ES2929422T3 - Procedimiento y sistema para mediciones de cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un método y un sistema para una medición rápida de la fluorescencia cinética en un cribado de alto rendimiento con una alta resolución de tiempo usando una placa de microtitulación con una base transparente con una pluralidad de depresiones de prueba, un sistema de medición que está dispuesto sobre la placa de microtitulación. placa para agregar líquido simultáneamente en múltiples depresiones de prueba, un sistema de iluminación debajo de la placa de microtitulación, siendo dicho sistema de iluminación adecuado para iluminar simultáneamente las múltiples depresiones de prueba a través de la base transparente, y un sistema de detección que es adecuado para detectar simultáneamente la radiación electromagnética de múltiples o todas las depresiones de prueba, en las que por depresión de prueba se agregan 0,5 - 300 μl de líquido del sistema de medición en las múltiples depresiones de prueba simultáneamente dentro de 5 - 200 ms a una presión que varía de 0,5 bar a 2 bar, las múltiples depresiones de prueba están encendidas simultáneamente a través de la base transparente por el sistema de iluminación antes o en el mo ment comienza la adición, y la radiación electromagnética de múltiples o todas las depresiones de prueba se detecta simultáneamente con un retraso de 1 - 1000 ms entre los puntos de medición individuales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento y sistema para mediciones de cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal
La invención se refiere a un procedimiento y un sistema para mediciones de cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal.
La identificación y el desarrollo de nuevos fármacos tienen como objetivo identificar compuestos químicos que modulen procedimientos bioquímicos como la unión de ligandos, los cambios conformacionales macromoleculares o las reacciones enzimáticas. Normalmente, el cribado de alto rendimiento (HTS) se usa para probar un gran número de estructuras químicas, dado que la miniaturización garantiza la realización de pruebas rápidas, rentables y eficaces.
Las pruebas basadas en la fluorescencia son probablemente los enfoques más importantes para HTS debido a su alta sensibilidad y automaticidad. Además de seguir el cambio de fluorescencia provocado por una reacción enzimática, las técnicas de marcado se utilizan para determinar las interacciones proteína-proteína o la unión de ligandos mediante la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) o la polarización de fluorescencia (FP).
Muchos procedimientos biológicos, especialmente la unión de pequeños ligandos, se caracterizan por una cinética muy rápida que requiere procedimientos de mezcla rápida.
Sin embargo, los instrumentos que utilizan formatos de placa con 384 o 1536 pocillos de ensayo suelen estar limitados en términos de resolución temporal, en los que la determinación de la cinética de unión rápida se limita a procedimientos de bajo rendimiento. Incluso el enfoque de cribado de los instrumentos equipados con un multidispensador (véase González, J. E., y Maher, M. P. (2002) Cellular Fluorescent Indicators and Voltage/Ion Probe Reader (VIPR TM ): Tools for Ion Channel and Receptor Drug Discovery, Receptors and Channels 8, 283-295; Mori, T., Itami, S., Yanagi, T., Tatara, Y., Takamiya, M., y Uchida, T. (2009) Use of a Real-Time Fluorescence Monitoring System for HighThroughput Screening for Prolyl Isomerase Inhibitors, Journal of Biomolecular Screening 14, 419-424; Schroeder, K. S., y Neagle, B. D. (1996) FLIPR: A NewInstrument for Accurate, High Throughput Optical Screening, Journal of Biomolecular Screening 1, 75-80; Anónimo: "FLUOStar Omega - The Microplate Reader for life science research", 1 de noviembre de 2016 (2016-11-01), Seiten 1-6, XP055449967.), que mejora considerablemente la resolución temporal, se limita principalmente al dominio temporal de los segundos.
Esto también es cierto para el dispositivo del documento JPH10197449. La citada memoria describe un dispositivo para medir la luz de las reacciones que se producen en los pocillos de una placa de microtitulación. El dispositivo tiene un sistema de punta-pistón que extrae el reactivo de un depósito y luego lo dosifica en los pocillos de una placa de microtitulación transparente. El reactivo interactúa con la muestra en el pocillo respectivo y la luz fluorescente emitida por cada muestra. Para la excitación de la fluorescencia, las muestras en los pocillos de la placa de microtitulación se iluminan con un iluminante a través del fondo transparente de la placa de microtitulación. Una cámara de vídeo capta una imagen de la placa de microtitulación y una unidad de procesamiento determina la intensidad de fluorescencia de cada muestra.
Otro dispositivo se conoce del documento de patente GB2353093 que desvela un dispositivo para manipular muestras líquidas, en el que el dispositivo comprende una pluralidad de capilares huecos, cada uno de los cuales está abierto en ambos extremos y tiene un volumen interno definido. El dispositivo comprende una carcasa que mantiene los capilares en su orientación deseada, en la que los capilares sobresalen en un espacio interior de la carcasa y sobresalen en sus extremos opuestos en un espacio exterior. La disposición puede usarse para estudios fotométricos, de modo que una superficie del líquido en cada capilar se ilumina con luz y la luz transmitida se mide en la otra superficie del capilar.
Los procedimientos de mezcla rápida conocidos en el estado de la técnica son dispositivos de flujo continuo o detenido.
En los experimentos de flujo continuo, la reacción se estudia en condiciones de flujo de equilibrio en función de la distancia aguas abajo del mezclador. Las mejoras en el diseño de los mezcladores han dado lugar a tiempos muertos del orden de 100 ps o incluso menos (Regenfuss, P., Clegg, R. M., Fulwyler, M. J., Barrantes, F. J., y Jovin, T. M. (1985) Mixing liquids in microseconds, Rev. Sci. Instrumento. 56, 293-290 Shastry, M. C. R., Luck, S. D., y Roder, H. (1998) A Continuous-Flow Capillary Mixing Method to Monitor Reactions on the Microsecond Time Scale, Biophysical Journal 74, 2714-2721;Roder, H., Maki, K., Cheng, H., y Ramachandra Shastry, M. C. (2004) Rapid mixing methods for exploring the kinetics of protein folding, Methods 34, 15-27.). Sin embargo, para lograr una mezcla eficaz, se requieren caudales elevados y dimensiones de canal relativamente grandes, lo que consume grandes cantidades de material.
En los instrumentos de flujo detenido disponibles en el mercado, los reactivos se alimentan a través de dos jeringas utilizando un gatillo neumático. Tras el llenado de la celda de observación, el flujo se detiene bruscamente cuando la jeringa de parada choca con un bloque de parada. Los instrumentos pueden alcanzar rutinariamente tiempos muertos de unos pocos milisegundos (Dickson, P. N., y Margerum, D. W. (1986) Extension of accessible first-order rate constants and accurate dead-time determinations for stopped-flow spectroscopy, Analytical Chemistry 58, 3153-3158 Nakatani, H., y Hiromi, K. (1980) Analysis of signal amplitude in stopped-flow method for enzyme-ligand systems,
Journal of Biochemistry 87, 1805-1810 Peterman, B. F. (1979) Measurement of the dead time of a fluorescence stopped-flow instrument, Analytical Biochemistry 93, 442-444).
Tanto los dispositivos de flujo continuo como los de flujo detenido son procedimientos de bajo rendimiento limitados a una cubeta o a un canal. Sin embargo, se requiere un procedimiento de mezcla rápida para probar múltiples inhibidores y concentraciones, ya que la determinación de las reacciones de unión rápida o de la cinética enzimática desempeña un papel fundamental en la identificación y el desarrollo de nuevos fármacos. Para observar cinéticas rápidas en placas de microtitulación, se desarrolló un nuevo procedimiento basado en un instrumento de imagen para la detección de cinéticas rápidas que combina una alta resolución temporal con el rendimiento de un sistema altamente paralelizado. Esto permite, por primera vez, la aplicación eficaz de la cinética rápida a la identificación y el desarrollo de nuevos fármacos.
De los documentos ES 102004016361 A1 y WO 03/100398 A1 se conoce un dispositivo de medición analítica óptica para realizar mediciones de fluorescencia en placas de microtitulación. Las placas de microtitulación tienen un fondo transparente. Los haces de excitación y detección se dirigen hacia el fondo transparente de la placa de microtitulación. Encima de las placas de microtitulación hay un dispositivo dispensador o de pipeteo para la adición de líquido durante las mediciones en continuo de la emisión de las muestras de la placa de microtitulación.
La idea básica de la invención de los documentos ES 10 2004 016 361 A1 y WO 03/100398 A1 se basa en la consideración de que para un alto rendimiento de muestras con un gran número de muestras individuales en placas de microtitulación, la excitación de las muestras individuales así como el registro de la emisión y, si es necesario, la adición de líquidos deben tener lugar simultáneamente y, si es posible, la emisión (fluorescencia o luminiscencia) de todas las muestras de la microplaca puede ser detectada permanentemente durante un período de tiempo más largo por medio de un registrador de imágenes (por ejemplo, una cámara intensificada).
El documento US 2014/0005078 A1 desvela un dispositivo en el que la luz de cada pocillo de una placa de microtitulación se lee a través de guías de luz y luego se descompone espectralmente. Un detector detecta un intervalo específico de longitudes de onda del espectro.
Para los ensayos en biología celular, en los que la cinética de una reacción de fluorescencia debe medirse a menudo después de la adición de una sustancia farmacológicamente activa, el dispositivo de medición analítica cumple el requisito de que la emisión de las muestras se mida antes, durante y después de la adición de la sustancia, midiendo todos los pocillos simultáneamente. Si la excitación por fluorescencia y la detección de la emisión de la placa de microtitulación se llevan a cabo desde abajo, las sustancias y/u otros líquidos pueden añadirse desde arriba de acuerdo con se desee, también simultáneamente en varios pocillos o pueden añadirse diferentes sustancias y/u otros líquidos en momentos definidos y en diferentes cantidades o concentraciones sin contacto y observarse continuamente. Especialmente para el régimen HTS, la llamada ventaja multiplex puede ser obtenida por esta medición paralela por medio de una cámara CCD y por lo tanto se puede lograr un alto rendimiento de la muestra a pesar de un tiempo de medición significativamente mayor por pocillo.
Con el analizador óptico de los documentos DE 10 2004 016 361 A1 y WO 03/100398 A1 se puede lograr un alto rendimiento de la muestra, pero este no está diseñado para las mediciones de intensidad con una resolución de tiempo de menos de 1 segundo, como se requiere para la elucidación de la cinética rápida en ciertos procedimientos biológicos, como la unión de pequeños ligandos.
La solución al problema planteado consiste en el procedimiento para mediciones rápidas y cinéticas en el cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal de acuerdo con la reivindicación 1.
También es un objetivo de la invención proporcionar un sistema para mediciones cinéticas rápidas en el cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal de acuerdo con la reivindicación 8.
La placa de microtitulación tiene preferentemente 384 o 1536 pocillos de ensayo.
Dispositivo de dosificación
El dispositivo de dosificación comprende una carcasa que tiene al menos una cámara de presión, una abertura de suministro para suministrar líquido a la cámara de presión, y una pluralidad de pasajes entre la cámara de presión y un exterior de la carcasa, en la que cada uno de los pasajes tiene un tubo con un primer extremo que se proyecta en la cámara de presión y un segundo extremo que se proyecta fuera de la carcasa en el exterior.
La cámara de presión tiene preferentemente una extensión mayor en una dimensión espacial que en las otras dos dimensiones espaciales. El eje longitudinal de la cámara de presión corre en la dirección de la extensión mayor. El eje longitudinal de la cámara de presión corre paralelo al exterior de la carcasa al mismo tiempo. En una realización preferente, la cámara de presión es cilíndrica o cúbica. Los pasajes están situados en una de las paredes de la cámara de presión, en paralelo al eje longitudinal de la misma. Preferentemente, los pasajes están dispuestos en paralelo entre sí. Hay al menos dos pasajes. Los pasajes pueden estar dispuestos en una o varias filas paralelas al eje longitudinal de la cámara de presión. Hay preferentemente 12, particularmente preferentemente 24 o 48 pasajes por
fila. Lo ideal es que el número de pasajes por fila se adapte al número de pocilios de una fila de la placa de microtitulación (lado largo) en la que se realiza la dosificación por el dispositivo de dosificación.
Los tubos son preferentemente capilares de metal o de plástico, es decir, tubos finos en los que se produce el efecto de capilaridad con los líquidos utilizados. Deben tener un diámetro interior del orden de 0,1 mm a 0,8 mm, preferentemente de 0,2 mm a 0,6 mm. El diámetro exterior puede estar en el intervalo de 0,35 mm a 2 mm, preferentemente de 0,6 mm a 1,1 mm. La longitud de los tubos está en el intervalo de 6 mm a 15 mm, preferentemente de 8,5 mm a 13 mm, más preferentemente de 10 mm a 13 mm.
Los tubos están dispuestos verticalmente (90°) o en un ángulo en el intervalo de 40° a < 90° con respecto al exterior de la carcasa, dependiendo de si el líquido debe ser dispensado verticalmente desde arriba en el pocillo de la placa de microtitulación, o dispensado o inyectado en un ángulo en la pared lateral del pocillo.
Para aumentar la hidrofobicidad de los tubos situados en el exterior de la carcasa, pueden estar recubiertos, preferentemente de plástico, por ejemplo de teflón.
Los tubos capilares sobresalen con un extremo dentro de la cámara de presión y con el otro extremo fuera de la carcasa
En una realización, la abertura de suministro del líquido está situada en una de las paredes dispuestas perpendicularmente al eje longitudinal de la cámara de medición. La carcasa puede tener además una abertura de ventilación por la que se expulsa el aire cuando la cámara de dosificación está llena de líquido. Esta abertura de ventilación puede estar situada en una de las paredes dispuestas perpendicularmente al eje longitudinal de la cámara de medición.
La cámara de presión puede tener un área de sección transversal del orden de 60 mm2 a 300 mm2 o un diámetro del orden de 4 mm a 10 mm, preferentemente del orden de 5,5 mm a 6,5 mm.
La carcasa del dispositivo de dosificación también puede tener más de una, por ejemplo, dos, tres o cuatro, cámaras de presión, cuyos ejes longitudinales son paralelos entre sí. Cada cámara de presión tiene un puerto de alimentación separado para alimentar el líquido en la cámara de presión y cada cámara de presión tiene una pluralidad de pasajes entre la cámara de presión y el exterior de la carcasa con los pasajes y tubos correspondientes. Preferentemente, los pasajes y tubos de las diferentes cámaras de presión están dispuestos en paralelo entre sí. En función de las necesidades, también pueden disponerse varios recintos con una o varias cámaras de presión, uno al lado del otro y en paralelo.
Debido al gran volumen de la cámara de presión combinado con los tubos cortos que sobresalen en la cámara de presión, no hay gradiente de presión y por lo tanto es posible una dosificación muy rápida y cuantitativamente precisa del líquido. Se hace posible la dosificación paralela, precisa y rápida en el intervalo de pl en, por ejemplo, placas de microtitulación 384 o 1536.
Además del dispositivo de dosificación, el sistema de dosificación tiene un depósito de líquido que está conectado a la abertura de suministro del dispositivo de dosificación a través de una línea. La presión en el depósito de líquido hace que el líquido sea bombeado desde el depósito de líquido a la cámara de presión. Para ello, el depósito de líquido se cierra a prueba de presión de la atmósfera circundante y se conecta a una bomba que genera la presión necesaria. En el caso de múltiples cámaras de presión, el puerto de alimentación de cada cámara de presión puede estar conectado al mismo o a diferentes depósitos de líquido.
El tiempo de conmutación de la válvula entre el depósito de líquido y la abertura de suministro, en combinación con la presión de la bomba, puede utilizarse para controlar la cantidad de líquido que entra en la cámara de presión y se dispensa a través de los tubos individuales en cada ciclo de conmutación (paso abierto/cerrado).
En una realización de la invención, el líquido del depósito de líquido está a una presión en el intervalo de 50 kPa (0,5 bar) a 200 kPa (2 bar) preferentemente en el intervalo de 50 kPa (0,5 bar) a 85 kPa (0,85) bar en la válvula y la válvula tiene un tiempo de conmutación en el intervalo de 5 ms a 200 ms (5-60 ms para placas de microtitulación con 1536 pocillos, 40-200 ms para placas de microtitulación con 384 pocillos), preferentemente en el intervalo de 5 ms a 50 ms.
El tiempo de conmutación de la válvula y la presión a través de la bomba se ajustan de manera que el volumen de dosificación del dispositivo de dosificación esté en el intervalo de 0,3 y 300 pl por capilar, preferentemente entre 1 y 30 pl.
Iluminación
El sistema de iluminación comprende al menos un par de módulos de luz LED dispuestos en lados opuestos debajo de la placa de microtitulación y que iluminan el fondo transparente de la placa de microtitulación en un ángulo de 20 a 80 grados.
Un módulo de luz LED de acuerdo con la invención se caracteriza porque la emisión máxima se alcanza en menos de 10 pseg tras el inicio de una señal de disparo y el impulso decae de nuevo en < 20 pseg tras el final de la señal de
disparo. Esto permite realizar mediciones cinéticas rápidas. Al mismo tiempo, la disposición óptica permite una iluminación homogénea de la placa de microtitulación.
El módulo de luz LED contiene fuentes de luz LED dispuestas en una o más filas y, opcionalmente, una lente cilíndrica plano-convexa en forma de varilla, que está dispuesta con el lado plano sobre las fuentes de luz LED de tal manera que la radiación de las fuentes de luz LED entra en la lente cilíndrica por el lado plano y sale de la lente cilíndrica por el lado convexo.
El número de fuentes de luz LED puede oscilar entre 12 y 36.
Preferentemente, las fuentes de luz LED están dispuestas en una placa LED y la placa LED está conectada térmicamente a un disipador de calor.
Puede haber un filtro de extinción entre las fuentes de luz LED y la lente cilíndrica, y un vidrio protector o filtro polarizador entre el filtro de extinción y la lente cilíndrica.
En una realización preferente, las fuentes de luz LED son fuentes de luz LED de alta potencia en el intervalo de longitudes de onda visibles (VIS) o UV, preferentemente en el intervalo de longitudes de onda de 340 nm a 800 nm. Para ciertas aplicaciones, se puede utilizar más de un par de módulos de luz LED o se pueden utilizar múltiples módulos de luz LED. Si los diferentes módulos de luz l Ed tienen diferentes longitudes de onda, la excitación de la fluorescencia puede tener lugar en varias longitudes de onda simultáneamente.
Dos pares de módulos de luz LED pueden estar dispuestos cada uno en lados opuestos debajo de la placa de microtitulación e iluminar el fondo transparente de la placa de microtitulación en el mismo o en diferentes ángulos. Dos o más pares de módulos de luz LED pueden estar dispuestos cada uno a diferentes distancias de la placa de microtitulación en los mismos lados de la placa de microtitulación y cada uno ilumina el fondo transparente de la placa de microtitulación con diferentes ángulos de iluminación.
Preferentemente, los dos módulos de luz LED de un mismo par están dispuestos en lados opuestos debajo de la placa de microtitulación y, además, uno o dos módulos de luz LED adicionales están dispuestos más centrados debajo de la placa de microtitulación, de modo que la luz emitida por estos módulos de luz LED adicionales incide en el fondo transparente de la placa de microtitulación con un ángulo mayor respecto al plano de la placa de microtitulación que la luz de los módulos de luz LED del par.
Una aplicación de los módulos de luz LED con diferentes longitudes de onda es el campo de la optogenética. La optogenética significa que las células modificadas genéticamente son controladas por la luz con la ayuda de proteínas sensibles a la luz. Una longitud de onda se usa para activar estas proteínas e influir en los procedimientos celulares. Para poder observar estos procedimientos, se usa otra longitud de onda para excitar la emisión de fluorescencia para la medición de fluorescencia de un sensor o tinte correspondiente.
Detección
La luz emitida se detecta en ángulo recto con el fondo de la placa de microtitulación.
El sistema de detección puede colocarse en el centro de la placa de microtitulación y recibir la luz emitida directamente, y/o la luz emitida se dirige al sistema de detección a través de los correspondientes espejos de desviación, o divisores de haz dicroicos.
La detección de la luz emitida puede tener lugar en diferentes longitudes de onda simultáneamente.
El sistema de detección es adecuado para detectar la radiación electromagnética de varios o todos los pocillos de ensayo simultáneamente con un intervalo de tiempo de 1 - 1000 ms entre los puntos de medición individuales. Figuras y ejemplos
Figura 1 Dos dispositivos de dosificación con dos cámaras de dosificación en vista en perspectiva
Figura 2 Dispositivo de dosificación con dos cámaras de dosificación en vista en perspectiva con estructura interna
Figura 3 Dispositivo de dosificación en vista lateral
Figura 4 Sección ampliada del dispositivo de dosificación en vista lateral (lado de la válvula)
Figura 5 Sistema de dosificación con depósito de líquido
Figura 6 Módulo de luz LED en vista en perspectiva
Figura 7 Módulo de luz LED en vista en despiece ordenado
Figura 8 Módulo de luz LED en sección transversal
Figura 9 Módulo de luz LED en sección longitudinal
Figura 10 Emisión de LED para señales de disparo de diferentes longitudes
Figura 11 Instrumento de medición de imágenes (detección monocanal)
Figura 12 Instrumento de medición de imágenes (detección de dos canales)
Figura 13 Perfil de emisión de una placa de microtitulación con 1536 pocillos de ensayo
Fig. 14 A-C Medición de la cinética de unión del ANS a la BSA con el instrumento de medición de imágenes
La Fig. 1 muestra una vista en perspectiva de dos dispositivos de dosificación 10 paralelos de acuerdo con la invención, cada uno con dos cámaras de presión. En las figuras 2 a 4 se muestran otras vistas de un dispositivo de dosificación. Cada dispositivo de dosificación 10 tiene una carcasa 2 cuboide con dos orificios tubulares de 4-10 mm de diámetro y 120-140 mm de longitud. Estos orificios forman dos cámaras de presión paralelas 5. Cada orificio tiene un extremo abierto que forma la abertura circular de alimentación 6. El extremo opuesto está abierto para el llenado y vaciado del sistema y cerrado herméticamente durante la operación de dosificación. Aquí se encuentra el orificio de salida o de ventilación 3. Las carcasas 2 se fijan a un soporte 7 con el lado en el que se encuentra la abertura de suministro 6 de forma que sobresalen horizontalmente del soporte 7. El soporte 7 tiene un hueco para cada abertura de suministro 6. En la parte inferior de la carcasa saliente 2 hay una fila de hasta 48 pasajes entre cada cámara de presión 5 y la parte inferior de la carcasa 2, en la que en cada uno de los pasajes hay un tubo capilar 4 de acero inoxidable preferentemente que se proyecta con su primer extremo en la cámara de presión 5 y con su segundo extremo fuera de la carcasa 2 en la parte inferior. Los tubos capilares tienen un diámetro interior de 0,1 a 0,8 mm y están dispuestos verticalmente. Las secciones de los tubos que sobresalen de la parte inferior de la carcasa 2 están revestidas de forma hidrofóbica (preferentemente con teflón).
La Fig. 3 muestra una vista lateral del dispositivo de dosificación 10. La sección circular A se muestra ampliada en la Fig. 4. En la Fig. 4 se observa que los tubos capilares 4 se proyectan en la cámara de presión hasta la mitad de su altura. Esto ha demostrado ser especialmente ventajoso para la dosificación uniforme.
La Fig. 5 muestra el sistema de dosificación de acuerdo con la invención. La cámara de presión 5 (no visible en la carcasa 2) del dispositivo de dosificación 10 está conectada a través de una línea 71, una válvula 72 y otra línea 70 a un líquido situado en un recipiente de almacenamiento. El aire ambiente a una presión de 80 kPa (0,8 bar) se introduce en el recipiente de almacenamiento a través de una bomba 66 de membrana y una línea de presión 68. En lugar de aire ambiente, también se puede utilizar otro gas como el N2. En lugar de una bomba de membrana, también se puede utilizar otro sistema de suministro de presión. Las electroválvulas con bajo volumen de espacio muerto y cortos tiempos de conmutación, como las vendidas por Parker Hannifin Corp., Cleveland, OH 44124 Ee . UU., han demostrado ser válvulas adecuadas.
Las Figs. 6 - 9 muestran varias vistas de un módulo de luz LED 610. La Fig. 6 muestra el módulo de luz LED 610 en vista en perspectiva. El módulo de luz LED 610 tiene una carcasa 612 con un fondo 615 y dos paredes laterales y una cubierta frontal de la carcasa 613 con una abertura de entrada de aire de refrigeración. El lado abierto de la carcasa 612 opuesto al fondo 615 está cerrado por un soporte de vidrio protector 617 y un vidrio protector 616. El vidrio protector 616 puede ser sustituido por un filtro de polarización en caso de mediciones de polarización. Una lente cilíndrica plano convexa en forma de varilla puede montarse sobre el vidrio protector 616 y el soporte de vidrio protector 617 con el lado plano orientado hacia el vidrio protector 616 o el soporte de vidrio protector 617. Frente a la cubierta frontal de la carcasa 613, la posición del ventilador para la entrada de aire de refrigeración se encuentra en el lado abierto y extendido de la caja. Las conexiones eléctricas 618 se encuentran por encima de la posición del ventilador 614.
En el interior de la carcasa 612 hay un disipador de calor 632 sobre el que se montan las conexiones eléctricas 618 por un lado y la placa de LED 630 por otro. La placa de LED 630 puede comprender una o dos filas paralelas de 12 a 36 LED 631, preferentemente una fila de 24 LED 631. Los LED 631 están dispuestos de manera que irradien hacia arriba en la imagen durante el funcionamiento. Por encima de los LED 631, el filtro de excitación 622 se encuentra en el soporte del filtro 623. La carcasa está cerrada por el vidrio protector 616 y el soporte del vidrio protector 617. Un imán de sujeción 636 y un transpondedor RFID 634 están situados en el fondo de la carcasa 615. También podría montarse en una pared lateral.
Para las mediciones descritas a continuación, se utilizó un módulo de luz LED 610 con LED 631 del tipo LuxeonRebel de Philips. Otros LED 631 adecuados para el mismo uso son, por ejemplo:
• Osram: Golden DRAGON Plus, OSLON SSL 80/150, Platinum Dragon
• CREE: XLampXPC, XLampXRC, Xlamp7090XRE, XLampXPE,
• Nichia: NCU133A, NCSU034B, NCSU033B
La potencia de emisión de estos LED es de 100-2000 mW dependiendo de la longitud de onda.
Las Figs. 10 a) a d) muestran mediciones del curso temporal de la emisión del LED para señales de disparo 660 de diferentes longitudes. Una señal de disparo 660 de diferente longitud se aplica a cada uno de los LED 631 de la placa de circuito 630 a través de las conexiones 618. Dependiendo de la longitud de la señal de disparo 660, se consigue una emisión de LED de diferente intensidad y longitud. El eje x 666 muestra el tiempo en unidades de 5 pseg.
En la Fig. 10 a), se muestra la emisión del LED para una señal de disparo 660 de 2 ps de duración. La emisión de los LED comienza sólo después de un tiempo muerto de 5 pseg tras el inicio de la señal de disparo 660 y alcanza el 60% de la potencia máxima de emisión.
En la Fig. 10 b), se muestra la emisión del LED para una señal de disparo 660 de 5 ps de duración. La emisión del LED 662 sólo se inicia tras un tiempo muerto de 5 pseg después del inicio de la señal de disparo 660 y alcanza el 70% de la potencia máxima de emisión.
En la Fig. 10 c), se muestra la emisión del LED para una señal de disparo 660 de 8 pseg de duración. La emisión de los LED se inicia sólo después de un tiempo muerto de 5 pseg tras el inicio de la señal de disparo 660 y alcanza el 100% de la potencia máxima de emisión.
En la Fig. 10 d), se muestra la emisión del LED 64 para una señal de disparo 660 de 14 pseg de duración. La emisión de los LED se inicia sólo después de un tiempo muerto de 5 pseg tras el inicio de la señal de disparo 660 y alcanza el 100% de la potencia máxima de emisión.
El tiempo de retardo entre el inicio de la señal de disparo 660 y la máxima potencia de emisión de los LED 631 del módulo es de aproximadamente 8 pseg. 17 pseg después del final de la señal de disparo 660, la emisión del LED ha decaído completamente. La intensidad del LED puede controlarse mediante la modulación de ancho de pulso o el control de corriente.
A continuación, las Figs. 11 y 12 describen el funcionamiento de un sistema para mediciones cinéticas rápidas en el cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal.
La dosificación del líquido con los reactivos se realiza desde la parte superior de la placa de microtitulación de fondo transparente 60 situada en una bandeja de posicionamiento de placas de microtitulación 62. La dosificación se combina con la iluminación desde la parte inferior oblicua y la detección con las cámaras adecuadas desde la parte inferior. El progreso de una reacción se rastrea registrando simultáneamente el perfil de fluorescencia de una fila de 48 pocillos de ensayo de la placa de microtitulación 60. El sistema de dosificación y de iluminación están diseñados y controlados de tal manera que esta disposición permite la observación del procedimiento cinético, lo que incluye el tiempo de dosificación y de mezcla.
La dosificación se realiza con la ayuda de un sistema de dosificación. El dispositivo de dosificación 10 forma parte de este sistema de dosificación. El líquido 65 de un recipiente de almacenamiento 64 que contiene el reactivo que se va a probar se bombea a través de una válvula 72 a la cámara de dosificación 5 (no mostrada) del dispositivo de dosificación (Fig. 5). Los tubos capilares 4 tienen una abertura (= diámetro interior) de ~ 800 pm, lo que permite la dosificación paralela en 48 pocillos de ensayo de la placa de microtitulación (Fig. 5). Para conseguir condiciones de mezcla de alta turbulencia, la orientación de las salidas de dosificación de los tubos 4 está especialmente adaptada a las placas de microtitulación con 384 y 1536 pocillos de ensayo. Los mejores resultados de mezcla en placas de microtitulación con 384 pocillos de ensayo se obtuvieron dispensando el reactivo en diagonal sobre las paredes de la placa de microtitulación. Por el contrario, el menor volumen de dosificación requerido para las placas de microtitulación 60 con 1536 pocillos de ensayo se dispensa verticalmente, como se muestra en la Fig. 5. El tiempo de conmutación de la válvula, y por tanto el volumen a dosificar, se define mediante una función de calibración (lineal o polinómica de 3er orden) almacenada para cada presión a utilizar. Un soporte de placa de microtitulación 62 preciso garantiza la alineación óptima y reproducible del dispositivo de dosificación 10 con los pocillos de la placa de microtitulación 60.
La iluminación homogénea del fondo de la placa de microtitulación 60 se consigue mediante un par de módulos de luz LED 610 con 12 a 36 fuentes de luz LED de alta potencia (UV o VIS) 631 dispuestas en filas y alineadas en diagonal a la placa (Figs. 11, 12 y 7). Los LED 631 utilizados suministran luz de excitación 92 en el intervalo de longitudes de onda de 340 a 800 nm y los filtros de extinción mejoran la selectividad de la longitud de onda transmitiendo un intervalo de longitudes de onda seleccionado. La luz fluorescente emitida 94 es detectada en un ángulo de 90° por una cámara 82 de dispositivo de acoplamiento de carga de electrones retroiluminados (EMCCD) o de dispositivo de acoplamiento de carga intensificada (iCCD), rápida y altamente sensible. La cámara 82 está equipada con filtros de interferencia 84 y puede estar equipada adicionalmente con filtros de polarización 85.
La detección de fluorescencia con 2 cámaras 82 y un espejo divisor de haz 90 permite la detección simultánea de dos señales de emisión, como es necesario, por ejemplo, para las mediciones de transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET), transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) o polarización de fluorescencia (FP).
Es posible ampliar el sistema de medición mostrado en las Figs. 11 y 12 añadiendo más unidades de iluminación LED dispuestas debajo de las unidades LED mostradas con un ángulo de iluminación modificado. Si estas unidades LED adicionales tienen una longitud de onda diferente a la de las unidades LED originales, la excitación de la fluorescencia puede producirse en varias longitudes de onda simultáneamente.
La representación en falso color de la emisión de una placa de microtitulación con 1536 pocillos de ensayo que contienen solución fluorescente se muestra como ejemplo en la Fig. 13. Los datos de los pocillos de ensayo se recogen capturando y visualizando hasta 1.000 puntos por segundo por pocillo de prueba y se procesan mediante un software de procesamiento de datos personalizado.
Prueba de rendimiento
Un procedimiento utilizado rutinariamente para investigar el rendimiento de un dispositivo de mezcla rápida es observar una reacción de prueba rápida. Para los estudios de fluorescencia, se sigue adecuadamente la unión del colorante hidrofóbico ácido 1-anilino-8-naftalenosulfónico (ANS) a la albúmina de suero bovino (BSA), lo que se asocia a un gran aumento del rendimiento de fluorescencia. La cinética de fluorescencia para diferentes concentraciones de BSA se ajusta a funciones exponenciales y se extrapola a una fluorescencia inicial común. Este punto común proporciona la fluorescencia del ANS en ausencia de BSA en el momento inicial (tü) de la reacción. El intervalo de tiempo desde este punto hasta el primer punto de datos que cae en la curva exponencial ajustada proporciona una estimación del tiempo muerto de la medición. La Fig. 14 A-C muestra la cinética de fluorescencia corregida a diferentes concentraciones de BSA medidas en el instrumento de medición de imágenes con el dispositivo de dosificación de cinética rápida de acuerdo con la invención.
Después de 55 ms, se añadieron 1,6 pl de solución de ANS a través de un circuito de válvula capilar de 9 ms a una microplaca de 1536 pocillos de ensayo que contenía BSA (Fig. 14A). El circuito de la válvula capilar se indica con la barra gris. La unión del ANS a la BSA provoca un aumento de la fluorescencia del ANS registrada a 460 nm (paso de banda 60 nm) tras la excitación a 365 nm (paso de banda 36 nm). Las soluciones de ANS y BSA se prepararon en fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5). Concentración final: 5 pM de ANS y 1,9 (círculos abiertos), 2,5 (círculos llenos), 3,4 (triángulos invertidos), 7,9 (cuadrados) y 10,6 pM (triángulos) de BsA (Fig. 14A).
El tiempo inicial de la reacción de unión se determinó mediante ajustes exponenciales dobles y extrapolación de la cinética de fluorescencia al tiempo inicial común t0. La cinética de fluorescencia (tomada de la Fig. 14 A) se corrigió a este tiempo inicial fe (Fig. 14 B). Las líneas continuas muestran las funciones exponenciales dobles extrapoladas al tiempo común a.
Hay que tener en cuenta que fe de la reacción no es equivalente al tiempo de conmutación de la válvula, sino que se retrasa por la entrada y mezcla de los reactivos en los pocillos de ensayo. El tiempo muerto del instrumento, implementado por el tiempo desde hasta el primer punto correctamente determinado en la curva exponencial ajustada, se basa en el tiempo de dosificación y los artefactos de mezcla. Cuando hay 3pl de líquido en los pocillos de ensayo de una placa de microtitulación y se dosifica un pequeño volumen de 1,6 pl en los 1536 pocillos de ensayo de estas placas de microtitulación, se puede conseguir un tiempo muerto de unos 10 ms, que se aproxima a la resolución temporal de los instrumentos comerciales de flujo detenido de unos pocos milisegundos.
Las trazas de fluorescencia detectadas (Fig.14B) muestran un nivel de ruido muy bajo, lo que indica la alta calidad de los datos cinéticos. La Fig.14C muestra un gráfico de las constantes de velocidad aparente de unión determinadas a partir de las trazas cinéticas en función de la concentración de BSA. Se pudo demostrar una fase de unión lenta (círculos llenos) y otra rápida (círculos abiertos). La dependencia lineal de la fase de unión con cinética lenta de la concentración de BSA confirma la exactitud y fiabilidad de las trazas determinadas. Las constantes de velocidad observadas (negro) se compararon con los datos obtenidos por un aparato convencional de flujo detenido (rojo). Las constantes de velocidad aparente, así como las constantes de velocidad de segundo orden determinadas a partir de la dependencia de la concentración de la fase de unión lenta, están en excelente acuerdo con los datos obtenidos por adición en un aparato de flujo detenido en una sola cubeta.
Números de referencia:
10 Dispositivo de dosificación
1 Válvula
2 Carcasa
3 Abertura de salida/ventilación
4 Tubo
5 Cámara de presión
6 Abertura de suministro
Soporte
Revestimiento
Placa de microtitulación
Soporte de placa de microtitulación
Recipiente de almacenamiento
Líquido
Bomba
Línea de presión
Línea
Línea
Válvula
Cámara
Filtro de emisiones
Filtro de polarización
Divisor de radiación
Luz de excitación
Luz fluorescente
Módulo de luz LED
Carcasa
Cubierta frontal de la caja con abertura de entrada de aire de refrigeración Posición del ventilador para la entrada de aire de refrigeración
Fondo de la carcasa
Vidrio protector o filtro de polarización
Soporte de vidrio protector
Conexión eléctrica
Lente cilíndrica
Filtro de excitación
Soporte del filtro
Tablero LED
LED
Disipador de calor
Transpondedor RFID
Imán de sujeción
Señal de disparo
Curva de tensión de la emisión del LED en la Fig. 10 b)
Curva de tensión de la emisión del LED en la Fig. 10 d)
Eje temporal en la Fig. 10
A Eje de corte para la Fig. 8
B Eje de corte para la Fig. 9
Claims (15)
1. Procedimiento de medición de cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal que comprende las etapas:
a. suministrar
i. una placa de microtitulación (60) que tiene un fondo transparente con una pluralidad de pocillos de ensayo, ii. un sistema de dosificación dispuesto por encima de la placa de microtitulación para la adición simultánea de líquido a una pluralidad de pocillos de ensayo; en el que el sistema de dosificación comprende un dispositivo de dosificación (10) y el dispositivo de dosificación comprende una carcasa (2) con al menos una cámara de presión (5), que tiene una abertura de suministro (6) para el suministro de líquido en la cámara de presión (5) y que tiene una pluralidad de pasajes entre la cámara de presión (5) y un exterior de la carcasa (2), en la que un tubo (4) está situado en cada uno de los pasajes con su primer extremo proyectándose hacia la cámara de presión (5) y con su segundo extremo proyectándose hacia el exterior de la carcasa (2);
iii. un sistema de iluminación debajo de la placa de microtitulación (60) capaz de iluminar simultáneamente los múltiples pocillos de ensayo a través del fondo transparente; y
iv. un sistema de detección capaz de detectar la radiación electromagnética procedente de varios o todos los pocillos de ensayo simultáneamente a través del fondo transparente.
b. añadir 0,3 - 300 pl de líquido por pocillo de prueba desde el sistema de dosificación a los múltiples pocillos de ensayo simultáneamente en un plazo de 5-200 ms a una presión en el intervalo de 50 kPa (0,5 bar) a 200 kPa (2 bar).
c. Iluminar los múltiples pocillos de ensayo simultáneamente a través del fondo transparente con el sistema de iluminación con iluminación que comienza antes o desde el momento del inicio de la adición;
d. detectar la radiación electromagnética de varios o todos los pocillos de ensayo simultáneamente con un intervalo de tiempo de 1 - 1000 ms entre los puntos de medición individuales.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de dosificación es adecuado para añadir líquido a 24 o 48 pocillos de ensayo simultáneamente.
3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la adición del líquido por el sistema de dosificación se realiza a una presión en el intervalo de 50 kPa (0,5 bar) a 85 kPa (0,85 bar), preferentemente a 80 kPa (0,8 bar).
4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la adición del líquido por el sistema de dosificación tiene lugar en diagonal o en paralelo a las paredes laterales de los pocillos de ensayo de la placa de microtitulación.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la iluminación es proporcionada por una pluralidad de módulos de luz LED (610) que tienen diferentes longitudes de onda, para activar las proteínas fotosensibles y/o estimular una medición de fluorescencia.
6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los módulos de luz LED comprenden fuentes de luz LED (631) y, preferentemente, comprenden también filtros de extinción, en los que las fuentes de luz LED (631) emiten en el intervalo de longitudes de onda de 340 a 800 nanómetros
7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la detección de la luz emitida tiene lugar simultáneamente a diferentes longitudes de onda.
8. Sistema para mediciones cinéticas rápidas en el cribado de alto rendimiento con alta resolución temporal que contiene
a. una placa de microtitulación (60) que tiene un fondo transparente con una pluralidad de pocillos de ensayo, b. Un sistema de dosificación dispuesto sobre la placa de microtitulación (60) para la adición simultánea de líquido a varios pocillos de ensayo;
c. un sistema de iluminación por debajo de la placa de microtitulación (60) capaz de iluminar los múltiples pocillos de ensayo simultáneamente a través del fondo transparente; y
d. un sistema de detección capaz de detectar la radiación electromagnética procedente de varios o todos los pocillos de ensayo simultáneamente a través del fondo transparente;
en el que el dispositivo de dosificación (10) comprende una carcasa (2) que tiene al menos una cámara de presión (5), que tiene una abertura de suministro (6) para el suministro de líquido en la cámara de presión (5) y que tiene
una pluralidad de pasajes entre la cámara de presión (5) y un exterior de la carcasa (2), en el que en cada uno de los pasajes hay un tubo (4) que se proyecta con su primer extremo en la cámara de presión (5) y con su segundo extremo se proyecta fuera de la carcasa (2) en el exterior.
9. Sistema de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque los pasajes de la al menos una cámara de presión (5) discurren en una o dos filas paralelas a un eje longitudinal de la cámara de presión (5) y existen 24 o 48 pasajes por fila.
10. Sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque el sistema de dosificación comprende además un depósito de líquido (64) conectado a través de una línea a la abertura de suministro (6) del dispositivo de dosificación (10), estando el depósito de líquido (64) sellado a prueba de presión de la atmósfera circundante y conectado a una bomba (66).
11. Sistema de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque una válvula (72) está dispuesta entre el depósito de líquido (64) y la abertura de suministro (6) de la cámara de presión (10) y preferentemente tiene un tiempo de conmutación en el intervalo de 5 ms a 200 ms, más preferentemente en el intervalo de 5 ms a 50 ms.
12. Sistema de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el líquido del depósito de líquido se apoya contra la válvula a una presión en el intervalo de 50 kPa (0,5 bar) a 200 kPa (2 bar), preferentemente en el intervalo de 50 kPa (0,5 bar) a 85 kPa (0,85 bar).
13. Sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque el sistema de iluminación comprende un par de módulos de luz LED (610) que comprenden cada uno de 12 a 36 fuentes de luz LED de alta potencia (631) dispuestas en lados opuestos debajo de la placa de microtitulación (60) y que iluminan el fondo de la placa de microtitulación en un ángulo en el intervalo de 20 a 80 grados, en el que las fuentes de luz LED de alta potencia (631) emiten preferentemente en el intervalo de longitud de onda de 340-800 nanómetros y comprenden particularmente preferentemente filtros de extinción.
14. Sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque el sistema de iluminación comprende una pluralidad de módulos de luz LED (610) que tienen diferentes longitudes de onda.
15. Sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado porque la detección de la luz emitida se realiza en ángulo recto con respecto a la parte inferior de la placa de microtitulación (60) y el sistema de detección se coloca centralmente bajo la placa de microtitulación (60).
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