ES2937174T3

ES2937174T3 - Anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos para CD47

Info

Publication number: ES2937174T3
Application number: ES20198499T
Authority: ES
Inventors: Jie Liu; Irving L Weissman; Ravindra Majeti
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: AU2020203132A1; JP2019216719A; AU2023202660A1; JP6964631B2; JP2024050548A; HRP20221260T1; JP6943549B2; AU2011252851A1; US20210246206A1; US20240084006A1; EP2569013B1; US20150183874A1; JP2022031635A; EP3181149A1; CA2797720C; EP3789038B1; PL3789038T3; HUE060541T2; CA3138956A1; US20130142786A1

Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales anti-CD47 humanizados o quiméricos. Los anticuerpos se unen a la CD47 humana y la neutralizan, y encuentran uso en varios métodos terapéuticos. Se prefieren los anticuerpos no activantes. Las realizaciones de la invención incluyen anticuerpos aislados y derivados y fragmentos de los mismos, formulaciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los anticuerpos monoclonales anti-CD47 humanizados o quiméricos; y líneas celulares que producen estos anticuerpos monoclonales. También se proporcionan secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos para CD47

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los macrófagos depuran patógenos y las células dañadas o envejecidas desde el torrente sanguíneo a través de la fagocitosis. CD47 de la superficie celular interactúa con su receptor en los macrófagos, SIRPa, para inhibir la fagocitosis de las células normales y sanas. CD47 es una glicoproteína transmembrana expresada en líneas generales con un solo dominio similar a Ig y cinco regiones de membrana que abarca, que funciona como un ^{ligando celular para SIRPa con la unión mediada por el dominio de tipo V del terminal NH}2 ^{de SIRPa. SIRPa se}expresa principalmente en las células mieloides, incluyendo los macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides (DC), mastocitos, y sus precursores, incluyendo las células madre hematopoyéticas.

SIRPa inhibe la fagocitosis de las células huésped por los macrófagos, en los que la ligadura de SIRPa en macrófagos por CD47 expresado en la célula diana anfitrión genera una señal inhibidora mediada por SHP-1 que regula negativamente la fagocitosis. SIRPa actúa para detectar señales proporcionadas por "sí misma", para controlar negativamente la función efectora inmune innata contra estas células.

De acuerdo con el papel de CD47 para inhibir la fagocitosis de las células normales, no existe evidencia de que se regula hacia arriba transitoriamente en células madre hematopoyéticas (HSC) y progenitores justo antes y durante su fase migratoria, y que el nivel de CD47 en estas células determinan la probabilidad de que se engullen in vivo.

CD47 es también constitutivamente regulada hacia arriba en un número de cánceres, incluyendo leucemias mieloides. La sobreexpresión de CD47 en una línea de leucemia mieloide aumenta su patogenicidad al permitirle evadir la fagocitosis. Llegamos a la conclusión de que la regulación hacia arriba de CD47 es un importante mecanismo que proporciona protección a HSCs normales durante la inflamación mediada por la movilización, y que los progenitores leucémicos cooptan esta capacidad con el fin de evadir la muerte por macrófagos.

La US 2008/107654 describe un anticuerpo anti-CD47 humanizado Gresham et al. (1989) The Journal of Cell Biology 108(5):1935-1943 informa que un nuevo miembro de la familia de receptores de integrina media la fagocitosis de neutrófilos estimulada por Arg-Gly-Asp. Brown et al. (1990) The Journal of Cell Biology 111(6):2785-2794 describe proteína asociada a la integrina. Lindberg et al. (1993) The Journal of Cell Biology 123(2):485-496 describe la clonación molecular de la proteína asociada a la integrina. Majeti et al. (2009) Developmental Cell 138(2):286-299 informa que CD47 es un factor de pronóstico adverso y objetivo de anticuerpos terapéuticos en células madre de leucemia mieloide aguda humana. La WO 2008/035894 describe un agente antiviral contra virus animales. Pettersen et al. (1999) The Journal of Immunology 162:7031-7040 informa que CD47 señala la muerte de células T. Subramanian et al. (2006) Blood Cells, Molecules and Diseases 36(3):364-372 describe la movilidad de la membrana y la agrupación de la proteína asociada a la integrina (IAP, CD47), Subramanian et al. (2006) Transfusion Clinique et Biologique 13(1-2):31-38 describe el 'metabolón', CD47 y la sinapsis fagocítica. Selli et al. (1994) Urology 44(6):930-932 describe linfoma no de Hodgkin bilateral síncrono de los testículos. La US 2003/108546 describe Fv de cadena sencilla inductor de apoptosis.

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD47 que tienen baja inmunogenicidad en los seres humanos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado aislado que se une específicamente a CD47 humana, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene cada una de las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 20-22 y una cadena ligera que tiene cada una de las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 23-25; y en donde la composición farmacéutica está en forma de una solución acuosa.

Se proporcionan composiciones y métodos referentes a anticuerpos monoclonales anti-CD47 humanizados o quiméricos. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden anticuerpos que se unen y neutralizan CD47 humana, y encuentran uso en varios métodos terapéuticos. Se prefieren los anticuerpos no activantes. Los anticuerpos de interés incluyen los anticuerpos humanizados o quiméricos proporcionados, y variantes de los mismos. Los anticuerpos monoclonales en las composiciones farmacéuticas de la invención encuentran utilidad particular como reactivos para el diagnóstico e inmunoterapia de la enfermedad asociada con CD47 en humanos, particularmente en la terapia contra el cáncer. Una ventaja de los anticuerpos monoclonales en las composiciones farmacéuticas de la invención deriva del proceso de humanización. Por tanto, el uso in vivo de los anticuerpos monoclonales de la invención para inmunoterapia reduce en gran medida los problemas de la respuesta inmunitaria del huésped significativa a los anticuerpos.

Varias formas de los anticuerpos se contemplan en este documento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD47 puede ser un anticuerpo de longitud completa quimérico o humanizado, por ejemplo, que tiene una región constante de inmunoglobulina humana de cualquier isotipo, por ejemplo IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, etc., o un ^{fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un F(ab}')2 ^{fragmento, y Fragmento F(ab), etc. fragmentos que comprenden}regiones CDR son también de interés, por ejemplo para fines de formación de imágenes. Además, el anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable, inmovilizado en una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo. El anticuerpo también puede proporcionarse como un anticuerpo biespecífico o multiespecífico reactivo con un segundo antígeno, particularmente incluyendo antígenos de cáncer.

Se contemplan usos diagnósticos y terapéuticos para el anticuerpo, en particular en relación a la detección y eliminación de las células no deseadas que expresan CD47. En una aplicación de diagnóstico, se describe un método para determinar la presencia de células cancerígenas que expresan CD47, que comprende exponer una muestra de paciente sospechosa de contener células cancerígenas que expresan CD47 al anticuerpo anti-CD47 y determinan la unión del anticuerpo a la muestra.

Los anticuerpos en las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente eficaces en el tratamiento de la enfermedad, por ejemplo, el aumento de la fagocitosis de células que expresan CD47. El tratamiento puede ser sistémico o localizado, por ejemplo, la entrega por inyección intratumoral, etc.

En la presente se divulgan anticuerpos aislados y derivados y fragmentos de los mismos que comprenden por lo menos una, habitualmente por lo menos 3 secuencias de CDR como se proporciona en la presente, por lo general en combinación con secuencias marco de una región variable humana o como un péptido de CDR aislado. En algunos casos, un anticuerpo comprende al menos una cadena ligera que comprende las 3 secuencias de CDR de cadena ligera situadas en una estructura de región variable, que puede ser, sin limitación, un armazón de región variable humana o de ratón y al menos una cadena pesada que comprende las 3 secuencias de cadena CDR situadas en una región variable marco, que puede ser, sin limitación, un marco variable de región humano o de ratón.

En otros casos, el anticuerpo comprende una variante de la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR de los anticuerpos, que la variante comprende una o más de inserción de aminoácidos dentro o adyacentes a un residuo y/o supresión de CDR dentro o adyacente a un residuo de CDR y/o sustitución de residuo de CDR (siendo la sustitución el tipo preferido de alteración de aminoácidos para generar tales variantes). Tales variantes ^{normalmente tiene una afinidad de unión para CD47 humana de al menos aproximadamente 10}-8 ^{M y se unirán al}mismo epítopo que un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos de los fijados en el presente documento. ^{Por ejemplo, la cadena ligera CDR}3 ^{puede ser modificada para mutar el sitio de desamidación. En este documento}se contemplan diversas formas de los anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, que tiene una región constante de inmunoglobulina humana de cualquier isotipo, por ejemplo ^{IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, etc., o un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento F(ab')}2^{, y}Fragmento F(ab), etc. Además, el anticuerpo se puede marcar con un marcador detectable, inmovilizado en una fase sólida y/o conjugado con un compuesto heterólogo.

La invención también proporciona una composición que comprende uno o más de los anticuerpos anti-CD47 humanos y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición para uso terapéutico es estéril y se puede liofilizar, por ejemplo, proporcionarse como un pre-paquete en una dosis unitaria con el diluyente y el dispositivo de entrega, por ejemplo, inhalador, jeringa, etc.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Fig. 1. Secuencias de aminoácidos de la región variable (A) de la cadena pesada B6H12 y de la región variable de la cadena ligera (B). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son las indicadas.

Fig. 2. El Análisis SDS-PAGE de proteínas B6H12 purificadas. El B6H12 quimérico y humanizado purificado se analizó mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Los patrones de masa molecular se indican a la izquierda.

Fig. 3. La competencia del anticuerpo quimérico B6H12 contra el anticuerpo B6H12 de ratón para la unión de CD47. A. B6H12 quimérico compitió contra B6H12 de ratón para unirse a células YB2/0 que habían sido transfectadas de forma estable con CD47 humana (YB2/0-CD47). Se utilizó un anticuerpo IgG1 humano como control de isotipo. B. El ratón B6H12 compitió contra el B6H12 quimérico para la unión a CD47 humana expresada en células YB2/0 transfectadas. Se usó una IgG1 de ratón como control de isotipo.

Fig. 4. Secuencias de nucleótidos para región variable (A) de cadena pesada de B6H12 humanizada y región variable (B) de cadena ligera.

Fig. 5. La comparación de la unión de anticuerpos B6H12 quiméricos y humanizados a CD47 humana mediante citometría de flujo. Las células YB2/0 transfectadas de forma estable con CD47 humana se tiñeron con B6H12 quimérico, B6H12 humanizado o un anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano. El anticuerpo unido se detectó con anticuerpo secundario marcado con PE.

^Fig.6^{. La comparación de la unión de anticuerpos B6H12 quiméricos y humanizados a CD47 humana mediante}ELISA. La actividad de unión a CD47 soluble se midió mediante ELISA como se describe en Materiales y Métodos. El anticuerpo unido se detectó con kappa anti-humano de cabra conjugado a HRP, y la señal se desarrolló utilizando OPT.

Fig. 7. Fagocitosis mediada por anticuerpo B6H12 quimérico y humanizado. Las células HL-60 marcadas con CFSE se incubaron con macrófagos derivados de médula ósea de ratón en una relación diana de 4:1 a célula ^efectora.2 ^{horas más tarde, los macrófagos fueron visualizados por microscopía de fluorescencia para detectar}la fagocitosis. El índice fagocítico (número de células diana ingeridas por 100 macrófagos) se determinó para cada condición por duplicado. La comparación estadística de cada anticuerpo con el control del isotipo de hIgG1 usando la prueba t de Student mostró que todos los anticuerpos permitían un aumento estadísticamente significativo en la fagocitosis (valores de p: anticuerpo B6H12 de ratón: 0,004, anticuerpo B6H12 quimérico: 0,04 y anticuerpo B6H12 humanizado: 0,003)

^Figura8^{. Alineación de aminoácidos entre B6H12 VL humanizado y VK3-11 humano y JK1, y B6H12}humanizado VH y VH3-7 y JH4 humanos. El número de aminoácidos diferentes de las secuencias de la línea germinal humana B6H12 humanizada en el marco y las regiones CDR de VH y VL se resumen en la tabla.

Fig. 9. Secuencias de aminoácidos de región variable (A) de cadena pesada 5F9 y Región variable (B) de cadena ligera. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las indicadas.

^{Fig. 10. Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada}8^B6 ^{(A) y de la región variable de}la cadena ligera (B). Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las indicadas.

^{Fig. 11. Comparación de la unión de anticuerpos quiméricos 5F9 y}8^B6 ^{a CD47 humana mediante ELISA. La}actividad de unión CD47 soluble se midió mediante un ensayo ELISA como se describió anteriormente. El anticuerpo unido se detectó con kappa anti-humano de cabra conjugado a HRP, y la señal se desarrolló utilizando OPT.

Fig. 12. Alineaciones de secuencias de aminoácidos de diferentes versiones de regiones variables (A) de cadena pesada 5F9 humanizada y regiones variables (B) de cadena ligera con secuencias de líneas germinales. Las regiones CDR están marcadas en rojo.

Fig. 13. La comparación de la unión de anticuerpos 5F9 humanizados y quiméricos con CD47 humana mediante ELISA. La actividad de unión CD47 soluble se midió mediante un ensayo ELISA como se describió anteriormente. El anticuerpo unido se detectó con kappa anti-humano de cabra conjugado a HRP, y la señal se desarrolló utilizando OPT.

^{Fig. 14. Fagocitosis inducida por anticuerpos de 5F9 y}8^B6^{. Se usaron células HL-60 como células diana y se}incubaron con macrófagos derivados de sangre periférica humana en una relación diana 4: 1 a célula efectora. Cada condición se hizo en duplicado.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a composiciones farmacéutica que comprenden anticuerpos monoclonales humanizados que son específicos para CD47. Los anticuerpos se utilizan en métodos terapéuticos y de diagnóstico asociados con CD47.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya están con el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.

"Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, de zoológicos, deportivos o de animales de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, El mamífero es humano.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la deseada actividad biológica. "Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo son, por ejemplo, producidos a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles aumentados por mielomas.

Como se usa en esta invención, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten usualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

"Anticuerpos e inmunoglobulinas nativas" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadenos regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol.

186: 651 (1985), Novotny y Haber, Proc. Nat. Acad. Sci USA 82: 4592 (1985)).

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones de determinación de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman la estructura (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración de p-hoja, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de p-hoja. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Las secuencias CDR de combinaciones de cadenas pesadas y ligeras de anti-CD47 ejemplares se exponen ^{en la lista de secuencias, incluyendo B6H12: SEQ ID NO: 3-8; 5F9: SEQ ID NO: 20-25; y}8^B6^{: SEQ ID NO: 28-33.}En algunas realizaciones las secuencias CDR para una combinación particularmente pesada y de cadena ligera ^{como se establece en B6H12, 5F9 y}8^B6 ^{se mantendrán en una combinación, es decir, un anticuerpo humanizado}comprenderá tanto secuencias CDR de cadena pesada B6H12 como secuencias CDR de cadena pesada B6H12; o bien secuencias CDR de cadena pesada 5F9 y secuencias CDR de cadena pesada 5F9, o secuencias CDR de ^{cadena pesada}8^B6 ^{y secuencias CDR de cadena pesada}8^B6^.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antígeno y todavía es capaz de antígeno de reticulación.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antígeno y el sitio de unión. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha y no covalente. En una especie Fv de cadena sencilla (scFv), un dominio variable pesado y un dominio variable de cadena ligera pueden estar unidos de forma covalente por un enlace peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, páginas 269 - 315 (1994).

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab 'difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación de la presente invención para Fab' donde el resto de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. F(ab')2 de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i , IgG2, IgG3, IgG4, IgA-i, IgA2. Los dominios constantes de ^{cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a,}8^{, £, y, y M,}respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

"Fragmento de anticuerpo", y todas las variantes gramaticales de los mismos, tal como se usa en el presente documento se define como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o región variable del anticuerpo intacto, donde la porción está libre de la cadena pesada constante (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de ^{fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')}2^{, y fragmentos Fv; diacuerpos; cualquier fragmento}de anticuerpo que es un polipéptido que tiene una estructura primaria que consiste en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominada en la presente memoria como "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "polipéptido de cadena única"), incluyendo sin limitación (1) moléculas Fv de cadena única (scFv) ⁽2^{) polipéptidos de cadena única que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo}que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociada y (3) polipéptidos de cadena única que contienen sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin un resto de cadena ligera asociada; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpo. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, la cadena o cadenas pesadas pueden contener cualquier secuencia de dominio constante (por ejemplo CH1 en el isotipo IgG) que se encuentra en una región no Fc de un anticuerpo intacto, y/o puede contener cualquier secuencia de región de bisagra que se encuentra en un anticuerpo intacto, y/o puede contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de la región de bisagra o la secuencia de dominio constante de la cadena pesada.

A menos que se indique específicamente lo contrario, el término "conjugado", como se describe y reivindica en el presente documento se define como una molécula heterogénea formada por la unión covalente de uno o más fragmentos de anticuerpos a una o más moléculas de polímero, donde la molécula heterogénea es soluble en agua, es decir soluble en fluidos fisiológicos tales como sangre, y donde la molécula heterogénea está libre de cualquier agregado estructurado. Un conjugado de interés es PEG. En el contexto de la definición anterior, el término ^{agregado estructurado se refiere a (}1^{) cualquier agregado de moléculas en solución acuosa que tiene una estructura}esferoidal o esferoidal, de modo que la molécula heterogénea no está en una micela u otra estructura de emulsión, y ^{no está anclado a una bicapa lipídica, vesícula o liposoma; y (}2^{) cualquier agregado de moléculas en forma sólida o}insolubilizada, tal como una matriz de perlas cromatográficas, que no libera la molécula heterogénea en solución al entrar en contacto con una fase acuosa. Por consiguiente, el término "conjugado" como se define aquí abarca la molécula heterogénea mencionada anteriormente en un precipitado, sedimento, matriz bioerodable u otro sólido capaz de liberar la molécula heterogénea en una solución acuosa por hidratación del sólido.

El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Cada mAb está dirigido contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden ser sintetizados por cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse en una célula B inmortalizada o un hibridoma de la misma, o pueden hacerse mediante métodos de ADN recombinante.

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por ayuste de un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo anti-CD47 con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de especies de origen o la clase inmunoglobulina o la designación de subclase, así como fragmentos de anticuerpos ^{(por ejemplo, Fab, F(ab')}2^{, y Fv), siempre que exhiban la actividad biológica deseada.}

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase de anticuerpo particular o subclase, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico o homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la deseada actividad biológica.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 75% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de 80%, 90% o 99% en peso, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos un paso de purificación.

El término "epítopo etiquetado" cuando se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo anti-CD47 fusionado a un "epítopo etiqueta". El polipéptido del epítopo etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar unepítopo contra el que puede hacerse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para que no interfiera con la actividad del anticuerpo CD47. La etiqueta de epítopo es preferiblemente lo suficientemente única para que el anticuerpo específico para el epítopo no reaccione de forma cruzada sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos marcados ^{adecuados generalmente tienen al menos}6 ^{residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8-50}residuos de aminoácidos (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 residuos). Los ejemplos incluyen la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5 (12): 3610-3616 (1985)); y la ^{etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (}6^):547-553 (1990)).

La palabra "marcador" cuando se usa aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, etiquetas de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto de sustrato o composición que es detectable.

Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Ejemplos de fases sólidas incluidas aquí incluyen aquellas formadas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; En otros, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la Patente de EE.UU. 4.275.149.

Polipéptidos

En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos que son específicamente reactivos con CD47 y neutralizan, y las líneas celulares que producen tales anticuerpos. Se proporcionan regiones variables de anticuerpos ejemplares. Los anticuerpos de interés incluyen estas combinaciones proporcionadas, así como fusiones de las regiones variables a regiones o fragmentos constantes apropiados de regiones constantes, por ejemplo para generar anticuerpos F(ab)'. Las regiones variables de interés incluyen al menos una secuencia c Dr del anticuerpo anti-CD47 proporcionado, donde una CDR puede ser 3, 4, 5, 6^{, 7,}8^{, 9, 10, 11, 12 o más aminoácidos. Alternativamente, los anticuerpos de interés incluyen una región variable}como se expone en los anticuerpos proporcionados, o pares de secuencias de regiones variables como se expone aquí.

En algunas realizaciones un polipéptido de interés que tiene una secuencia contigua de al menos aproximadamente 10 aminoácidos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos, Hasta la región variable proporcionada completa. Los polipéptidos de interés también incluyen secuencias de regiones ^{variables que se diferencian hasta uno, hasta dos, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta}6 ^{o más aminoácidos en}comparación con la secuencia de aminoácidos expuesta aquí. En otras realizaciones, un polipéptido de interés es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos expuesta aquí.

Además de los Fab, fragmentos de anticuerpo más pequeños y péptidos de unión a epítopo que tienen especificidad de unión para al menos un epítopo de CD47 están también contemplados por la presente invención y también se puede utilizar en los métodos de la invención. Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos de cadena única de acuerdo con el método de la Patente de EE.UU. Los anticuerpos de cadena única comprenden las regiones variables de las cadenas ligera y pesada unidas por un resto enlazador flexible. Aún más pequeño es el fragmento de anticuerpo conocido como anticuerpo de dominio único, que comprende un dominio único VH de aislamiento. Las técnicas para obtener un anticuerpo de dominio único con al menos parte de la especificidad de unión del anticuerpo intacto del que derivan son conocidas en la técnica. Por ejemplo, Ward, et al. en "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli," Nature 341: 644-646, describen un método para cribado para obtener una región variable de cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de dominio único H) con afinidad suficiente para su objetivo epítopo para unirse a él en forma aislada.

Como se sabe en la técnica, una secuencia de región variable puede fusionarse a cualquier secuencia de la región constante apropiada.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Muchos vectores están disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

El anticuerpo anti-CD47 en la composición farmacéutica de esta invención se puede producir de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo u homólogo, que incluyen una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido, una secuencia de región constante de inmunoglobulina, y similares. Una secuencia de señal heteróloga seleccionada preferiblemente puede ser una que es reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal de anticuerpo nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o configuración donde se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan normalmente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN son las células procariotas, levadura, o eucariotas superiores. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al, J. Gen Virol 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/- DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (Cv 1 ATc C CCL 70); Células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al, Annals NY Acad Sci 383: 44-68 (1.982)); Células MRC5; Células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped se transforman con la expresión antes descrita o vectores de clonación para la producción de anticuerpos anti-CD47 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La composición de anticuerpos preparada a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, hidroxiapatita cromatografía, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ^y1, ^y2, o ^y4 humanas (Lindmark et al, J. Immunol Meth 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para y3 humana (Guss et al, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinilo)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXTM (JT Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en cromatografía de heparina SEPHAROSE™ en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

Después de cualquier paso de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes pueden someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo utilizando un tampón de delución a un pH entre aproximadamente 2,5 a 4,5, preferiblemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25 M de sal).

Métodos de uso

Los anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos en las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden utilizar en la modulación de la fagocitosis, incluyendo los métodos establecidos en la Solicitud Internacional PCT/US2009/000319 (publicada como WO 2009/091601). Por ejemplo, composiciones de anticuerpos se pueden administrar para aumentar la fagocitosis de las células cancerosas que expresan CD47.

Los anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos en las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar in vitro y in vivo para controlar el curso de la terapia de la enfermedad de CD47. Así, por ejemplo, midiendo el aumento o la disminución en el número de células que expresan CD47, en particular células cancerosas que expresan CD47, se puede determinar si un régimen terapéutico particular destinado a mejorar la enfermedad es eficaz.

Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse in vitro en inmunoensayos en los que pueden ser utilizados en fase líquida o unidos a un soporte en fase sólida. Además, los anticuerpos monoclonales en estos inmunoensayos pueden marcarse de forma detectable de varias maneras. Ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos monoclonales de la invención son citometría de flujo, por ejemplo, FACS, MAC^s, inmunohistoquímica, inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto; y similares. La detección de los antígenos usando los anticuerpos monoclonales de la invención puede hacerse utilizando inmunoensayos que se ejecutan ya sea en el avance, retroceso, o simultáneo, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras fisiológicas. Los expertos en la técnica conocerán, o pueden discernir fácilmente, otros formatos de inmunoensayos sin experimentación excesiva.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden unir a muchos portadores diferentes y utilizarse para detectar la presencia de células que expresan CD47. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales, o serán capaces de determinarlos, usando experimentación de rutina.

Existen muchos marcadores diferentes y métodos de marcaje conocidos por los expertos normales en la técnica, que encuentran uso como trazadores en métodos terapéuticos, para el uso en métodos de diagnóstico, y similares. Para fines de diagnóstico una etiqueta puede ser covalente o no covalentemente unido a un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo, incluyendo fragmentos que consisten en o que comprenden las secuencias de CDR. Ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden utilizar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, y compuestos bioluminescentes. Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para la unión a los anticuerpos monoclonales de la invención, o serán capaces de determinarlos, usando experimentación de rutina. Además, la unión de estos marcadores a los anticuerpos monoclonales de la invención se puede hacer usando técnicas estándar comunes para los expertos normales en la técnica.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento del mismo está unido a una nanopartícula, por ejemplo, para su uso en formación de imágenes. Nanopartículas útiles son las conocidos en la técnica, por ejemplo incluyendo, sin limitación, Raman-sílice-O-Ro-nanopartícula (R-Si-Au-NP). El R-Si-Au-PN constan de una molécula orgánica Raman, con una firma espectral de banda estrecha, adsorbida sobre un núcleo de oro. Debido a que la molécula orgánica Raman se puede cambiar, cada nanopartícula pueden llevar su propia firma, lo que permite que múltiples nanopartículas puedan detectarse de forma independiente al mismo tiempo por multiplexación. Toda la nanopartícula está encapsulada en una cáscara de sílice para mantener la molécula orgánica Raman en la Nanocore dorado. (PEG)-ilación de polietilenglicol opcional de R-Si-Au-PN aumenta su biodisponibilidad y ofrece "asas" funcionales para la fijación de restos diana (véase Thakor et al (2011) Sci Transl Med 3 (79): 79ra33;. Jokerst ^{et al (2011) Small 7 (5): 625-33; Gao et al (2011) Biomaterials 32 (}8^{): 2141-8)..}

CD47 se puede detectar por los anticuerpos monoclonales de la invención cuando está presente en fluidos biológicos y en los tejidos, in vivo o in vitro. Cualquier muestra que contenga una cantidad detectable de CD47 puede utilizarse. Una muestra puede ser un líquido tal como orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, sangre, suero y similares, o un sólido o semisólido tal como tejidos, heces y similares, o, alternativamente, un tejido sólido tales como los comúnmente utilizados en el diagnóstico histológico.

Otra técnica de etiquetado que puede resultar en una mayor sensibilidad consiste en acoplar los anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular. Estos haptenos pueden detectarse después específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es común usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenol, piridoxal o fluoresceína, que puede reaccionar con anticuerpos anti-hapteno específicos.

Como cuestión de conveniencia, el anticuerpo en la composición farmacéutica de la presente invención se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, otros aditivos pueden incluirse tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

Las formulaciones terapéuticas que comprenden uno o más anticuerpos de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables (Pharmaceutical Sciences 16a edición de Remington, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de soluciones acuosas. La composición de anticuerpo se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero particular a tratar, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo a administrarse se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir la enfermedad asociada CD47.

La dosis terapéutica puede ser al menos aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,05 pg/kg de peso corporal; al menos aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0,5 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2,5 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, y no más de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal. Se entenderá por un experto en la técnica que tales directrices se ajustarán para el peso molecular del agente activo, por ejemplo, en el uso de fragmentos de anticuerpos, o en el uso de conjugados de anticuerpos. La dosis puede variarse también para la administración localizada, por ejemplo, intranasal, inhalación, etc., o para la administración sistémica, por ejemplo, im, ip, iv, y similares.

El anticuerpo no necesita ser, pero está opcionalmente formulado con uno o más agentes que potencian la actividad, o que de otra manera aumenta el efecto terapéutico. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con vías de administración tal como se utiliza anteriormente en esta memoria o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

Los vehículos, excipientes o estabilizantes no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como cloruro de amonio de octadeciidimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalkonio, cloruro de bencetonio; fenol, butilo o bencilo alcohol; parabenos de alquilo tales como metilo o propilo parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); bajo peso molecular ^{(menos de aproximadamente}10 ^{cuotas residentes) polipéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina,}o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteínas Zn); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEENTM, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli (metacrilato de metilo) de microcápsulas, respectivamente, en fármacos coloidales sistemas de entrega (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Pharmaceutical Sciences 16a edición de Remington, Osol, A. Ed. (1980).

El anticuerpo anti-CD47 se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el anticuerpo anti-CD47 se administra convenientemente mediante infusión de pulsos, particularmente con dosis decrecientes de anticuerpo.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos, de la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

También se describe aquí un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, tubos, botellas, viales, jeringas y de prueba. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-CD47. La etiqueta en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso.

EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos ordinarios en la técnica una exposición y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), Pero algunos errores y desviaciones experimentales deberían tenerse en cuenta. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cerca de atmosférica.

Ejemplo 1

La clonación y la generación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 humana

Se describe aquí la clonación, la construcción y expresión de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47 humana a partir de una línea celular de hibridoma de ratón que secretan B6H12, un anticuerpo de bloqueo funcional dirigido contra CD47 humana, el ARN total se preparó y se convirtió en ADNc usando oligonucleótidos Igespecíficos. Fragmentos de ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera se aislaron y secuenciaron. Los genes quiméricos después se construyeron mediante la vinculación de los fragmentos de ADNc de la región V murina a regiones constantes de inmunoglobulina humana. Por análisis FACS competitivo, B6H12 quimérico inhibe la unión del anticuerpo de ratón nativo B6H12 a CD47, lo que demuestra que los anticuerpos quiméricos B6H12 y de ratón reconocen el mismo epítopo de CD47. Por otra parte, hemos diseñado y construido un anticuerpo humanizado B6H12 por injerto de CDR. El anticuerpo humanizado B6H12 mostró unión comparable de CD47 a la de B6H12 quimérico. Ambos anticuerpos quiméricos y humanizados B6H12 permiten la fagocitosis de las células cancerosas in vitro. Anticipamos que los anticuerpos quiméricos y humanizados sean menos inmunogénicos que el anticuerpo de ratón nativo cuando se administra a pacientes humanos como parte de la terapia anti-cáncer.

Hemos identificado y validado expresión preferencial de células madre de la leucemia de CD47 usando anticuerpos monoclonales específicos de antígeno. CD47 es una proteína transmembrana ampliamente expresada; Sin embargo, se encontró que CD47 fue más altamente expresado en LMA LSC que sus homólogos normales, y que el aumento de expresión CD47 predijo peor supervivencia global en tres cohortes independientes de pacientes de LMA de adultos. CD47 sirve como ligando para proteína alfa reguladora de señal (SIRPa), que se expresa en células fagocíticas, incluyendo macrófagos y células dendríticas, que cuando se activa inicia una cascada de transducción de señales que resulta en la inhibición de la fagocitosis. Cuando se utilizó un anticuerpo monoclonal dirigido contra el bloqueo de CD47, que preferentemente activa la fagocitosis de la LMA LSC y se inhibe su injerto in vivo. Por otra parte, el tratamiento de ratones injertados por LSC LMA humanos con LMA reducida por anticuerpo anti-CD47 y LMA LSC. Estos resultados establecen una base para los anticuerpos monoclonales anti-CD47 como monoterapia o terapia combinada para LMA y otros tipos de cáncer.

Aquí se presenta el aislamiento, síntesis, y la generación de un anticuerpo monoclonal quimérico de IgG1 humana derivado de anticuerpos de B6H12 y un anticuerpo B6H12 humanizado por ingeniería por injerto de CDR. Se describe la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos y humanizados compuestos de los ADNc que ^{codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera fusionadas a y}1 ^{humana y regiones constantes k,}respectivamente. La introducción de estos genes en células de mamífero como resultan en la producción de anticuerpos quiméricos y humanizados funcionales capaces de unir CD47 humana y causan la fagocitosis de las células diana.

Materiales y métodos

La clonación de anticuerpo V y secuenciación. La estrategia de clonación utilizada aquí implicó el aislamiento inicial de ARN a partir de células de hibridoma (Qiagen), y preparación de ADNc. Secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal B6H12 se obtuvieron utilizando técnicas 5'RACE-PCR (Clontech) y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de ADN estándar.

La construcción de anticuerpo quimérico B6H12/hIgG1. Con el fin de construir las regiones variables de cadena pesada y ligera de B6H12 en un vector de expresión, se utilizaron los siguientes cebadores:

Cebador de sentido VH,

5' CAGACCCGTCGACATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTT 3'

Cebador de antisentido VH,

5' GCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACC 3'

Cebador de sentido VL,

5' CGCCATCACAGATCTATGGTGTCCACTTCTCAGCTCCTTGGACTT 3'

Cebador de antisentido VL,

5' TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCCACCGAA 3'.

PCR se realizó usando polimerasa de pfu ADN clonada (Invitrogen). Estos productos de PCR se cortaron por Sall/NheI para la VH y BgIII/BsiWI para VL y se ligaron en un vector de expresión que codifica gamma humana 1 y regiones constantes kappa que fue digerido por Sall/NheI o BgIII/BsiWI, respectivamente. Todas las construcciones se secuenciaron para confirmar la fidelidad de secuencia.

Modelado Molecular. Humanización de anticuerpos de ratón anti-CD47 B6H12 se llevó a cabo mediante la instalación de residuos de CDR del anticuerpo de ratón en secuencias marco de línea germinal humana (FR). Brevemente, ratón B6H12 se humanizó por el reclutamiento juicioso de los correspondientes residuos de CDR y algunos residuos de FR en las secuencias humanas. Las diferencias entre el ratón B6H12 y los residuos de f R humanos se modelaron de forma individual para investigar su posible influencia en la conformación de CDR. Genes humanizados VH y VL fueron sintetizados por McLab (South San Francisco, CA).

La transfección celular y el establecimiento de línea celular estable. Las líneas celulares estables que expresan B6H12 quimérico o humanizado se establecieron mediante transfección de la construcción de expresión en células CHOS utilizando reactivo de transfección DMRIEC (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Tres días más tarde, se seleccionaron las células transfectadas en virtud de 500 ug/ml G418. Clones estables se aislaron mediante dilución limitada en placas de 96 pocillos. Para examinar clones resistentes a G418 para determinar su capacidad para secretar anticuerpos, los sobrenadantes de las células transfectadas se ensayaron mediante ELISA. Brevemente, placas de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con anticuerpo gamma Fc anti-humano de cabra 1 ug/ml en PBS durante 16 horas a 4°C. Después de bloquearse durante 1 h con 0,4% de BSA en PBS a temperatura ambiente, se añadieron sobrenadantes aislados en 1/3 de diluciones secuenciales, y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas fueron posteriormente lavadas tres veces y se incubaron con anticuerpo kappa específico anti-humano de cabra conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se desarrollaron con OPT. La reacción se detuvo con 2M H2SO4, y OD se midió a 520 nM. Los clones positivos se expandieron más allá y la expresión se confirmó mediante ELISA.

Purificación de anticuerpos y la caracterización. El sobrenadante del cultivo se aplicó a columnas SEPHAROSE de proteína G. La columna se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 8,0, y después la proteína se eluyó con tampón de elución (glicina pH 2,0). Las fracciones eluidas se recogieron en tubos que contenían tampón de neutralización (2 M Tris-HCl, pH 8,0) para ajustar el pH a aproximadamente 7,0. Finalmente, las muestras purificadas se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS). La pureza de la fracción de anticuerpo eluido se analizó por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en 10% de geles en condiciones reductoras o no reductoras. Las bandas se visualizaron por tinción con azul brillante de Coomassie.

La especificidad de unión por ELISA. Las placas de microtitulación se recubrieron con 100 pl de proteína de fusión CD47-Fc humana purificada en 1,0 pg/ml en PBS, y después se bloquearon con 100 pl de 0,4% de BSA en PBS. Las diluciones del anticuerpo B6H12 quimérico o humanizado se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Un anticuerpo anti-CD47 murino conocido se utilizó como control positivo, y la IgG1 humana fue utilizada como un control de isotipo. Las placas se lavaron con PBS/Tween y después se incubaron con un reactivo secundario-kappa específico de cabra anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se revelaron con sustrato de TPO, y se analizaron a una DO de 520 nm.

La especificidad de unión por FACS. Células YB2/0 que habían sido transfectadas de manera estable con CD47 humana se incubaron con diversas cantidades de B6H12 quimérico, B6H12 humanizado, o un anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano en hielo durante 1 hr. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS (PBS que ^{contiene 0,5% de BSA y 0,05% NaN}3^{). Anticuerpo anti-humano de cabra marcado PE se añadió como anticuerpo}secundario, y las muestras se incubaron en hielo durante 1 hora más. Las muestras fueron lavadas y analizadas utilizando un FACSAria (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).

Ensayo de unión competitivo por FACS. Inhibición de unión del anticuerpo quimérico B6H12 para CD47 humana por el anticuerpo B6H12 de ratón o un anticuerpo de control de isotipo se midió utilizando FACS. Se recogieron las células YB2/0 CD47 transfectadas y se lavaron dos veces con tampón FACS (PBS que contiene 0,5% ^{de BSA y 0,05% NaN}3^{). A continuación se añadió B6H12 quimérico a las células a una concentración final de 1} ug/ml con diversas cantidades de anticuerpo B6H12 ratón o un anticuerpo de control de isotipo y se incubó durante 1 ^{hora en hielo. Del mismo modo, la inhibición de unión del anticuerpo B}6^H12 ^{de ratón para c D47 humana se midió}mediante la adición de diversas cantidades de B6H12 quimérico o un anticuerpo de control de isotipo. Las muestras se lavaron con tampón de FACS, se añadió anticuerpo anti-humano o anti-ratón de cabra marcado con PE, y las muestras se incubaron en hielo durante 1 hora más. Las muestras fueron lavadas y analizadas utilizando un FACSAria (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).

En ensayos in vitro de la fagocitosis. Células HL-60 fueron CFSE-etiquetadas y se incubaron con macrófagos derivados de médula ósea de ratón en presencia de 10 pg/ml de control de isotipo IgG1, B6H12 de ratón, B6H12 quimérico o anticuerpo B6H12 humanizado por 2 hr. Las células fueron después analizadas por ^{microscopía de fluorescencia para determinar el índice de fagocitosis (número de células ingeridas por}100 macrófagos). El análisis estadístico utilizando la prueba t de Student se realizó con GraphPad Prism.

Resultados

La clonación de las regiones variables de ratón B6H12. El uso de cebadores universales de anticuerpos, los clones que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera se aislaron con éxito a partir de un hibridoma anti-CD47 B6H12. Múltiples clones de cada producto de gen V se secuenciaron para controlar los errores inducidos por PCR. Las secuencias VH y VL se muestran en la Fig. 1A y B, respectivamente. Análisis de la secuencia de ADN de los productos demostró que la cadena pesada de B6H12 utiliza un segmento V de la familia VH5 Igh-v7183, y que la cadena ligera pertenece al subgrupo IGKV23. La región variable de la cadena pesada comprende CDR1, CDR2, y CDR3 de secuencias; y la región variable de la cadena ligera comprende CDR1, CDR2, y CDR3 de secuencias (Figura 1).

La producción y caracterización de anticuerpos quiméricos B6H12. Para construir el vector de expresión para el anticuerpo B6H12 quimérico, la región variable de cadena pesada de B6H12 que incluye su secuencia de ^{péptido señal nativo en el terminal NH}2 ^{se fusionó a la región constante de la y}1 ^{humana de cadena pesada y}después se clonaron en un vector de expresión de mamífero. Del mismo modo, la región variable de cadena ligera ^{de B}6^H12 ^{que incluye su secuencia de péptido señal nativo en el terminal NH}2^{se fusionó a la región constante de}cadena ligera humana k y se introdujo en el vector que codifica la cadena pesada B6H12. A continuación, el vector de expresión único resultante se transfectó en células de mamífero. El anticuerpo quimérico B6H12 expresado se purificó y se examinó por análisis de SDS-PAGE. Como era de esperar, una única banda con una masa molecular de ~150 kDa se observó en condiciones no reductoras (Figura 2). Después de la reducción con 2-mercaptoetanol, dos bandas aparecieron a 50 kDa y 25 kDa, que corresponde a las cadenas pesada y ligera, respectivamente. Estos resultados indican que péptidos de cadena pesada y ligera quiméricos producidos en el transfectante se ensamblan para formar la molécula de IgG nativa.

Para demostrar que regiones variables B6H12 clonadas a partir del hibridoma de ratón retienen la actividad ^{de unión al antígeno similar a la del anticuerpo original de ratón B}6^H12^{, un ensayo de unión a competición entre}B6H12 quimérico y de ratón se llevó a cabo por citometría de flujo. CD47 humana se transfectó de forma estable en células YB2/0 y la expresión de CD47 se confirmó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 3A, B6H12 quimérico superó B6H12 de ratón para la unión de una manera dependiente de la dosis CD47, mientras que un anticuerpo de control de isotipo IgG1 humano no tuvo ningún impacto sobre la unión de B6H12 de ratón. De manera similar, el anticuerpo B6H12 de ratón inhibió anticuerpo B6H12 quimérico para CD47 de unión (Figura 3B). Esto sugiere que el anticuerpo quimérico B6H12 reconoce el mismo epítopo de CD47 como el anticuerpo B6H12 de ratón nativo.

Diseño y análisis de anticuerpo B6H12 humanizado. Para seleccionar los marcos de anticuerpos humanos (FR) para ser utilizados como plantillas para el injerto de CDR, las regiones de ratón B6H12 VL y VH se compararon con las de las secuencias de la línea germinal humana. Se ha encontrado las FR de la región VL de ratón B6H12 tienen la más alta homología con el subgrupo VK3 humano, lo que sugiere que un miembro del subgrupo III podría ser la mejor selección. Las FR de la región V^hdel ratón B6H12 exhiben la más alta homología con el subgrupo VH-3 humano. Las FR de VH humano-3-7 y VK3-11 finalmente fueron seleccionados como punto de partida para el diseño de B6H12 humanizado. Los residuos en las FR idénticas a las secuencias de ratón se retuvieron y residuos no idénticos fueron bien retenidos o sustituidos basándose en el modelado molecular. El B6H12 humanizado se transfectó y se purificó como se describe anteriormente. El análisis de SDS-PAGE mostró una única banda con una masa molecular de -150 kDa en condiciones no reductoras (Figura 2), y dos bandas aparecieron en 50 kDa y 25 kDa en condiciones reductoras. Las secuencias se muestran en la Figura 4.

A continuación, se examinó la capacidad de B6H12 humanizado para reconocer CD47 humano. Células humanas YB2/0 transfectadas por CD47, que han mostrado que expresan CD47 unido a la membrana, se utilizaron para la análisis de citometría de flujo. CD47 unido a B6H12 humanizado expresado en la superficie celular, y la actividad de unión era equivalente a la del anticuerpo quimérico B6H12 (Figura 5). No se detectó la unión con anticuerpos B6H12 cuando se utilizaron células YB2/0 no transfectadas. También se obtuvieron resultados similares en la determinación de la unión de CD47 soluble por ELISA. En este ensayo, B6H12 humanizado mostró actividad ^{de unión comparable a la del anticuerpo quimérico B6H12 (Figura}6^{) .}

Activación de la fagocitosis por los anticuerpos quiméricos y humanizados B6H12. Se sabe que el anticuerpo de ratón B6H12 bloquea la interacción entre CD47 y SIRPa, un receptor inhibidor expresado en los macrófagos, y permite así la fagocitosis de las células de expresión de CD47. Para examinar la capacidad de los anticuerpos quiméricos y humanizados B6H12 para permitir la fagocitosis, se realizó un ensayo de fagocitosis in vitro. CFSE marcado con células HL-60 se incubaron con macrófagos derivados de médula ósea de ratón durante 2 horas en presencia de control o anticuerpo B6H12 nativo, quimérico o humanizado. La fagocitosis se evaluó contando el número de células diana HL-60 marcadas con CFSE ingeridas dentro de los macrófagos de ratón visualizados por microscopía de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 7, B6H12 tanto quiméricos como humanizados activan eficazmente la fagocitosis, a niveles comparables a los del anticuerpo B6H12 de ratón nativo. En contraste, un anticuerpo de control de isotipo no provocó la fagocitosis mediada por macrófagos. Estos resultados demuestran que B6H12 quimérico y humanizado son capaces de funcionar de una manera similar a la del anticuerpo B6H12 de ratón nativo.

Hasta el momento los anticuerpos generados contra CD47 humana han sido los anticuerpos de ratón. Una desventaja importante de la utilización de un anticuerpo de ratón en el tratamiento de pacientes humanos es el desarrollo de una respuesta anti-ratón humana (RARH) en el paciente. En consecuencia, existe la necesidad de mejorar los anticuerpos terapéuticos contra CD47 que son menos inmunogénicos. En el presente estudio, hemos construido y expresado los anticuerpos quiméricos y humanizados de ingeniería de las regiones variables de un CD47 mAb de ratón anti-humano (B6H12), que se fusiona a regiones constantes de inmunoglobulina humana. El análisis por SDS-PAGE reveló que los anticuerpos B6H12 tanto quiméricos como humanizados se expresan como proteínas de IgG nativos compuestas de dos pares de cadenas pesadas y ligeras. Anticuerpos B6H12 quiméricos y de ratón compitieron entre sí por la unión a antígeno (Figura 3), lo que indica que el anticuerpo B6H12 quimérico conserva la unión del anticuerpo de ratón del antígeno y reconoce el mismo epítopo del antígeno. Además, el anticuerpo humanizado se une a B6H12 tanto soluble como de membrana CD47 unido de manera equivalente a la ^{del anticuerpo quimérico (Figuras 5 y}6^{). B6H12 quiméricos y humanizados también mostraron capacidad eficiente}para permitir la fagocitosis en comparación con el anticuerpo B6H12 original de ratón (Figura 7). Estos resultados sugieren que nuestros anticuerpos manipulados forman IgG funcionalmente activos.

En particular, en la humanización de anticuerpos B6H12, hemos utilizado VH-3-7 y VK3-11 humanas como base de nuestro diseño. Sin embargo, el ratón B6H12 también mostró homología de secuencia con otros miembros de la familia en los subgrupos de VH-3 y VK3 humanos y de otros dominios variables fuera de estos dos subgrupos. Es posible que otros marcos puedan funcionar igual de bien.

Los anticuerpos presentan cuatro principales funciones efectoras: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), la fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y la vida media/velocidad de deliminación. Cada una de estas funciones efectoras es mediada a través de la interacción con un conjunto específico de los receptores y tipos de células: CCDA y la fagocitosis a través de la interacción de mAbs unidos por células con receptores Fc gamma (F^cyR), CDC través de la interacción de mAbs unidos a las células con la serie de proteínas solubles de la sangre que constituyen el sistema de complemento (por ejemplo, C1q, C3, C4, etc.), y la vida media/tasa de deliminación a través de la unión de anticuerpos para el receptor Fc neonatal (FcRn). Anticuerpos de activación, típicamente de la subclase IgG1 humano, son dependientes en un dominio Fc de activación. Los anticuerpos monoclonales que funcionan mediante el bloqueo de una interacción ligando-receptor, sin embargo, pueden funcionar sin la utilización de mecanismos efectores. En estos casos, las funciones efectoras pueden ser desventajosas, ya que pueden contribuir a la citotoxicidad no deseada. Agonismo no deseado mediante la reticulación por las células que expresan FcR podría desencadenar la activación inapropiada de células que expresan FcR y la posterior tormenta de citocinas y los efectos tóxicos asociados. Por lo tanto, se requiere la elección adecuada de la subclase IgG o el uso de una IgG diseñada para abrogar la función efectora. Como se informó anteriormente, B6H12 murino funcionó como un anticuerpo bloqueante, y un fragmento B6H12 F(ab)'2 mostró una eficacia similar a B6H12 murino de longitud completa en ensayos de fagocitosis in vitro. Así, el desarrollo de anticuerpos monoclonales de B6H12 de no activación con menos efectos secundarios es beneficioso.

Se han reportado muchas estrategias para diseñar anticuerpos de no-activación. El uso de fragmentos basados en anticuerpos que carecen de un dominio Fc ofrece la forma más sencilla de evitar mecanismos efectores Fc-dependientes. Desde un punto de vista de la fabricación, los fragmentos basados en anticuerpos representan una estrategia atractiva al obtenerse altos rendimientos de manera rutinaria en sistemas de expresión eucariotas y procariotas inferiores bien caracterizados y rentables. Tecnologías de anticuerpo recombinante han hecho ^{disponibles formatos monovalentes (por ejemplo, Fab, scFv, nanocuerpos, y dAb), bivalentes (por ejemplo, F(ab')}2^,diacuerpos, y minicuerpos) y multivalentes (por ejemplo, triacuerpos y pentacuerpos). Estos enfoques ya han dado lugar a terapias aprobadas de FDA, y varios otros están en proceso de evaluación clínica, que ilustra la confianza en este enfoque. Sin embargo, la eliminación del dominio Fc cambiará drásticamente las propiedades farmacocinéticas de fragmentos basados en anticuerpos y hará menos conveniente la purificación de anticuerpos. Sin un dominio Fc, el aclaramiento renal es el mecanismo predominante que influye en la vida media en suero y fragmentos basados en anticuerpos menores que -50 a 70 kDa están sujetos a esta vía de deliminación. El aumento del tamaño molecular aparente de pequeños fragmentos de anticuerpos, por ejemplo a través de la vinculación con polietilenglicol (PEG) y la albúmina de suero humano (HSA), representa una estrategia alternativa para aumentar el tiempo de circulación y mejorar sus propiedades farmacocinéticas.

Combinaciones de anticuerpos terapéuticos se utilizan cada vez más que pueden traer el beneficio adicional de orientación hacia múltiples epítopos o antígenos. Las combinaciones pueden ser más eficaces contra determinadas enfermedades que son comúnmente heterogéneas y por lo tanto pueden limitar la resistencia o escapar. Hemos demostrado la sinergia y la curación con B6H12 en combinación con rituximab en modelos humanos de xenotrasplante NHL. Nuestra investigación sugiere que la terapia de combinación con B6H12 es una nueva modalidad de tratamiento prometedor para el linfoma no Hodgkin. Mientras tanto, en los últimos años, el concepto de anticuerpo biespecífico (BsAb) mediado por destrucción de células tumorales se ha estudiado ampliamente tanto en modelos preclínicos como ensayos clínicos. BsAbs comparten dos restos de reconocimiento de antígeno diferentes dentro de una molécula. Sobre la base de nuestros datos, B6H12 se sinergiza con anticuerpos FcR de acoplamiento adicionales para eliminar las células diana. Esta sinergia puede ser recapitulada en reactivos B6H12 BsAbs con CD47 en una mano y un antígeno de superficie adicional en una célula diana del tumor en el otro. Tal reactivo puede centrar funciones efectoras inmunes hacia las células diana.

En resumen, hemos desarrollado anticuerpos terapéuticos sobre la base de anticuerpo B6H12 monoclonal de ratón dirigido contra CD47 humana, mediante el uso de métodos para crear un anticuerpo quimérico humano/de ratón y un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos B6H12 quiméricos y humanizados conservan la capacidad de unir CD47 específicamente y son capaces de inducir la fagocitosis in vitro. Estos anticuerpos pueden ser menos inmunogénicos, y por lo tanto son más adecuados como potenciales agentes terapéuticos clínicos.

Ejemplo 2

^{Clonación regiones variables 5F9 y}8^B6 ^{de ratón}

El uso de cebadores de anticuerpos universales, fragmentos de ADN que codifican las regiones variables ^{de cadena pesada y ligera fueron clonadas exitosamente a partir de hibridomas anti-CD47 5F9 y}8^B6^{. Múltiples}clones de cada producto de gen V fueron secuenciados para controlar los errores inducidos PCR. Las secuencias VH y VL de 5F9 se muestran en la Fig. 9A y 9B, respectivamente. El análisis de la secuencia de ADN de los productos demostró que la cadena pesada de 5F9 utiliza un segmento V de la familia VH1 Igh-VJ558, y que la ^{cadena ligera pertenece al subgrupo IGKV1. Las secuencias VH y VL de}8^B6 ^{se muestran en la Fig. 10A y 10B, respectivamente. análisis de la secuencia de ADN de los productos demostró que la cadena pesada de}8^B6 ^utilizaun segmento V de la familia VH1 Igh-VJ558, y que la cadena ligera pertenece al subgrupo IGKV23. Las regiones variables de cadena pesada comprenden secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3; y las regiones variables de cadena ligera comprenden secuencias c DR1, CDR2, y CDR3 (Figuras 9 y 10).

^{Actividades de unión CD47 de 5F9 y}8^B6 ^{quiméricos. 5F9 y}8^B6 ^{quiméricos se construyeron y se}expresaron. Los anticuerpos purificados se analizaron por SDS-PAGE, que demuestra que se formaron anticuerpos ^{IgG nativos para ambos. Después, las actividades de unión de 5F9 y}8^B6 ^{quiméricos se sometieron a pruebas}ELISA mediante el recubrimiento de proteína soluble CD47 humana en las placas de 96 pocillos. Como se muestra ^{en la figura 11, tanto 5F9 como}8^B6 ^{quiméricos unieron el antígeno a niveles comparables al del anticuerpo B6H12}quimérico.

La humanización de anticuerpos y caracterización de 5F9. Con el fin de seleccionar las regiones marco del anticuerpo humano (FR) para utilizarse como plantillas para el injerto de CDR, las regiones 5F9 VL y VH de ratón se compararon con las de las secuencias de la línea germinal humana. Se ha encontrado que las FR de la región 5F9 VL de ratón tienen la más alta homología con el subgrupo IGKV2. Las FR de la región 5F9 VH de ratón mostraron la más alta homología con el subgrupo VH-1 humano. Los residuos idénticos en las FR se retuvieron y residuos no idénticos fueron bien retenidos o sustituidos en base al modelado molecular. Tres versiones de cada VH y VL humanizado fueron diseñadas. Los alineamientos de secuencias de cada versión junto con secuencias de la línea ^{germinal humana se indican en la figura}12^.

Versiones diferentes de cadenas pesada y ligera humanizadas 5F9 se transfectaron en combinaciones, para proporcionar diferentes versiones de 5F9 humanizado. A continuación, se examinó la capacidad de los anticuerpos humanizados 5F9 para reconocer CD47. Como se muestra en la figura 13, tanto en la versión 1 como en la versión 2 de 5F9 humanizado se unió bien a CD47 soluble. El anticuerpo de control de isotipo no mostró ninguna actividad de unión. Estos resultados demuestran que 5F9 humanizado retuvo una capacidad de unión al antígeno CD47 humano.

^{La fagocitosis inducida por anticuerpos 5F9 y}8^B6^{. Se sabe que el anticuerpo B6H12 bloquea la interacción}entre CD47 y SIRPa que se expresa en los macrófagos y a su vez activa los macrófagos para respuesta fagocítica. ^{Para examinar la capacidad de los anticuerpos 5F9 y}8^B6 ^{para inducir la fagocitosis, se incubaron los anticuerpos}con los macrófagos derivados de la sangre periférica humana y células diana HL-60 durante 2 hr, y se evaluó la

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado aislado que se une específicamente a la CD47 humana, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene cada una de las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 20-22 y una cadena ligera que tiene cada una de las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO:23-25, y en donde la composición farmacéutica está en forma de una solución acuosa.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha cadena ligera comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de VL de 5F9 de ratón expuesta en la Figura 12B (SEQ ID NO:19),

(ii) la secuencia de aminoácidos de hu5F9-vl1 expuesta en la Figura 12B (SEQ ID NO:41),

(iii) la secuencia de aminoácidos de hu5F9-vl2 expuesta en la Figura 12B (SEQ ID NO:42), o

(iv) la secuencia de aminoácidos de hu5F9-vl3 expuesta en la Figura 12B (SEQ ID NO:43).

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha cadena pesada comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de VH de 5F9 de ratón expuesta en la Figura 12A (SEQ ID NO:18),

(ii) la secuencia de aminoácidos de hu5F9-vh1 expuesta en la Figura 12A (SEQ ID NO:36),

(iii) la secuencia de aminoácidos de hu5F9-vh2 expuesta en la Figura 12A (SEQ ID NO:37), o

(iv) la secuencia de aminoácidos de hu5F9-vh3 expuesta en la Figura 12A (SEQ ID NO:38).

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, el anticuerpo comprendiendo una cadena ligera como se expone en la reivindicación 2 y una cadena pesada como se expone en la reivindicación 3.

5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado de longitud completa.

6^{. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, el anticuerpo teniendo una región constante de IgG1, IgG2a,}IgG2b, IgG3, IgG4 o IgA humana.

7. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo es un fragmento ^{de anticuerpo, y en donde el fragmento de anticuerpo es opcionalmente un fragmento F(ab')}2 ^{o F(ab).}

8^{. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo no activa CD47}tras la unión.

^{9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a}8^{, en donde el anticuerpo es un anticuerpo}monoclonal humanizado o un anticuerpo monoclonal quimérico.