ES2250406T3 - Derivados de triterpenoides. - Google Patents

Derivados de triterpenoides.

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ES2250406T3
ES2250406T3 ES01934139T ES01934139T ES2250406T3 ES 2250406 T3 ES2250406 T3 ES 2250406T3 ES 01934139 T ES01934139 T ES 01934139T ES 01934139 T ES01934139 T ES 01934139T ES 2250406 T3 ES2250406 T3 ES 2250406T3
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Marian Hajduch
Jan Sarek
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Karlova Univerzita v Praze
Univerzita Palackeho V Olomouci
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Karlova Univerzita v Praze
Univerzita Palackeho V Olomouci
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Abstract

Compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, destinado a ser utilizado en terapia, en la que: X1 es C=O, C=NOR1a, CHOR1a, CHOCOR1a, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR9, CHOC(O)OR1a, CHOC(O)OR10, y Hal es Br, Cl, I, F; X3 es C=O, CHOR1b, CHOCOR1b, o X3 y R8 juntos son CHOCOCH2; R1-5 son cada uno independientemente H o alquilo C1-6; R6 es H, o está ausente si "a" es un doble enlace; R7 es H, COOR1c, YOCOR1c, COOYOCOR1e, YCOOR1e; R8 es H, COOR1d, YCOOR1d, YCOOR10, YCOHaI, COOYOCOR1d, CH2OR1d, CH2COCOR1d, COCOCOR1d, o R7 y R8 juntos son =CH2 o CH2OCOCH2; R9 es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico; R10 es alquilo C1-4 sustituido con Hal; "a" es un enlace doble o un enlace sencillo; y en la que Y = (CH2)n n= 0 a 5; R1a-1d son grupos iguales o diferentes de R1.

Description

Derivados de triterpenoides.
La presente invención se refiere al uso terapéutico y a la actividad biológica de derivados de triterpenoides. La invención se refiere además a nuevos derivados de triterpenoides.
Hasta la actualidad, la técnica anterior se ha centrado principalmente en compuestos que son capaces de regular el ciclo celular en virtud de la inhibición de las quinasas dependientes de ciclinas (CDK). Los ejemplos de tales compuestos incluyen butirolactona I, flavopiridol, bohemina, olomucina, roscovitina, purvanalol e indarrubicina.
Existe un considerable apoyo en la bibliografía para la hipótesis de que las CDK y sus proteínas reguladoras desempeñan un papel significativo en el desarrollo de tumores humanos. De este modo, en muchos tumores, se ha observado una expresión o actividad anormal temporal de las CDK, junto con una importante desregulación de inhibidores de proteínas (mutaciones, supresiones). Esto da como resultado la activación de CDK y, en consecuencia, la regulación defectuosa de la transición G1/S. A diferencia de las células normales, las células tumorales no se detienen en G1, y puesto que se independizan de los factores de crecimiento, pasan el punto de restricción de G1 y entran muy rápidamente en la fase S.
Contrariamente a la técnica anterior, la presente invención se refiere a compuestos que son antiproliferativos, pero que se cree que operan mediante un mecanismo distinto de la inhibición de las CDK.
La transición G_{1}/S del ciclo celular de los mamíferos está estrechamente regulada por la proteína del retinoblastoma (pRb). Las mutaciones o supresiones del gen de retinoblastoma predisponen a los individuos al retinoblastoma familiar y a otros tipos de cánceres. La proteína pRb es una proteína acopladora, que en su forma hipofosforilada tiene la capacidad para unirse, y de este modo para inactivar, a factores de transcripción de la fase S, tales como DP-1 y E2F. Sin embargo, tras la fosforilación mediante quinasas dependientes de ciclinas G_{1}/S (CDK) (CDK4/ciclina D1-D3, CDK6/ciclina D1-D3, CDK2/ciclina A), la pRb hiperfosforilada libera los factores de transcripción y se inicia la fase S. En la fase S, la fosforilación de la proteína pRb se mantiene mediante la actividad de complejos de CDK2/ciclina E. De este modo, la hiperfosforilación de la proteína pRb desempeña un papel clave en la patología molecular de células cancerosas con actividad de CDK alterada.
La presente invención se refiere al uso de compuestos de triterpenoides derivados de los productos naturales betulina y ácido betulínico (BA), como se muestran en la fórmula (A). Los compuestos de la presente invención se denominan en lo sucesivo como betulininas.
1
Con respecto a su actividad biológica y terapéutica, se cree que los compuestos descritos en la presente invención son de beneficio específico en el tratamiento de enfermedades proliferativas tales como cánceres y leucemias.
Ya se conocen en la técnica varios de los compuestos adecuados para uso en la presente invención, por ejemplo los descritos en Ber. Dtsch. Chem. Ges. 55, 2332 (1922), Schluze, H. et al.; Acta Chem. Scand., B 29, 139 (1975), Suokas E. et al.; Collect. Czech. Chem. Commun. 56, 2936 (1991), Sejbal J. et al.; Collect. Czech. Chem. Commun. 64, 329 (1999), Klinotová et al.; Indian. J. Chem., Sect. B 34, 624 (1995), Dinda B. et al.; Chem. Listy 91, 1005 (1997), \check{S}arek J. et al.; Collect Czech Chem Commun 58, No 10, 2505-2516 (1993), Klinotova E. et al.; J. Chem. Soc. C. 350-351 (1970), Kirk et al.; Chem. Nat. Compd. (Eng translation) 28, No. 2, 179-184 (1992), Odinokova et al. Sin embargo, estas descripciones no incluyen ninguna indicación en cuanto a la posible actividad biológica de tales compuestos.
El documento WO 98/51293 describe derivados del ácido betulínico que tienen propiedades antiproliferativas.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, destinado a ser utilizado en terapia,
2
en la que:
X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHOC(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y R^{8} juntos son CHOCOCH_{2} y forman una espirolactona;
R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo inferior;
R^{6} es H, o está ausente si "a" es un doble enlace;
R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCO COR^{1d}, o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
R^{10} es alquilo inferior sustituido con Hal;
"a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
y en la que
Y = (CH_{2})n
n= 0 a 5;
R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}.
En un aspecto preferido, la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar a un paciente que padece leucemia, cáncer u otro trastorno proliferativo.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a nuevas betulininas de fórmula estructural Ia, o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas,
3
\newpage
en la que:
X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHOC(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y X^{8} juntos son CHOCOCH_{2} y forman una espirolactona;
R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo inferior;
R^{6} es H, o está ausente si "a" es un enlace doble;
R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOC OR^{1d},
o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
R^{10} es alquilo inferior sustituido con Hal;
"a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
y en la que
Y = (CH_{2})n
n = 0 a 5;
R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}
con la condición de que
(i) cuando X^{1} es CHOAc, X^{3} es C=O, "a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me, R^{6} es H;
-
cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de COOH, CH_{2}COCOPr^{i}, COCOCOPr^{i}, CH_{2}COOH, o CH_{2}CH_{2}CO^{i} Pr;
-
cuando R^{7} es CO_{2}Me, R^{8} es distinto de CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2};
-
cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOMe, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}COPr^{i}; y
(ii) cuando X^{1} es CHOH, X^{3} es C=O, "a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me, y R^{6} es H,
-
cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOH, CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2} o CH_{2}COOMe;
-
cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de CH_{2}COOH;
o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
Como se utiliza en la presente invención, la expresión alquilo inferior significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, incluyendo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario.
Descripción de las realizaciones preferidas
Dentro de las opciones proporcionadas para los grupos X^{1}, X^{3} y R^{1-8} de fórmula I, se prefieren las siguientes opciones. Preferentemente,
X^{1} es CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a} o CHOCOY-Hal; y
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}.
En una realización más preferida, R^{2-5} son todos metilo, y R^{1} es como se define anteriormente para el grupo pertinente R^{1a-1d};
\newpage
X^{1} es
-
CHOCOCH_{2}Cl; o
-
CHOR^{1a} o CHOCOR^{1a}, en el que R^{1a} es H y metilo respectivamente;
X^{3} es C=O, CHOH o CHOAc;
R^{7} es H, COOH, COOMe, CH_{2}OAc, COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que
Y es CH_{2} y R^{1e} es alquilo C_{1-4};
R^{8} es
-
COOR^{1d}, en el que R^{1d} es H o metilo;
-
YCOOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es H, metilo o etilo;
-
COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es alquilo C_{1-4};
-
CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4};
-
CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4}.
De las definiciones preferidas proporcionadas anteriormente, es preferible que
R^{8} sea
-
COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es metilo o butilo;
-
CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es metilo o etilo;
-
CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es propilo; y
R^{7} es COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e} es metilo o butilo.
En una realización preferida, "a" es un enlace sencillo y R^{6} es H.
En una realización más preferida del primer aspecto de la invención, los compuestos de uso se seleccionan de los mostrados a continuación en la Tabla 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
4
TABLA 1 (continuación)
5
\newpage
En una realización más preferida, el compuesto se selecciona de:
6
Con respecto al segundo aspecto de la invención, las realizaciones preferidas que se refieren a los compuestos son idénticas a las proporcionadas anteriormente para el primer aspecto con aplicación de la condición de la fórmula Ia.
Los compuestos más preferidos del segundo aspecto son los representados a continuación en la Tabla 1a.
TABLA 1a
7
8
\newpage
Con respecto al conjunto de la invención, es preferible que el trastorno proliferativo sea cáncer o leucemia. En una realización, el cáncer o leucemia es p53, independiente de hormonas y de resistencia a múltiples fármacos. En otra realización, el cáncer o leucemia es independiente del estado de Rb.
Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para tratar pacientes que padecen cáncer, mediante la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de un compuesto de fórmula I o sales o ésteres farmacéuticamente aceptables del mismo.
Sin desear estar limitados por la teoría, los estudios preliminares sugieren que en lugar de influir sobre la actividad de quinasas dependientes de ciclinas, los compuestos de la presente invención parece que operan mediante un mecanismo alternativo. En particular, se cree que las betulininas de la presente invención pueden inhibir la proliferación celular e inducir la muerte de las células cancerosas de una manera que implica principalmente modificaciones post-traduccionales, principalmente la fosforilación, de una proteína reguladora clave implicada en la proliferación celular. Más específicamente, se cree que las betulininas de la invención efectúan un cambio en el estado de fosforilación de la proteína Rb. Tal mecanismo puede ser ventajoso puesto que se piensa que los compuestos de la presente invención pueden ser capaces de inhibir la proliferación celular en el tejido tumoral proliferante, pero no en el tejido sano.
De este modo, en una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad proliferativa cancerosa o leucémica efectuando un cambio en el estado de fosforilación de la proteína pRb mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I o sales o ésteres farmacéuticamente aceptables del mismo.
Los compuestos de la presente invención también son capaces de inducir apoptosis (muerte celular programada) en células proliferativas. De este modo, en una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para inducir la muerte celular en células proliferativas, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I o sales o ésteres farmacéuticamente aceptables del mismo.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de betulininas de fórmula I como productos químicos de investigación y como compuestos para el diagnóstico clínico y/o de laboratorio. Más particularmente, la invención se refiere al uso de betulininas como productos químicos de investigación para el estudio de los procesos de fosforilación/desfosforilación de sustratos celulares, de la proliferación celular, de la purificación de moléculas diana, y/o para estudios del ciclo celular.
Por lo tanto, la presente invención se refiere además al uso de un compuesto de fórmula I en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa.
Como se utiliza en la presente invención, la expresión "preparación de un medicamento" incluye el uso de un compuesto de fórmula I directamente como el medicamento, además de su uso en un programa de cribado para la identificación de otros agentes antiproliferativos, o en cualquier etapa de la fabricación de tal medicamento.
Tal programa de cribado puede incluir, por ejemplo, un ensayo para determinar el estado de fosforilación de sustratos celulares, y determinar si una sustancia candidata es capaz de imitar la actividad de una betulinina de fór-
mula I.
De este modo, en una realización adicional, la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable, una forma cristalina, un complejo, un hidrato, o un éster hidrolizable del mismo, en un ensayo para determinar el estado de fosforilación de sustratos celulares, y opcionalmente en la identificación de compuestos candidatos que actúen de manera similar.
Preferentemente, el sustrato celular, cuyo estado de fosforilación se ensaya, es la proteína de Rb.
Los compuestos de los aspectos primero y segundo de la presente invención pueden estar presentes como sales o ésteres, en particular sales o ésteres farmacéuticamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables del producto de la invención incluyen sales de adición de ácidos o sales de bases adecuadas del mismo. En Berge et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977) se puede encontrar un repaso de las sales farmacéuticas adecuadas. Las sales se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes, tales como ácidos minerales, por ejemplo ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácidos hidrohálicos; con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono que están no sustituidos o que están sustituidos (por ejemplo, mediante halógeno), tales como ácido acético; con ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, por ejemplo oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tereftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos organosulfónicos, tales como ácidos alquil (C_{1}-C_{4}) o arilsulfónicos que están no sustituidos o sustituidos (por ejemplo, mediante un halógeno), tales como ácido metano- o p-toluenosulfónico.
Los ésteres se forman usando ácidos orgánicos o alcoholes/hidróxidos, dependiendo del grupo funcional que se está esterificando. Los ácidos orgánicos incluyen ácidos carboxílicos, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 12 átomos de carbono que están no sustituidos o sustituidos (por ejemplo, mediante halógeno) tales como ácido acético; con ácido dicarboxílico saturado o insaturado, por ejemplo oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tereftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos organosulfónicos, tales como ácidos alquil (C_{1}-C_{4})- o arilsulfónicos que están no sustituidos o sustituidos (por ejemplo, mediante un halógeno), tales como ácido metano- o p-toluenosulfónico. Los hidróxidos adecuados incluyen hidróxidos inorgánicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio. Los alcoholes incluyen alcanoalcoholes de 1-12 átomos de carbono que pueden estar no sustituidos o sustituidos (por ejemplo mediante un halógeno).
En todos los aspectos de la presente invención previamente discutidos, la invención incluye, cuando sea apropiado, todos los enantiómeros y tautómeros de los compuestos de fórmula I o Ia. El experto en la materia reconocerá los compuestos que poseen propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales), o características tautómeras. Los enantiómeros y/o tautómeros correspondientes se pueden aislar/preparar mediante métodos conocidos en la técnica.
La invención se refiere además a los compuestos de, o de uso, en la presente invención en sus diversas formas cristalinas, formas polimórficas y formas (an)hidras. Es bien sabido en la industria farmacéutica que los compuestos químicos se pueden aislar en cualquiera de tales formas variando ligeramente el método de purificación y/o aislamiento de los disolventes usados en la preparación sintética de tales compuestos.
La invención incluye además los compuestos de la presente invención, o de uso en la presente invención, en forma de profármacos. Tales profármacos son generalmente compuestos de fórmula I o Ia en el que uno o más grupos apropiados se han modificado de manera que la modificación se invierte con la administración a un ser humano o a un mamífero. Tal inversión se realiza habitualmente mediante una enzima presente de forma natural en tal sujeto, aunque es posible que se administre un segundo agente junto con tal profármaco a fin de realizar in vivo la inversión. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen ésteres (por ejemplo, cualquiera de los descritos anteriormente), en los que la inversión se puede llevar a cabo mediante una esterasa, etc. Otros sistemas son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención. A este respecto, y en particular para la terapia humana, incluso aunque los compuestos de la presente invención (incluyendo sus sales farmacéuticamente aceptables, ésteres y solvatos farmacéuticamente aceptables) se pueden administrar solos, generalmente se administrarán en mezcla con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico, seleccionado con respecto a la vía pretendida de administración y a la práctica farmacéutica estándar.
De este modo, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden betulininas o sales o ésteres farmacéuticamente aceptables de las mismas, junto con al menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. A título de ejemplo, en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, los compuestos de la invención se pueden mezclar con cualquier aglutinante o aglutinantes adecuados, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de revestimiento, y/o agente o agentes solubilizantes. En "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2ª Edición, editado por A Wade y PJ Weller, se pueden encontrar ejemplos de tales excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas aquí.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden adaptar para las vías oral, rectal, vaginal, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa, nasal, bucal o sublingual de administración.
Para la administración oral, se hace uso particular de tabletas comprimidas, pastillas, comprimidos, píldoras, gotas y cápsulas. Preferentemente, estas composiciones contienen de 1 a 250 mg, y más preferentemente de 10 a 100 mg, de ingrediente activo por dosis.
Otras formas de administración comprenden disoluciones o emulsiones que se pueden inyectar de forma intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, o intramuscular, y que se preparan a partir de disoluciones estériles o esterilizables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de supositorios, pesarios, suspensiones, emulsiones, lociones, ungüentos, cremas, geles, pulverizaciones, disoluciones o polvos muy finos.
Un medio alternativo para la administración transdérmica es el uso de un parche dérmico. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede incorporar en una crema que consiste en una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. El ingrediente activo también se puede incorporar, a una concentración entre 1 y 10% en peso, en un ungüento que consiste en cera blanca o base de parafina blanda blanca, junto con estabilizantes y conservantes, según se requiera.
Las formas inyectables pueden contener entre 10-1.000 mg, preferentemente entre 10-250 mg, de ingrediente activo por dosis.
Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, es decir, en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, o un múltiplo o subunidad de una dosis unitaria.
El experto en la materia puede determinar fácilmente una dosis apropiada de una de las actuales composiciones para administrarla a un sujeto sin experimentación innecesaria. Típicamente, el médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un paciente individual, y variará con la edad, el peso y la respuesta del paciente particular. Las dosis descritas en la presente invención son ejemplares del caso medio. Por supuesto, pueden haber casos individuales en los que merezca la pena intervalos de dosificación mayores o menores, y estos están dentro del alcance de esta invención.
En una realización ejemplar, una o más dosis de 10 a 150 mg/día se administrarán al paciente para el tratamiento del tumor maligno.
La invención se refiere además a métodos de síntesis química de los compuestos descritos anteriormente.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula I tal como se ha definido anteriormente, que comprende:
10
(i)
oxidar un compuesto de fórmula Ib a un compuesto de fórmula Ic;
(ii)
reducir dicho compuesto de fórmula Ic para formar un compuesto de fórmula Id; y opcionalmente
(iii)
convertir dicho compuesto de fórmula Id a un compuesto de fórmula I en la que "a" es un doble enlace.
En una realización preferida, el compuesto de fórmula Ib se oxida a Ic mediante tratamiento secuencial con dióxido de selenio, ácido peroxiacético y tetróxido de rutenio.
En una realización más preferida, la reducción de Ic a Id es una reducción estereoselectiva.
Incluso más preferentemente, el compuesto de fórmula Ic se reduce a Id mediante tratamiento con borohidruro de sodio en presencia de una sal de cerio (III).
En un aspecto preferido, la etapa (iii) comprende esterificar un compuesto de fórmula Id, en la que R^{1d} es H, oxidar y deshidrogenar.
La preparación de los compuestos de la presente invención se discutirá con mayor detalle a continuación, haciendo referencia específica a las realizaciones preferidas. El experto en la materia pertinente será capaz de preparar otros compuestos de la invención mediante selección de los reactivos apropiados.
El siguiente esquema ilustra la síntesis de compuestos de fórmula I en la que X^{1} es CHOAc, X^{2} es CH_{2}, X^{3} es C=O, R^{1-5} son metilo, R^{6} es H o está ausente (cuando "a" es un doble enlace), R^{7} es CH_{2}OAc, y R^{8} es COOH, COOCH_{2}OCOMe o COOCH_{2}OCOC(CH_{3})_{3}.
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Condiciones: a, acetilación con anhídrido acético en presencia de una base (por ejemplo, piridina); b, isomerización del doble enlace mediante tratamiento con bromuro de hidrógeno en ácido acético; c, oxidación (por ejemplo, con dicromato sódico); d, oxidación (por ejemplo, con dióxido de selenio); e, oxidación (por ejemplo, con ácido peroxiacético); f, ruptura del doble enlace (por ejemplo, con etóxido de rutenio); g, reducción estereoselectiva (por ejemplo, con borohidruro de sodio en presencia de una sal de cerio (III)); h, esterificación con pivalato de clorometilo (POM-Cl) en presencia de una base (por ejemplo, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU)); i, esterificación con acetato de bromometilo (AcM-Br) en presencia de una base (por ejemplo, DBU); j, deshidrogenación (por ejemplo, con dióxido de selenio); k, hidrólisis (por ejemplo con óxido de bis(tributilestaño)).
El esquema a continuación ilustra la síntesis del compuesto I.58 de fórmula I en la que X^{1} es CHOAc, X^{3} es C=O, R^{1}-R^{5} son metilos, R^{6} es H, R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es COF.
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Condiciones: 1, reacción con trifluoruro de dietilaminoazufre.
La presente invención también se describe haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
la Figura 1A muestra una microfotografía electrónica de una célula de cáncer pulmonar A549 normal, no tratada, unida al cubreobjetos con un número de pseudópodos bien formados y una estructura fina de la membrana citoplasmática.
La Figura 1B muestra una microfotografía electrónica de células de cáncer pulmonar A549 tratadas con ácido betulínico. La célula de la izquierda está unida al cubreobjetos, y muestra una morfología normal con una estructura fina de la membrana citoplasmática, mientras que la célula de la derecha ya muestra una membrana citoplasmática aburbujada, una señal temprana de apoptosis.
La Figura 1C muestra una microfotografía electrónica de células de cáncer pulmonar A549 tratadas con 1.3. Ésta ilustra una célula tumoral apoptótica típica, con un extenso aburbujamiento de la membrana citoplasmática, de su unión y formación de cuerpos apoptóticos.
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La Figura 1D es un aumento de la Figura 1C, que muestra detalles de la formación de cuerpos apoptóticos en células tratadas con 1.3.
La Figura 2 muestra la actividad anticancerígena de la betulinina 1.3 en neuroblastoma SK-N-AS humano xenotransplantado.
La Figura 3 muestra los resultados de la electroforesis en SDS-PAGE de proteínas celulares totales. En particular, el gel muestra que la betulinina 1.3, pero no el ácido betulínico (BA), induce la rápida desfosforilación de la proteína Rb.
La Figura 4A muestra un análisis del ciclo celular de células tratadas con 1.3 y paclitaxel como control.
La Figura 4B muestra la inducción de apoptosis en células tratadas con 1.3 o paclitaxel como control.
En los ejemplos descritos se puede encontrar una referencia más detallada a las figuras anteriores.
La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como adicionalmente limitativos.
Ejemplos General
Los valores de los desplazamiento químicos (escala \delta, ppm) y las constantes de acoplamiento (J, Hz), en los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C, se obtuvieron usando un espectrómetro Varian UNITY-INOVA 400 FT (^{1}H a 400 MHz y ^{13}C a 100,6 MHz) en deuterocloroformo, con tetrametilsilano (para datos de RMN ^{1}H \delta = 0 ppm) como patrón interno. Para los datos de RMN ^{13}C, \delta (CDCl_{3}) = 77,00 ppm. Se da el valor para un multiplete, ya sea definido (doblete (d), triplete (t), cuartete (q), septete (sept.)) o no (m), en el punto medio aproximado, excepto que se cite un intervalo (s = singlete, b = ancho).
Los espectros de masas mediante impacto electrónico (EIMS) se midieron en un instrumento INCOS 50. La energía electrónica ionizante es 75 eV, la temperatura de la fuente de iones es 150ºC. El EIMS se usó para determinar los pesos moleculares, correspondiendo M^{+} al ion molecular.
Éter es éter dietílico. El THF y el dioxano se secaron sobre sodio. El ácido acético se purificó antes del uso mediante tratamiento con trióxido de cromo y destilación. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, excepto que se establezca de otro modo. El transcurso de la reacción se monitorizó mediante cromatografía de capa fina (TLC) en gel de sílice 60 G (Merck, detección mediante pulverización con 10% de ácido sulfúrico y calentamiento). El procedimiento de tratamiento implica la dilución con el disolvente especificado (de otro modo el disolvente de la reacción orgánico), la extracción con agua y después con salmuera o con hidrogenocarbonato de sodio, el secado sobre sulfato magnésico anhidro, y la evaporación a vacío para dar un residuo.
Ejemplo 1 Diacetato de lup-20(29)-en-3\beta,28-diilo
La betulina bruta (500 g) se disolvió en una mezcla de 250 ml de piridina y 250 ml de anhídrido acético. La mezcla se puso a reflujo entonces durante media hora. Tras enfriar, los cristales resultantes se separaron por filtración y se lavaron con ácido acético, etanol y agua. Una disolución del diacetato de lup-20(29)-en-3\beta,28-diilo bruto (400 g) en cloroformo se filtró a través de una columna de alúmina, y la columna se lavó con cloroformo. El filtrado se evaporó entonces a presión reducida. El residuo se cristalizó en cloroformo/metanol para obtener 250 g de compuesto del título que, según TLC, contiene trazas de acetato de luteol. Después de la recristalización en cloroformo/metanol, el rendimiento del compuesto puro fue 239 g, p.f. 222-223ºC, [\alpha]_{D} +22º (c 0,4; CHCl_{3}). [Schulze H., Pieroh K.: Ber. Dtsch. Chem. Ges. 55, 2332 (1992)].
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del título es el siguiente:
0,84 s, 0,84 s, 0,85 s, 0,97 s, 1,03 s, 1,68, 6 x 3H (6 x CH_{3}); 2,04 s, 3 H, 2,07 s, 3 H (2x OAc); 2,44 ddd, 1 H (J' = 11,4, J' = 10,9, J''' = 0,7, H-19); 3,85 d, 1 H (J = 11,1, H-28a); 4,25 dd, 1 H, (J' = 11,1, J'' = 1,4, H-28b); 4,47 m, 1 H (H-3\alpha); 4,59 m, 1 H (\Sigma J = 3,4, H-29E); 4,69 m, 1 H (\Sigma J = 2,1, H-29Z).
Ejemplo 2 Diacetato de lup-18-en-3\beta,28-diilo
Se añadió una disolución de bromuro de hidrógeno en ácido acético (38%, 1,4 l) a una disolución de diacetato de lup-20(29)-en-3\beta,28-diilo (100 g, 190 mmoles) en una mezcla de benceno, ácido acético y anhídrido acético (1 l:0,5 l:50 ml). La mezcla de reacción se puso a reflujo hasta que la reacción estuvo terminada (la TLC se desarrolló en una mezcla de hexano/éter). Después de enfriar, la mezcla de reacción se vertió sobre agua enfriada con hielo (3:1), y se extrajo con benceno (3 x 0,5 l). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con disolución acuosa de NaHCO_{3}, con disolución de NaHSO_{3} y con agua, y se secaron sobre sulfato de magnesio. El procedimiento de tratamiento habitual dio 90 g de un residuo marrón oscuro. El polvo seco se extrajo en un extractor Soxhlet con acetona, hasta que se puso blanco. Después de secar en aire, el producto se cristalizó en butanona. El rendimiento del compuesto del título fue 74 g (74%), p.f. 215-216ºC, [\alpha]_{D} +15º (c 0,45; CHCl_{3}). [Suokas E., Hase T.: Acta Chem. Scand., B 29, 139 (1975)].
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del título es el siguiente:
0,84 s, 0,85 s, 0,89 s, 0,90 s, 0,91 d, 3 H (J = 6,8), 0,99 d, 3 H (J = 6,8), 1,06 s, 7 x 3H (7 x CH_{3}); 2,04 s, 3 H, 2,05 s, 3 H (2x OAc); 2,25 m, 2 H (\Sigma J \sim 15); 2,43 m, 1 H (\Sigma J \sim 15); 3,14 sept., 1 H (J = 7, H-20); 3,98 d, 1 H (J = 10,8, H-28a); 4,03 d, 1 H (J = 10,8, H-28b); 4,49 m, 1 H (H-3\alpha).
Ejemplo 3 Diacetato de 21-oxo-lup-18-en-3\beta,28-diilo
Se disolvieron diacetato de lup-18-en-3\beta,28-diilo (50 g; 95 mmoles), dicromato sódico (22,5 g; 75,5 mmoles) y acetato sódico (5 g) en una mezcla de benceno y ácido acético (0,7 l, 0,3 l). La mezcla de reacción se dejó reposar hasta que la reacción estuvo terminada (la TLC se desarrolló en hexano/éter). Tras la dilución con un exceso de agua, la mezcla se extrajo con benceno (3 x 300 ml). Después del procedimiento de tratamiento habitual, el compuesto del título se obtuvo (45 g, 87%) como una espuma cristalina amarilla pálida, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional (véase el Ejemplo 4). El compuesto del título puro tuvo un p.f. 205-206ºC, [\alpha]_{D} -35º (c 0,49; CHCl_{3}). Otra forma para obtener el compuesto del título se describe en Sejbal J., Klinot J., Bude\check{s}ínský M., Protiva J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 56, 2936 (1991).
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del título es el siguiente:
0,85 s, 0,86 s, 0,93 s, 0,94 s, 1,16 s, 1,17 d (J = 7,1), 1,21 d (J = 7,1), 7 x 3 H (7 x CH_{3}); 2,00 s, 3 H, 2,05 s, 3 H (2 x OAc); 2,39 d, 1 H (J = 18,5, H-22); 2,87 dd, 1 H (J' = 11,9, J'' = 4,1, H-13\beta); 3,18 sept, 1 H (J = 6,6, H-20); 4,06 d, 1 H (J = 10,9, H-28a); 4,34 d, 1 H (J = 10,9, H-28b); 4,49 m, 1 H (J \sim 7, H-3\alpha).
Los siguientes compuestos se prepararon mediante el procedimiento mencionado anteriormente:
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentan1orlupan-22-oato de (pivaloiloxi)metilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentan1orlupan-22-oato de acetoximetilo
Ejemplo 4 Diacetato de 21,22-dioxolup-18-en-3\beta,28-diilo
Una disolución de diacetato de 21-oxolup-18-en-3\beta,28-diilo bruto (40 g; 74 mmoles; que contiene alrededor de 85% de diacetato de 21-oxolup-18-en- 3\beta,28-diilo) y dióxido de selenio (160 g; 1,44 mmoles), en una mezcla de dioxano (0,8 l) y ácido acético (0,4 l), se puso a reflujo hasta que la reacción estuvo terminada (la TLC se desarrolló en benceno/éter).
Tras enfriar, el selenio precipitado se eliminó por filtración, y el filtrado se vertió lentamente en un exceso de agua agitado vigorosamente. El precipitado rojo naranja se separó por filtración a presión reducida, se lavó cuidadosamente con agua, y se secó en aire. El diacetato de 21,22-dioxo-lup-18-en-3\beta,28-diilo bruto seco se disolvió en cloroformo, y la disolución se filtró a través de una columna de alúmina, la columna se lavó entonces con cloroformo, y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo se cristalizó en acetato de metilo para dar 28,9 g (82%) del compuesto del título como agujas naranjas pálidas, p.f. 267-270ºC, [\alpha]_{D} -127º (c 0,32; CHCl_{3}). Otra forma para obtener el compuesto del título se describe en Klinotová E., Cermáková J., Rejzek M., Krecek V., Sejbal J., Ol\check{s}ovský; P., Klinot J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 64, 329 (1999).
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del título es el siguiente:
0,85 s, 0,86 s, 0,94 s, 0,97 s, 1,18 s, 1,24 d (J = 7,2), 1,26 d (J = 7,2), 7 x 3 H (7 x CH_{3}); 1,93 s, 3 H, 2,06 s, 3 H (2 x OAc); 3,12 dd, 1 H (J' = 12,5, J'' = 3,8, H-13(3); 3,36 sept, 1 H (J = 7,0, H-20); 4,02 d, 1 H (J = 11,1, H-28a); 4,49 dd, 1 H (J' = 10,2, J'' = 6,0, H-3a); 4,84 d, 1 H (J = 11,1, H-28b).
Los siguientes compuestos se prepararon mediante el procedimiento mencionado anteriormente:
3\beta-acetoxi-21,22-dioxolup-18-en-28-oato de metilo
3\beta-acetoxi-21,22-dioxolup-18-en-28-oato de acetoximetilo
3\beta-acetoxi-21,22-dioxolup-18-en-28-oato de (pivaloiloxi)metilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-12-en-22-oato de acetoximetilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-12-en-22-oato de (pivaloiloxi)metilo
ácido 3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oico [Dinda B., Hajra A. K., Das S. K., Chel G., Chakraborty R., Ranu B. C.: Indian. J. Chem., Sect. B 34, 624 (1995)]
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oato de acetoximetilo
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oato de (pivaloiloxi)metilo
Ejemplo 5 Anhídrido de ácido 3\beta,28-diacetoxi-21,22-secolup-18-en-21,22-dioico
Una disolución de diacetato de 21,22-dioxolup-18-en-3\beta,28-diilo (25 g; 45 mmoles) y ácido peroxiacético (0,6 l; 32%) en cloroformo (0,25 l) se agitó vigorosamente hasta que la reacción estuvo terminada (la TLC se desarrolló en hexano/éter). La mezcla de reacción incolora se diluyó con agua fría y se extrajo con cloroformo (3 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con disolución acuosa al 5% de yoduro potásico (400 ml), con disolución acuosa saturada de sulfito sódico (200 ml) y con salmuera (2 x 200 ml), se secaron y se evaporaron. El aceite amarillo pálido resultante se cristalizó en cloroformo/metanol para dar 20,7 g (80,5%) del compuesto del título como pequeños cristales blancos, p.f. 306-309ºC, [\alpha]_{D} +88º (c 0,45; CHCl_{3}). Otra forma para obtener el compuesto del título se describe en Sejbal J., Klinot J. Bude\check{s}ínský M., Protiva J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 56, 2936 (1991).
El espectro de RMN ^{1}H del compuesto del título es el siguiente:
0,85 s, 0,85 s, 0,90 s, 0,91 s, 1,11 s, 1,14 d (J = 7), 1,31 d (J = 7), 7 x 3H (7 x CH_{3}); 2,01 s, 3 H, 2,05 s, 3 H (2 x OAc); 2,53 dt, 1 H (J' = 14,4, J'' = J''' = 3,5); 2,72 dd, 1 H (J ' = 3,1, J'' = 12,3); 3,26 sept,, 1 H (H-20, J = 7); 3,90 d, 1 H, 4,54 d, 1 H (2 x H-28, J = 11,0); 4,47 m, 1 H (H-3\alpha).
Los siguientes compuestos se prepararon mediante el procedimiento mencionado anteriormente:
ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-18,19-seco-19,20,29,30-tetranorlupan-21-oico [\check{S}arek J., Klinot J., Klinotová E., Sejbal J.: Chem. Listy 91, 1005 (1997)], ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico.
Ejemplo 6 Ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico
El anhídrido del ácido 3\beta,28-diacetoxi-21,22-secolup-18-en-21,22-dioico (20 g; 35,1 mmoles), en acetato de etilo (1 l), se añadió a una mezcla de dióxido de rutenio (400 mg; 4 mmoles), metaperyodato de sodio (60 g; 280,3 mmoles), agua (200 ml) y ácido trifluoroacético (20 ml), y la mezcla se agitó vigorosamente. Después de que la reacción estuvo terminada, se añadió etanol, la mezcla se filtró, y la capa orgánica se filtró a través de una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó entonces con acetato de etilo, el filtrado se evaporó a presión reducida, y el residuo se lavó con éter y se cristalizó en una mezcla de diclorometano/éter. El rendimiento del compuesto del título fue 10,6 g (61%), p.f. 137-140ºC, [\alpha]_{D} +40º (c 0,37; CHCl_{3}). \check{S}arek J., Klinot J., Klinotová E., Sejbal J.: Chem. Listy 91, 1005
(1997)].
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del título es el siguiente:
213,3, 174,2, 171,1, 170,5, 80,7, 65,4, 58,8, 55,4, 50,6, 50,1, 46,8, 41,1, 38,5, 37,8, 37,1, 33,9, 28,4, 27,9, 26,8, 23,5, 21,8, 21,2, 20,6, 19,6, 18,1, 16,7, 16,5, 16,2, 16,0.
Los siguientes compuestos se prepararon mediante el procedimiento mencionado anteriormente:
diacetato de 18,19,21-trioxo-18,19-secolupan-3\beta,28-diilo [\check{S}arek J., Klinot J., Klinotová E., Sejbal J.: Chem. Listy 91, 1005 (1997)], diacetato de 18,19,21,22-tetraoxo-18,19-secolupan-3\beta,28-diilo, ácido 3\beta-acetoxi-21-oxolup-18-en-28-oico.
Ejemplo 7 Ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-hidroxi-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico
Se añadió una disolución de cloruro de cerio (200 ml; 1 M) y borohidruro de sodio (2 g; 53 mmoles) a una disolución de ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico (10 g; 19,8 mmoles) en 500 ml de THF. La mezcla de reacción se agitó durante una hora. La mezcla se vertió en un exceso de disolución acuosa al 1% de ácido clorhídrico, y se extrajo con cloroformo (3 x 300 ml). El procedimiento de tratamiento habitual dio 8,7 g (86,7%) del compuesto del título, p.f. 156-159ºC, [\alpha]_{D} +48º (c 0,32; CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del título es el siguiente:
179,5, 171,1, 170,9, 80,9, 73,5, 64,5, 55,4, 51,7, 50,6, 41,0, 40,3, 38,4, 37,8, 37,3, 37,1, 32,6, 27,9, 25,9 (2 C), 23,6, 21,3, 20,9, 20,8, 19,9, 18,0, 16,5, 16,3, 16,1, 16,0.
Ejemplo 8 3\beta,28-diacetoxi-18-hidroxi-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oato de (pivaloiloxi)metilo
Se añadieron DBU (0,3 g; 2 mmoles) y pivalato de clorometilo (0,3 g; 2 mmoles) a la disolución de ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-hidroxi-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oico (1 g; 2 mmoles), en una mezcla de diclorometano (5 ml) y acetonitrilo (2 ml). La mezcla se agitó vigorosamente durante 3 horas y después se diluyó con agua enfriada con hielo, y se extrajo con cloroformo (3 x 10 ml). Los extractos orgánicos recogidos se lavaron con salmuera fría, se secaron y el cloroformo se evaporó a vacío. El aceite amarillo pálido viscoso resultante (1,5 g) se cromatografió sobre gel de sílice, eluyendo con tolueno. Tras la cristalización en metanol, se obtuvieron 0,6 g (48%) del compuesto del título en forma de agujas incoloras, p.f. 235-240ºC, [\alpha]_{D} + 53º (c 0,23; CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C obtenido para el compuesto del título es el siguiente:
177,4, 172,9, 171,0, 170,6, 80,8, 80,0, 73,5, 64,1, 55,4, 52,1, 50,6, 41,0, 40,3, 38,8, 38,5, 37,8, 37,3, 37,1, 32,7, 27,9, 26,8 (3 C), 25,9, 25,8, 23,6, 21,3, 20,9, 20,7, 19,8, 18,1, 16,5, 16,3, 16,1, 16,0.
Los siguientes ésteres se prepararon mediante este procedimiento general:
3\beta,29-diacetoxi-18-oxo-18,19-seco-19,20,29,30-tetranorlupan-21-oato de (pivaloiloxi)metilo
3\beta-hidroxi-30-oxo-lup-20(29)-en-28-oato de (pivaloiloxi)metilo
3\beta-acetoxi-21-oxo-lup-18-en-28-oato de (pivaloiloxi)metilo
De la misma manera, usando AcM-Br en vez de POM-Cl, se prepararon los siguientes ésteres:
3\beta,28-diacetoxi-18-hidroxi-19,20,21,29,30-pentanorlupan-22-oato de acetoximetilo
3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-18,19-seco-19,20,29,30-tetranorlupan-21-oato de acetoximetilo
3\beta-hidroxi-30-oxolup-20(29)-en-28-oato de acetoximetilo
3\beta-acetoxi-21-oxolup-18-en-28-oato de acetoximetilo
Ejemplo 9 Ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-12-en-22-oico
Se añadió óxido de bis(tributilestaño) (1,9 g; 3,2 mmoles) a una disolución de 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,
30-pentanorlup-12-en-22-oato de (pivaloiloxi)metilo (1 g; 1,6 mmoles) y AIBN (20 mg) en éter (50 ml). La mezcla se agitó vigorosamente hasta que la reacción estuvo terminada (el TLC se desarrolló con cloroformo/acetato de etilo).
El éter se evaporó entonces a vacío, y el producto se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con cloroformo/acetato de etilo. Tras la cristalización en una mezcla de diclorometano/éter, el compuesto del título se obtuvo en forma de sólido cristalino blanco (0,5 g, 62%), p.f. 138-141ºC, [\alpha]_{D} +38º (c 0,25; CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del título es el siguiente:
16,0, 16,7, 16,9, 18,1, 20,8, 21,3, 23,4, 24,2, 24,4, 24,6, 25,2, 27,8, 33,4, 36,8, 37,7, 38,3, 38,7, 43,9, 46,9, 55,4, 58,9, 64,3, 80,5, 138,1, 140,6, 170,5, 170,9, 171,6, 196,8.
Ejemplo 10 Fluoruro de 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-22-oilo, y compuestos similares
Se añadió gota a gota trifluoruro de dietilaminoazufre (0,5 ml; 3,25 mmoles) a una disolución de ácido 3\beta,28-diacetoxi-18-oxo-19,20,21,29,30-pentanorlup-22-oico (0,5 g; 1,0 mmoles) en cloroformo seco (5 ml), y la mezcla de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Después de que la reacción estuvo terminada, la mezcla se vertió lentamente en agua fría (50 ml), y se extrajo dos veces con cloroformo. Las fracciones orgánicas combinadas se trataron en la forma general, y se cromatografiaron sobre gel de sílice (20% de acetato de etilo en hexano). El residuo se cristalizó en alcohol isopropílico para dar 0,19 g (38%) del compuesto del título como cristales blancos, p.f. 150-155ºC (descomp.), [\alpha]_{D} + 21º (c 0,55; CHCl_{3}).
El espectro de RMN ^{13}C del compuesto del título es el siguiente:
211,3 s, 160,2 d (J = 374), 170,1 s, 169,5 s, 80,6 s, 65,4 s, 57,5 d (J = 39), 55,1 s, 50,6 s, 49,9 s, 46,8 s, 40,1 s, 38,5 s, 37,8 s, 36,1 s, 33,3 s, 28,4 s, 27,9 s, 26,8 s, 23,5 s, 21,3 s, 21,2 s, 20,6 s, 19,6 s, 18,0 s,16,5 s, 16,4 s, 16,2 s, 15,9 s.
Ejemplo 11 Actividad biológica de betulininas 11.1. Actividad citotóxica in vitro de betulininas sobre líneas de células tumorales
Uno de los parámetros usados como base para ensayos colorimétricos es la actividad metabólica de las células viables. Por ejemplo, ahora se usa ampliamente un ensayo de microtitulación, que usa la sal de tetrazolio MTT, para cuantificar la proliferación celular y la citotoxicidad [Hajdúch M, Mihál V, Minarik J, Fáber E, \check{S}afárová M, Weigl E, Antálek P.: Cytotechnology, 1996, 19, 243-245]. Por ejemplo, este ensayo se usa en programas de detección sistemática de fármacos, y en ensayos de quimiosensibilidad. Debido a que las sales de tetrazolio se rompen sólo mediante células metabólicamente activas, estos ensayos detectan exclusivamente células viables. En el caso del ensayo con MTT, la sal de tetrazolio soluble amarilla se reduce a una sal de formazano coloreada, insoluble en agua. Después de que se solubiliza, el formazano formado se puede cuantificar fácil y rápidamente en un lector de placas ELISA convencional a 570 nm (absorbancia máxima). La cantidad de formazano reducido corresponde al número de células viables en el cultivo.
Para la detección sistemática habitual de estos compuestos, se usó la línea celular CEM de leucemia linfobástica T humana. Para demostrar un mecanismo común de acción, se ensayaron en un panel de líneas celulares (Tabla 2) compuestos seleccionados que mostraron actividad en un ensayo de detección sistemática. Estas líneas procedían de diferentes especies y de diferente origen histogenético, y poseían diversas alteraciones en las proteínas reguladoras del ciclo celular y en el estatus de dependencia hormonal (Tabla 2). Las células se mantuvieron en matraces plásticos para cultivo de tejidos de 80 cm^{2} de Nunc/Corning, y se cultivaron en medio de cultivo celular (DMEM con 5 g/l de glucosa, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 10% de suero fetal de ternera, y bicarbonato sódico). Los compuestos individuales se disolvieron en 10% de dimetilsulfóxido/disolución salina,
pH 8,0.
Las suspensiones celulares que se prepararon y se diluyeron según el tipo celular particular y la densidad celular diana esperada (2.500-30.000 células por pocillo, basándose en las características del crecimiento celular) se añadieron mediante pipeta (80 \mul) en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se permitió a los inoculados un período de preincubación de 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2}, para estabilización. En el tiempo cero, se añadieron diluciones de 4 veces de la concentración de ensayo pretendida, en alícuotas de 20 \mul, a los pocillos de una placa de microtitulación. Habitualmente, los compuestos de ensayo se evaluaron en seis diluciones de 4 veces. En el ensayo habitual, la concentración más elevada del pocillo fue 250 \muM, pero puede diferir, dependiendo del agente. Todas las concentraciones del fármaco se examinaron por duplicado. Las incubaciones de las células con los compuestos de ensayo duraron 72 horas a 37ºC, en una atmósfera de 5% de CO_{2} y 100% de humedad. Al final del período de incubación, las células se ensayaron usando el ensayo con MTT. Se pipetearon en cada pocillo diez microlitros de la disolución madre de MTT, y se incubaron adicionalmente durante 1-4 horas. Después de este período de incubación, el formazano se solubilizó mediante adición de 100 \mul/pocillo de 10% de SDS en agua (pH = 5,5), seguido de una incubación adicional a 37ºC toda la noche. La densidad óptica (DO) se midió a 540 nm con el lector Labsystem iEMS Reader MF(UK). La supervivencia de las células tumorales (TCS) se calculó usando la siguiente ecuación: TCS = (DO_{pocillo \ expuesto \ al \ fármaco}/DO_{pocillos \ de \ control} media) x 100%. El valor de TCS_{50}, la concentración del fármaco letal para el 50% de las células tumorales, se calculó a partir de las curvas de dosis y respuesta obtenidas.
Para evaluar la actividad anticancerígena de las betulininas, se examinó su actividad citotóxica frente a la línea celular CEM, usando el ensayo de detección sistemática. Adicionalmente, se ensayaron compuestos potentes frente a un panel de líneas celulares de diferente origen histogénico y de especie (Tabla 2).
TABLA 2
Actividad citotóxica de betulininas seleccionadas frente a un panel de diferentes líneas
celulares (no) tumorales
Línea celular Descripción Compuesto (TCS_{50}[\muM])
Ácido 1,3 1,7 1,28 1,44 1,55 1,57
betulínico
B16 Melanoma de ratón 36 2,1
B16F Melanoma de ratón, 4,6 4,7
metastásico
SW620 Cáncer de colon 250 1,2
humano, metástasis
U87MG Glioblastoma humano 250 5,1
HepG2 carcinoma hepatocelular 3,6 1,7
humano
A549 Adenocarcinoma 236 1,0
pulmonar humano
MCF-7 Cáncer de mama 194 2,3
humano, dependiente de
estrógeno, p53+/+, Rb +/+
U20S Osteosarcoma humano, 250 1,5
p53+/-, Rb +/-
Saos 2 Rhabdomionsarcoma 250 1,8
humano, p53-/-, Rb-/-
BT549 Cáncer de mama 250 2,0
humano, p53mut/mut
MDA-MB-238 Cáncer de mama 195 1,4
humano, dependiente de
estrógeno, p53mut/mut
DU145 Cáncer de próstata 241 0,8
humano, dependiente de
andrógenos, Rb-/-
HT-29 Cáncer de colon humano 250 1,6
OVCAR-3 Cáncer ovárico humano 164 1,0
Caco-2 Cáncer de colon humano 20 3,0
MEL-3 Melanoma humano 2,7 1,3
Linfocitos Linfocitos normales 250 13
humanos
NIH3T3 Fibroblastos 250 7,2
inmortalizados de ratón
TABLA 2 (continuación)
Línea celular Descripción Compuesto (TCS_{50}[\muM])
Ácido 1,3 1,7 1,28 1,44 1,55 1,57
betulínico
K562 Leucemia promielocítica 250 0,2
humana
K562-CdA Leucemia promielocítica 250 0,3
humana, resistente a
cladrubina
K562-GEM Leucemia promielocítica 101 0,9
humana, resistente a
gemcitabina
K562-ARA-C Leucemia promielocítica 250 0,6
humana, resistente a
citarabina
K562-FLUD Leucemia promielocítica 250 0,4
humana, resistente a
fludarabina
CEM Leucemia linfoblástica T 250 1,0 5,0 18 11 26 0,2
humana
CEM-DNR Leucemia linfoblástica T 250 0,6
1/C2 humana, resistente a
daunorrubicina
CEM-DNR Leucemia linfoblástica T 250 1,1
bulk humana, resistente a
daunorrubicina
CEM-VCR Leucemia linfoblástica T 19 3,3
1/F3 humana, resistente a
vincristina
CEM-VCR Leucemia linfoblástica T 24 2,9
3/D5 humana, resistente a
vincristina
CEM-VCR Leucemia linfoblástica T 69 2,5
bulk humana, resistente a
vincristina
En contraste con el ácido betulínico, que se afirma que es un agente selectivo para tumores derivados neuroectodérmicos, no hubo ninguna diferencia significativa en la sensibilidad de las betulininas a tumores de diferente origen histogenético.
Los compuestos son eficaces a concentraciones submicromolares y concentraciones micromolares bajas. Sin embargo, las células no tumorales, por ejemplo fibroblastos NIH3T3 y linfocitos humanos normales, toleraron dosis sustancialmente mayores de betulininas que las células tumorales, lo que sugiere un índice terapéutico favorable.
De forma notable, se encontró que la eficacia de las betulininas es idéntica en líneas celulares que tienen diversas mutaciones o supresiones en las proteínas asociadas con el ciclo celular (Tabla 2). Esto indica que estas sustancias deberían ser igualmente eficaces en tumores con diversas alteraciones de genes supresores de tumores, a saber, p53, Rb, etc.
Además, se mostró que las betulininas eran igualmente eficaces en líneas celulares resistentes a fármacos que sus homólogos maternos, sugiriendo de ese modo que los mecanismos clásicos de resistencia a múltiples fármacos aparentemente no se aplican a estos compuestos. Esta característica particular debe ser de importante beneficio terapéutico a pacientes de cáncer resistentes a la quimioterapia.
Finalmente, la actividad citotóxica de las betulininas es independiente del estado hormonal de las células cancerosas, de forma que los compuestos deben ser igualmente eficaces en el tratamiento de cánceres dependientes e independientes de hormonas.
11.2. Apoptosis inducida por betulininas en células tumorales
Para analizar los mecanismos de la citotoxicidad inducida por betulininas, es importante distinguir la apoptosis de la otra forma principal de muerte celular, la necrosis. En primer lugar, a nivel del tejido, la apoptosis produce poca o ninguna inflamación, puesto que las porciones arrugadas de la célula son engullidas por las células vecinas, especialmente macrófagos, en lugar de ser liberadas en el fluido extracelular. Por el contrario, en la necrosis, los contenidos celulares se liberan en el fluido extracelular, y de este modo tiene un efecto irritante sobre las células cercanas, provocando inflamación. En segundo lugar, a nivel celular, las células apoptóticas exhiben arrugamiento y aburbujamiento del citoplasma, conservación de la estructura de orgánulos celulares, incluyendo la mitocondria, condensación y marginación de cromatina, fragmentación de los núcleos, y formación de cuerpos apoptóticos, aunque no todo esto se observa en todos los tipos celulares. En tercer lugar, a nivel molecular, un número de procesos bioquímicos desarrolla un papel importante en la inducción de la apoptosis. Sin embargo, la mayoría de ellos no son bien comprendidos, y dan como resultado la activación de proteasas y nucleasas que finalmente destruyen macromoléculas biológicas claves - proteínas y ADN. Para la detección de los modos apoptótico frente a necrótico de la muerte celular, se evaluó la morfología mediante microscopía electrónica de barrido.
Se cultivó una línea celular A549 sobre cubreobjetos de vidrio tratados con cultivo de tejido en placas de cultivo de 6 pocillos con o sin una concentración 2 \muM de I.3 o de ácido betulínico a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 12 horas. Tras la incubación, los cubreobjetos se lavaron en disolución salina tamponada con Hank, y se procesaron como se describe a continuación.
Las células se fijaron en 2% de glutaraldehído/PBS toda la noche a 4ºC, se secaron y se cubrieron con oro a vacío. La superficie de las células se examinó para determinar marcadores morfológicos típicos de la apoptosis bajo un microscopio electrónico de barrido (Tesla, República Checa).
El examen inicial de la microscopía de contraste de fases indicó que las betulininas inducen características morfológicas típicas de apoptosis en células cancerígenas. Esto se confirmó posteriormente mediante microscopía electrónica (Figura 1). Los criterios morfológicos típicos de la apoptosis se identificaron en células tratadas con betulinina 1.3: formación de burbujas citoplasmáticas, fragmentación celular y formación de cuerpos apoptóticos.
11.3. Actividad in vivo de betulinina 1.3
Los sistemas tumorales animales son modelos importantes para determinar la capacidad de un compuesto para ser adsorbido en el torrente sanguíneo, para penetrar en el compartimiento tumoral, y para exterminar fracciones de células tumorales proliferantes o en descanso, a dosis mínimamente tóxicas. Aunque sujetos a crítica, los modelos in vitro/in vivo han identificado todos los agentes quimioterapéuticos eficaces en la práctica clínica actual. Es bien sabido que la mayoría de los compuestos son eficaces en linfomas y leucemias, mientras que algunos han demostrado ser eficaces en tumores sólidos, ilustrando que hay importantes diferencias entre modelos de animales y situaciones clínicas. Los tumores sólidos de diferente origen histogenético se implantan subcutánea o intramuscularmente en animales, los cuales entonces son tratados con un único agente. De este modo, la inhibición del crecimiento del tumor sólido es un parámetro relacionado con la actividad del fármaco. Contrariamente, los tumores primarios de pacientes son controlados mediante cirugía y radiación, junto con poliquimioterapia. Habitualmente, el criterio aceptable para la actividad es una regresión del tumor de >50%. Sin embargo, los fármacos activos en varios sistemas diferentes de detección sistemática serán muy probablemente eficaces en seres humanos; por ejemplo, la doxorrubicina, la ciclofosfamida y el cisplatino tienen un amplio espectro de actividad en modelos de tumores de animales. Además, con respecto a la toxicidad y a la exposición al fármaco total, se ha encontrado una correlación entre los ratones y el hombre para la mayoría de los fármacos antitumorales activos.
Se ha dado a conocer que el ácido betulínico exhibe una prominente actividad en tumores neuroectodérmicos, por ejemplo melanoma, tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET) y neuroblastoma. Éste último es el tumor sólido más letal de la niñez, puesto que se considera que es uno de los tumores más resistentes a fármacos. A la luz de este conocimiento, fue de particular interés la actividad de 1.3 en neuroblastoma humano xenotransplantado, aunque este compuesto demostró una amplia actividad anticancerosa en condiciones in vitro.
Se obtuvo de ATCC una línea celular SK-N-AS de neuroblastoma humano. La línea se cultivó en medio esencial modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Para los fines del transplante, sólo se usaron las células en fase de log.
En este estudio se usaron ratones hembra atímicas CD-1/Ctrl-1 nu/nu, de 8 semanas, que pesan 18-22 g (IffaCredo, Francia). Se inoculó a los animales con 5.10^{6} células tumorales subcutáneamente en la región inguinal derecha. Tras el transplante, se midió el crecimiento tumoral tanto en los grupos del control/vehículo como en los grupos tratados, usando calibradores. El volumen tumoral (TV) se midió según lo siguiente: TV = (a^{2} x b)/2, en la que a es la anchura y b es la longitud. La significación estadística se evaluó usando un ensayo de la t no paramétrico.
En este experimento, se usó como fármaco de control cisplatino (Platidiam 10 inh, sicc., Lachema, República Checa). Se diluyó en agua apirógena, y se aplicó a animales en un volumen final de 0,18 ml subcutáneamente en el día 1.
El compuesto 1.3 se sintetizó como se describe anteriormente. Se suspendió a 10 mg/ml en 5% de dextrosa, y el pH se ajustó a 8,0 con hidróxido sódico.
Vehículo: 5% de dextrosa con pH ajustado a 8,0 con hidróxido sódico.
Los animales se trataron con fármacos/vehículo 24 horas después del transplante. Se crearon los siguientes grupos (con 10 animales por grupo):
control - animales no tratados
vehículo - 0,2 ml de vehículo aplicado a animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10 intraperitonealmente
cisplatino 4 mg/kg - 0,18 ml de disolución de cisplatino aplicada a los animales subcutáneamente en 1 x D 1
1.3 1 mg/ratón s.c. - 0,1 ml de suspensión de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10 subcutáneamente
1.3 2 mg/ratón s.c. - 0,2 ml de suspensión de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10 subcutáneamente
1.3 1 mg/ratón i.p. - 0,1 ml de suspensión de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10 intraperitonealmente
1.3 2 mg/ratón i.p. - 0,2 ml de suspensión de 1.3 aplicado a los animales a 3 x D 1, 2, 5, 6, 9, 10 intraperitonealmente
En la Figura 2 se resumen los resultados del estudio. Se demuestra claramente la actividad anticancerígena de 1.3, puesto que no hay ningún crecimiento tumoral en los animales tratados con 1.3. Fue estadísticamente significativo en todos los grupos a los que se les aplicó 1.3 comenzando a partir de la semana 2 de todo el experimento. El efecto fue independiente de la vía de aplicación (intraperitoneal o subcutánea), y de la dosis en esta aplicación.
Contrariamente a 1.3, el cisplatino fue ineficaz en el tratamiento del neuroblastoma de SK-N-AS, y no mostró ninguna actividad significativa.
La actividad anticancerígena de 1.3, como representante típico de esta generación de betulininas, se demostró en condiciones en vivo. Este nuevo compuesto parece ser muy activo frente a neuroblastoma humano en condiciones in vivo. Junto con su amplia actividad anticancerígena y nuevo mecanismo de acción, previamente no identificado, se cree que los compuestos de la presente invención son de potencial terapéutico para pacientes de cáncer en el futuro.
11.4. La betulinina 1.3 induce la rápida desfosforilación de la proteína de Rb y la apoptosis relacionada con la activación de caspasa
Como se discute al principio, la transición G1/S está fuertemente regulada por la fosforilación de la proteína de retinoblastoma (Rb).
Puesto que la proteína de Rb contiene múltiples sitios de fosforilación para las CDK, su forma fosforilada tiene un peso molecular de alrededor de 110 kDa, mientras que el peso molecular de la proteína hipofosforilada es sólo de 105 kDa. Esta pequeña diferencia en el peso molecular es suficiente para separar a ambas formas mediante electroforesis de SDS-PAGE convencional.
Se cultivaron células CEM en medio esencial modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina, con/sin concentraciones indicadas más abajo de ácido betulínico (BA) o 1.3. En puntos de tiempo seleccionados, las células se cosecharon, se lavaron con disolución salina equilibrada de Hank enfriada en hielo, y se solubilizaron en hielo usando el tampón para muestras de SDS-PAGE que contiene inhibidores de proteasa y de fosfatasa (10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de inhibidor de tripsina de haba de soja, 100 \mumoles de benzamida, 1 mM de vanadato de sodio, 1 mM de NaF, 1 mM de fosfato de fenilo), y se hirvieron inmediatamente.
Las proteínas celulares totales (100 \mug/pocillo) se separaron en electroforesis de SDS-PAGE, se transfirieron sobre membranas de poli(difluoruro de vinilo), y la proteína de Rb total, incluyendo el fragmento o fragmentos proteolíticos, se detectó usando un anticuerpo monoclonal anti-pRb (Oncogene, Germany, Rb(Ab-5), Cat# OP66 Rev 02-sept-96 EB, Clone LM95.1), y se visualizó mediante quimioluminiscencia (Sistema de Transferencia Western ECL, Amersham). Los detalles de la técnica de transferencia Western se describen en Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K (Eds): Short Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, John Wiley & Sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, 1992, página 10-33 - 10-35.
Los resultados de este estudio indican que, en células de leucemia linfoblástica CEM, la proteína de Rb se desfosforila rápidamente tras el tratamiento con 1.3, pero no con ácido betulínico (Figura 3). Esto se demostró por un desplazamiento de la masa de la proteína de Rb desde la forma hiperfosforilada, con una masa molecular de alrededor de 110 kDa, hacia la forma hipofosforilada (105 kDa). El efecto de 1.3 depende del tiempo y de la concentración; a una concentración de 20 \muM, la forma hipocoincidente de Rb aparece tan pronto como 15 minutos después del tratamiento, mientras que a 7 \muM el mismo efecto aparece después de 2 horas. De forma interesante, la ruptura de la proteína de Rb tras la hipofosforilación estuvo acompañada con la desaparición de una Rb de 105 kDa, y la aparición de un fragmento inmunorreactivo de proteína Rb con un peso molecular de alrededor de 42 kDa. Según la bibliografía, la descomposición proteolítica de Rb es un sello típico de apoptosis debido a la activación de caspasas celulares.
Los resultados de este estudio indican claramente que las betulininas de la presente invención, pero no el propio ácido betulínico, son capaces de inducir la rápida desfosforilación de la proteína clave Rb reguladora del ciclo celular. Ésta fue seguida de la inducción de apoptosis, que se ha dado a conocer que activa a caspasas celulares. Las caspasas activadas tienen la capacidad para romper proteínas diana, incluyendo Rb. Esto se ilustra por la aparición, dependiente del tiempo y de la concentración, de un fragmento inmunorreactivo de proteína de Rb con un peso molecular de 42 kDa en células tratadas con 1.3.
11.5. La betulinina 1.3 induce el bloqueo de G1 y la apoptosis en células tumorales
La hipofosforilación de la proteína de Rb está acompañada de un bloqueo del ciclo celular en la transición de G1/S. Para investigar si la incubación de células tumorales con betulininas dará como resultado el bloqueo del ciclo celular y/o la apoptosis, se realizó un estudio de citometría de flujo con medida del contenido de ADN total en células CEM tratadas con/sin 1.3. Como control positivo, se usó Taxol (paclitaxel), puesto que se sabe que este fármaco da como resultado la acumulación de células en la fase G2.
De forma breve, las células CEM se cultivaron en medio esencial modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina, con/sin las concentraciones indicadas de paclitaxel o 1.3 (Figura 4A). A los puntos de tiempo seleccionados, las células se cosecharon, se lavaron en disolución salina equilibrada de Hank (HBSS) enfriada con hielo, y se fijaron en etanol al 70% a -20ºC toda la noche. Al día siguiente, el etanol se eliminó mediante centrifugación, las células se lavaron dos veces en HBSS, y se reconstituyó un pelete celular (10^{6} células) en disolución de tinción (yoduro de propidio 60 \mug/ml, ARNasa libre de ADNasa, 175 U/ml en HBSS) durante 15 minutos a 37ºC. El contenido de ADN de las células individuales se analizó en un citómetro de flujo Excalibur (Becton and Dickinson) a una longitud de onda de excitación de 488 nm.
Como se indica en la Figura 4A,B, el compuesto 1.3 induce la acumulación de células en las fases G0/G1 del ciclo celular, lo que va acompañado de una rápida apoptosis (aparición de células sub-G1). El efecto depende de la concentración y del tiempo. La inducción del bloqueo de G1 y la apoptosis en consistente con la desfosforilación de la proteína de Rb.
11.6. La betulinina 1.3 induce la rápida acetilación de histona
Los estudios de citotoxicidad celular (datos no mostrados) demostraron que la actividad citotóxica de 1.3 se correlaciona enormemente con actinomicina D (p < 0,00001). Puesto que la actinomicina D es un inhibidor de ARN polimerasas bien conocido, estos resultados sugieren que 1.3 selecciona como dianas a complejos transcripcionales.
Como se ha tratado anteriormente, la transición G1/S está fuertemente regulada por la fosforilación de la proteína de retinoblastoma (Rb). La Rb hipofosforilada silencia genes específicos que son activos en la fase S del ciclo celular y que están regulados por factores de transcripción E2F. La Rb se une al dominio activo de E2F, y después reprime activamente al promotor mediante un mecanismo que se comprende muy mal. Los estudios recientes muestran que Rb se asocia con una histona desacetilasa (HDAC 1 y 2) a través del dominio de bolsillo de Rb. Rb recluta histona desacetilasa a E2F, y de este modo Rb coopera con HDAC para reprimir el promotor regulado por E2F del gen. La inhibición de la actividad de histona desacetilasa mediante el inhibidor específico tricostatina A (TSA) inhibe la represión, mediada por Rb, de una actividad transcripcional de E2F.
A fin de proporcionar signos de interferencia de las betulininas con la transcripción, se investigó la capacidad de 1.3 para modificar la acetilación de la histona.
Se cultivaron células CEM en medio esencial modificado de Dulbeco con 4,5 g de dextrosa/l, 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina con/sin las concentraciones indicadas de inhibidor de HDAC TSA o 1.3. En los puntos de tiempo seleccionados, las células se cosecharon, se lavaron en disolución salina equilibrada de Hank enfriada en hielo, y se solubilizaron en hielo usando tampón para muestras de SDS-PAGE que contiene inhibidores de proteasa y de fosfatasa (10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de inhibidor de tripsina de haba de soja, 100 \mumoles de benzamida, 1 mM de vanadato de sodio, 1 mM de NaF, 1 mM de fosfato de fenilo), y se pusieron a hervir inmediatamente.
Las proteínas celulares totales (100 \mug/pocillo) se separaron en electroforesis de SDS-PAGE, se transfirieron sobre membranas de poli(difluoruro de vinilo), y la histona acetilada se detectó usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-acetil(Lys9)-histona H3 (Cell Signalling Technology, Beverly, MA; Cat# 9671L), y se visualizó mediante quimioluminiscencia (sistema de transferencia Western ECL, Amersham). Los detalles de la técnica de transferencia Western se describen en Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K (Eds): Short Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, John Wiley & Sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore, 1992, página 10-33 - 10-35.
Los resultados de este estudio indican que, en células CEM de leucemia linfoblástica, la histona H3 se acetila rápidamente en la posición de Lys9 tras el tratamiento con tanto TSA como con la betulinina 1.3 (Figura 5). El efecto de 1.3 depende del tiempo y de la concentración; a 20 \muM (10 x IC_{50}) la histona acetilada aparece tan pronto como a los 30 minutos después de la incubación. De forma interesante, las células CEM cultivadas con 2 \muM de 1.3 (IC_{50}) muestran acetilación de histona en puntos de tiempo entre 45-120 minutos, lo que es consistente con la semivida de degradación de 1.3 en condiciones in vitro (datos no mostrados). Por otro lado, sin embargo, TSA a 0,24 \muM (IC_{50}) no mostró ninguna capacidad significativa para aumentar la acetilación de la histona, sugiriendo que el mecanismo o mecanismos de actividad citotóxica de TSA pueden ser más complejos de lo que originalmente se pensó.
Los resultados de este estudio indican claramente que las betulininas de la presente invención son capaces de inducir la rápida acetilación de histona. Generalmente se acepta que los términos N de histonas centrales son importantes para los procedimientos que modulan una estructura del nucleosoma. La hiperacetilación de las histonas reduce su capacidad para restringir la ruta de ADN en la cromatina, dando como resultado cambios alostéricos en la conformación nucleosómica, desestabilización de contactos internucleosómicos, y un aumento en la accesibilidad del ADN nucleosómico a factores de transcripción. La cantidad de acetilación de histonas está determinada por un equilibrio entre histona acetiltransferasas (HAT) e histona desacetilasas (HDAC). El balance desempeña un papel importante en la regulación de la transcripción génica, así como en la génesis o supresión del cáncer. Desafortunadamente, sigue abierta la pregunta de si las betulininas inhiben HDAC directa o indirectamente. Como se ha expuesto anteriormente, las betulininas inducen la rápida desfosforilación de la proteína de Rb. Se demostró que la Rb hipofosforilada se une tanto a HDAC como al complejo de E2F-DP1. Se ha dado a conocer recientemente que E2F-1, -2, y -3, pero no E2F-4, -5, y -6, se asocian con y se acetilan mediante acetiltransferasas proteínicas que se unen a elementos de respuesta a cAMP y p300. La acetilación se produce en tres restos de lisina conservados, localizados en el límite N-terminal de sus dominios de unión a ADN. La acetilación de E2F-1 in vitro e in vivo aumenta notablemente su afinidad de unión por un sitio de unión a ADN de E2F de consenso, lo que es paralelo por la transactivación potenciada de un promotor sensible a E2F. La acetilación de E2F-1 se invirtió mediante HDAC1, indicando que la acetilación reversible es un mecanismo para la regulación también de proteínas no histónicas. De este modo, la inhibición de HDAC mediante compuestos sintéticos debe dar como resultado tanto la acetilación de histonas como de factores de transcripción, dando como resultado la activación transcripcional de genes sensibles. De forma interesante, un número de oncosupresores y de genes accionados por promotores víricos son reprimidos transcripcionalmente en células cancerosas/transfectadas/infectadas por virus, debido a la desacetilación constitutiva de promotores específicos. La inhibición de HDAC da como resultado la reactivación de oncosupresores y de genes bajo promotor vírico. Los expertos en la técnica reconocerán que las betulininas se podrían usar no sólo en el tratamiento del cáncer, sino también en el tratamiento de enfermedades o en enfoques terapéuticos, en los que es indeseado la represión transcripcional de un gen o genes específicos, por ejemplo el silenciamiento transcripcional de vectores usados en terapia génica.
De forma notable, puesto que estos fármacos potenciales no muestran ninguna actividad inhibidora de CDK (datos no mostrados), es de esperar que posean un nuevo mecanismo de acción, no dado a conocer previamente.
Los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de averiguar, usando únicamente la experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente invención. Tales equivalentes están destinados a estar comprendidos en las reivindicaciones.

Claims (15)

1. Compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, destinado a ser utilizado en terapia,
13
en la que:
X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHO C(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y R^{8} juntos son CHOCOCH_{2};
R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo C_{1-6};
R^{6} es H, o está ausente si "a" es un doble enlace;
R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOC OR^{1d},
o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
R^{10} es alquilo C_{1-4} sustituido con Hal;
"a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
y en la que
Y = (CH_{2})n
n= 0 a 5;
R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que:
X^{1} es CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, o CHOCOY-Hal; y
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, o COCOCOR^{1d}.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que:
R^{2-5} son todos metilo, y R^{1} es tal como se define a continuación para el grupo correspondiente R^{1a-1d};
X^{1} es
-
CHOCOCH_{2}Cl; o
-
CHOR^{1a} o CHOCOR^{1a}, en el que R^{1a} es H y metilo respectivamente;
X^{3} es C=O, CHOH o CHOAc;
R^{7} es H, COOH, COOMe, CH_{2}OAc, COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e} es alquilo C_{1-4};
R^{8} es
-
COOR^{1d}, en el que R^{1d} es H o metilo;
-
YCOOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es H, metilo o etilo;
-
COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es alquilo C_{1-4};
-
CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4};
-
CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4}.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el que:
R^{8} es
-
COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es metilo o butilo;
-
CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es metilo o etilo;
-
CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es propilo; y
R^{7} es COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e} es metilo o butilo.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que "a" es un enlace sencillo, y R^{6} es H.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto de fórmula I se selecciona de la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
14
15
\newpage
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto se selecciona de entre los siguientes:
16
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, destinado al tratamiento de un trastorno proliferativo.
9. Uso de un compuesto de fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento destinado a ser utilizado en el tratamiento de una enfermedad proliferativa.
10. Compuesto de fórmula Ia, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
17
en la que:
X^{1} es C=O, C=NOR^{1a}, CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal, CHOC(O)OR^{9}, CHOC(O)OR^{1a}, CHOC(O)OR^{10}, y Hal es Br, Cl, I, F;
X^{3} es C=O, CHOR^{1b}, CHOCOR^{1b}, o X^{3} y X^{8} juntos son CHOCOCH_{2};
R^{1-5} son cada uno independientemente H o alquilo C_{1-6};
R^{6} es H, o está ausente si "a" es un enlace doble;
R^{7} es H, COOR^{1c}, YOCOR^{1c}, COOYOCOR^{1e}, YCOOR^{1e};
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, YCOOR^{10}, YCOHal, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}OR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOC OR^{1d},
o R^{7} y R^{8} juntos son =CH_{2} o CH_{2}OCOCH_{2};
R^{9} es un grupo alquilo sustituido con OH, un grupo éter o un éter cíclico;
R^{10} es alquilo C_{1-6} sustituido con Hal;
"a" es un enlace doble o un enlace sencillo;
y en la que
Y = (CH_{2})n
n= 0 a 5;
R^{1a-1d} son grupos iguales o diferentes de R^{1}
con la condición de que
(i) cuando X^{1} es CHOAc, X^{3} es C=O, "a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me, R^{6} es H;
-
cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de COOH, CH_{2}COCOPr^{i}, COCOCOPr^{i}, CH_{2}COOH, o CH_{2}CH_{2}CO^{i} Pr;
-
cuando R^{7} es CO_{2}Me, R^{8} es distinto de CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2};
-
cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOMe, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}COPr^{i}; y
(ii) cuando X^{1} es CHOH, X^{3} es C=O, "a" es un enlace sencillo, R^{1-5} son Me, y R^{6} es H,
-
cuando R^{7} es H, R^{8} es distinto de H, CH_{2}COOH, CH_{2}CH_{2}COCH(CH_{3})_{2} o CH_{2}COOMe;
-
cuando R^{7} es CH_{2}OAc, R^{8} es distinto de CH_{2}COOH;
(iii) cuando X^{1} es CHOAc, R^{1-2} y R^{4-8} son H, R^{3} es Me, y "a" es un enlace sencillo, X^{3} es distinto de C=O;
(iv) cuando X^{1} es CHOAc, R^{1-5} son Me, R^{6} = H, "a" es un enlace sencillo
-
cuando R^{7} y R^{8} juntos forman CH_{2}OCOCH_{2}, X^{3} es distinto de C=O, CHOAc o CHOH;
-
cuando X^{3} y R^{8} juntos forman CHOCOCH_{2}, R^{7} es distinto de CH_{2}OAc;
o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
11. Compuesto según la reivindicación 10, en el que
X^{1} es CHOR^{1a}, CHOCOR^{1a}, CHOCOY-Hal; y
R^{8} es H, COOR^{1d}, YCOOR^{1d}, COOYOCOR^{1d}, CH_{2}COCOR^{1d}, COCOCOR^{1d}.
12. Compuesto según la reivindicación 10 o reivindicación 11, en el que:
R^{2-5} son todos metilo, y R^{1} es tal como se define a continuación para el grupo correspondiente R^{1a-1d};
X^{1} es
-
CHOCOCH_{2}Cl; o
-
CHOR^{1a} o CHOCOR^{1a}, en el que R^{1a} es H y metilo respectivamente;
X^{3} es C=O, CHOH o CHOAc;
R^{7} es H, COOH, COOMe, CH_{2}OAc, COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e} es alquilo C_{1-4};
R^{8} es
-
COOR^{1d}, en el que R^{1d} es H o metilo;
-
YCOOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es H, metilo o etilo;
-
COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es alquilo C_{1-4};
-
CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4};
-
CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es alquilo C_{1-4}.
13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que
R^{8} es
-
COOYOCOR^{1d}, en el que Y es CH_{2} y R^{1d} es metilo o butilo;
-
CH_{2}OR^{1d}, en el que R^{1d} es metilo o etilo;
-
CH_{2}COCOR^{1d} o COCOCOR^{1d}, en el que R^{1d} es propilo; y
R^{7} es COOYOCOR^{1e} o YCOOR^{1e}, en el que Y es CH_{2} y R^{1e} es metilo o butilo.
14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que "a" es un enlace sencillo, y R^{6} es H.
15. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, seleccionado de la siguiente tabla:
18
19
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