5 kB o menos de aproximadamente 0,1 kB de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se obtiene el ácido nucleico. Por otra parte, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

La expresión "sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo" incluye preparaciones de molécula de ácido nucleico en las que la molécula se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Por tanto, la molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de molécula de ácido nucleico que tienen menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10% o menos de aproximadamente 5% (en peso seco) de otro material celular o medio de cultivo.

Una molécula de ácido nucleico de fusión se puede aislar usando técnicas de biología molecular convencionales y la información de secuencia en los registros de bases de datos descritos en el presente documento. Utilizando la totalidad o una porción de tales secuencias de ácido nucleico, se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico de fusión como se describe en el presente documento usando técnicas de hibridación y clonación convencionales (p. ej., como describen Sambrook etal., ed., en MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2aed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Una molécula de ácido nucleico de fusión (p. ej., la molécula de fusión descrita en el presente documento) se puede amplificar usando ADNc, ARNm o ADN genómico como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación por PCR convencionales. Las moléculas de ácido nucleico así amplificadas se pueden clonar en un vector apropiado y caracterizar por análisis de secuencias de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a la totalidad o una porción de una molécula de ácido nucleico presentada en la invención se pueden preparar por técnicas sintéticas convencionales, p. ej., usando un sintetizador de ADN automatizado.

En otro caso, una molécula de ácido nucleico de fusión (p. ej., la molécula de fusión descrita en el presente documento) comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de fusión o a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de nucleótidos dada es una que es lo suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos dada para que se pueda hibridar a la secuencia de nucleótidos dada formando, de este modo, un dúplex estable.

Por otra parte, una molécula de ácido nucleico de fusión puede comprender solo una porción de una secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de ácido nucleico de longitud completa, o que, codifica un polipéptido de fusión. Tales moléculas de ácido nucleico se pueden utilizar, p. ej., como sonda o cebador. La sonda/cebador típicamente se usa como uno o más oligonucleótidos sustancialmente purificados. El oligonucleótido típicamente comprende una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 125, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 175, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 350, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1 kb, al menos aproximadamente 2 kb, al menos aproximadamente 3 kb, al menos aproximadamente 4 kb, al menos aproximadamente 5 kb, al menos aproximadamente 6 kb, al menos aproximadamente 7 kb, al menos aproximadamente 8 kb, al menos aproximadamente 9 kb, al menos aproximadamente 10 kb, al menos aproximadamente 15 kb, al menos aproximadamente 20 kb, al menos aproximadamente 25 kb, al menos aproximadamente 30 kb, al menos aproximadamente 35 kb, al menos aproximadamente 40 kb, al menos aproximadamente 45 kb, al menos aproximadamente 50 kb, al menos aproximadamente 60 kb, al menos aproximadamente 70 kb, al menos aproximadamente 80 kb, al menos aproximadamente 90 kb, al menos aproximadamente 100 kb, al menos aproximadamente 200 kb, al menos aproximadamente 300 kb, al menos aproximadamente 400 kb, al menos aproximadamente 500 kb, al menos aproximadamente 600 kb, al menos aproximadamente 700 kb, al menos aproximadamente 800 kb, al menos aproximadamente 900 kb, al menos aproximadamente 1 mb, al menos aproximadamente 2 mb, al menos aproximadamente 3 mb, al menos aproximadamente 4 mb, al menos aproximadamente 5 mb, al menos aproximadamente 6 mb, al menos aproximadamente 7 mb, al menos aproximadamente 8 mb, al menos aproximadamente 9 mb, al menos aproximadamente 10 mb o más nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento.

La divulgación engloba adicionalmente moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente idénticas a las mutaciones génicas y/o productos génicos descritos en el presente documento, de modo que son idénticas en al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5% o más. La divulgación engloba adicionalmente moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente idénticas a las mutaciones génicas y/o productos génicos descritos en el presente documento, de modo que son idénticas en al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,5% o más.

En otros casos, la divulgación engloba adicionalmente moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente homólogas a mutaciones de genes de fusión y/o productos génicos descritos en el presente documento, de modo que difieran solo o al menos en 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600 nucleótidos o cualquier intervalo intermedio.

En otro caso, una molécula de ácido nucleico de fusión aislada descrita en el presente documento tiene al menos 7, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos 550, al menos 650, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1200, al menos 1400, al menos 1600, al menos 1800, al menos 2000, al menos 2200, al menos 2400, al menos 2600, al menos 2800, al menos 3000 o más nucleótidos de longitud e hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de fusión o con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína correspondiente a un marcador presentado en la invención.

Como se emplea en el presente documento, se pretende que el término "hibrida en condiciones rigurosas" describa las condiciones de hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80% o al menos 85% idénticas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. Tales condiciones rigurosas son conocidas para los expertos en la técnica y se pueden encontrar en las secciones 6.3.1-6.3.6 de Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Otro ejemplo no limitante de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 50-65°C.

La divulgación también incluye moléculas de ácido nucleico baliza molecular que tienen al menos una región que es complementaria a una molécula de ácido nucleico de fusión descrita en el presente documento, de modo que la baliza molecular sea útil para cuantificar la presencia de la molécula de ácido nucleico presentada en la invención en una muestra. Un ácido nucleico "baliza molecular" es una molécula de ácido nucleico que comprende un par de regiones complementarias y que tiene un fluoróforo y un extintor fluorescente asociado con las mismas. El fluoróforo y extintor están asociados con diferentes porciones del ácido nucleico en una orientación tal que cuando las regiones complementarias se reasocian entre sí, la fluorescencia del fluoróforo es extinguida por el extintor. Cuando las regiones complementarias de las moléculas de ácido nucleico no se reasocian entre sí, la fluorescencia del fluoróforo se extingue en menor grado. Se describen moléculas de ácido nucleico baliza molecular, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.876.930.

Sondas

La divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, útiles como sondas. Tales sondas de ácido nucleico se pueden diseñar basándose en la secuencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento.

Se pueden utilizar sondas basadas en la secuencia de una molécula de ácido nucleico de fusión como se describe en el presente documento para detectar transcritos o secuencias genómicas correspondientes a uno o más marcadores presentados en la invención. La sonda comprende un grupo marcador fijado a ella, p. ej., un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de prueba para identificar células o tejidos que expresen la proteína de fusión (p. ej., una fusión descrita en el presente documento), por ejemplo, midiendo los niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en una muestra de células de un sujeto, p. ej., detectando niveles de ARNm o determinando si un gen que codifica la proteína se ha mutado o suprimido.

Las sondas presentadas en la divulgación incluyen aquellas que hibridarán específicamente con una secuencia génica descrita en los ejemplos, p. ej., la molécula de fusión descrita en el presente documento. Típicamente, estas sondas tienen de 12 a 20, p. ej., de 17 a 20 nucleótidos de longitud (más largas para inserciones grandes) y tienen la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región de las mutaciones en sus localizaciones de nucleótidos respectivas en la secuencia de gen. Tales moléculas se pueden marcar de acuerdo con cualquier mecanismo conocido en la técnica, tal como con radiomarcas, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas, etiquetas de secuencia, biotina, otros ligandos, etc. Como se emplea en el presente documento, una sonda que " hibrida específicamente" con una secuencia de gen de fusión hibridará en condiciones muy rigurosas.

Una sonda típicamente contendrá una o más de las mutaciones específicas descritas en el presente documento. Típicamente, una sonda de ácido nucleico englobará solo una mutación. Tales moléculas se pueden marcar y se pueden utilizar como sondas específicas de alelo para detectar la mutación de interés.

En un aspecto, la divulgación presenta una sonda o conjunto de sondas que hibridan específicamente con un ácido nucleico que comprende una inversión que da como resultado una molécula de fusión descrita en el presente documento. En otro aspecto, la divulgación presenta una sonda o conjunto de sondas que hibridan específicamente con un ácido nucleico que comprende deleciones que dan como resultado una molécula de fusión descrita en el presente documento.

También se proporcionan pares aislados de sondas oligonucleotídicas específicas de alelo, donde la primera sonda del par hibrida específicamente con el alelo mutante, y la segunda sonda del par hibrida específicamente con el alelo de tipo salvaje. Por ejemplo, en un par de sondas ilustrativo, una sonda reconocerá el punto de unión de fusión en la fusión FGFR3-TACC3, y la otra sonda reconocerá una secuencia aguas abajo o aguas arriba de TACC3 o FGFR3, ninguna de las cuales incluye el punto de unión de fusión. Estas sondas específicas de alelo son útiles en la detección de una mutación somática en FGFR3 en una muestra tumoral, p. ej., una muestra de adenocarcinoma de pulmón. De manera similar, se pueden diseñar y producir pares de sondas para cualquiera de las moléculas de fusión descritas en el presente documento, y son útiles en la detección de una mutación somática en una muestra tumoral.

Cebadores

La divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas útiles como cebadores.

El término "cebador" como se emplea en el presente documento se refiere a una secuencia que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, p. ej., más de tres y más de ocho, o al menos 20 nucleótidos de un gen descrito en el Ejemplo, donde la secuencia corresponde a una secuencia que flanquea una de las mutaciones o una secuencia de tipo salvaje de un gen identificado en el Ejemplo, p. ej., cualquier gen descrito en el presente documento implicado en una fusión descrita en el presente documento. Se pueden utilizar cebadores para iniciar la síntesis de ADN por medio de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o un método de secuenciación. Los cebadores presentados en la divulgación incluyen las secuencias enumeradas y las secuencias complementarias que hibridarían con la hebra de ADN opuesta de la diana de muestra. Puesto que ambas hebras de ADN son imágenes complementarias y especulares entre sí, se amplificará el mismo segmento de ADN.

Se pueden utilizar cebadores para secuenciar un ácido nucleico, p. ej., un ácido nucleico aislado descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante un método de NGS, o para amplificar un gen descrito en el Ejemplo, por ejemplo, mediante PCR. Los cebadores pueden hibridar específicamente, p. ej., con los extremos de los exones o con los intrones que flanquean los exones. A continuación, el segmento amplificado se puede analizar adicionalmente para determinar la presencia de la mutación, por ejemplo, mediante un método de secuenciación. Los cebadores son útiles para dirigir la amplificación de un polinucleótido diana antes de la secuenciación. En otro aspecto, la divulgación presenta un par de cebadores oligonucleotídicos que amplifican una región que contiene o es adyacente a un punto de unión de fusión identificado en el ejemplo. Tales cebadores son útiles para dirigir la amplificación de una región diana que incluye un punto de unión de fusión identificado en el Ejemplo, p. ej., antes de la secuenciación. El cebador típicamente contiene de 12 a 20 o de 17 a 20 o más nucleótidos, aunque un cebador puede contener menos nucleótidos.

Un cebador es típicamente de hebra sencilla, p. ej., para su uso en métodos de secuenciación o amplificación, pero puede ser de doble hebra. Si es de doble hebra, el cebador se puede tratar, en primer lugar, para separar sus hebras antes de utilizarse para preparar productos de extensión. Un cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor para la polimerización. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo las aplicaciones (p. ej., el método de amplificación), la temperatura, el tampón y la composición de nucleótidos. Un cebador típicamente contiene 12-20 o más nucleótidos, aunque un cebador puede contener menos nucleótidos.

Los cebadores típicamente se diseñan para que sean "sustancialmente" complementarios a cada hebra de un locus genómico que se va a amplificar. Por tanto, los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios para hibridar específicamente con sus respectivas hebras en condiciones que permitan que actúe el agente para la polimerización. En otras palabras, los cebadores deben tener suficiente complementariedad con las secuencias 5' y 3' que flanquean la mutación para hibridar con la misma y permitir la amplificación del locus genómico.

El término "sustancialmente complementaria a" o "sustancialmente la secuencia" se refiere a secuencias que hibridan con las secuencias proporcionadas en condiciones rigurosas y/o secuencias que tienen suficiente homología con una secuencia que comprende un punto de unión de fusión identificada en el Ejemplo, o la secuencia contraparte de tipo salvaje, de modo que los oligonucleótidos específicos de alelo hibriden con la secuencia. En un caso, una secuencia es sustancialmente complementaria a un punto de unión de fusión en un evento de inversión, p. ej., a un punto de unión de fusión en cualquier molécula de fusión descrita en el presente documento. "Sustancialmente iguales" en lo que se refiere a secuencias de oligonucleótidos también se refiere a la capacidad funcional de hibridar o reasociarse con suficiente especificidad para distinguir entre la presencia o ausencia de la mutación. Esto es medible por la temperatura de fusión que es lo suficientemente diferente para permitir una fácil identificación de si el oligonucleótido se une a la secuencia del gen normal o mutante identificada en el Ejemplo.

En un aspecto, la divulgación presenta un cebador o conjunto de cebadores para amplificar un ácido nucleico que comprende una inversión que da como resultado una fusión descrita en el presente documento. En otro aspecto, la divulgación presenta un cebador o conjunto de cebadores para amplificar un ácido nucleico que comprende una deleción que da como resultado la fusión descrita en el presente documento.

También se proporcionan pares aislados de cebadores oligonucleotídicos específicos de alelo, donde el primer cebador del par hibrida específicamente con el alelo mutante, y el segundo cebador del par hibrida específicamente con una secuencia aguas arriba o aguas abajo de una mutación, o un punto de unión de fusión que resulta, p. ej., de una inversión, duplicación, deleción, inserción o translocación. En un par de cebadores ilustrativo, una sonda reconocerá una fusión FGFR3-TACC3, por ejemplo, mediante hibridación con una secuencia en el punto de unión de fusión entre los transcritos de FGFR3 y TACC3, y el otro cebador reconocerá una secuencia aguas arriba o aguas abajo del punto de unión de fusión. Estos cebadores específicos de alelo son útiles para amplificar una secuencia de fusión FGFR3-TACC3 de una muestra tumoral, p. ej., una biopsia, p. ej., una biopsia que se sospecha que es de cáncer de pulmón, p. ej., adenocarcinoma de pulmón.

En otro par de cebadores ilustrativo, un cebador puede reconocer una translocación FGFR3-TACC3 (p. ej., la recíproca de la translocación FGFR3-TACC3), por ejemplo, mediante hibridación con una secuencia en el punto de unión de fusión entre los transcritos de FGFR3 y TACC3, y el otro cebador reconocerá una secuencia aguas arriba o aguas abajo del punto de unión de fusión. Estos cebadores específicos de alelo son útiles para amplificar una secuencia de fusión FGFR3-TACC3 de una muestra tumoral, p. ej., una muestra o biopsia de cáncer de pulmón o una muestra de biopsia de pulmón.

Se pueden preparar cebadores usando cualquier método adecuado, tal como los métodos de fosfotriéster y fosfodiéster convencionales o casos automatizados de los mismos. En uno de tales casos automatizados, se usan dietilfosforamiditas como materiales de partida y se pueden sintetizar como describen Beaucage, et al., en Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, (1981). Un método para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.458.066.

Se dice que un cebador o sonda oligonucleotídicos que hibridan con un alelo mutante o de tipo salvaje son el complemento del alelo. Como se emplea en el presente documento, una sonda presenta "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de la sonda es complementario al nucleótido correspondiente del alelo. Se dice que dos polinucleótidos son "mínimamente complementarios" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer reasociados entre sí en condiciones al menos convencionales de "baja rigurosidad". De forma similar, se dice que los polinucleótidos son "complementarios" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer hibridados entre sí en condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Son conocidas condiciones rigurosas convencionales para los expertos en la técnica y se pueden encontrar, p. ej., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a edición, volúmenes 1, 2 y 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000.

Por lo tanto, se permiten desviaciones de la complementariedad completa, siempre que dichas desviaciones no excluyan completamente la capacidad de una sonda para hibridar con un alelo. Por tanto, para que un polinucleótido sirva como cebador o sonda, solo es necesario que tenga una secuencia lo suficientemente complementaria para poder formar una estructura de doble hebra estable a las concentraciones de disolvente y sal particulares empleadas. Las condiciones rigurosas apropiadas que promueven la hibridación del ADN son, p. ej., 6,0 X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de un lavado de 2,0 X SSC a 50°C. Tales condiciones son conocidas para los expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). La concentración de sal y la temperatura en la etapa de lavado se pueden ajustar para alterar la rigurosidad de la hibridación. Por ejemplo, las condiciones pueden variar de poco rigurosas de aproximadamente 2,0 X SSC a 40°C a condiciones moderadamente rigurosas de aproximadamente 2,0 X SSC a 50°C y condiciones muy rigurosas de aproximadamente 0,2 X SSC a 50°C.

Proteínas de fusión y anticuerpos

Un aspecto presentado en la divulgación se refiere a polipéptidos de fusión purificados y a porciones biológicamente activas de los mismos. El polipéptido de fusión puede ser cualquier molécula de fusión descrita en el presente documento. En un caso, el polipéptido de fusión nativo se puede aislar de fuentes celulares o tisulares por un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En otro caso, se produce un polipéptido de fusión por técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, un polipéptido de fusión descrito en el presente documento se puede sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se obtiene la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Por tanto, la proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10% o menos de aproximadamente 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada en el presente documento "proteína contaminante"). Cuando la proteína o porción biológicamente activa de la misma se producen de forma recombinante, pueden estar sustancialmente libres de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10% o menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteínas. Cuando la proteína se produce por síntesis química, puede estar sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia, tales preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del polipéptido de interés.

Las porciones biológicamente activas de un polipéptido de fusión incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos lo suficientemente idénticas a, u obtenidas de, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión, que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa y presentan al menos una actividad de la proteína de longitud completa correspondiente, p. ej., una actividad cinasa, p. ej., una actividad cinasa de FGFR3. Una porción biológicamente activa de una proteína presentada en la divulgación puede ser un polipéptido que tenga, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Por otra parte, otras porciones biológicamente activas, en las que se suprimen otras regiones de la proteína, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluar para determinar una o más de las actividades funcionales de la forma nativa de un polipéptido.

En ciertos casos, el polipéptido de fusión descrito en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento. Otras proteínas útiles son sustancialmente idénticas (p. ej., al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 86, al menos 87, al menos 88, al menos 89, al menos 90, al menos 91, al menos 92, al menos 93, al menos 94, al menos 95, al menos 96, al menos 97, al menos 98, al menos 99, al menos 99,5% o más) a una de estas secuencias y conservan la actividad funcional de la proteína de la correspondiente proteína de longitud completa, aunque difieren en la secuencia de aminoácidos.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). A continuación, se comparan los residuos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = Núm. de posiciones idénticas/Núm. total de posiciones (p. ej., posiciones solapantes) x100). En un caso, las dos secuencias tienen la misma longitud.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está incorporado a los programas Nb La ST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos en b La ST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de un ácido nucleico presentadas en la invención. Se pueden realizar búsquedas de proteínas en BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína presentadas en la divulgación. Para obtener alineamientos con huecos para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como describen Altschul et al. (1997) en Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. De forma alternativa, se puede utilizar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterativa que detecte relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSl-Blast, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, (1988) Comput Appl Biosci, 4:11-7. Tal algoritmo se incorpora al programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de programa informático de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Otro algoritmo útil más para identificar regiones de similitud y alineamiento de secuencias locales es el algoritmo FASTA, como describen Pearson y Lipman (1988) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448. Cuando se usa el algoritmo FASTA para comparar secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, se puede utilizar, p. ej., una tabla de restos de peso PAM120 con un valor de ft-tupla de 2.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, solo se cuentan los emparejamientos exactos.

Un polipéptido de fusión aislado (p. ej., una fusión descrita en el presente documento), o uno de sus fragmentos, se puede utilizar como inmunógeno para generar anticuerpos usando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se puede utilizar el polipéptido de fusión de longitud completa o, de forma alternativa, la divulgación proporciona fragmentos de péptidos antigénicos para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de una proteína presentada en la divulgación comprende al menos 8 (o al menos 10, al menos 15, al menos 20 o al menos 30 o más) restos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos presentados en la invención, y engloba un epítopo de la proteína de modo que un anticuerpo producido frente al péptido forme un inmunocomplejo específico con un marcador presentado en la invención al que corresponde la proteína. Los epítopos ilustrativos englobados por el péptido antigénico son regiones que están localizadas en la superficie de la proteína, p. ej., regiones hidrófilas. Se pueden utilizar análisis de secuencias de hidrofobia, análisis de secuencias de hidrofilia o análisis similares para identificar regiones hidrófilas.

Un inmunógeno se usa típicamente para preparar anticuerpos inmunizando a un sujeto adecuado (es decir, inmunocompetente), tal como un conejo, cabra, ratón u otro mamífero o vertebrado. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, un polipéptido expresado de forma recombinante o sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un adyuvante, tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar.

En consecuencia, otro aspecto presentado en la divulgación se refiere a los anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de fusión descrito en el presente documento. En un caso, la molécula de anticuerpo se une específicamente a la molécula de fusión descrita en el presente documento, p. ej., se une específicamente a un epítopo formado por la fusión. En casos, el anticuerpo puede distinguir los genes de tipo salvaje que forman la fusión, de la fusión de los genes, p. ej., el anticuerpo puede distinguir los genes de tipo salvaje, p. ej., FGFR3 (o TACC3) de FGFR3-TACC3.

Los términos "anticuerpo" y "molécula de anticuerpo" empleados indistintamente en el presente documento se refieren a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno, tal como un polipéptido presentado en la invención. Una molécula que se une específicamente a un polipéptido dado presentado en la invención es una molécula que se une al polipéptido, pero no se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, p. ej., una muestra biológica, que contiene naturalmente el polipéptido. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen los fragmentos F(ab) y F(ab')2 que se pueden generar tratando el anticuerpo con una enzima, tal como pepsina. La divulgación proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se emplean en el presente documento, se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie de un sitio de unión a antígeno que pueda inmunorreaccionar con un epítopo particular.

Los anticuerpos policlonales se pueden preparar como se describe anteriormente inmunizando a un sujeto adecuado con un polipéptido de fusión como inmunógeno. Las células productoras de anticuerpos se pueden obtener del sujeto y utilizar para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridoma de linfocito B humanos (véase Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), la técnica de hibridoma de EBV (véase Cole et al., pág. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (véase, en general, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1994). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal se detectan escrutando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para determinar anticuerpos que se unan al polipéptido de interés, p. ej., usando un ensayo ELISA convencional.

Como alternativa a la preparación de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un anticuerpo monoclonal escrutando una biblioteca combinatoria y recombinante de inmunoglobulinas (p. ej., una biblioteca de presentación en fagos con anticuerpos) con el polipéptido de interés. Los kits para generar y escrutar bibliotecas de presentación en fagos están disponibles comercialmente (p. ej., Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, Núm. de catálogo 27-9400-01; y SurfZAP Phage Display Kit de Stratagene, Núm. de catálogo 240612). Adicionalmente, se pueden encontrar ejemplos de métodos y reactivos, en particular, susceptibles para su uso en la generación y escrutinio de una biblioteca de presentación de anticuerpos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.223.409; Publicación PCT Núm. WO 92/18619; Publicación PCT Núm. WO 91/17271; Publicación PCT Núm. WO 92/20791; Publicación PCT Núm. WO 92/15679; Publicación PCT Núm. WO 93/01288; Publicación PCT Núm. WO 92/01047; Publicación PCT Núm. WO 92/09690; Publicación PCT Núm. WO 90/02809; Fuchs etal. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay etal. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734.

Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir por mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo, usando los métodos descritos en la Publicación PCT Núm. WO 87/02671; la Solicitud de Patente Europea 184.187; la Solicitud de Patente Europea 171.496; la Solicitud de Patente Europea 173.494; la Publicación PCT Núm. WO 86/01533; la Patente de Estados Unidos Núm. 4.816.567; la Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; Patente de Estados Unidos Núm. 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol.

141:4053-4060.

Se pueden producir anticuerpos completamente humanos usando ratones transgénicos que no puedan expresar genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadenas pesadas y ligeras humanas. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véanse, p. ej., la Patente de Estados Unidos 5.625.126; la Patente de Estados Unidos 5.633.425; la Patente de Estados Unidos 5.569.825; la Patente de Estados Unidos 5.661.016; y la Patente de Estados Unidos 5.545.806. Además, se pueden contratar empresas, tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA), para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.

Se puede utilizar un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de fusión descrito en el presente documento (p. ej., un anticuerpo monoclonal) para aislar el polipéptido por técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, se puede utilizar un anticuerpo de este tipo para detectar el marcador (p. ej., en un producto lisado celular o en un sobrenadante celular) para evaluar el nivel y el patrón de expresión del marcador. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, pgalactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminafluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye, pero no se limita a, luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen, pero no se limitan a, luciferasa, luciferina y aecuorina, y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 125I, 131I, 35S o 3H.

También se puede utilizar de forma diagnóstica un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de fusión descrito en el presente documento para supervisar los niveles de proteína en tejidos o líquidos corporales (p. ej., en un líquido corporal que contenga células tumorales) como parte de un método de pruebas clínicas, p. ej., para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado.

Antígenos y vacunas

Los casos presentados en la divulgación incluyen preparaciones, p. ej., preparaciones antigénicas, de toda la fusión o de uno de sus fragmentos, p. ej., un fragmento que pueda producir anticuerpos específicos para la proteína de fusión, p. ej., un fragmento que contenga un punto de unión de fusión (conjuntamente denominados en el presente documento "polipéptidos específicos de fusión" o FSP). La preparación puede incluir un adyuvante u otro componente.

Un FSP se puede utilizar como antígeno o vacuna. Por ejemplo, un FSP se puede utilizar como antígeno para inmunizar a un animal, p. ej., un roedor, p. ej., un ratón o rata, conejo, caballo, cabra, perro o primate no humano, para obtener anticuerpos, p. ej., anticuerpos específicos de proteínas de fusión. En un caso, una molécula de anticuerpo específico de fusión es una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, p. ej., una policlonal. En otros casos, una molécula de anticuerpo específico de fusión es monoespecífica, p. ej., monoclonal, humana, humanizada, quimérica u otra molécula de anticuerpo monoespecífica. Se puede utilizar una molécula de anticuerpo específica anti-proteína de fusión para tratar a un sujeto que tiene un cáncer, p. ej., un cáncer descrito en el presente documento.

Los casos presentados incluyen preparaciones de vacunas que comprenden un FSP que pueda estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, p. ej., produciendo, en el sujeto, anticuerpos específicos para la proteína de fusión. La preparación de vacunas puede incluir otros componentes, p. ej., un adyuvante. Las preparaciones de vacunas se pueden utilizar para tratar a un sujeto que tiene cáncer, p. ej., un cáncer descrito en el presente documento.

Vacunas contra el cáncer basadas en reordenamientos

Los casos presentados en la divulgación incluyen preparaciones de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento. El polipéptido de fusión se puede obtener a partir de, pero no se limita a, cualquier molécula de fusión descrita en el presente documento.

Un polipéptido de punto de unión de fusión se puede utilizar como antígeno o vacuna para el tratamiento de una enfermedad, p. ej., un cáncer, p. ej., un cáncer descrito en el presente documento. Por ejemplo, se pueden incubar células presentadoras de antígeno (APC) obtenidas de un paciente con una enfermedad, p. ej., cáncer, p. ej., un cáncer descrito en el presente documento con un polipéptido de punto de unión de fusión, en donde es conocida, se ha determinado o se sospecha que la enfermedad de la que se obtienen las APC del paciente expresa la molécula de fusión de la que se obtiene el polipéptido de punto de unión de fusión. En ciertos casos, las APC también se incuban con una o más citocinas. En ciertos casos, la citocina induce la maduración de las APC. En ciertos casos, la citocina es una o más de GMCSF, TNF-alfa, IL-4, IL-2, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15, HGF. En ciertos casos, la citocina es GMCSF. Las APC se incuban con el polipéptido de fusión en condiciones que permiten que las APC capten o endociten el polipéptido de fusión, y procesen el polipéptido para su presentación sobre una molécula de superficie celular, p. ej., moléculas del complejo principal de histocompatibilidad, MHC, de clase I. Las condiciones de cultivo celular son conocidas para los expertos en la técnica. A continuación, las APC se pueden volver a infundir en el mismo paciente del que se obtuvieron las células.

En ciertos casos, las APC se purifican antes de la incubación con un polipéptido de fusión. En ciertos casos, las APC son células dendríticas. En ciertos casos, las APC incluyen una o más células dendríticas, macrófagos y células B. En ciertos casos, las APC se incuban con uno, dos, tres, cuatro o más polipéptidos de fusión.

En ciertos casos, la divulgación incluye preparaciones de, o una preparación de vacunas de APC maduras que se han incubado con un polipéptido de fusión descrito en el presente documento.

En ciertos casos, el método incluye determinar o adquirir una determinación de si un paciente expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento. En ciertos casos, el método incluye seleccionar un polipéptido de fusión basándose en la determinación de si un paciente expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento. En algunos casos, el método comprende adicionalmente la incubación de APC obtenidas del paciente con el polipéptido de fusión seleccionado. En algunos casos, el método comprende adicionalmente la infusión de las APC de nuevo en el paciente del que se obtuvieron.

Vectores de expresión, células anfitrionas y células recombinantes

En otro aspecto, la divulgación incluye vectores (p. ej., vectores de expresión) que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión descrito en el presente documento. Como se emplea en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que pueda transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado y puede incluir un plásmido, cósmido o vector vírico. El vector se puede replicar de forma autónoma o se puede integrar en un ADN anfitrión. Los vectores víricos incluyen, p. ej., retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados.

Un vector puede incluir un ácido nucleico de fusión en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitriona. Preferiblemente, el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras enlazadas de forma funcional a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias reguladoras y/o inducibles específicas de tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado y similares. Los vectores de expresión se pueden introducir en células anfitrionas para producir, de este modo, un polipéptido de fusión, incluyendo proteínas o polipéptidos de fusión codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento, formas mutantes de los mismos y similares.

Se pretende que el término "célula anfitriona recombinante" (o simplemente "célula anfitriona" o "célula recombinante"), como se emplea en el presente documento, se refiera a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que no solo se pretende que tales términos se refieran a la célula objeto particular, sino a la descendencia de una célula de este tipo. Puesto que se pueden producir determinadas modificaciones en generaciones subsiguientes debido a mutaciones o bien influencias ambientales, tal descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía se incluye dentro del alcance del término "célula anfitriona" como se emplea en el presente documento.

Los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para la expresión de un polipéptido de fusión (p. ej., una fusión descrita en el presente documento) en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los polipéptidos presentados en la invención se pueden expresar en E. coli, células de insecto (p. ej., usando vectores de expresión en baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células anfitrionas adecuadas son analizadas adicionalmente por Goeddel, (1990) en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. De forma alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo más a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o bien de no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada, normalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión típicamente cumplen tres propósitos: 1) incrementar la expresión de proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escisión proteolítica en el punto de unión del radical de fusión y la proteína recombinante para posibilitar la separación de la proteína recombinante del radical de fusión posteriormente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de la fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), μMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Los polipéptidos de fusión purificados descritos en el presente documento se pueden utilizar en ensayos de actividad (p. ej., ensayos directos o ensayos competitivos descritos en detalle a continuación), o para generar anticuerpos específicos para los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento.

Maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína en una bacteria anfitriona con una capacidad alterada de escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión, de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferiblemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de las secuencias de ácido nucleico se puede llevar a cabo por técnicas de síntesis de ADN convencionales.

El vector de expresión del polipéptido de fusión puede ser un vector de expresión en levaduras, un vector para la expresión en células de insecto, p. ej., un vector de expresión en baculovirus o un vector adecuado para su expresión en células de mamífero.

Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión pueden ser proporcionadas por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se obtienen de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40.

En otro caso, el promotor es un promotor inducible, p. ej., un promotor regulado por una hormona esteroidea, por una hormona polipeptídica (p. ej., por medio de una vía de transducción de señales) o por un polipéptido heterólogo (p. ej., los sistemas inducibles por tetraciclina, "activado por Tet" y "desactivado por Tet", véanse, p. ej., Clontech Inc., Ca , Gossen y Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547, y Paillard (1989) Human Gene Therapy 9:983).

En otro caso, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo celular particular (p. ej., se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular, promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (p. ej., el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (p. ej., promotor de suero lácteo; Patente de Estados Unidos Núm. 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Núm.

264.166). Los promotores regulados por el desarrollo también están englobados, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de -fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN presentada en la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Se pueden elegir secuencias reguladoras (p. ej., promotores y/o potenciadores víricos) enlazadas de forma funcional a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo celular de ARN antisentido en una variedad de tipos celulares. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado.

Otro aspecto de la divulgación proporciona una célula anfitriona que incluye una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento, p. ej., una molécula de ácido nucleico de fusión descrita en el presente documento dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico de fusión descrita en el presente documento que contiene secuencias que le permiten la recombinación homóloga en un sitio específico del genoma de la célula anfitriona.

Una célula anfitriona puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido de fusión se puede expresar en células bacterianas (tales como E. coli), células de insecto, células de levadura o de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS, p. ej., células COS-7, células SV40 de origen CV-1; Gluzman (1981) Cell 23:175-182). Otras células anfitrionas adecuadas son conocidas para los expertos en la técnica.

El ADN del vector se puede introducir en las células anfitrionas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se emplea en el presente documento, se pretende que los términos "transformación" y "transfección" se refieran a una variedad de mecanismos reconocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos foráneos (p. ej., ADN) en una célula anfitriona, incluyendo la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación.

Se puede utilizar una célula anfitriona para producir (p. ej., expresar) un polipéptido de fusión (p. ej., una molécula de fusión descrita en el presente documento). En consecuencia, la divulgación proporciona métodos para producir un polipéptido de fusión usando las células anfitrionas. En un caso, el método incluye cultivar la célula anfitriona (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido) en un medio adecuado de modo que se produzca el polipéptido de fusión. En otro caso, el método incluye adicionalmente aislar un polipéptido de fusión del medio o de la célula anfitriona.

En otro aspecto, la divulgación presenta una célula o preparación purificada de células que incluyen una molécula de fusión descrita en el presente documento, transgén, o que de otro modo expresa erróneamente la fusión. Por ejemplo, una célula o preparación purificada de células que incluye un transgén de fusión FGFR3-TACC3, o que de otro modo expresa erróneamente la fusión FGFR3-TACC3.

La preparación de células puede consistir en células humanas o no humanas, p. ej., células de roedor, p. ej., células de ratón o rata, células de conejo o células de cerdo. En casos, la célula o células incluyen un transgén de fusión, p. ej., una forma heteróloga de una fusión descrita en el presente documento, p. ej., un gen obtenido de seres humanos (en el caso de una célula no humana) o un transgén de fusión, p. ej., una forma heteróloga de una fusión descrita en el presente documento. El transgén de fusión se puede expresar erróneamente, p. ej., expresar de manera anormalmente alta o expresar de manera anormalmente baja. En otros casos preferidos, la célula o células incluyen un gen que expresa erróneamente una fusión endógena, p. ej., un gen en el que su expresión está interrumpida, p. ej., una inactivación. Tales células pueden servir como modelo para estudiar trastornos que están relacionados con alelos de fusión mutados o expresados erróneamente (p. ej., cánceres) o para su uso en el escrutinio de fármacos, como se describe en el presente documento.

Métodos terapéuticos

De forma alternativa, o en combinación con los métodos descritos en el presente documento, la divulgación presenta un método de tratamiento de una neoplasia, un cáncer o un tumor que alberga una molécula de fusión descrita en el presente documento. Los métodos incluyen la administración de un agente anticanceroso, p. ej., un inhibidor de cinasa, solo o combinado, p. ej., combinado con otros agentes o procedimientos quimioterapéuticos, en una cantidad suficiente para reducir o inhibir el crecimiento de células tumorales, y/o tratar o prevenir el cáncer o los cánceres, en el sujeto.

"Tratar", "tratamiento" y otras formas de esta palabra se refieren a la administración de un inhibidor de cinasa, solo o combinado con un segundo agente para impedir el crecimiento de un cáncer, provocar que el cáncer se reduzca en peso o volumen, extender el tiempo de supervivencia esperado del sujeto y/o el tiempo transcurrido hasta la progresión del tumor o similares. En esos sujetos, el tratamiento puede incluir, pero no se limita a, la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de la masa tumoral, la reducción del tamaño o número de lesiones metastásicas, la inhibición del desarrollo de nuevas lesiones metastásicas, la prolongación de la supervivencia, la prolongación de la supervivencia sin progresión, la prolongación del tiempo transcurrido hasta la progresión y/o la mejora de la calidad de vida.

Como se emplea en el presente documento, a menos que se especifique de otro modo, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" contemplan una acción que se produce antes de que un sujeto comience a padecer el nuevo crecimiento del cáncer y/o que inhibe o reduce la gravedad del cáncer.

Como se emplea en el presente documento, y a menos que se especifique de otro modo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o atención médica del cáncer, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con el cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o combinado con otros agentes terapéuticos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o atención médica del cáncer. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" puede englobar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita los síntomas o las causas del cáncer, o potencia la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.

Como se emplea en el presente documento, y a menos que se especifique de otro modo, una "cantidad profilácticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para prevenir el nuevo crecimiento del cáncer, o uno o más síntomas asociados con el cáncer, o prevenir su recidiva. Una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad del compuesto, solo o combinado con otros agentes terapéuticos, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención del cáncer. El término "cantidad profilácticamente eficaz" puede englobar una cantidad que mejora la profilaxis global o potencia la eficacia profiláctica de otro agente profiláctico.

Como se emplea en el presente documento, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a un animal, típicamente un ser humano (es decir, un hombre o una mujer de cualquier grupo de edad, p. ej., un paciente pediátrico (p. ej., un bebé, un niño, un adolescente) o paciente adulto (p. ej., adulto joven, adulto de mediana edad o adulto mayor) u otro mamífero, tal como un primate (p. ej., mono cinomolgo, mono Rhesus); mamíferos comercialmente relevantes, tales como ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, cabras, gatos y/o perros; y/o aves, incluyendo aves comercialmente relevantes, tales como pollos, patos, gansos y/o pavos, que serán o han sido objeto de tratamiento, observación y/o experimentación. Cuando el término se usa junto con la administración de un compuesto o fármaco, el paciente ha sido objeto de tratamiento, observación y/o administración del compuesto o fármaco.

En ciertos casos, el cáncer incluye, pero no se limita a, un tumor sólido, un tumor de partes blandas y una lesión metastásica (p. ej., un cáncer como se describe en el presente documento). En un caso, el cáncer se elige entre adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de cuello uterino, adenocarcinoma de endometrio uterino, glioblastoma, melanoma, sarcoma fusocelular, fibroscarcoma ameloblástico, adenocarcinoma, colangiocarcinoma, carcinoma urotelial (de células de transición), carcinoma epitelial de ovario, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de próstata o adenocarcinoma ductal de páncreas. En un caso, el cáncer se elige entre un cáncer de pulmón, un cáncer de páncreas, melanoma, un cáncer colorrectal, un cáncer esofagogástrico, un cáncer de tiroides o un adenocarcinoma. En otro caso, el cáncer de pulmón se elige entre uno o más de los siguientes: carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de pulmón microcítico (CPM), carcinoma de células escamosas (CCE), adenocarcinoma de pulmón, carcinoma broncogénico o una combinación de los mismos. En un caso, el cáncer de pulmón es CPNM o CCE.

En otros casos, el cáncer se elige entre cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, adenocarcinoma, melanoma, cáncer de células B, cáncer de mama, cáncer de bronquio, cáncer de cavidad bucal o faringe, cáncer de tejidos hematológicos, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer esofagogástrico, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de hígado, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de las glándulas salivales, cáncer del intestino delgado o apéndice, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de la vejiga urinaria, cáncer de útero o de endometrio, tumores miofibroblásticos inflamatorios, tumor del estroma gastrointestinal (GIST) y similares.

En otros casos, el cáncer es un cáncer cerebral, p. ej., un astrocitoma cerebral, un glioblastoma cerebral. En otros casos, el cáncer es un cáncer de cuello uterino, p. ej., un carcinoma de cuello uterino, un adenocarcinoma de cuello uterino, un carcinoma de células escamosas de cuello uterino. En otros casos, el cáncer es un cáncer de riñón, p. ej., un carcinoma de riñón, un carcinoma urotelial de riñón. En otros casos, el cáncer es un cáncer de vejiga, p. ej., un carcinoma urotelial de vejiga, un carcinoma urotelial de vejiga (de células de transición). En otros casos, el cáncer es un cáncer de páncreas, p. ej., un carcinoma ductal de páncreas. En otros casos, el cáncer es un cáncer de piel, p. ej., un melanoma. En otros casos, el cáncer es un cáncer de endometrio, p. ej., un adenocarcinoma de endometrio. En otros casos, el cáncer es un colangiosarcoma, p. ej., un colangiosarcoma de hígado. En otros casos, el cáncer es un fibrosarcoma, p. ej., un fibrosarcoma ameloblástico. En otros casos, el cáncer es un adenocarcinoma de las vías biliares. En otros casos, el cáncer es un colangiocarcinoma. En otros casos, el cáncer es un cáncer de mama, p. ej., un carcinoma de mama, un carcinoma inflamatorio de mama. En otros casos, el cáncer es un leiomiosarcoma, p. ej., un leiomiosarcoma de partes blandas, p. ej., un leiomiosarcoma uterino, un leiomisarcoma del intestino delgado. En otros casos, el cáncer es un cáncer de tiroides, p. ej., un carcinoma anaplásico de tiroides.

En ciertos casos, la neoplasia o célula neoplásica es benigna, premaligna, maligna (cáncer) o metástasis.

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de cinasa. Por ejemplo, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de múltiples cinasas o un inhibidor específico. Los inhibidores de cinasa ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, axitinib (AG013736), bosutinib (SKI-606), cediranib (RECENTINTM, AZD2171), dasatinib (SPRYCEL®, BMS-354825), erlotinib (T^aRCEVA®), gefitinib (IRESSA®), imatinib (Gleevec®, CGP57148B, STI-571), lapatinib (TYKERB®, TYVERB®), lestaurtinib (CEP-701), neratinib (HKI-272), nilotinib (Ta SIGNA®), semaxanib (semaxinib, SU5416), sunitinib (SUTENT®, SU11248), toceranib (PALLADIA®), vandetanib, vatalanib (PTK787, PTK/ZK), sorafenib (NEXAVAR®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, lactato de dovitinib (TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOKTM), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, tivozanib (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647 y XL228.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de FGFR3 que incluye, pero sin limitarse a, TKI258 (dovitinib); AP24534 (ponatinib); AZD4547; FP-1039 (GSK3052230) (HGS1036); XL9999; o BGJ398 (NVP-BGJ398).

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BRAF que incluye, pero sin limitarse a, Vemurafenib (PLX4032, RG7204, R05185426), Tosilato de Sorafenib (Bay 43-9006, Nexavar), PLX4720, GDC-0879, RAF265 (CHIR-265), MLN2480 (BIIB-024), PF-04880594, GW5074, CEP-32496, Dabrafenib (GSK2118436), AZ628, SB590885, derivado de Raf265, Regorafenib (BAY 73-4506, Fluoro-Sorafenib), DP-4978, DP-2514, DP-3346, ARQ736, XL281, RG7256, LGX818, PLX3603, Trematinib y/o ZM 336372.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de RAF1 que incluye, pero sin limitarse a, sorafenib (Nexavar); PLX-4720; o regorafenib (BAY 73-4506).

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de RET que incluye, pero sin limitarse a, pirazolopirimidinas, p. ej., PP1 y PP2; derivados de indocarbazol, p. ej., CEP-701 y CEP-751; 2-indolinona, p. ej., RPI-1; y quinazolina, p. ej., ZD6474; o TG101209.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de NTRK1 que incluye, pero sin limitarse a, danusertib (PHA-739358); PHA-848125; CEP-2563; K252a; KRC-108; lestaurtinib (CEP-701); AZ-23; indenopirrolocarbazol 12a; oxindol 3; isotiazol 5n; tiazol 20h. En ciertos casos, el inhibidor es un inhibidor de HSP90. En ciertos casos, el inhibidor de HSP90 es 17-DMAG.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de IGF1R que incluye, pero sin limitarse a, NVP-ADW742; BMS-754807; o AG-1024.

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de metiltransferasa. Por ejemplo, el inhibidor de metiltransferasa es un inhibidor de múltiples metiltransferasas o un inhibidor específico de DOT1L. En un caso, el inhibidor de metiltransferasa es un inhibidor de DOT1L que incluye, pero sin limitarse a, EPZ004777; o EPZ-5676; SGC0946.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de FLT4 que incluye, pero sin limitarse a, BIBF1120 (Vargatef); KRN 633; alaninato de Brivanib (BMS-582664); Telatinib (BAY 57-9352); E7080 (Lenvatinib); Trivozanib (AV-951), XL999; AL2846; Motesanib; AAL-993; Axitinib; Foretinib; MGCD-265; SAR131675; Sorafenib; Pazopanib; Regorafenib (BAY 73-4506); Sunitinib; Vandetanib; y/o IMC-3C5.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de ALK que incluye, pero sin limitarse a, Crizotinib (PF-2341066; 1066); LDK378; TAE684 (NVP-TAE684); CH5424802 (AF802, RO5424802); GSK1838705A; ASP-3026; CEP-37440, CEP-28122, CEP-108050; AP26113 o AZD-3463. Se describen ejemplos adicionales de inhibidores de cinasa ALK en los ejemplos 3-39 del documento WO 2005016894 de Garcia-Echeverria C, et al.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de ERBB4 que incluye, pero sin limitarse a, AST-1306; o dacomitinib (PF299804).

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de NOTCH. En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de NOTCH1. En un caso, el inhibidor de NOCTH incluye, pero no se limita a, un inhibidor de pan-NOTCH, un compuesto inhibidor de NOTCH1, un anticuerpo anti-NOTCH1, un anticuerpo de región reguladora negativa anti-NOTCH1 o un inhibidor de gamma-secretasa (GSI). En otros casos, el inhibidor de NOTCH1 se elige entre: BMS-906024, PF-03084014 y/o MK-0752.

En un caso, el agente anticanceroso es un activador o estabilizante de TSC2. En ciertos casos, el activador o estabilizante de TSC2 puede incluir, pero sin limitarse a, 14-3-3beta.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de FGFR2 que incluye, pero sin limitarse a, BIBF1120 (Vargatef); Panatinib (AP24534); AZD4547; BGJ398 (NVP-BGJ398); o alaninato de Brivanib (BMS-582664).

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de cinasa. En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de ROS1, p. ej., Ganetespib; Crizotinib; TAE684; un inhibidor doble de ALK y ROS1.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de ERBB2 que incluye, pero sin limitarse a, lestaurtinib (CEP-701); AZ-23; indenopirrolocarbazol 12a; oxindol 3; isotiazol 5n; tiazol 20h.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MTOR que incluye, pero sin limitarse a, BEZ235 (NVP-BEZ235); Everólimus (RAD001); Rapamicina (Sirólimus, AY-22989, WY-090217); AZD8055; Temsirólimus (CCI-779, Torisel); PI-103; Ku-0063794; Deforólimus (Ridaforólimus, AP23573, MK-8669); PP242; XL765; GSK1059615; WYE-354; OSI-027; GDC-0980 (RG7422); GSK2126458; PF-05212384 (PKI-587); PF-04691502; Palomid 529 (P529); PP-121; WYE-125132; WYE-687; NVP-BGT226; WAY-600; AZD2014; CH5132799; INK 128; o Torin1.

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de CBL, p. ej., base libre XL-184 (Cabozantinib); R406; Dovitinib-ácido Diláctico (TKI258-ácido Diláctico); Quizartinib (AC220); Tandutinib (MLN518); Amuvatinib (MP-470); ENMD-2076; KW 2449; TG101209; o Dovitinib (TKI-258).

Inhibidores de cinasa

En un caso, el agente anticanceroso es un inhibidor de cinasa. Los inhibidores de cinasa ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, axitinib (AG013736), bosutinib (SKI-606), cediranib (RECENTINTM, AZD2171), dasatinib (SPRYCEL®, BMS-354825), erlotinib (Ta RCEVA®), gefitinib (IRESSA®), imatinib (Gleevec®, CGP57148B, STI-571), lapatinib (TYKERB®, TYVERB®), lestaurtinib (CEP-701), neratinib (HKI-272), nilotinib (TASI^gN^a®), semaxanib (semaxinib, SU5416), sunitinib (SUTENT®, SU11248), toceranib (PALLADIA®), vandetanib, vatalanib (PTK787, PTK/ZK), sorafenib (NEXAVAR®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, lactato de dovitinib (TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOKTM), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, tivozanib (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647 y XL228.

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Axitinib. Axitinib es un inhibidor multidiana de VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRp y c-Kit con CI50 de 0,1 nM, 0,2 nM, 0,1-0,3 nM, 1,6 nM y 1,7 nM, respectivamente. Axitinib tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Bosutinib (SKI-606). Bosutinib (SKI-606) es un novedoso inhibidor doble de Src/Abl con CI50 de 1,2 nM y 1 nM, respectivamente. Bosutinib (SKI-606) tiene la denominación química 4-(2,4-dicloro-5-metoxifenilamino)-6-metoxi-7-(3-(4-metilpiperazin-1 -il)propoxi)quinolin-3-carbonitrilo; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Cediranib. Cediranib (AZD2171) es un inhibidor de VEGFR(KDR) altamente potente con CI50 de <1 nM, también inhibe Flt1/4 con CI50 de 5 nM/<3 nM, actividad similar frente a c-Kit y PDGFRp, 36, 110 veces y >1000 veces más selectivo para VEGFR que para PDGFR-a, CSF-1R y Flt3. Cediranib tiene la denominación química 4-(4-fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-(pirrolidin-1-il)propoxi)quinazolina; y tiene la siguiente estructura:

,

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Dasatinib. Dasatinib es un novedoso y potente inhibidor multidiana que selecciona como diana Abl, Src y c-Kit, con CI50 de <1 nM, 0,5 nM y 79 nM, respectivamente. Dasatinib tiene la denominación química N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-(6-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1 -il)-2-metilpirimidin-4-ilamino)tiazol-5-carboxamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Erlotinib. Erlotinib HCl (OSI-744) es un inhibidor de EGFR con CI50 de 2 nM, >1000 veces más sensible para EGFR que c-Src o v-Abl humanas. Erlotinib tiene la denominación química hidrocloruro de N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Gefitinib. Gefitinib (ZD-1839) es un inhibidor de EGFR para Tyr1173, Tyr992, Tyr1173 y Tyr992 en las células NR6wtEGFR y NR6W con CI50 de 37 nM, 37 nM, 26 nM y 57 nM, respectivamente. Gefitinib tiene la denominación química N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Imatinib. Imatinib es un inhibidor multidiana de v-Abl, c-Kit y PDGFR con CI50 de 0,6 μM, 0,1 μM y 0,1 μM, respectivamente. Imatinib tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es Lestaurtinib. Lestaurtinib es un potente inhibidor de JAK2, FLT3 y T rkA (los valores de CI50 son 0,9, 3 y < 25 nM respectivamente) que previene la fosforilación de STAT5 (CI50 = 20 -30 nM). Presenta actividad antiproliferativa in vitro (CI50 = 30 - 100 nM en células HEL92.1.7) y es eficaz frente a trastornos mieloproliferativos in vivo. Lestaurtinib tiene la denominación química: (9S,10S,12fí)-2,3,9,10,11,12-hexahidro-10-hidroxi-10-(hidroximetil)-9-metil-9,12-epoxi-1 H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1 '-k/]pirrolo[3,4-/][1,6]benzodiazozin-1 -ona; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Sunitinib. Malato de Sunitinib es un inhibidor de RTK multidiana que selecciona como diana VEGFR2 (Flk-1) y PDGFRp con CI50 de 80 nM y 2 nM, y también inhibe c-Kit. Sunitinib tiene la denominación química (Z)-N-(2-(dietilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-iliden)metil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida, ácido (S)-2-hidroxisuccínico; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es ZD6474. Vandetanib (ZD6474) es un inhibidor de VEGFR2 basado en quinazolina, competitivo con ATP y biodisponible por vía oral que se ha demostrado que inhibe tanto la señalización inducida por VEGF en células endoteliales como la angiogénesis inducida por tumores. [1] Vandetanib inhibe VEGFR2, VEGFR3, EGFR y RET a CI50 de 40 nM, 110 nM, 500 nM y 130 nM, respectivamente. Se ha descubierto que inhibe la proliferación celular de células estimuladas por VEGFR (CI50 de 60 nM) y la proliferación de HUVEC estimuladas por EGFR (CI50 de 170 nM). ZD6474 tiene la denominación química: N-(4-bromo-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-((1-metilpiperidin-4-il)metoxi)quinazolin-4-amina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es el tosilato de Sorafenib (también conocido como Bay 43-9006, Nexavar). En un caso, Sorafenib tiene la denominación química: 4-metilbenzenosulfonato de 4-[4-[[[[4-cloro-3-(trifluorometil)fenil]amino]carbonil]amino]fenoxi]-N-metil-2-piridinacarboxamida (1:1); y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Lapatinib. Lapatinib, usado en forma de Ditosilato de Lapatinib, es un potente inhibidor de EGFR y ErbB2 con CI50 de 10,8 y 9,2 nM, respectivamente. Lapatinib tiene la denominación química di4-metilbenzenosulfonato de N-(4-(3-fluorobenciloxi)-3-clorofenil)-6-(5-((2-(metilsulfonil)etilamino)metil)furan-2-il)quinazolin-4-amina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Neratinib. Neratinib (HKI-272) es un inhibidor altamente selectivo de HER2 y EGFR con CI50 de 59 nM y 92 nM; inhibe débilmente KDR y Src, sin inhibición significativa de Akt, CDK1/2/4, IKK-2, MK-2, PDK1, c-Raf y c-Met. Neratinib tiene la denominación química (E)-N-(4-(3-cloro-4-(piridin-2-ilmetoxi)fenilamino)-3-ciano-7-etoxiquinolin-6-il)-4-(dimetilamino)but-2-enamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Nilotinib. Nilotinib (AMN-107) es un inhibidor de Bcr-Abl con CI50 de menos de 30 nM. Nilotinib tiene la denominación química 4-metil-N-(3-(4-metil-1H-imidazol-1-il)-5-(trifluorometil)fenil)-3-(4-(piridin-3-il)pirimidin-2-ilamino)benzamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Semaxanib. Semaxanib (SU5416) es un inhibidor potente y selectivo de VEGFR (Flk-1/KDR) con CI50 de 1,23 mM, 20 veces más selectivo para VEGFR que para PDGFRp, carece de actividad frente a EGFR, InsR y FGFR. Semaxanib tiene la denominación química (3Z)-3-[(3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il)metilen]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Vatalanib. Vatalanib (PTK787) es un inhibidor de VEGFR2/KDR con CI50 de 37 nM, menos potente frente a VEGFR 1 /Flt-1, 18 veces frente a VEGFR3/Flt-4. Vatalanib tiene la denominación química dihidrocloruro de N-(4-clorofenil)-4-(pir'idin-4-ilmetil)ftalazin-1 -amina; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es ENMD-2076. ENMD-2076 tiene actividad selectiva frente a Aurora A y VEGFR(Flt3) con CI50 de 14 nM y 1,86 nM, 25 veces más selectivo para Aurora A que para Aurora B y menos potente con respecto a VEGFR2/KDR y VEGFR3, FGFR1 y FGFR2 y PDGFRa. ENMD-2076 tiene la denominación química (E)-N-(5-metil-1H-pirazol-3-il)-6-(4-metilpiperazin-1-il)-2-estirilpirimidin-4-amina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es PCI-32765 (Ibrutinib). PCI-32765 (Ibrutinib) es un inhibidor de Btk potente y altamente selectivo con CI50 de 0,5 nM, moderadamente potente con respecto a Bmx, CSK, FOR, BRK, HCK, menos potente con respecto a EGFR, Yes, ErbB2, JAK3, etc. PCI-32765 (Ibrutinib) tiene la denominación química (R)-1 -(3-(4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidin-1 -il)prop-2-en-1 -ona; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es Quizartinib. Quizartinib (AC220) es un inhibidor de tirosina cinasa receptora de molécula pequeña que se encuentra actualmente en desarrollo para el tratamiento de leucemia mielógena aguda. Su diana molecular es FLT3, también conocida como CD135, que es un protoncogén. Quizartinib tiene la denominación química 1-(5-(ferc-butil)isoxazol-3-il)-3-(4-(7-(2-morfolinoetoxi)benzo[a(|imidazo[2,1-b]tiazol-2-il)fenil)urea; y tiene la siguiente estructura:

Estructura química de quizartinib

Peso molecular: 560,67.

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es dovitinib-ácido diláctico (TKI258-ácido diláctico). Dovitinib-ácido diláctico es un inhibidor de RTK multidiana, mayoritariamente para la clase III (FLT3/c-Kit) con CI50 de 1 nM/2 nM, también potente con respecto a RTK de clase IV (FGFR1/3) y de clase V (VEGFR1-4) con CI50 de 8-13 nM, menos potente con respecto a InsR, EGFR, c-Met, EphA2, Tie2, IGFR1 y HER2. Dovitinib-ácido diláctico tiene la denominación química: ácido propanoico, 2-hidroxi-, comp. con 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-metil-1-piperazinil)-1H-benzimidazol-2-il]-2(1 H)-quinolinona; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es afatinib (BIBW2992). Afatinib (BIBW2992) inhibe irreversiblemente EGFR/HER2, incluyendo EGFR(wt), EGFR(L858R), EGFR(L858R/T790M) y HER2 con CI50 de 0,5 nM, 0,4 nM, 10 nM y 14 nM, respectivamente; 100 veces más activo frente al mutante de EGFR L858R-T790M resistente a Gefitinib. Afatinib (BIBW2992) tiene la denominación química (S,E)-N-(4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-(tetrahidrofurano-3-iloxi)quinazolin-6-il)-4-(dimetilamino)but-2-enamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es SGX523. SGX-523 es un inhibidor selectivo de Met con CI50 de 4 nM, sin actividad con respecto a BRAFV599E, c-Raf, Abl y p38a. SGX523 tiene la denominación química 6-(6-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-iltio)quinolina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es PF-04217903. PF-04217903 es un inhibidor selectivo de c-Met competitivo con ATP con CI50 de 4,8 nM, susceptible a mutaciones oncogénicas (sin actividad con respecto al mutante Y1230C). PF-04217903 tiene la denominación química 2-(4-(3-(quinolin-6-ilmetil)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piracin-5-il)-1 H-pirazol-1 -il)etanol; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es Dacomitinib. Dacomitinib es un inhibidor de molécula pequeña de segunda generación altamente selectivo y biodisponible por vía oral de la familia de tirosina cinasas (familia ErbB) del pan-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) con potencial actividad antineoplásica. Dacomitinib se une específica e irreversiblemente a e inhibe los subtipos de EGFR humano, dando como resultado la inhibición de la proliferación y la inducción de la apoptosis en células tumorales que expresan EGFR. Los EGFR desempeñan importantes papeles en la proliferación de células tumorales y en la vascularización tumoral y, a menudo, se expresan de manera anormalmente alta o mutan en diversos tipos de células tumorales. Dacomitinib tiene la denominación química (E)-N-(4-((3-cloro-4-fluorofenil)amino)-7-metoxiquinazolin-6-il)-4-(piperidin-1-il)but-2-enamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es BMS-777607. BMS-777607 es un inhibidor relacionado con Met para c-Met, Axl, Ron y Tyro3 con CI50 de 3,9 nM, 1,1 nM, 1,8 nM y 4,3 nM, 40 veces más selectivo para dianas relacionadas con Met frente a Lck, VEGFR-2 y TrkA/B, y una selectividad más de 500 veces mayor frente a todas las demás cinasas receptoras y no receptoras. BMS-777607 tiene la denominación química N-(4-(2-amino-3-cloropiridin-4-iloxi)-3-fluorofenil)-4-etoxi-1-(4-fluorofenil)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-carboxamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Linifanib (ABT-869). Linifanib (ABT-869) es un novedoso y potente inhibidor de VEGFR/PDGFR competitivo con ATP para KDR, CSF-1R, Fit-1/3 y PDGFRp con CI50 de 4 nM, 3 nM, 3 nM/4 nM y 66 nM, respectivamente, mayoritariamente eficaz en células cancerosas mutantes dependientes de cinasa (es decir, FLT3). Linifanib (ABT-869) tiene la denominación química 1-(4-(3-amino-1H-indazol-4-il)fenil)-3-(2-fluoro-5-metilfenil)urea; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Amuvatinib (MP-470). Amuvatinib (MP-470) es un inhibidor potente y multidiana de c-Kit, PDGFRa y Flt3 con CI50 de 10 nM, 40 nM y 81 nM, respectivamente. Amuvatinib (MP-470) tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es BIBF1120 (Nintedanib). Nintedanib es un potente inhibidor triple de angiocinasa para VEGFR1/2/3, FGFR1/2/3 y PDGFRa/p con CI50 de 34 nM/13 nM/13 nM, 69 nM/37 nM/108 nM y 59 nM/65 nM. BIBF1120 tiene la denominación química: (Z)-3-((4-(N-metil-2-(4-metilpiperazin-1-il)acetamido)fenilamino)(fenil)metilen)-2-oxoindolin-6-carboxilato de metilo; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es ponatinib (AP24534). Ponatinib es un novedoso y potente inhibidor multidiana de Abl, PDGFRa, VEGFR2, FGFR1 y Src con CI50 de 0,37 nM, 1,1 nM, 1,5 nM, 2,2 nM y 5,4 nM, respectivamente. Ponatinib tiene la denominación química: 3-(2-(imidazo[1,2-b]piridazin-3-il)etinil)-4-metil-N-(4-((4-metilpiperazin-1 -il)metil)-3-(trifluorometil)fenil)benzamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es DCC-2036 (Rebastinib). DCC-2036 es un inhibidor de Bcr-Abl de control conformacional para Abl1(WT) y Abl1 (T315I) con CI50 de 0,8 nM y 4 nM, también inhibe SRC, LYN, FOR, HCK, KDR, FFT3 y Tie-2, y se observa baja actividad hacia c-Kit. DCC-2036 (Rebastinib) tiene la denominación química 1 -(3-íerc-butil-1 -(quinolin-6-il)-1 H-pirazol-5-il)-3-(2-fluoro-4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-iloxi)fenil)urea; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Daclatasvir (BMS-790052). BMS-790052 es un inhibidor altamente selectivo de NS5A del VHC con CE50 de 9-50 μM, para una amplia gama de genotipos de replicón del VHC y del virus infeccioso de genotipo 2a, JFH-1, en cultivo celular. Daclatasvir (BMS-790052) tiene la denominación química ácido carbámico, N,N'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diilbis[1 H-imidazol-5,2-diil-(2S)-2,1 -pirrolidindiil[(1 S)-1 -(1 -metiletil)-2-oxo-2,1 -etanodiil]]]bis-C,C'-dimetil éster; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es CEP-11981. CEP-11981 es un inhibidor biodisponible por vía oral del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y de tirosina cinasas receptoras Tie2 con potenciales actividades antiangiogénicas y antineoplásicas. CEP-11981 tiene la denominación química 13-isobutil-4-metil-10-(pirimidin-2-ilamino)-4,7,8,13-tetrahidro-1 H-indazolo[5,4-a]pirrolo[3,4-c]carbazol-6(2H)-ona; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es Tivozanib (AV-951). Tivozanib (AV-951) es un inhibidor potente y selectivo de VEGFR para VEGFR1/2/3 con CI50 de 0,21 nM/0,16 nM/0,24 nM, y también inhibe PDGFR y c-Kit, se observa baja actividad frente a FGFR-1, Flt3, c-Met EGFR e IGF-1R. Tivozanib (AV-951) tiene la denominación química 1-(2-cloro-4-(6,7-dimetoxiquinolin-4-iloxi)fenil)-3-(5-metilisoxazol-3-il)urea; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es OSI-930. OSI-930 es un potente inhibidor de Kit, KDR y CSF-1R con CI50 de 80 nM, 9 nM y 15 nM, respectivamente; también potente con respecto a Flt-1, c-Raf y Lck y baja actividad frente a PDGFRa/p, Flt-3 y Abl. OSI-930 tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de cinasa es Cabozantinib. Cabozantinib es un inhibidor de molécula pequeña de las tirosina cinasas c-Met y VEGFR2, y se ha demostrado que reduce el crecimiento tumoral, la metástasis y la angiogénesis. Cabozantinib tiene la denominación química N-(4-((6,7-Dimetoxiquinolin-4-il)oxi)fenil)-N-(4-fluorofenil)ciclopropano-1,1-dicarboxamida; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es XL-647. XL647 es un inhibidor de tirosina cinasa receptora (RTK) de molécula pequeña biodisponible por vía oral con potencial actividad antineoplásica. XL647 se une a e inhibe varias tirosina cinasas receptoras que desempeñan papeles importantes en la proliferación de células tumorales y en la vascularización tumoral, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; ERBB1), el receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2; ERBB2), el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y efrina B4 (EphB4). Esto puede dar como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y la angiogénesis, y la remisión tumoral. XL-647 tiene la denominación química N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-(((3aR,6aS)-2-metiloctahidrociclopenta[c]pirrol-5-il)metoxi)quinazolin-4-amina; y tiene la siguiente estructura:

En algunos casos, el inhibidor de cinasa es XL288. XL288 tiene la siguiente estructura:

Inhibidores de NTRK1

En otros casos, el agente es un inhibidor de NTRK1. En otros casos, el inhibidor de NTRK1 se elige entre: danusertib (P^hA-739358); lestaurtinib (CEP-701); AZ-23; indenopirrolocarbazol 12a; oxindol 3; isotiazol 5n; tiazol 20h.

En algunos casos, el inhibidor de NTRK1 es danusertib (PHA-739358). Danusertib es un inhibidor de cinasa Aurora para Aurora A/B/C con CI50 de 13 nM/79 nM/61 nM, moderadamente potente con respecto a Abl, TrkA, c-RET y FGFR1, y menos potente con respecto a Lck, VEGFR2/3, c-Kit y CDK2. Danusertib tiene la denominación química: (R)-N-(5-(2-metoxi-2-fenilacetil)-1,4,5,6-tetrahidropirrolo[3,4-c]pirazol-3-il)-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzamida; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de NTRK1 es lestaurtinib. Lestaurtinib es un potente inhibidor de JAK2, FLT3 y T rkA (los valores de CI50 son 0,9, 3 y < 25 nM respectivamente) que previene la fosforilación de STAT5 (CI50 = 20 -30 nM). Presenta actividad antiproliferativa in vitro (CI50 = 30 - 100 nM en células HEL92.1.7) y es eficaz frente a trastornos mieloproliferativos in vivo. Lestaurtinib tiene la denominación química: (9S,10S,12fí)-2,3,9,10,11,12-hexahidro-10-hidroxi-10-(hidroximetil)-9-metil-9,12-epoxi-1 H-diindolo[1,2,3-/g:3',2',1 '-k/]pirrolo[3,4-i][1,6]benzodiazozin-1 -ona; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de NTRK1 es PHA-848125 (Milciclib). Milciclib es un inhibidor biodisponible por vía oral de las cinasas dependientes de ciclina (CDK) y del receptor de tropomiosina cinasa A (TRKA), con potencial actividad antineoplásica. El inhibidor de CDK2/TRKA PHA-848125 AC inhibe de forma potente la cinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2) y presenta actividad frente a otras CDK, incluyendo CDK1 y CDK4, además del TRKA. PHA-848125 (Milciclib) tiene la denominación química: N,1,4,4-tetrametil-8-((4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)amino)-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-h]quinazolin-3-carboxamida; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de NTRK1 es K252a. K252a es un análogo de la Estaurosporina (Núm. de cat. 1048) que actúa como un inhibidor de proteína cinasa no selectivo. Inhibe PKA (Ki = 18 nM), PKC (Ki = 25 nM) y PKG (Ki = 20 nM). Inhibe de forma potente CaMK (Ki = 1,8 nM), de forma competitiva con ATP y de forma no competitiva con el sustrato. K252a tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de NTRK1 es AZ-23. AZ-23 es un inhibidor potente y selectivo de tirosina cinasa Trk con CI50 de 2 y 8 nM para TrkA y TrkB, respectivamente; AZ-23 mostró inhibición de la cinasa TrkA y eficacia in vivo en ratones tras la administración por vía oral; tiene potencial de utilidad terapéutica en neuroblastoma y otras múltiples indicaciones de cáncer. AZ-23 tiene la denominación química: 5-cloro-N-[(1S)-1-(5-fluoropiridin-2-il)etil]-N'-(5-propan-2-iloxi-1 H-pirazol-3-il)pirimidin-2,4-diamina; y tiene la siguiente estructura:

En ciertos casos, el inhibidor de NTRK1 es oxindol 3. Oxindol 3 tiene la denominación química: 1,2-dihidro-3H-indol-3-ona; y tiene la siguiente estructura:

En otros casos, el agente anticanceroso es un antagonista de la fusión que inhibe la expresión del ácido nucleico que codifica una fusión descrita en el presente documento. Los ejemplos de tales antagonistas de fusión incluyen moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas antisentido, ribozimas, ARNi, moléculas con triple hélice que hibridan con un ácido nucleico que codifica una fusión descrita en el presente documento, o una región reguladora de la transcripción, y bloquea o reduce la expresión de ARNm de una fusión descrita en el presente documento.

En otros casos, el inhibidor de cinasa se administra combinado con un segundo agente terapéutico o una modalidad terapéutica diferente, p. ej., agentes anticancerosos, y/o combinado con procedimientos quirúrgicos y/o de radiación.

No se pretende que "combinado con" implique que la terapia o los agentes terapéuticos se deban administrar al mismo tiempo y/o formular para su suministro conjunto, aunque estos métodos de administración están dentro del alcance de la divulgación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar simultáneamente con, antes de o posteriormente a uno o más de otras terapias o agentes terapéuticos adicionales. En general, cada agente se administrará a una dosis y/o en una pauta horaria determinada para ese agente. Se apreciará adicionalmente que el agente terapéutico adicional utilizado en esta combinación se puede administrar conjuntamente en una única composición o administrar por separado en diferentes composiciones. La combinación particular que se va a emplear en un régimen tendrá en cuenta la compatibilidad de la composición farmacéutica según la invención con el agente terapéuticamente activo adicional y/o el efecto terapéutico deseado que se vaya a lograr.

Por ejemplo, el segundo agente terapéutico puede ser un agente citotóxico o citostático. Los agentes citotóxicos ilustrativos incluyen agentes antimicrotúbulos, inhibidores de topoisomerasa, o taxanos, antimetabolitos, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, agentes intercalantes, agentes que pueden interferir en una vía de transducción de señales, agentes que promueven la apoptosis y radiación. En otros casos más, los métodos se pueden utilizar combinados con agentes inmunomoduladores, p. ej., IL-1,2 , 4, 6 o 12, o interferón alfa o gamma, o factores de crecimiento de células inmunitarias, tales como GM-CSF.

Se pueden evaluar los agentes anticancerosos, p. ej., inhibidores de cinasa, usados en métodos terapéuticos usando los ensayos de escrutinio descritos en el presente documento. En un caso, los agentes anticancerosos se evalúan en un sistema libre de células, p. ej., un producto lisado celular o en un sistema reconstituido. En otros casos, los agentes anticancerosos se evalúan en una célula en cultivo, p. ej., una célula que expresa la molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En otros casos más, los agentes anticancerosos se evalúan en una célula in vivo (una célula que expresa la molécula de fusión presente en un sujeto, p. ej., un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo).

Los parámetros ilustrativos evaluados incluyen uno o más de:

(ii) un cambio en la actividad cinasa, p. ej., niveles de fosforilación de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento (p. ej., un aumento o disminución de autofosforilación); o un cambio en la fosforilación de una diana de una cinasa;

(iii) un cambio en una actividad de una célula que contiene una fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula tumoral o una célula recombinante), p. ej., un cambio en la proliferación, morfología o tumorogenia de la célula;

(v) un cambio en el nivel, p. ej., nivel de expresión, de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento o de una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento.

En un caso, se evalúa un cambio en un ensayo libre de células en presencia de un agente candidato. Por ejemplo, se pueden detectar una actividad de una molécula de fusión descrita en el presente documento, o la interacción de una molécula de fusión descrita en el presente documento con un ligando aguas abajo.

En otros casos, se detecta un cambio en una actividad de una célula en una célula en cultivo, p. ej., una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En un caso, la célula es una célula recombinante que se modifica para expresar un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento, p. ej., es una célula recombinante transfectada con un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento. La célula transfectada puede mostrar un cambio en respuesta a la molécula de fusión expresada descrita en el presente documento, p. ej., aumento de proliferación, cambios en la morfología, aumento de tumorogenia y/o adquisición de un fenotipo transformado. Se puede detectar un cambio en cualquiera de las actividades de la célula, p. ej., la célula recombinante, en presencia del agente candidato. Por ejemplo, una disminución de una o más de: proliferación, tumorogenia, morfología transformada, en presencia del agente candidato puede ser indicativa de un inhibidor de una molécula de fusión descrita en el presente documento. En otros casos, se detecta un cambio en la actividad de unión o fosforilación como se describe en el presente documento.

En otro caso más, se detecta un cambio en un tumor presente en un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo). En un caso, el modelo animal es un animal que contiene un tumor o un xenoinjerto que comprende células que expresan una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., células tumorogénicas que expresan una molécula de fusión descrita en el presente documento). Los agentes anticancerosos se pueden administrar al sujeto animal y se detecta un cambio en el tumor. En un caso, se evalúa el cambio en el tumor que incluye uno o más de crecimiento tumoral, tamaño tumoral, carga tumoral, supervivencia. Una disminución de uno o más de crecimiento tumoral, tamaño tumoral, carga tumoral o un aumento de supervivencia son indicativos de que el agente candidato es un inhibidor.

Los métodos de escrutinio y los ensayos se describen con más detalle a continuación en el presente documento.

Métodos de escrutinio

En otro aspecto, la divulgación presenta un método, o ensayo, para escrutar agentes que modulan, p. ej., inhiben, la expresión o actividad de una molécula de fusión descrita en el presente documento. El método incluye poner en contacto una molécula de fusión descrita en el presente documento, o una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento, con un agente candidato; y detectar un cambio en un parámetro asociado con una molécula de fusión descrita en el presente documento, p. ej., un cambio en la expresión o una actividad de la molécula de fusión descrita en el presente documento. El método, opcionalmente, puede incluir comparar el parámetro tratado con un valor de referencia, p. ej., una muestra de control (p. ej., comparar un parámetro obtenido de una muestra con el agente candidato con un parámetro obtenido de una muestra sin el agente candidato). En un caso, si se detecta una disminución de la expresión o actividad de la molécula de fusión descrita en el presente documento, el agente candidato se identifica como un inhibidor. En otro caso, si se detecta un incremento de la expresión o actividad de la molécula de fusión descrita en el presente documento, el agente candidato se identifica como un activador. En ciertos casos, la molécula de fusión descrita en el presente documento es una molécula de ácido nucleico o un polipéptido como se describe en el presente documento.

En un caso, la etapa de contacto se efectúa en un sistema libre de células, p. ej., un producto lisado celular o en un sistema reconstituido. En otros casos, la etapa de contacto se efectúa en una célula en cultivo, p. ej., una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En otros casos más, la etapa de contacto se efectúa en una célula in vivo (una célula que expresa la molécula de fusión descrita en el presente documento presente en un sujeto, p. ej., un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo).

Los parámetros ilustrativos evaluados incluyen uno o más de:

(ii) un cambio en la actividad cinasa, p. ej., niveles de fosforilación de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento (p. ej., un aumento o disminución de autofosforilación); o un cambio en la fosforilación de una diana de una cinasa. En ciertos casos, se detecta un cambio en la actividad cinasa, p. ej., fosforilación, por cualquiera de transferencia Western (p. ej., usando un anticuerpo anti-FGFR3 o anti-TACC3; un anticuerpo fosforoespecífico, que detecta una variación en el peso molecular de un polipéptido de fusión FGFR3-TACC3), espectrometría de masas, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, cuentas inmunomagnéticas, entre otros;

En un caso, se evalúa un cambio en un ensayo libre de células en presencia de un agente candidato. Por ejemplo, se puede detectar una actividad de una molécula de fusión descrita en el presente documento, o la interacción de una molécula de fusión descrita en el presente documento con un ligando aguas abajo. En un caso, un polipéptido de fusión descrito en el presente documento se pone en contacto con un ligando, p. ej., en solución, y se supervisa un agente candidato para determinar una capacidad de modular, p. ej., inhibir, una interacción, p. ej., unión, entre el polipéptido de fusión descrito en el presente documento y el ligando. En un ensayo ilustrativo, la proteína de fusión purificada descrita en el presente documento se pone en contacto con un ligando, p. ej., en solución, y se supervisa un agente candidato para determinar una capacidad de inhibir la interacción de la proteína de fusión con el ligando, o de inhibir la fosforilación del ligando por la proteína de fusión. Se puede supervisar un efecto sobre una interacción entre la proteína de fusión y un ligando por métodos conocidos en la técnica, tales como por absorbancia, y se puede someter a ensayo un efecto sobre la fosforilación del ligando, p. ej., por transferencia Western, inmunoprecipitación o microcuentas inmunomagnéticas.

En otros casos, se detecta un cambio en una actividad de una célula en una célula en cultivo, p. ej., una célula que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., una célula de mamífero, una célula o línea celular tumoral, una célula recombinante). En un caso, la célula es una célula recombinante que se modifica para expresar un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento, p. ej., es una célula recombinante transfectada con un ácido nucleico de fusión descrito en el presente documento. La célula transfectada puede mostrar un cambio en respuesta a la molécula de fusión expresada, p. ej., aumento de proliferación, cambios en la morfología, aumento de tumorogenia y/o adquisición de un fenotipo transformado. Se puede detectar un cambio en cualquiera de las actividades de la célula, p. ej., la célula recombinante, en presencia del agente candidato. Por ejemplo, una disminución de una o más de: proliferación, tumorogenia, morfología transformada, en presencia del agente candidato puede ser indicativa de un inhibidor de una molécula de fusión descrita en el presente documento. En otros casos, se detecta un cambio en la actividad de unión o fosforilación como se describe en el presente documento.

En un ensayo basado en células ilustrativo, un ácido nucleico que comprende una molécula de fusión descrita en el presente documento se puede expresar en una célula, tal como una célula (p. ej., una célula de mamífero) en cultivo. La célula que contiene un ácido nucleico que expresa la molécula de fusión se puede poner en contacto con un agente candidato, y la célula se supervisa para determinar un efecto del agente candidato. Se puede determinar que un agente candidato que provoca una disminución de la proliferación celular o muerte celular es un candidato para tratar un tumor (p. ej., un cáncer) que porta una fusión descrita en el presente documento.

En un caso, se puede supervisar una célula que contiene un ácido nucleico que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento para determinar la expresión de la proteína de fusión. Se puede supervisar la expresión de proteínas por métodos conocidos en la técnica, tales como, p. ej., por espectrometría de masas (p. ej., espectrometría de masas en tándem), un ensayo indicador (p. ej., un ensayo basado en fluorescencia), transferencia Western e inmunohistoquímica. Por un método, se detecta una disminución de la expresión de la fusión. Se puede determinar que un agente candidato que provoca una disminución de la expresión de la proteína de fusión en comparación con una célula que no contiene la fusión de ácido nucleico es un candidato para tratar un tumor (p. ej., un cáncer) que porta una fusión descrita en el presente documento.

Se puede supervisar una célula que contiene un ácido nucleico que expresa una molécula de fusión descrita en el presente documento para determinar la alteración de la actividad cinasa. La actividad cinasa se puede someter a ensayo midiendo el efecto de un agente candidato sobre una proteína cinasa diana conocida.

En otro caso más, se detecta un cambio en un tumor presente en un sujeto animal (p. ej., un modelo animal in vivo). En un caso, el modelo animal es un animal que contiene un tumor o un xenoinjerto que comprende células que expresan una molécula de fusión descrita en el presente documento (p. ej., células tumorogénicas que expresan una molécula de fusión descrita en el presente documento). El agente candidato se puede administrar al sujeto animal y se detecta un cambio en el tumor. En un caso, se evalúa el cambio en el tumor que incluye uno o más de crecimiento tumoral, tamaño tumoral, carga tumoral, supervivencia. Una disminución de uno o más de crecimiento tumoral, tamaño tumoral, carga tumoral o un aumento de supervivencia son indicativos de que el agente candidato es un inhibidor.

En un modelo animal ilustrativo, se crea un xenoinjerto inyectando células en un ratón. Se administra un agente candidato al ratón, p. ej., por inyección (tal como inyección subcutánea, intraperitoneal o en la vena de la cola, o por inyección directamente en el tumor) o suministro por vía oral, y se observa el tumor para determinar un efecto del agente anticanceroso candidato. También se supervisa la salud del animal, tal como para determinar si un animal tratado con un agente candidato sobrevive más tiempo. Un agente candidato que provoca que el crecimiento del tumor se ralentice o detenga, o que provoca que el tumor se reduzca de tamaño, o que provoca una reducción de la carga tumoral, o que incrementa el tiempo de supervivencia, se puede considerar que es un candidato para tratar un tumor (p. ej., un cáncer) que porta una fusión descrita en el presente documento.

En otro ensayo animal ilustrativo, las células que expresan una fusión descrita en el presente documento se inyectan en la vena de la cola, p. ej., de un ratón, para inducir metástasis. Se administra un agente candidato al ratón, p. ej., por inyección (tal como inyección subcutánea, intraperitoneal o en la vena de la cola, o por inyección directamente en el tumor) o suministro por vía oral, y se observa el tumor para determinar un efecto del agente anticanceroso candidato. Un agente candidato que inhibe, previene o reduce la metástasis, o aumenta el tiempo de supervivencia, se puede considerar que es un candidato para tratar un tumor (p. ej., un cáncer) que porta una fusión descrita en el presente documento.

La proliferación celular se puede medir por métodos conocidos en la técnica, tales como el ensayo de PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación), la incorporación de 5-bromodesoxiuridina (BrdUrd), el ensayo de Ki-67, la respiración mitocondrial o la tinción con yoduro de propidio. Las células también se pueden medir para determinar la apoptosis, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo TUNEL (Marcaje de Mellas Terminales de dUTP por Desoxinucleótido Transferasa Terminal). Las células también se pueden someter a ensayo para determinar la presencia de angiogénesis usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo la formación de tubos endoteliales o midiendo el crecimiento de vasos sanguíneos del tejido subcutáneo, tal como en un gel sólido de la membrana basal.

En ciertos casos, los métodos de escrutinio descritos en el presente documento se pueden repetir y/o combinar. En una realización, un agente candidato que se evalúa en un sistema libre de células o basado en células descrito en el presente documento se puede someter a prueba adicionalmente en un sujeto animal.

En un caso, el agente candidato se identifica y se vuelve a someter a prueba en el mismo ensayo o uno diferente. Por ejemplo, un compuesto de prueba se identifica en un sistema in vitro o libre de células y se vuelve a someter a prueba en un modelo animal o en un ensayo basado en células. Se puede utilizar cualquier orden o combinación de ensayos. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de alto rendimiento combinado con un modelo animal o cultivo tisular.

Los agentes candidatos adecuados para su uso en los ensayos de escrutinio descritos en el presente documento incluyen, p. ej., compuestos de molécula pequeña, ácidos nucleicos (p. ej., ARNip, aptámeros, ARN de horquilla corta, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, antagomir, miméticos de microARN o ADN, p. ej., para tratamiento génico) o polipéptidos, p. ej., anticuerpos (p. ej., anticuerpos de longitud completa o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, fragmentos Fab o fragmentos scFv). Los agentes anticancerosos candidatos se pueden obtener de una biblioteca (p. ej., una biblioteca comercial) o se pueden diseñar racionalmente, por ejemplo, para seleccionar como diana un sitio activo en un dominio funcional (p. ej., un dominio cinasa).

En otros casos, el método o ensayo incluyen proporcionar una etapa basándose en la generación de señales dependientes de la proximidad, p. ej., un ensayo de dos híbridos que incluya una primera proteína de fusión (p. ej., una proteína de fusión descrita en el presente documento) y una segunda proteína de fusión (p. ej., un ligando), poner en contacto el ensayo de dos híbridos con un compuesto de prueba, en condiciones en donde dicho ensayo de dos híbridos detecta un cambio en la formación y/o estabilidad del complejo, p. ej., la formación del complejo inicia la activación de la transcripción de un gen indicador.

En un ejemplo no limitante, la estructura tridimensional del sitio activo de la molécula de fusión descrita en el presente documento se determina cristalizando el complejo formado por la molécula de fusión y un inhibidor conocido. A continuación, se usa el diseño de fármacos racional para identificar nuevos agentes de prueba realizando alteraciones en la estructura de un inhibidor conocido o diseñando compuestos de molécula pequeña que se unen al sitio activo de la fusión.

Los agentes candidatos se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de los péptidos, pero con una novedosa cadena principal no peptídica que son resistentes a la degradación enzimática pero que, no obstante, siguen siendo bioactivas; véase, p. ej., Zuckermann, R.N. et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas direccionables espacialmente; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de bibliotecas de 'una cuenta, un compuesto'; y métodos de bibliotecas sintéticas que usan selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de bibliotecas biológicas y de bibliotecas de peptoides se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos peptídicos, de oligómero no peptídico o de molécula pequeña (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo, en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.

Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (p. ej., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o sobre cuentas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, Patente de Estados Unidos Núm. 5.223.409), esporas (Patente de Estados Unidos de Ladner Núm. 5.223.409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o sobre fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991). J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner más arriba.).

La interacción entre dos moléculas también se puede detectar, p. ej., usando transferencia de energía por fluorescencia (FET) (véanse, p. ej., Lakowicz et al., Patente de Estados Unidos Núm. 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., Patente de Estados Unidos Núm. 4.868.103). Se selecciona una marca de fluoróforo en la primera molécula 'donadora' de modo que su energía fluorescente emitida sea absorbida por una marca fluorescente en una segunda molécula 'aceptora', que, a su vez, puede emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. De forma alternativa, la molécula de proteína 'donadora' simplemente puede utilizar la energía fluorescente natural de los restos de triptófano. Se eligen marcas que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de modo que la marca de molécula 'aceptora' se pueda diferenciar de la de la 'donadora'. Puesto que la eficacia de la transferencia de energía entre las marcas se relaciona con la distancia que separa las moléculas, se puede valorar la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de la marca de molécula 'aceptora' en el ensayo debe ser máxima. Se puede medir convenientemente un evento de unión por FET a través de medios de detección fluorométrica convencionales conocidos en la técnica (p. ej., usando un fluorímetro).

En otro caso, la determinación de la capacidad de la proteína de fusión de unirse a una molécula diana se puede lograr usando el análisis de interacción biomolecular (BIA) en tiempo real (véanse, p. ej., Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). La "resonancia de plasmón superficial" o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcaje de ninguno de los interactuantes (p. ej., BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (RPS)), lo que da como resultado una señal detectable que se puede utilizar como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Inhibidores de ácido nucleico

En otro caso, un inhibidor de fusión inhibe la expresión de un ácido nucleico que codifica una fusión descrita en el presente documento. Los ejemplos de tales inhibidores de fusión incluyen moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas antisentido, ARNdh, ARNip, ribozimas o moléculas con triple hélice, que hibridan con un ácido nucleico que codifica una fusión descrita en el presente documento, o una región reguladora de la transcripción, y bloquea o reduce la expresión del ARNm de la fusión. En consecuencia, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que son inhibidores de ácido nucleico, p. ej., antisentido, ARNip, ARNi, para una molécula de ácido nucleico que codifica la fusión.

Antisentido

En algunos casos, el inhibidor de la fusión de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico antisentido. Un ácido nucleico "antisentido" puede incluir una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a un ácido nucleico "efector" que codifica una proteína, p. ej., complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria a una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a toda una hebra codificante de fusión, o solo a una porción de la misma. En otro caso, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región no codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica la fusión (p. ej., las regiones no traducidas 5' y 3'). Los agentes antisentido pueden incluir, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleótidos), p. ej., de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleobases, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS) (oligozimas) y otros ARN catalíticos u oligonucleótidos catalíticos cortos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión. Los compuestos antisentido pueden incluir un tramo de al menos ocho nucleobases consecutivas que son complementarias a una secuencia en el gen diana. No es necesario que un oligonucleótido sea 100% complementario a su secuencia de ácido nucleico diana para ser hibridable específicamente. Un oligonucleótido es hibridable específicamente cuando la unión del oligonucleótido a la diana interfiere en la función normal de la molécula diana para provocar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico o, en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.

La hibridación de oligonucleótidos antisentido con ARNm puede interferir en una o más de las funciones normales del ARNm. Las funciones del ARNm con las que se interfiere incluyen todas las funciones clave tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de traducción de la proteína, la traducción de la proteína a partir del ARN, el empalme del ARN para proporcionar una o más especies de ARNm y la actividad catalítica en la que puede estar implicado el ARN. También se puede interferir en la unión de una o varias proteínas específicas al ARN por la hibridación de oligonucleótidos antisentido con el ARN.

Los compuestos antisentido ilustrativos incluyen secuencias de ADN o ARN que hibridan específicamente con el ácido nucleico diana, p. ej., el ARNm que codifica una fusión descrita en el presente documento. La región complementaria se puede extender entre aproximadamente 8 y aproximadamente 80 nucleobases. Los compuestos pueden incluir una o más nucleobases modificadas. Las nucleobases modificadas pueden incluir, p. ej., pirimidinas 5-sustituidas, tales como 5-yodouracilo, 5-yodocitosina, y C5-propinilpirimidinas, tales como C5-propinilcitosina y C5-propiniluracilo. Otras nucleobases modificadas adecuadas incluyen N4--alquilaminocitosinas (C1-C12) y N4,N4--dialquilaminocitosinas (C1-C12). Las nucleobases modificadas también pueden incluir 8-aza-7-desazapurinas 7-sustituidas y 7-desazapurinas 7-sustituidas, tales como, por ejemplo, 7-yodo-7-desazapurinas, 7-ciano-7-desazapurinas, 7-aminocarbonil-7-desazapurinas. Los ejemplos de estas incluyen 6-amino-7-yodo-7-desazapurinas, 6-amino-7-ciano-7-desazapurinas, 6-amino-7-aminocarbonil-7-desazapurinas, 2-amino-6-hidroxi-7-yodo-7-desazapurinas, 2-amino-6-hidroxi-7-ciano-7-desazapurinas y 2-amino-6-hidroxi-7-aminocarbonil-7-desazapurinas. Además, las N6--alquilaminopurinas (C1-C12) y N6,N6--dialquilaminopurinas (C1-C12), incluyendo N6-metilaminoadenina y N6,N6-dimetilaminoadenina también son nucleobases modificadas adecuadas. De forma similar, otras purinas 6-sustituidas que incluyen, por ejemplo, 6-tioguanina pueden constituir nucleobases modificadas apropiadas. Otras nucleobases adecuadas incluyen 2-tiouracilo, 8-bromoadenina, 8-bromoguanina, 2-fluoroadenina y 2-fluoroguanina. También son apropiados los derivados de cualquiera de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente. Los sustituyentes de cualquiera de los compuestos precedentes pueden incluir alquilo C1-C30, alquenilo C2-C30, alquinilo C2-C30, arilo, aralquilo, heteroarilo, halo, amino, amido, nitro, tio, sulfonilo, carboxilo, alcoxi, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo y similares. También están disponibles descripciones de otros tipos de agentes de ácido nucleico. Véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.987.071; 5.116.742; 5.093.246; Woolf et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA; Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); 89:7305-9; Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) Bioassays 14:807-15.

En otro caso más, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico a-anomérico. Una molécula de ácido nucleico a-anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con ARN complementario en los que, al contrario de las unidades b normales, las hebras son paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-ometilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido típicamente se administran a un sujeto (p. ej., por inyección directa en un sitio tisular) o se generan in situ de modo que hibriden con o se unan a ARNm celular y/o ADN genómico que codifique una fusión descrita en el presente documento para inhibir, de este modo, la expresión de la proteína, p. ej., inhibiendo la transcripción y/o la traducción. De forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar para elegir como diana células seleccionadas y, a continuación, administrarse sistémicamente. Para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar de modo que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada, p. ej., conectando las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos en la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también se pueden suministrar a las células usando los vectores descritos en el presente documento. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloque bajo el control de un fuerte promotor de pol II o pol III.

Ribozima

En otro caso, un ácido nucleico antisentido presentado en la divulgación es una ribozima. Una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica la fusión puede incluir una o más secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de un ADNc de fusión divulgado en el presente documento, y una secuencia que tenga una secuencia catalítica conocida responsable de la escisión del ARNm (véase la Patente de Estados Unidos Núm.

5.093.246 o Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591). Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de IVS L-19 de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo sea complementaria a la secuencia de nucleótidos que se va a escindir en un ARNm que codifica la fusión. Véanse, p. ej., Cech et al., Patente de Estados Unidos Núm. 4.987.071; y Cech et al., Patente de Estados Unidos Núm. 5.116.742. De forma alternativa, se puede utilizar ARNm de fusión para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad ribonucleasa específica de un grupo de moléculas de ARN. Véase, p. ej., Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

Moléculas con triple hélice

La inhibición de un gen de fusión descrito en el presente documento se puede lograr seleccionando como diana secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de la fusión para formar estructuras con triple hélice que prevengan la transcripción del gen de fusión en células diana. Véanse, en general, Helene, C. (1991) AnticancerDrug Des. 6:569-84; Helene, C. i (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci.660:27-36; y Maher, L.J. (1992) Bioassays 14:807-15. Las secuencias potenciales que se pueden seleccionar como diana para la formación de la triple hélice se pueden incrementar creando la llamada molécula de ácido nucleico "en zigzag". Las moléculas en zigzag se sintetizan de una manera alterna 5'-3', 3'-5', de modo que se sometan a emparejamiento de bases, en primer lugar, con una hebra de un dúplex y, a continuación, con la otra, eliminando la necesidad de que esté presente un tramo considerable de purinas o bien pirimidinas en una hebra de un dúplex.

ARNdh

En algunos casos, el inhibidor de la fusión de ácido nucleico es una molécula de ARNdh. Los ARNdh que tienen una estructura de dúplex de entre aproximadamente 20 y 23 pares de bases, p. ej., 21 pares de bases, son eficaces para provocar interferencia por ARN (ARNi) (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han descubierto que también pueden ser eficaces estructuras de dúplex de ARN más cortas o más largas (Chu y Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226).

En un caso, el ARNdh no está modificado y no comprende, p. ej., modificaciones químicas y/o conjugaciones conocidas en la técnica o descritas en el presente documento. En otro caso, el ARNdh se modifica químicamente para potenciar la estabilidad u otras características beneficiosas. El ARNdh se puede sintetizar y/o modificar por métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edr.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. Mientras que una secuencia diana de un ARNdh puede tener, en general, aproximadamente 15-30 nucleótidos de longitud, existe una amplia variación en la idoneidad de secuencias particulares en este rango para dirigir la escisión de cualquier ARN diana dado. Diversos paquetes de programa informático y las pautas expuestas en el presente documento proporcionan orientación para la identificación de secuencias diana óptimas para cualquier diana génica dada, pero también se puede adoptar un enfoque empírico en el que una "ventana" o "máscara" de un tamaño dado (como un ejemplo no limitante, 21 nucleótidos) se coloca literal o figurativamente (incluyendo, p. ej., in silico) en la secuencia de ARN diana para identificar secuencias en el rango de tamaños que pueden servir como secuencias diana. Al mover la "ventana" de secuencia progresivamente un nucleótido aguas arriba o aguas abajo de una localización de secuencia diana inicial, se puede identificar la siguiente secuencia diana potencial, hasta que se identifique el conjunto completo de secuencias posibles para cualquier tamaño diana dado seleccionado. Este procedimiento, acoplado con la síntesis sistemática y las pruebas de las secuencias identificadas (usando ensayos como se describe en el presente documento o como es conocido en la técnica) para identificar aquellas secuencias que funcionan de forma óptima, puede identificar aquellas secuencias de ARN que, cuando se seleccionan como diana con una molécula de ARNdh, median la mejor inhibición de la expresión génica diana. Por tanto, aunque las secuencias identificadas en el presente documento representan secuencias diana eficaces, se contempla que se puede lograr otra optimización de la eficacia de inhibición "recorriendo la ventana" progresivamente un nucleótido aguas arriba o aguas abajo de las secuencias dadas para identificar secuencias con características de inhibición iguales o mejores.

En algunos casos, el inhibidor de la fusión de ácido nucleico es una molécula de ARNip. Los ARNip son pequeños ARN de doble hebra (ARNdh) que opcionalmente incluyen protuberancias. Por ejemplo, la región dúplex de un ARNip tiene una longitud de aproximadamente 18 a 25 nucleótidos, p. ej., una longitud de aproximadamente 19, 20, 21,22, 23 o 24 nucleótidos. Típicamente, las secuencias de ARNip son exactamente complementarias al ARNm diana. Los ARNdh y los ARNip, en particular, se pueden utilizar para silenciar la expresión génica en células de mamífero (p. ej., células humanas). Los ARNip también incluyen ARN de horquilla corta (ARNhc) con tallos de 29 pares de bases y protuberancias en 3' de 2 nucleótidos. Véanse, p. ej., Clemens et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6499-6503; Billy et al. (2001) Proc. Natl. Sci. USA 98:14428-14433; Elbashir et al. (2001) Nature.411:494-8; Yang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9942-9947; Siolas et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23(2):227-31; los documentos 20040086884; U.S. 20030166282; 20030143204; 20040038278; y 20030224432.

Modificaciones de moléculas inhibidoras de la fusión de ácidos nucleicos

Un inhibidor de la fusión de ácido nucleico se puede modificar para potenciar u obtener características beneficiosas.

Por ejemplo, un inhibidor de la fusión de ácido nucleico se puede modificar en el radical de la base, el radical de azúcar o la cadena principal de fosfato para mejorar, p. ej., la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Para ejemplos no limitantes de oligonucleótidos sintéticos con modificaciones, véanse Toulme (2001) Nature Biotech. 19:17 y Faria et al. (2001) Nature Biotech. 19:40-44. Tales oligonucleótidos de fosforamidita pueden ser agentes antisentido eficaces.

Una molécula inhibidora de la fusión de ácido nucleico se puede modificar para incluir uno o más ácidos nucleicos con puente (ANP). Un ácido nucleico con puente es un nucleótido que lleva un radical de azúcar restringido conformacionalmente. Los oligonucleótidos que contienen ANP muestran alta afinidad de unión con hebras complementarias de ARN y son más tolerantes a la degradación endonucleolítica y exonucleolítica (Roongjang, S. et al., (2007) Nucleic Acids Symp Ser (Oxf) 51:113-114). Los ANP ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, 2'4'-ANP (también conocido como ANB (véase a continuación); 3'-amino2',4'-ANP, 3',4'-ANP; ANPCOC; AⁿP^ncy ANP(ME). La estructura del ANP influirá en la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico con ADN de hebra sencilla complementario y ADN de doble hebra, así como en su estabilidad enzimática frente a la degradación por nucleasas. La síntesis y purificación de moléculas de ANP se puede realizar usando protocolos convencionales (p. ej., véase Imanishi T, et al., (2002) Chem. Commun. 16: 1653-1659).

En algunos casos, el ácido nucleico se puede modificar para generar ácidos peptidonucleicos (véase Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5-23). Como se emplea en el presente documento, los términos "ácido peptidonucleico" o "APN" se refieren a un mimético de ácido nucleico, p. ej., un mimético de ADN o ARN, en el que la cadena principal de fosfato de desoxirribosa o ribosa se reemplaza por una cadena principal pseudopeptídica y solo se conservan las cuatro nucleobases naturales. La cadena principal neutra de un APN puede permitir la hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. Los APN de moléculas inhibidoras de la fusión de ácido nucleico se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, los APN se pueden utilizar como agentes antisentido, antigénicos, de ARNip o de ARNi para la modulación específica de secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la parada de la transcripción o traducción o inhibiendo la replicación. Los APN de moléculas inhibidoras de la fusión de ácido nucleico también se pueden utilizar en el análisis de mutaciones de un par de bases único en un gen (p. ej., mediante bloqueo de PCR dirigido por APN); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se usan combinados con otras enzimas (p. ej., nucleasas S1 (Hyrup B. et al. (1996) más arriba)); o como sondas o cebadores para secuenciación o hibridación de ADN (Hyrup B. et al. (1996) más arriba; Perry-O'Keefe más arriba).

La síntesis de oligómeros de APN se puede realizar usando protocolos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida como describen Hyrup B. et al. (1996) más arriba y Perry-O'Keefe et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675. Las patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de compuestos de APN incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Los compuestos de APN adicionales adecuados para su uso en moléculas de ARN son descritas, por ejemplo, por Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500.

Las moléculas inhibidoras de la fusión de ácido nucleico también se pueden modificar para incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (ANB). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un radical de azúcar modificado en el que el radical de azúcar comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esta estructura "bloquea" eficazmente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Las moléculas de ácido nucleico que contienen ANB poseen alta afinidad por el ADN y ARN complementarios y mejor discriminación de los emparejamientos erróneos con relación a las moléculas de ácido nucleico no modificadas (Jepson, J., et al., (2004) Oligonucleotides 14:130-146). Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip incrementa la estabilidad del ARNip en suero y reduce los efectos inespecíficos (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Las Patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: Patentes de Estados Unidos Núm. 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; y 7.399.845.

Una molécula inhibidora de la fusión de ácido nucleico también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente "base"). Como se emplea en el presente documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases púricas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados 6-metílicos y otros alquílicos de adenina y guanina, derivados 2-propílicos y otros alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular, 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos 5-sustituidos y citosinas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases incluyen las divulgadas en la Patente de Estados Unidos Núm. 3.687.808, las divulgadas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Flerdewijn, P. ed. Wiley-VCFl, 2008; las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L., ed. John Wiley & Sons, 1990, las divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991,30, 613, y las divulgadas por Sanghvi, Y S., capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son, en particular, útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos presentados en la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6-sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pág. 276-278) y son sustituciones de bases ilustrativas, incluso más en particular cuando se combinan con modificaciones de azúcares 2'-O-metoxietilo.

Las patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de algunas de las nucleobases modificadas señaladas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos señaladas anteriormente Núm. 3.687.808, 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088.

Las modificaciones potencialmente estabilizantes de los extremos de las moléculas inhibidoras de la fusión de ácido nucleico pueden incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidin-2'-O-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil-uridin-3"-fosfato, base dT invertida (idT) y otras. La divulgación de esta modificación se puede encontrar en la Publicación PCT Núm. WO 2011/005861.

En otros casos, la molécula inhibidora de la fusión de ácido nucleico puede incluir otros grupos anexos, tales como péptidos (p. ej., para seleccionar como diana receptores de células anfitrionas in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véanse, p. ej., Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; el documento WO88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, p. ej., el documento WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de escisión desencadenada por hibridación (véase, p. ej., Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, p. ej., Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Con este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula (p. ej., un péptido, un agente de entrecruzamiento desencadenado por hibridación, un agente de transporte o un agente de escisión desencadenada por hibridación).

En algunos casos, las modificaciones a las moléculas de ácido nucleico de fusión pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de extremo, p. ej., modificaciones de extremo 5' (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos) o modificaciones de extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.); modificaciones de bases, p. ej., reemplazo por bases estabilizantes, bases desestabilizantes o bases que se someten a emparejamiento de bases con un repertorio expandido de compañeros, retirada de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones de azúcar (p. ej., en la posición 2' o posición 4') o reemplazo del azúcar; y/o modificaciones de la cadena principal, incluyendo la modificación o el reemplazo de los enlaces fosfodiéster. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico de fusión que contienen cadenas principales modificadas o ningún enlace internucleosídico natural. Las moléculas de ácido nucleico de fusión que tienen cadenas principales modificadas incluyen, entre otras, aquellas que no tienen ningún átomo de fósforo en la cadena principal.

Las cadenas principales de ácido nucleico modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil- y otros alquilfosfonatos que incluyen 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos conectados en 2'-5’ de estos y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósido se conectan de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las Patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de Estados Unidos Núm. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6.239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; y la Patente de Estados Unidos RE39464.

Las cadenas principales de ácido nucleico modificadas que no incluyen ningún átomo de fósforo en las mismas tienen cadenas principales que están formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos mixtos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estas incluyen aquellas que tienen enlaces morfolino (formados, en parte, a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno, formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.

Las patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5,64,562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

Algunos casos incluyen moléculas inhibidoras de la fusión de ácido nucleico con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales de heteroátomos, y, en particular, --CH2--NH--CH2-,

--CH2--N(CH₃)--O--CH2-- [conocida como cadena principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH₃)--CH2--, --CH2--N(CH₃)--N(CH₃)--CH2-- y --N(CH₃)--Ch 2--Ch 2--[en donde la cadena principal de fosfodiéster nativo se representa como --O--P--O--CH2--] de la Patente de Estados Unidos Núm. 5.489.677 referenciada anteriormente, y las cadenas principales de amida de la Patente de Estados Unidos Núm. 5.602.240 referenciada anteriormente.

Las moléculas inhibidoras de la fusión de ácido nucleico modificadas también pueden contener uno o más radicales de azúcar sustituido. Las moléculas de ácido nucleico, p. ej., ARN, pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 sustituido o no sustituido o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Las modificaciones adecuadas ilustrativas incluyen O[(CH2)nO]mCH₃, O(CH2)nOCH₃, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH₃, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH₃)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otros casos, los ARNdh incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH₃, SO2CH₃, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de una molécula de ARN o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de una molécula de ARN y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunos casos, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH₃, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin etal., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ilustrativa es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH₃)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación en el presente documento, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.

Otras modificaciones pueden incluir 2'-metoxi (2'-OCH₃), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones en el ARN de una molécula de ARN, en particular, la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los ARNdh conectados en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Las moléculas de ARN también pueden tener miméticos de azúcar, tales como radicales ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las Patentes de Estados Unidos representativas que ilustran la preparación de tales estructuras de azúcar modificada incluyen, pero no se limitan a, las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920, siendo algunas de titularidad común con la presente solicitud.

Evaluación de sujetos

Los sujetos, p. ej., pacientes, se pueden evaluar para determinar la presencia de una molécula de fusión descrita en el presente documento. Un paciente se puede evaluar, por ejemplo, determinando la secuencia genómica del paciente, p. ej., por un método de NGS. De forma alternativa, o además, la evaluación de un paciente puede incluir el ensayo directo para determinar la presencia de una fusión descrita en el presente documento, en el paciente, tal como mediante un ensayo para detectar un ácido nucleico de fusión (p. ej., ADN o ARN), tal como mediante transferencia Southern, transferencia Northern o RT-PCR, p. ej., qRT-PCR. De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar a un paciente para determinar la presencia de una proteína de fusión, tal como mediante inmunohistoquímica, transferencia Western, inmunoprecipitación o ensayo con cuentas inmunomagnéticas.

La evaluación de un paciente también puede incluir un ensayo citogenético, por ejemplo, mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH), para identificar el reordenamiento cromosómico que da como resultado la fusión. Por ejemplo, para realizar FISH, se puede diseñar al menos una primera sonda etiquetada con una primera marca detectable para seleccionar como diana TACC3, tal como en uno o más exones de TACC3, y se puede diseñar al menos una segunda sonda etiquetada con una segunda marca detectable para seleccionar como diana FGFR3, tal como en uno o más exones de FGFR3 (p. ej., los exones que contienen la parte de la proteína que incluye el dominio tirosina cinasa). La al menos una primera sonda y la al menos una segunda sonda estarán más cerca entre sí en pacientes que portan la fusión FGFR3-TACC3 que en pacientes que no portan la fusión FGFR3-TACC3. Estos métodos se pueden utilizar de manera similar para cualquier fusión descrita en el presente documento.

A continuación, se proporcionan métodos adicionales para la detección de la fusión.

En un aspecto, los resultados de un ensayo clínico, p. ej., un ensayo clínico con éxito o sin éxito, se pueden reutilizar para identificar agentes que seleccionan como diana una fusión descrita en el presente documento. Mediante un método ilustrativo, se puede reevaluar un agente candidato usado en un ensayo clínico para determinar si el agente en el ensayo selecciona como diana una fusión o es eficaz para tratar un tumor que contiene una fusión particular. Por ejemplo, se pueden identificar sujetos que participaron en un ensayo clínico para un agente, tal como un inhibidor de cinasa. Los pacientes que experimentaron una mejoría en los síntomas, p. ej., síntomas de cáncer (p. ej., cáncer de pulmón), tales como reducción del tamaño tumoral o reducción de la tasa de crecimiento tumoral, se pueden evaluar para determinar la presencia de una fusión descrita en el presente documento. Los pacientes que no experimentaron ninguna mejoría en los síntomas del cáncer también se pueden evaluar para determinar la presencia de una fusión descrita en el presente documento. Cuando se descubre que es más probable que los pacientes que portan una fusión descrita en el presente documento respondan al agente de prueba que los pacientes que no portan tal fusión, a continuación, se determina que el agente es una opción de tratamiento apropiada para un paciente que porta la fusión.

La "reevaluación" de los pacientes puede incluir, por ejemplo, determinar la secuencia genómica de los pacientes, o un subconjunto de los pacientes del ensayo clínico, p. ej., mediante un método de NGS. De forma alternativa, o además, la reevaluación de los pacientes puede incluir el ensayo directo para determinar la presencia de una fusión descrita en el presente documento, en el paciente, tal como mediante un ensayo para detectar un ácido nucleico de fusión (p. ej., ARN), tal como por RT-PCR, p. ej., qRT-PCR. De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar a un paciente para determinar la presencia de una proteína de fusión, tal como mediante inmunohistoquímica, transferencia Western, inmunoprecipitación o ensayo con cuentas inmunomagnéticas.

Los ensayos clínicos adecuados para la reutilización como se describe anteriormente incluyen ensayos que someten a prueba inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de múltiples cinasas.

Métodos para la detección de ácidos nucleicos y polipéptidos de fusión

Son conocidos métodos para evaluar un gen de fusión, mutaciones y/o productos génicos para los expertos en la técnica. En un caso, la fusión se detecta en una molécula de ácido nucleico por un método elegido entre uno o más de: ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos basados en amplificación (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), ensayo de PCR-RFLP, PCR en tiempo real, secuenciación, análisis de escrutinio (incluyendo análisis citogenético en metafase por métodos de cariotipo convencionales, FISH (p. ej., FISH de separación), cariotipificación espectral o MFISH, hibridación genómica comparativa), hibridación in situ, SSP, HPLC o genotipificación por espectrometría de masas.

Los métodos ilustrativos adicionales incluyen métodos con "sonda directa" tradicionales, tales como transferencias Southern o hibridación in situ (p. ej., hibridación in situ con fluorescencia (FISH) y FISH más SKY), y se pueden utilizar métodos con "sonda comparativa", tales como hibridación genómica comparativa (CGH), p. ej., CGH basada en ADNc o basada en oligonucleótidos. Los métodos se pueden utilizar en una amplia variedad de formatos incluyendo, pero sin limitarse a, métodos unidos a sustrato (p. ej., membrana o vidrio) o enfoques basados en matrices.

En ciertos casos, los métodos de evaluación incluyen las sondas/cebadores descritos en el presente documento. En un caso, las sondas/cebadores se pueden diseñar para detectar una molécula de fusión descrita en el presente documento o una recíproca de la misma. Las sondas/cebadores son adecuados, p. ej., para la amplificación por FISH o PCR. Para PCR, p. ej., para ampliar una región que incluya un punto de unión de fusión descrito en el presente documento, se pueden diseñar cebadores directos para que hibriden con una secuencia génica de nucleótidos correspondiente a uno de los genes de una fusión descrita en el presente documento, y se pueden diseñar cebadores inversos para que hibriden con una secuencia de nucleótidos correspondiente al segundo gen implicado en la fusión.

Por ejemplo, las sondas/cebadores se pueden diseñar para detectar una fusión FGFR3-TACC3 o una recíproca de la misma. Las sondas/cebadores de FGFR3 pueden hibridar con los nucleótidos que codifican uno o más exones de la proteína FGFR3. Las sondas/cebadores de TACC3 pueden hibridar con los nucleótidos que codifican uno o más exones de la proteína TACC3. Estas sondas/cebadores son adecuados, p. ej., para la amplificación por FISH o PCR.

Las sondas/cebadores descritos anteriormente usan FGFR3-TACC3 como ejemplo, y tales métodos se pueden aplicar fácilmente a cualquiera de las fusiones descritas en el presente documento por un experto en la técnica.

En un caso, se usa análisis de FISH para identificar el reordenamiento cromosómico que da como resultado las fusiones descritas anteriormente. Por ejemplo, para realizar FISH, se puede diseñar al menos una primera sonda etiquetada con un primera marca detectable para seleccionar como diana un primer gen de una fusión descrita en el presente documento, tal como en uno o más exones del gen, y se puede diseñar al menos una segunda sonda etiquetada con una segunda marca detectable para seleccionar como diana un segundo gen de la fusión, tal como en uno o más exones de los genes (p. ej., los exones que contienen la parte de la proteína que incluye el dominio tirosina cinasa). La al menos una primera sonda y la al menos una segunda sonda estarán más cerca entre sí en un sujeto que porta la fusión en comparación con un sujeto que no porta la fusión.

En un enfoque, se usa una variación de un ensayo de FISH, p. ej., "FISH de separación", para evaluar a un paciente. Por este método, se utilizan al menos una sonda que selecciona como diana el punto de unión de fusión y al menos una sonda que selecciona como diana un gen individual de la fusión, p. ej., en uno o más exones y/o intrones del gen. En las células normales, se observarán ambas sondas (o se observará un color secundario debido a la cercana proximidad de los dos genes de la fusión génica), y solo se observará la sonda de un gen único cuando se produzca la translocación. Otras variaciones del método de FISH conocidas en la técnica son adecuadas para evaluar a un paciente.

Por ejemplo, por este método, se utilizan al menos una sonda que selecciona como diana el punto de unión del intrón 17 de FGFR3/intrón 7 de TACC3 y al menos una sonda que selecciona como diana TACC3 (o FGFR3), p. ej., en uno o más exones y/o intrones de TACC3 o FGFR3. En las células normales, se observarán ambas sondas (o se observará un color secundario debido a la cercana proximidad de los genes TACC3 y FGFR3), y solo se observará la sonda de TACC3 cuando se produzca la translocación. Otras variaciones del método de FISH conocidas en la técnica son adecuadas para evaluar a un paciente.

Los métodos de FISH descritos anteriormente en el presente documento usan FGFR3-TACC3 como ejemplo, y tales métodos se pueden aplicar fácilmente a cualquiera de las fusiones descritas en el presente documento por un experto en la técnica.

Se usan sondas que contienen segmentos de ADN que son esencialmente complementarios a las secuencias de bases de ADN existentes en diferentes porciones de los cromosomas. Los ejemplos de sondas útiles de acuerdo con la divulgación, y el marcaje e hibridación de sondas a muestras se describen en dos Patentes de Estados Unidos de Vysis, Inc., Patentes de Estados Unidos Núm. 5.491.224 y 6.277.569 de Bittner, et al.

Se describen protocolos adicionales para la detección por FISH a continuación.

Las sondas cromosómicas típicamente tienen de aproximadamente 50 a aproximadamente 105 nucleótidos de longitud. Las sondas más largas típicamente comprenden fragmentos más pequeños de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las sondas que hibridan con ADN centromérico y ADN específico de locus están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Vysis, Inc. (Downers Grove III.), Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.) o de Cytocell (Oxfordshire, Reino Unido). De forma alternativa, las sondas se pueden preparar de forma no comercial a partir de ADN cromosómico o genómico a través de técnicas convencionales. Por ejemplo, las fuentes de ADN que se pueden utilizar incluyen ADN genómico, secuencias de ADN clonado, híbridos de células somáticas que contienen un, o parte de un, cromosoma (p. ej., un cromosoma humano) junto con el complemento cromosómico normal del anfitrión y cromosomas purificados por citometría de flujo o microdisección. La región de interés se puede aislar a través de clonación o por amplificación específica de sitio por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véanse, por ejemplo, Nath y Johnson, Biotechnic Histochem., 1998, 73(1):6-22, Wheeless et al., Cytometry 1994, 17:319-326 y la Patente de Estados Unidos Núm. 5.491.224.

Las sondas que se van a utilizar hibridan con una región específica de un cromosoma para determinar si está presente una anomalía citogenética en esta región. Un tipo de anomalía citogenética es una deleción. Aunque las deleciones pueden ser de uno o más cromosomas completos, las deleciones normalmente implican la pérdida de parte de uno o más cromosomas. Si toda la región de un cromosoma que está contenida en una sonda se suprime de una célula, normalmente no se producirá la hibridación de esa sonda al ADN de la célula y no estará presente ninguna señal en ese cromosoma. Si la región de un cromosoma que está parcialmente contenida dentro de una sonda se suprime de una célula, todavía se puede producir la hibridación de esa sonda con el ADN de la célula, pero puede estar presente menos de una señal. Por ejemplo, la pérdida de una señal se compara con la hibridación de la sonda con el ADN de las células de control que no contienen las anomalías genéticas que se pretende que las sondas detecten. En algunos casos, se enumeran al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o más células para determinar la presencia de la anomalía citogenética.

Las anomalías citogenéticas que se van a detectar pueden incluir, pero no se limitan a, translocaciones no recíprocas, translocaciones equilibradas, inversiones intracromosómicas, mutaciones puntuales, deleciones, cambios en el número de copias génicas, cambios en el nivel de expresión génica y mutaciones en la línea germinal. En particular, un tipo de anomalía citogenética es una duplicación. Las duplicaciones pueden ser de cromosomas completos o de regiones más pequeñas que un cromosoma completo. Si la región de un cromosoma que está contenida en una sonda se duplica en una célula, la hibridación de esa sonda con el ADN de la célula normalmente producirá al menos una señal adicional en comparación con el número de señales presentes en las células de control sin anomalía de la región cromosómica contenida en la sonda.

Las sondas cromosómicas se marcan de modo que se pueda detectar la región cromosómica con la que hibridan. Las sondas típicamente se marcan directamente con un fluoróforo, una molécula orgánica que emite fluorescencia después de absorber luz de menor longitud de onda/mayor energía. El fluoróforo permite que la sonda se visualice sin una molécula de detección secundaria. Después de fijar covalentemente un fluoróforo a un nucleótido, el nucleótido se puede incorporar directamente en la sonda con técnicas convencionales, tales como desplazamiento de mella, cebado aleatorio y marcaje por PCR. De forma alternativa, los nucleótidos de desoxicitidina dentro de la sonda se pueden transaminar con un conector. A continuación, el fluoróforo se fija covalentemente a los nucleótidos de desoxicitidina transaminados. Véase la Patente de Estados Unidos Núm. 5.491.224.

La Patente de Estados Unidos Núm. 5.491.224 describe el marcaje de sondas como un número de restos de citosina que tienen un marcador fluorescente unido covalentemente a los mismos. El número de bases de citosina marcadas de forma fluorescente es suficiente para generar una señal fluorescente detectable mientras que los segmentos de ADN individuales así marcados conservan esencialmente sus propiedades de unión complementaria (hibridación) específicas con respecto al cromosoma o región cromosómica que se va a detectar. Tales sondas se preparan tomando el segmento de sonda de ADN no marcada, transaminando con un grupo conector una serie de nucleótidos de desoxicitidina en el segmento, uniendo covalentemente un marcador fluorescente a al menos una porción de las bases de desoxicitidina transaminadas.

Las sondas también se pueden marcar por desplazamiento de mella, marcaje de cebadores aleatorio o marcaje por PCR. El marcaje se realiza usando nucleótidos marcados con fluorescencia (directos) o bien hapténicos (indirectos). Los ejemplos representativos y no limitantes de marcas incluyen: AMCA-6-dUTP, CascadeBlue-4-dUTP, Fluoresceína-12-dUTP, Rodamina-6-dUTP, TexasRed-6-dUTP, Cy3-6-dUTP, Cy5-dUTP, Biotina(BIO)-11-dUTP, Digoxigenina(DIG)-11-dUTP o Dinitrofenilo (DNP)-11-dUTP.

Las sondas también se pueden marcar indirectamente con biotina o digoxigenina, o marcar con isótopos radioactivos, tales como 32P y 3H, aunque a continuación se requieren moléculas de detección secundarias o procesamiento posterior para visualizar las sondas. Por ejemplo, una sonda marcada con biotina se puede detectar por avidina conjugada a un marcador detectable. Por ejemplo, la avidina se puede conjugar con un marcador enzimático, tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Los marcadores enzimáticos se pueden detectar en reacciones colorimétricas convencionales usando un sustrato y/o un catalizador para la enzima. Los catalizadores para fosfatasa alcalina incluyen 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y nitroazul de tetrazolio. Se puede utilizar diaminobenzoato como catalizador para la peroxidasa de rábano picante.

Las sondas también se pueden preparar de modo que una marca fluorescente u otra marca no sea parte del ADN antes o durante la hibridación, y se añada después de la hibridación para detectar la sonda hibridada a un cromosoma. Por ejemplo, se pueden utilizar sondas que tengan moléculas antigénicas incorporadas al ADN. Después de la hibridación, estas moléculas antigénicas se detectan usando anticuerpos específicos reactivos con las moléculas antigénicas. Tales anticuerpos pueden incorporar por sí mismos un fluorocromo o se pueden detectar usando un segundo anticuerpo con un fluorocromo unido.

Independientemente de cómo se trate o modifique, el ADN de la sonda se purifica comúnmente para retirar los productos residuales sin reaccionar (p. ej., moléculas de fluorocromo no incorporadas al ADN) antes de su uso en la hibridación.

Antes de la hibridación, las sondas cromosómicas se desnaturalizan de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Las sondas se pueden hibridar o reasociar con el ADN cromosómico en condiciones de hibridación. Las "condiciones de hibridación" son condiciones que facilitan la reasociación entre una sonda y el ADN cromosómico diana. Puesto que la reasociación de diferentes sondas variará dependiendo de la longitud de la sonda, la concentración de base y similares, la reasociación se facilita variando la concentración de sonda, la temperatura de hibridación, la concentración de sal y otros factores bien conocidos en la técnica.

Las condiciones de hibridación se facilitan variando las concentraciones, las composiciones de base, las complejidades y las longitudes de las sondas, así como las concentraciones de sal, las temperaturas y la duración de la incubación. Por ejemplo, las hibridaciones in situ típicamente se realizan en un tampón de hibridación que contiene 1 -2x SSC, 50-65% de formamida y ADN de bloqueo para suprimir la hibridación no específica. En general, las condiciones de hibridación, como se describe anteriormente, incluyen temperaturas de aproximadamente 25°C a aproximadamente 55°C, y duraciones de incubación de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 96 horas.

La unión no específica de las sondas cromosómicas al ADN fuera de la región diana se puede retirar mediante una serie de lavados. La temperatura y la concentración de sal en cada lavado se varían para controlar la rigurosidad de los lavados. Por ejemplo, para condiciones muy rigurosas, los lavados se pueden llevar a cabo de aproximadamente 65°C a aproximadamente 80°C, usando de 0,2x a aproximadamente 2x SSC, y de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% de un detergente no iónico, tal como Nonidet P-40 (NP40). La rigurosidad se puede reducir disminuyendo la temperatura de los lavados o incrementando la concentración de sal en los lavados. En algunas aplicaciones es necesario bloquear la capacidad de hibridación de secuencias repetitivas. Por tanto, en algunos casos, se utiliza ARNt, ADN genómico humano o ADN Cot-I para bloquear la hibridación no específica. Después del lavado, se permite que el portaobjetos se drene y se seque al aire, a continuación, se aplican al portaobjetos el medio de montaje, una contratinción, tal como DAPI, y un cubreobjetos. Los portaobjetos se pueden visualizar inmediatamente o almacenar a -20°C antes del examen.

Para las sondas fluorescentes utilizadas en técnicas de hibridación in situ con fluorescencia (FISH), la fluorescencia se puede visualizar con un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro apropiado para cada fluoróforo, o utilizando conjuntos de filtros de paso de banda doble o triple para observar múltiples fluoróforos. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm. 5.776.688. De forma alternativa, se pueden utilizar técnicas, tales como citometría de flujo para examinar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas.

En los métodos de CGH, una primera colección de ácidos nucleicos (p. ej., de una muestra, p. ej., un posible tumor) se marca con un primera marca, mientras que una segunda colección de ácidos nucleicos (p. ej., un control, p. ej., de una célula/tejido sano) se marca con una segunda marca. La razón de hibridación de los ácidos nucleicos se determina por la razón de las dos (primera y segunda) marcas que se unen a cada fibra en la matriz. Cuando existan deleciones o multiplicaciones cromosómicas, se detectarán diferencias en la razón de las señales de las dos marcas y la razón proporcionará una medida del número de copias. La CGH basada en matrices también se puede realizar con marcaje de color único (a diferencia del marcaje del control y la posible muestra tumoral con dos tintes diferentes y el mezclado de los mismos antes de la hibridación, lo que proporcionará una razón debida a la hibridación competitiva de las sondas en las matrices). En la CGH de un color único, el control se marca e hibrida con una matriz y se leen las señales absolutas, y la posible muestra tumoral se marca y se hibrida con una segunda matriz (con contenido idéntico) y se leen las señales absolutas. La diferencia en el número de copias se calcula basándose en señales absolutas de las dos matrices.

Los protocolos de hibridación adecuados para su uso con los métodos presentados en la divulgación son descritos, p. ej., por Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; Pub. EPO Núm. 430.402; Methods in Molecular Biology, vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994), etc. En un caso, se utiliza el protocolo de hibridación de Pinkel et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211, o de Kallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992). Se describe la CGH basada en matrices en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.455.258.

En otro caso más, se pueden utilizar ensayos basados en amplificación para medir la presencia/ausencia y el número de copias. En tales ensayos basados en amplificación, las secuencias de ácido nucleico actúan como molde en una reacción de amplificación (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En una amplificación cuantitativa, la cantidad de producto de amplificación será proporcional a la cantidad de molde en la muestra original. La comparación con controles apropiados, p. ej., tejido sano, proporciona una medida del número de copias.

Los métodos de amplificación "cuantitativa" son bien conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la PCR cuantitativa implica coamplificar simultáneamente una cantidad conocida de una secuencia de control utilizando los mismos cebadores. Esto proporciona un patrón interno que se puede utilizar para calibrar la reacción de PCR. Los protocolos detallados para la PCR cuantitativa son proporcionados por Innis, et al. (1990) en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.). La medición del número de copias de ADN en locus de microsatélites utilizando análisis por PCR cuantitativa es descrita por Ginzonger, et al. (2000) en Cancer Research 60:5405-5409. La secuencia de ácido nucleico conocida para los genes es suficiente para posibilitar que un experto en la técnica seleccione cebadores de forma rutinaria para amplificar cualquier porción del gen. También se puede utilizar la PCR cuantitativa fluorogénica. En la PCR cuantitativa fluorogénica, la cuantificación se basa en la cantidad de señales de fluorescencia, p. ej., TaqMan y SYBR Green.

Otros métodos de amplificación adecuados incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la ligasa (FCR) (véanse Wu y Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077, y Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), amplificación transcripcional (Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), replicación de secuencias autosostenida (Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), PCR por puntos y PCR con adaptador de conector, etc.

Muestras de ácido nucleico

Una variedad de muestras tisulares puede ser la fuente de las muestras de ácido nucleico utilizadas en los presentes métodos. Los fragmentos de ADN genómico o subgenómico se pueden aislar de la muestra de un sujeto (p. ej., una muestra tumoral, un tejido adyacente normal (NAT), una muestra de sangre o cualquier control normal)). En ciertos casos, la muestra tisular se conserva como una muestra congelada o como una preparación tisular fijada con formaldehído o paraformaldehído e incluida en parafina (FFPE). Por ejemplo, la muestra se puede incluir en una matriz, p. ej., un bloque FFPE o una muestra congelada. La etapa de aislamiento puede incluir la separación por flujo de cromosomas individuales; y/o microdisección de la muestra de un sujeto (p. ej., una muestra tumoral, un NAT, una muestra de sangre).

Los protocolos para el aislamiento de ADN de una muestra tisular son conocidos en la técnica. Los métodos adicionales para aislar ácidos nucleicos (p. ej., ADN) de tejidos fijados con formaldehído o paraformaldehído e incluidos en parafina (FFPE), son divulgados, p. ej., por Cronin M. et al., (2004) en Am J Pathol. 164(1):35-42; Masuda N. et al., (1999) en Nucleic Acids Res. 27(22):4436-4443; Specht K. et al., (2001) en Am J Pathol.

158(2):419-429, Ambion RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Protocol (Ambion, Núm. de cat. AM1975, septiembre de 2008) y QIAamp® DNA FFPE Tissue Handbook (Qiagen, Núm. de cat. 37625, octubre de 2007). El RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit utiliza xileno a temperaturas elevadas para solubilizar muestras incluidas en parafina y un filtro de fibra de vidrio para capturar ácidos nucleicos. El QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit utiliza la tecnología QIAamp® DNA Micro para la purificación de ADN genómico y mitocondrial.

Las muestras de ácido nucleico aislado (p. ej., muestras de ADN genómico) se pueden fragmentar o cortar poniendo en práctica técnicas rutinarias. Por ejemplo, el ADN genómico se puede fragmentar por métodos de corte físico, métodos de escisión enzimática, métodos de escisión química y otros métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. La biblioteca de ácidos nucleicos puede contener toda o sustancialmente toda la complejidad del genoma. El término "sustancialmente toda" en este contexto se refiere a la posibilidad de que, en la práctica, pueda existir una pérdida no deseada de la complejidad genómica durante las etapas iniciales del procedimiento. Los métodos descritos en el presente documento también son útiles en los casos donde la biblioteca de ácidos nucleicos es una porción del genoma, es decir, donde la complejidad del genoma se reduce por diseño. En algunos casos, se puede utilizar cualquier porción seleccionada del genoma con los métodos descritos en el presente documento. En ciertos casos, se aísla todo el exoma o un subconjunto del mismo.

Los métodos pueden incluir adicionalmente aislar una muestra de ácido nucleico para proporcionar una biblioteca (p. ej., una biblioteca de ácidos nucleicos). En ciertos casos, la muestra de ácido nucleico incluye fragmentos genómicos completos, subgenómicos, o ambos. Las muestras de ácido nucleico aislado se pueden utilizar para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos. Por tanto, en un caso, los métodos presentados en la divulgación incluyen adicionalmente aislar una muestra de ácido nucleico para proporcionar una biblioteca (p. ej., una biblioteca de ácidos nucleicos como se describe en el presente documento). Los protocolos para aislar y preparar bibliotecas a partir de fragmentos genómicos completos o subgenómicos son conocidos en la técnica (p. ej., el kit de preparación de muestras de ADN genómico de Illumina). En ciertos casos, el fragmento de ADN genómico o subgenómico se aísla de la muestra de un sujeto (p. ej., una muestra tumoral, un tejido adyacente normal (NAT), una muestra de sangre o cualquier control normal)). En un caso, la muestra (p. ej., el tumor o muestra de NAT) es una muestra conservada. Por ejemplo, la muestra se incluye en una matriz, p. ej., un bloque FFPE o una muestra congelada. En ciertos casos, la etapa de aislamiento incluye la separación por flujo de cromosomas individuales; y/o microdisección de la muestra de un sujeto (p. ej., una muestra tumoral, un NAT, una muestra de sangre). En ciertos casos, la muestra de ácido nucleico utilizada para generar la biblioteca de ácidos nucleicos es de menos de 5, de menos de 1 microgramo, de menos de 500 ng, de menos de 200 ng, de menos de 100 ng, de menos de 50 ng o de menos de 20 ng (p. ej., de 10 ng o menos).

En otros casos más, la muestra de ácido nucleico utilizada para generar la biblioteca incluye ARN o ADNc derivado de ARN. En algunos casos, el ARN incluye ARN celular total. En otros casos, se han agotado determinadas secuencias de ARN abundante (p. ej., ARN ribosómico). En algunos casos, se ha enriquecido la fracción de ARNm con cola de poli(A) en la preparación de ARN total. En algunos casos, el ADNc se produce por métodos de síntesis de ADNc con cebado aleatorio. En otros casos, la síntesis de ADNc se inicia en la cola de poli(A) de los ARNm maduros cebando mediante oligonucleótidos que contienen oligo(dT). Los métodos para el agotamiento, el enriquecimiento de poli(A) y la síntesis de ADNc son bien conocidos para los expertos en la técnica.

El método puede incluir adicionalmente la amplificación de la muestra de ácido nucleico (p. ej., muestra de ADN o ARN) por métodos de amplificación de ácidos nucleicos específicos o no específicos que son bien conocidos para los expertos en la técnica. En algunos casos, en ciertos casos, la muestra de ácido nucleico se amplifica, p. ej., por métodos de amplificación del genoma completo, tales como amplificación por desplazamiento de hebra con cebado aleatorio.

En otros casos, la muestra de ácido nucleico se fragmenta o corta por métodos físicos o enzimáticos y se liga a adaptadores sintéticos, se selecciona por tamaño (p. ej., por electroforesis en gel preparativa) y se amplifica (p. ej., por PCR). En otros casos, el grupo de ácidos nucleicos fragmentado y ligado a adaptador se utiliza sin selección de tamaño explícita o amplificación antes de la selección de híbridos.

En otros casos, el ADN aislado (p. ej., el ADN genómico) se fragmenta o corta. En algunos casos, la biblioteca incluye menos de 50% de ADN genómico, tal como una subfracción de ADN genómico que es una representación reducida o una porción definida de un genoma, p. ej., que se ha subfraccionado por otros medios. En otros casos, la biblioteca incluye todo o sustancialmente todo el ADN genómico.

En algunos casos, la biblioteca incluye menos de 50% de ADN genómico, tal como una subfracción de ADN genómico que es una representación reducida o una porción definida de un genoma, p. ej., que se ha subfraccionado por otros medios. En otros casos, la biblioteca incluye todo o sustancialmente todo el ADN genómico. Los protocolos para aislar y preparar bibliotecas a partir de fragmentos genómicos completos o subgenómicos son conocidos en la técnica (p. ej., el kit de preparación de muestras de ADN genómico de Illumina). Los métodos de corte de ADN alternativos pueden ser más automatizables y/o más eficaces (p. ej., con muestras FFPE degradadas). También se pueden utilizar alternativas a los métodos de corte de ADN para evitar una etapa de ligación durante la preparación de bibliotecas.

Los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar utilizando una pequeña cantidad de ácidos nucleicos, p. ej., cuando la cantidad de ADN origen es limitante (p. ej., incluso después de la amplificación del genoma completo). En un caso, el ácido nucleico comprende menos de aproximadamente 5 gg, 4 gg, 3 gg, 2 gg, 1 gg, 0,8 gg, 0,7 gg, 0,6 gg, 0,5 gg o 400 ng, 300 ng, 200 ng, 100 ng, 50 ng o 20 ng o menos de muestra de ácido nucleico. Por ejemplo, para preparar 500 ng de ácidos nucleicos listos para la hibridación, típicamente se comienza con 3 gg de a Dn genómico. Sin embargo, se puede empezar con menos si se amplifica el ADN genómico (p. ej., utilizando PCR) antes de la etapa de hibridación en solución. Por tanto, es posible, pero no esencial, amplificar el ADN genómico antes de la hibridación en solución.

En algunos casos, se genera una biblioteca utilizando ADN (p. ej., ADN genómico) de un tejido de muestra, y se genera una biblioteca correspondiente con ARN (o ADNc) aislado del mismo tejido de muestra.

Diseño de cebos

Un cebo puede ser una molécula de ácido nucleico, p. ej., una molécula de ADN o ARN, que puede hibridar (p. ej., ser complementaria a) y, de este modo, permitir la captura de un ácido nucleico diana. En un caso, un cebo es una molécula de ARN. En otros casos, un cebo incluye una entidad de unión, p. ej., una etiqueta de afinidad, que permite la captura y separación, p. ej., uniéndose a una entidad de unión, de un híbrido formado por un cebo y un ácido nucleico hibridado con el cebo. En un caso, un cebo es adecuado para la hibridación en fase de solución.

Los cebos se pueden producir y utilizar por métodos y condiciones de hibridación como describen el documento US 2010/0029498 y Gnirke, A. et al. (2009) en Nat Biotechnol. 27(2): 182-189, y el documento USSN 61/428.568, presentado el 30 de diciembre de 2010. Por ejemplo, se pueden producir cebos de ARN biotinilado obteniendo un grupo de oligonucleótidos largos sintéticos, sintetizados originalmente en una micromatriz, y amplificando los oligonucleótidos para producir las secuencias de cebo. En algunos casos, los cebos se producen añadiendo una secuencia de promotor de ARN polimerasa a un extremo de las secuencias de cebo y sintetizando secuencias de ARN utilizando ARN polimerasa. En un caso, las bibliotecas de oligodesoxinucleótidos sintéticos se pueden obtener de proveedores comerciales, tales como Agilent Technologies, Inc., y amplificar utilizando métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos.

Cada secuencia de cebo puede incluir una secuencia de cebo específica de diana (p. ej., una específica de miembro) y colas universales en cada extremo. Como se emplea en el presente documento, el término "secuencia de cebo" se puede referir a la secuencia de cebo específica de la diana o a todo el oligonucleótido, incluyendo la "secuencia de cebo" específica de la diana y otros nucleótidos del oligonucleótido. En un caso, un cebo específico de la diana hibrida con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico en un intrón de un gen de una fusión descrita en el presente documento, en un intrón del otro gen de una fusión descrita en el presente documento, o un punto de unión de fusión que une los intrones. En un caso, el cebo es un oligonucleótido de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, de los que 170 nucleótidos son una "secuencia de cebo" específica de la diana. Los otros 30 nucleótidos (p. ej., 15 nucleótidos en cada extremo) son colas arbitrarias universales utilizadas para la amplificación por PCR. Las colas pueden ser cualquier secuencia seleccionada por el usuario.

Las secuencias de cebo descritas en el presente documento se pueden utilizar para la selección de exones y secuencias diana cortas. En un caso, el cebo tiene entre aproximadamente 100 nucleótidos y 300 nucleótidos de longitud. En otro caso, el cebo tiene entre aproximadamente 130 nucleótidos y 230 nucleótidos de longitud. En otro caso más, el cebo tiene entre aproximadamente 150 nucleótidos y 200 nucleótidos de longitud. Las secuencias específicas de la diana en los cebos, p. ej., para la selección de exones y secuencias diana cortas, tienen entre aproximadamente 40 nucleótidos y 1000 nucleótidos de longitud. En un caso, la secuencia específica de la diana tiene entre aproximadamente 70 nucleótidos y 300 nucleótidos de longitud. En otro caso, la secuencia específica de la diana tiene entre aproximadamente 100 nucleótidos y 200 nucleótidos de longitud. En otro caso más, la secuencia específica de la diana tiene entre aproximadamente 120 nucleótidos y 170 nucleótidos de longitud.

Secuenciación

La divulgación también incluye métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. En un caso, se puede utilizar cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente al menos una porción de una molécula de fusión descrita en el presente documento. En un caso, la secuencia de fusión se compara con una secuencia de referencia (control) correspondiente.

En un caso, la secuencia de la molécula de ácido nucleico de fusión se determina por un método que incluye uno o más de: hibridar un oligonucleótido, p. ej., un oligonucleótido específico de alelo para una alteración descrita en el presente documento con dicho ácido nucleico; hibridar un cebador, o un conjunto de cebadores (p. ej., un par de cebadores), que amplifica una región que comprende la mutación o un punto de unión de fusión del alelo; amplificar, p. ej., amplificar específicamente, una región que comprende la mutación o un punto de unión de fusión del alelo; fijar un oligonucleótido adaptador a un extremo de un ácido nucleico que comprende la mutación o un punto de unión de fusión del alelo; generar una señal óptica, p. ej., una colorimétrica, específica de la presencia de uno de la mutación o punto de unión de fusión; hibridar un ácido nucleico que comprende la mutación o punto de unión de fusión con un segundo ácido nucleico, p. ej., un segundo ácido nucleico fijado a un sustrato; generar una señal, p. ej., una señal eléctrica o fluorescente, específica de la presencia de la mutación o punto de unión de fusión; e incorporar un nucleótido al oligonucleótido que híbrida con un ácido nucleico que contiene la mutación o punto de unión de fusión.

En otro caso, la secuencia se determina por un método que comprende uno o más de: determinación de la secuencia de nucleótidos a partir de una molécula de ácido nucleico individual, p. ej., donde una señal correspondiente a la secuencia se obtiene de una molécula única, a diferencia, p. ej., de una suma de señales de una pluralidad de moléculas expandidas clonalmente; determinación de la secuencia de nucleótidos de sustitutos expandidos clonalmente para moléculas de ácido nucleico individuales; secuenciación masiva en paralelo de lecturas cortas; secuenciación basada en moldes; pirosecuenciación; secuenciación en tiempo real que comprende la formación de imágenes de la incorporación continua de nucleótidos marcados con tinte durante la síntesis de ADN; secuenciación por nanoporos; secuenciación por hibridación; secuenciación basada en matrices de nanotransistores; secuenciación polony; secuenciación basada en microscopia de efecto túnel de barrido (STM); o secuenciación basada en sensores moleculares de nanocables.

Se puede utilizar cualquier método de secuenciación conocido en la técnica. Las reacciones de secuenciación ilustrativas incluyen aquellas basadas en mecanismos desarrollados por Maxam y Gilbert (Proc. NatlAcad Sci USA (1977) 74:560) o Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci 74:5463). Se puede utilizar cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan los ensayos (Biotechniques (1995) 19:448), incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.547.835 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. w O 94/16101, titulada DNA Sequencing by Mass Spectrometry de H. Koster; la Patente de Estados Unidos Núm. 5.547.835 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 94/21822, titulada DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via Exonuclease Degradation de H. Koster), y la Patente de Estados Unidos Núm. 5.605.798 y la Solicitud de Patente Internacional Núm. PCT/US96/03651, titulada DNA Diagnostics Based on Mass Spectrometry de H. Koster; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159).

La secuenciación de moléculas de ácido nucleico también se puede llevar a cabo utilizando secuenciación de nueva generación (NGS). La secuenciación de nueva generación incluye cualquier método de secuenciación que determine la secuencia de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico individuales o bien sustitutos expandidos clonalmente para moléculas de ácido nucleico individuales en una forma altamente paralela (p. ej., se secuencian simultáneamente más de 105 moléculas). En un caso, la abundancia relativa de las especies de ácido nucleico en la biblioteca se puede estimar contando el número relativo de apariciones de sus secuencias afines en los datos generados por el experimento de secuenciación. Son conocidos métodos de secuenciación de nueva generación en la técnica y son descritos, p. ej., por Metzker, M. (2010) en Nature Biotechnology Reviews 11:31 -46.

En un caso, la secuenciación de nueva generación permite la determinación de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico individual (p. ej., Helicos BioSciences’ HeliScope Gene Sequencing System y Pacific Biosciences’ PacBio RS System). En otros casos, el método de secuenciación determina la secuencia de nucleótidos de sustitutos expandidos clonalmente para moléculas de ácido nucleico individuales (p. ej., el secuenciador Solexa, Illumina Inc., San Diego, California; 454 Life Sciences (Branford, Conn.) e Ion Torrent), p. ej., secuenciación masiva en paralelo de lecturas cortas (p. ej., el secuenciador Solexa, Illumina Inc., San Diego, Calif.), que genera más bases de secuencia por unidad de secuenciación que otros métodos de secuenciación que generan menos lecturas, pero más largas. Otros métodos o máquinas para la secuenciación de nueva generación incluyen, pero no se limitan a, los secuenciadores proporcionados por 454 Life Sciences (Branford, Conn.), Applied Biosystems (Foster City, Calif.; secuenciador SOLiD) y Helicos BioSciences Corporation (Cambridge, Mass.).

Las plataformas para la secuenciación de nueva generación incluyen, pero no se limitan a Roche/454’s Genome Sequencer (GS) FLX System, Illumina/Solexa’ Genome Analyzer (GA), Life/APG’s Support Oligonucleotide Ligation Detection (SOLID) System, Polonator’s G.007 System, Helicos BioSciences’ HeliScope Gene Sequencing System y Pacific Biosciences’ PacBio RS System.

Las tecnologías de NGS pueden incluir una o más etapas, p. ej., preparación de moldes, secuenciación y formación de imágenes y análisis de datos.

Preparación de moldes

Los métodos para la preparación de moldes pueden incluir etapas tales como romper aleatoriamente ácidos nucleicos (p. ej., ADN genómico o ADNc) en tamaños más pequeños y generar moldes de secuenciación (p. ej., moldes de fragmentos o moldes de pares de parejas). Los moldes separados espacialmente se pueden fijar o inmovilizar a una superficie o soporte sólido, lo que permite que se realicen simultáneamente cantidades masivas de reacciones de secuenciación. Los tipos de moldes que se pueden utilizar para las reacciones de NGS incluyen, p. ej., moldes amplificados clonalmente que se originan a partir de moléculas de ADN únicas y moldes de moléculas de ADN únicas.

Los métodos para preparar moldes amplificados clonalmente incluyen, p. ej., PCR en emulsión (emPCR) y amplificación en fase sólida.

Se puede utilizar emPCR para preparar moldes para NGS. Típicamente, se genera una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico y los adaptadores que contienen sitios de cebado universal se ligan a los extremos del fragmento. A continuación, los fragmentos se desnaturalizan en hebras únicas y se capturan por medio de cuentas. Cada cuenta captura una única molécula de ácido nucleico. Después de la amplificación y el enriquecimiento de las cuentas de emPCR, se puede fijar o inmovilizar una gran cantidad de moldes en un gel de poliacrilamida en un portaobjetos de microscopio convencional (p. ej., Polonator), entrecruzar químicamente a una superficie de vidrio recubierta de amino (p. ej., Life/APG; Polonator), o depositar en pocillos individuales de PicoTiterPlate (PTP) (p. ej., Roche/454), en los que se puede realizar la reacción de NGS.

También se puede utilizar amplificación en fase sólida para producir moldes para NGS. Típicamente, los cebadores directo e inverso se fijan covalentemente a un soporte sólido. La densidad superficial de los fragmentos amplificados se define por la proporción de los cebadores con respecto a los moldes en el soporte. La amplificación en fase sólida puede producir cientos de millones de agrupamientos de moldes separados espacialmente (p. ej., Illumina/Solexa). Los extremos de los agrupamientos de moldes pueden hibridar con cebadores de secuenciación universales para reacciones de NGS.

Otros métodos para preparar moldes amplificados clonalmente también incluyen, p. ej., Amplificación de Desplazamiento Múltiple (MDA) (Lasken R. S. Curr Opin Microbiol. 2007; 10(5):510-6). La MdA es una técnica de amplificación de ADN no basada en PCR. La reacción implica hibridar cebadores de hexámeros aleatorios con el molde y la síntesis de ADN por una enzima de alta fidelidad, típicamente 029, a una temperatura constante. La MDA puede generar productos de gran tamaño con menor frecuencia de errores.

Los métodos de amplificación de moldes, tales como PCR, se pueden acoplar con plataformas de NGS para seleccionar como diana o enriquecer regiones específicas del genoma (p. ej., exones). Los métodos ilustrativos de enriquecimiento de moldes incluyen, p. ej., tecnología de PCR con microgotículas (Tewhey R. etal., Nature Biotech.

2009, 27:1025-1031), micromatrices de oligonucleótidos diseñadas a medida (p. ej., micromatrices de oligonucleótidos de Roche/NimbleGen) y métodos de hibridación basada en solución (p. ej., sondas de inversión molecular (MIP) (Porreca G. J. et al., Nature Methods, 2007, 4:931-936; Krishnakumar S. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2008, 105:9296-9310; Turner E. H. et al., Nature Methods, 2009, 6:315-316), y secuencias de captura de ARN biotinilado (Gnirke A. et al., Nat. Biotechnol. 2009; 27(2):182-9).

Los moldes de molécula única son otro tipo de moldes que se pueden utilizar para la reacción de NGS. Los moldes de molécula única separados espacialmente se pueden inmovilizar sobre soportes sólidos por diversos métodos. En un enfoque, las moléculas de cebador individuales se fijan covalentemente al soporte sólido. Se añaden adaptadores a los moldes y, a continuación, los moldes hibridan con los cebadores inmovilizados. En otro enfoque, los moldes de molécula única se fijan covalentemente al soporte sólido cebando y extendiendo moldes de hebra sencillas de molécula única a partir de cebadores inmovilizados. A continuación, los cebadores universales hibridan con los moldes. En otro enfoque más, las moléculas de polimerasa únicas se fijan al soporte sólido, al que se unen los moldes cebados.

Secuenciación y formación de imágenes

Los métodos ilustrativos de secuenciación y formación de imágenes para NGS incluyen, pero no se limitan a, terminación reversible cíclica (CRT), secuenciación por ligación (SBL), adición de molécula única (pirosecuenciación) y secuenciación en tiempo real.

La CRT utiliza terminadores reversibles en un método cíclico que incluye mínimamente las etapas de incorporación de nucleótidos, formación de imágenes de fluorescencia y escisión. Típicamente, una ADN polimerasa incorpora al cebador un único nucleótido modificado de forma fluorescente correspondiente al nucleótido complementario de la base de molde. La síntesis de ADN se termina después de la adición de un nucleótido único y los nucleótidos no incorporados se eliminan por lavado. La formación de imágenes se realiza para determinar la identidad del nucleótido marcado incorporado. A continuación, en la etapa de escisión, se retiran el grupo de terminación/inhibición y el tinte fluorescente. Las plataformas de NGS ilustrativas que utilizan el método de CRT incluyen, pero no se limitan al Genome Analyzer (GA) de Illumina/Solexa, que utiliza el método de molde amplificado clonalmente acoplado con el método de CRT de cuatro colores detectado por fluorescencia de reflexión interna total (TIRF); y Helicos BioSciences/HeliScope, que utiliza el método de molde de molécula única acoplado con el método de c Rt de un color detectado por TIRF.

La SBL utiliza ADN ligasa y sondas codificadas con una base o bien sondas codificadas con dos bases para la secuenciación. Típicamente, una sonda marcada de forma fluorescente hibrida con su secuencia complementaria adyacente al molde cebado. Se utiliza ADN ligasa para ligar la sonda marcada con tinte al cebador. Se realiza la formación de imágenes de fluorescencia para determinar la identidad de la sonda ligada después de que las sondas no ligadas se eliminen mediante lavado. El tinte fluorescente se puede retirar utilizando sondas escindibles para regenerar un grupo 5'-PO₄para ciclos de ligación posteriores. De forma alternativa, se puede hibridar un nuevo cebador al molde después de que se retire el cebador antiguo. Las plataformas de SBL ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Life/APG/SOLiD (detección de ligación de oligonucleótidos en soporte), que utiliza sondas codificadas con dos bases.

El método de pirosecuenciación se basa en la detección de la actividad de la ADN polimerasa con otra enzima quimioluminiscente. Típicamente, el método permite la secuenciación de una hebra única de ADN sintetizando la hebra complementaria a lo largo de ella, un par de bases a la vez, y detectando qué base se añadió realmente en cada etapa. El ADN molde está inmóvil y las soluciones de los nucleótidos A, C, G y T se añaden secuencialmente y retiran de la reacción. Se produce luz solo cuando la solución de nucleótidos complementa la primera base no emparejada del molde. La secuencia de soluciones que producen señales quimioluminiscentes permite la determinación de la secuencia del molde. Las plataformas de pirosecuenciación ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Roche/454, que utiliza moldes de ADN preparados por emPCR con 1-2 millones de cuentas depositadas en pocillos de PTP.

La secuenciación en tiempo real implica la formación de imágenes de la incorporación continua de nucleótidos marcados con tinte durante la síntesis de ADN. Las plataformas de secuenciación en tiempo real ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, la plataforma de Pacific Biosciences, que utiliza moléculas de ADN polimerasa fijadas a la superficie de detectores de guía de ondas en modo cero (ZMW) individuales para obtener información de secuencia cuando se incorporan nucleótidos fosfoenlazados a la hebra de cebador creciente; la plataforma de LifeNisiGen, que utiliza una ADN polimerasa genomodificada con un tinte fluorescente fijado para generar una señal potenciada después de la incorporación de nucleótidos por transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET); y la plataforma de LI-COR Biosciences, que utiliza nucleótidos de tinte-extintor en la reacción de secuenciación.

Otros métodos de secuenciación para NGS incluyen, pero no se limitan a, secuenciación por nanoporos, secuenciación por hibridación, secuenciación basada en matrices de nanotransistores, secuenciación polony, secuenciación basada en microscopia de efecto túnel de barrido (STM) y secuenciación basada en sensores moleculares de nanocables.

La secuenciación por nanoporos implica la electroforesis de moléculas de ácido nucleico en solución a través de un poro a escala nanométrica que proporciona un espacio altamente confinado dentro del que se pueden analizar polímeros de ácidos nucleicos únicos. Los métodos ilustrativos de secuenciación por nanoporos son descritos, p. ej., por Branton D. et al., en Nat Biotechnol. 2008; 26(10):1146-53.

La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que utiliza una micromatriz de ADN. Típicamente, un grupo único de ADN se marca de forma fluorescente e hibrida con una matriz que contiene secuencias conocidas. Las señales de hibridación de un punto dado en la matriz pueden identificar la secuencia de ADN. La unión de una hebra de ADN a su hebra complementaria en la doble hélice de ADN es sensible incluso a emparejamientos erróneos de base única cuando la región híbrida es corta o están presentes proteínas de detección de emparejamientos erróneos especializadas. Los métodos ilustrativos de secuenciación por hibridación son descritos, p. ej., por Hanna G.J. et al., en J. Clin. Microbiol. 2000; 38 (7): 2715-21; y Edwards J.R. et al., en Mut. Res. 2005; 573 (1-2): 3-12.

La secuenciación polony se basa en la amplificación polony y en la secuenciación por síntesis por medio de múltiples extensiones de base única (FISSEQ). La amplificación polony es un método para amplificar el ADN in situ en una película de poliacrilamida. Los métodos de secuenciación polony ilustrativos se describen, p. ej., en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0087362.

También se pueden utilizar dispositivos basados en matrices de nanotransistores, tales como Carbon NanoTube Field Effect Transitor (CNTFET) para NGS. Por ejemplo, las moléculas de ADN se estiran y conducen sobre nanotubos por electrodos microfabricados. Las moléculas de ADN entran en contacto secuencialmente con la superficie de los nanotubos de carbono y la diferencia en el flujo de corriente de cada base se produce debido a la transferencia de carga entre la molécula de ADN y los nanotubos. El ADN se secuencia registrando estas diferencias. Se describen métodos de secuenciación basada en matrices de nanotransistores ilustrativos, p. ej., en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2006/0246497.

La microscopia de efecto túnel de barrido (STM) también se puede utilizar para NGS. La STM utiliza una sonda piezoeléctrica que realiza una exploración de trama de un espécimen para formar imágenes de su superficie. Se puede utilizar la STM para formar imágenes de las propiedades físicas de moléculas de ADN únicas, p. ej., generando imágenes y espectroscopia de efecto túnel electrónico coherente integrando un microscopio de efecto túnel de barrido con un hueco flexible accionado por un accionador. Se describen métodos de secuenciación ilustativos que utilizan la STM, p. ej., en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm.

2007/0194225.

También se puede utilizar un dispositivo de análisis molecular que se componga de un sensor molecular de nanocables para NGS. Tal dispositivo puede detectar las interacciones del material nitrogenado dispuesto en los nanocables y moléculas de ácido nucleico, tal como ADN. Se configura una guía molecular para guiar una molécula cerca del sensor molecular, lo que permite una interacción y posterior detección. Se describen métodos de secuenciación ilustrativos que utilizan un sensor molecular de nanocables, p. ej., en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2006/0275779.

Se pueden utilizar métodos de secuenciación de doble extremo para NGS. La secuenciación de doble extremo utiliza cebadores bloqueados y no bloqueados para secuenciar tanto las hebras tanto efectora como antisentido de ADN. Típicamente, estos métodos incluyen las etapas de reasociación de un cebador no bloqueado con una primera hebra de ácido nucleico; reasociación de un segundo cebador bloqueado con una segunda hebra de ácido nucleico; elongación del ácido nucleico a lo largo de la primera hebra con una polimerasa; terminación del primer cebador de secuenciación; desbloqueo del segundo cebador; y elongación del ácido nucleico a lo largo de la segunda hebra. Se describen métodos de secuenciación de doble extremo ilustrativos, p. ej., en la Patente de Estados Unidos con Núm. de serie 7.244.567.

Análisis de datos

Una vez que se han generado las lecturas de NGS, se pueden alinear con una secuencia de referencia conocida o ensamblar de novo.

Por ejemplo, se puede lograr la identificación de variaciones genéticas, tales como un polimorfismo mononucleotídico, y de variantes estructurales en una muestra (p. ej., una muestra tumoral) alineando las lecturas de NGS con una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo salvaje). Los métodos de alineamiento de secuencias para NGS son descritos, p. ej., por Trapnell C. y Salzberg S.L. en Nature Biotech., 2009, 27:455-457.

Los ejemplos de ensamblajes de novo son descritos, p. ej., por Warren R. et al., en Bioinformatics, 2007, 23:500-501; Butler J. et al., Genome Res., 2008, 18:810-820; y Zerbino D.R. y Birney E., Genome Res., 2008, 18:821-829.

El alineamiento o el ensamblaje de secuencias se pueden realizar utilizando datos de lectura de una o más plataformas de NGS, p. ej., mezclando datos de lectura de Roche/454 y de Illumina/Solexa.

Se describen algoritmos y métodos para el análisis de datos en el documento USSN 61/428.568, presentado el 30 de diciembre de 2010.

Nivel de expresión de la fusión

En ciertos casos, también se puede someter a ensayo el nivel de expresión de una fusión descrita en el presente documento. La expresión de la fusión se puede valorar por cualquiera de una amplia variedad de métodos para detectar la expresión de una molécula o proteína transcritas. Los ejemplos no limitantes de tales métodos incluyen métodos inmunológicos para la detección de proteínas secretadas, de superficie celular, citoplásmicas o nucleares, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad de proteínas, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos y métodos de amplificación de ácidos nucleicos.

En ciertos casos, la actividad de un gen particular se caracteriza por una medida del transcrito del gen (p. ej., ARNm), por una medida de la cantidad de proteína traducida o por una medida de la actividad del producto génico. La expresión de la fusión se puede supervisar en una variedad de modos, incluyendo la detección de niveles de ARNm, niveles de proteína o actividad de proteína, pudiéndose medir cualquiera utilizando técnicas convencionales. La detección puede implicar la cuantificación del nivel de expresión génica (p. ej., ADN genómico, ADNc, ARNm, proteína o actividad enzimática) o, de forma alternativa, puede ser una valoración cualitativa del nivel de expresión génica, en particular, en comparación con un nivel de control. El tipo de nivel que se detecta quedará claro a partir del contexto.

Son conocidos métodos de detección y/o cuantificación del transcrito del gen de fusión (ARNm o ADNc preparado a partir del mismo) utilizando técnicas de hibridación de ácidos nucleicos para los expertos en la técnica (véase Sambrook et al. más arriba). Por ejemplo, un método para evaluar la presencia, ausencia o cantidad de ADNc implica una transferencia Southern como se describe anteriormente. En resumen, el ARNm se aísla (p. ej., utilizando un método de extracción con guanidinio ácido-fenol-cloroformo, Sambrook et al. más arriba) y se transcribe de forma inversa para producir ADNc. A continuación, el ADNc se digiere opcionalmente y se pasa por un gel en tampón y se transfiere a membranas. Después, se lleva a cabo la hibridación utilizando las sondas de ácido nucleico específicas para el ADNc de una fusión descrita en el presente documento, p. ej., utilizando las sondas y cebadores descritos en el presente documento.

En otros casos, la expresión de una molécula de fusión descrita en el presente documento se valora preparando ADN genómico o ARNm/ADNc (es decir, un polinucleótido transcrito) a partir de células en una muestra del sujeto e hibridando el ADN genómico o ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia que es un complemento de un polinucleótido que comprende la fusión y fragmentos del mismo. El ADNc, opcionalmente, se puede amplificar utilizando cualquiera de una variedad de métodos de reacción en cadena de la polimerasa antes de la hibridación con el polinucleótido de referencia. La expresión de una fusión como se describe en el presente documento se puede detectar igualmente utilizando PCR cuantitativa (QPCR) para valorar el nivel de expresión.

Detección del polipéptido de fusión

La actividad o nivel de un polipéptido de fusión descrito en el presente documento también se puede detectar y/o cuantificar detectando o cuantificando el polipéptido expresado. El polipéptido de fusión se puede detectar y cuantificar por cualquiera de una serie de medios conocidos para los expertos en la técnica. Estos pueden incluir métodos bioquímicos analíticos, tales como electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión y similares, o diversos métodos inmunológicos, tales como reacciones de precipitación en líquido o gel, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoanálisis (RIA), ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, transferencia Western, inmunohistoquímica (IHC) y similares. Un experto en la técnica puede adaptar métodos de detección de proteínas/anticuerpos conocidos.

Otro agente para detectar un polipéptido de fusión es una molécula de anticuerpo que se puede unir a un polipéptido correspondiente a un marcador, p. ej., un anticuerpo con una marca detectable. Se describen técnicas para generar anticuerpos en el presente documento. Se pretende que el término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, englobe el marcaje directo de la sonda o anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, enlace físico) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente y el marcaje en el extremo de una sonda de ADN con biotina de modo que se pueda detectar con estreptavidina marcada de forma fluorescente.

En otro caso, el anticuerpo está marcado, p. ej., un anticuerpo radiomarcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo o marcado con enzima. En otro caso, se utiliza un derivado de anticuerpo (p. ej., un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de un par proteína-ligando {p. ej., biotina-estreptavidina}), o un fragmento de anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de cadena sencilla, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado, etc.) que se unen específicamente con una proteína de fusión descrita en el presente documento.

Los polipéptidos de fusión de las células se pueden aislar utilizando mecanismos que son conocidos para los expertos en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados pueden ser , p. ej., los descritos por Harlow y Lane (Harlow y Lane, 1988, en Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Los medios de detección de proteínas utilizando mecanismos electroforéticos son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, en general, R. Scopes (1982) Protein Purificación, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology, vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).

En otro caso, se utiliza el análisis por transferencia Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de un polipéptido en la muestra.

En otro caso, el polipéptido se detecta utilizando un inmunoensayo. Como se emplea en el presente documento, un inmunoensayo es un ensayo que utiliza un anticuerpo para unirse específicamente al analito. Por tanto, el inmunoensayo se caracteriza por la detección de la unión específica de un polipéptido a un antianticuerpo a diferencia del uso de otras propiedades físicas o químicas para aislar, seleccionar como diana y cuantificar el analito.

El polipéptido de fusión se detecta y/o cuantifica utilizando cualquiera de una serie de ensayos de unión inmunológicos (véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm.4.366.241; 4.376.110; 4.517.288 y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, véanse también Asai (1993) Methods in Cell Biology, volumen 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York; Stites y Terr (1991) Basic and Clinical Immunology, 7.a edición.

Kits

En un aspecto, la divulgación presenta un kit, p. ej., que contiene un oligonucleótido que tiene una mutación descrita en el presente documento, p. ej., una molécula de fusión descrita en el presente documento. Opcionalmente, el kit también puede contener un oligonucleótido que sea la contraparte de tipo salvaje del oligonucleótido mutante.

Un kit presentado en la divulgación puede incluir un portador, p. ej., un medio que se compartimenta para recibir en confinamiento cercano uno o más medios de recipiente. En un caso, el recipiente contiene un oligonucleótido, p. ej., un cebador o sonda como se describe anteriormente. Los componentes del kit son útiles, por ejemplo, para diagnosticar o identificar una mutación en una muestra tumoral en un paciente. La sonda o cebador del kit se pueden utilizar en cualquier ensayo de secuenciación o de detección de nucleótidos conocido en la técnica, p. ej., un ensayo de secuenciación, p. ej., un método de NGS, RT-PCR o hibridación in situ.

En algunos casos, los componentes del kit son útiles, p. ej., para diagnosticar o identificar una fusión descrita en el presente documento en una muestra tumoral en un paciente y, en consecuencia, para identificar un agente terapéutico apropiado para tratar el cáncer.

Un kit presentado en la divulgación puede incluir, p. ej., controles positivos y negativos de ensayo, nucleótidos, enzimas (p. ej., ARN o ADN polimerasa o ligasa), disolventes o tampones, un estabilizante, un conservante, un anticuerpo secundario, p. ej., un anticuerpo (IgG) anti-HRP y un reactivo de detección.

Un oligonucleótido se puede proporcionar en cualquier forma, p. ej., líquida, seca, semiseca o liofilizada, o en una forma para su almacenamiento en estado congelado.

Típicamente, se proporcionan un oligonucleótido y otros componentes en un kit en una forma que sea estéril. Un oligonucleótido, p. ej., un oligonucleótido que contiene una mutación, p. ej., una fusión descrita en el presente documento, o un oligonucleótido complementario a una fusión descrita en el presente documento, se proporciona en una solución líquida, la solución líquida, en general, es una solución acuosa, p. ej., una solución acuosa estéril. Cuando el oligonucleótido se proporciona como forma seca, la reconstitución, en general, se logra por la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, p. ej., tampón estéril, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.

El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene un oligonucleótido a una concentración adecuada para su uso en el ensayo o con instrucciones de dilución para su uso en el ensayo. En algunos casos, el kit contiene recipientes, divisores o compartimentos separados para el oligonucleótido y los componentes del ensayo, y el material informativo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden estar contenidos en un frasco o vial, y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plástico. En otros casos, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un recipiente no dividido único. Por ejemplo, una composición de oligonucleótidos está contenida en un frasco o vial que tiene fijado al mismo el material informativo en forma de etiqueta. En algunos casos, el kit incluye una pluralidad (p. ej., un envase) de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o más formas unitarias (p. ej., para su uso con un ensayo) de un oligonucleótido. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de ampollas, paquetes de aluminio o envases alveolados, conteniendo cada uno una única unidad de oligonucleótido para su uso en la secuenciación o detección de una mutación en una muestra tumoral. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos y/o impermeables. El recipiente se puede marcar para su uso.

Para kits basados en anticuerpos, el kit puede incluir: (1) un primer anticuerpo (p. ej., fijado a un soporte sólido) que se une a un polipéptido de fusión; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido o bien al primer anticuerpo y se conjuga con un agente detectable.

En un caso, el kit puede incluir material informativo para realizar e interpretar la secuenciación o diagnóstico. En otro caso, el kit puede proporcionar orientación sobre dónde informar de los resultados del ensayo, p. ej., a un centro de tratamiento o profesional sanitario. El kit puede incluir formularios para informar de los resultados de un ensayo de secuenciación o de diagnóstico descrito en el presente documento, y la dirección e información de contacto con respecto a dónde enviar tales formularios u otra información relacionada; o una dirección URL (Localizador Uniforme de Recursos) para informar de los resultados en una base de datos en línea o una aplicación en línea (p. ej., una aplicación). En otro caso, el material informativo puede incluir orientación con respecto a si un paciente debe recibir tratamiento con un fármaco quimioterapéutico particular, dependiendo de los resultados del ensayo.

El material informativo de los kits no está limitado en su formato. En muchos casos, el material informativo, p. ej., instrucciones, se proporciona en forma impresa, p. ej., un texto impreso, dibujos y/o fotografías, p. ej., una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material informativo también se puede proporcionar en otros formatos, tales como material legible por ordenador, grabación de vídeo o grabación de audio. En otro caso, el material informativo del kit es información de contacto, p. ej., una dirección física, dirección de correo electrónico, sitio web o número de teléfono, donde un usuario del kit puede obtener información sustancial sobre la secuenciación o ensayo de diagnóstico y/o su uso en los métodos descritos en el presente documento. El material informativo también se puede proporcionar en cualquier combinación de formatos.

En algunos casos, se proporciona una muestra biológica a un proveedor de ensayos, p. ej., un proveedor de servicios (tal como un centro externo) o un profesional sanitario, que evalúa la muestra en un ensayo y proporciona una lectura. Por ejemplo, en un caso, un proveedor de ensayos recibe una muestra biológica de un sujeto, tal como una muestra de sangre o tisular, p. ej., una muestra de biopsia, y evalúa la muestra utilizando un ensayo descrito en el presente documento, p. ej., un ensayo de secuenciación o ensayo de hibridación in situ, y determina que la muestra contiene una fusión descrita en el presente documento. El proveedor de ensayos, p. ej., un proveedor de servicios o profesional sanitario, a continuación, puede concluir que el sujeto es, o no, un candidato para un fármaco particular o una pauta de tratamiento del cáncer particular.

El proveedor de ensayos puede proporcionar los resultados de la evaluación y, opcionalmente, las conclusiones con respecto a uno o más diagnósticos, pronósticos u opciones de tratamiento apropiadas, por ejemplo, a un profesional sanitario, un paciente o una compañía de seguros, en cualquier formato adecuado, tal como por correo o de forma electrónica, o a través de una base de datos en línea. La información obtenida y proporcionada por el proveedor de ensayos se puede almacenar en una base de datos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que

(a) codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22;

(b) codifica una fusión LMNA-NTRK1 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20, y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa;

(c) es una molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 de SEQ ID NO: 19 y (ii) los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21; o

(d) es una fusión LMNA-NTRK1 que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 de SEQ ID NO: 19, y (ii) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21, y que codifica un polipéptido LMNA-NTRK1 que tiene una actividad tirosina cinasa; en donde la fusión LMNA-NTRK1 incluye un punto de unión de fusión LMNA-NTRK1.

2. Un vector aislado o purificado que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 2.

4. Una molécula de ácido nucleico que reduce o inhibe específicamente la expresión de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que se elige entre una molécula antisentido, una ribozima, un agente de ARNi, un ARNip o una molécula con triple hélice, cada uno de los cuales selecciona como diana un punto de unión de fusión de la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1.

5. Un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 aislado o purificado, en donde (a) el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende (i) uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22; o (b) el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20, y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa; en donde la fusión LMNA-NTRK1 incluye un punto de unión de fusión LMNA-NTRK1.

6. Un agente anticanceroso para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que tiene una molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 o un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1,

en donde:

la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 (a) es una molécula de ácido nucleico que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 de SEQ ID NO: 19 y (ii) los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21, (b) es una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1 5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID n O: 22, (c) es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1 -5 de SEQ ID NO: 19, y (ii) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21, y que codifica un polipéptido LMNA-NTRK1 que tiene una actividad tirosina cinasa, o (d) es una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20, y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa; y

el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 (a) es un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, o (b) tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20, y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa;

en donde la fusión LMNA-NTRK1 incluye un punto de unión de fusión LMNA-NTRK1;

en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del agente anticanceroso, tratando, de este modo, el cáncer en el sujeto,

en donde el agente anticanceroso es:

un inhibidor de múltiples cinasas, un inhibidor específico de cinasa, TAE-684, PF02341066 (crizotinib), AF-802, LDK-378, ASP-3026, CEP-37440, CEP-28122, CEP-108050 o AP26113; o

un inhibidor elegido entre una molécula antisentido, una ribozima, un agente de ARNi, un ARNip o una molécula con triple hélice, en donde el inhibidor hibrida con la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1, o hibrida con una región reguladora de la transcripción que bloquea o reduce la expresión del ARNm de la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1, o

un inhibidor de NTRK1, p. ej., danusertib (PHA-739358); PHA-848125; CEP-2563; K252a; KRC-108; lestaurtinib (CEP-701); AZ-23; indenopirrolocarbazol 12a; oxindol 3; isotiazol 5n; o tiazol 20h.

7. El agente anticanceroso para su uso según la reivindicación 6, en donde el sujeto tiene la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1, y en donde la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 es una molécula de ácido nucleico que comprende (i) uno o más de los exones 1 -5 de SEQ ID NO: 19 y (ii) los exones 12 17 de SEQ ID NO: 21.

8. El agente anticanceroso para su uso según la reivindicación 6, en donde el sujeto tiene la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1, y en donde la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 es una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22.

9. El agente anticanceroso para su uso según la reivindicación 6, en donde el sujeto tiene la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1, y en donde la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 de SEQ ID NO: 19, y (ii) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21, y que codifica un polipéptido LMNA-NTRK1 que tiene una actividad tirosina cinasa.

10. El agente anticanceroso para su uso según la reivindicación 6, en donde el sujeto tiene la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1, y en donde la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 es una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa.

11. El agente anticanceroso para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicho agente anticanceroso es un inhibidor de cinasa y se administra en respuesta a la determinación de la presencia de la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 o del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 en una muestra tumoral de dicho sujeto.

12. El agente anticanceroso para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde la presencia de la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 en el cáncer se determina por secuenciación.

13. El agente anticanceroso para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicho cáncer es un tumor sólido o un cáncer de partes blandas, opcionalmente en donde dicho cáncer se elige entre una histiocitosis no Langerhans, un cáncer colorrectal, un cáncer de páncreas o un cáncer de tiroides.

14. Un método para escrutar un agente que modula la expresión o actividad del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 de la reivindicación 5, que comprende: opcionalmente, determinar si el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 está presente; poner en contacto el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1, o una célula anfitriona que expresa el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1, con un agente candidato; y detectar un cambio en la expresión o una actividad del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1, en donde la actividad del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 comprende una actividad tirosina cinasa.

15. Un método de evaluación de un paciente, que comprende: identificar, seleccionar u obtener información o conocimiento de que el paciente ha participado en un ensayo clínico o ha sido tratado de cáncer; y adquirir información o conocimiento que identifique que una molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 o un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 está presente en una muestra del paciente,

en donde:

la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 (a) comprende una molécula de ácido nucleico que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 de SEQ ID NO: 19, y (ii) los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21, (b) es una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, (c) es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 de SEQ ID NO: 19, y (ii) a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 de SEQ ID NO: 21, y que codifica un polipéptido LMNA-NTRK1 que tiene una actividad tirosina cinasa, o (d) es una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20, y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa; y

el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 (a) comprende un polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 que comprende (i) uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20 y (ii) los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, o (b) tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica (i) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o uno de sus fragmentos, que comprenden uno o más de los exones 1-5 codificados de SEQ ID NO: 20, y (ii) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, o uno de sus fragmentos, que comprenden los exones 12-17 codificados de SEQ ID NO: 22, y tiene una actividad tirosina cinasa;

en donde la presencia de la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 o del polipéptido de fusión LMNA-NTRK1 identifica al paciente que tiene un mayor riesgo de, o que tiene, un cáncer asociado con la molécula de ácido nucleico de fusión LMNA-NTRK1 o el polipéptido de fusión LMNA-NTRK1.