ES2940488T3 - Nuevo macrólido anfótero de polieno epoxidado y procedimiento para purificar natamicina - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un proceso para purificar natamicina, a un macrólido anfótero de polieno epóxido, a una composición que comprende dicho macrólido anfótero de polieno ya un proceso para preparar dicho macrólido anfótero de polieno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevo macrólido anfótero de polieno epoxidado y procedimiento para purificar natamicina
Campo de la invención
La presente invención se dirige a un procedimiento para purificar natamicina, a un macrólido anfótero de polieno epoxidado, a una composición que comprende dicho macrólido anfótero de polieno y a un procedimiento para preparar dicho macrólido anfótero de polieno.
Antecedentes de la invención
La natamicina (fórmula estructural (I), pimaricina, C33H47NO13, número CAS 7681-93-8, ácido (1 R,3S,5R,7R,8E,12r ,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25ft,26S)-22-[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-man-nopiranosil)oxi]-1,3,26-trihidroxi-12-metil-10-oxo-6,11,28-trioxatriciclo[22.3.1.057]octacosa-8,14,16,18,20-pentaeno-25-carboxílico) es un antifúngico de macrólido anfótero de polieno epoxidado totalmente trans usado para tratar infecciones fúngicas alrededor del ojo. Esto incluye infecciones de los párpados, la conjuntiva y la córnea. La natamicina también se usa en la industria alimentaria como un conservante para productos lácteos como queso, y también como un conservante para productos cárnicos como salchichas y para fruta.
El acceso a moléculas producidas naturalmente con alta pureza es de importancia clave por múltiples razones tales como la optimización de la eficacia atómica, la minimización de residuos y la evitación de efectos secundarios no deseados por contaminantes. Especialmente para aplicaciones farmacéuticas, el listón sobre la pureza es alto y la natamicina no es una excepción a esta norma.
La natamicina se produce mediante fermentación de la bacteria Streptomyces natalensis después de que el producto se obtenga habitualmente en forma de cristales laminares. Uno de los problemas asociados con la natamicina está relacionado con su baja solubilidad en ambiente acuoso y el hecho resultante de que las formulaciones acuosas están en forma de suspensiones. En su forma original, los cristales de natamicina sedimentan rápidamente, lo que hace a las suspensiones de natamicina poco prácticas para el usuario y difíciles de distribuir uniformemente. El documento WO 2006/045831 describe la recristalización en ambiente acuoso al disolver a pH bien bajo o bien alto seguido por reajuste del pH hasta neutro para dar pequeños cristales aciculares. El último procedimiento de recristalización es muy adecuado para aplicación a escala industrial y resuelve el problema de la sedimentación rápida no deseada de suspensiones de natamicina en virtud de la morfología de los cristales.
Además, o alternativamente, en teoría pueden conseguirse mejoras con respecto a la pureza mediante técnicas cromatográficas. Desgraciadamente, según se indica anteriormente, el principal problema en la purificación cromatográfica (preparativa) es la baja solubilidad de la natamicina en ambiente acuoso. Por consiguiente, no se pueden conseguir concentraciones suficientemente altas y como resultado no es posible diseñar un procedimiento eficaz para purificar adicionalmente la natamicina. Aunque se han presentado métodos cromatográficos en la bibliografía científica, todos están diseñados para detectar y cuantificar la natamicina en diversas muestras y no son de naturaleza preparativa. Por consiguiente, estos métodos nunca divulgan mayores concentraciones de natamicina para ser aplicadas sobre el material cromatográfico ni existe ninguna sugerencia que indique cómo se podría conseguir esto. En la práctica, la documentación anterior divulga concentraciones de natamicina que varían de 0,02 a 1 mg/l, lo que incluso está significativamente por debajo de la solubilidad de la natamicina en agua a pH neutro (alrededor de 40 mg/l). Es posible conseguir concentraciones superiores de natamicina disuelta, sin embargo, esto requiere la adición de cantidades sustanciales de disolventes orgánicos según se describe, p. ej. en los documentos WO 2004/105491, WO 95/07998 y en H. Brik en 'Analytical Profiles of Drug Substances' (1981) 10, 513-561.
El mismo problema también impide el aislamiento, la preparación, la identificación y el análisis de compuestos que están presentes en muestras de natamicina en cantidades extremadamente bajas y que hasta ahora no se detectaban o, dependiendo de la fuente o el procedimiento de producción de la natamicina, quizás incluso no estaban presentes.
Tener acceso a estos compuestos sería una herramienta deseable para un análisis adicional, ayudando a entender y optimizar no solo el producto natamicina sino cuando fuera aplicable también su procedimiento de producción.
La presente invención busca resolver los problemas anteriores, al proporcionar una solución líquida de natamicina en combinación con una sal metálica de un ácido carboxílico para el uso en un procedimiento de purificación cromatográfica. Por otra parte, la presente invención se dirige a aislar e identificar compuestos vestigiales hasta ahora desconocidos que pueden estar presentes en la natamicina.
Descripción detallada de la invención
A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender", "incluir" y "tener" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" se han de interpretar inclusivamente. Esto es, estas palabras están destinadas a comunicar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, cuando el contexto lo permita.
Los artículos "un" y "uno(a)" se usan en este documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
En el contexto de la invención, el término "solución" se refiere a una composición en la que un componente (o mezcla de componentes) está disuelto en otro componente (o mezcla de componentes). Cuando el componente (o mezcla de componentes) no está (completamente), es decir, está parcialmente, disuelto en otro componente (o mezcla de componentes), la composición se denomina una "suspensión". Por ejemplo, una composición que comprenda 999,98 g de agua y 0,02 g de natamicina (es decir, 20 ppm) en la que la natamicina esté completamente disuelta se denomina una solución (de 20 ppm) de natamicina en agua, mientras que una composición que comprenda 999,8 g de agua y 0,2 g de natamicina (es decir, 200 ppm) en la que la natamicina esté parcialmente disuelta se denomina una suspensión (de 200 ppm) de natamicina en agua. En el contexto de la invención, una solución se define como una mezcla líquida que, después de la centrifugación durante al menos 10 min a 3000 rpm, da como resultado una pella y un sobrenadante, representando la pella después de la retirada del sobrenadante y el secado no más de 0,001% del peso de la solución de partida antes de la centrifugación.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para purificar natamicina que comprende mezclar una composición que comprende natamicina bruta, una sal metálica de un ácido carboxílico y agua y someter la mezcla resultante a cromatografía, con lo que se recogen fracciones y se combinan fracciones seleccionadas que comprenden natamicina, donde la cantidad de dicha natamicina bruta es de 1 g a 100 g/kg del peso total de dicha composición y donde la concentración de dicha sal metálica de un ácido carboxílico es de 0,1 mol/l a 5 mol/l.
En el contexto de la presente invención, la purificación de natamicina mediante cromatografía no es directa. Aunque se pueden prever, o se conocen, diversos procedimientos cromatográficos, estos se desarrollan con propósitos analíticos e implican la aplicación de muestras a concentración muy baja. Lo último es importante para ajustarse a la baja solubilidad de la natamicina en sistemas acuosos a pH neutro. Para la purificación cromatográfica de natamicina a escala preparativa estos métodos no son adecuados ya que las cantidades máximas de natamicina son demasiado bajas para aislar cantidades cuantitativas. No existen métodos conocidos para disolver la natamicina en alta concentración a valores de pH adecuados en sistemas acuosos, es decir sistemas que no comprendan componentes como, p. ej., disolventes orgánicos, ácidos o bases fuertes, que influyen negativamente en la separación cromatográfica o incluso el material cromatográfico como tal. La combinación de natamicina con una sal metálica de un ácido carboxílico a altas concentraciones se conoce como tal, aunque para diferentes fines y/o no en la forma de una solución acuosa. Por ejemplo, el documento CN 105342987 divulga un gel que comprende diversos componentes, incluyendo natamicina y sorbato potásico, para el tratamiento de úlceras bucales. El uso de la misma combinación, u otras sales metálicas de ácidos carboxílicos, para controlar el crecimiento de hongos también se describe en los documentos EP 2749166, US 5,738,888, WO 2009/010547, y P. Onsberg y cols. (Sabouradia (1978) 16, 39-46), el último combinado con tanto como 60% de dimetilsulfóxido.
Al aplicar concentraciones relativamente bajas de sal metálica de un ácido carboxílico, como de 0,1 mol/l a 10 mol/l o de 0,5 mol/l a 5 mol/l o de 1 mol/l a 2,5 mol/l, la natamicina se disuelve a concentraciones altas como de 1 g/l a 100 g/l, o de 2 g/l a 75 g/l o de 5 g/l a 60 g/l. El valor del pH de la solución de la invención es, medido a 20±2°C, de 6,0 a 11, a menudo de 6,5 a 10, o de 7,0 a 9,5. A estos valores de pH, la solubilidad de la natamicina en agua normalmente es mucho menor, por ejemplo, a valores de pH neutros, esta es alrededor de 0,04 g/l (40 ppm).
En una realización, el metal que es parte de la sal metálica de un ácido carboxílico es un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, ejemplos de los cuales son calcio, litio, magnesio, potasio o sodio. Prácticamente, se obtienen buenos resultados cuando el metal es potasio o sodio.
En otra realización, el ácido carboxílico comprende de 1 a 7 átomos de carbono. Ejemplos son ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido sórbico, pero también mezclas de los mismos. Buenos ejemplos son ácidos carboxílicos con 3 átomos de carbono tales como ácido láctico y ácido propiónico
y ácidos carboxílicos con 6 átomos de carbono tales como ácido cítrico y ácido sórbico. El ácido carboxílico puede estar insaturado con uno o más dobles enlaces. Los dobles enlaces pueden estar orientados en cis o trans. Un buen ejemplo es un ácido carboxílico que tiene dos dobles enlaces orientados en trans tal como ácido sórbico. El ácido carboxílico puede contener grupos hidroxilo, tal como ácido cítrico y ácido láctico. El ácido carboxílico puede tener una sola función carboxilo, pero también dos, tres o más.
En una realización, la mezcladura anterior se lleva a cabo a una temperatura que es elevada durante un cierto período. Se encuentra que no solo la disolución de natamicina se produce más rápidamente, sino que también se obtienen concentraciones finales altas de natamicina y a menudo las soluciones resultantes presentan una mejora de la estabilidad. Así, un incremento temporal de temperatura hasta de 30°C a 130°C, o de 60°C a 120°C, o de 70°C a 110°C se puede aplicar durante de 2 a 200 minutos, o de 3 a 100 minutos, o de 4 a 60 minutos.
Notablemente, la estabilidad de la natamicina en la solución obtenida anteriormente es alta y la concentración de natamicina permanece a valores altos, también después de períodos prolongados. Este efecto es el más pronunciado cuando el ácido carboxílico es ácido sórbico. Además, este efecto es el más pronunciado cuando el metal es un metal alcalino tal como potasio. Según esto, la solución de la invención, inesperadamente, no requiere materiales auxiliares adicionales tales como agentes quelantes como EDTA o antioxidantes para garantizar la estabilidad química descrita en la técnica anterior.
Según esto, la mezcladura de natamicina con una sal metálica de un ácido carboxílico da como resultado soluciones de alta concentración que se pueden aplicar ventajosamente en cromatografía preparativa, un enfoque no se ha demostrado o sugerido en la técnica.
En otra realización, se puede añadir un diol a la composición que comprende natamicina, una sal metálica de un ácido carboxílico y agua. El diol se puede añadir antes, durante o después de que se mezclen los otros componentes. El diol tiene preferiblemente un punto de ebullición de entre 125°C y 300°C o entre 150°C y 250°C y la cantidad de diol es de 50 g/kg a 950 g/kg del peso total de la composición. Se observa que la adición de un diol a la solución de la invención daba como resultado una mejora adicional de la estabilidad y o un incremento adicional de la solubilidad de la natamicina. Dioles adecuados son dipropilenglicol, etilenglicol, polietilenglicol, propilenglicol o mezclas de los mismos.
La relación de sal metálica de un ácido carboxílico a natamicina es de 0,1 (p/p) a 50 (p/p), o de 0,2 (p/p) a 45 (p/p), o de 0,5 (p/p) a 25 (p/p), o de 1 (p/p) a 10 (p/p). Alternativamente, sobre una base molar, la relación de sal metálica de un ácido carboxílico a natamicina es de 0,5 (mol/mol) a 250 (mol/mol), o de 1 (mol/mol) a 100 (mol/mol), o de 2,5 (mol/mol) a 50 (mol/mol), o de 5 (mol/mol) a 45 (mol/mol).
Una realización de la invención es el uso de soluciones de natamicina altamente concentradas que se someten a cromatografía. Así, los procedimientos cromatográficos de la invención se llevan a cabo ventajosamente a una gran escala sin precedentes. Por ejemplo, cuando los procedimientos cromatográficos de la invención se llevan a cabo por lotes, la cantidad de natamicina aplicada al material cromatográfico puede ser de 1 g a 10 kg por lote, o de 5 g a 5 kg por lote, o de 25 g a 1 kg por lote. En un ejemplo, se encontró que se pueden conseguir altas concentraciones de entrada al disolver la alimentación de natamicina en sorbato potásico de alta molaridad.
El término "cromatografía preparativa" se refiere a métodos para separar mezclas de compuestos que están disueltos en la fase móvil, de escala suficiente para aislar cantidades importantes del compuesto deseado. Estos métodos se conocen en la técnica. Un método adecuado para la cromatografía preparativa es, a modo de ejemplo, la cromatografía de adsorción, p. ej. cromatografía en columna. Métodos de separación particularmente preferidos son los conocidos como HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución), SFC (cromatografía de fluidos supercríticos), ambas en modo por lotes y en modo continuo, p. ej. SMB (cromatografía en lecho móvil simulado).
Como se sabe bien por los expertos en la técnica, el término "fase estacionaria" se refiere a un material de soporte inerte adecuado sobre el que está inmovilizado un agente interactivo. El término "fase inversa" se refiere a fases estacionarias en las que cadenas alquílicas están unidas a un material de soporte inerte. Un material de soporte inerte adecuado es preferiblemente macroporoso, p. ej. gel de sílice, poliestireno reticulado, poliacrilamida o zirconia. El gel de sílice se prefiere particularmente. Ejemplos de fases estacionarias en "fase inversa" son Symmetry C18 y Atlantis C18.
El término "fase móvil" se refiere a un disolvente o una mezcla de disolventes en los que está disuelta la mezcla de compuestos que se van a separar. Disolventes adecuados para ser usados en el procedimiento cromatográfico preparativo según la invención son los disolventes que se sabe que se usan en cromatografía analítica. En la cromatografía de líquidos en "fase inversa", como norma. se usan disolventes polares, próticos polares o apróticos, o mezclas de los mismos. Disolventes polares adecuados son, por ejemplo, agua en combinación con metanol o acetonitrilo. En la cromatografía supercrítica, se prefieren mezclas de dióxido de carbono y disolventes próticos polares, p. ej. metanol.
En una realización, las columnas usadas en cromatografía preparativa son tubos cilindricos verticales rellenos con medios cromatográficos destinados a unirse a las moléculas elegidas y a continuación eluirlas lentamente con un tampón y recoger diversas fracciones del eluyente. Las fracciones que contienen la molécula elegida en su forma más pura se reúnen a continuación para obtener un grado de purificación deseado. Sin embargo, el experto en la técnica sabe que están disponibles configuraciones alternativas.
En un segundo aspecto, la invención proporciona ácido (1 R,3S,5R,7 R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-man-nopiranosil)oxi]-1,3,26-trihidroxi-12-metil-10-oxo-6,11,28-trioxatriciclo[22.3.1.057]octacosa-8,14,16,18,20-pentaeno-25-carboxílico de fórmula (II), C33H47NO13, o una sal del mismo.
Se encontró que al realizar el procedimiento del primer aspecto de la invención, se puede aislar, y posteriormente analizar e identificar, el compuesto de fórmula (II) hasta ahora desconocido.
En una realización, la invención proporciona una composición que comprende natamicina y el compuesto de fórmula (II) , donde la cantidad de dicho compuesto de fórmula (II) es de 0,001-0,1% (p/p) con relación a la cantidad de natamicina. Preferiblemente, la composición se aísla, por ejemplo por medio de liofilización, secado por pulverización u otros medios para retirar una cantidad significativa de masas de agua después del procedimiento para purificar natamicina del primer aspecto de la invención. Por consiguiente, la composición del segundo aspecto comprende de 0,001 -10% (p/p) de agua, o de 0,002-5% (p/p) de agua, o de 0,005-3% (p/p) de agua. En otras palabras, la composición del segundo aspecto es una composición obtenible mediante un procedimiento para purificar natamicina que comprende mezclar una composición que comprende natamicina bruta, una sal metálica de un ácido carboxílico y agua y someter la mezcla resultante a cromatografía, con lo que se recogen fracciones y se combinan fracciones seleccionadas que comprenden natamicina, donde la cantidad de dicha natamicina bruta es de 1 g a 100 g/kg del peso total de dicha composición y donde la concentración de dicha sal metálica de un ácido carboxílico es de 0,1 mol/l a 5 mol/l. La composición puede proporcionar además otro componente nuevo, a saber ácido (1 R,3S,5E,7R,11 R,13E,15E,17E,19E,21 R,23S,24R,25S)-21 -[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-manopiranosil)oxi]-1,3,7,25-tetrahidroxi-11-metil-9-oxo-10,27-dioxabiciclo[21.3.1]heptacosa-5,13,15,17,19-pentaeno-24-carboxílico de fórmula (III) , C33H49NO13, o una sal del mismo. La cantidad del compuesto de fórmula (III) es de 0,001-0.1% (p/p) con relación a la cantidad de natamicina.
En un tercer aspecto, se describe un procedimiento para preparar los compuestos (II) del segundo aspecto que comprende someter la natamicina o las aguas madres de la natamicina recristalizada a cromatografía, con lo que se recogen fracciones y se combinan fracciones seleccionadas que comprenden dichos compuestos. Las fracciones combinadas se pueden concentrar para aislar los compuestos respectivos. La concentración se puede conseguir usando herramientas disponibles para el experto tales como evaporación, liofilización, pero también cristalización o precipitación después de filtración.
Una realización de la invención es el uso de soluciones de natamicina muy concentradas que se someten a cromatografía. Así, los procedimientos cromatográficos de la invención se llevan a cabo ventajosamente a una gran escala sin precedentes. Por ejemplo, cuando los procedimientos cromatográficos de la invención se llevan a cabo por lotes, la cantidad de natamicina aplicada al material cromatográfico puede ser de 1 g a 10 kg por lote, o de 5 g a 5 kg por lote, o de 25 g a 1 kg por lote.
Una realización de la invención es someter las aguas madres de la natamicina recristalizada a cromatografía preparativa. Estas aguas madres se pueden obtener, por ejemplo, después de la recristalización de la natamicina según se describe en el documento WO 2006/045831. Esto puede ser disolución de natamicina a pH alto seguida por cristalización a pH neutro o disolución de natamicina a pH bajo seguida por cristalización a pH neutro. La ventaja de usar las aguas madres de natamicina recristalizada en la cromatografía preparativa está en el hecho de que las aguas madres son generalmente relativamente superiores en impurezas en comparación con la natamicina que los cristales originales y ciertamente que los cristales resultantes. Por consiguiente, el uso de las aguas madres de natamicina recristalizada conducirá a un rendimiento superior del compuesto deseado después de la cromatografía y/o una pureza superior y/o un procedimiento menos elaborado.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de los compuestos o las composiciones del segundo aspecto en el análisis de muestras que contienen natamicina. El diseño y la optimización de procedimientos de producción de natamicina se consigue mejor cuando se conocen muchos posibles o probables productos secundarios o contaminantes o similares. Pero, de forma importante, no solo se conocen sino también están disponibles para el técnico, permitiéndole repetir coherentemente procedimientos analíticos y obtener resultados fiables. Los compuestos y las composiciones de la actual invención son además la caja de herramientas del técnico experto que le permite mejorar y optimizar adicionalmente procedimientos analíticos y por consiguiente elevar no solo la comprensión del procedimiento sino también la calidad del producto hasta un nivel todavía superior. Estas son necesidades constantes en el desarrollo de productos actuales.
En una realización, los compuestos o las composiciones del segundo aspecto se pueden usar como patrones y/o referencias en métodos analíticos tales como cromatografía de líquidos de alta resolución, análisis espectrométrico de masas, cromatografía en capa fina o RMN. Tener acceso a cantidades mayores permite una disponibilidad y una calidad constantes de las referencias y los patrones. Por consiguiente, el compuesto de fórmula (II), pero también el de fórmula (III), es aplicable industrialmente con diversos fines que varían de la optimización adicional de la producción de natamicina a la actividad antifúngica potencial en sí misma. La actividad antifúngica se puede usar en diversas aplicaciones alimentarias.
La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Parte General
HPLC en combinación con espectrómetro de masas de alta resolución (LC-MS)
Columna de LC: Waters, Symmetry C18
Fase móvil: Disolvente A: tampón de acetato amónico 50 mM pH 5,8
Disolvente B: Acetonitrilo
Volumen de inyección: 10 pl
Temp. columna: 25 °C
Caudal: 1 ml/min
Instrumento de MS: LTQ Orbitrap
LC/MS: ESI de barrido total modo positivo
Condiciones de HPLC-UV para el fraccionamiento
Columna: Dr. Maische, NovoGROM Spherical C18, 100 Á, 250 x 4,6 mm, 15 pm
Fase móvil: Disolvente A: tampón de acetato amónico 50 mM pH 5,8
Disolvente B: Acetonitrilo
Gradiente: Tiempo (min.) Disolvente A (%) Disolvente B (%)
0,0 75 25
15.0 75 25
21.0 65 35
25.0 50 50
26.0 75 25
30,0 75 25
Volumen de inyección: 100 pl
Temp. columna 25°C
Caudal: 1,0 ml/min.
Temp. muestra: 15°C
Tiempo de prueba (min.): 30 minutos
Dionex Ultimate DAD-3000 (longitud de onda simple UV)
Longitud de onda 305 nm
Anchura de banda 1 nm
Velocidad de recogida de datos 5 Hz
Dionex Ultimate DAD-3000 (UV 3D)
Longitud de onda 200 - 600 nm
Anchura de banda 4 nm
Velocidad de recogida de datos 5 Hz
Tiempo de respuesta 1 s
La separación de los compuestos (I), (II) y (III) se verificó usando las condiciones descritas anteriormente por medio de espectrometría de masas de alta resolución. Comiéncese recogiendo 20 fracciones de compuestos (II), (III) y natamicina (I). Las fracciones recogidas se liofilizaron para el aislamiento de los compuestos respectivos y se analizaron adicionalmente para la elucidación de la estructura.
Con propósitos de referencia, se registraron los espectros de RMN de natamicina (I) en un espectrómetro Bruker Ascend 600. Se usó metanol como referencia de desplazamiento químico (5=3,31 ppm, 49,2 ppm). Los desplazamientos químicos de 1H y 13C se extrajeron del espectro de correlación de 1H-13C (HSQC).
Ejemplo 1
Preparación de ácido (1fl,3S,5fl,7fl,8E,12fl,14Z,16E,18E,20E,22fl,24S,25fl,26S)-22-[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-manopiranosil)oxi]-1,3,26-trihidroxi-12-metil-10-oxo-6,11,28-trioxatri-ciclo[22.3.1.05’7]octacosa-8,14,16,18,20-pentaeno-25-carboxílico (II)
Se produjo natamicina mediante un cultivo de bacterias Streptomyces natalensis después de un procedimiento de fermentación controlada, por ejemplo según se describe en el documento WO 97/29207 o las referencias del mismo. Una muestra del caldo resultante se mezcló con una solución acuosa de sorbato potásico (3 M) y la mezcla se agitó hasta que se disolvía toda la natamicina. La cantidad de solución acuosa de sorbato potásico era tal que la concentración resultante de natamicina era 10 g/l (p/p, 1%). En experimentos alternativos, por lo demás similares, la disolución de natamicina se facilitaba al elevar la temperatura hasta 40±10°C durante 30±20 min seguido por enfriamiento hasta 20±2°C. La solución resultante se sometió a cromatografía de líquidos de alta resolución semipreparativa según se describe bajo la Parte General (Condiciones de HPLC-UV para el fraccionamiento) anterior para aislar cantidades de compuesto (II). Además, se aislaron fracciones que comprendían un segundo compuesto de fórmula (III). Las muestras se obtuvieron según la Tabla posterior. El contenido de las muestras se determinó con LC-UV.
Las estructuras químicas se elucidaron mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).
Ejemplo 2
Elucidación de la estructura del ácido (1 fí,3S,5fí,7fí,8£,12fí,14Z,16£,18£,20£,22fí,24S,25fí,26S)-22-[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-manopiranosil)oxi]-1,3,26-trihidroxi-12-metil-10-oxo-6,11,28-trioxatriciclo[22.3.1.05’7]octacosa-8,14,16,18,20-pentaeno-25-carboxílico (II)
Todo el material procedente de la fracción que comprendía compuesto (II) obtenida en el Ejemplo 1 se adsorbió en una columna Sep-Pak. La columna se enjuagó con D2O (1 ml). Posteriormente, la columna se barrió con nitrógeno gaseoso. La columna se eluyó en la dirección inversa con CD3CN (1 ml). El compuesto (II) no se eluía de la columna que posteriormente se eluyó con CDCh/CDaOD 1/1. La solución se transfirió a un tubo de RMN, y se concentró adicionalmente por medio de una corriente de nitrógeno gaseoso, hasta que se obtenía un volumen de 0,65 ml. Se añadió una gota de D2O para mejorar la anchura de línea en el espectro de RMN.
Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker DRX 600, que funcionaba a una frecuencia de 1H de 600 MHz. Se usó una sonda inversa equipada con arrollamientos en gradiente. Además de un espectro de RMN 1H, se registraron espectros de COSY, TOCSY y HSQC. Para la predicción de los desplazamientos químicos, se usó el programa ACD versión 4.04.
Tabla: Desplazamientos químicos de los carbonos y protones característicos en (II) y en natamicina (I) en comparación con los desplazamientos predichos mediante el programa ACD versión 4.04.
La comparación de los espectros de RMN 2D con los de natamicina (I) demostraba que el compuesto (II) difiere de la natamicina (I) solo en la configuración del doble enlace C14-C15, que es cis en el compuesto (II) y trans en la natamicina (I). El patrón de constantes de acoplamiento de H14 estaba de acuerdo con un enlace doble cis en C14-C15. Cuando se comparaban los espectros de la natamicina (I) y el compuesto (II), parecía que la mayoría de las señales tenían desplazamientos químicos casi idénticos, excepto los de C/H 12, 13 y 14. Por otra parte, el patrón de acoplamiento de H14 era muy diferente del patrón observado en la natamicina (I). El cuadruplete ligeramente distorsionado de H14 surgía de tres constantes de acoplamiento de ± 9 Hz, un valor típico para un acoplamiento cis, mientras que un acoplamiento trans tiene habitualmente una magnitud de 12-18 Hz. Por otra parte, el desplazamiento químico 13C de C13 tiene 6 ppm desplazados sobre el campo, siendo el desplazamiento sobre el campo esperado de un CH2 adyacente a un doble enlace cis en comparación con un doble enlace trans (predicción de ACD). Los desplazamientos químicos de los protones y carbonos importantes se listan en la Tabla anterior. A partir de los resultados, se concluía que el compuesto (II) es un isómero de la natamicina (I) con un doble enlace cis entre C14 y C15.
Ejemplo 3
Elucidación de la estructura del ácido (1fí,3S,5£,7fí,11fí,13£,15£,17£,19£,21fí,23S,24fí,25S)-21-[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-manopiranosil)oxi]-1,3,7,25-tetrahidroxi-11-metil-9-oxo-10,27-dioxabiciclo[21.3.1]heptacosa-5,13,15,17,19-pentaeno-24-carboxílico (III)
Todo el material procedente de la fracción que comprendía compuesto (III) obtenida en el Ejemplo 1 se disolvió en CD3OD (0,6 ml). La muestra contenía presumiblemente una gran cantidad de glicerol, introducida como un contaminante durante el criosecado. Además, las señales de los ácidos grasos libres eran dominantes. Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Ascend 700 que funciona a una frecuencia protónica de 700 MHz equipado con una criosonda TCI y medido con una temperatura de la sonda de 300 K con supresión de la señal del agua. Se obtuvo un espectro de 1H 1D con 256 barridos en 30 minutos, un espectro de COSY se registró con 8 barridos y 800 incrementos en F1 en 3 horas, los espectros de TOCSY se registraron con 8 barridos y tiempos de mezcladura de 40 y 100 ms y 800 incrementos en la dimensión F1 en 3 horas cada uno. Se registró un espectro de correlación de 1H-13C (HSQC) con 288 barridos y 512 incrementos en la dimensión F1 en 55 horas.
A partir del espectro de RMN de 1H, estaba claro que la señal de H9 de natamicina se perdía. La identificación del compuesto en esta fracción era posible al comparar el espectro de correlación de protón-carbono (HSQC) y el espectro de correlación de protón-protón (COSY) con los de la natamicina. El solapamiento del espectro de HSQC de la natamicina y el de esta fracción mostraba que la mayoría de las señales tenían desplazamientos químicos (casi) idénticos con las excepción de los de los números de átomo 5,6,7,8 y 11 del compuesto de fórmula (II) (nótese que los átomos 5, 6, 7, 8 y 11 en (III) son 5, 7, 8, 9 y 12, respectivamente, en (I)). Con la ayuda del espectro COSY y la fórmula molecular dada por LC/MS (natamicina 2H) se asignaron las susodichas señales, y se concluyó que la impureza tiene la estructura que se da en la fórmula (III).
El doblete característico de la natamicina (I) de H9 a 6,06 ppm ha desaparecido, y en cambio H8 en (III) aparecía como dos señales mutuamente acopladas a 2,28 y 2,50 ppm. Estos desplazamientos químicos indican intensamente un grupo CH2. Por otra parte, el doble doblete característico de H8 en la natamicina (I) ha desaparecido, y la señal de protón de H7 en (III) se identificó a 4,29 ppm, lo que indica intensamente un grupo CH(OH). Finalmente, H7 y H5 en (I) se encontraban a 3,14 y 2,82 ppm, respectivamente, de acuerdo con el resto epóxido. En el análisis, estas señales de protón, marcadas H6 y H5, se encontraban ambas a 5,48 ppm. Los desplazamientos químicos de los protones y carbonos que difieren significativamente de los de la natamicina se dan en la Tabla posterior. Estos desplazamientos químicos de 1H y 13C se extrajeron del espectro de correlación de 1H-13C (HSQC). La multiplicidad de las señales de 1H no se daba, ya que todas las señales de protón se solapaban parcialmente con otras señales.
Tabla: Desplazamientos químicos de los carbonos y protones característicos en (III) en comparación con los desplazamientos predichos por el programa ACD versión 4.04.
Claims (13)
1. Un procedimiento para purificar natamicina que comprende mezclar una composición que comprende natamicina bruta, una sal metálica de un ácido carboxílico y agua y someter la mezcla resultante a cromatografía, con lo que se recogen fracciones y se combinan fracciones seleccionadas que comprenden natamicina, donde la cantidad de dicha natamicina bruta es de 1 g a 100 g/kg del peso total de dicha composición y donde la concentración de dicha sal metálica de un ácido carboxílico es de 0,1 mol/l a 5 mol/l.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha mezcladura se lleva a cabo a una temperatura de 30°C a 130°C, donde dicha temperatura se mantiene durante de 10 a 200 minutos.
3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho metal es un metal alcalino o un metal alcalinotérreo.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho ácido carboxílico es ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido sórbico o mezclas de los mismos.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde dicho ácido carboxílico es ácido sórbico.
6. Ácido (1 R,3S,5R,7R,8E,12R,14Z,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-manopiranosil)oxi]-1,3,26-trihidroxi-12-metil-10-oxo-6,11,28-trioxatriciclo[22.3.1.057]octacosa-8,14,16,18,20-pentaeno-25-carboxílico de fórmula (II) o una sal del mismo.
7. Una composición que comprende natamicina, agua y el compuesto (II) según la reivindicación 6, donde la cantidad de agua es de 0,001-10% (p/p) y donde la cantidad de dicho compuesto (II) según la reivindicación 6 es de 0,001-0,1% (p/p) con relación a la cantidad de natamicina.
8. Composición según la reivindicación 7, que comprende además ácido (1 R,3S,5E,7R,11 R,13E,15E,17E,19E,21 R,23S,24R,25S)-21 -[(3-amino-3,6-didesoxi-p-D-mano-piranosil)oxi]-1,3,7,25-tetrahidroxi-11-metil-9-oxo-10,27-dioxabiciclo[21.3.1]heptacosa-5,13,15,17,19-pentaeno-24-carboxílico de fórmula (III) o una sal del mismo, donde la cantidad de dicho compuesto de fórmula (III) es de 0,001-0,1% (p/p) con relación a la cantidad de natamicina.
9. Un procedimiento para preparar un compuesto (II) según la reivindicación 6, que comprende someter la natamicina o las aguas madres de natamicina recristalizada a cromatografía, donde la natamicina o las aguas madres de la natamicina recristalizada se mezclan con una sal metálica de un ácido carboxílico y agua y la mezcla resultante se somete a cromatografía, con lo que se recogen fracciones y se combinan fracciones seleccionadas que comprenden dicho compuesto (II) según la reivindicación 6, donde la concentración de dicha sal metálica de un ácido carboxílico es de 0,1 mol/l a 5 mol/l.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde dichas fracciones seleccionadas combinadas se concentran.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, donde dicha concentración es liofilización.
12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde dicha cromatografía se lleva a cabo con de 1 g a 10 kg de natamicina por lote.
13. Uso de un compuesto (II) según la reivindicación 6, en el análisis de muestras que contienen natamicina.
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