ES2941700T3 - Microorganismo mutante recombinante que tiene capacidad de producción de ácido malónico y método para producir ácido malónico usando el mismo - Google Patents

Microorganismo mutante recombinante que tiene capacidad de producción de ácido malónico y método para producir ácido malónico usando el mismo Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a un microorganismo mutante recombinante que tiene capacidad de producción de ácido malónico, y a un método para producir ácido malónico usando el mismo y, más particularmente, a un microorganismo mutante que tiene capacidad de producción de ácido malónico, resultante de la introducción de una semialdehído deshidrogenasa que codifica gen en un microorganismo capaz de producir semialdehído malónico, y un método para producir ácido malónico usando el mismo. Expresando biológicamente una enzima que tiene actividad semialdehído deshidrogenasa, el microorganismo mutante según la presente invención es útil para producir eficazmente ácido malónico a partir de beta alanina o diversas fuentes de carbono, utilizando semialdehído malónico como intermedio. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismo mutante recombinante que tiene capacidad de producción de ácido malónico y método para producir ácido malónico usando el mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un microorganismo mutante recombinante que tiene la capacidad de producir ácido malónico y a un método para producir ácido malónico usando el mismo y, más particularmente, a un microorganismo mutante que tiene la capacidad de producir ácido malónico, en donde se introduce un gen que codifica semialdehído deshidrogenasa en un microorganismo que tiene la capacidad de producir semialdehído malónico y a un método para producir ácido malónico usando el mismo.
Antecedentes de la técnica
El ácido malónico, un ácido dicarboxílico C3, es una sustancia química que se usa en la producción de diversos aromas, fragancias y productos farmacéuticos. El ácido malónico tiene una alta demanda, pero los métodos químicos convencionales para producir ácido malónico tienen limitaciones debido a los altos costes y los procesos de producción peligrosos para el medio ambiente. Los métodos conocidos para producir ácido malónico a través de rutas biológicas incluyen un método para producir ácido malónico a partir de malonil-CoA por actividad de malonil-CoA hidrolasa (documento WO 2013134424).
NAKAMURA K ET AL:"Studies of malonic semialdehyde dehydrogenase from Pseudomonas aeruginosa", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, ELSEVIER, NL, vol. 50, n.° 1, 10 de junio de 1961, (1961-06-10), páginas 147­ 152 desvela una semialdehído malónico deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de nucleótidos de difosfopiridina de semialdehído malónico a malonato.
Sin embargo, se sabe que la ruta del malonil-CoA tiene una menor eficiencia de producción de metabolitos que la ruta del aspartato (Vinod Kumar et al., Biotechnology Advances 31:945-961, 2013; Valdehuesa et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 97:3309-3321, 2013). Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un método para producir ácido malónico de una manera más eficiente que los métodos de producción química convencionales y un método que emplee malonil-CoA.
Por tanto, se ha intentado desarrollar un método para producir ácido malónico usando semialdehído malónico, que puede producirse fácilmente en las células, como un precursor por la actividad semialdehído malónico deshidrogenasa.
En consecuencia, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar un método de producción más eficiente de ácido malónico a través de una ruta biológica y, como resultado, han producido un microorganismo recombinante que expresa semialdehído malónico deshidrogenasa y beta alanina piruvato transaminasa y, adicionalmente, expresa aspartato-a-descarboxilasa, y han descubierto que el uso del microorganismo recombinante producido hace posible producir de manera eficiente ácido malónico a partir de una fuente de carbono, completando de esta manera la presente invención.
Divulgación de la invención
Problema técnico
Es un objeto de la presente invención proporcionar un microorganismo mutante que produzca ácido malónico usando semialdehído malónico como un precursor por la actividad semialdehído malónico deshidrogenasa.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir ácido malónico usando el microorganismo mutante que utiliza una ruta de semialdehído malónico como una ruta principal de producción de ácido malónico.
Solución técnica
Para conseguir el objeto anterior, la presente invención proporciona un microorganismo mutante como se define en la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas se reflejan en las reivindicaciones dependientes.
La presente invención también proporciona un método para producir ácido malónico a partir de azúcar como se define en la reivindicación 10.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra la conversión de semialdehído malónico en ácido malónico por semialdehído deshidrogenasa.
La FIG. 2 muestra esquemáticamente la construcción de una ruta metabólica y una cepa, que produce ácido malónico a partir de glucosa a través de beta alanina y semialdehído malónico.
La FIG. 3 muestra un plásmido recombinante construido insertando los genes panD, aspA y ppc para sobreproducir beta alanina.
La FIG. 4 muestra un plásmido recombinante p100-99A pa4123pa0132 construido insertando el gen pa4123 y el gen pa0132 para producir ácido malónico a partir de beta alanina.
La FIG. 5 muestra un plásmido recombinante p100-99A ynelpa0132 construido insertando el gen ynel y el gen pa0132 para producir ácido malónico a partir de beta alanina.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende generalmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los métodos experimentales, que se describirán a continuación, son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
En la presente invención, se desarrolló un método para convertir semialdehído malónico en ácido malónico mediante el uso de semialdehído deshidrogenasa. En un ejemplo específico de la presente invención, una cepa productora de beta-alanina previamente desarrollada (Song et al., Metab, Eng., 30:121-129, 2015) se usó y se desarrolló un método que produce ácido malónico mediante la producción de semialdehído malónico a través de la expresión de beta alanina piruvato transaminasa en la cepa y, adicionalmente, se desarrolló la expresión de semialdehído deshidrogenasa en la cepa.
En la presente invención, se preparó un microorganismo mutante que tiene la capacidad de producir ácido malónico a partir de semialdehído malónico mediante la semialdehído deshidrogenasa en el cual se sobreexpresa la semialdehído deshidrogenasa representada por la semialdehído malónico deshidrogenasa, la semialdehído succínico deshidrogenasa o la glutarato semialdehído deshidrogenasa.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención se dirige a un microorganismo mutante que tiene la capacidad de producir ácido malónico, en donde se introduce un gen que codifica semialdehído deshidrogenasa en un microorganismo que tiene la capacidad de producir semialdehído malónico.
En la presente invención, la semialdehído deshidrogenasa puede seleccionarse del grupo que consiste en semialdehído malónico deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa y glutarato semialdehído deshidrogenasa, Preferentemente, la semialdehído deshidrogenasa es semialdehído succínico deshidrogenasa, pero no se limita a la misma.
En la presente invención, el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa puede ser pa4123 (SEQ ID NO: 10) o ynel (SEQ ID NO: 12) y es preferentemente una enzima que codifica un gen que tiene una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 90 % con PA4132 (SEQ iD NO: 11) o Ynel (SEQ ID NO: 13). Además, el gen pa4123 de la presente invención puede derivar de P. aeruginosa y el gen ynel de la presente invención puede derivar de E. coli.
En la presente invención, para hacer posible la producción de ácido malónico a partir de una fuente de carbono, se usó una cepa parental desarrollada previamente que tiene la capacidad de producir beta alanina (FIG. 2) y se estableció un sistema que puede producir ácido malónico a partir de una fuente de carbono al sobreexpresar beta alanina piruvato transaminasa y, adicionalmente, sobreexpresar semialdehído deshidrogenasa para producir semialdehído malónico a partir de beta alanina.
En la presente invención, preferentemente, se introducen adicionalmente uno o más seleccionados del grupo que consiste en un gen que codifica beta alanina piruvato transaminasa, un gen que codifica aspartato-a-descarboxilasa, un gen que codifica aspartasa y un gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa, pero no se limita a las mismas.
En la presente invención, los métodos para aumentar la actividad de la semialdehído deshidrogenasa incluyen reemplazar un promotor nativo de un gen de interés en un genoma con un promotor más fuerte trc, tac, T7, lac, trp o similares, y transformar una cepa después de clonar un gen que codifica una semialdehído deshidrogenasa en un vector de expresión.
En la presente invención, preferentemente, el gen que codifica aspartato-a-descarboxilasa, el gen que codifica aspartasa y el gen que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa se introducen en un vector de expresión que contiene un promotor trc, pero no se limitan al mismo.
En la presente invención, el gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa puede ser pa0132.
En la presente invención, el gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa puede ser panD, el gen que codifica la aspartasa puede ser aspA y el gen que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa puede ser ppc.
En la presente invención, preferentemente, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ptsG (sistema fosfotransferasa), fumC (fumarasa C), fumA (fumarasa A), fumB (fumarasa B), icIR (represor del operón acetato) y lacl (represor del operón lac) se eliminan adicionalmente, pero no se limita a los mismos.
En la presente invención, el microorganismo que tiene la capacidad de producir semialdehído malónico se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos. Preferentemente, las bacterias pueden seleccionarse del grupo que consiste en Zymomonas sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Corynebacterium sp., Ralstonia sp., Klebsiella sp., Saccaromyces sp., Pichia sp., Salmonella sp., Kluyveromyces sp., Clostridium sp., Candida sp., Shigella sp., Burkholderia sp. y Oligotropha sp. y pueden seleccionarse más preferentemente del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Klebsiella pneumonia y E. coli.
En un ejemplo de la presente invención, un sistema productor de beta-alanina previamente desarrollado (Song et al, Metab, Eng., 30:121-129, 2015) se usó como una cepa parental para producir un microorganismo mutante que puede producir ácido malónico a partir de una fuente de carbono mediante semialdehído malónico como un intermedio. Se construyó una cepa que puede producir ácido malónico a través de la sobreexpresión del gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa pa0132 (SEQ ID NO: 14) de Pseudomonas aeruginosa y el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa pa4123 (SEQ ID NO: 10) de Pseudomonas aeruginosa. Además, se construyó una cepa de producción de ácido malónico más eficiente al sobreexpresar ynel (SEQ ID NO: 12) de E. coli, que se conoce como un gen que codifica la semialdehído succínico deshidrogenasa en lugar de pa4123.
En otro aspecto, la presente invención se dirige a un microorganismo mutante que tiene la capacidad de producir ácido malónico, en donde un gen que codifica la beta-alanina-piruvato transaminasa y un gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa se introducen en un microorganismo que tiene la capacidad de producir beta-alanina.
En la presente invención, preferentemente, el gen que codifica la beta-alanina-piruvato transaminasa y el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa se introducen en un vector de expresión que contiene un promotor p100 sintético (SEQ ID NO: 9), pero no se limitan a los mismos.
En la presente invención, el gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa puede ser pa0132 (SEQ ID NO: 14) y el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa puede ser pa4123 o ynel.
En la presente invención, preferentemente, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en un gen panD (aspartato-a-descarboxilasa), un gen aspA (aspartasa A) y un gen ppc (fosfoenol piruvato carboxilasa) se introducen adicionalmente y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ptsG (sistema fosfotransferasa), fumC (fumarasa C), fumA (fumarasa A), fumB (fumarasa B), icIR (represor del operón acetato) y lacl (represor del operón lac) se eliminan adicionalmente, pero no se limita a los mismos.
En aún otro aspecto, la presente invención se dirige a un microorganismo mutante que tiene la capacidad de producir ácido malónico, en donde un gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa, un gen que codifica la beta-alaninapiruvato transaminasa y un gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa se introducen en un microorganismo que tiene la capacidad de producir aspartato.
En la presente invención, el gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa puede ser panD, el gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa puede ser pa0132 y el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa puede ser pa4123 o ynel.
En la presente invención, preferentemente, un gen aspA o un gen ppc puede introducirse adicionalmente y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ptsG, fumC, fumA, fumB, icIR y lacl pueden eliminarse adicionalmente, pero el alcance de la presente invención no se limita a los mismos.
En la presente invención, el microorganismo que tiene la capacidad de producir beta-alanina o aspartato puede seleccionarse del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos. Preferentemente, las bacterias pueden seleccionarse del grupo que consiste en Zymomonas sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Corynebacterium sp., Ralstonia sp., Klebsiella sp., Saccharomyces sp., Pichia sp., Salmonella sp., Kluyveromyces sp., Clostridium sp., Candida sp., Shigella sp., Burkholderia sp. y Oligotropha sp. y pueden seleccionarse más preferentemente del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Klebsiella pneumonia y E. coli.
En otro aspecto más, la presente invención se dirige a un método para producir ácido malónico a partir de azúcar, comprendiendo el método las etapas de: cultivar el microorganismo mutante descrito anteriormente en un medio que contiene una fuente de carbono, produciendo de esta manera ácido malónico; y recuperar el ácido malónico producido.
En la presente invención, la fuente de carbono puede seleccionarse del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos y polisacáridos, incluyendo glucosa, sacarosa, galactosa, maltosa, xilosa, glicerol, fructosa y caña de azúcar.
En un ejemplo de la presente invención, solo se ilustraba un determinado medio y un determinado método de cultivo. Sin embargo, como se informa en la bibliografía (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111,2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41,2001), el uso de líquido de sacarificación tales como suero de leche o CSL (licor de maceración de maíz) y otros medios, o el uso de varios métodos de cultivo tales como cultivo por lotes alimentado o cultivo continuo, también será obvio para un experto habitual en la materia.
En un ejemplo de la presente invención, pudo verse que el ácido malónico no se produjo en la cepa W3110 de E. coli de tipo silvestre y productora de beta-alanina (Song et al., Metab. Eng., 30:121-129, 2015).
Pudo observarse que cuando un vector de expresión p100-99A pa4123pa0132 que expresa el gen codificante de la beta-alanina-piruvato transaminasa pa0132 de Pseudomonas aeruginosa y el gen codificante de la semialdehído deshidrogenasa pa4123 de Pseudomonas aeruginosa se introdujeron en E. coli W3110 de tipo silvestre, que después se cultivó en un medio suplementado con 8 g/l de beta-alanina, se produjeron 25 mg/l de ácido malónico.
A partir del resultado anterior, pudo verse que el ácido malónico podría producirse a partir de beta alanina a través de la sobreexpresión de la beta alanina piruvato transaminasa y la semialdehído deshidrogenasa, que son bien conocidas. Además, pudo verse que cuando se introdujo un vector de expresión p100-99A ynelpa0132 que expresa un gen ynel codificante de la semialdehído succínico deshidrogenasa de E. coli en lugar del gen pa4123 codificante de la semialdehído deshidrogenasa en E. coli W3110 de tipo silvestre, que después se cultivó en el medio, se produjeron 60 m/l de ácido malónico.
A partir de este resultado, pudo verse que cuando el vector de expresión p100-99A ynelpa0132 se introdujo en una cepa original que tenía la capacidad de producir beta-alanina y la cepa se cultivó en un medio suplementado con glucosa, podrían producirse 200 mg/l de ácido malónico a partir de glucosa.
Como se usa en el presente documento, el término "eliminar" pretende incluir mutar, reemplazar (o sustituir) o eliminar parte o la totalidad del gen de interés, de tal manera que el gen no se exprese o no muestre actividad enzimática aunque se exprese, bloqueando de esta manera la ruta biosintética en la que está implicado el gen.
Como se usa en el presente documento, el término "sobreexpresión" se refiere a la expresión del gen de interés en las células a niveles superiores al nivel de expresión del gen en condiciones normales y pretende incluir el aumento de los niveles de expresión reemplazando el promotor de un gen en el genoma con un promotor fuerte o clonando el gen de interés en un vector de expresión y transformando las células con el vector de expresión.
Como se usa en el presente documento, el término "vector" significa una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN unida operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedador adecuado. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez incorporado en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma hospedador o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" a veces se usan indistintamente, ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la presente invención pretende incluir otros tipos de vectores con la misma función que los conocidos o que serían conocidos en la técnica. Los vectores de expresión típicos para la expresión en cultivos de células de mamíferos se basan en, por ejemplo, pRK5 (documento EP 307.247), pSV16B (documento WO91/08291) y pVL1392 (Pharmingen).
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de ADN esencial para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control incluyen un promotor para realizar la transcripción, una secuencia operadora aleatoria para controlar dicha transcripción, una secuencia para codificar un sitio de unión al ribosoma (RBS por sus siglas en inglés) de ARNm adecuada y una secuencia para controlar la terminación de la transcripción y la traducción. Por ejemplo, una secuencia de control adecuada para una célula procariota incluye un promotor, una secuencia operadora aleatoria y un RBS de ARNm. Una secuencia de control adecuada para una célula eucariota incluye un promotor, una señal de poliadenilación y un potenciador.
El promotor es el factor más crítico que afecta a la expresión génica en un plásmido. Por tanto, puede usarse un promotor de alta expresión tales como el promotor SRa o el promotor derivado de citomegalovirus.
Para expresar la secuencia de ADN de la presente invención, cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de la expresión puede usarse en el vector. Los ejemplos de secuencias de control de expresión útiles incluyen los promotores temprano y tardío de SV40 o adenovirus, así como el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, los promotores T3 y T7, las regiones operadoras y promotoras principales del fago lambda, las regiones de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa, por ejemplo, Pho5, los promotores del sistema de apareamiento a de levadura y otras secuencias con configuraciones o derivaciones conocidas para controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. El promotor de la polimerasa de ARN T7010 puede usarse de manera efectiva para expresar la proteína NSP en E. coli.
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. La secuencia de nucleótidos puede ser un gen y una secuencia o secuencias de control enlazadas para ser capaces de expresar el gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteína activadora de la transcripción) se unen a una secuencia o secuencias de control. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretor se une operativamente al polipéptido que codifica el ADN cuando se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante cuando afecta a la transcripción de la secuencia; y una RBS está unida operativamente a una secuencia de codificación cuando afecta a la transcripción de la secuencia o a una secuencia de codificación cuando se dispone para facilitar la traducción. Generalmente, la expresión "unido operativamente" significa que las secuencias unidas al ADN son contiguas y, en el caso del líder secretor, son contiguas y están presentes en un marco de lectura. Sin embargo, un potenciador no es necesariamente contiguo. El enlace entre estas secuencias se realiza mediante ligación en un sitio de enzima de restricción conveniente. Sin embargo, cuando el sitio no existe, se usa un adaptador de oligonucleótido sintético o un enlazador de acuerdo con un método convencional.
La expresión "vector de expresión" como se usa en el presente documento generalmente significa un fragmento de ADN bicatenario que funciona como un vehículo recombinante en el cual se inserta un fragmento de ADN heterólogo. En este caso, el ADN heterólogo significa un ADN heterotipo, que no se encuentra de forma natural en una célula hospedadora. El vector de expresión puede autorreplicarse independientemente del ADN cromosómico hospedador una vez en una célula hospedadora y puede producir varias copias del vector y del ADN (heterólogo) insertado en el mismo.
Como es bien sabido en la técnica, para aumentar el nivel de expresión de un gen transfectado en una célula hospedadora, un gen correspondiente debe estar unido operativamente a las secuencias de control de la expresión de transcripción y de la traducción que se operan en un hospedador de expresión seleccionado. Preferentemente, las secuencias de control de expresión y el gen correspondiente se incluyen en un vector de expresión junto con un marcador de selección bacteriano y un origen de replicación. Cuando el hospedador de expresión es una célula eucariota, el vector de expresión debe incluir además un marcador de expresión útil en una célula de expresión eucariota.
La célula hospedadora transformada o transfectada por el vector de expresión mencionado anteriormente constituye otro aspecto de la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "transformación" significa que el ADN puede replicarse como un factor fuera del cromosoma o por medio de la finalización del cromosoma completo mediante la introducción del ADN como hospedador. Como se usa en el presente documento, el término "transfección" significa que una célula hospedadora acepta un vector de expresión independientemente de si realmente se expresa o no alguna secuencia codificante.
Las células hospedadoras que se usan en la presente invención pueden ser células procariotas o células eucariotas. Además, generalmente se usa un hospedador, en el cual se introduce ADN con gran eficacia y en el cual el ADN introducido se expresa con alta eficiencia. Los ejemplos de células hospedadoras que pueden usarse en la presente invención incluyen hospedadores procariotas y eucariotas conocidos tales como E. coli, Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., hongos o levaduras, células de insectos tales como Spodoptera fruglperda (SF9), células animales tales como CHO y células de ratón, células de mono verde africano tales como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 y BMT 10 y células humanas cultivadas en tejido. En la presente invención, cuando se va a clonar el ADNc que codifica la proteína NSP, se usan preferentemente células animales como un hospedador. Cuando se usan células COS, un plásmido con origen de replicación SV40 puede estar presente como múltiples copias de un episoma en las células y puede expresarse a niveles más altos que un nivel convencional, porque la célula COS expresa el antígeno T grande de SV40. La secuencia de ADN introducida puede obtenerse de la misma especie que las células hospedadoras, o puede ser de especies diferentes de las células hospedadoras, o puede ser una secuencia de ADN híbrida que comprende cualquier ADN heterogéneo u homólogo.
Por supuesto, debe entenderse que todos los vectores y secuencias de control de la expresión no funcionan por igual para expresar secuencias de ADN de acuerdo con la presente invención. De modo similar, todos los hospedadores no funcionan por igual con respecto al mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia puede seleccionar apropiadamente entre diversos vectores, secuencias de control de expresión y hospedadores sin apartarse del alcance de la presente invención ni soportar una carga experimental excesiva. Por ejemplo, debe seleccionarse un vector considerando una célula hospedadora, porque el vector debe replicarse en la célula hospedadora. Específicamente, el número de copias del vector, la capacidad de regular el número de copias y la expresión de otra proteína codificada por el vector correspondiente (por ejemplo, la expresión de un marcador antibiótico) también deben considerarse. También, puede seleccionarse una secuencia de control de la expresión teniendo en cuenta varios factores. Por ejemplo, la fuerza relativa, la capacidad de control y la compatibilidad con la secuencia de ADN de la presente invención de la secuencia deben deliberarse particularmente con respecto a posibles estructuras secundarias. Además, la selección de una célula hospedadora puede hacerse teniendo en cuenta la compatibilidad con un vector seleccionado, la toxicidad de un producto codificado por una secuencia de ADN, la naturaleza secretora del producto, la capacidad para plegar correctamente un polipéptido, los requisitos de fermentación o cultivo, la capacidad para asegurar una fácil purificación de un producto codificado por una secuencia de ADN, o similares. Dentro del alcance de estos parámetros, un experto en la materia puede seleccionar diversos vectores/secuencias de control de la expresión/combinaciones de hospedadores que pueden expresar las secuencias de ADN de la invención en cultivo animal a gran escala o en fermentación. Al clonar el ADNc de una proteína NSP mediante la estrategia de clonación por expresión, pueden usarse procedimientos de selección tales como un método de unión, un método de selección y un método de emulsión de película.
En la definición de la presente invención, la expresión "sustancialmente puro" significa que un polipéptido de acuerdo con la presente invención y las secuencias de ADN que codifican el polipéptido sustancialmente no contienen ninguna otra proteína derivada de bacterias.
Como células hospedadoras para la expresión de proteínas recombinantes, las células procariotas, tales como E. coli y Bacillus subtilis, que pueden cultivarse a una alta concentración en poco tiempo, que se modifican genéticamente de forma fácil y que tienen propiedades genéticas y fisiológicas bien establecidas, se han usado ampliamente. Sin embargo, para resolver diversos problemas, incluyendo modificación postraduccional, secreción, estructura activa tridimensional y activación de proteínas, una amplia gama desde microorganismos hasta organismos superiores, incluyendo células eucariotas unicelulares, levaduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, etc.), hongos filamentosos, células de insecto, células vegetales y células de mamíferos, se han usado recientemente como células hospedadoras para la producción de proteínas recombinantes. Por lo tanto, será obvio para un experto en la materia usar no solamente células de E. coli ilustradas en los Ejemplos, sino también otras células hospedadoras.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en más detalle con referencia a los ejemplos. Será obvio para un experto habitual en la materia que estos ejemplos solo tienen fines ilustrativos y no han de interpretarse limitantes del alcance de la presente invención.
En particular, E. coli W3110 se usó como un microorganismo hospedador en los siguientes ejemplos. Sin embargo, será obvio para los expertos en la materia que otras cepas de E. coli, bacterias, levaduras u hongos también pueden usarse. Además, en los siguientes ejemplos, sólo los genes de cepas específicas se ilustraron como los genes a introducir; sin embargo, será obvio para los expertos en la materia que los genes que se van a introducir no están limitados siempre que se expresen en una célula hospedadora en la que se introduzcan y muestren la misma actividad que los genes ilustrados.
Ejemplo 1: Construcción del vector
1-1: Vector pTac15k PTAP para producir beta-alanina a partir de una fuente de carbono
Usando el ADN cromosómico de E. coli W3100 como un molde, se realizó PCR con cebadores de las siguientes SEQ ID NO: 1 y 2, construyendo de esta manera un fragmento del gen ppc que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa.
[SEQ ID NO: 1] ppc F
5'-agacagcctgcaggttagccggtattacgcatacctg-3'
[SEQ ID NO: 2] ppc R
5'-AGACAGCCTGCAGGACAGGAAACAGACCATGAACGAACAATATTCCGC-3'.
A continuación, el fragmento ppc construido se trató con la enzima de restricción Sbfl y el plásmido pTac15k PTA (Song et al., Metab. Eng., 30:121-129, 2015), que expresa un gen panD que codifica una aspartato-a-descarboxilasa derivado de una cepa de Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) y un gen aspA que codifica una aspartasa derivado de E. coli W3110, se trató con la enzima de restricción Sbfl. En lo sucesivo, el fragmento ppc y el pTac15k PTA se ligaron entre sí mediante la ADN ligasa de T4, construyendo de esta manera el plásmido recombinante pTac15k PTAP.
1-2: Vectores p100-99A pa4123pa0132 y p100-99A ynelpa0132 para producir ácido malónico a partir de beta-alanina
Usando el ADN cromosómico de una cepa PA01 de Pseudomonas aeruginosa como un molde, se realizó PCR con cebadores de las siguientes SEQ ID NO: 3 y 4, construyendo de esta manera un fragmento génico pa0132 que codifica la beta-alanina-piruvato transaminasa. De modo similar, usando el ADN cromosómico de una cepa PA01 de Pseudomonas aeruginosa como un molde, se realizó PCR con cebadores de las siguientes SEQ ID NO: 5 y 6, construyendo de esta manera un fragmento génico pa4123 que codifica la semialdehído deshidrogenasa. Además, usando el ADN cromosómico de una cepa W3110 de E. coli como un molde, se realizó PCR con cebadores de las siguientes SEQ ID NO: 7 y 8, construyendo de esta manera un fragmento génico ynel que codifica la semialdehído succínico deshidrogenasa:
[SEQ ID NO: 3] pa0132 F
5'-AGACAGTCTAGAGAAAGCCCGAGGATCGAACGA-3'
[SEQ ID NO: 4] pa0132 R
5'-AGACAGCCTGCAGGTCAGGCGATGCCGTTGAGC-3'
[SEQ ID NO: 5] pa4123 F
5 ' -
AGACAGGAGCTCACAGGAAACAGACCATGATCAAACACTGGATCAATGGCC-3'
[SEQ ID NO: 6] pa4123 R
5'-AGACAGTCTAGACTACACGCCCCAGCGGGGG-3'
[SEQ ID NO: 7] ynel F
5 ' -
AGACAGGAGCTCACAGGAAACAGACCATGACCATTACTCCGGCAACTCATG-3'
[SEQ ID NO: 8] yneI R
5'-AGACAGTCTAGATCAGATCCGGTCTTTCCACACCG-3'.
A continuación, el fragmento pa0132 construido se trató con las enzimas de restricción Xbal y Sbfl para ligarlo a un plásmido p100-99A que regula la expresión génica mediante un promotor p100 (SEQ ID NO. 9: ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc). En lo sucesivo, basándose en este vector, los fragmentos pa4123 e ynel se trataron con sacl y Xbal y se ligaron al vector mediante ADN ligasa de T4, construyendo de esta manera los plásmidos recombinantes p100-99A pa4123pa0132 y p100-99A ynelpa0132.
Ejemplo 2: Medición de la capacidad de producción de ácido malónico del microorganismo muíante recombinante
2-1: Microorganismo mutante que produce ácido malónico a partir de beta-alanina
El plásmido p100-99A pa4123pa0132 o p100-99A ynelpa0132 construido en el Ejemplo 1-2 se introdujo en una cepa W3110 de E. coli, que después se cultivó en un medio suplementado con 8 g/l de beta-alanina y se analizó la producción de ácido malónico en la cepa (Tabla 1).
Se seleccionó un microorganismo mutante recombinante que tenía capacidad de producir ácido malónico como resultado de introducir en él el vector para producir ácido malónico a partir de beta-alanina en un medio de placa LB suplementado con 30 ug/ml de kanamicina y 30 ug/ml de ampicilina. El microorganismo transformado se inoculó en 10 ml de medio LB y se precultivó a 37 °C durante 12 horas y después se inocularon 3 ml del precultivo y se cultivaron en 50 ml de medio MR modificado en un matraz de 350 ml.
La composición del medio MR modificado (pH 6,5) estaba compuesta por, por litro de agua destilada, 15 g de glucosa, 9 g de (NH4)2SO4 , 6,67 g de KH2PO4, 4,0 g de (n H4)2HPO4, 3,0 g de extracto de levadura, 2,0 g de NaHCO3 , 0,8 g de ácido cítrico, 0,8 g de MgSO47H2O, 0,01 g de CaCb2H2O y 5 ml de una solución de metales traza (compuesta por, por litro de agua destilada, 10 g de FeSO4 -7H2O, 2,2 g de ZnSO4 -4H2O, 0,58 g de ZnSO4 -4H2O, 1,0 g de CuSO4 -5H2O, 0,1 g de (NH4)6Mo7O244 H2O y 0,02 g de Na2B4Oz 10H2O). El cultivo se realizó en una incubadora con agitación a 220 rpm a 37 °C durante 24 horas. Después de la finalización del cultivo, el cultivo se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se recogió y se analizó por cromatografía líquida para medir la producción de ácido malónico.
Como resultado, como se muestra en la Tabla 1 a continuación, pudo verse que E. coli W3110 de tipo silvestre no produjo ácido malónico y los microorganismos transformados introducidos con el plásmido p100-99A pa4123pa0132 o p100-99A ynelpa0132 produjeron ácido malónico en cantidades de 25 mg/l y 60 mg/l, respectivamente, por adición de beta-alanina.
Tab - a
Figure imgf000008_0001

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo mutante que tiene la capacidad de producir ácido malónico, en donde se introduce un gen que codifica semialdehído deshidrogenasa en un microorganismo que tiene la capacidad de producir semialdehído malónico, en donde el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa es pa4123 de acuerdo con SEQ ID NO: 10 o ynel de acuerdo con SEQ ID NO: 12 y dicho microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos.
2. El microorganismo mutante de la reivindicación 1, en donde uno o más seleccionados del grupo que consiste en un gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa, un gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa, un gen que codifica la aspartasa y un gen que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa se introducen adicionalmente, en donde el gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa es pa0132 de acuerdo con SEQ ID NO: 14; o en donde el gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa es panD; o en donde el gen que codifica la aspartasa es aspA; o en donde el gen que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa es ppc.
3. El microorganismo mutante de la reivindicación 2, en donde el gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa, el gen que codifica la aspartasa y el gen que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa se introducen en un vector de expresión que contiene un promotor trc.
4. El microorganismo mutante de la reivindicación 1, en donde uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ptsG, fumC, fumA, fumB, icIR y lacl se eliminan adicionalmente.
5. El microorganismo mutante de la reivindicación 1, en donde se introduce adicionalmente un gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa, en donde el gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa es pa0132 de acuerdo con SEQ ID NO: 14.
6. El microorganismo mutante de la reivindicación 5, en donde el gen que codifica la beta alanina piruvato transaminasa y el gen que codifica la semialdehído deshidrogenasa se introducen en un vector de expresión que contiene un promotor p100 sintético de acuerdo con SEQ ID NO: 9.
7. El microorganismo mutante de la reivindicación 6, en donde uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en un gen panD, un gen aspA y un gen ppc se introducen adicionalmente y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ptsG, fumC, fumA, fumB, icIR y lacl se eliminan adicionalmente.
8. El microorganismo mutante de la reivindicación 5, en donde se introduce adicionalmente un gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa, en donde el gen que codifica la aspartato-a-descarboxilasa es panD.
9. El microorganismo mutante de la reivindicación 8, en donde un gen aspA o un gen ppc se introducen adicionalmente y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ptsG, fumC, fumA, fumB, icIR y lacl se eliminan adicionalmente.
10. Un método para producir ácido malónico a partir de azúcar, comprendiendo el método las etapas de: producir ácido malónico cultivando el microorganismo mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio que contiene una fuente de carbono; y recuperar el ácido malónico producido, en donde preferentemente la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en glucosa, sacarosa, galactosa, maltosa, xilosa, glicerol, fructosa, caña de azúcar y beta alanina.
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