ES2949335T3 - Procedimiento y compuestos para la inhibición del complejo MCM y su aplicación en el tratamiento de cáncer - Google Patents

Procedimiento y compuestos para la inhibición del complejo MCM y su aplicación en el tratamiento de cáncer Download PDF

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Abstract

Un método para tratar el cáncer mediante el uso de un agente que es capaz de inhibir la funcionalidad del complejo MCM, un anillo heterohexámero formado a partir de seis subunidades, en el proceso de replicación del ADN y un método de detección de dichos agentes mediante la detección de las ubicaciones y funciones de las subunidades de MCM, como hMcm2 y hMcm6, en células tratadas con compuestos candidatos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento y compuestos para la inhibición del complejo MCM y su aplicación en el tratamiento de cáncer
Campo de la invención
En el presente documento se divulga una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para el tratamiento de cáncer mediante el uso de un agente que es capaz de inhibir la funcionalidad del complejo MCM, un anillo heterohexamérico formado por seis subunidades, en el proceso de replicación del ADN, y además se refiere a un procedimiento de cribado de dichos agentes mediante la detección de las localizaciones y las funciones de las subunidades de MCM, tales como hMcm2 y hMcm6, en células tratadas con compuestos candidatos. La invención se define en las reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
Las células cancerosas son células que se dividen y crecen de forma incontrolada, invaden partes próximas a las mismas del cuerpo y también pueden propagarse a otras partes del cuerpo a través del sistema linfático y/o del torrente sanguíneo. El tratamiento de cáncer generalmente implica la eliminación o la destrucción de las células cancerosas, tal como mediante cirugía, quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia, etc. Sin embargo, uno de los desafíos en todas esas formas de tratamiento es cómo eliminar o destruir por completo las células cancerosas y al mismo tiempo no causar daños graves a células y tejidos normales o sanos. En el caso de la quimioterapia, durante varias décadas, el cribado de compuestos citotóxicos ha sido el foco principal de la inversión en investigación y desarrollo. Se ha indicado que un elevado número de compuestos químicos presentan actividades citotóxicas y anticancerosas. Como señalaron Schwartsmann et al., en 1988, se han cribado más de 600.000 compuestos, pero solo aproximadamente 40 de los mismos presentan algún tipo de significancia clínica. Esta baja tasa de éxito se debe en gran medida a consideraciones sobre la toxicidad de los fármacos anticancerosos, que generalmente tienen un índice terapéutico estrecho, es decir, presentan un pequeño margen entre la dosis requerida para lograr un efecto anticanceroso y la que causa una toxicidad inaceptable. La utilidad de descubrir compuestos que tengan efectos inhibidores sobre la proliferación celular basados en citotoxicidad es limitada y está lejos de ser clínicamente relevante. Ejemplos de compuestos que se consideran para su uso en el tratamiento de cáncer son glicósidos cardiacos tales como los que se describen en los documentos US 2009/018088 y WO 02/14343.
Lo que es necesario y más importante es encontrar compuestos que no solo inhiban de forma potente la proliferación celular, sino que también lo hagan con especificidad hacia las células cancerosas, sin causar daños graves a células y tejidos normales o sanos.
Se han identificado proteínas de la familia de proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM) como marcadores de proliferación que desempeñan un papel patofisiológico (véase Karimi y Sadr en "DNA Replication and Related Cellular Processes", capítulo "Minichromosome Maintanance Protein Family: Novel Proliferative Markers -The Phthophysiologic Role and Clinical Application", 2011, InTech, editora Jelena Kusic-Tisma, ISBM 978-353-307­ 775-8). Se ha identificado Mcm7 como una diana terapéutica potencial en cáncer (véase Toyokawa et al., Molecular Cancer, 2011, 10:65).
Sumario de la invención
En consecuencia, un objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para destruir células cancerosas con alta especificidad sin causar daños significativos a las células normales. Este objeto se realiza mediante la interrupción de la formación del complejo MCM (de mantenimiento de minicromosomas) funcional a partir de sus subunidades. La invención se define en las reivindicaciones. Se sabe que el complejo MCM desempeña un papel esencial en el ensamblaje pre-RC (es decir, complejo pre-replicativo), que también se conoce como licencia de replicación, y la elongación de la replicación del ADN. El complejo MCM funcional requiere las seis subunidades de MCM (Mcm2-7) para formar un anillo heterohexamérico, que se carga en el origen de la replicación por medio de Orc1-6, Noc3, Ipil-3, Cdtl, Cdc6 y quizás algunas otras proteínas. Como miembro de la familia de proteínas AAA+ (ATPasas asociadas con una diversidad de actividades), el complejo MCM se mueve junto con la horquilla de replicación, probablemente para servir como helicasa replicativa para desenrollar las dobles cadenas de ADN. La investigación previa de los inventores, divulgada en las patentes de Estados Unidos N° 7393950 y 8318922, ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los genes de las subunidades de MCM tienen el efecto de inhibir la proliferación celular.
Debido a que las proteínas MCM deben formar un complejo intacto con una estructura de anillo para ser funcionales, la interrupción de sus interacciones (es decir, hacerlas incapaces de formar un complejo funcional) inhibirá la replicación del ADN e inducirá la apoptosis y, lo que es más importante, el efecto de interrumpir la funcionalidad de las MCM solo es grave y permanente en las células cancerosas, y no en las células normales y sanas.
Dicha alta especificidad es la esencia de la presente invención. Sin pretender vincularse a ninguna teoría, se cree que la alta especificidad de la presente invención radica en la diferencia de que las células normales poseen puntos de control intactos que detienen el ciclo celular en la fase G1 para evitar la muerte celular, mientras que las células cancerosas carecen de controles de puntos de control y entrarán en una fase S abortiva. En otras palabras, las células normales tienen la capacidad de detectar si el complejo MCM se ha formado y es funcional y solo entran en la fase S cuando saben que el complejo MCM está listo para imponer sus reglas en la replicación del ADN. De lo contrario, se detendrán temporalmente en la fase G1. Por usar una analogía, estas son como un vehículo en marcha equipado con un freno operativo. Se puede detener una vez que el conductor se da cuenta de que el puente sobre el río está roto. Por otra parte, la célula cancerosa es como un vehículo que tiene un freno no operativo, y no puede detenerse antes de alcanzar el puente roto y continuará su curso hasta que se caiga al río (es decir, entrará en la fase S abortiva). También se divulga un procedimiento de cribado de fármacos anticancerosos con alta especificidad que destruyan las células cancerosas sin causar daños graves a las células normales. Este objeto se realiza mediante un proceso para identificar compuestos que inhiban la formación del complejo MCM funcional (una estructura de anillo heterohexamérico) a partir de subunidades, que permanecerán en el citoplasma y no podrán ser transportadas al núcleo.
Preferentemente, el procedimiento comprende las etapas siguientes: (a) poner en contacto una serie de compuestos candidatos con una población de células durante un periodo de tiempo y (b) detectar el nivel de complejo MCM funcional en las células tratadas con los compuestos candidatos. De forma más preferida, la etapa (b) se realiza indirectamente mediante la detección de la porción de las subunidades de MCM ubicada en el núcleo en comparación con la porción ubicada en el citoplasma. Debido a que solo el complejo MCM funcional puede localizarse dentro del núcleo, cuantas menos subunidades de MCM se encuentren localizadas en el núcleo, más potente es el efecto de interrupción del compuesto candidato sobre la formación del complejo MCM funcional. De forma aún más preferida, la etapa (b) se realiza mediante un procedimiento de fluorescencia indirecto (inmunotinción) en el que los anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente que reconocen los anticuerpos primarios contra una o más proteínas MCM endógenas permiten la visualización de las localizaciones subcelulares de las proteínas MCM endógenas después de ser expuestas a los compuestos candidatos durante un periodo de tiempo determinado. Alternativamente, la etapa (b) también puede realizarse mediante un procedimiento de fluorescencia directa en el que las células se han transfectado con plásmidos capaces de expresar una o más subunidades de MCM fusionadas con una proteína fluorescente, tales como, por ejemplo, hMcm2-GFP y/o hMcm6-GFP, por lo que se pueden detectar las localizaciones de las proteínas de fusión m Cm fluorescentes después de tratar las células con los compuestos candidatos. Otros procedimientos para la etapa (b) incluyen detectar las interacciones físicas de las subunidades de MCM o medir la cantidad de proteínas MCM unidas a cromatina en las ubicaciones en las que las proteínas MCM normalmente realizan sus funciones.
Opcionalmente, se pueden llevar a cabo etapas adicionales para complementar la etapa (b) o como una etapa separada para examinar los defectos en la replicación del ADN mediante procedimientos tales como el ensayo de incorporación de BrdU, citometría de flujo, etc. También se pueden llevar a cabo etapas adicionales para confirmar que los compuestos identificados con la capacidad de interrumpir la formación del complejo MCM funcional también tienen efectos diferenciales potentes en términos de antiproliferación e inducción de la apoptosis entre células cancerosas y células normales.
También se divulgan compuestos específicos como agentes anticancerosos con alta especificidad para producir la composición farmacéutica para su uso en el procedimiento terapéutico según la presente invención. Según la presente invención, el compuesto se selecciona de entre 17β-desacetiltanginina, 17β-neriifolina, 17β-desacetiltanginina-diol y cinobufagina. La composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de la presente invención puede aplicarse a todas las formas de cáncer sensibles a la interrupción del complejo MCM, por ejemplo, cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de ovario, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma de enfermedad no de Hodgkin, linfoma de enfermedad de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma folicular o cáncer de pulmón de células no pequeñas.
En resumen, la característica técnica especial que subyace a la presente invención implica un agente capaz de destruir selectivamente las células cancerosas mediante la interrupción de la formación del complejo MCM funcional a partir de sus subunidades.
Las diversas características de novedad que caracterizan a la invención se señalan con particularidad en las reivindicaciones anexas a la presente divulgación y que forman parte de la misma. Para una mejor comprensión de la invención, sus ventajas operativas y los objetos específicos asociados a su uso, se debe hacer referencia a las figuras y la descripción siguiente en los que se ilustran y se describen formas de realización preferidas de la invención.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra las estructuras de los compuestos anticancerosos (3), (4), (6) y (8) de la presente invención en comparación con la de isómeros inactivos (1-2) y compuestos comparativos (5) y (7).
La figura 2 presenta una observación microscópica directa (A) y datos de ensayo WST-1 (tetrazolio-1 hidrosoluble) (B-H), que muestran que la 17β-desacetiltanginina (A-C), la 17β-neriifolina (D) y el 17β-desacetiltanginina-diol (E), tres representantes de los compuestos anticancerosos de la presente invención, tienen potentes actividades anticancerosas sin presentar una citotoxicidad significativa hacia las células normales. A modo de comparación, el paclitaxel (Taxol) es más citotóxico para las células normales que para las células cancerosas (F), y el VP16 (fosfato de etopósido) tiene poca selectividad entre las células normales y las cancerosas (G y H).
La figura 3 muestra mediante coinmunoprecipitación que la 17β-desacetiltanginina (DAT) y la 17β-neriifolina (NRF) inhibe las interacciones entre las subunidades de MCM, mientras que la 17β-desacetiltanginina-diol (Diol) tiene una actividad más débil.
La figura 4 presenta datos de microscopía de inmunofluorescencia indirecta que muestran que la 17βdesacetiltanginina (DAT), la 17β-neriifolina (NRF) y el 17β-desacetiltanginina-diol (Diol) inhiben la localización nuclear de hMcm2 (h, humano) y hMcm6.
La figura 5 presenta un ensayo de unión a cromatina y datos de citometría de flujo para mostrar que la 17βdesacetiltanginina inhibe el ensamblaje del complejo pre-replicativo (pre-RC) e induce la apoptosis de células cancerosas.
La figura 6 muestra por citometría de flujo que la 17β-desacetiltanginina inhibe la replicación del ADN e induce la apoptosis en células cancerosas.
La figura 7 presenta datos del ensayo de incorporación de BrdU para mostrar que la 17β-desacetiltanginina inhibe la replicación del ADN.
La figura 8 presenta datos de citometría de flujo y de tinción con anexina V que muestran que la 17β-desacetiltanginina (DAT), la 17β-neriifolina (NRF) y el 17β-desacetiltanginina-diol (Diol) pueden inducir la apoptosis en células cancerosas.
La figura 9 muestra que las células normales, pero no las células cancerosas, son capaces de reanudar el crecimiento después de eliminar la 17β-desacetiltanginina según lo medido mediante el ensayo WST-1.
La figura 10 muestra la actividad antitumoral in vivo de la 17β-desacetiltanginina en modelos de xenoinjerto de ratones desnudos.
La figura 11 muestra que la 17β-desacetiltanginina no presente toxicidad obvia sobre ratones desnudos que se sometieron al experimento que se muestra en la figura 10.
Descripción detallada de formas de realización particulares de la invención
Líneas celulares y plásmidos
Se clonaron fragmentos de ADNc de Mcm6 y Mcm2 humanos en cada caso en el vector pEGFP-C3 (Invitrogen) para la detección de la localización. Se cultivaron células HeLa (adenocarcinoma cervical), células HepG2 (carcinoma hepatocelular), células Hep3B (carcinoma hepatocelular), HK1 (carcinoma nasofaríngeo) y C666-1 (carcinoma nasofaríngeo) en DMEM que contenía el 10% de FBS. Se cultivaron células L-02 (células hepáticas humanas normales) en RPMI 1640 con el 10% de FBS. Se cultivaron células NP460 en queratinocito-SFM 1:1 (Invitrogen) y MEPI 500CA con un suplemento de S0125 (Cascade Biologics). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía el 5% de CO2.
Ensayo de actividad antiproliferativa
Para evaluar la actividad antiproliferativa de los compuestos en líneas celulares humanas y el cálculo de CI50, se sembraron células cancerosas, que incluían HepG2, HeLa y Hep3B (4 x 105 células/pocillo) y células L-02 normales (5 x 105 células/pocillo) respectivamente en placas de 96 pocillos en 100 μl de medio de cultivo y se incubaron durante aproximadamente 12 horas a 37 °C. Las células se trataron con diluciones en serie dobles de los fármacos durante 48 horas. Se retiró el medio y se añadieron a cada pocillo 100 μl de medio de cultivo que contenía WST-1 (tetrazolio-1 hidrosoluble) 1 μM. Las células se incubaron durante 2 horas y después se midió la absorbancia a 405 nm (referencia a 630 nm). Para construir la curva estándar de la relación entre el número de células y la absorbancia a una DO405, se sembraron diluciones en serie de células con cantidades conocidas de células y se incubaron durante seis horas antes de medirlas mediante el ensayo WST-1. La viabilidad celular se expresó como la relación del número de células vivas tratadas con un compuesto candidato frente al de las células tratadas con DMSO.
Cribado de productos naturales y aislamiento guiado por bioactividad de compuestos anticancerosos
Un protocolo general para preparar muestras químicas de origen natural para el ensayo de cribado de fármacos contra el cáncer fue el siguiente: se extrajeron 10-100 gramos del material herbáceo (planta entera, raíz, tallo, hoja o fruto) con metanol a temperatura ambiente tres veces. Cada extracto total se suspendió en agua y después se repartió en Et2O, EtOAc, n-BuOH sucesivamente, para proporcionar cuatro fracciones, es decir, fracción de Et2O, fracción de EtOAc, fracción de n-BuOH y fracción de H2O. Cada extracto total o fracción se disolvió en DMSO como una solución madre de 10 mg/ml para el ensayo de cribado. Los compuestos individuales purificados se prepararon como solución madre de 1 mg/ml cada uno.
Usando el enfoque de cribado anterior, se identificó una fracción con potentes actividades anticancerosas e interruptoras del complejo MCM, que es la fracción de Et2O del extracto de hojas o ramas jóvenes secas de Cerebra manhas y Cerebra odollam. Posteriormente, esta fracción se sometió a un fraccionamiento guiado por actividad mediante el uso de una combinación de diferentes cromatografías en columna sobre SiO2, MCI-gel CHP 20P (75-150 m, Mitsubishi Chemical Corporation, Japón), Chromatorex ODS (100-200 de malla, Fuji Silysia Chemical Ltd., Japón) y Toyopearl HW-40F (Tosoh Corporation, Japón), lo que dio como resultado el aislamiento de 17β-desacetiltanginina como un compuesto principal responsable de la actividad de la fracción activa de hojas y ramas jóvenes secas de Cerebra odollam y Cerebra manhas.
Identificación de la estructura de 17β-desacetiltanginina
La estructura de la 17β-desacetiltanginina se caracterizó sobre la base de evidencias espectroscópicas. Los espectros de RMN se registraron utilizando un espectrómetro Varian-400. Las constantes de acoplamiento se proporcionaron en Hz y los desplazamientos químicos se representaron en (ppm) con respecto a Me4Si como patrón interno. El HR-ESI-EM se realizó en un espectrómetro de masas Q-TOF (Bruker Daltonics, MA, Estados Unidos).
ESI-EM de alta resolución (modo de iones positivos): m/z 549,3077 [M+H]+ (calculado para C30H45O9: 549,3064). RMN de 1H (400 MHz, piridina-d5): 86,31 (1H, s, H-22), 5,25 (1H, d, J=2,9 Hz, H-1'), 5,20 (1H, m, H-21), 5,02 (1H, dd, J=18,0, 1,4 Hz, H-21), 4,33 (1H, m, H-5'), 4,12 (1H, s ancho, H-3), 4,09 (1H, dd, J= 9,0, 4,0 Hz, H-2'), 4,03 (1H, t, J=9,5 Hz, H-3'), 3,85 (3H, s, 3'-OMe), 3,69 (1H, m, H-4'), 3,41 (1H, d, J=5,8 Hz, H-7), 2,82 (1H, dd, J=9,0, 5,0 Hz, H-17), 1,66 (1H, d, J=6,2 Hz, H-6'), 1,06 (3H, s, H-19), 0,99 (3H, s, H-18). RMN de 13C (100 MHz, piridina-d5): 832,7 (C-1), 28,0 (C-2), 73,7 (C-3), 33,5 (C-4), 34,8 (C-5), 28,9 (C-6), 51,9 (C-7), 65,1 (C-8), 32,5 (C-9), 34,4 (C-10), 21,5 (C-11), 41,4 (C-12), 53,2 (C-13), 82,4 (C-14), 35,9 (C-15), 29,3 (C-16), 51,5 (C-17), 13,0 (C-18), 25,0 (C-19), 175,9 (C-20), 74,4 (C-21), 113,4 (C-22), 175,1 (C-23), 99,6 (C-1'), 74,0 (C-2'), 86,0 (C-3'), 77,2 (C-4'), 69,6 (C-5'), 19,2 (C-6'), 61,2 (C-3'-OMe).
Se determinó que la 17β-desacetiltanginina era un monoglucósido de cardenólido por su ESI-EM de alta resolución que corresponde a una fórmula molecular de C30H44O9 , los espectros de RMN de 1H que muestran señales características procedentes de cardenólido [protón de metileno en C-21 (85,20, m; 5,02, dd, J=18,0, 1,4 Hz) y protón olefínico en C-22 (86,31, s)], y las señales del protón anomérico (85,25, d, J=2,9 Hz) del resto de azúcar. Un grupo epoxi en las posiciones C-7 y C-8 vino sugerido por el gran desplazamiento campo abajo para las señales C-7 y C-8 en comparación con las de la neriifolina, un cardenólido principal de las hojas de Cerbera manghas, y además vino respaldado mediante comparación del desplazamiento químico con el de cardenólidos que poseen un grupo 7,8-epoxi. La configuración de C-17 se estableció que era p tal como se demuestra mediante la señal de H-17 (82,82, dd, J=9,0, 5,0 Hz) y vino respaldada por la señal de C-12 (8c, 41,4) que se encuentra bajo el efecto de apantallamiento del anillo de lactona. La aglicona se identificó como 3p-hidroxi-7p,8p-epoxi-14p-hidroxi-card-20(22)-enólido mediante comparación de sus datos de RMN de 13C con los notificados. Se reveló que el resto de azúcar era a-L-tevetosa (3-O-metil-6-desoxi-a-L-glucopiranosilo) mediante comparación de sus señales de protón y de carbono con las descritas en la literatura. Basándose en la evidencia anterior, la estructura de HMG-17β-desacetiltanginina se caracterizó que era 3p-O-(3-O-metil-6-desoxi-a-L-glucopiranosil-7p,8p-epoxi-14p-hidroxi-card-20(22)-enólido (17βdesacetiltanginina):
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Ensayo de inmunotinción
Para estudiar el efecto de los compuestos anticancerosos sobre la interacción entre hMcm2 y hMcm6 en las células, se realizó una inmunotinción para detectar la localización subcelular de las proteínas. Se fijaron células HeLa cultivadas en cubreobjetos (recubiertos con poli-D-lisina) con o sin tratamiento farmacológico con PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 20 min. Después de una permeabilización con Triton X-100 al 0,1% y BSA al 1% en PBS durante 20 min, las células se bloquearon con BSA al 1% y después se incubaron con anticuerpos primarios antihMcm6 de conejo (Santa Cruz; 1:500) y anti-hMcm2 de ratón (Becton Dickinson; 1:500) a temperatura ambiente durante 1 h. Después, las células se incubaron con anticuerpo anti-cabra de burro conjugado con Alexa Fluor 488 y anticuerpo anti-ratón de burro conjugado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen; 1:500) a temperatura ambiente durante 1 h. Se realizaron tres lavados con p Bs después de cada ronda de incubación de anticuerpos. Después, las células se incubaron con Hochest 33852 (Sigma Chemical Company; 1 μg/ml) a temperatura ambiente durante 15 min para realizar la tinción nuclear y se lavaron con PBS tres veces nuevamente. Finalmente, las células se montaron en el microscopio de fluorescencia (Nikon TE2000E) y se observaron con el mismo.
Sincronización celular
Para detener las células en la fase M, las células HeLa se presincronizaron con timidina 2 μM durante 18 horas, se liberaron en medio nuevo durante 6 horas y después se detuvieron en la fase M temprana con 0,1 μg/ml de nocodozol durante 6 horas. Las células HeLa se detuvieron en el límite de fase G1/S mediante tratamiento con mimosina 0,5 mM durante 20 horas. A continuación, se liberó una parte alícuota de células en fase G1/S en un medio que contenía hidroxiurea durante 4 h para obtener células en fase S temprana.
Ensayo de incorporación de BrdU
Se incubaron células Hela cultivadas en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina con BrdU 50 μM (Sigma) durante 1 hora a 37 °C después de 24 horas de tratamiento con 17β-desacetiltanginina. A continuación, las células se fijaron con PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y BSA al 1% en PBS durante 20 min y después se incubaron secuencialmente con anti-BrdU (Sigma Chemical Company; 1:500) y conjugados IgG-FITC anti-ratón (Sigma Chemical Company; 1:500), en cada caso durante 1 hora a 37 °C, con tres lavados en PBS después de la incubación de cada anticuerpo. La señal de BrdU se observó con el microscopio de fluorescencia (Nikon TE2000E).
Ensayo de unión a cromatina
Se recogieron células mediante tripsinización y se lavaron dos veces con PBS frío. Se añadió tampón de extracción (EB; ~20 μl/106 células) (KCl 100 mM, HEPES-KOH 50 mM pH 7,5, MgCh 2,5 mM, NaF 50 mM, Na4P2Oy 5 mM, NaVOa 0,1 mM, Triton X-100 al 0,5%, PMSF 1 mM, 2 μg/ml de pepstatina A, 20 μg/ml de leupeptina, 20 μg/ml de aprotinina, Pefabloc 0,2 mM, benzamidina HCl 2 mM y 0,2 mg/ml de bacitracina) para resuspender y lisar las células mediante pipeteo. Las células se dispusieron en hielo durante 10 min y recibieron unos golpecitos para que se mezclaran cada 2-3 min durante la incubación. Un volumen de sacarosa helada al 30% igual a EB que contiene inhibidores de proteasa como en el EB se añadió al fondo del tubo. El tubo se hizo girar a máxima velocidad en una microcentrífuga durante 10 min para separar la cromatina y las proteínas libres. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se mantuvo en hielo. El sedimento se lavó con un volumen igual de EB dando unos golpecitos al tubo para desprender el sedimento de la pared del tubo y se resuspendió mediante agitación con vórtice breve. La suspensión se hizo girar de nuevo a máxima velocidad durante 5 min. Los dos sobrenadantes se combinaron. El sedimento se resuspendió en EB igual a la mitad del volumen del sobrenadante. Las fracciones de sobrenadante y sedimento se trataron finalmente para una inmunotransferencia.
Citometría de flujo (análisis FACS)
Tanto las células flotantes como las adheridas se recogieron y se lavaron una vez con PBS. Las células se fijaron en etanol al 70% durante 1 h a toda la noche a -20 °C, se lavaron a fondo con PBS y después se tiñeron en 50 μg/ml de RNasa A, Triton X-100 al 0,1%, EDTA 0,1 mM (pH 7,4) y 50 μg/ml de yoduro de propidio durante 30 min a 4 °C. Las muestras se analizaron con el instrumento FACSort (Becton Dickinson).
Identificación de agentes antiproliferación con alta especificidad entre células normales y cancerosas
Después del cribado de unos pocos cientos de muestras que son compuestos, fracciones o extractos brutos de plantas y compuestos sintéticos, se identificaron varios candidatos que pueden inhibir las proteínas MCM humanas y la replicación del ADN. De estos candidatos, se aisló y se identificó un pequeño compuesto denominado 17βdesacetiltanginina (figura 1) después de varias rondas de fraccionamiento guiado por actividad, purificación y evaluación de los extractos de plantas, fracciones y compuestos. También se encontró que otros diversos compuestos y un derivado químico de la 17β-desacetiltanginina (7p-desacetiltanginina-diol) que están relacionados estructuralmente con la 17β-desacetiltanginina tienen actividades similares a las de la 17β-desacetiltanginina (figura 1(3)-(8)). Por otra parte, se descubrió que sus isómeros 17alfa (a) (figura 1(1) y (2)) eran inactivos.
Se trataron un par de líneas celulares humanas, L-02 (células hepáticas normales) y HepG2 (una línea celular de cáncer de hígado) con 17β-desacetiltanginina durante 48 horas. La observación directa de la densidad celular y la morfología con el microscopio mostró que la 17β-desacetiltanginina puede inhibir eficazmente la proliferación de células cancerosas (HepG2) y tiene una actividad mucho menor hacia las células normales (L-02) en cultivo (figura 2A). Por lo tanto, se identificó la 17β-desacetiltanginina como un agente antiproliferativo muy activo con poca citotoxicidad hacia las células normales. En la figura 2B-H, la cuantificación del número de células viables se llevó a cabo utilizando el ensayo WST-1 (tetrazolio-1 hidrosoluble).
Para analizar adicionalmente la 17β-desacetiltanginina y determinar los valores de CI50, además de células L-02 y HepG2, se trataron Hep3B (otra línea celular de cáncer de hígado que es negativa para p53), HeLa (línea celular de cáncer de cuello uterino), HK1 y C666-1 (carcinoma nasofaríngeo) y una línea celular de células nasofaríngeas normales inmortalizadas con hTert (NP460) con 17β-desacetiltanginina durante 48 h, y las viabilidades celulares relativas se determinaron mediante ensayo WST-1 (figuras 2B,C). Estas y otras líneas celulares cancerosas (incluido el cáncer de pulmón, etc.; datos no mostrados) se emplearon para demostrar que la 17β-desacetiltanginina puede destruir un amplio espectro de células cancerosas. La 17β-desacetiltanginina inhibió significativamente el crecimiento de todas las líneas celulares cancerosas sometidas a ensayo. Aunque los valores de CI50 fueron ligeramente diferentes entre las diferentes líneas celulares cancerosas, el promedio de CI50 de la 17β-desacetiltanginina en las líneas celulares cancerosas fue de aproximadamente 0,1 μg/ml (0,2 M), mientras que para las células normales fue muy superior (más de 4 μg/ml). Se obtuvo una actividad anticancerosa y una selectividad similares entre células cancerosas y normales para algunos compuestos estructuralmente relacionados, por ejemplo, 17β-neriifolina (figura 2D), 17βdesacetiltanginina-diol, que es un nuevo derivado químico de 17β-desacetiltanginina que sintetizamos (con una menor actividad anticancerosa que la 17β-desacetiltanginina (figura 2E), bufalina, resibufogenina y cinobufagina (tabla siguiente). Por otra parte, la 17a-desacetiltanginina y la 17a-neriifolina tienen poca actividad antiproliferativa (tabla siguiente), lo que indica que la configuración 17β es crítica para la actividad antiproliferativa de estos compuestos.
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A modo de comparación, los fármacos clínicos anticancerosos Paclitaxel (Taxol; figura 2F) y VP16 (fosfato de etopósido; figuras 2G,H) no mostraron una selectividad significativa entre las células cancerosas y las normales (también son citotóxicos para las células normales, así como para células cancerosas; de hecho, el paclitaxel es más tóxico para las células normales del hígado que para las células cancerosas del hígado).
Interrupción de la formación del complejo MCM y la localización nuclear de proteínas MCM
Para analizar si la 17β-desacetiltanginina se dirige a las proteínas hMcm2 y hMcm6 en células humanas, se analizó la posible co-inmunoprecipitación (co-IP) de las dos proteínas en extractos de células humanas a partir de células tratadas con 17β-desacetiltanginina. En la figura 3, se trataron células HeLa asincrónicas con DMSO o 17βdesacetiltanginina (DAT) (figura 3A), o con DMSO, 17β-neriifolina (NRF) o 17β-desacetiltanginina-diol (Diol) (figura 3B) y se prepararon extractos de células completas y se incubaron adicionalmente con el compuesto antes de usarse para co-IP en presencia del compuesto. A continuación, los inmunoprecipitados se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-hMcm6, anti-hMcm2, anti-hMcm4 y anti-hMcm7. Los resultados mostraron que la 17β-desacetiltanginina interrumpió la interacción entre hMcm2 y hMcm6 y entre otras subunidades de MCM (figura 3A). De forma similar, la 17β-neriifolina también pudo interrumpir la interacción hMcm2-hMcm6, mientras que el 17β-desacetiltanginina-diol mostró una actividad más débil (figura 3B).
Debido a que se requieren interacciones por pares entre las subunidades de MCM para la estructura de anillo heterohexamérico de MCM, que es esencial para su importación al núcleo, la interrupción de la interacción entre hMcm2 y hMcm6 debería destruir el hexámero y dar como resultado un fallo en la localización nuclear de proteínas MCM. Para analizarlo empleamos microscopía de fluorescencia indirecta (inmunotinción) utilizando anticuerpos contra las proteínas MCM endógenas y microscopía de fluorescencia directa después de transfección con plásmidos para expresar hMcm2-GFP y hMcm6-GFP en las células.
En la inmunotinción, las células HeLa se trataron con 17β-desacetiltanginina durante 24 horas, y las hMcm2 y hMcm6 endógenas se detectaron mediante anticuerpos específicos contra estas proteínas. Los resultados mostraron que la 17β-desacetiltanginina inhibió la localización nuclear de hMcm2 y hMcm6 (figura 4A). En microscopía de fluorescencia directa, las células HeLa que expresan hMcm2-GFP y hMcm6-GFP se trataron con 17β-desacetiltanginina durante 36 horas a partir de las 4 horas posteriores a la transfección con los plásmidos que expresan hMcm2-GFP y hMcm6-GFP. Los resultados mostraron que algunas de las hMcm2-GFP y hMcm6-GFP expresadas se localizaron en el citoplasma, mientras que en las células de control no tratadas casi todas las hMcm2-GFP y hMcm6-GFP expresadas se localizaron en el núcleo (figura 4B). Para excluir la posibilidad de que la localización citoplasmática de algunas proteínas MCM era debida a una detención del ciclo celular provocada por la 17β-desacetiltanginina, usamos mimosina para detener células en fase G1 tardía en la que todas las proteínas MCM deberían estar en el núcleo si las proteínas MCM no están inhibidas, y encontramos que la localización nuclear de hMcm2 y hMcm6 se evitaba aún mediante la 17βdesacetiltanginina (datos no mostrados).
En conjunto, estos datos indican que la 17β-desacetiltanginina puede bloquear específicamente la localización nuclear de MCM. También encontramos que 17β-neriifolina, otro compuesto aislado de Cerebra manhas y estructuralmente relacionado con la 17β-desacetiltanginina, también puede inhibir la localización nuclear de MCM tan eficazmente como lo puede hacer la 17β-desacetiltanginina, mientras que el 17β-desacetiltanginina-diol, que es un derivado químico de la 17β-desacetiltanginina, tiene una actividad más débil (figura 4C).
Inhibición del ensamblaje de pre-RC
Como componente de pre-RC, el complejo MCM desempeña un papel central en la licencia de la replicación del ADN. Dado que la 17β-desacetiltanginina puede interrumpir las interacciones de hMcm2 y hMcm6 y evitar su localización nuclear, la 17β-desacetiltanginina debería inhibir la asociación de cromatina de proteínas MCM, lo que indica un fallo en el ensamblaje pre-RC (licencia de replicación). A fin de analizarlo, realizamos ensayos de unión a cromatina para detectar proteínas asociadas a la cromatina. En las figuras 5A y B, se trataron células Hela asíncronas con 17βdesacetiltanginina durante 24 horas y se analizaron mediante el ensayo de unión a cromatina (figura 5A). Las células no tratadas (sin tratar), las células tratadas con el disolvente DMSO y las tratadas con 0,2, 0,4 o 0,8 μg/ml de 17βdesacetiltanginina se analizaron en busca de componentes pre-RC en las fracciones de cromatina y sobrenadante mediante inmunotransferencia (figura 5A). Se usó beta-actina como control de carga. Cada muestra de células también se analizó para determinar la distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo (figura 5B). Los experimentos mostrados en las figuras 5C y D eran similares a los de las figuras 5A y B, excepto que las células se sincronizaron en la fase M usando Nocodazol (Noc.) y después se liberaron en medio nuevo que contenía DMSO o 17βdesacetiltanginina (DAT) tal como se indica.
De acuerdo con la predicción, tanto hMcm2 como hMcm6 se redujeron significativamente en las fracciones de cromatina mediante la 17β-desacetiltanginina de una forma dependiente de la dosis (figura 5A). Estos resultados sugieren que pre-RC no se pudo ensamblar en presencia de l7p-desacetiltanginina. Además, las células sufrieron apoptosis según se determina por medio de citometría de flujo con partes alícuotas de las células del mismo experimento (figura 5B).
Para determinar los efectos de la 17β-desacetiltanginina en células sincronizadas, se pre-sincronizaron HeLa en primer lugar en la fase G1 tardía/S temprana con timidina y después se detuvieron en la fase M con nocadozol. A continuación, las células se liberaron en medio nuevo en presencia de 17β-desacetiltanginina. Las células de control, incluidas las células tratadas con DMSO y las no tratadas, pudieron pasar a través de las fases M y G1 y entrar en la fase S (figura 5D). Sin embargo, las células tratadas con 17β-desacetiltanginina solo entraron en la fase G1 y la mayor parte de las células no entraron en la fase S (figura 5D). El análisis de inmunotransferencia mostró que la 17β-desacetiltanginina (figura 5C) impidió en gran medida la carga de MCM en la cromatina. Estos resultados indican que la 17βdesacetiltanginina puede evitar el ensamblaje de pre-RC en células humanas.
Inhibición de la replicación del ADN con apoptosis en células cancerosas
Como la 17β-desacetiltanginina interrumpe las interacciones entre hMcm2 y hMcm6 e inhibe la asociación de las proteínas m Cm con la cromatina, la 17β-desacetiltanginina debería bloquear la replicación del ADN. Para confirmarlo, tratamos las células HeLa con 17β-desacetiltanginina durante 24 horas y después las marcamos con BrdU durante 1 hora. La BrdU incorporada en el ADN celular se detectó mediante un anticuerpo anti-BrdU seguido de anticuerpos secundarios FITC-anti-ratón que se visualizaron con el microscopio de fluorescencia (figura 6A). Se usó DAPI para teñir los núcleos (figura 6A), y se cuantificó el porcentaje de células positivas para BrdU (figura 6B). Se observó una inhibición significativa de la replicación del ADN en las células HeLa tratadas con 17β-desacetiltanginina, ya que casi no se observó señal de BrdU cuando la 17β-desacetiltanginina se encontraba por encima de 0,2 μg/ml, mientras que en las células tratadas con DMSO y no tratadas, aproximadamente el 30% eran positivas para BrdU tal como se esperaba (figuras 6A, B).
Además, la inhibición de la replicación del ADN y la posterior inducción de la apoptosis por la 17β-desacetiltanginina podrían demostrarse mediante citometría de flujo. En la figura 7, las células Hela se bloquearon en la fase M con Nocodazol (Noc.; figura 7A), en la transición G1/S con mimosina (MMS; figura 7B), o en la fase S temprana con hidroxiurea (HU; figura 7C) y después se liberaron en un medio nuevo en presencia de 17β-desacetiltanginina (DAT). Se analizaron las células en diferentes puntos temporales después de la liberación mediante citometría de seguimiento. Ayn. significa células asíncronas. Las células no tratadas y las células tratadas con el disolvente DMSO pudieron completar las fases M, G1 y S después de la liberación (figura 7A). Las células tratadas con 17βdesacetiltanginina pudieron completar la mitosis pero no pudieron entrar en la fase S después de ser liberadas de la detención con nocodazol en la fase M e iniciaron la apoptosis con un tiempo de tratamiento más prolongado con 17βdesacetiltanginina (figura 7A). De forma similar, las células liberadas de la detención con mimosina (MMS) (en la transición G1/S; figura 7B) o la detención con hidroxiurea (HU) (en la fase S temprana; figura 7C) no pudieron terminar la fase S en presencia de 17β-desacetiltanginina. Estos resultados concuerdan con la inhibición de las funciones de MCM, tanto en la iniciación como en la elongación de la replicación del ADN.
La 17β-desacetiltanginina también indujo la muerte celular apoptótica en células cancerosas, ya que se detectó una población de células cancerosas sub-G1, indicativas de apoptosis, mediante citometría de flujo después del tratamiento con 17β-desacetiltanginina (figuras 5B, 7 y 8A), mientras que las células L-02 normales se detuvieron en su mayor parte en la fase G1 con una población G2/M reducida (figura 8A). En la figura 8A, se realizó una citometría de flujo para analizar el contenido de ADN en células HepG2 y L-02 tratadas con 17β-desacetiltanginina a diversas concentraciones durante 24 horas. En la figura 8B, las células Hela se trataron con 17β-desacetiltanginina durante 24 horas y se marcaron con anexina V-Cy3 (An. Cy3) durante 20 minutos. Se utilizó mitoxantrona (MTX), un fármaco anticanceroso clínico que puede inducir la apoptosis en células cancerosas, como control positivo. Los resultados muestran que las células cancerosas tratadas con 17β-desacetiltanginina pudieron teñirse con anexina V (figura 8B), respaldando la idea de que la 17β-desacetiltanginina inducía la apoptosis.
Tal como se ha descrito anteriormente, la 17β-desacetiltanginina inhibió la replicación del ADN en células HeLa asincrónicas (mediante el ensayo de incorporación de BrdU) (figura 6), y la mayor parte de las células sincronizadas liberadas de la fase M entraron en la fase G1 pero aparentemente no entraron en la fase S en presencia de 17βdesacetiltanginina a juzgar por los resultados de la citometría de flujo (figura 7A). Una incubación más prolongada de las células cancerosas con 17β-desacetiltanginina pudo inducir la apoptosis tal como se demuestra mediante una población sub-G1 en los perfiles de citometría de flujo (figura 7A) y mediante tinción con anexina V (figura 8B). Para determinar la causa de la muerte celular en las células cancerosas tratadas con 17β-desacetiltanginina, detuvimos las células HeLa en la transición G1/S con mimosina y después añadimos 17β-desacetiltanginina al medio para pretratar las células durante 12 horas. Después, las células se liberaron del bloqueo con mimosina en presencia de 17βdesacetiltanginina, se recolectaron en diferentes momentos después de la liberación y se analizaron mediante citometría de flujo y ensayos de incorporación de BrdU. Los resultados de incorporación de BrdU mostraron que ~40% de las células tratadas con 17β-desacetiltanginina eran positivas para BrdU, en comparación con ~100% de células positivas para BrdU no tratadas y células tratadas con DMSO; sin embargo, las intensidades de señal de BrdU en las células tratadas con 17β-desacetiltanginina fueron mucho más bajas que las de las células no tratadas y las células tratadas con DMSO (figura 8C), lo que indica que al menos algunas células tratadas con 17β-desacetiltanginina experimentaron un bajo grado de replicación de ADN, que se atribuyo a la inhibición incompleta del complejo MCM y, por lo tanto, a un bajo grado de activación de algunos orvgenes de replicación y a la elongación limitada de la replicación del ADN en cilulas tratadas con 17β-desacetiltanginina. Como tal, la duplicación parcial abortiva del genoma muy probablemente causó daños en el ADN, lo que dio lugar a la apoptosis.
Además de la 17β-desacetiltanginina, también se descubrió que varios compuestos estructuralmente relacionados, por ejemplo la 17β-neriifolina y el 17β-desacetiltanginina-diol, pueden inducir la apoptosis de las células cancerosas, tal como se indica mediante la población de células sub-G1 en análisis de citometría de flujo (figura 8D).
Análisis adicionales de la especificidad de los compuestos antiproliferativos hacia las células cancerosas
Los datos de las figuras 2 y 8A indican que los compuestos antiproliferativos de la presente invención pueden destruir específicamente células cancerosas presentando poca citotoxicidad hacia las células normales. Para analizar si las células normales y/o cancerosas podían reanudar el crecimiento celular después de la eliminación de la 17βdesacetiltanginina, se incubaron células L-02 (hígado normal) y células HepG2 (cáncer de hígado) con 17βdesacetiltanginina o DMSO durante un día, la 17β-desacetiltanginina o el DMSO se retiraron y las células se incubaron adicionalmente con medio de crecimiento nuevo durante tres días. El número de células viables se controló diariamente mediante ensayo WST-1. En la figura 9, L+DAT se refiere a células L-02 tratadas con 17βdesacetiltanginina; L+D representa células L-02 tratadas con DMSO; H+DAT se refiere a células HepG2 tratadas con 17β-desacetiltanginina; y H+D representa células HepG2 tratadas con DMSO antes de liberarlas en medio nuevo. Los resultados mostraron que las células normales, pero no las células cancerosas, reanudaron el crecimiento después de retirar la 17β-desacetiltanginina (figura 9), de acuerdo con nuestros hallazgos de que la mayor parte de las células normales permanecieron en la fase G1 cuando se trataron con 17β-desacetiltanginina, mientras que las células cancerosas entraron en una fase S abortiva y murieron con el mismo tratamiento (figura 8A).
Actividad anticancerosa in vivo en el modelo de xenoinjerto de ratones desnudos
Se llevaron a cabo análisis de actividad anticancerosa in vivo en el modelo de xenoinjerto de ratones desnudos mediante la inoculación de células HeLa en ratones desnudos tanto en el flanco izquierdo como en el derecho. Después del agrupamiento aleatorio, los ratones desnudos se trataron por vía intraperitoneal con 17βdesacetiltanginina o el disolvente (propilenglicol al 30% en PBS). En el primer análisis, 3 días después de la inoculación del tumor, cuando comenzaron a formarse pequeños tumores, se trataron dos grupos de ratones desnudos los días 1-3 y 6-10 con 3,5 y 7,0 mg de fármaco/kg de peso corporal de 17β-desacetiltanginina, respectivamente, y otro grupo de ratones de control se trataron con el mismo volumen del disolvente (figura 10A). En la figura 10A, los datos de volumen tumoral representados por el símbolo de punto de datos de tamaño pequeño vinculado con líneas finas se obtuvieron en los días en que se realizaron tanto la medición del tamaño tumoral como las inyecciones de fármacos, y los datos de volumen tumoral representados por el símbolo de punto de datos de tamaño grande vinculado con líneas gruesas se obtuvieron en los días sin inyección de fármaco. Cada tamaño tumoral fue el promedio de diez tumores en cinco ratones en cada grupo. Los resultados mostraron que la 17β-desacetiltanginina suprimió significativamente el crecimiento de tumores en un 90% con la dosis alta (7,0 mg/kg) y en un 70% con la dosis baja (3,5 mg/kg). De hecho, con la dosis alta, durante las últimas 5 inyecciones continuas de 17β-desacetiltanginina, el tamaño de los tumores incluso disminuyó, lo que sugiere que la 17β-desacetiltanginina había inducido la muerte de las células tumorales en los ratones.
Estudio comparativo con taxol y evaluaciones de toxicidad in vivo
Después se realizó otra serie de experimentos con animales con un periodo de tiempo más largo, en el que se realizaron quince inyecciones de fármaco a 5,0 mg/kg una semana después de la inoculación del tumor cuando el tamaño tumoral alcanzó 0,05-0,1 cm3. En la figura 10B, las inyecciones de fármacos y las mediciones del tamaño tumoral se realizaron en los días representados por los puntos de datos, y las fotografías de la figura 10C se tomaron el día 20. Los resultados mostraron que el crecimiento tumoral se suprimió significativamente de nuevo; los tumores en los ratones tratados con 17β-desacetiltanginina eran un 80% más pequeños que los de los ratones de control tratados con disolvente (figuras 10B, C). A modo de comparación, paclitaxel (taxol) a 10 mg/kg por inyección mostró muchas menos actividades antitumorales que la 17β-desacetiltanginina en los primeros 10 días, y los ratones murieron el día 10 debido a la toxicidad de taxol (figura 10B).
Al final del tratamiento farmacológico tal como se describe en la figura 10B, no se observó pérdida de peso evidente en los ratones desnudos después de la administración intraperitoneal de 5,0 mg/kg de 17β-desacetiltanginina durante 20 días (figura 11A). En la figura 11, S se refiere a ratones tratados con disolvente sin inoculación tumoral; S+T representa ratones tratados con disolvente con inoculación tumoral; DAT se refiere a ratones tratados con 17βdesacetiltanginina sin inoculación tumoral; DAT+T representa ratones tratados con 17β-desacetiltanginina con inoculación tumoral; y P+T se refiere a ratones tratados con paclitaxel con inoculación tumoral. Se seleccionaron tres de los cinco ratones con tamaño de tumor intermedio en cada grupo para el examen de parámetros fisiológicos. Se diseccionaron de cada ratón los tumores (T) y los órganos internos, incluidos el hígado (L), el corazón (H) y el riñón (K). El tamaño de los tumores (figura 11B) concordaba con las medidas del volumen tumoral presentadas en la figura 10B. Todos los órganos parecían normales, por ejemplo, no se observó intumescencia ni color anormal (figura 11B), y los pesos de los órganos con respecto a los pesos corporales no cambiaron significativamente (figura 11C).
Además, también se recogió sangre de cada ratón para los análisis de las actividades de ALT (alanina aminotransferasa) y LDH (lactato deshidrogenasa). El nivel de ATL revela daño hepático, mientras que el nivel de LDH generalmente refleja daños en cualquier tejido. Los resultados de ambos análisis se representaron como los valores de los ratones tratados de manera diferente con respecto a los no tratados. Tal como se muestra en la figura 11D, la 17β-desacetiltanginina no indujo un aumento significativo del nivel de ATL o LDH en sangre. Tomados en conjunto, estos datos sugieren intensamente que la 17β-desacetiltanginina tiene una actividad antitumoral significativa con poca toxicidad en ratones.
Si bien se han descrito y señalado características novedosas fundamentales de la invención aplicadas a una forma de realización preferida de la misma, se entenderá que se pueden realizar diversas omisiones, sustituciones y cambios en la forma y los detalles de las formas de realización ilustradas por parte de los expertos en la técnica sin apartarse del espíritu de la invención. La invención no está limitada a las formas de realización descritas anteriormente, que se presentan solo como ejemplos, pero que pueden modificarse de diversas maneras dentro del alcance de la protección definida por las reivindicaciones de patente adjuntas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para tratar cáncer en un paciente, que comprende un compuesto anticanceroso seleccionado por su efecto inhibidor sobre el complejo MCM humano, en el que dicho efecto inhibidor se efectúa mediante la interrupción de la formación de un complejo MCM funcional a partir de subunidades de MCM y en el que dicho compuesto anticanceroso se selecciona de entre 17β-desacetiltanginina, 17βneriifolina, 17β-desacetiltanginina-diol y cinobufagina.
2. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho complejo MCM funcional es una estructura de anillo heterohexamérico capaz de moverse al interior del núcleo y es necesario para la replicación del ADN.
3. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho compuesto anticanceroso interrumpe la formación del complejo MCM funcional interfiriendo en la interacción entre hMcm2 y hMcm6.
4. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho agente anticanceroso es 17-beta-desacetiltanginina.
5. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho agente anticanceroso es 17­ beta-desacetiltanginina-diol.
6. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho agente anticanceroso es cinobufagina.
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