CN1171595C - 获取无毒有效蝎毒的生产工艺及由该工艺制备的治疗癫痫的药物 - Google Patents

Abstract

本发明及一种获取无毒有效蝎毒的生产工艺：①采集蝎毒(SV)；②加蒸馏水后，分离，取上清液；③加热上清液，加热温度为100摄氏度，加热时间至少为2.5小时，加热方式为煮沸，即将盛装上清液的容器置于沸水中，武火煮沸，制得无毒SV水提液；④将上述无毒SV水提液与药物辅料制成片剂或胶囊。本发明提供了一种获取安全且具有新的医疗用途的蝎毒制剂的工艺，该药对各种兴奋性神经毒引起的脑损伤均有治疗作用，包括癫痫、帕金森病、脑血管病以及老年性痴呆等。

Description

获取无毒有效蝎毒的生产工艺及由该工艺制备的治疗癫痫的药物

本发明涉及一种获取无毒有效蝎毒的生产工艺，属于生命科学，医药技术领域，特别是用于癫痫、帕金森病等神经性疾病的防治。

东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch.BmK)具有镇静息风的功能，对惊厥、抽搐有显著疗效。蝎毒(Scorpion venom.SV)是蝎尾节毒腺排放的毒液，是蝎子捕食御敌的武器。医学研究证明，全蝎的功用在于蝎尾，即SV。SV具有多种治疗作用，但严重的神经毒作用使其开发和应用受到极大的限制，因此寻找消除SV毒性而又保持其治疗活性的方法是目前的当务之急。用凝胶过滤及离子交换树脂等手段进行分离、纯化，回收率仅为0.305％，因此从1988年至今未见用此技术路线进行开发应用的报道。有人用上述类似技术将SV分离、纯化后拟用于肿瘤的治疗，但由于其毒副作用仍然存在，至今未见开发成功。新药的安全性是其开发应用的最关键前提。

我们以往的工作证实，通过口服途径给药可大幅度降低SV的毒性。SV半数致死量(LD₅₀)的测定结果表明，小鼠口服或经腹腔注射途径给药，其LD₅₀分别为5.48g/kg体重和6.80mg/kg。尽管经口服途径给药的毒性作用已大大降低，但毒性成份仍在其中。

本发明的目的在于提供一种获取无毒有效蝎毒的生产工艺，即是在口服前将SV的毒性降到尽可能低的程度。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

似往(包括我们自己)SV工艺的每个环节都严格注意低温，包括采集到的SV液，必须经冷冻干燥后，避光4摄氏度保存。本发明用高温(100摄氏度)处理SV1.0小时，其神经毒作用开始明显降低。2.5小时以上，可消除其毒性，但仍能保存抗癫痫作用的生物活性。而且，随高温处理时间的延长，SV中具有抗癫痫作用的组份所占百分比增加。

本发明的生产工艺如下：

1、采集蝎毒(SV)；

2、加蒸馏水后，分离，取上清液；

3、加热上清液，加热温度为100摄氏度，加热时间至少为2.5小时，加热方式为煮沸，即将盛装上清液的容器置于沸水中，武火煮沸，制得无毒SV水提液；

4、将上述无毒SV水提液(原料药)与药物辅料制成片剂或胶囊。

本发明提供了一种获取安全且具有新的医疗用途的蝎毒制剂的工艺(国内外均未见报导)，该药对各种兴奋性神经毒引起的脑损伤均有治疗作用，包括癫痫、帕金森病、脑血管病以及老年性痴呆等。

图1为SV的毒性取决于加热(100摄氏度)时间数据图表。

图2为SV的毒性取决于加热的温度和方式数据图表。

图3为SV及其有效组分对抗PTZ作用(发作例数)数据图表。

图4为SV及其有效组分对抗PTZ作用(发作严重程度)数据图表。

图5为一次口服SV对PTZ模型的治疗作用数据图表。

图6为一次口服SV对PTZ模型的治疗作用(程度/时间关系)数据图表。

图7为癫痫大鼠SV处置3周后疗效观察数据图表。

图8、图9为本发明组分分析及功能组分的确定示意图。

图10为KA诱导癫痫反复发作及SV的治疗机制方框图。

图11为SV对再次阈下剂量KA诱发癫痫发作潜伏期的影响示意图。

图12为SV对再次阈下剂量KA诱发癫痫发作持续时间的影响示意图。

图13为SV对再次阈下剂量KA诱发癫痫发作严重程度的影响示意图。

图14为SV对再次阈下剂量KA诱发癫痫发作次数的影响示意图。

下面结合实施例及附图详细描述本发明：

实施例：

用电刺激法从东亚钳蝎(Bmk)蝎尾采集蝎毒(SV)，加等量蒸馏水后，4000×g离心5分钟，取上清。将不同浓度的SV按同等容积分装并置入同样规格的耐热离心管中。将上述各管放置在沸水中，然后在武火煮沸的沸水中分别放置0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4小时。结束后再次400×g离心5分钟，取上清。对经上述方法处理后的SV-进行毒力测定，并与不同加热温度(40摄氏度、60摄氏度、80摄氏度)和100摄氏度烤箱烘烤4小时、8小时的处理组进行对照。结果表明，SV的毒性取决于加热的温度及其时间和方式(见图1和图2)。然后，将上述无毒SV水提液(原料药)与辅料β环虎精可压性淀粉制成斯威片(或胶囊)。

如图1所示，SV的毒性取决于加热(100摄氏度)时间，动物为昆明种小鼠。

(1)本实验中SV的剂量为0.3mg/20gBW/0.4ml，给药途径为腹腔注射(是依据上述LD₅₀测定中引起100％死亡的最小剂量，即15.4m-g/kg，i.p)。结果表明，100摄氏度2.5小时、3小时、3.5小时和4小时均可使SV的毒力明显降低。

(2)增加引起致死的剂量(倍比增加剂量，一直增加到上述剂量的320-倍)，100摄氏度处理2.5小时，结果发现3只小鼠全部存活。

(3)抗癫痫活性见(本发明的医药用途部分)

如图2所示，SV的毒力取决于加热的温度和方式。

上述毒力测定结果表明，SV生产工艺过程中，无需低温冷冻干燥。SV经100摄氏度煮沸处理1小时毒力开始降低，2.5小时其毒力开始降到最低。因为：

(1)用未经处理的可引起100％死亡的SV剂量，经上述处理后用于动物(15.4mg/kg，BW，i.p)不引起动物死亡。

(2)用比未经处理的引起100％死亡剂量高320倍的SV仍不引起死亡。

本发明组分分析及功能组分的确定：

(1)组分分析及确定功能组分：经FPLC(AKTATMexplore)快速纯化工艺开拓系统，结合30％SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据同时分离的蛋白质分子量标准迁移率，显示该药为多组分多肽(图8、图9)。

(2)主要有效组分分析：采用戊唑小鼠小发作模型，确定SV的抗癫痫的主要有效组分是FPLC分离的第一峰。

本发明的医药用途：

用现代药理学研究方法，即采用多种世界公认的癫痫动物模型，证实SV镇静息风作用的行为特点及其脑机理。

(1)戊四唑癫痫模型

A、戊四唑(PTZ)最小发作阈及SV的对抗作用。

a、最小发作阈测定：设定不同戊四唑剂量组，以给药后30min内陈挛性发作(震摇至双前肢阵挛性发作)3ses以上为终指标，求得最小发作阈剂量为52mg/kgB.W s.c。

b、SV对抗作用，如图3和图4所示。

B、SV对PTZ大鼠模型的治疗作用，如图5和图6所示，图6中^*与对照组比较P＜0.01。

(2)抗马桑内酯小鼠癫痫大发作作用及ED50

应用马桑内脂(3.76mg/kg)腹腔注射诱发小鼠癫痫大发作。观察不同剂量SV口服对发作的治疗作用，并计算ED50。

ED50＝1g-1[Xm-i(∑p-0.5)]

    ＝1g-1(2.3010-0.0969×1.2)

    ＝153.0030(mg/kg)

已知LD50＝5480mg/kg

治疗指数＝LD50/ED50＝35.82

(3)根治癫痫反复发作药理学研究(特殊功效)

癫痫症(Epilpsy)其病因复杂，临床表现多样，但反复出现癫痫发作(简称反复发作)是其共同的最显著的临床特征，这是癫痫顽固难治的主要原因，也是病人最大的痛苦所在。

目前全世界有5千万癫痫病人，我国癫痫患病率为3.3‰-5.8‰，半数以上在10岁以内起病，有20％-30％癫痫病人发展为难治癫痫(即长期甚至终身服药仍不能控制反复出现的癫痫发作)，而且有37％癫痫病人伴有精神障碍。癫痫及其并发症依然严重困扰着患者、家庭与社会。以往国内外大量工作集中在关于癫痫发作机理研究，这是由于缺乏具有长期反复发作特征的动物模型。本研究除采用上述急性癫痫发作模型外，进一步采用一个理想的具有反复发作特征的动物模型，即颞叶癫痫红藻氨酸(KA)模型，筛选并证实SV早期用药(急性癫痫发作后，反复发作形成前)可防止反复发作的形成，晚期用药(反复发作形成后)，对已形成的反复发作有明显的治疗作用，并且能够改变脑内已出现的神经病理、神经生化等变化，如图10所示。

第一部分实验：SV早期用药疗效观察如图7所示，图7中^*与实验对照组比较P＜0.05。

结果还显示，与实验对照组比较，SV治疗后，癫痫发作严重程度明显降低(ρ＜0.01)；发作潜伏期明显延长(＜0.05)。

第二部分实验：SV晚期服用疗效观察如图10-14所示。

对已形成的癫痫发作的敏感性有明显的治疗作用(两次实验共用90只SD大鼠)。结果证实，实验给药组动物当再次受到癫痫刺激(阈下剂量KA)诱发癫痫发作时，其发作潜伏期明显延长(P＜0.05)；发作持续时间明显缩短(P＜0.01)；发作严重程度明显降低(P＜0.01)；发作次数明显减少(P＜0.01)。

Claims (2)

1、一种获取无毒有效蝎毒的生产工艺，其特征在于：

①、采集蝎毒；

②、加蒸馏水后，分离，取上清液；

③、加热上清液，加热温度为100摄氏度，加热时间为2.5-4小时，加热方式为煮沸，即将盛装上清液的容器置于沸水中，武火煮沸，制得无毒蝎毒水提液；

④、将上述无毒蝎毒水提液与药物辅料制成片剂或胶囊。

2、治疗癫痫的药物，含有如权利要求1生产工艺制备的无毒有效蝎毒和制药可接受的载体。

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