ES2250406T3 - Derivados de triterpenoides. - Google Patents
Derivados de triterpenoides.Info
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Abstract
Compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, destinado a ser utilizado en terapia, en la que: X1 es C=O, C=NOR1a, CHOR1a, CHOCOR1a, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR9, CHOC(O)OR1a, CHOC(O)OR10, y Hal es Br, Cl, I, F; X3 es C=O, CHOR1b, CHOCOR1b, o X3 y R8 juntos son CHOCOCH2; R1-5 son cada uno independientemente H o alquilo C1-6; R6 es H, o está ausente si "a" es un doble enlace; R7 es H, COOR1c, YOCOR1c, COOYOCOR1e, YCOOR1e; R8 es H, COOR1d, YCOOR1d, YCOOR10, YCOHaI, COOYOCOR1d, CH2OR1d, CH2COCOR1d, COCOCOR1d, o R7 y R8 juntos son =CH2 o CH2OCOCH2; R9 es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico; R10 es alquilo C1-4 sustituido con Hal; "a" es un enlace doble o un enlace sencillo; y en la que Y = (CH2)n n= 0 a 5; R1a-1d son grupos iguales o diferentes de R1.
Description
Derivados de triterpenoides.
La presente invención se refiere al uso
terapéutico y a la actividad biológica de derivados de
triterpenoides. La invención se refiere además a nuevos derivados
de triterpenoides.
Hasta la actualidad, la técnica anterior se ha
centrado principalmente en compuestos que son capaces de regular el
ciclo celular en virtud de la inhibición de las quinasas
dependientes de ciclinas (CDK). Los ejemplos de tales compuestos
incluyen butirolactona I, flavopiridol, bohemina, olomucina,
roscovitina, purvanalol e indarrubicina.
Existe un considerable apoyo en la bibliografía
para la hipótesis de que las CDK y sus proteínas reguladoras
desempeñan un papel significativo en el desarrollo de tumores
humanos. De este modo, en muchos tumores, se ha observado una
expresión o actividad anormal temporal de las CDK, junto con una
importante desregulación de inhibidores de proteínas (mutaciones,
supresiones). Esto da como resultado la activación de CDK y, en
consecuencia, la regulación defectuosa de la transición G1/S. A
diferencia de las células normales, las células tumorales no se
detienen en G1, y puesto que se independizan de los factores de
crecimiento, pasan el punto de restricción de G1 y entran muy
rápidamente en la fase S.
Contrariamente a la técnica anterior, la presente
invención se refiere a compuestos que son antiproliferativos, pero
que se cree que operan mediante un mecanismo distinto de la
inhibición de las CDK.
La transición G_{1}/S del ciclo celular de los
mamíferos está estrechamente regulada por la proteína del
retinoblastoma (pRb). Las mutaciones o supresiones del gen de
retinoblastoma predisponen a los individuos al retinoblastoma
familiar y a otros tipos de cánceres. La proteína pRb es una
proteína acopladora, que en su forma hipofosforilada tiene la
capacidad para unirse, y de este modo para inactivar, a factores de
transcripción de la fase S, tales como DP-1 y E2F.
Sin embargo, tras la fosforilación mediante quinasas dependientes de
ciclinas G_{1}/S (CDK) (CDK4/ciclina D1-D3,
CDK6/ciclina D1-D3, CDK2/ciclina A), la pRb
hiperfosforilada libera los factores de transcripción y se inicia
la fase S. En la fase S, la fosforilación de la proteína pRb se
mantiene mediante la actividad de complejos de CDK2/ciclina E. De
este modo, la hiperfosforilación de la proteína pRb desempeña un
papel clave en la patología molecular de células cancerosas con
actividad de CDK alterada.
La presente invención se refiere al uso de
compuestos de triterpenoides derivados de los productos naturales
betulina y ácido betulínico (BA), como se muestran en la fórmula
(A). Los compuestos de la presente invención se denominan en lo
sucesivo como betulininas.
Con respecto a su actividad biológica y
terapéutica, se cree que los compuestos descritos en la presente
invención son de beneficio específico en el tratamiento de
enfermedades proliferativas tales como cánceres y leucemias.
Ya se conocen en la técnica varios de los
compuestos adecuados para uso en la presente invención, por ejemplo
los descritos en Ber. Dtsch. Chem. Ges. 55, 2332 (1922), Schluze,
H. et al.; Acta Chem. Scand., B 29, 139 (1975), Suokas
E. et al.; Collect. Czech. Chem. Commun. 56, 2936
(1991), Sejbal J. et al.; Collect. Czech. Chem. Commun.
64, 329 (1999), Klinotová et al.; Indian. J. Chem.,
Sect. B 34, 624 (1995), Dinda B. et al.; Chem. Listy
91, 1005 (1997), \check{S}arek J. et al.; Collect
Czech Chem Commun 58, No 10, 2505-2516
(1993), Klinotova E. et al.; J. Chem. Soc. C.
350-351 (1970), Kirk et al.; Chem. Nat.
Compd. (Eng translation) 28, No. 2, 179-184
(1992), Odinokova et al. Sin embargo, estas descripciones no
incluyen ninguna indicación en cuanto a la posible actividad
biológica de tales compuestos.
El documento WO 98/51293 describe derivados del
ácido betulínico que tienen propiedades antiproliferativas.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere al uso de un compuesto de fórmula I, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, destinado a ser utilizado en
terapia,
en la
que:
- X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHOC(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
- X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y R^{8} juntos son CHOCOCH_{2} y forman una espirolactona;
- R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo inferior;
- R^{6} es H, o está ausente si "a" es un doble enlace;
- R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
- R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCO COR^{1d}, o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
- R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
- R^{10} es alquilo inferior sustituido con Hal;
- "a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
- y en la que
- Y = (CH_{2})n
- n= 0 a 5;
- R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}.
En un aspecto preferido, la invención se refiere
al uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para tratar a un paciente que padece leucemia,
cáncer u otro trastorno proliferativo.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a nuevas betulininas de fórmula estructural Ia, o sales
farmacéuticamente aceptables de las mismas,
\newpage
en la
que:
- X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHOC(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
- X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y X^{8} juntos son CHOCOCH_{2} y forman una espirolactona;
- R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo inferior;
- R^{6} es H, o está ausente si "a" es un enlace doble;
- R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
- R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOC OR^{1d},
- o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
- R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
- R^{10} es alquilo inferior sustituido con Hal;
- "a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
- y en la que
- Y = (CH_{2})n
- n = 0 a 5;
- R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}
con la condición de
que
(i) cuando X^{1} es CHOAc, X^{3} es C=O,
"a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me,
R^{6} es H;
- -
- cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de COOH, CH_{2}COCOPr^{i}, COCOCOPr^{i}, CH_{2}COOH, o CH_{2}CH_{2}CO^{i} Pr;
- -
- cuando R^{7} es CO_{2}Me, R^{8} es distinto de CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2};
- -
- cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOMe, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}COPr^{i}; y
(ii) cuando X^{1} es CHOH, X^{3} es C=O,
"a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me, y
R^{6} es H,
- -
- cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOH, CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2} o CH_{2}COOMe;
- -
- cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de CH_{2}COOH;
o una sal farmacéuticamente
aceptable de las
mismas.
Como se utiliza en la presente invención, la
expresión alquilo inferior significa un grupo alquilo de cadena
lineal o ramificada que contiene de 1 a 6 átomos de carbono,
incluyendo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,
butilo terciario.
Dentro de las opciones proporcionadas para los
grupos X^{1}, X^{3} y R^{1-8} de fórmula I,
se prefieren las siguientes opciones. Preferentemente,
X^{1} es CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a} o
CHOCOY-Hal; y
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d},
COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d} o
COCOCOR^{1d}.
En una realización más preferida,
R^{2-5} son todos metilo, y R^{1} es como se
define anteriormente para el grupo pertinente
R^{1a-1d};
\newpage
X^{1} es
- -
- CHOCOCH_{2}Cl; o
- -
- CHOR^{1a} o CHOCOR^{1a}, en el que R^{1a} es H y metilo respectivamente;
X^{3} es C=O, CHOH o CHOAc;
R^{7} es H, COOH, COOMe, CH_{2}OAc,
COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que
Y es CH_{2} y R^{1e} es alquilo
C_{1-4};
R^{8} es
- -
- COOR^{1d}, en el que R^{1d} es H o metilo;
- -
- YCOOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es H, metilo o etilo;
- -
- COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es alquilo C_{1-4};
- -
- CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4};
- -
- CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4}.
De las definiciones preferidas proporcionadas
anteriormente, es preferible que
R^{8} sea
- -
- COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es metilo o butilo;
- -
- CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es metilo o etilo;
- -
- CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es propilo; y
R^{7} es COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el
que Y es CH_{2} y R^{1e} es metilo o butilo.
En una realización preferida, "a" es un
enlace sencillo y R^{6} es H.
En una realización más preferida del primer
aspecto de la invención, los compuestos de uso se seleccionan de los
mostrados a continuación en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
En una realización más preferida, el compuesto se
selecciona de:
Con respecto al segundo aspecto de la invención,
las realizaciones preferidas que se refieren a los compuestos son
idénticas a las proporcionadas anteriormente para el primer aspecto
con aplicación de la condición de la fórmula Ia.
Los compuestos más preferidos del segundo aspecto
son los representados a continuación en la Tabla 1a.
\newpage
Con respecto al conjunto de la invención, es
preferible que el trastorno proliferativo sea cáncer o leucemia. En
una realización, el cáncer o leucemia es p53, independiente de
hormonas y de resistencia a múltiples fármacos. En otra
realización, el cáncer o leucemia es independiente del estado de
Rb.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a un método para tratar pacientes que padecen cáncer,
mediante la administración de cantidades terapéuticamente eficaces
de un compuesto de fórmula I o sales o ésteres farmacéuticamente
aceptables del mismo.
Sin desear estar limitados por la teoría, los
estudios preliminares sugieren que en lugar de influir sobre la
actividad de quinasas dependientes de ciclinas, los compuestos de la
presente invención parece que operan mediante un mecanismo
alternativo. En particular, se cree que las betulininas de la
presente invención pueden inhibir la proliferación celular e
inducir la muerte de las células cancerosas de una manera que
implica principalmente modificaciones
post-traduccionales, principalmente la
fosforilación, de una proteína reguladora clave implicada en la
proliferación celular. Más específicamente, se cree que las
betulininas de la invención efectúan un cambio en el estado de
fosforilación de la proteína Rb. Tal mecanismo puede ser ventajoso
puesto que se piensa que los compuestos de la presente invención
pueden ser capaces de inhibir la proliferación celular en el tejido
tumoral proliferante, pero no en el tejido sano.
De este modo, en una realización adicional, la
presente invención se refiere a un método para tratar una
enfermedad proliferativa cancerosa o leucémica efectuando un cambio
en el estado de fosforilación de la proteína pRb mediante la
administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto de fórmula I o sales o ésteres farmacéuticamente
aceptables del mismo.
Los compuestos de la presente invención también
son capaces de inducir apoptosis (muerte celular programada) en
células proliferativas. De este modo, en una realización adicional,
la presente invención se refiere a un método para inducir la muerte
celular en células proliferativas, que comprende administrar una
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I o
sales o ésteres farmacéuticamente aceptables del mismo.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de betulininas de fórmula I como productos químicos
de investigación y como compuestos para el diagnóstico clínico y/o
de laboratorio. Más particularmente, la invención se refiere al uso
de betulininas como productos químicos de investigación para el
estudio de los procesos de fosforilación/desfosforilación de
sustratos celulares, de la proliferación celular, de la
purificación de moléculas diana, y/o para estudios del ciclo
celular.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
además al uso de un compuesto de fórmula I en la preparación de un
medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad
proliferativa.
Como se utiliza en la presente invención, la
expresión "preparación de un medicamento" incluye el uso de un
compuesto de fórmula I directamente como el medicamento, además de
su uso en un programa de cribado para la identificación de otros
agentes antiproliferativos, o en cualquier etapa de la fabricación
de tal medicamento.
Tal programa de cribado puede incluir, por
ejemplo, un ensayo para determinar el estado de fosforilación de
sustratos celulares, y determinar si una sustancia candidata es
capaz de imitar la actividad de una betulinina de fór-
mula I.
mula I.
De este modo, en una realización adicional, la
invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I, o una sal
farmacéuticamente aceptable, una forma cristalina, un complejo, un
hidrato, o un éster hidrolizable del mismo, en un ensayo para
determinar el estado de fosforilación de sustratos celulares, y
opcionalmente en la identificación de compuestos candidatos que
actúen de manera similar.
Preferentemente, el sustrato celular, cuyo estado
de fosforilación se ensaya, es la proteína de Rb.
Los compuestos de los aspectos primero y segundo
de la presente invención pueden estar presentes como sales o
ésteres, en particular sales o ésteres farmacéuticamente
aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables del
producto de la invención incluyen sales de adición de ácidos o
sales de bases adecuadas del mismo. En Berge et al., J.
Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977) se puede
encontrar un repaso de las sales farmacéuticas adecuadas. Las sales
se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes, tales como
ácidos minerales, por ejemplo ácido sulfúrico, ácido fosfórico o
ácidos hidrohálicos; con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes,
tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono que
están no sustituidos o que están sustituidos (por ejemplo, mediante
halógeno), tales como ácido acético; con ácidos dicarboxílicos
saturados o insaturados, por ejemplo oxálico, malónico, succínico,
maleico, fumárico, ftálico o tereftálico; con ácidos
hidroxicarboxílicos, por ejemplo ascórbico, glicólico, láctico,
málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido
aspártico o ácido glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos
organosulfónicos, tales como ácidos alquil
(C_{1}-C_{4}) o arilsulfónicos que están no
sustituidos o sustituidos (por ejemplo, mediante un halógeno),
tales como ácido metano- o p-toluenosulfónico.
Los ésteres se forman usando ácidos orgánicos o
alcoholes/hidróxidos, dependiendo del grupo funcional que se está
esterificando. Los ácidos orgánicos incluyen ácidos carboxílicos,
tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 12 átomos de carbono
que están no sustituidos o sustituidos (por ejemplo, mediante
halógeno) tales como ácido acético; con ácido dicarboxílico
saturado o insaturado, por ejemplo oxálico, malónico, succínico,
maleico, fumárico, ftálico o tereftálico; con ácidos
hidroxicarboxílicos, por ejemplo ascórbico, glicólico, láctico,
málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido
aspártico o ácido glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos
organosulfónicos, tales como ácidos alquil
(C_{1}-C_{4})- o arilsulfónicos que están no
sustituidos o sustituidos (por ejemplo, mediante un halógeno), tales
como ácido metano- o p-toluenosulfónico. Los
hidróxidos adecuados incluyen hidróxidos inorgánicos, tales como
hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio,
hidróxido de aluminio. Los alcoholes incluyen alcanoalcoholes de
1-12 átomos de carbono que pueden estar no
sustituidos o sustituidos (por ejemplo mediante un halógeno).
En todos los aspectos de la presente invención
previamente discutidos, la invención incluye, cuando sea apropiado,
todos los enantiómeros y tautómeros de los compuestos de fórmula I
o Ia. El experto en la materia reconocerá los compuestos que poseen
propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales), o
características tautómeras. Los enantiómeros y/o tautómeros
correspondientes se pueden aislar/preparar mediante métodos
conocidos en la técnica.
La invención se refiere además a los compuestos
de, o de uso, en la presente invención en sus diversas formas
cristalinas, formas polimórficas y formas (an)hidras. Es
bien sabido en la industria farmacéutica que los compuestos químicos
se pueden aislar en cualquiera de tales formas variando ligeramente
el método de purificación y/o aislamiento de los disolventes usados
en la preparación sintética de tales compuestos.
La invención incluye además los compuestos de la
presente invención, o de uso en la presente invención, en forma de
profármacos. Tales profármacos son generalmente compuestos de
fórmula I o Ia en el que uno o más grupos apropiados se han
modificado de manera que la modificación se invierte con la
administración a un ser humano o a un mamífero. Tal inversión se
realiza habitualmente mediante una enzima presente de forma natural
en tal sujeto, aunque es posible que se administre un segundo
agente junto con tal profármaco a fin de realizar in vivo la
inversión. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen ésteres
(por ejemplo, cualquiera de los descritos anteriormente), en los que
la inversión se puede llevar a cabo mediante una esterasa, etc.
Otros sistemas son bien conocidos por los expertos en la
técnica.
La presente invención también comprende
composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la
invención. A este respecto, y en particular para la terapia humana,
incluso aunque los compuestos de la presente invención (incluyendo
sus sales farmacéuticamente aceptables, ésteres y solvatos
farmacéuticamente aceptables) se pueden administrar solos,
generalmente se administrarán en mezcla con un vehículo, excipiente
o diluyente farmacéutico, seleccionado con respecto a la vía
pretendida de administración y a la práctica farmacéutica
estándar.
De este modo, la presente invención también se
refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden betulininas o
sales o ésteres farmacéuticamente aceptables de las mismas, junto
con al menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente
aceptable. A título de ejemplo, en las composiciones farmacéuticas
de la presente invención, los compuestos de la invención se pueden
mezclar con cualquier aglutinante o aglutinantes adecuados,
lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o
agentes de revestimiento, y/o agente o agentes solubilizantes. En
"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2ª Edición, editado
por A Wade y PJ Weller, se pueden encontrar ejemplos de tales
excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de
composiciones farmacéuticas descritas aquí.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden adaptar para las vías oral, rectal, vaginal,
parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial,
intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa,
nasal, bucal o sublingual de administración.
Para la administración oral, se hace uso
particular de tabletas comprimidas, pastillas, comprimidos,
píldoras, gotas y cápsulas. Preferentemente, estas composiciones
contienen de 1 a 250 mg, y más preferentemente de 10 a 100 mg, de
ingrediente activo por dosis.
Otras formas de administración comprenden
disoluciones o emulsiones que se pueden inyectar de forma
intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica,
intraperitoneal, o intramuscular, y que se preparan a partir de
disoluciones estériles o esterilizables. Las composiciones
farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma
de supositorios, pesarios, suspensiones, emulsiones, lociones,
ungüentos, cremas, geles, pulverizaciones, disoluciones o polvos muy
finos.
Un medio alternativo para la administración
transdérmica es el uso de un parche dérmico. Por ejemplo, el
ingrediente activo se puede incorporar en una crema que consiste en
una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. El
ingrediente activo también se puede incorporar, a una concentración
entre 1 y 10% en peso, en un ungüento que consiste en cera blanca o
base de parafina blanda blanca, junto con estabilizantes y
conservantes, según se requiera.
Las formas inyectables pueden contener entre
10-1.000 mg, preferentemente entre
10-250 mg, de ingrediente activo por dosis.
Las composiciones se pueden formular en una forma
de dosificación unitaria, es decir, en forma de porciones discretas
que contienen una dosis unitaria, o un múltiplo o subunidad de una
dosis unitaria.
El experto en la materia puede determinar
fácilmente una dosis apropiada de una de las actuales composiciones
para administrarla a un sujeto sin experimentación innecesaria.
Típicamente, el médico determinará la dosis real que será la más
adecuada para un paciente individual, y variará con la edad, el peso
y la respuesta del paciente particular. Las dosis descritas en la
presente invención son ejemplares del caso medio. Por supuesto,
pueden haber casos individuales en los que merezca la pena
intervalos de dosificación mayores o menores, y estos están dentro
del alcance de esta invención.
En una realización ejemplar, una o más dosis de
10 a 150 mg/día se administrarán al paciente para el tratamiento del
tumor maligno.
La invención se refiere además a métodos de
síntesis química de los compuestos descritos anteriormente.
En una realización, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula I tal
como se ha definido anteriormente, que comprende:
- (i)
- oxidar un compuesto de fórmula Ib a un compuesto de fórmula Ic;
- (ii)
- reducir dicho compuesto de fórmula Ic para formar un compuesto de fórmula Id; y opcionalmente
- (iii)
- convertir dicho compuesto de fórmula Id a un compuesto de fórmula I en la que "a" es un doble enlace.
En una realización preferida, el compuesto de
fórmula Ib se oxida a Ic mediante tratamiento secuencial con
dióxido de selenio, ácido peroxiacético y tetróxido de rutenio.
En una realización más preferida, la reducción de
Ic a Id es una reducción estereoselectiva.
Incluso más preferentemente, el compuesto de
fórmula Ic se reduce a Id mediante tratamiento con borohidruro de
sodio en presencia de una sal de cerio (III).
En un aspecto preferido, la etapa (iii) comprende
esterificar un compuesto de fórmula Id, en la que R^{1d} es H,
oxidar y deshidrogenar.
La preparación de los compuestos de la presente
invención se discutirá con mayor detalle a continuación, haciendo
referencia específica a las realizaciones preferidas. El experto en
la materia pertinente será capaz de preparar otros compuestos de la
invención mediante selección de los reactivos apropiados.
El siguiente esquema ilustra la síntesis de
compuestos de fórmula I en la que X^{1} es CHOAc, X^{2} es
CH_{2}, X^{3} es C=O, R^{1-5} son metilo,
R^{6} es H o está ausente (cuando "a" es un doble enlace),
R^{7} es CH_{2}OAc, y R^{8} es COOH, COOCH_{2}OCOMe o
COOCH_{2}OCOC(CH_{3})_{3}.
Condiciones: a, acetilación con anhídrido
acético en presencia de una base (por ejemplo, piridina); b,
isomerización del doble enlace mediante tratamiento con bromuro de
hidrógeno en ácido acético; c, oxidación (por ejemplo, con
dicromato sódico); d, oxidación (por ejemplo, con dióxido de
selenio); e, oxidación (por ejemplo, con ácido
peroxiacético); f, ruptura del doble enlace (por ejemplo, con
etóxido de rutenio); g, reducción estereoselectiva (por
ejemplo, con borohidruro de sodio en presencia de una sal de
cerio (III)); h, esterificación con pivalato de clorometilo
(POM-Cl) en presencia de una base (por
ejemplo,
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU)); i, esterificación con acetato de bromometilo
(AcM-Br) en presencia de una base (por ejemplo,
DBU); j, deshidrogenación (por ejemplo, con dióxido de
selenio); k, hidrólisis (por ejemplo con óxido de
bis(tributilestaño)).
El esquema a continuación ilustra la síntesis del
compuesto I.58 de fórmula I en la que X^{1} es CHOAc, X^{3} es
C=O, R^{1}-R^{5} son metilos, R^{6} es H,
R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es COF.
Condiciones: 1, reacción con trifluoruro
de dietilaminoazufre.
La presente invención también se describe
haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
la Figura 1A muestra una microfotografía
electrónica de una célula de cáncer pulmonar A549 normal, no
tratada, unida al cubreobjetos con un número de pseudópodos bien
formados y una estructura fina de la membrana citoplasmática.
La Figura 1B muestra una microfotografía
electrónica de células de cáncer pulmonar A549 tratadas con ácido
betulínico. La célula de la izquierda está unida al cubreobjetos, y
muestra una morfología normal con una estructura fina de la membrana
citoplasmática, mientras que la célula de la derecha ya muestra una
membrana citoplasmática aburbujada, una señal temprana de
apoptosis.
La Figura 1C muestra una microfotografía
electrónica de células de cáncer pulmonar A549 tratadas con 1.3.
Ésta ilustra una célula tumoral apoptótica típica, con un extenso
aburbujamiento de la membrana citoplasmática, de su unión y
formación de cuerpos apoptóticos.
\newpage
La Figura 1D es un aumento de la Figura 1C, que
muestra detalles de la formación de cuerpos apoptóticos en células
tratadas con 1.3.
La Figura 2 muestra la actividad anticancerígena
de la betulinina 1.3 en neuroblastoma
SK-N-AS humano
xenotransplantado.
La Figura 3 muestra los resultados de la
electroforesis en SDS-PAGE de proteínas celulares
totales. En particular, el gel muestra que la betulinina 1.3, pero
no el ácido betulínico (BA), induce la rápida desfosforilación de
la proteína Rb.
La Figura 4A muestra un análisis del ciclo
celular de células tratadas con 1.3 y paclitaxel como control.
La Figura 4B muestra la inducción de apoptosis en
células tratadas con 1.3 o paclitaxel como control.
En los ejemplos descritos se puede encontrar una
referencia más detallada a las figuras anteriores.
La presente invención se ilustra además mediante
los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como
adicionalmente limitativos.
Los valores de los desplazamiento químicos
(escala \delta, ppm) y las constantes de acoplamiento (J, Hz), en
los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C, se obtuvieron usando un
espectrómetro Varian UNITY-INOVA 400 FT (^{1}H a
400 MHz y ^{13}C a 100,6 MHz) en deuterocloroformo, con
tetrametilsilano (para datos de RMN ^{1}H \delta = 0 ppm) como
patrón interno. Para los datos de RMN ^{13}C, \delta
(CDCl_{3}) = 77,00 ppm. Se da el valor para un multiplete, ya sea
definido (doblete (d), triplete (t), cuartete (q), septete (sept.))
o no (m), en el punto medio aproximado, excepto que se cite un
intervalo (s = singlete, b = ancho).
Los espectros de masas mediante impacto
electrónico (EIMS) se midieron en un instrumento INCOS 50. La
energía electrónica ionizante es 75 eV, la temperatura de la fuente
de iones es 150ºC. El EIMS se usó para determinar los pesos
moleculares, correspondiendo M^{+} al ion molecular.
Éter es éter dietílico. El THF y el dioxano se
secaron sobre sodio. El ácido acético se purificó antes del uso
mediante tratamiento con trióxido de cromo y destilación. Las
reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, excepto que
se establezca de otro modo. El transcurso de la reacción se
monitorizó mediante cromatografía de capa fina (TLC) en gel de
sílice 60 G (Merck, detección mediante pulverización con 10% de
ácido sulfúrico y calentamiento). El procedimiento de tratamiento
implica la dilución con el disolvente especificado (de otro modo el
disolvente de la reacción orgánico), la extracción con agua y
después con salmuera o con hidrogenocarbonato de sodio, el secado
sobre sulfato magnésico anhidro, y la evaporación a vacío para dar
un residuo.
La betulina bruta (500 g) se disolvió en una
mezcla de 250 ml de piridina y 250 ml de anhídrido acético. La
mezcla se puso a reflujo entonces durante media hora. Tras enfriar,
los cristales resultantes se separaron por filtración y se lavaron
con ácido acético, etanol y agua. Una disolución del diacetato de
lup-20(29)-en-3\beta,28-diilo
bruto (400 g) en cloroformo se filtró a través de una columna de
alúmina, y la columna se lavó con cloroformo. El filtrado se
evaporó entonces a presión reducida. El residuo se cristalizó en
cloroformo/metanol para obtener 250 g de compuesto del título que,
según TLC, contiene trazas de acetato de luteol. Después de la
recristalización en cloroformo/metanol, el rendimiento del compuesto
puro fue 239 g, p.f. 222-223ºC,
[\alpha]_{D} +22º (c 0,4; CHCl_{3}). [Schulze H.,
Pieroh K.: Ber. Dtsch. Chem. Ges. 55, 2332 (1992)].
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del
título es el siguiente:
0,84 s, 0,84 s, 0,85 s, 0,97 s, 1,03 s, 1,68, 6 x
3H (6 x CH_{3}); 2,04 s, 3 H, 2,07 s, 3 H (2x OAc); 2,44 ddd, 1 H
(J' = 11,4, J' = 10,9, J''' = 0,7, H-19); 3,85 d, 1
H (J = 11,1, H-28a); 4,25 dd, 1 H, (J' = 11,1, J''
= 1,4, H-28b); 4,47 m, 1 H
(H-3\alpha); 4,59 m, 1 H (\Sigma J = 3,4,
H-29E); 4,69 m, 1 H (\Sigma J = 2,1,
H-29Z).
Se añadió una disolución de bromuro de hidrógeno
en ácido acético (38%, 1,4 l) a una disolución de diacetato de
lup-20(29)-en-3\beta,28-diilo
(100 g, 190 mmoles) en una mezcla de benceno, ácido acético y
anhídrido acético (1 l:0,5 l:50 ml). La mezcla de reacción se puso
a reflujo hasta que la reacción estuvo terminada (la TLC se
desarrolló en una mezcla de hexano/éter). Después de enfriar, la
mezcla de reacción se vertió sobre agua enfriada con hielo (3:1), y
se extrajo con benceno (3 x 0,5 l). Las fases orgánicas combinadas
se lavaron con disolución acuosa de NaHCO_{3}, con disolución de
NaHSO_{3} y con agua, y se secaron sobre sulfato de magnesio. El
procedimiento de tratamiento habitual dio 90 g de un residuo marrón
oscuro. El polvo seco se extrajo en un extractor Soxhlet con
acetona, hasta que se puso blanco. Después de secar en aire, el
producto se cristalizó en butanona. El rendimiento del compuesto del
título fue 74 g (74%), p.f. 215-216ºC,
[\alpha]_{D} +15º (c 0,45; CHCl_{3}). [Suokas E., Hase
T.: Acta Chem. Scand., B 29, 139 (1975)].
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del
título es el siguiente:
0,84 s, 0,85 s, 0,89 s, 0,90 s, 0,91 d, 3 H (J =
6,8), 0,99 d, 3 H (J = 6,8), 1,06 s, 7 x 3H (7 x CH_{3}); 2,04 s,
3 H, 2,05 s, 3 H (2x OAc); 2,25 m, 2 H (\Sigma J \sim 15); 2,43
m, 1 H (\Sigma J \sim 15); 3,14 sept., 1 H (J = 7,
H-20); 3,98 d, 1 H (J = 10,8,
H-28a); 4,03 d, 1 H (J = 10,8,
H-28b); 4,49 m, 1 H
(H-3\alpha).
Se disolvieron diacetato de
lup-18-en-3\beta,28-diilo
(50 g; 95 mmoles), dicromato sódico (22,5 g; 75,5 mmoles) y acetato
sódico (5 g) en una mezcla de benceno y ácido acético (0,7 l, 0,3
l). La mezcla de reacción se dejó reposar hasta que la reacción
estuvo terminada (la TLC se desarrolló en hexano/éter). Tras la
dilución con un exceso de agua, la mezcla se extrajo con benceno (3
x 300 ml). Después del procedimiento de tratamiento habitual, el
compuesto del título se obtuvo (45 g, 87%) como una espuma
cristalina amarilla pálida, que se usó en la siguiente etapa sin
purificación adicional (véase el Ejemplo 4). El compuesto del
título puro tuvo un p.f. 205-206ºC,
[\alpha]_{D} -35º (c 0,49; CHCl_{3}). Otra forma para
obtener el compuesto del título se describe en Sejbal J., Klinot
J., Bude\check{s}ínský M., Protiva J.: Collect. Czech. Chem.
Commun. 56, 2936 (1991).
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del
título es el siguiente:
0,85 s, 0,86 s, 0,93 s, 0,94 s, 1,16 s, 1,17 d (J
= 7,1), 1,21 d (J = 7,1), 7 x 3 H (7 x CH_{3}); 2,00 s, 3 H, 2,05
s, 3 H (2 x OAc); 2,39 d, 1 H (J = 18,5, H-22); 2,87
dd, 1 H (J' = 11,9, J'' = 4,1, H-13\beta); 3,18
sept, 1 H (J = 6,6, H-20); 4,06 d, 1 H (J = 10,9,
H-28a); 4,34 d, 1 H (J = 10,9,
H-28b); 4,49 m, 1 H (J \sim 7,
H-3\alpha).
Los siguientes compuestos se prepararon mediante
el procedimiento mencionado anteriormente:
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentan1orlupan-22-oato
de (pivaloiloxi)metilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentan1orlupan-22-oato
de acetoximetilo
Una disolución de diacetato de
21-oxolup-18-en-3\beta,28-diilo
bruto (40 g; 74 mmoles; que contiene alrededor de 85% de diacetato
de 21-oxolup-18-en-
3\beta,28-diilo) y dióxido de selenio (160 g; 1,44
mmoles), en una mezcla de dioxano (0,8 l) y ácido acético (0,4 l),
se puso a reflujo hasta que la reacción estuvo terminada (la TLC se
desarrolló en benceno/éter).
Tras enfriar, el selenio precipitado se eliminó
por filtración, y el filtrado se vertió lentamente en un exceso de
agua agitado vigorosamente. El precipitado rojo naranja se separó
por filtración a presión reducida, se lavó cuidadosamente con agua,
y se secó en aire. El diacetato de
21,22-dioxo-lup-18-en-3\beta,28-diilo
bruto seco se disolvió en cloroformo, y la disolución se filtró a
través de una columna de alúmina, la columna se lavó entonces con
cloroformo, y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo
se cristalizó en acetato de metilo para dar 28,9 g (82%) del
compuesto del título como agujas naranjas pálidas, p.f.
267-270ºC, [\alpha]_{D} -127º (c 0,32;
CHCl_{3}). Otra forma para obtener el compuesto del título se
describe en Klinotová E., Cermáková J., Rejzek M., Krecek V.,
Sejbal J., Ol\check{s}ovský; P., Klinot J.: Collect. Czech. Chem.
Commun. 64, 329 (1999).
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del
título es el siguiente:
0,85 s, 0,86 s, 0,94 s, 0,97 s, 1,18 s, 1,24 d (J
= 7,2), 1,26 d (J = 7,2), 7 x 3 H (7 x CH_{3}); 1,93 s, 3 H, 2,06
s, 3 H (2 x OAc); 3,12 dd, 1 H (J' = 12,5, J'' = 3,8,
H-13(3); 3,36 sept, 1 H (J = 7,0,
H-20); 4,02 d, 1 H (J = 11,1,
H-28a); 4,49 dd, 1 H (J' = 10,2, J'' = 6,0,
H-3a); 4,84 d, 1 H (J = 11,1,
H-28b).
Los siguientes compuestos se prepararon mediante
el procedimiento mencionado anteriormente:
3\beta-acetoxi-21,22-dioxolup-18-en-28-oato
de metilo
3\beta-acetoxi-21,22-dioxolup-18-en-28-oato
de acetoximetilo
3\beta-acetoxi-21,22-dioxolup-18-en-28-oato
de (pivaloiloxi)metilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-12-en-22-oato
de acetoximetilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-12-en-22-oato
de (pivaloiloxi)metilo
ácido
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oico
[Dinda B., Hajra A. K., Das S. K., Chel G., Chakraborty R., Ranu B.
C.: Indian. J. Chem., Sect. B 34, 624 (1995)]
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oato
de acetoximetilo
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oato
de (pivaloiloxi)metilo
Una disolución de diacetato de
21,22-dioxolup-18-en-3\beta,28-diilo
(25 g; 45 mmoles) y ácido peroxiacético (0,6 l; 32%) en cloroformo
(0,25 l) se agitó vigorosamente hasta que la reacción estuvo
terminada (la TLC se desarrolló en hexano/éter). La mezcla de
reacción incolora se diluyó con agua fría y se extrajo con
cloroformo (3 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron
con disolución acuosa al 5% de yoduro potásico (400 ml), con
disolución acuosa saturada de sulfito sódico (200 ml) y con
salmuera (2 x 200 ml), se secaron y se evaporaron. El aceite
amarillo pálido resultante se cristalizó en cloroformo/metanol para
dar 20,7 g (80,5%) del compuesto del título como pequeños cristales
blancos, p.f. 306-309ºC, [\alpha]_{D}
+88º (c 0,45; CHCl_{3}). Otra forma para obtener el compuesto del
título se describe en Sejbal J., Klinot J. Bude\check{s}ínský M.,
Protiva J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 56, 2936
(1991).
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del
título es el siguiente:
0,85 s, 0,85 s, 0,90 s, 0,91 s, 1,11 s, 1,14 d (J
= 7), 1,31 d (J = 7), 7 x 3H (7 x CH_{3}); 2,01 s, 3 H, 2,05 s, 3
H (2 x OAc); 2,53 dt, 1 H (J' = 14,4, J'' = J''' = 3,5); 2,72 dd, 1
H (J ' = 3,1, J'' = 12,3); 3,26 sept,, 1 H (H-20, J
= 7); 3,90 d, 1 H, 4,54 d, 1 H (2 x H-28, J =
11,0); 4,47 m, 1 H (H-3\alpha).
Los siguientes compuestos se prepararon mediante
el procedimiento mencionado anteriormente:
ácido
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-18,19-seco-19,20,29,30-tetranorlupan-21-oico
[\check{S}arek J., Klinot J., Klinotová E., Sejbal J.: Chem.
Listy 91, 1005 (1997)], ácido
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico.
El anhídrido del ácido
3\beta,28-diacetoxi-21,22-secolup-18-en-21,22-dioico
(20 g; 35,1 mmoles), en acetato de etilo (1 l), se añadió a una
mezcla de dióxido de rutenio (400 mg; 4 mmoles), metaperyodato de
sodio (60 g; 280,3 mmoles), agua (200 ml) y ácido trifluoroacético
(20 ml), y la mezcla se agitó vigorosamente. Después de que la
reacción estuvo terminada, se añadió etanol, la mezcla se filtró, y
la capa orgánica se filtró a través de una columna corta de gel de
sílice. La columna se lavó entonces con acetato de etilo, el
filtrado se evaporó a presión reducida, y el residuo se lavó con
éter y se cristalizó en una mezcla de diclorometano/éter. El
rendimiento del compuesto del título fue 10,6 g (61%), p.f.
137-140ºC, [\alpha]_{D} +40º (c 0,37;
CHCl_{3}). \check{S}arek J., Klinot J., Klinotová E., Sejbal J.:
Chem. Listy 91, 1005
(1997)].
(1997)].
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del
título es el siguiente:
213,3, 174,2, 171,1, 170,5, 80,7, 65,4, 58,8,
55,4, 50,6, 50,1, 46,8, 41,1, 38,5, 37,8, 37,1, 33,9, 28,4, 27,9,
26,8, 23,5, 21,8, 21,2, 20,6, 19,6, 18,1, 16,7, 16,5, 16,2,
16,0.
Los siguientes compuestos se prepararon mediante
el procedimiento mencionado anteriormente:
diacetato de
18,19,21-trioxo-18,19-secolupan-3\beta,28-diilo
[\check{S}arek J., Klinot J., Klinotová E., Sejbal J.: Chem.
Listy 91, 1005 (1997)], diacetato de
18,19,21,22-tetraoxo-18,19-secolupan-3\beta,28-diilo,
ácido
3\beta-acetoxi-21-oxolup-18-en-28-oico.
Se añadió una disolución de cloruro de cerio (200
ml; 1 M) y borohidruro de sodio (2 g; 53 mmoles) a una disolución
de ácido
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico
(10 g; 19,8 mmoles) en 500 ml de THF. La mezcla de reacción se
agitó durante una hora. La mezcla se vertió en un exceso de
disolución acuosa al 1% de ácido clorhídrico, y se extrajo con
cloroformo (3 x 300 ml). El procedimiento de tratamiento habitual
dio 8,7 g (86,7%) del compuesto del título, p.f.
156-159ºC, [\alpha]_{D} +48º (c 0,32;
CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del
título es el siguiente:
179,5, 171,1, 170,9, 80,9, 73,5, 64,5, 55,4,
51,7, 50,6, 41,0, 40,3, 38,4, 37,8, 37,3, 37,1, 32,6, 27,9, 25,9 (2
C), 23,6, 21,3, 20,9, 20,8, 19,9, 18,0, 16,5, 16,3, 16,1, 16,0.
Se añadieron DBU (0,3 g; 2 mmoles) y pivalato de
clorometilo (0,3 g; 2 mmoles) a la disolución de ácido
3\beta,28-diacetoxi-18-hidroxi-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico
(1 g; 2 mmoles), en una mezcla de diclorometano (5 ml) y
acetonitrilo (2 ml). La mezcla se agitó vigorosamente durante 3
horas y después se diluyó con agua enfriada con hielo, y se extrajo
con cloroformo (3 x 10 ml). Los extractos orgánicos recogidos se
lavaron con salmuera fría, se secaron y el cloroformo se evaporó a
vacío. El aceite amarillo pálido viscoso resultante (1,5 g) se
cromatografió sobre gel de sílice, eluyendo con tolueno. Tras la
cristalización en metanol, se obtuvieron 0,6 g (48%) del compuesto
del título en forma de agujas incoloras, p.f.
235-240ºC, [\alpha]_{D} + 53º (c 0,23;
CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C obtenido para el
compuesto del título es el siguiente:
177,4, 172,9, 171,0, 170,6, 80,8, 80,0, 73,5,
64,1, 55,4, 52,1, 50,6, 41,0, 40,3, 38,8, 38,5, 37,8, 37,3, 37,1,
32,7, 27,9, 26,8 (3 C), 25,9, 25,8, 23,6, 21,3, 20,9, 20,7, 19,8,
18,1, 16,5, 16,3, 16,1, 16,0.
Los siguientes ésteres se prepararon mediante
este procedimiento general:
3\beta,29-diacetoxi-18-oxo-18,19-seco-19,20,29,30-tetranorlupan-21-oato
de (pivaloiloxi)metilo
3\beta-hidroxi-30-oxo-lup-20(29)-en-28-oato
de (pivaloiloxi)metilo
3\beta-acetoxi-21-oxo-lup-18-en-28-oato
de (pivaloiloxi)metilo
De la misma manera, usando AcM-Br
en vez de POM-Cl, se prepararon los siguientes
ésteres:
3\beta,28-diacetoxi-18-hidroxi-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oato
de acetoximetilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-18,19-seco-19,20,29,30-tetranorlupan-21-oato
de acetoximetilo
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oato
de acetoximetilo
3\beta-acetoxi-21-oxolup-18-en-28-oato
de acetoximetilo
Se añadió óxido de bis(tributilestaño)
(1,9 g; 3,2 mmoles) a una disolución de
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,
30-pentanorlup-12-en-22-oato de (pivaloiloxi)metilo (1 g; 1,6 mmoles) y AIBN (20 mg) en éter (50 ml). La mezcla se agitó vigorosamente hasta que la reacción estuvo terminada (el TLC se desarrolló con cloroformo/acetato de etilo).
30-pentanorlup-12-en-22-oato de (pivaloiloxi)metilo (1 g; 1,6 mmoles) y AIBN (20 mg) en éter (50 ml). La mezcla se agitó vigorosamente hasta que la reacción estuvo terminada (el TLC se desarrolló con cloroformo/acetato de etilo).
El éter se evaporó entonces a vacío, y el
producto se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice,
eluyendo con cloroformo/acetato de etilo. Tras la cristalización en
una mezcla de diclorometano/éter, el compuesto del título se obtuvo
en forma de sólido cristalino blanco (0,5 g, 62%), p.f.
138-141ºC, [\alpha]_{D} +38º (c 0,25;
CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del
título es el siguiente:
16,0, 16,7, 16,9, 18,1, 20,8, 21,3, 23,4, 24,2,
24,4, 24,6, 25,2, 27,8, 33,4, 36,8, 37,7, 38,3, 38,7, 43,9, 46,9,
55,4, 58,9, 64,3, 80,5, 138,1, 140,6, 170,5, 170,9, 171,6,
196,8.
Se añadió gota a gota trifluoruro de
dietilaminoazufre (0,5 ml; 3,25 mmoles) a una disolución de ácido
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-22-oico
(0,5 g; 1,0 mmoles) en cloroformo seco (5 ml), y la mezcla de
reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Después de
que la reacción estuvo terminada, la mezcla se vertió lentamente en
agua fría (50 ml), y se extrajo dos veces con cloroformo. Las
fracciones orgánicas combinadas se trataron en la forma general, y
se cromatografiaron sobre gel de sílice (20% de acetato de etilo en
hexano). El residuo se cristalizó en alcohol isopropílico para dar
0,19 g (38%) del compuesto del título como cristales blancos, p.f.
150-155ºC (descomp.), [\alpha]_{D} + 21º
(c 0,55; CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del
título es el siguiente:
211,3 s, 160,2 d (J = 374), 170,1 s, 169,5 s,
80,6 s, 65,4 s, 57,5 d (J = 39), 55,1 s, 50,6 s, 49,9 s, 46,8 s,
40,1 s, 38,5 s, 37,8 s, 36,1 s, 33,3 s, 28,4 s, 27,9 s, 26,8 s,
23,5 s, 21,3 s, 21,2 s, 20,6 s, 19,6 s, 18,0 s,16,5 s, 16,4 s, 16,2
s, 15,9 s.
Uno de los parámetros usados como base para
ensayos colorimétricos es la actividad metabólica de las células
viables. Por ejemplo, ahora se usa ampliamente un ensayo de
microtitulación, que usa la sal de tetrazolio MTT, para cuantificar
la proliferación celular y la citotoxicidad [Hajdúch M, Mihál V,
Minarik J, Fáber E, \check{S}afárová M, Weigl E, Antálek P.:
Cytotechnology, 1996, 19, 243-245]. Por ejemplo,
este ensayo se usa en programas de detección sistemática de
fármacos, y en ensayos de quimiosensibilidad. Debido a que las
sales de tetrazolio se rompen sólo mediante células metabólicamente
activas, estos ensayos detectan exclusivamente células viables. En
el caso del ensayo con MTT, la sal de tetrazolio soluble amarilla se
reduce a una sal de formazano coloreada, insoluble en agua. Después
de que se solubiliza, el formazano formado se puede cuantificar
fácil y rápidamente en un lector de placas ELISA convencional a 570
nm (absorbancia máxima). La cantidad de formazano reducido
corresponde al número de células viables en el cultivo.
Para la detección sistemática habitual de estos
compuestos, se usó la línea celular CEM de leucemia linfobástica T
humana. Para demostrar un mecanismo común de acción, se ensayaron en
un panel de líneas celulares (Tabla 2) compuestos seleccionados que
mostraron actividad en un ensayo de detección sistemática. Estas
líneas procedían de diferentes especies y de diferente origen
histogenético, y poseían diversas alteraciones en las proteínas
reguladoras del ciclo celular y en el estatus de dependencia
hormonal (Tabla 2). Las células se mantuvieron en matraces plásticos
para cultivo de tejidos de 80 cm^{2} de Nunc/Corning, y se
cultivaron en medio de cultivo celular (DMEM con 5 g/l de glucosa,
2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 10% de suero fetal de ternera, y bicarbonato
sódico). Los compuestos individuales se disolvieron en 10% de
dimetilsulfóxido/disolución salina,
pH 8,0.
pH 8,0.
Las suspensiones celulares que se prepararon y se
diluyeron según el tipo celular particular y la densidad celular
diana esperada (2.500-30.000 células por pocillo,
basándose en las características del crecimiento celular) se
añadieron mediante pipeta (80 \mul) en placas de microtitulación
de 96 pocillos. Se permitió a los inoculados un período de
preincubación de 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2}, para
estabilización. En el tiempo cero, se añadieron diluciones de 4
veces de la concentración de ensayo pretendida, en alícuotas de 20
\mul, a los pocillos de una placa de microtitulación.
Habitualmente, los compuestos de ensayo se evaluaron en seis
diluciones de 4 veces. En el ensayo habitual, la concentración más
elevada del pocillo fue 250 \muM, pero puede diferir, dependiendo
del agente. Todas las concentraciones del fármaco se examinaron por
duplicado. Las incubaciones de las células con los compuestos de
ensayo duraron 72 horas a 37ºC, en una atmósfera de 5% de CO_{2} y
100% de humedad. Al final del período de incubación, las células se
ensayaron usando el ensayo con MTT. Se pipetearon en cada pocillo
diez microlitros de la disolución madre de MTT, y se incubaron
adicionalmente durante 1-4 horas. Después de este
período de incubación, el formazano se solubilizó mediante adición
de 100 \mul/pocillo de 10% de SDS en agua (pH = 5,5), seguido de
una incubación adicional a 37ºC toda la noche. La densidad óptica
(DO) se midió a 540 nm con el lector Labsystem iEMS Reader
MF(UK). La supervivencia de las células tumorales (TCS) se
calculó usando la siguiente ecuación: TCS = (DO_{pocillo \
expuesto \ al \ fármaco}/DO_{pocillos \ de \ control} media) x
100%. El valor de TCS_{50}, la concentración del fármaco letal
para el 50% de las células tumorales, se calculó a partir de las
curvas de dosis y respuesta obtenidas.
Para evaluar la actividad anticancerígena de las
betulininas, se examinó su actividad citotóxica frente a la línea
celular CEM, usando el ensayo de detección sistemática.
Adicionalmente, se ensayaron compuestos potentes frente a un panel
de líneas celulares de diferente origen histogénico y de especie
(Tabla 2).
Actividad citotóxica de betulininas seleccionadas frente a un panel de diferentes líneas | ||||||||
celulares (no) tumorales | ||||||||
Línea celular | Descripción | Compuesto (TCS_{50}[\muM]) | ||||||
Ácido | 1,3 | 1,7 | 1,28 | 1,44 | 1,55 | 1,57 | ||
betulínico | ||||||||
B16 | Melanoma de ratón | 36 | 2,1 | |||||
B16F | Melanoma de ratón, | 4,6 | 4,7 | |||||
metastásico | ||||||||
SW620 | Cáncer de colon | 250 | 1,2 | |||||
humano, metástasis | ||||||||
U87MG | Glioblastoma humano | 250 | 5,1 | |||||
HepG2 | carcinoma hepatocelular | 3,6 | 1,7 | |||||
humano | ||||||||
A549 | Adenocarcinoma | 236 | 1,0 | |||||
pulmonar humano | ||||||||
MCF-7 | Cáncer de mama | 194 | 2,3 | |||||
humano, dependiente de | ||||||||
estrógeno, p53+/+, Rb +/+ | ||||||||
U20S | Osteosarcoma humano, | 250 | 1,5 | |||||
p53+/-, Rb +/- | ||||||||
Saos 2 | Rhabdomionsarcoma | 250 | 1,8 | |||||
humano, p53-/-, Rb-/- | ||||||||
BT549 | Cáncer de mama | 250 | 2,0 | |||||
humano, p53mut/mut | ||||||||
MDA-MB-238 | Cáncer de mama | 195 | 1,4 | |||||
humano, dependiente de | ||||||||
estrógeno, p53mut/mut | ||||||||
DU145 | Cáncer de próstata | 241 | 0,8 | |||||
humano, dependiente de | ||||||||
andrógenos, Rb-/- | ||||||||
HT-29 | Cáncer de colon humano | 250 | 1,6 | |||||
OVCAR-3 | Cáncer ovárico humano | 164 | 1,0 | |||||
Caco-2 | Cáncer de colon humano | 20 | 3,0 | |||||
MEL-3 | Melanoma humano | 2,7 | 1,3 | |||||
Linfocitos | Linfocitos normales | 250 | 13 | |||||
humanos | ||||||||
NIH3T3 | Fibroblastos | 250 | 7,2 | |||||
inmortalizados de ratón |
Línea celular | Descripción | Compuesto (TCS_{50}[\muM]) | ||||||
Ácido | 1,3 | 1,7 | 1,28 | 1,44 | 1,55 | 1,57 | ||
betulínico | ||||||||
K562 | Leucemia promielocítica | 250 | 0,2 | |||||
humana | ||||||||
K562-CdA | Leucemia promielocítica | 250 | 0,3 | |||||
humana, resistente a | ||||||||
cladrubina | ||||||||
K562-GEM | Leucemia promielocítica | 101 | 0,9 | |||||
humana, resistente a | ||||||||
gemcitabina | ||||||||
K562-ARA-C | Leucemia promielocítica | 250 | 0,6 | |||||
humana, resistente a | ||||||||
citarabina | ||||||||
K562-FLUD | Leucemia promielocítica | 250 | 0,4 | |||||
humana, resistente a | ||||||||
fludarabina | ||||||||
CEM | Leucemia linfoblástica T | 250 | 1,0 | 5,0 | 18 | 11 | 26 | 0,2 |
humana | ||||||||
CEM-DNR | Leucemia linfoblástica T | 250 | 0,6 | |||||
1/C2 | humana, resistente a | |||||||
daunorrubicina | ||||||||
CEM-DNR | Leucemia linfoblástica T | 250 | 1,1 | |||||
bulk | humana, resistente a | |||||||
daunorrubicina | ||||||||
CEM-VCR | Leucemia linfoblástica T | 19 | 3,3 | |||||
1/F3 | humana, resistente a | |||||||
vincristina | ||||||||
CEM-VCR | Leucemia linfoblástica T | 24 | 2,9 | |||||
3/D5 | humana, resistente a | |||||||
vincristina | ||||||||
CEM-VCR | Leucemia linfoblástica T | 69 | 2,5 | |||||
bulk | humana, resistente a | |||||||
vincristina |
En contraste con el ácido betulínico, que se
afirma que es un agente selectivo para tumores derivados
neuroectodérmicos, no hubo ninguna diferencia significativa en la
sensibilidad de las betulininas a tumores de diferente origen
histogenético.
Los compuestos son eficaces a concentraciones
submicromolares y concentraciones micromolares bajas. Sin embargo,
las células no tumorales, por ejemplo fibroblastos NIH3T3 y
linfocitos humanos normales, toleraron dosis sustancialmente
mayores de betulininas que las células tumorales, lo que sugiere un
índice terapéutico favorable.
De forma notable, se encontró que la eficacia de
las betulininas es idéntica en líneas celulares que tienen diversas
mutaciones o supresiones en las proteínas asociadas con el ciclo
celular (Tabla 2). Esto indica que estas sustancias deberían ser
igualmente eficaces en tumores con diversas alteraciones de genes
supresores de tumores, a saber, p53, Rb, etc.
Además, se mostró que las betulininas eran
igualmente eficaces en líneas celulares resistentes a fármacos que
sus homólogos maternos, sugiriendo de ese modo que los mecanismos
clásicos de resistencia a múltiples fármacos aparentemente no se
aplican a estos compuestos. Esta característica particular debe ser
de importante beneficio terapéutico a pacientes de cáncer
resistentes a la quimioterapia.
Finalmente, la actividad citotóxica de las
betulininas es independiente del estado hormonal de las células
cancerosas, de forma que los compuestos deben ser igualmente
eficaces en el tratamiento de cánceres dependientes e independientes
de hormonas.
Para analizar los mecanismos de la citotoxicidad
inducida por betulininas, es importante distinguir la apoptosis de
la otra forma principal de muerte celular, la necrosis. En primer
lugar, a nivel del tejido, la apoptosis produce poca o ninguna
inflamación, puesto que las porciones arrugadas de la célula son
engullidas por las células vecinas, especialmente macrófagos, en
lugar de ser liberadas en el fluido extracelular. Por el contrario,
en la necrosis, los contenidos celulares se liberan en el fluido
extracelular, y de este modo tiene un efecto irritante sobre las
células cercanas, provocando inflamación. En segundo lugar, a nivel
celular, las células apoptóticas exhiben arrugamiento y
aburbujamiento del citoplasma, conservación de la estructura de
orgánulos celulares, incluyendo la mitocondria, condensación y
marginación de cromatina, fragmentación de los núcleos, y formación
de cuerpos apoptóticos, aunque no todo esto se observa en todos los
tipos celulares. En tercer lugar, a nivel molecular, un número de
procesos bioquímicos desarrolla un papel importante en la inducción
de la apoptosis. Sin embargo, la mayoría de ellos no son bien
comprendidos, y dan como resultado la activación de proteasas y
nucleasas que finalmente destruyen macromoléculas biológicas claves
- proteínas y ADN. Para la detección de los modos apoptótico frente
a necrótico de la muerte celular, se evaluó la morfología mediante
microscopía electrónica de barrido.
Se cultivó una línea celular A549 sobre
cubreobjetos de vidrio tratados con cultivo de tejido en placas de
cultivo de 6 pocillos con o sin una concentración 2 \muM de I.3 o
de ácido betulínico a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 12 horas. Tras
la incubación, los cubreobjetos se lavaron en disolución salina
tamponada con Hank, y se procesaron como se describe a
continuación.
Las células se fijaron en 2% de
glutaraldehído/PBS toda la noche a 4ºC, se secaron y se cubrieron
con oro a vacío. La superficie de las células se examinó para
determinar marcadores morfológicos típicos de la apoptosis bajo un
microscopio electrónico de barrido (Tesla, República Checa).
El examen inicial de la microscopía de contraste
de fases indicó que las betulininas inducen características
morfológicas típicas de apoptosis en células cancerígenas. Esto se
confirmó posteriormente mediante microscopía electrónica (Figura
1). Los criterios morfológicos típicos de la apoptosis se
identificaron en células tratadas con betulinina 1.3: formación de
burbujas citoplasmáticas, fragmentación celular y formación de
cuerpos apoptóticos.
Los sistemas tumorales animales son modelos
importantes para determinar la capacidad de un compuesto para ser
adsorbido en el torrente sanguíneo, para penetrar en el
compartimiento tumoral, y para exterminar fracciones de células
tumorales proliferantes o en descanso, a dosis mínimamente tóxicas.
Aunque sujetos a crítica, los modelos in vitro/in
vivo han identificado todos los agentes quimioterapéuticos
eficaces en la práctica clínica actual. Es bien sabido que la
mayoría de los compuestos son eficaces en linfomas y leucemias,
mientras que algunos han demostrado ser eficaces en tumores
sólidos, ilustrando que hay importantes diferencias entre modelos de
animales y situaciones clínicas. Los tumores sólidos de diferente
origen histogenético se implantan subcutánea o intramuscularmente
en animales, los cuales entonces son tratados con un único agente.
De este modo, la inhibición del crecimiento del tumor sólido es un
parámetro relacionado con la actividad del fármaco. Contrariamente,
los tumores primarios de pacientes son controlados mediante cirugía
y radiación, junto con poliquimioterapia. Habitualmente, el
criterio aceptable para la actividad es una regresión del tumor de
>50%. Sin embargo, los fármacos activos en varios sistemas
diferentes de detección sistemática serán muy probablemente eficaces
en seres humanos; por ejemplo, la doxorrubicina, la ciclofosfamida y
el cisplatino tienen un amplio espectro de actividad en modelos de
tumores de animales. Además, con respecto a la toxicidad y a la
exposición al fármaco total, se ha encontrado una correlación entre
los ratones y el hombre para la mayoría de los fármacos
antitumorales activos.
Se ha dado a conocer que el ácido betulínico
exhibe una prominente actividad en tumores neuroectodérmicos, por
ejemplo melanoma, tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET) y
neuroblastoma. Éste último es el tumor sólido más letal de la
niñez, puesto que se considera que es uno de los tumores más
resistentes a fármacos. A la luz de este conocimiento, fue de
particular interés la actividad de 1.3 en neuroblastoma humano
xenotransplantado, aunque este compuesto demostró una amplia
actividad anticancerosa en condiciones in vitro.
Se obtuvo de ATCC una línea celular
SK-N-AS de neuroblastoma humano. La
línea se cultivó en medio esencial modificado de Dulbeco con 4,5 g
de dextrosa/l, 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de glutamina,
100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Para los
fines del transplante, sólo se usaron las células en fase de
log.
En este estudio se usaron ratones hembra atímicas
CD-1/Ctrl-1 nu/nu, de 8 semanas, que
pesan 18-22 g (IffaCredo, Francia). Se inoculó a los
animales con 5.10^{6} células tumorales subcutáneamente en la
región inguinal derecha. Tras el transplante, se midió el
crecimiento tumoral tanto en los grupos del control/vehículo como en
los grupos tratados, usando calibradores. El volumen tumoral (TV)
se midió según lo siguiente: TV = (a^{2} x b)/2, en la que a es la
anchura y b es la longitud. La significación estadística se evaluó
usando un ensayo de la t no paramétrico.
En este experimento, se usó como fármaco de
control cisplatino (Platidiam 10 inh, sicc., Lachema,
República Checa). Se diluyó en agua apirógena, y se aplicó a
animales en un volumen final de 0,18 ml subcutáneamente en el día
1.
El compuesto 1.3 se sintetizó como se
describe anteriormente. Se suspendió a 10 mg/ml en 5% de dextrosa,
y el pH se ajustó a 8,0 con hidróxido sódico.
Vehículo: 5% de dextrosa con pH ajustado a
8,0 con hidróxido sódico.
Los animales se trataron con fármacos/vehículo 24
horas después del transplante. Se crearon los siguientes grupos (con
10 animales por grupo):
control - animales no tratados
vehículo - 0,2 ml de vehículo aplicado a
animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10 intraperitonealmente
cisplatino 4 mg/kg - 0,18 ml de disolución
de cisplatino aplicada a los animales subcutáneamente en 1 x D
1
1.3 1 mg/ratón s.c. - 0,1 ml de suspensión
de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10
subcutáneamente
1.3 2 mg/ratón s.c. - 0,2 ml de suspensión
de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10
subcutáneamente
1.3 1 mg/ratón i.p. - 0,1 ml de suspensión
de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10
intraperitonealmente
1.3 2 mg/ratón i.p. - 0,2 ml de suspensión
de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10
intraperitonealmente
En la Figura 2 se resumen los resultados del
estudio. Se demuestra claramente la actividad anticancerígena de
1.3, puesto que no hay ningún crecimiento tumoral en los animales
tratados con 1.3. Fue estadísticamente significativo en todos los
grupos a los que se les aplicó 1.3 comenzando a partir de la semana
2 de todo el experimento. El efecto fue independiente de la vía de
aplicación (intraperitoneal o subcutánea), y de la dosis en esta
aplicación.
Contrariamente a 1.3, el cisplatino fue ineficaz
en el tratamiento del neuroblastoma de
SK-N-AS, y no mostró ninguna
actividad significativa.
La actividad anticancerígena de 1.3, como
representante típico de esta generación de betulininas, se demostró
en condiciones en vivo. Este nuevo compuesto parece ser muy
activo frente a neuroblastoma humano en condiciones in vivo.
Junto con su amplia actividad anticancerígena y nuevo mecanismo de
acción, previamente no identificado, se cree que los compuestos de
la presente invención son de potencial terapéutico para pacientes
de cáncer en el futuro.
Como se discute al principio, la transición G1/S
está fuertemente regulada por la fosforilación de la proteína de
retinoblastoma (Rb).
Puesto que la proteína de Rb contiene múltiples
sitios de fosforilación para las CDK, su forma fosforilada tiene un
peso molecular de alrededor de 110 kDa, mientras que el peso
molecular de la proteína hipofosforilada es sólo de 105 kDa. Esta
pequeña diferencia en el peso molecular es suficiente para separar a
ambas formas mediante electroforesis de SDS-PAGE
convencional.
Se cultivaron células CEM en medio esencial
modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10% de suero fetal
de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100
\mug/ml de estreptomicina, con/sin concentraciones indicadas más
abajo de ácido betulínico (BA) o 1.3. En puntos de tiempo
seleccionados, las células se cosecharon, se lavaron con disolución
salina equilibrada de Hank enfriada en hielo, y se solubilizaron en
hielo usando el tampón para muestras de SDS-PAGE que
contiene inhibidores de proteasa y de fosfatasa (10 \mug/ml de
leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de inhibidor
de tripsina de haba de soja, 100 \mumoles de benzamida, 1 mM de
vanadato de sodio, 1 mM de NaF, 1 mM de fosfato de fenilo), y se
hirvieron inmediatamente.
Las proteínas celulares totales (100
\mug/pocillo) se separaron en electroforesis de
SDS-PAGE, se transfirieron sobre membranas de
poli(difluoruro de vinilo), y la proteína de Rb total,
incluyendo el fragmento o fragmentos proteolíticos, se detectó
usando un anticuerpo monoclonal anti-pRb (Oncogene,
Germany, Rb(Ab-5), Cat# OP66 Rev
02-sept-96 EB, Clone LM95.1), y se
visualizó mediante quimioluminiscencia (Sistema de Transferencia
Western ECL, Amersham). Los detalles de la técnica de transferencia
Western se describen en Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E.,
Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K (Eds): Short
Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, John Wiley & Sons,
New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, 1992, página
10-33 - 10-35.
Los resultados de este estudio indican que, en
células de leucemia linfoblástica CEM, la proteína de Rb se
desfosforila rápidamente tras el tratamiento con 1.3, pero no con
ácido betulínico (Figura 3). Esto se demostró por un desplazamiento
de la masa de la proteína de Rb desde la forma hiperfosforilada,
con una masa molecular de alrededor de 110 kDa, hacia la forma
hipofosforilada (105 kDa). El efecto de 1.3 depende del tiempo y de
la concentración; a una concentración de 20 \muM, la forma
hipocoincidente de Rb aparece tan pronto como 15 minutos después del
tratamiento, mientras que a 7 \muM el mismo efecto aparece
después de 2 horas. De forma interesante, la ruptura de la proteína
de Rb tras la hipofosforilación estuvo acompañada con la
desaparición de una Rb de 105 kDa, y la aparición de un fragmento
inmunorreactivo de proteína Rb con un peso molecular de alrededor
de 42 kDa. Según la bibliografía, la descomposición proteolítica de
Rb es un sello típico de apoptosis debido a la activación de
caspasas celulares.
Los resultados de este estudio indican claramente
que las betulininas de la presente invención, pero no el propio
ácido betulínico, son capaces de inducir la rápida desfosforilación
de la proteína clave Rb reguladora del ciclo celular. Ésta fue
seguida de la inducción de apoptosis, que se ha dado a conocer que
activa a caspasas celulares. Las caspasas activadas tienen la
capacidad para romper proteínas diana, incluyendo Rb. Esto se
ilustra por la aparición, dependiente del tiempo y de la
concentración, de un fragmento inmunorreactivo de proteína de Rb con
un peso molecular de 42 kDa en células tratadas con 1.3.
La hipofosforilación de la proteína de Rb está
acompañada de un bloqueo del ciclo celular en la transición de
G1/S. Para investigar si la incubación de células tumorales con
betulininas dará como resultado el bloqueo del ciclo celular y/o la
apoptosis, se realizó un estudio de citometría de flujo con medida
del contenido de ADN total en células CEM tratadas con/sin 1.3.
Como control positivo, se usó Taxol (paclitaxel), puesto que se sabe
que este fármaco da como resultado la acumulación de células en la
fase G2.
De forma breve, las células CEM se cultivaron en
medio esencial modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10%
de suero fetal de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina, con/sin las
concentraciones indicadas de paclitaxel o 1.3 (Figura 4A). A los
puntos de tiempo seleccionados, las células se cosecharon, se
lavaron en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS) enfriada
con hielo, y se fijaron en etanol al 70% a -20ºC toda la noche. Al
día siguiente, el etanol se eliminó mediante centrifugación, las
células se lavaron dos veces en HBSS, y se reconstituyó un pelete
celular (10^{6} células) en disolución de tinción (yoduro de
propidio 60 \mug/ml, ARNasa libre de ADNasa, 175 U/ml en HBSS)
durante 15 minutos a 37ºC. El contenido de ADN de las células
individuales se analizó en un citómetro de flujo Excalibur (Becton
and Dickinson) a una longitud de onda de excitación de 488 nm.
Como se indica en la Figura 4A,B, el compuesto
1.3 induce la acumulación de células en las fases G0/G1 del ciclo
celular, lo que va acompañado de una rápida apoptosis (aparición de
células sub-G1). El efecto depende de la
concentración y del tiempo. La inducción del bloqueo de G1 y la
apoptosis en consistente con la desfosforilación de la proteína de
Rb.
Los estudios de citotoxicidad celular (datos no
mostrados) demostraron que la actividad citotóxica de 1.3 se
correlaciona enormemente con actinomicina D (p < 0,00001).
Puesto que la actinomicina D es un inhibidor de ARN polimerasas bien
conocido, estos resultados sugieren que 1.3 selecciona como dianas a
complejos transcripcionales.
Como se ha tratado anteriormente, la transición
G1/S está fuertemente regulada por la fosforilación de la proteína
de retinoblastoma (Rb). La Rb hipofosforilada silencia genes
específicos que son activos en la fase S del ciclo celular y que
están regulados por factores de transcripción E2F. La Rb se une al
dominio activo de E2F, y después reprime activamente al promotor
mediante un mecanismo que se comprende muy mal. Los estudios
recientes muestran que Rb se asocia con una histona desacetilasa
(HDAC 1 y 2) a través del dominio de bolsillo de Rb. Rb recluta
histona desacetilasa a E2F, y de este modo Rb coopera con HDAC para
reprimir el promotor regulado por E2F del gen. La inhibición de la
actividad de histona desacetilasa mediante el inhibidor específico
tricostatina A (TSA) inhibe la represión, mediada por Rb, de una
actividad transcripcional de E2F.
A fin de proporcionar signos de interferencia de
las betulininas con la transcripción, se investigó la capacidad de
1.3 para modificar la acetilación de la histona.
Se cultivaron células CEM en medio esencial
modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10% de suero fetal
de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100
\mug/ml de estreptomicina con/sin las concentraciones indicadas de
inhibidor de HDAC TSA o 1.3. En los puntos de tiempo seleccionados,
las células se cosecharon, se lavaron en disolución salina
equilibrada de Hank enfriada en hielo, y se solubilizaron en hielo
usando tampón para muestras de SDS-PAGE que contiene
inhibidores de proteasa y de fosfatasa (10 \mug/ml de leupeptina,
10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de inhibidor de tripsina
de haba de soja, 100 \mumoles de benzamida, 1 mM de vanadato de
sodio, 1 mM de NaF, 1 mM de fosfato de fenilo), y se pusieron a
hervir inmediatamente.
Las proteínas celulares totales (100
\mug/pocillo) se separaron en electroforesis de
SDS-PAGE, se transfirieron sobre membranas de
poli(difluoruro de vinilo), y la histona acetilada se
detectó usando un anticuerpo policlonal de conejo
anti-acetil(Lys9)-histona H3
(Cell Signalling Technology, Beverly, MA; Cat# 9671L), y se
visualizó mediante quimioluminiscencia (sistema de transferencia
Western ECL, Amersham). Los detalles de la técnica de transferencia
Western se describen en Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E.,
Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K (Eds): Short
Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, John Wiley & Sons,
New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, 1992, página
10-33 - 10-35.
Los resultados de este estudio indican que, en
células CEM de leucemia linfoblástica, la histona H3 se acetila
rápidamente en la posición de Lys9 tras el tratamiento con tanto
TSA como con la betulinina 1.3 (Figura 5). El efecto de 1.3 depende
del tiempo y de la concentración; a 20 \muM (10 x IC_{50}) la
histona acetilada aparece tan pronto como a los 30 minutos después
de la incubación. De forma interesante, las células CEM cultivadas
con 2 \muM de 1.3 (IC_{50}) muestran acetilación de histona en
puntos de tiempo entre 45-120 minutos, lo que es
consistente con la semivida de degradación de 1.3 en condiciones
in vitro (datos no mostrados). Por otro lado, sin embargo,
TSA a 0,24 \muM (IC_{50}) no mostró ninguna capacidad
significativa para aumentar la acetilación de la histona, sugiriendo
que el mecanismo o mecanismos de actividad citotóxica de TSA pueden
ser más complejos de lo que originalmente se pensó.
Los resultados de este estudio indican claramente
que las betulininas de la presente invención son capaces de inducir
la rápida acetilación de histona. Generalmente se acepta que los
términos N de histonas centrales son importantes para los
procedimientos que modulan una estructura del nucleosoma. La
hiperacetilación de las histonas reduce su capacidad para restringir
la ruta de ADN en la cromatina, dando como resultado cambios
alostéricos en la conformación nucleosómica, desestabilización de
contactos internucleosómicos, y un aumento en la accesibilidad del
ADN nucleosómico a factores de transcripción. La cantidad de
acetilación de histonas está determinada por un equilibrio entre
histona acetiltransferasas (HAT) e histona desacetilasas (HDAC). El
balance desempeña un papel importante en la regulación de la
transcripción génica, así como en la génesis o supresión del cáncer.
Desafortunadamente, sigue abierta la pregunta de si las betulininas
inhiben HDAC directa o indirectamente. Como se ha expuesto
anteriormente, las betulininas inducen la rápida desfosforilación
de la proteína de Rb. Se demostró que la Rb hipofosforilada se une
tanto a HDAC como al complejo de E2F-DP1. Se ha dado
a conocer recientemente que E2F-1, -2, y -3, pero no
E2F-4, -5, y -6, se asocian con y se acetilan
mediante acetiltransferasas proteínicas que se unen a elementos de
respuesta a cAMP y p300. La acetilación se produce en tres restos de
lisina conservados, localizados en el límite
N-terminal de sus dominios de unión a ADN. La
acetilación de E2F-1 in vitro e in
vivo aumenta notablemente su afinidad de unión por un sitio de
unión a ADN de E2F de consenso, lo que es paralelo por la
transactivación potenciada de un promotor sensible a E2F. La
acetilación de E2F-1 se invirtió mediante HDAC1,
indicando que la acetilación reversible es un mecanismo para la
regulación también de proteínas no histónicas. De este modo, la
inhibición de HDAC mediante compuestos sintéticos debe dar como
resultado tanto la acetilación de histonas como de factores de
transcripción, dando como resultado la activación transcripcional de
genes sensibles. De forma interesante, un número de oncosupresores
y de genes accionados por promotores víricos son reprimidos
transcripcionalmente en células cancerosas/transfectadas/infectadas
por virus, debido a la desacetilación constitutiva de promotores
específicos. La inhibición de HDAC da como resultado la reactivación
de oncosupresores y de genes bajo promotor vírico. Los expertos en
la técnica reconocerán que las betulininas se podrían usar no sólo
en el tratamiento del cáncer, sino también en el tratamiento de
enfermedades o en enfoques terapéuticos, en los que es indeseado la
represión transcripcional de un gen o genes específicos, por ejemplo
el silenciamiento transcripcional de vectores usados en terapia
génica.
De forma notable, puesto que estos fármacos
potenciales no muestran ninguna actividad inhibidora de CDK (datos
no mostrados), es de esperar que posean un nuevo mecanismo de
acción, no dado a conocer previamente.
Los expertos en la materia reconocerán o serán
capaces de averiguar, usando únicamente la experimentación
rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de
la invención descrita en la presente invención. Tales equivalentes
están destinados a estar comprendidos en las reivindicaciones.
Claims (15)
1. Compuesto de fórmula I, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, destinado a ser utilizado en
terapia,
en la
que:
- X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHO C(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
- X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y R^{8} juntos son CHOCOCH_{2};
- R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo C_{1-6};
- R^{6} es H, o está ausente si "a" es un doble enlace;
- R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
- R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOC OR^{1d},
- o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
- R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
- R^{10} es alquilo C_{1-4} sustituido con Hal;
- "a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
- y en la que
- Y = (CH_{2})n
- n= 0 a 5;
- R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que:
- X^{1} es CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, o CHOCOY-Hal; y
- R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, o COCOCOR^{1d}.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el
que:
- R^{2-5} son todos metilo, y R^{1} es tal como se define a continuación para el grupo correspondiente R^{1a-1d};
- X^{1} es
- -
- CHOCOCH_{2}Cl; o
- -
- CHOR^{1a} o CHOCOR^{1a}, en el que R^{1a} es H y metilo respectivamente;
- X^{3} es C=O, CHOH o CHOAc;
- R^{7} es H, COOH, COOMe, CH_{2}OAc, COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e} es alquilo C_{1-4};
- R^{8} es
- -
- COOR^{1d}, en el que R^{1d} es H o metilo;
- -
- YCOOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es H, metilo o etilo;
- -
- COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es alquilo C_{1-4};
- -
- CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4};
- -
- CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4}.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el
que:
- R^{8} es
- -
- COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es metilo o butilo;
- -
- CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es metilo o etilo;
- -
- CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es propilo; y
R^{7} es COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el
que Y es CH_{2} y R^{1e} es metilo o butilo.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que "a" es un enlace
sencillo, y R^{6} es H.
6. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto de fórmula I se
selecciona de la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
7. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto se
selecciona de entre los siguientes:
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, destinado al tratamiento de un trastorno
proliferativo.
9. Uso de un compuesto de fórmula I, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un
medicamento destinado a ser utilizado en el tratamiento de una
enfermedad proliferativa.
10. Compuesto de fórmula Ia, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la
que:
- X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHOC(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
- X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y X^{8} juntos son CHOCOCH_{2};
- R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo C_{1-6};
- R^{6} es H, o está ausente si "a" es un enlace doble;
- R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
- R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOC OR^{1d},
- o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
- R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
- R^{10} es alquilo C_{1-6} sustituido con Hal;
- "a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
- y en la que
- Y = (CH_{2})n
- n= 0 a 5;
- R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}
con la condición de
que
(i) cuando X^{1} es CHOAc, X^{3} es C=O,
"a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me,
R^{6} es H;
- -
- cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de COOH, CH_{2}COCOPr^{i}, COCOCOPr^{i}, CH_{2}COOH, o CH_{2}CH_{2}CO^{i} Pr;
- -
- cuando R^{7} es CO_{2}Me, R^{8} es distinto de CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2};
- -
- cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOMe, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}COPr^{i}; y
(ii) cuando X^{1} es CHOH, X^{3} es C=O,
"a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me, y
R^{6} es H,
- -
- cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOH, CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2} o CH_{2}COOMe;
- -
- cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de CH_{2}COOH;
(iii) cuando X^{1} es CHOAc,
R^{1-2} y R^{4-8} son H, R^{3}
es Me, y "a" es un enlace sencillo, X^{3} es distinto de
C=O;
(iv) cuando X^{1} es CHOAc,
R^{1-5} son Me, R^{6} = H, "a" es un enlace
sencillo
- -
- cuando R^{7} y R^{8} juntos forman CH_{2}OCOCH_{2}, X^{3} es distinto de C=O, CHOAc o CHOH;
- -
- cuando X^{3} y R^{8} juntos forman CHOCOCH_{2}, R^{7} es distinto de CH_{2}OAc;
o una sal farmacéuticamente
aceptable de las
mismas.
11. Compuesto según la reivindicación 10, en el
que
X^{1} es CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a},
CHOCOY-Hal; y
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d},
COOYOCOR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOCOR^{1d}.
12. Compuesto según la reivindicación 10 o
reivindicación 11, en el que:
R^{2-5} son todos metilo, y
R^{1} es tal como se define a continuación para el grupo
correspondiente R^{1a-1d};
X^{1} es
- -
- CHOCOCH_{2}Cl; o
- -
- CHOR^{1a} o CHOCOR^{1a}, en el que R^{1a} es H y metilo respectivamente;
X^{3} es C=O, CHOH o CHOAc;
R^{7} es H, COOH, COOMe, CH_{2}OAc,
COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e}
es alquilo C_{1-4};
R^{8} es
- -
- COOR^{1d}, en el que R^{1d} es H o metilo;
- -
- YCOOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es H, metilo o etilo;
- -
- COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es alquilo C_{1-4};
- -
- CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4};
- -
- CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4}.
13. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que
R^{8} es
- -
- COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es metilo o butilo;
- -
- CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es metilo o etilo;
- -
- CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es propilo; y
R^{7} es COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el
que Y es CH_{2} y R^{1e} es metilo o butilo.
14. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que "a" es un enlace sencillo,
y R^{6} es H.
15. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, seleccionado de la siguiente tabla:
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