ES2928756T3 - Congelación de material biológico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método de congelación de material biológico ya un aparato de congelación para congelar material biológico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Congelación de material biológico

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un método de congelación de material biológico y un aparato de congelación para congelación de material biológico.

Antecedentes de la invención

La crioconservación de material biológico, tal como, por ejemplo, células, tejido, órganos, productos sanguíneos, embriones, espermatozoides, células madre, huevos de pescado, etc., implica congelar un material biológico a temperaturas suficientemente bajas, de modo que los procesos químicos, que de otro modo pueden dañar el material, se detienen, conservando de este modo el material.

El campo de crioconservación frecuentemente tiene como objetivo no solo congelar los materiales biológicos, sino también retener su viabilidad, es decir, su capacidad para reanudar la función biológica normal después de la descongelación. Cuando se congela un material biológico, el fluido en el interior experimentará una transición de fase durante la cual se pueden formar cristales de hielo. La formación de cristales de hielo puede provocar daño al material biológico, de modo que puede no ser viable después de la descongelación.

Un procedimiento común en la crioconservación es la utilización de los llamados crioprotectores tal como, por ejemplo, DMSO (dimetilsulfóxido, (CH3)2SO)), glicerol y diferentes alcoholes. Los crioprotectores son sustancias que protegen los materiales biológicos durante la congelación al reducir la formación de cristales de hielo. Sin embargo, muchos de los crioprotectores usados son inherentemente tóxicos para el material biológico y se necesitan remover inmediatamente después de la descongelación del material biológico. Por lo tanto, sería preferible crioconservar sin la adición de crioprotectores o de manera alternativa, con menos cantidad de crioprotector.

Un tipo de protocolo estándar usado en un laboratorio celular prescribe colocar los crio-tubos con suspensiones de células que contienen DMSO en un congelador ordinario, por ejemplo, un congelador a -20 °C, durante un período, por ejemplo, 30 minutos. Posteriormente, las muestras se colocan en un congelador a -80 °C o en un recipiente con hielo seco durante un período, por ejemplo, 45 minutos, antes de que las muestras se inserten finalmente en un localizador con nitrógeno líquido para almacenamiento permanente. Este procedimiento se desarrolla en gran medida de manera empírica y se usa con modificaciones menores en diferentes laboratorios que realizan investigaciones in vitro. El método da por resultado una recuperación celular aceptable siempre y cuando se remueva DMSO rápidamente después de la descongelación, ya que de otro modo dañará las células. De manera alternativa, la concentración de crioprotector se reduce a un nivel menos dañino cuando se adiciona medio de crecimiento después de la descongelación.

Una alternativa a la colocación de muestras en un congelador ordinario es hacer uso de un congelador de velocidad controlada, que se puede ajustar para controlar la velocidad de enfriamiento con base en la temperatura dentro del congelador. Usando este dispositivo, frecuentemente se recomienda una velocidad de congelación de -1 °C/min. La crioconservación de material biológico en un congelador de velocidad controlada también implica el uso de crioprotectores como un estándar.

Un factor importante al diseñar los protocolos estándar para crioconservación es la viabilidad, es decir, cuánto del material biológico es viable después de la descongelación.

Un método mejorado de crioconservación, que da por resultado una viabilidad tolerable, sería ventajoso, y en particular un método por el cual no se necesitan crioprotectores para lograr una viabilidad tolerable sería ventajoso.

Cuando el agua líquida se enfría, experimenta una transición de fase de líquido a sólido a una temperatura crítica. La transición de fase es una transición de primer orden, que significa que el agua ya sea absorbe o libera una cantidad de energía por volumen conocida como el calor latente. Durante la transición de fase, la temperatura del agua permanecerá constante conforme se adiciona o remueve el calor y durante este tiempo el agua está en un estado mezclado, donde parte de ella está en estado líquido y parte está en estado sólido. La temperatura a la cual ocurre una transición de fase se puede llamar la temperatura crítica de la transición de fase. Cuando el agua se enfría, la temperatura del agua disminuye hasta que se alcanza la temperatura crítica. En tanto que aún se aplican el enfriamiento, la temperatura del agua permanece constante hasta que se ha removido el calor latente del agua, después de lo cual la temperatura del agua, ahora en estado sólido, vuelve a disminuir. Esto significa que hay una duración de tiempo durante la cual el calor latente se está removiendo del agua.

El inventor ha señalado que la duración de remoción de calor latente durante la congelación es un factor importante en la crioconservación. El tiempo durante el cual se remueve el calor latente en el proceso de congelación es el tiempo cuando se pueden formar cristales de hielo. Cuando se usan protocolos de crioconservación estándar tal como los descritos anteriormente, el inventor ha señalado que la duración de remoción de calor latente es del orden de 20 minutos. Se señala que es preferible una duración más corta de remoción de calor latente para obtener mayor viabilidad del material biológico, que se ha congelado.

En WO 91/01635 también se prefiere una duración más corta de remoción de calor latente. El documento divulga un método, donde se usan diferentes velocidades de extracción de calor; una velocidad se usa en tanto que se pierde calor latente, en tanto que una segunda velocidad y más pequeña, se usa ya sea cuando la temperatura del material comienza a descender nuevamente, es decir, después de que se ha removido el calor latente, o en tanto que se sigue removiendo el calor latente. En la invención divulgada se usan crioprotectores como estándar.

Thurston et al. divulgan un método para congelar esperma de jabalí en suspensión, donde las muestras de esperma de jabalí se suspenden en un amortiguador de congelación que comprende glicerol al 3 % en volumen. Varias de estas pajillas se equiparon con un termopar y sirvieron como pajillas de control, en tanto que los termopares externos se colocaron en el ambiente de pajilla adicional. Todas las pajillas se enfriaron en un congelador de velocidad controlada y las mediciones de temperatura de los termopares dentro de las pajillas de control se compararon con las mediciones realizadas en el área de pajilla adicional. La cantidad de enfriamiento no se controló (THERIOGENOLOGY 2003, 60, 101­ 113).

Hoffmann et al. divulgan que el superenfriamiento de muestras de tejido durante la crioconservación y la liberación consecuente del calor latente puede conducir a un crecimiento dendrítico de cristales de hielo. La liberación de calor latente se sigue por una fuerte caída de temperatura que puede provocar daño a la célula. El calor latente se debe conducir tan rápidamente como sea posible (Biotechnology: Molecular Biomedicine and Stem Cell Research, Annual Report TUM 2005, 1-2).

WO 97/38092 divulga un método para crioconservar células suspendidas en el medio esencial de Chee que comprende DMSO a aproximadamente 11 % en volumen.

El manual de operación “IceCube 14S VAL” (SY-LAB Industries, Austria) divulga un aparato para congelar células donde un operador puede tratar de definir un programa de enfriamiento con base en una muestra de control.

Se han llevado a cabo varios experimentos interesantes por el inventor. Por ejemplo, se llevaron a cabo experimentos en dos tipos de células de mamífero donde se probó el efecto de reducir la duración de remoción de calor latente en la viabilidad. El primer experimento encontró un incremento de 1000 veces en la supervivencia celular determinada por formación de colonias después de congelar un tipo de células vivas en ausencia de un crioprotector cuando el calor latente se removió en 4 minutos en comparación con cuando se removió en 20 minutos. El segundo experimento encontró un incremento pronunciado en la eficiencia de recubrimiento después de la descongelación para ambos tipos de células probadas si el tiempo de formación de hielo se redujo a la mitad de aproximadamente 6 min a aproximadamente 3 min y siempre que no hubiera DMSO presente. La eficiencia de recubrimiento para ambas células que se han congelado con un tiempo de formación de hielo de 2 minutos y 3 minutos fue cercana a la encontrada para las muestras enfriadas con DMSO al 5 % durante 30 minutos en -20 °C, entonces 45 minutos en ~ -80 °C y almacenamiento final en N2 líquido, que es uno de los procedimientos de congelación de laboratorio estándar usados hoy en día.

Objeto de la invención

Se puede ver como un objeto de la invención proporcionar un método para congelar o crioconservar material biológico, preferentemente células humanas o animales.

Se puede ver como otro objeto de la invención proporcionar un aparato para congelar o crioconservación de material biológico, preferentemente células humanas o animales.

Un objeto de la presente invención es superar total o parcialmente las desventajas e inconvenientes anteriores de la técnica anterior.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una alternativa a la técnica anterior.

Sumario de la invención

Por lo tanto, se propone que el objeto descrito anteriormente y varios objetos diferentes se obtengan en un primer aspecto de la invención al proporcionar un método para congelar o crioconservar células humanas y/o animales en suspensión, donde una o más muestras de células humanas y/o animales en suspensión (12) contenidas en uno o más recipientes comprenden uno o más líquidos, el método que comprende:

- controlar la capacidad de enfriamiento de tal manera que se puede regular y controlar el tiempo de transición de fase de una muestra,

- determinar el enfriamiento necesario de modo que el tiempo de transición de fase de una muestra de calibración (11) contenida en un recipiente es una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos;

- enfriar esta una o más muestras (12) de la misma manera como esta muestra de calibración (11) al controlar la cantidad de enfriamiento, de modo que el tiempo de transición de fase de la muestra (11) se regula a una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos,

donde menos de 2 % del crioprotector del volumen de muestra total se adiciona al recipiente que contiene el material biológico (12).

Las células humanas o animales incluyen, pero no se limitan a: células humanas o animales, líneas de células, células primarias, células madre, productos sanguíneos, tal como células sanguíneas, células de tejido, embriones, espermatozoides y huevos de pescado.

Las células humanas o animales (en suspensión) en este documento se referirán indistintamente como muestras biológicas o material biológico.

El material biológico adicional, que se puede congelar usando el método o aparato divulgado en la presente, incluye, pero no se limita a: órganos, virus, bacterias y otros materiales biológicos en general.

Determinar el enfriamiento necesario significa determinar un perfil de enfriamiento, es decir, determinar uno o más parámetros de enfriamiento tal como, pero no limitado a, velocidad de enfriamiento, potencia de enfriamiento, temperaturas de inicio, tiempos de retención y otros parámetros conocidos cuando se enfría.

El enfriamiento de la misma manera significa usar el perfil de enfriamiento determinado.

El tiempo de transición de fase en este documento se referirá indistintamente como el tiempo de remoción de calor latente o tiempo de formación de hielo.

La suspensión es una solución líquida que comprende las células animales o humanas, donde las células representan una fracción muy pequeña del volumen total de la suspensión. El número de células por mililitro en la suspensión está preferentemente en el intervalo de 60.000 a 100.000.000 de células/ml.

Breve descripción de las figuras

La presente invención y realizaciones preferidas de la misma se describirán ahora en más detalle con respecto a las figuras anexas. Las figuras muestran formas de implementar la presente invención y no se va a interpretar como que se limitan a otras realizaciones posibles que se encuentran dentro del alcance del conjunto de reivindicaciones adjunto.

La figura 1 es una gráfica que muestra una curva de enfriamiento habitual para agua. Las secciones de la curva se equipan con líneas rectas y demuestran un método para determinar el tiempo de transición de fase, que se detalla en la descripción. La figura 2 es una ilustración de una placa de enfriamiento con una muestra que se va a enfriar.

La figura 3 es una ilustración de una placa de enfriamiento con otra muestra que se va a enfriar.

La figura 4 es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende dos placas, que pueden cerrarse entre sí. La figura 5 es una ilustración del dispositivo de enfriamiento de la figura 4, donde las placas se cierran entre sí.

La figura 6A es una ilustración de otro dispositivo de enfriamiento que comprende dos placas, que pueden cerrarse entre sí.

La figura 6B es una ilustración del dispositivo de enfriamiento en la figura 6B, donde las placas se cierran entre sí.

La figura 7 es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende placas que tienen hendiduras para que las muestras se enfríen.

La figura 8 es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende un miembro de generación de viento. La figura 9A es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende un baño de enfriamiento.

La figura 9B es una ilustración de otro dispositivo de enfriamiento que comprende un baño de enfriamiento y que comprende además una varilla de enfriamiento.

La figura 9C es una ilustración de otro dispositivo de enfriamiento que comprende un baño de enfriamiento y que comprende además un circulador de baño.

La figura 9D es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende un baño de enfriamiento y que comprende además un miembro de agitación.

La figura 10 es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende un estante de muestras giratorio.

La figura 11 es una gráfica que muestra una curva de enfriamiento habitual para agua y demuestra un método para determinar el tiempo de transición de fase, que se detalla en la descripción.

La figura 12 es una gráfica que muestra una curva de enfriamiento habitual para agua y demuestra un método para determinar el tiempo de transición de fase, que se detalla en la descripción.

La figura 13 es un diagrama de flujo de un método de acuerdo con la invención.

La figura 14 es una ilustración de un dispositivo de enfriamiento que comprende una corriente de aire y un soporte.

La figura 15 es una ilustración de un aparato y un soporte de imán de acuerdo con una realización de la presente invención. La figura 16 es una ilustración de un estante de muestras que se va a usar en el aparato de acuerdo con una realización de la presente invención.

La figura 17 ilustra la distribución del campo eléctrico en pulsos para el sistema de condensador de placa paralela (COMSOL Multiphysics).

La figura 18 ilustra el vector de campo eléctrico a través de la mitad del sistema de condensador de placa paralela (COMSOL Multiphysics).

La figura 19 ilustra la densidad de flujo magnético y transmisión de vector de campo magnético de un aparato de acuerdo con una realización de la presente invención.

La figura 20 ilustra la densidad de flujo magnético de un aparato de acuerdo con una realización de la presente invención, desde la superficie superior del imán inferior hasta la superficie inferior del imán superior en el centro del imán.

La figura 21 ilustra la distribución de densidad de flujo magnético por arriba, dentro y debajo de un aparato de acuerdo con una realización de la presente invención, a lo largo de la línea que pasa a través del centro del imán desde cada lado. La figura 22 ilustra la densidad de flujo magnético de un aparato de acuerdo con una realización de la presente invención, desde la superficie superior del imán inferior hasta la superficie inferior del imán superior en el centro de la unión de cuatro imanes.

La figura 23 ilustra la densidad de flujo magnético por arriba, dentro y debajo del aparato de acuerdo con una realización de la presente invención.

La figura 24 ilustra la magnitud de la densidad de flujo magnético en el centro de un aparato de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de realización preferida

Por lo tanto, se propone que el objeto descrito anteriormente y varios objetos diferentes se obtengan en un primer aspecto de la invención al proporcionar un método para congelar una muestra biológica, el método que comprende controlar el tiempo de transición de fase del uno o más líquidos de una muestra biológica. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión, donde una o más muestras de células humanas y/o animales en suspensión (12) se contienen en uno o más recipientes (1) que comprenden uno o más líquidos, comprende:

- controlar la capacidad de enfriamiento de tal manera que se puede regular y controlar el tiempo de transición de fase de una muestra,

- determinar el enfriamiento necesario de modo que el tiempo de transición de fase de una muestra de calibración (11) contenida en un recipiente (1) es una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos;

- enfriar esta una o más muestras (12) de la misma manera como esta muestra de calibración (11) al controlar la cantidad de enfriamiento, de modo que el tiempo de transición de fase de la muestra (11) se regula a una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos, donde se adiciona menos de 2 % de crioprotector del volumen total de muestra al recipiente (1) que contiene el material biológico (12).

En el caso donde el cambio de fase de fase líquida a sólida del uno o más líquidos de la muestra biológica que se va a congelar no es detectable, el intervalo de tiempo de la transición de fase es el de una muestra de calibración adecuada tal como, por ejemplo, una solución salina isotónica. Una solución salina isotónica, también referida como solución salina fisiológica o solución salina normal, contiene 9 gramos de NaCl disueltos en agua hasta un volumen total de 1000 ml, es decir, es una solución de 0,90 % p/v de NaCl.

Una muestra de calibración alternativa es el medio de crioconservación o medio de crecimiento, que contiene suero o está libre de suero.

Otra muestra de calibración alternativa es una o más de las muestras biológicas que se van a congelar por introducción de un sensor de temperatura (estéril) directamente en la muestra que se va a congelar.

El intervalo de tiempo de la transición de fase entonces se puede calibrar al medir la temperatura de una muestra de calibración adecuada en un recipiente, en tanto que el recipiente se enfría. El intervalo de tiempo entonces se determina de acuerdo con una definición del tiempo de transición de fase.

A continuación se da un (primer) método para definir el tiempo de transición de fase y con referencia a la figura 1, que muestra una curva de enfriamiento habitual (línea continua) para una solución salina isotónica que se enfría a una velocidad de enfriamiento que es cercana a constante:

1. Ajustar una línea recta a la parte de la curva de enfriamiento, donde la temperatura está cayendo/disminuyendo, en un intervalo de tiempo antes de que la curva se aplane debido al calor latente de la fusión (línea punteada en la figura 1). El conjunto de datos para ajustarse a la línea recta se puede definir por cambios en la primera y/o segunda derivadas de la curva de enfriamiento.

2. Definir t_start como el tiempo, donde los puntos de datos de temperatura cerca del punto de congelación se desvían de la línea recta ajustada en 1) por 0,5 grados Celsius (línea de puntos y guiones en la figura 1).

3. Ajustar una línea recta a la parte de la curva de enfriamiento, donde la temperatura está cayendo/disminuyendo, en un intervalo de tiempo después de que la curva se aplane debido al calor latente de la fusión (línea punteada en la figura 1). El conjunto de datos para ajustarse a la línea recta se puede definir por cambios en la primera y/o segunda derivadas de la curva de enfriamiento.

4. Definir t_end como el tiempo, donde los puntos de datos de temperatura cerca del punto de congelación se desvían de la línea recta ajustada en 3) por 0,5 grados Celsius (línea de puntos y guiones en la figura 1).

5. Ajustar una línea recta a los datos de temperatura en el intervalo de tiempo entre t_start y t_end.

6. Definir t1 como el tiempo más cercano a t_start, donde los puntos de datos de temperatura se desvían de la línea recta ajustada en 5) por 0,25 grados Celsius y t2 como el tiempo más cercano a t_end, donde los puntos de datos de temperatura se desvían de la línea recta ajustada en 5) por 0,25 grados Celsius (líneas punteadas en la figura 1).

7. El tiempo de transición de fase o tiempo de remoción de calor latente es entonces el intervalo de tiempo entre t1 y t2.

En el método descrito anteriormente, cualquier punto de datos falso puede no tenerse en cuenta en el proceso de definición de t_start, t_end, t1 y t2.

A continuación se da otro segundo método para definir el tiempo de transición de fase y con referencia a la figura 11:

1. Determinar la línea recta que cruza los puntos de datos con valores de temperatura 5C y 10C y determinar la línea recta que cruza los puntos de datos con valores de temperatura -5C y -10C.

2. Determinar los valores en la abscisa, donde las líneas encontradas en el paso 1, se cruzan, es decir, los puntos (t1, 0C) y (t2, 0C).

3. El tiempo de transición de fase o tiempo de remoción de calor latente es entonces el intervalo de tiempo entre t1 y t2.

El enfriamiento puede comprender enfriamiento de temperatura ambiente a una temperatura más baja, tal como 5C, 4C, 3C, 2C o 1C, y permanecer a esta temperatura, T_lower, durante un período de tiempo. En este caso, todavía se puede usar el primer método para definir el tiempo de transición de fase descrito anteriormente. Sin embargo, el segundo método descrito solo se puede usar para determinar t2. El valor de t1 se puede determinar al determinar una línea recta que cruza una temperatura menor que T_lower y una temperatura mayor que 0C y entonces siguiendo los pasos 2 y 3 en el segundo método.

A continuación se da otro cuarto método para definir el tiempo de transición de fase, cuando se enfría a T_lower antes de un enfriamiento adicional, y con referencia a la figura 12:

1. t1 se define como el tiempo, cuando la remoción de calor se incrementa de tal manera que la temperatura medida disminuye.

2. t2 se determina al usar de los pasos relevantes en el primer o segundo método descrito anteriormente.

3. El tiempo de transición de fase o tiempo de remoción de calor latente es entonces el intervalo de tiempo entre t1 y t2.

Se puede medir la curva de enfriamiento de más de una muestra de calibración. Si es así, el tiempo de formación de hielo se puede calcular como la media de estas mediciones.

Como el calor latente es una constante de material dada en energía por volumen, la cantidad de calor que se va a remover durante la transición de fase depende del volumen del material. Además, la forma del material influirá en la remoción de calor. También, se prefieren los recipientes, que tienen una o más dimensiones que se pueden considerar pequeñas, puesto que el gradiente de temperatura a través de esta dimensión será más pequeño y por lo tanto, menos significativo.

El material biológico que se va a congelar puede estar en un recipiente o en un portador de algún tipo. Los recipientes pueden incluir, por ejemplo, tubos, pajillas, bolsas y ampollas. Se debe elegir un recipiente adecuado y/o una muestra de calibración con respecto a la muestra de material biológico que se va a congelar.

La forma en cómo se logra la potencia de enfriamiento no es fundamental para el método. Una característica preferida es que la capacidad de enfriamiento se puede controlar de alguna manera de modo que se puede regular el tiempo de transición de fase. Al enfriar muestras de calibración en diferentes sistemas y al alterar la capacidad de enfriamiento, se puede realizar un catálogo de intervalos de tiempo de transición de fase para cada sistema. Al enfriar una o más muestras biológicas al mismo tiempo que una o más muestras de calibración, es posible determinar tanto un tiempo de remoción de calor latente como una viabilidad para las muestras biológicas.

Por lo tanto, los materiales biológicos se pueden congelar usando un método mejorado al enfriar el material biológico 12 de una manera donde se define que la muestra de calibración 11 ha cambiado de una fase líquida a una fase sólida en un tiempo de transición de fase que es una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos.

En una realización, se define que la muestra de calibración 11 ha cambiado de fase líquida a fase sólida en un tiempo de transición de fase que es menor de 6 minutos. Es decir, el material biológico se enfría usando un perfil de enfriamiento, que da por resultado que una muestra de calibración haya cambiado de fase líquida a sólida en un tiempo de transición de fase que es menor de 6 minutos.

En una realización, se define que la muestra de calibración 11 ha cambiado de fase líquida a fase sólida en un tiempo de transición de fase que es menor de 3 minutos. Es decir, el material biológico se enfría usando un perfil de enfriamiento, que da por resultado que una muestra de calibración haya cambiado de fase líquida a sólida en un tiempo de transición de fase que es menor de 3 minutos.

En una realización, el método se caracteriza porque un crioprotector no se adiciona al recipiente 1 que contiene el material biológico 12.

En otra realización, el método para congelar material biológico comprende adicionar una pequeña cantidad de crioprotector al recipiente 1 que contiene el material biológico 12.

La pequeña cantidad de crioprotector adicionada al recipiente 1

es menor de 2 % o menos o tal como 1 % o menos.

En una realización, el método para congelar material biológico comprende el uso de medio sintético libre de suero. En una realización, el método para congelar material biológico comprende descongelar este material biológico al aplicar uno de los métodos descritos anteriormente en forma inversa para proporcionar un tiempo de descongelación equivalente al tiempo de remoción de calor latente preferido.

En otra realización, el método para congelar material biológico comprende descongelar este material biológico al aplicar cualquier procedimiento estándar para descongelar el material biológico.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un aparato para congelar un material biológico.

En una realización, el aparato para congelar material biológico comprende un sistema de enfriamiento y un sistema para controlar la energía de enfriamiento.

En una realización, el sistema de enfriamiento comprende un congelador, tal como, por ejemplo, un congelador de compresión de vapor.

En una realización, el control de la potencia de enfriamiento comprende un medio para establecer un tiempo, donde el tiempo establecido es la duración de remoción de calor latente de una muestra de calibración.

En una realización, la muestra de calibración comprende una solución salina isotónica.

En otra realización, la muestra de calibración comprende una solución que comprende medio de crecimiento con suero. En otra realización, la muestra de calibración comprende una solución que comprende medio de crecimiento sin suero. En una realización adicional, la muestra de calibración es una o más de las muestras biológicas que se van a congelar. En las figuras 2 y 3 se muestra una realización, donde el aparato para congelar un material biológico comprende un primer miembro de placa 2.

En una realización, con referencia a las figuras 2 y 3, el primer miembro de placa 2 puede sostener una o más muestras de calibración 11 y/o una o más muestras biológicas 12 y/o uno o más recipientes de muestra 1 que contienen material biológico.

En otra realización, con referencia a las figuras 2 y 3, el primer miembro de placa 2 se puede elaborar completamente de un material conductor de calor o puede comprender un material conductor de calor, donde el material conductor de calor puede cubrir solo parte del primer miembro de placa 2.

En una realización, con referencia a las figuras 2 y 3, el primer miembro de placa 2 se puede enfriar al estar en contacto térmico con un sistema de enfriamiento tal como, por ejemplo, un fluido de enfriamiento. Este fluido de enfriamiento puede fluir a través del primer miembro de placa 2 o en una construcción 3, que está en contacto térmico con el primer miembro de placa 2, mediante aberturas 4 en el primer miembro de placa 2 o construcción 3.

En una realización, con referencia a las figuras 2 y 3, algunas de las dimensiones del primer miembro de placa 2 es 10 cm por 10 cm o 20 cm por 20 cm o más.

En una realización, con referencia a las figuras 2 y 3, la construcción 3 comprende preferentemente un material térmicamente aislante en una o más de las superficies que no están en contacto con los recipientes de muestra 1 o el material biológico.

En una realización, con referencia a las figuras 2 y 3, se puede colocar una tapa en la parte superior de una o más muestras biológicas o recipientes de muestra que contienen material biológico. Esta tapa puede comprender una placa metálica delgada, tal como una placa de acero inoxidable, aluminio o cobre o material compuesto revestido con un material térmicamente aislante tal como un material plástico, tal como, por ejemplo, un material plástico de espuma. Al colocar la tapa con el material térmicamente aislante en contacto con la muestra o recipiente de muestra, la muestra biológica o recipiente de muestra puede entrar en mejor contacto térmico con el primer miembro de placa 2.

En la figura 4 se muestra una realización, donde el aparato comprende además un segundo miembro de placa 7.

En una realización, con referencia a la figura 4, el segundo miembro de placa 7 está en contacto térmico con el sistema de enfriamiento.

En una realización, con referencia a la figura 4, el segundo miembro de placa 7 comprende aberturas 4 a través de las cuales puede fluir un fluido de enfriamiento.

En una realización, con referencia a la figura 4, la temperatura del fluido de enfriamiento que fluye a través del primer miembro de placa 2 o la construcción 3 y/o el segundo miembro de placa 7 es entre -100 C y 20 C.

En una realización, con referencia a la figura 4, el segundo miembro de placa 7 se puede elaborar completamente de un material conductor de calor o puede comprender un material conductor de calor, donde el material conductor de calor puede cubrir solo parte del segundo miembro de placa 7.

Con referencia a la figura 4 y 5, en una realización, el primer miembro de placa 2 o una parte de la construcción 3 se monta en una o más bisagras 6 de modo que el segundo miembro de placa 7, que también se monta en la bisagra 6, se puede cerrarse en ella. De manera alternativa, el segundo miembro de placa 7 es parte de un miembro, que se monta en la bisagra 6, de modo que el segundo miembro de placa 7 se puede cerrarse en el primer miembro de placa 2.

Con referencia a las figuras 6A y 6B, en otra realización, el primer miembro de placa 2 se puede montar en uno o más agregados de cierre 8 de modo que un segundo miembro de placa 7, que también se monta en los agregados de cierre 8 se pueden cerrar en el miembro de placa 2 por una o ambas placas que se mueven en una dirección que es perpendicular a un plano definido por las placas.

Con referencia a la figura 7, en otra realización, el primer miembro de placa 2 tiene una o más hendiduras 5 para acomodar una o más muestras de calibración 11 y/o una o más muestras biológicas 12 y/o uno o más recipientes de muestra 1 que contienen material biológico.

En una realización, con referencia a la figura 7, el segundo miembro de placa 7 puede tener una o más hendiduras 5 para acomodar una o más muestras de calibración 11 y/o una o más muestras biológicas 12 y/o uno o más recipientes de muestra 1 que contienen material biológico.

En una realización, con referencia a la figura 7, las dimensiones de las hendiduras 5 pueden ser de modo que cuando una muestra biológica o un recipiente de muestra que contiene material biológico o una muestra de calibración se coloca en las hendiduras, no se contienen completamente dentro de la hendidura en el primer miembro de placa 2, es decir, se extienden a través de un plano definido por una superficie superior del primer miembro de placa 2 cuando se ignoran las hendiduras 5.

En una realización, con referencia a la figura 7, las dimensiones de las hendiduras 5 pueden ser de modo que cuando una muestra biológica o un recipiente de muestra que contiene material biológico o una muestra de calibración se coloca en las hendiduras 5, se contienen completamente dentro de la hendidura en el primer miembro de placa 2, es decir, no se extienden a través de un plano definido por una superficie superior del primer miembro de placa 2 cuando se ignoran las hendiduras 5.

En una realización con referencia a la figura 7, el primer miembro de placa 2 y/o el segundo miembro de placa 7 comprende uno o más insertos cambiantes. Los insertos pueden ser planos o comprender hendiduras 5 de diferentes tamaños y formas. Estos insertos pueden acomodar diferentes tamaños y formas de objetos que se van a congelar.

En la figura 8 se muestra una realización, donde el aparato para congelar un material biológico comprende un miembro de generación de viento 10, que puede suministrar enfriamiento.

En una realización, con referencia a la figura 8, el aparato que comprende un miembro de generación de viento 10 comprende además un soporte de muestras 9 para sostener una o más muestras de calibración 11 y/o una o más muestras biológicas 12 y/o uno o más recipientes de muestra 1 que contienen material biológico.

En una realización adicional, con referencia a la figura 8, la velocidad de viento suministrada por el miembro de generación de viento 10 se regula en el intervalo entre 0,0 m/s - 50 m/s, preferentemente en el intervalo entre 0,1 m/s - 50 m/s.

En la figura 9A se muestra una realización, donde el aparato para congelar un material biológico comprende un baño de enfriamiento 13.

En una realización, con referencia a la figura 9A, el baño de enfriamiento 13 se usa para enfriar una o más muestras de calibración 11 y/o una o más muestras biológicas 12 y/o uno o más recipientes de muestra 1 que contienen material biológico.

En una realización, con referencia a la figura 9A, el baño de enfriamiento 13 comprende además un termómetro 16 para medir la temperatura del baño de enfriamiento 13.

En la figura 9B se muestra una realización que comprende un baño de enfriamiento y que comprende además una varilla de enfriamiento 17, que se usa para enfriar el baño de enfriamiento.

En la figura 9C se muestra una realización que comprende un baño de enfriamiento y que comprende además un circulador de baño 18 para circulación de fluido de enfriamiento.

En la figura 9D se muestra una realización que comprende un baño de enfriamiento y que comprende además un miembro de agitación 19.

En la figura 10 se muestra una realización, donde uno o más recipientes 1 se colocan en un estante o soporte giratorio 14 que se va a enfriar por un dispositivo de enfriamiento 15. El uno o más recipientes 1 pueden ser, por ejemplo, criotubos o bolsas de plástico, pero no se limitan a los mismos. El estante o soporte giratorio 14 es preferentemente adecuado para el tipo particular de muestra.

En la figura 14 se muestra una realización, donde el aparato para congelar un material biológico comprende una entrada 21 y una salida 22 para aire frío. La corriente de aire se dirige de modo que fluye desde debajo de un soporte 20 y más allá del soporte 20.

En una realización, con referencia a la figura 14, la corriente de aire ejerce suficiente fuerza sobre los recipientes 1 en el soporte 20 para que los recipientes se empujen fuera del soporte.

En una realización, con referencia a la figura 14, la potencia de enfriamiento se regula al cambiar la temperatura del aire de flujo.

En una realización, con referencia a la figura 14, el soporte 20 tiene orificios en él.

En una realización, con referencia a la figura 14, el soporte 20 es una malla.

En una realización, con referencia a la figura 14, la malla se elabora de un metal.

En una realización, con referencia a la figura 14, la malla se elabora de un material compuesto.

En una realización, con referencia a la figura 14, el aparato se opera en un modo por lotes.

En una realización, con referencia a la figura 14, el aparato se opera en un modo continuo.

En una realización, con referencia a las figuras 2 y 3, el primer miembro de placa 2 comprende un medio de generación de campo magnético.

En una realización, con referencia a las figuras 4 - 7, el segundo miembro de placa 7 comprende un medio de generación de campo magnético.

En una realización, el medio de generación de campo magnético es imanes permanentes.

En otra realización, el medio de generación de campo magnético es un electroimán.

El campo magnético se puede producir al montar un arreglo de imanes permanentes de bloque NdFeB, tal como 12 o 24 imanes permanentes de bloque.

En una realización, cada uno de los imanes permanentes tiene una intensidad de campo magnético entre 0,0001 y 1,0 T, tal como entre 0,01 y 1,0 T o preferentemente entre 0,0001 - 0,1 T.

En una realización, con referencia a las figuras 4 - 7, el primer miembro de placa 2 y/o el segundo miembro de placa 7 comprende un medio de generación de campo eléctrico.

En una realización, el aparato comprende un medio de generación de campo eléctrico pulsante.

El campo eléctrico se puede generar a partir de dos dispositivos que incluyen un suministro de energía en pulsos y un par de electrodos, que convierte el voltaje en pulsos en campos eléctricos en pulsos. Una disposición de condensador de placa paralela que comprende dos placas de aluminio conectadas directamente a un suministro de voltaje funcional produce un campo uniforme en el volumen entre las placas. La separación entre las dos placas se puede rellenar con aire de permitividad relativa de uno y con conductividad cero.

El campo eléctrico en pulsos puede ser una forma de onda de pulso cuadrado.

En algunas realizaciones, el medio de generación de campo eléctrico pulsante tiene una intensidad en el intervalo de 0,1 - 100 V/cm, tal como entre 0,5 - 2,2 V/cm.

En algunas realizaciones, el medio de generación de campo eléctrico pulsante tiene una frecuencia pulsante en el intervalo de 1 - 1000 kHz, tal como en el intervalo de 5 y 100 kHz.

En algunas realizaciones, el aparato comprende tanto un medio de generación de campo eléctrico pulsante como un medio de generación de campo magnético.

En algunas realizaciones, la orientación del campo magnético y campo eléctrico pulsante es en paralelo.

En una realización, con referencia a las figuras 4 - 7, el primer miembro de placa 2 y/o el segundo miembro de placa 7 se elaboran de un material no magnético.

Aunque la presente invención se ha descrito en relación con las realizaciones especificadas, no se debe interpretar que se limita de ninguna manera a los ejemplos presentados. El alcance de la presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones anexas. En el contexto de las reivindicaciones, los términos “que comprende” o “comprende” no excluyen otros elementos o pasos posibles. También, no se debe interpretar que la mención de referencias tal como “un” o “una”, etc., excluye una pluralidad. El uso de signos de referencia en las reivindicaciones con respecto a los elementos indicados en las figuras tampoco se debe interpretar como que limita el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1:

El ejemplo 1 muestra el efecto de los cambios en la duración del tiempo de formación de hielo para crioconservación de células humanas de las dos líneas de células de cáncer establecidas T-47D y T98G en presencia o ausencia de DMSO al 5 % y en presencia o ausencia de campos eléctricos pulsantes - magnéticos estáticos superpuestos. El uso de DMSO al 5 % como crioprotector no es de acuerdo con la presente invención.

El objetivo fue probar la importancia de la duración del tiempo de formación de hielo (= tiempo para remover calor latente durante la formación de hielo) de las existencias de semillas de dos líneas de células humanas establecidas: Células de cáncer de mama T-47D y células de glioblastoma T98G, para viabilidad después de la descongelación. Además de la variación en el tiempo de formación de hielo, se han probado dos variables:

• Células congeladas sin DMSO o con DMSO al 5 %

• Células congeladas dentro de un campo magnético fuerte (0,2 - 0,3 T) - eléctrico pulsante (20 V (220 V/m) - 20 kHZ) mixto (en lo sucesivo denominado, “MAG/PEF fuerte”), o justo fuera de la caja de campo en un campo magnético débil (0,005 - 0,008 T) - eléctrico pulsante (7 - 16 V (75 - 185 V/m) - 20 kHz) (en lo sucesivo, “MAG/PEF débil”).

El experimento tuvo como objetivo determinar la influencia de tiempos de formación de hielo reducidos hasta 3 min y además, determinar la probabilidad de que un campo magnético fuerte o débil - eléctrico pulsante y/o la presencia o ausencia de DMSO influyan en la fracción de células que retienen su capacidad proliferativa completa después de la congelación.

Las células de ambos tipos se cultivaron como cultivos de monocapa en medio RPMI 1640 (Gibco, Rockwill, MD, EUA) complementado con suero de ternera fetal al 10 % (Gibco), L-glutamina 2 mM, 200 unidades/I de insulina y penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco). Las células se mantuvieron rutinariamente en crecimiento exponencial continuo por el re-cultivo dos veces por semana. La cosecha para recultivo o para congelación se realizó al remover el medio de crecimiento, al enjuagar 2 veces en 1,5 ml de solución de tripsina EDTA (0,05 % y 0,02 % respectivamente) y al incubar cultivos durante 5 min a 37 °C en la solución de tripsina residual.

Un total de 108 células de cada línea de células se produjeron antes del experimento. Las células se prepararon para el experimento por re-cultivo de varias poblaciones de trabajo el día 0 y las células se congelaron el día 3.

Para cada tipo de célula, se realizó una preparación separada de muestras para congelación por tratamiento con tripsina estándar de varios matraces y agrupación de las células después de la remoción de la solución de tripsina y la re­ suspensión de las células en medio RPMI. Después de agrupar los números de células por ml, se contaron de manera precisa en un citómetro de flujo y posteriormente se realizaron diluciones de suspensiones de células adecuadas para obtener la concentración de células deseada para transferencia a los crio-tubos para cada tipo de célula. La cantidad final de suspensión en cada crio-tubo fue 1 ml. Para obtener esta cantidad, se adicionaron 0,5 ml de la suspensión de células y entonces se adicionaron 0,5 ml ya sea de RPMI o de RPMI complementado con DMSO al 10 % (de tal forma que la concentración final de DMSO fue 5 % en muestras que contienen DMSO.

El día 4 se descongelaron las muestras indicadas por los números de semilla 200, 300, 1000 o 5000 por matraz de 25 cm2 y se sembraron células para formación de colonias. Se probaron 5 matraces paralelos para cada muestra. Un control fue el procedimiento tradicional usado en el laboratorio con DMSO al 5 % y con 30 minutos en -20 °C, 45 minutos en ~-80 °C y almacenamiento final en N2 líquido. Otro control fue muestras mantenidas a 20 °C sin congelación.

Los matraces se incubaron para formación de colonias en una incubadora Steri-cult 200 operada a 37 °C y con una concentración atmosférica de CO2 de 5 %. La incubación continuó durante entre 10 y 17 días dependiendo de la velocidad de crecimiento de las células (las células T-47D tienen una duración de ciclo celular más larga que las células T98G). Para el conteo de colonias macroscópicas, las células se fijaron en etanol y se tiñeron con azul de metileno. Para ilustrar las diferencias de apariencia después de la incubación completada, algunos matraces se llevaron a un escáner para producción de fotografías de colonias teñidas.

Los resultados se presentan en la tabla 1 más adelante.

Para células crioconservadas sin DMSO, la eficiencia de recubrimiento tanto para células T-47D como para células T-98G fue comparable con la congelación estándar con DMSO en un tiempo de formación de hielo de 3 minutos tanto en campo magnético fuerte como débil con campo eléctrico pulsante. Sin campo eléctrico en pulsos y magnético, la eficiencia de recubrimiento para ambos es menos favorable que en la presencia de campos eléctricos magnéticos y/o pulsantes.

Tabla 1: Tiem o de formación de hielo versus eficiencia de recubrimiento - PE %

Ejemplo 2:

El ejemplo 2 muestra el efecto de los cambios en la duración del tiempo de formación de hielo para crioconservación de células CHO adherentes en presencia o ausencia de DMSO al 5 % y en presencia o ausencia de campos eléctricos pulsantes - magnéticos estáticos superpuestos. El uso de DMSO al 5 % como crioprotector no es de acuerdo con la invención.

El objetivo fue probar la importancia de la duración de la formación de hielo (= tiempo para remover calor latente durante la formación de hielo) de las existencias de semillas de células CHO adherentes (células de ovario de hámster chino K1 para viabilidad después de la descongelación. Además de la variación en el tiempo de formación de hielo, se han probado dos variables:

•Células congeladas sin DMSO o con DMSO al 5 %

•Células congeladas dentro de un campo magnético fuerte (0,2 - 0,3 T) - eléctrico pulsante (20 V (220 V/m) - 20 kHZ) mixto (en lo sucesivo denominado, “m Ag /PEF fuerte”), o justo fuera de la caja de campo en un campo magnético débil (0,005 - 0,008 T) - eléctrico pulsante (7 - 16 V (75 - 185 V/m) - 20 kHz) (en lo sucesivo, “MAG/PEF débil”).

El experimento tuvo como objetivo determinar la influencia de tiempos de formación de hielo reducidos hasta 2 min y además, determinar la probabilidad de que un campo magnético fuerte o débil - eléctrico pulsante y/o la presencia o ausencia de DMSO influyan en la fracción de células que retienen su capacidad proliferativa completa después de la congelación.

Las células se cultivaron en matraces de 162 cm2 como cultivos de monocapa en medio F12 de Ham complementado con suero de ternera fetal al 10 %. Las células se mantuvieron en crecimiento exponencial continuo por el re-cultivo dos veces por semana. La cosecha para recultivo o para congelación se realizó al remover el medio de crecimiento, al enjuagar dos veces en 1,5 ml de solución de tripsina EDTA (0,05 % y 0,02 % respectivamente) y al incubar cultivos durante 5 min a 37 °C en la solución de tripsina residual. La tripsinización se detuvo al adicionar medio F12 de Ham con FBS.

Las células se resuspendieron y se contaron usando contador de células automatizado Countess con tinción de azul de tripano (0,4 %) para estimar la viabilidad celular.

La suspensión de células se transfirió a un tubo de 15 ml y se centrifugó (200 g, 5 min, 4 °C). El sobrenadante se removió y los sedimentos de células se resuspendieron en FBS frío para dar una concentración final de 2x106 células/ml. 0,5 ml de la suspensión de células se transfirieron a 2 ml de crio-tubo. Se adicionó medio de congelación de igual volumen (0,5 ml) con o sin medio DMSO a cada crio-tubo para dar una concentración final de 5 % de DMSO y 1x106 células por ml en cada tubo.

Después de 10 días, se descongelaron las muestras de nitrógeno líquido y se sembraron células para formación de colonias. Se probaron 3 matraces paralelos para cada muestra. El control fue el procedimiento tradicional usado en el laboratorio con DMSO al 5 % y con 30 minutos en -20 °C, 45 minutos en ~-80 °C y almacenamiento final en N2 líquido. Los matraces se incubaron para formación de colonias en una incubadora Steri-cult 200 operada a 37 °C y con CO2 al 5 % en la atmósfera. La incubación continuó durante seis días. Para el conteo de colonias macroscópicas, las células se fijaron en etanol y se tiñeron con azul de metileno.

Los resultados del experimento se muestran en la tabla 2 y 3.

Tabla 2: Tiem o de formación de hielo eficiencia de recubrimiento sin DMSO

Tabla 3: Tiem o de formación de hielo eficiencia de recubrimiento con DMSO

El experimento muestra que en un campo magnético estático y campo eléctrico en pulsos combinados, la viabilidad de las células CHO crioconservadas libres de DMSO después de la descongelación es comparable con las células CHO crioconservadas convencionales con DMSO cuando el tiempo de formación de hielo es corto, y que la viabilidad se reduce para tiempos de formación de hielo más largos tanto para las células crioconservadas libres de DMSO como para células congeladas con DMSO.

Ejemplo 3 : El objetivo fue probar si es posible mantener las plaquetas sanguíneas no activadas y funcionalmente intactas en ^p R^p cuando se congelan con tiempos cortos de remoción de calor latente, y si la presencia de campos magnéticos y/o campos eléctricos pulsantes influye en el resultado.

Se extrajo sangre (2,7 ml) en anticoagulante de citrato 0,109 M (0,3 ml /tubo) en tubos que se centrifugaron sucesivamente a 200 xg en 12 min a 20 °C para proporcionar sobrenadantes con plasma rico en plaquetas (PRP) en volúmenes de aproximadamente 1,2 ml/tubo.

De cada tubo, 1,0 ml de PRP se pipeteó cuidadosamente en 20 crio-tubos separados que se sellaron y se usaron en experimentos de congelación. Las muestras de PRP se almacenaron a 20 °C durante 20 horas hasta que se iniciaron los procesos de congelación. Dos muestras se mantuvieron como controles a 20 °C sin congelación.

La congelación se realizó en dos muestras según las condiciones de prueba y las condiciones de congelación variaron como sigue:

Tiempo de remoción de calor latente: 2; 3,5; 4; 5 y 6 minutos

Campo en pulsos: Presencia o ausencia de campo eléctrico pulsante 220 V/m - 20KHz; o 75 - 185V/m - 20KHz.

Campo magnético: Presencia o ausencia de campo magnético estático 0,2 - 0,3 T o 0,005 - 0,008 T.

Todas las muestras se dejaron congelar a -70 °C y se mantuvieron a esta temperatura durante 24 horas y entonces se descongelaron a 20 °C. Las muestras de PRP se inspeccionaron para agregados de plaquetas. Ninguna de las muestras de PRP, independientemente de las condiciones usadas para congelación, así como los controles que no se congelaron, mostraron ningún signo de agregados probando que las plaquetas no se activaron durante el proceso. A continuación, se adicionó uno de los dos conjuntos de PRP a 1U de trombina humana, para cada tubo, que en todos los tubos provocó una agregación de plaquetas inmediata después de coagulación del plasma, que muestra que la respuesta de agregación de plaquetas estuvo activa intacta después de los procesos de congelación. Algunas de las muestras del otro conjunto de PRP se transfirieron a tubos de vidrio y se adicionó CaCl2 a una concentración sobre la de citrato en las muestras. Después de algunos minutos, se formaron agregados de plaquetas, que también muestran que la respuesta de agregaciones estuvo intacta.

Después del experimento de agregación, el PRP se sometió a centrifugación a 200 xg durante 10 minutos para remover cualquier agregado y dejar cualquier plaqueta no agregada en el sobrenadante. Como se midió a 620 nm en un espectrofotómetro contra los controles apropiados, no se detectaron plaquetas no agregadas probando que la agregación se completó.

El experimento muestra que es posible mantener las plaquetas sanguíneas no activadas y funcionalmente intactas en PRP congelado con un corto tiempo de remoción de calor latente, y que la presencia de campos magnéticos y/o campos eléctricos pulsantes no influyó en el resultado.

Ejemplo 4 :

El objetivo fue probar la lisis de eritrocitos después de la congelación con un corto tiempo de remoción de calor latente y descongelación.

Ocho muestras de sangre de 3,5 ml cada una se extrajeron de un individuo masculino sano y no medicado en tubos Vacuette K2EDTA. Dos tubos se almacenaron a 20 °C y se usaron para control. Los otros tubos se colocaron adyacentes a los tubos que contienen NaCl al 0,9 % en el aparato de congelación. Los tubos que contienen NaCl al 0,9 % se equiparon con sensores de temperatura que permiten medir el proceso de remoción del calor latente del líquido. Se asume que la remoción del calor latente de las soluciones de NaCl al 0,9 % es idéntica o casi idéntica a la remoción del calor latente de las muestras de sangre que se encuentran cerca. Se permitió que dos muestras de sangre se congelaran en un proceso donde se removió el calor latente de la formación de hielo durante un intervalo de tiempo de 2 min. Otras dos muestras se dejaron congelar en un proceso donde el calor latente de la formación de hielo se removió durante un intervalo de tiempo de 2 min, 29 seg, en tanto que las últimas dos muestras de sangre se dejaron congelar es un proceso donde el calor latente de la formación de hielo se removió durante un intervalo de tiempo de 4 min, 23 seg. La temperatura se dejó caer sucesivamente a -70 °C. Las muestras de sangre se almacenaron bajo estas condiciones durante 24 horas antes de ser extraídas y se descongelaron a 20 °C. Después de que las muestras han alcanzado 20 °C, se sometieron a centrifugación a 2000 xg durante 15 min, a fin de hacer girar la fracción de eritrocitos y dejar un sobrenadante de plasma para inspección adicional.

Las fracciones de plasma se dividieron posteriormente en dos paralelos y se transfirieron a cubetas y se midieron a 550 nm usando el plasma de las muestras de sangre no tratadas como un control. Si se ha presentado lisis de eritrocitos, la luz absorbente de hemoglobina a 550 nm sería medible en el plasma.

La tabla 4 muestra los resultados del experimento, probando que el corto tiempo de remoción de calor latente no afectó la lisis de los eritrocitos bajo las condiciones dadas.

Tabla 4:

Ejemplo 5 :

El objetivo fue probar la estabilidad de los conteos de plaquetas después de la congelación con un corto tiempo de remoción de calor latente y descongelación.

Ocho muestras de sangre de 3,5 ml cada una se extrajeron de un individuo masculino sano y no medicado en tubos Vacuette K2EDTA. Dos tubos se almacenaron a 20 °C y se usaron para control. Los otros tubos se colocaron adyacentes a los tubos que contienen NaCl al 0,9 % en el aparato de congelación. Los tubos que contienen NaCl al 0,9 % se equiparon con sensores de temperatura que permiten medir el proceso de remoción del calor latente del líquido. Se asume que la remoción del calor latente de las soluciones de NaCl al 0,9 % es idéntica o casi idéntica a la remoción del calor latente de las muestras de sangre que se encuentran cerca. Las otras seis muestras de sangre se dejaron congelar en un proceso donde el calor latente de la formación de hielo se removió en intervalos de tiempo de 1 min, 30 seg, (dos muestras), 2 min, 54 seg, (dos muestras) y 3 min, 40 seg (dos muestras), respectivamente. La temperatura se dejó caer sucesivamente a -70 °C. Las muestras de sangre se almacenaron bajo estas condiciones durante 48 horas antes de ser extraídas y se descongelaron a 20 °C. Después de que las muestras han alcanzado 20 °C, se sometieron a medición y contenido de plaquetas por metodología de impedancia.

La tabla 5 muestra los conteos de plaquetas en muestras de sangre anticoaguladas con EDTA después de la congelación en diferentes intervalos de tiempo de remoción del calor latente, descongelación y medición con resultados de tecnología de impedancia. El resultado prueba que los conteos de plaquetas permanecen estables después del proceso de congelación y descongelación usando cortos períodos de tiempo para remoción del calor latente durante la congelación.

T l : n l

Ejemplo 6 :

Se produjo un aparato para aplicar campos magnéticos estáticos y/o campos eléctricos durante la congelación de material biológico de acuerdo con la presente invención. El aparato, también referido como caja de campo, se usó en el procedimiento de congelación de los ejemplos previos.

Se construyó una caja de campo con materiales con baja permeabilidad o sin permeabilidad magnética en la naturaleza (aluminio, plástico o mica), con dimensiones de 40 cm x 30 cm x 20 cm y tres compartimentos diferentes. Un cajón superior e inferior: 40 cm x 30 cm x 5, se usan como soportes para imanes, en tanto que la parte media es una cámara de tratamiento de 40 cm x 30 cm x 10 cm, en la cual se pueden colocar muestras en estantes adecuados que se van a exponer a campos magnéticos estáticos uniformes y/o eléctricos en pulsos. Se hace referencia a la figura 15A que ilustra una realización de la caja de campo.

El estante en el cual se puede monitorear el procedimiento de congelación (es decir, controlar el tiempo para remoción del calor latente durante la formación de hielo) se elaboró por 1) una caja de aluminio de 40 cm x 30 cm x 10 cm de tamaño abierta en dos extremos, y 2) un estante de aluminio donde la superficie superior contuvo 36 orificios de diámetro estándar de tipo crio-tubo, 3) Además, se montaron dos ventiladores (11 cm de diámetro de punta a punta, 230 V CA/ 0,12 A) en un extremo generando un flujo de aire de hasta 8 m/s (como se mide a temperatura ambiente), montado en un soporte cuadrado de 12 cm x 12 cm, y 3,8 cm de espesor, con una frecuencia máxima de 2700 rpm, flujo de aire máximo de 2,66 m3/min.

En diferentes posiciones en el estante, se colocaron crio-tubos que contienen NaCl al 0,9 % que contienen sensores de temperatura para permitir el monitoreo del proceso de congelación por conexión a un instrumento de registro. Se asumió que la formación de hielo y el proceso de remoción del calor latente monitoreado en el NaCl correspondían al proceso de congelación en muestras colocadas cerca que contienen suspensión de células que se va a probar para viabilidad después de la congelación. El estante se colocó en un congelador con los cables del sensor de temperatura extendiéndose hacia afuera hasta las unidades de registro. Al variar el flujo de aire a través del estante, se pueden generar diferentes intervalos de tiempo para remoción del calor latente durante la formación de hielo.

El estante se diseñó para ajustarse en la caja de campo. En el extremo opuesto de los ventiladores, se montó un manguito con capacidad de un estante de muestras con hasta 16 muestras en un ambiente que se va a colocar fuera de la caja de campo. Los dos estantes de muestras se conectaron perfectamente para facilitar el posicionamiento de las muestras al campo MAG/PEF y al campo de control (= sin campo MAG/PEF) en una operación.

Se hace referencia a la figura 16A, que ilustra un estante de muestras de acuerdo con una realización de la presente invención. En la figura 16B, se colocan sensores de temperatura dentro de los orificios, por ejemplo, en las muestras de líquido. Además, dos sensores se colocan “desnudos”, es decir, fuera de los crio-tubos, en el flujo de aire. Todos los sensores de temperatura se conectan a un sistema de control.

Además, se usaron dos cajas de 30 cm x 20 cm x 2,55 cm para montar y empacar los imanes para colocación posterior en las cajas de cajones. Estas cajas se elaboraron de un armazón de plástico fuerte de 2 cm con un fondo de madera impermeable de 1,5 cm y una parte superior de una cubierta de lámina de mica de plástico de 0,6 cm. En la madera se hicieron 12 espacios idénticos de 5,1 cm x 5,1 cm x 0,3 cm. Estos se usaron para unir placas metálicas delgadas (atornilladas a la madera inferior) a fin de mantener los imanes en su lugar. Se hace referencia a la figura 15B que ilustra una realización del soporte de imanes.

Se creó un campo eléctrico en pulsos (PEF) a partir de dos dispositivos: una fuente de alimentación en pulsos y un par de electrodos, que convirtieron el voltaje en pulsos en PEF. Una disposición de condensador de placa paralela que comprende dos placas de aluminio de 40 cm x 30 cm conectadas directamente a un suministro de voltaje funcional produjo un campo uniforme en el volumen entre las placas. La separación entre las dos placas se rellena con aire de permitividad relativa de uno y con conductividad cero. El campo eléctrico en pulsos fue una forma de onda de pulso cuadrado. Dos condensadores de placa de aluminio de área paralela separados por 10 cm y conectados a una fuente de alimentación.

El campo magnético estático se produjo en esta caja de campo al montar 24 imanes permanentes de bloque NdFeB (cada uno que tiene campo superficial de 0,42 T). Se dispusieron 12 imanes en el cajón superior y en el cajón inferior. Cada imán de bloque tuvo dimensiones de 5,08 cm x 5,08 cm x 2,54 cm con espaciamientos de 2,0 - 2,5 cm.

La simulación se realizó tanto para el campo eléctrico en pulsos como para el campo magnético estático, a fin de mostrar y verificar la fuerza y distribución de campo, usando COMSOL Multiphysics ver. 5.0., un paquete de software de simulación para diferentes aplicaciones de física e ingeniería. El software se basó en el método de elementos finitos (FEM), una técnica numérica en matemáticas para calcular soluciones aproximadas de ecuaciones diferenciales parciales (PDE) con condiciones de límite conocidas. Aquí la forma de ecuación diferencial parcial de ecuaciones de Maxwell de fenómenos electromagnéticos se puede resolver numéricamente usando el software.

El campo eléctrico dentro y fuera de la caja de campo horizontalmente a través de la mitad de las dos placas se muestra en la figura 17. La figura muestra que el vector de campo eléctrico es casi constante dentro de la caja y cae significativamente y se convierte en cero cuando se aleja de la caja. El vector de campo eléctrico entre la placa inferior y la placa superior también es constante como se muestra en la figura 5. Las figuras muestran que el vector de campo eléctrico en cualquier dirección dentro de la caja es uniforme.

La simulación se realizó usando el software Comsol Multiphysics (versión 5.0) y los resultados se presentan en las figuras 19 a 24.

Se hace referencia a la figura 19 que ilustra la densidad de flujo magnético y transmisión de vector de campo magnético (lado de 4 imanes).

Se hace referencia a la figura 20 que ilustra la densidad de flujo magnético desde la superficie superior del imán inferior hasta la superficie inferior del imán superior en el centro del imán.

Se hace referencia a la figura 21 que ilustra la densidad de flujo magnético a lo largo de la línea que pasa a través del centro del imán desde cada lado. Esto es para mostrar la distribución de densidad de flujo magnético por arriba, dentro y debajo de la caja de campo.

Se hace referencia a la figura 22 que ilustra la densidad de flujo magnético desde la superficie superior del imán inferior hasta la superficie inferior del imán superior en el centro de la unión de cuatro imanes.

Se hace referencia a la figura 23 que ilustra la densidad de flujo magnético a lo largo de la línea que pasa entre dos imanes. Esto es para mostrar la densidad de flujo magnético por arriba, dentro y debajo de la caja de campo.

Se hace referencia a la figura 24 que ilustra la magnitud de la densidad de flujo magnético a lo largo de la separación media entre los conjuntos superior e inferior de imanes, que es el centro de la caja de campo.

Lista de símbolos de referencia usados

1 Recipiente para muestra biológica o muestra de calibración

2 Primer miembro de la placa

3 Construcción en contacto térmico con el miembro de placa

4 Aberturas para fluido de enfriamiento

5 Hendiduras

6 Bisagra

7 Segundo miembro de placa

8 Agregado de cierre

9 Soporte de recipiente

10 Miembro de generación de viento

11 Muestra de calibración

12 Muestra biológica

13 Baño de enfriamiento

14 Soporte/estante de muestras giratorio

15 Dispositivo de enfriamiento

16 Termómetro

17 Varilla de enfriamiento

18 Circulador

19 Miembro agitador

20 Soporte

21 Entrada para aire

22 Salida para aire

23 Sistema de control

24 Sensores de temperatura

25 Medio de generación de campo magnético

26 caja

27 compartimento superior

28 compartimento inferior

29 compartimento medio

30 estante de muestras

31 soporte de imanes

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para congelar células humanas y/o animales en suspensión, donde una o más muestras de células humanas y/o animales en suspensión (12) se contienen en uno o más recipientes (1) que comprenden uno o más líquidos, el método que comprende:

controlar la capacidad de enfriamiento de tal manera que se puede regular y controlar el tiempo de transición de fase de una muestra,

determinar el enfriamiento necesario de modo que el tiempo de transición de fase de una muestra de calibración (11) contenida en un recipiente (1) es una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos;

enfriar esta una o más muestras (12) de la misma manera como esta muestra de calibración (11) al controlar la cantidad de enfriamiento, de modo que el tiempo de transición de fase de la muestra (11) se regula a una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos,

donde menos de 2 % del crioprotector del volumen de muestra total se adiciona al recipiente (1) que contiene el material biológico (12).

2. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con la reivindicación 1, donde la una o más muestras se exponen a un campo magnético y/o un campo eléctrico pulsante durante el tiempo de transición de fase finita, durante un período de tiempo de al menos 1 minuto, tal como al menos 2 minutos, tal como al menos 3 minutos, tal como al menos 4 minutos, tal como todo el tiempo de transición de fase finita.

3. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde este recipiente (1) no excede 100 mm en ninguna dimensión, tal como no excede 50 mm, preferentemente no excede 25 mm.

4. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el enfriamiento de esta una o más muestras contenidas en recipientes (1) comprende:

- colocar este recipiente (1) en una configuración que comprende un ventilador u otro medio de generación de viento, donde el viento generado enfría el recipiente (1) y el contenido del recipiente (1),

- regular el medio de generación de viento, tal como la velocidad del viento generado para lograr este enfriamiento.

5. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con la reivindicación 1, donde el enfriamiento de este recipiente (1) comprende:

colocar este recipiente (1) en un baño de enfriamiento (13),

regular la potencia de enfriamiento del baño de enfriamiento al reducir o al incrementar la temperatura de la solución de congelación para lograr este enfriamiento.

6. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión como se reivindica en la reivindicación 1, donde el enfriamiento de este recipiente (1) comprende:

- colocar este recipiente (1) en un primer miembro de placa (2),

- regular el enfriamiento de este primer miembro de placa (2) para lograr este enfriamiento.

7. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además:

- un segundo miembro de placa (7) que se cierra en este primer miembro de placa (2).

8. El método para congelar células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde las muestras de células humanas y/o animales en suspensión (12) que se van a congelar son células humanas, células animales, líneas de células, células primarias, células madre, células de tejido, productos sanguíneos, embriones, espermatozoides o huevos de pescado.

9. Un aparato para congelar muestras de células humanas y/o animales en suspensión de acuerdo con el método de las reivindicaciones 1-8, donde el aparato comprende

- un sistema de enfriamiento que comprende un miembro de generación de viento, tal como un ventilador, configurado para enfriar estas muestras durante un período de tiempo,

- un primer miembro de placa (2), que puede soportar una muestra de material biológico (12), este primer miembro de placa (2) que está en contacto térmico con este sistema de enfriamiento,

- un segundo miembro de placa (7), donde este primer miembro de placa (2) y este segundo miembro de placa (7) pueden moverse entre sí, y

- un sistema de control (23) que es capaz de determinar y regular el enfriamiento necesario de modo que el tiempo de transición de fase finita de una muestra de calibración (1) es una longitud más o menos precisa por debajo de 6 minutos; y

- configurarse para controlar el sistema de enfriamiento de modo que estas muestras se enfríen de la misma manera como la muestra de calibración (11).

10. Un aparato de acuerdo con la reivindicación 9, donde el sistema de control comprende sensores de temperatura (24) sumergidos en la muestra de calibración (11) y donde el sistema de control (23) determina el enfriamiento necesario con base en los datos de entrada de los sensores de temperatura (24).

11. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde el aparato comprende además un medio de generación de campo magnético (25), configurado para exponer la una o más muestras a una intensidad de campo magnético entre 0,0001 T y 1,0 T.

12. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde el medio de generación de campo magnético (25) comprende una pluralidad de imanes, tal como imanes de bloque permanentes, dispuestos en un arreglo.

13. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde el aparato comprende un medio de generación de campo eléctrico pulsante, configurado para exponer la una o más muestras a un campo eléctrico pulsante con una intensidad en el intervalo de 0,1 - 100 V/cm y una frecuencia pulsante en el intervalo de 1 - 1000 kHz.

14. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde el campo eléctrico en pulsos se elabora a partir de un suministro de energía en pulsos, un par de electrodos y una disposición de condensador de placa que comprende dos placas de aluminio separadas en paralelo.

15. Un aparato de acuerdo con la reivindicación 9, donde las muestras de células humanas y/o animales en suspensión que se van a congelar son células humanas, células animales, líneas de células, células primarias, células madre, células de tejido, productos sanguíneos, embriones, espermatozoides o huevos de pescado.