ES2945407T3

ES2945407T3 - Péptido sintético termorresistente del veneno de escorpión y aplicaciones del mismo

Info

Publication number: ES2945407T3
Application number: ES16905684T
Authority: ES
Inventors: Jie Zhao; Shao Li; Wanqin Zhang
Original assignee: Wanjin Pharmaceuticals Tech Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wanjin Pharmaceuticals Tech Shanghai Co Ltd
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2023-07-03
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: JP6483858B2; CN106220713B; CA2984569A1; EP3505530B1; US20200002381A1; US10442837B2; EP3505530A1; JP2018529626A; US20180066019A1; CA2984569C; CN106220713A; US10870680B2; EP3505530A4; WO2018028117A1

Abstract

Se describe un péptido sintetizado resistente al calor de veneno de escorpión y usos del mismo. El polipéptido de la presente invención es la secuencia de aminoácidos del péptido resistente al calor del veneno de escorpión (SVHRP) que se encuentra en el veneno de escorpión de Buthus martensii Karsch (BmK), proporciona actividades farmacéuticas para prevenir y tratar la epilepsia refractaria, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. (una demencia de aparición temprana), y tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No: 1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido sintético termorresisente del veneno de escorpión y aplicaciones del mismo

SECTOR DE LA TECNICA

La presente invención pertenece al campo de la investigación y el desarrollo de medicamentos polipeptídicos, y más concretamente se refiere a las aplicaciones de una secuencia de aminoácidos del péptido termorresistente del veneno de escorpión (SVHRP) obtenido a partir del veneno de escorpión de la medicina china Buthus martensii Karsch y su producto sintético, el péptido sintético termorresistente del veneno de escorpión (SVHRSP) en el tratamiento de la epilepsia, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los síntomas clínicos de la enfermedad de Parkinson (EP) surgen debido a una grave reducción del nivel de neurotransmisores dopaminérgicos (DA) estriatales como consecuencia de una lesión neuronal DA de la sustancia negra del mesencéfalo. Se propone la teoría del estrés oxidativo de la EP debido al estrés oxidativo de la DA; la teoría de los radicales libres es un mecanismo importante de la lesión neuronal de la DA de la sustancia negra pars compacta (NC). La terapia antioxidante es un régimen terapéutico eficaz bien conocido en la actualidad.

La medicina china Buthus martensii Karsch (BmK), los estudios médicos modernos han demostrado que el veneno de escorpión (SV) que se libera de la glándula del veneno de la cola del escorpión es rico en toxinas. Estas toxinas pueden dividirse en neurotoxinas y citotoxinas en función de sus mecanismos tóxicos. Las neurotoxinas se dividen en toxinas de escorpión de cadena larga (que contienen entre 60 y 70 residuos de aminoácidos) y toxinas de escorpión de cadena corta (que contienen entre 30 y 40 residuos de aminoácidos). Las toxinas de escorpión de cadena larga se dirigen principalmente a los canales de Na+ dependientes del voltaje de la membrana neuronal excitable, y las toxinas de escorpión de cadena corta pueden actuar sobre canales de Ca2+, canales de K+ o canales de CI-. Las toxinas de escorpión se han utilizado ampliamente en el desarrollo de fármacos y antitoxinas de canales iónicos de la membrana. El escorpión es una medicina tradicional china. Hasta ahora, la China ha separado y purificado toxinas de escorpión con funciones antitumorales, anti dolor, antiepilépticas, antitrombóticas, antiinflamatorias, antirreumáticas y antibacterianas a partir del veneno de escorpión BmK. La toxicidad del veneno de escorpión sólo es superada por la del veneno de serpiente. La patente nacional de invención CN1324621 ha confirmado la eficacia y la seguridad tras el tratamiento tecnológico del veneno, es decir, el veneno de escorpión liberado de la glándula del veneno de la cola de escorpión (la parte medicinal), de la medicina natural de escorpión en la epilepsia refractaria (ER). La solicitud de la patente de invención nacional (solicitud n.° 201310330290.1) divulga la eliminación de los componentes tóxicos termolábiles y termorresistentes del SV de BmK para obtener un extracto de SVHRP más seguro. El polipéptido tiene objetivos de acción comunes y efectos específicos respectivos en la prevención y el tratamiento de la epilepsia refractaria (ER), el Parkinson (EP) y la enfermedad de Alzheimer (EA), como se indica en Wang T. et al. : “Scorpion venom heat-resistant peptide (SVHRP) enhances neurogenesis and neurite outgrowth of immature neurons in adult mice by up-regulating brain-derived neurotrophic factor (BDNF)", PLoS ONE,vol. 9, no. 10, Artículo no. e109977, 9 de octubre de 2014, páginas 1-10, Yin S.-M. et al. : “Neuroprotection by scorpion venom heat resistant peptide in 6-hydroxydopamine rat model of early-stage Parkinson's disease", Acta Physiologica Sinica, vol. 66, n° 6, 25 de diciembre de 2014, páginas 658-666 y Zhang X.-G. et al. : "Scorpion venom heat-resistant peptide protects transgenic Caenorhabditis elegans from 13-amyloid toxicity, Front. Pharmacol., vol. 7,227, 26 de julio de 2016, páginas 1-9.

Pero el extracto de SVHRP tiene una tasa baja de obtención de péptidos y, por lo tanto, la obtención de la SVHRP sintetizada químicamente es un eslabón clave para determinar si este resultado original de investigación y desarrollo puede transformarse y producirse industrialmente.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene por objeto proporcionar una SVHRP químicamente sintética con efecto terapéutico y aplicaciones de la misma. La presente solicitud comprende principalmente: determinar la secuencia de aminoácidos de la SVHRP y llevar a cabo la síntesis química en fase sólida de acuerdo con la secuencia de aminoácidos, así como la detección de la actividad farmacológica y la seguridad de la SVHRP.

La secuencia de aminoácidos del SVHRSP de la presente invención es la siguiente:

SEQID No.1: (N-terminal) Lys-Val-Leu-Asn-Gly-Pro-Glu-Glu-Ala-Ala-Pro-Ala-Glu (C-terminal). El SVHRSP es un polipéptido activo sintético que contiene 15 residuos de aminoácidos y tiene un peso molecular de 1524Oa.

Según el SVHRSP de la presente invención, en primer lugar se obtiene la secuencia de aminoácidos del SVHRP a partir del veneno de escorpión BmK de la medicina tradicional china: comprende principalmente los siguientes pasos: los experimentos con animales demuestran que una muestra (xiedu 20160112-resumen del péptido) tiene efectos significativos de prevención y tratamiento de la epilepsia refractaria, la enfermedad de Parkinson y la demencia senil; en segundo lugar, la muestra se trata con compuesto LaGm y se somete a la separación magnética rápida repetida, y luego se somete a la cromatografía en fase inversa de nanolitros y la espectrometría de masas por ionización de electrospray (nanoLC-ESI-MS) experimento paralelo de espectrometría de masas integrada para detectar la secuencia de aminoácidos de la SVHRP; y finalmente, la SVHRSP se prepara mediante síntesis química en fase sólida, purificación por cromatografía e identificación por espectrometría de masas. La secuencia de aminoácidos de la SVHRSP es la que se muestra en SEQ ID NO.1, y mantiene la actividad farmacológica y la seguridad, así como diversas actividades biológicas de la SVHRP.

Un método para preparar el péptido termorresistente de veneno de escorpión de la presente invención es el siguiente:

1. Determinación de la secuencia de aminoácidos de la SVHRP

(1) el polvo liofilizado de veneno de escorpión BmK se redisuelve y se centrifuga para obtener sobrenadante, y el sobrenadante se calienta a 100°C en baño de agua, luego se extrae y se centrifuga para obtener sobrenadante, es decir, un extracto del componente termorresistente del veneno de escorpión. El extracto del componente termorresistente del veneno de escorpión se somete a ultrafiltración centrífuga con tubos de ultrafiltración centrífuga con ramas filtrantes que tienen pesos moleculares de 50kDa y 30kDa sucesivamente para obtener una solución de baño superior, es decir, un extracto de SVHRP. La muestra se fracciona aproximadamente con una columna de tamiz molecular Superdex Peptide 10/300GL (rango de separación óptimo (péptidos) M 100-7000 Da) (véase la Figura 1), y se fracciona finamente con HPLC (véase la Figura 2), siendo las condiciones cromatográficas las siguientes:

una columna cromatográfica: Zorbax SB-C184,6 * 2505 μm (AgilentUSA); una fase móvil comprende la solución A y la solución B. La solución A contiene acetonitrilo y agua con una relación de volumen de 2:98 y se añadió un 0,1% adicional de ácido trifluoroacético; mientras que la solución B contiene acetonitrilo y agua con una relación de volumen de 98:2 y se añadió un 0,08% adicional de ácido trifluoroacético. El procedimiento de elución se realiza sucesivamente a través de la fase móvil que contiene 0-40% de solución B con una capacidad de aproximadamente 3-6 volúmenes de columna, 40-100% de solución B con una capacidad de aproximadamente 0,5-1 volumen de columna (CV), y 100% de solución B con una capacidad de aproximadamente 1-3 volúmenes de columna; un caudal: 0,8 ml/min; un detector UV con una longitud de onda de detección: 280 nm/258nm/214nm.

(2) la muestra polipeptídica liofilizada se redisuelve en un tampón A para Nano-RPLC; la cromatografía líquida Nano-RPLC en línea se realiza en un sistema Eksigentnano LC-Ultra t M 20 (AB SCIEX). La muestra disuelta se carga en una precolumna C18 (100 μmx3 cm, C18, 3 μm, 150A) a un caudal de 2 μl/min, y se enjuaga y desala a un caudal constante durante 10 minutos. La espectrometría de masas se realiza utilizando un sistema TripleTOF 5600 (AB SCIEX) combinado con una fuente de iones nano-liter spray 111 (AB SCIEX, EE.UU.), Y los archivos de espectros wiff originales recogidos de la espectrometría de masas se someten a procesamiento de datos utilizando Protein Pilot Software v. 4.5 (AB SCIEX, EE.Uu .) para obtener una SVHRP, véase la tabla de secuencias SEQ ID No. 1.

2. Preparación de SVHRSP mediante síntesis química en fase sólida

(1) La tecnología de síntesis polipeptídica se utiliza para obtener moléculas diana de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SVHRP mediante un método de formación direccional de enlaces amido. La síntesis en fase sólida comprende: conectar un carboxilo de un aminoácido de un fármaco a granel en forma de enlace covalente con un portador en fase sólida (resina Fmoc), y a continuación realizar una reacción de acilación en un amino de este aminoácido como punto de partida de la síntesis con un carboxilo de aminoácido (amido-protegido) adyacente al mismo para formar un enlace peptídico. A continuación, se desprotege el amino del péptido de resina que contiene estos dos aminoácidos y se hace reaccionar con el carboxilo del siguiente aminoácido, y se repite el proceso hasta formar el péptido diana.

(2) Purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): un proceso de síntesis polipeptídica puede producir péptidos híbridos (véase la figura 6) similares al péptido objetivo en estructura a un proceso de síntesis polipeptídica, como los diastereómeros producidos debido a la racemización de aminoácidos, el péptido de deleción producido debido a la parte no conectada de aminoácidos y el péptido roto producido debido a la rotura de un enlace peptídico. Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna cromatográfica es lnertsil ODS-SP 4,6 mm * 250 mm, acetonitrilo que contiene 0,1 % de trifluoroacético - agua que contiene 0,1 % de trifluoroacético, y un detector UV que tiene una longitud de onda de detección de 214 nm.

(3) La secuencia de aminoácidos, véase la tabla de secuencias SEQ ID n° 1, del SVHRSP se detecta realizando una verificación estructural y un análisis de recuperación del polipéptido sintético mediante espectrometría de masas.

El efecto del SVHRSP de la presente invención en el aprendizaje y la memoria de ratones con EA se detecta mediante la prueba del laberinto acuático de Morris, y el resultado muestra que el SVHRSP tiene un efecto en la capacidad de aprendizaje espacial y memoria de los ratones con EA. La neurotoxicidad por Ap se mide mediante el ensayo de quimiotaxis de nematodos, y el resultado muestra que el SVHRSP podría proteger a las neuronas contra los efectos tóxicos inducidos por Ap y mejorar el comportamiento anormal de quimiotaxis inducido por la expresión neuronal de Ap. Se observan los efectos preventivos y terapéuticos del SVHRSP en las ratas con epilepsia intratable del modelo pilocarpina, y el resultado experimental muestra que el SVHRSP tiene un efecto de control significativo en los episodios epilépticos de modelo crónico en ratas con epilepsia litio-pilocarpina y el número de episodios puede reducirse significativamente. Los efectos inhibidores del SVHRSP en la corriente de sodio de las neuronas de cultivo primario se observan, y el resultado experimental muestra que el SVHRSP podría inhibir significativamente la corriente del canal de sodio de las neuronas del hipocampo de cultivo primario, y tienen un efecto protector en lesión celular SH-SY5Y inducida por NMDA. Se observan los efectos del SVHRSP en los astrocitos de tipo 11, y el resultado muestra que el SVHRSP podría promover la reprogramación (desdiferenciación) de los astrocitos de tipo 11 en células madre neurales endógenas intracerebrales. La capacidad de SVHRSP para eliminar el oxígeno activo producido dentro de las células SH-SY5Y inducidas por 6-OHDA se detecta mediante la medición de ROS en las células, y el resultado muestra que el SVHRSP puede eliminar significativamente ROS intracelulares y tener un papel inhibidor en el estrés oxidativo PD. La seguridad farmacológica y la relación farmacocinética del SVHRSP es superior al 2000/0,05 = 40.000 veces. La dosis de administración de la inyección intraperitoneal en ratones Kunming alcanza los 2000mg/kgBW y no se observa ninguna reacción tóxica, lo que muestra la perspectiva de aplicación del SVHRSP como un nuevo fármaco antiepiléptico, anti enfermedad de Alzheimer y anti enfermedad de Parkinson.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un cromatograma de cromatografía de filtración en gel de un compuesto peptídico resistente al calor del veneno de escorpión;

La Fig. 2 es un cromatograma RP-HPLC del compuesto péptido termorresistente del veneno de escorpión;

La Fig. 3 muestra el efecto del SVHRSP en la capacidad de aprendizaje y memoria espacial de ratones con enfermedad de Alzheimer (EA) detectada mediante la prueba del laberinto acuático de Morris;

La Fig. 4 muestra la eliminación de ROS inducida por un modelo celular de 6-OHDA PO por el SVHRSP;

La Fig. 5 muestra que el SVHRSP inhibe las descargas epileptiformes de cortes del hipocampo utilizando la técnica de patch-clamp;

La Fig. 6 es un resultado de cromatografía líquida de alto rendimiento inverso (RP-HPLC) de la SVHRSP;

La Fig. 7 es un resultado de la identificación MS del SVHRSP;

La Fig. 8 muestra un efecto inhibidor de la SVHRSP sobre el comportamiento (episodios recurrentes) de ratas de modelo epilepsia por litio-pilocarpina;

La Fig. 9 muestra el efecto del SVHRSP en el comportamiento de quimiotaxis del caenorhabditis elegans CL2355 transgénico AD;

La Fig. 10 muestra el efecto inhibidor del SVHRSP sobre la corriente de sodio de neuronas primarias cultivadas;

La Fig. 11 muestra que el SVHRSP tiene un efecto protector sobre la lesión inducida por NMDA de Células SH-SY5Y; La Fig. 12 muestra que el SVHRSP promueve la reprogramación (desdiferenciación) del tipo 11 astrocitos en células madre neurales in vitro;

La Fig. 13 muestra que el SVHRSP promueve la desdiferenciación de las células OPC en células madre neurales in vitro;

La Fig. 14 muestra que el SVHRSP regula al alza la expresión de la proteína Nestina en células de cultivo des diferenciadas.

DESCRIPCIONES DETALLADAS DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Las siguientes realizaciones ilustran aún más el contenido de la presente invención sin limitarlo.

Realización 1

Determinación de la secuencia de aminoácidos del péptido de veneno del escorpión resistente al calor

(1) El polvo liofilizado de veneno de escorpión BmK de la ciudad de Yichang, provincia de Henan, se disuelve con agua tridestilada y se centrifuga para obtener el sobrenadante, es decir, el extracto de veneno de escorpión BmK. El extracto de veneno de escorpión BmK se introduce en tubos de plástico resistentes al calor con tapas, se pone en un baño de agua homotérmico y se calienta a 100°C, se saca después de 4h, se enfría de forma natural a temperatura ambiente, se centrifuga a alta velocidad para obtener sobrenadante, es decir un extracto de componente termorresistente de veneno de escorpión; el extracto de componente termorresistente de veneno de escorpión se somete a ultrafiltración centrífuga con tubos de ultrafiltración centrífuga con miembros filtrantes con pesos moleculares de corte de 50kDa y 30kDa sucesivamente para obtener una solución de baño superior, es decir, un extracto de polipéptidos termorresistentes del veneno de escorpión. El extracto de polipéptidos termorresistentes del veneno de escorpión se centrifuga para obtener el sobrenadante, es decir, un extracto de componentes termorresistentes del veneno de escorpión. El extracto de polipéptido termorresistente de veneno de escorpión se centrifuga para obtener sobrenadante, es decir, un extracto de componente termorresistente de veneno de escorpión; el extracto de componente termorresistente de veneno de escorpión se somete a ultrafiltración centrífuga con tubos de ultrafiltración centrífuga con miembros filtrantes que tienen pesos moleculares de corte de 50kDa y 30kDa sucesivamente para obtener una solución de baño superior, es decir, un extracto de SVHRP.

El extracto de SVHRP se fracciona aproximadamente con una columna de tamiz molecular Superdex Peptide 10/300GL (intervalo de separación óptimo (péptidos) M, 100-7000 Da) (véase la figura 1 ), y se fracciona finamente con HPLC (véase la figura 2), siendo las condiciones cromatográficas las siguientes: una columna cromatográfica: Zorbax SB-C18 4,6 * 250 5 μm (Agilent.USA); una fase móvil: una solución A: acetonitrilo/agua: 2: 98 (que contiene ácido trifluoroacético al 0,1 % ); una solución B: acetonitrilo/agua: 98: 2 (que contiene ácido trifluoroacético al 0,08 %); 0-40% B siendo aproximadamente 3-6 volúmenes de columna, 40-100% B siendo 0,5-1 volumen de columna, y 100% B siendo 1-3 volúmenes de columna (CV); un caudal:0,8 ml/min; un detector UV, longitudes de onda de detección: 280 nm/258nm/214nm. Por lo tanto, se prepara un extracto de polipéptido termorresistente de veneno de escorpión purificado.

(2) Se toma 1,5 ml de extracto de polipéptido termorresistente de veneno de escorpión purificado y se centrifuga a 10000 rpm durante 10 minutos para obtener el sobrenadante. Se añaden 30mg/mL de compuesto de LaGM al sobrenadante según la proporción que sobrenadante: 30mg/mL de compuesto de LaGM=50:1, se agita suficientemente durante 2min y luego se oscila a 1000r a temperatura ambiente durante 10min. El sobrenadante se elimina por separación magnética después de centrifugarse a 10000r durante 5min, y el precipitado se añade a 500ul de agua, se agita suficientemente durante 1 min, se oscila durante 5min a temperatura ambiente, se centrifuga a 1 0000r durante 5min y luego se somete a separación magnética para eliminar el sobrenadante, y se repiten los pasos dos veces. El precipitado se añade al eluyente de 20ul 80%+1 %TFA, se agita durante 1 min, se oscila durante 5min a temperatura ambiente, se centrifuga a 10000r durante 5min y se somete a separación magnética, luego se recoge el sobrenadante, y estos pasos se repiten una vez; y luego el sobrenadante recogido se liofiliza.

La muestra de polipéptido liofilizado separada del material magnético se disuelve en tampón A de Nano-RPLC, la cromatografía líquida en línea de Nano-RPLC se realiza en un sistema Eksigentnano LC-UltraTM 20 (AB SCIEX), la muestra disuelta se carga en una precolumna C18 (100 μm x 3 cm, C18, 3 μm, 150A) a un caudal de 2 μl/min, y se enjuaga y desala a un caudal constante durante 10 min. La columna analítica es una columna de fase inversa C18 (75 μm x 15 cm C18-3 μm 120 A, ChromXPEksigent), el gradiente de la fase móvil B utilizada en los experimentos se incrementa del 5% al 80% en 70min. La espectrometría de masas se realiza utilizando un sistema TripleTOF 5600 (AB SCIEX) combinado con una fuente de iones nano-liter spray III (AB SCIEX, USA), el voltaje del spray es de 2.4kV, la presión de la cortina de aire es de 30Psi, la presión de atomización es de 5Psi, la temperatura de calentamiento es de 150°C, y el tiempo de barrido del espectro único primario TOF-MS es de 250ms, 35 espectros secundarios con una carga de 2+ a 8+ y un recuento por segundo superior a 100 se recogen en cada ciclo IDA, el tiempo acumulado para cada espectro secundario es de 80 ms. El tiempo de cada ciclo se fija en 2,5 segundos, el ajuste de energía de la cámara de colisión se aplica a todos los iones precursores de disociación inducida por colisión (CID), y la exclusión dinámica se fija en 11 segundos.

(3) Condiciones del análisis de datos

Un archivo de espectro wiff original recogido de la espectrometría de masas se somete a un análisis de procesamiento y recuperación de datos mediante el software Protein Pilot v. 4.5 (AB SCIEX, EE.UU.), en el que se escorifica una base de datos en una biblioteca Uniprot, el método de recuperación implica un análisis minucioso y la tasa de falsos positivos se controla al 1 % FDR. Se prepara el SVHRSP, véase la tabla de secuencias SEQ ID n° 1 para su secuencia de aminoácidos.

Los resultados de la búsqueda figuran en la Tabla 1

Tabla 1. NanoLC-ESI-MS combinada experimentos paralelos MS en los que una secuencia de aminoácidos del SVHRP se detecta.

Lote de muestra n°: xiedu 20160112 resmen de péptidos Txt Microsoft Excel

El extracto de SVHRP se trata con materiales compuestos de LaGM y se somete a repetidas separaciones magnéticas rápidas y, a continuación, se liofiliza. La muestra polipeptídica liofilizada se vuelve a disolver en un tampón A Nano-RPLC, se realiza cromatografía líquida Nano-RPLC en línea en un sistema Eksigentnano LC-UltraTM 20 (AB SCIEX), y se enjuaga y desala a flujo constante durante 10 minutos. La espectrometría de masas se realiza utilizando un sistema TripleTOF 5600 (AB SCIEX) combinado con una fuente de iones nano-liter spray III (AB SCIEX, EE.UU.), y los archivos de espectros wiff originales recogidos de la espectrometría de masas se someten a un análisis de procesamiento y recuperación de datos utilizando Protein Pilot Software v. 4.5 (AB SCIEX, EE.UU.), de tal manera que se detecta la secuencia de aminoácidos del polipéptido resistente al calor del veneno de escorpión.

Realización 2

Purificación del polipéptido de síntesis resistente al calor del veneno de escorpión mediante Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

En el proceso de síntesis de polipéptidos pueden producirse péptidos híbridos similares al péptido objetivo en estructura, como los diastereómeros producidos debido a la racemización de los aminoácidos, el péptido de supresión producido debido a la parte no conectada de aminoácidos y el péptido roto producido debido a la rotura de un enlace peptídico. Por lo tanto, se utiliza RP-HPLC para purificar estos péptidos híbridos.

Condiciones de purificación de las muestras: Estructura: KE-15

Número de serie: 0200046

Lote No: P160418-CQ455216

Columna: 4.6mm*250mm, lnertsil ODS-SP

Solución A: acetonitrilo con 0,1 % de trifluoroacético

Solución B: agua con 0,1 % de trifluoroacético

G

Realización 3

El efecto del SVHRSP en el aprendizaje y la memoria de ratones con EA detectados mediante prueba del laberinto acuático de Morris

El laberinto acuático se utiliza para detectar cambios de comportamiento. Los experimentos de navegación duran 5 días, con 4 entrenamientos al día, durante los cuales se registra el tiempo que tarda el ratón en encontrar una plataforma (la plataforma se coloca en el primer cuadrante), es decir, la latencia de escape, y se deja que los ratones permanezcan en la plataforma durante 20s; si los ratones no encuentran la plataforma en 60s, la latencia de escape se registra como 60s. El experimento de búsqueda espacial se lleva a cabo después de cuatro horas de entrenamiento, el quinto día de la prueba de navegación se retira la plataforma, se colocan los ratones en una piscina en el punto de entrada del tercer cuadrante y se inicia la prueba. Se calcula el porcentaje de una distancia de nado con respecto a un tiempo de nado en el cuadrante objetivo (el primer cuadrante), siendo la duración total de 60 secs. Se detecta el número de ratones que cruzan la plataforma oculta.

La prueba del laberinto acuático de Morris tras el estudio revela que el SVHRSP tiene un efecto promotor sobre la capacidad de aprendizaje espacial y memoria de los ratones con EA. La latencia de escape (en el quinto día, 12 ± 2 veces) de los ratones del grupo de administración del modelo de EA en la fecha de la prueba (en el quinto día) obtenida de la plataforma oculta del laberinto mater es significativamente más corta que la latencia de escape (**p<0,01) de los ratones del grupo modelo de EA (en el quinto día, 22 ± 2 veces). La distancia de nado se reduce de 500 cm en el quinto día del grupo modelo a 300 cm en el grupo de administración. Mediante la plataforma, los tiempos aumentan de 5 veces en el grupo modelo a 8 veces en el grupo de administración.

Realización 4

Método de ensayo de quimiotaxis de nematodos

Se administran diferentes concentraciones de SVHRSP (2, 20, 40μg/ml) y la misma cantidad de agua tridestilada a los nematodos transgénicos sincronizados CL2355 y su cepa de control CL2122, respectivamente, y se les administran los fármacos desde el principio de los huevos, y los nematodos se transfieren a una nueva placa de cultivo NGM con fármacos cada día. Todos los nematodos se incuban a 16°C durante 36 horas, la temperatura de la placa de cultivo se eleva entonces a 23°C y los nematodos se cultivan durante 36 horas secuencialmente. Se recogen los nematodos anteriores y se lavan tres veces con tampón M9. Se utiliza una placa grande de 100 mm como placa de cultivo para la prueba de quimiotaxis. El medio sólido contiene 1,9% de agar, 1 mM de CaCl², 1 mM de MgSCM, y 25 mM de tampón de fosfato, con un pH de 6,0. El medio sólido se mezcla en el microondas, se vierte en la placa y se enfría. En el fondo de la placa de cultivo, se trazan dos líneas rectas perpendiculares entre sí en el centro con un rotulador, quedando la placa dividida en cuatro cuadrantes. Se colocan aproximadamente 60 nematodos de cada grupo en el centro de la placa de cultivo quimiotaxica, y se dejan caer 1 pI de benzaldehído (con una concentración del 0,1 %, diluido con etanol anhidro) y 1 μL de azida sódica 0,25 M en los centros de los cuadrantes 1 y 3, 1 pI de etanol anhidro y 1 pI de azida sódica 0,25 M en los cuadrantes 2 y 4; la distancia desde este punto hasta el punto central debe ser superior a 2 cm. La placa de cultivo de quimiotaxis se transfiere a una incubadora a 23°C y se calcula el índice de quimiotaxis al cabo de una hora. El benzaldehído es una sustancia química con olor de alta concentración, los nematodos se sentirán atraídos por el olor del benzaldehído, se desplazarán a la zona de benzaldehído y se paralizarán in situ tras la exposición a la azida sódica. El índice de quimiotaxis se calcula restando el número de nematodos en los cuadrantes 2 y 4 del número de nematodos en los cuadrantes 1 y 3 (el cuadrante donde se localizan las atracciones) y dividiéndolo por el número total de nematodos.

El SVHRSP puede mejorar la IC de CL2355 dependiendo de la dosis, y 40 μg/ml de SVHRSP tiene un papel extremadamente protector en las neuronas, y revierte casi por completo la lesión quimiotáxica inducida por la expresión de Ap. El resultado de la prueba cambia del grupo de control (39,45 ± 6,2) al grupo de administración (7 ± 5,66), según la comparación de los dos grupos, p <0,01, lo que indicaba que el SVHRSP podía proteger a las neuronas contra los efectos tóxicos inducidos por Ap y mejorar la anomalía de quimiotaxis inducida por la expresión neuronal de Ap, véase la Tabla 2.

Tabla 2 Resultados de la quimiotaxis de nematodos

Realización 5

Efectos del SVHRSP en el estrés oxidativo de SH-SY5Y inducido por 6-0HDA

Se utiliza la sonda fluorescente DCFH-DA para detectar el efecto de SVHRSP sobre el estrés oxidativo de SH-SY5Y inducido por 6-OHDA. Los experimentos se dividen en un grupo de control normal, un grupo de control positivo en ROSup, un grupo modelo 6-OHDA y grupos con diferentes concentraciones (2μg/ml, 5μg/Ml, 10μg/ml, 20μg/ml) de fármaco SVHRSP. Se seleccionan las células SH-SY5H en fase de crecimiento exponencial, se lavan con PBS esterilizado después de desechar la solución de cultivo y se añade tripsina al 0,25% para digerirlas y soplarlas en células individuales. Las células se cuentan con una placa de recuento celular, se inoculan en una placa de 96 pocillos a 1,5 x 104 células/ml, y se cultivan en una incubadora de 5% de CO₂y 37°C durante 24 h después de hundir las células en el fondo de la placa. Después el grupo de fármaco de 20 μg/ml SVHRSP se añade para que intervenga durante 1 h, a continuación se añade6-OHDA y se incuba continuamente en una incubadora de 5% de CO₂y 37 ° C durante 24 h. ROSup se diluye con el medio de cultivo a la ratio de 1: 500, 100 μl de medio de cultivo se añade a cada pocillo. Después de 27 minutos de cultivo, DCFH-DA se diluye con medio de cultivo libre de suero en una proporción de 1: 2000 hasta una concentración final de 5 pmol/L, y el medio de cultivo se desecha, 50p1 de la solución diluida de DCFH-DA se añade en cada pocillo, la solución diluida se agita suavemente de manera uniforme, y se cultiva en una incubadora de 5% CO₂y 37°C durante 20min. Se desecha el sobrenadante y el producto cultivado se lava tres veces con PBS. La detección de fluorescencia se realiza a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm en una microplaca lectora de fluorescencia. Se miden y comparan los valores OD.

La capacidad del SVHRSP para eliminar el oxígeno activo producido dentro de las células SH-SY5Y inducida por 6-OHDA se detecta mediante la medición de ROS en las células. A las células se les administra SVHRSP (20μg/ml) a pre-tratados durante 1 h, y se lesionan con 6-OHDA (100μM) por 24 h, la expresión de ROS en las células se detecta mediante un lector de microplacas de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm. Los resultados experimentales muestran que 6-OHDA puede aumentar significativamente la ROS en las células, con significación estadística (control 1 ± 0,2 vs6-OHDA 3,4 ± 0,4 p <0,01 ), pero cuando se añade el SVHRSP, ROS en las células puede ser eliminado de manera significativa, y la significación estadística (control 3,4 ± 0,4 vs 1.5 ± 0,4 p <0,05) también se puede lograr.

Realización 6

Efectos preventivos y terapéuticos del veneno de escorpión resistente al calor

Péptido Sintético (SVHRSP) en Ratas con Epilepsia Refractaria Modelo Pilocarpina

(1) Selección y grupos de animales que se seleccionan, ratas macho sanas de SD de 180g. Se utiliza litiopilocarpina ip (administración intraperitoneal) 300mg/kg para inducir episodios de epilepsia del lóbulo temporal.

Tras 15 días de episodio epiléptico agudo, las ratas epilépticas se dividen aleatoriamente en un grupo modelo y un grupo de administración modelo. A los animales del grupo modelo de epilepsia se les administra una inyección intraperitoneal de solución salina normal durante 15 días consecutivos. A continuación, las ratas del grupo de administración del modelo de epilepsia se dividen en tres grupos de modelo de administración, a los que se administra 50μg/kg/día de extracto de SVHRP por vía ip, 50μg/kg/día de SVHRSP por vía ip y valproato sódico como fármaco de control positivo: es decir, modelo de epilepsia pilocarpina NS; modelo de epilepsia litio-pilocarpina SVHRP; modelo de epilepsia litio-pilocarpina SVHRSP; modelo de epilepsia litio-pilocarpina valproato sódico. Los niveles de epilepsia se observan y registran, y se gradúan según Racine como criterio de evaluación.

Tabla 3 Niveles de episodios de epilepsia

Análisis de resultados:

(1) El SVHRSP tiene un efecto de control significativo en el episodio de epilepsia en el modelo crónica de ratas epilépticas de litio-pilocarpina y puede reducir significativamente el número de episodios.

(2) El SVHRSP es superior al grupo de ácido valproico como grupo de control positivo en la reducción del nivel de episodios y del número de episodios del modelo crónico de epilepsia de ratas con litio-pilocarpina.

Realización 7

Efecto inhibidor del péptido sintético resistente al calor del veneno de escorpión (SVHRSP) en la corriente de sodio de neuronas primarias cultivadas

(1) Cultivo de neuronas hipocampales primarias. Se esteriliza una rata SD en las 24 horas siguientes a su nacimiento con alcohol al 75%, se separan las cabezas en el hielo y los hipocampos de ambos lados se despojan rápida y completamente bajo el microscopio de disección, se dividen en tres trozos de 1 mm3 de volumen en solución de disección, se colocan en una solución digestiva de tripsina con una concentración final del 0,125% y se digieren en una incubadora a 37°C, 10% de C02 durante 30min. Los tejidos digeridos se extraen, se colocan en un líquido de implantación para detener la digestión y, a continuación, se someten a soplado mecánico, suspensión y filtrado por tamiz para preparar una suspensión celular con una densidad de 1 x 105 /ml. La suspensión celular se inocula en un plato de cultivo previamente recubierto con polilisina (0,1 mg/ml) y se incuba en un incubador a 37°C y 10% de C02 El segundo día, el líquido de implantación se sustituye completamente por solución de cultivo. El 4° día, se añade citarabina (3μg/ml) a la solución de cultivo para inhibir la proliferación excesiva de células no neuronales. Cada 3 días se sustituye el 50% de la solución de cultivo. Las neuronas del hipocampo cultivadas in vitro se convierten en neuronas maduras entre el 9° y el 12° día. Las neuronas cultivadas después de 10 días se emplean en este experimento.

(2) Registro con patch-clamp de células enteras. Las neuronas primarias del hipocampo cultivadas se someten a un registro de patch clamp de células enteras después de 10 días de cultivo. El microelectrodo de vidrio de registro tiene un diámetro exterior de 1,5 mm, un diámetro interior de 0,6-0,8 mm y una longitud de 8 cm, y se dibuja con un instrumento de dibujo de microelectrodos PP-830 mediante un dibujo vertical en dos pasos. El electrodo estirado tiene un diámetro de aproximadamente 1 μm, y tiene una impedancia de electrodo de 3-5MΩ después de llenarlo con fluido interno de electrodo. El electrodo de referencia es un electrodo Ag-AgCI. El electrodo de registro con patch-clamp de células enteras y una membrana celular forman un sello estable de alta impedancia entre ellos, luego se someten a una compensación de capacitancia rápida (C-fast), se aplican ligeramente con una presión negativa para romper la membrana y formar una configuración de célula completa y luego se someten a una compensación de capacitancia lenta (C-slow) a una tasa de compensación de capacitancia lenta del 80% -85%. La corriente de fuga se sustrae por sustracción de fuga. El estado de activación actual se observa a un voltaje de estímulo establecido. Un instrumento para el registro con patch clamp de células enteras se establece tal que los parámetros experimentales, la adquisición de datos y la aplicación de estímulo del amplificador de patch clamp de doble canal EPC-10 son controlados por el software Pulse, siendo la frecuencia de un filtro de Bessel 1: 0KHz, y la frecuencia de un filtro de Bessel 2: 2,9KHz. Durante el transcurso del experimento, todos los fármacos se administran mediante un dispositivo de perfusión BPS-8, en el que el diámetro de cada tubo de un banco de tubos es de 0,2 mm, y la distancia entre el orificio del tubo y la célula registrada es de aproximadamente 100 μm. Se realiza un registro de patch-clamp en el sistema de neuronas de cultivo primario para obtener la corriente del canal de sodio, y se comparan las corrientes antes y después de la adición del SVHRSP de la misma célula.

Se registran con patch-clamp las células enteras, se comparan las corrientes de la misma célula antes y después de la adición del SVHRSP, y los resultados muestran que 2μg/ml de SVHRSP pueden inhibir significativamente la corriente del canal de sodio de las neuronas primarias del hipocampo cultivadas, y la tasa de inhibición es superior al 90% (N = 6) (p <0,0001). La corriente puede restablecerse después de enjuagarse con el líquido extracelular.

Realización 8

Las células SH-SY5Y derivan de líneas celulares del neuroblastoma humano. Modelo NMDA: NMDA 20 mM Gly 10μM. El proceso experimental es el siguiente: antes del experimento, se realiza la agrupación según los fines experimentales. SH-SY5Y se inocula en una placa de 96 pocillos (0,8 x 104/pocillo), después de 24 h se añade el SVHRSP y el péptido preincubado durante 24 h. A continuación, se añade NMDA 20 mM Gly 10 μM según los grupos y se incuba durante 24 h. Se utilizan kits MTT para detectar la viabilidad de varias células (véase la figura 11). Los resultados muestran que el SVHRSP tiene un efecto protector sobre la lesión inducida por NMDA de las células SH-SY5Y, donde la concentración de SVHRP es de 2 μg/ml, 20 μg/ml; la concentración de SVHRSP es de 2 μg/ml, 20 μg/ml; NMDA: 20 mM Gly 10 μM, p<0,05 (n = 3).

Realización 9

Formación de células madre neurales pluripotentes con proliferación y capacidad de diferenciación de los astrocitos de tipo II por desdiferenciación

Operaciones experimentales: la corteza cerebral de una rata SD de 24 horas desde el nacimiento se aísla asépticamente y se prepara en una suspensión celular, el cultivo primario de células gliales mixtas se lleva a cabo en una solución de cultivo DMEM que contiene un 10% de suero bovino fetal. Después de 7-9 días de cultivo, el producto se trata primero con clorhidrato éster metílico de L-leucina durante 1 h, y la solución de cultivo se sustituye por una nueva solución de cultivo celular estéril, después el producto tratado se hace oscilar en un agitador a temperatura constante de 37°C a 18r/min durante 18 horas, después se toma el sobrenadante y se filtra a través de un tamiz de malla 200, el sobrenadante filtrado se inocula en una placa de 6 pocillos tratada con polilisina para obtener OPC relativamente purificada. Las células se hunden de forma natural en la incubadora, se observa si las células están adheridas a la pared después de 2 horas. Después de que las células se adhieren a la pared, se desecha el sobrenadante y se sustituye por fluido inductor de astrocitos tipo II (20% DMEM), y se cultivan durante 4-5 días secuencialmente, pudiéndose obtener entonces astrocitos de tipo II relativamente purificados. Al cabo de 5 días, los astrocitos de tipo II se digieren y se inoculan en una placa de 6 pocillos de adherencia ultrabaja, se sustituye la solución de cultivo por una solución de cultivo de células madre que se cultiva durante 12 días de forma continua, y se observan las esferas de células madre. Transcurridos 12 días, se aspiran los esferoides celulares de la placa de 6 pocillos de adhesión ultrabaja y se inoculan en una placa de 24 pocillos con un portaobjetos de células tratadas con polilisina. Tras 24 h, se extrae el portaobjetos y se fija con paraformaldehído al 4%, se realiza la tinción de inmunofluorescencia y se utiliza Nestina (verde) para determinar si las esferas celulares son células madre. La Nestina es un marcador de especificidad de las células madre neurales, que puede utilizarse para marcar las células madre neurales formadas por la reprogramación de los astrocitos de tipo II efectuada por el SVHRSP.

Realización 10

Ensayo de toxicidad del péptido sintético termorresistente del veneno de escorpión (SVHRSP)

1) Principales indicadores de observación:

(1) Dosis máxima de tolerancia (DMT), es decir, la dosis más alta no letal, es decir, la dosis más alta que no causa la muerte de los animales sometidos a ensayo;

(2) Dosis letal mínima (DLM): dosis que causa la muerte en animales individuales sometidos a ensayo;

(3) La dosis más alta de reacción no tóxica (dosis no tóxica más alta): es decir, el nivel sin efecto adverso observado (MOAEL), es decir, la dosis más alta por debajo de la cual no se detectan lesiones en los animales en un periodo de tiempo determinado; 4

(4) Dosis mínima de reacción tóxica: dosis mínima de reacción tóxica en animales: es decir, la dosis más baja de reacción tóxica en animales cuyas respuestas tóxicas se acaban de provocar.

2) Notas:

(1) Animales de ensayo: Ratones Kunming, mitad machos y mitad hembras (adultos sanos, peso 19-20g);

(2) Objetos: SVHRSP:

a. fuente: Extracto de veneno de escorpión BmK adquirido en Henan Yichang.Fábrica de escorpiones Xinxin (2012 05-28);

b. Lote No: P160418-CQ455216;

c. Contenido (o especificación):10 mg/pieza;

d. Condiciones de conservación y métodos de preparación: -20°C para conservación a largo plazo, 4°C para conservación en 7-10 días, y redisolución con agua Millipore cuando se vaya a utilizar.

(3) Vía de administración: respectivamente la vía ip (inyección intraperitoneal) (el mayor volumen utilizado habitualmente en la administración por vía ip a ratones es de 0,1-1,0ml/20gBW) las dosis óptimas de administración a los animales (las dosis son diferentes, pero la capacidad de administración es idéntica) se seleccionan según la vía de administración, y en este experimento se adoptan 0,2ml/20gBW para las vías de administración ip.

(4) Selección de los métodos empleados

Según el método de la dosis letal aproximada, listado de las secuencias posibles:

La posible dosis máxima de tolerancia y la posible dosis mínima letal del SVHRSP se estiman según los resultados de la prueba de toxicidad aguda del antiguo polipéptido termorresistente del veneno de escorpión en ratones de Kunming. A continuación, se diseña una tabla de secuencias de dosis con varias dosis según el método incremental del 50%:

Dosis máxima de tolerancia, DMT: 76,8; 51,2; 34,1 mg/kg

Dosis letal mínima, DLM: 115,2; 76,8; 51,2 mg/kg

Los posibles intervalos de dosis letales (115,2; 76,8; 51,2; 34,1 mg/kg) se obtienen a partir de la lista de secuencias de dosis estimadas, en la que cada dosis se administra a un animal, se miden la dosis letal mínima y la dosis máxima tolerada y, a continuación, se administra a un animal la dosis comprendida entre ambas. Si el animal sometido a esta dosis no muere, el intervalo entre esta dosis y la dosis letal mínima es el intervalo de dosis letal aproximado; si el animal sometido a esta dosis muere, el intervalo entre esta dosis y la dosis máxima tolerada es el intervalo de dosis letal aproximado.

Tabla 4: Detección de seguridad del SVHRSP por vía de inyección intraperitoneal

Los resultados muestran que la relación entre la seguridad medicinal y la actividad farmacodinámica del SVHRSP de la presente invención son superiores a 2000/0,05 = 40.000 veces. La dosis de administración a ratones Kunming por vía de inyección intraperitoneal es de hasta 2000mg / kg.BW y no se observa ninguna reacción tóxica. La dosis máxima no tóxica (dosis más elevada no tóxica) no se ha alcanzado todavía: es decir, no se ha observado ningún nivel de efecto adverso

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido sintético resistente al calor del veneno de escorpión (SVHRSP) que consiste en el aminoácido secuencia de SEQ ID No. 1.

2. El péptido sintético termorresistente de veneno de escorpión según la reivindicación 1 para su uso en la preparación de medicamentos contra la epilepsia, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson