CN113016777A - 一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂 - Google Patents

一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，由冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖组成。本发明通过添加荷叶提取物和绞股蓝多糖提高对异齿裂腹鱼精液的保护，减少冷冻过程中的活性氧对精子的损伤。

Description

一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂
技术领域
本发明涉及鱼类养殖技术领域，尤其是涉及一种野生异齿裂腹鱼 精液冷冻保护剂。
背景技术
异齿裂腹鱼隶属于鲤形目,鲤科,裂腹鱼亚科,裂腹鱼属,俗称欧氏 弓鱼,副裂腹鱼,异齿弓鱼,地方名为棒棒鱼,是一种我国特有的高原冷 水性鱼种,分布于雅鲁藏布江中上游干支流及附属水体中。为了保护 野生异齿裂腹鱼，一方面是开展异齿裂腹鱼的养殖业，另一方面是需 要对野生异齿裂腹鱼进行保护，而对异齿裂腹鱼精液冷冻保存，不但 可以提高异齿裂腹鱼人工繁殖过程中的受精率，而且还有利于异齿裂 腹鱼的种质资源的保护。
相关研究表明，精液在冷冻平衡过程中，不可避免的通过呼吸代 谢产生大量的活性氧(ROS),其所携带的氧自由基(O2-、H2O2和-OH) 能使精子细胞膜的不饱和脂肪酸发生氧化，造成精子细胞膜损伤，最 终导致猪精子受精能力急剧下降。因此，在冷冻液中加入抗氧化成分 可以起到一定的保护作用。
荷叶提取物中主要含有黄酮类、生物碱类和鞣质类成分，黄酮类 物质是大多数氧自由基的清除剂，对治疗冠心病、高血压等疾病有显 著效果，并且有抗菌消炎的作用；荷叶提取物在较低的浓度下即可显 示出非常强的抗氧化能力。生物碱有降血脂作用、抗自由基、抑制高 胆固醇血症和动脉硬化等药疗、食疗功效，而且还有较强的抑菌效果。
绞股蓝又名七叶胆、甘茶蔓、七叶参，是葫芦科绞股蓝属植物。 绞股蓝主要有效成分之一为绞股蓝总皂甙，有80余种。绞股蓝有“南 方人参”之称，其总皂甙含量是人参总皂甙的四倍，具有降血脂，降 血压，坑疲劳，抗衰老，促生长，防癌抗癌等功效。绞股蓝主要有效 成分之二是绞股蓝多糖，它具有SOD类似的活性，可清除超氧阴离 子(O2-)和羟基自由基(OH)，据最近有关研究证实，绞股蓝多糖可抑制 肿瘤细胞的增殖，绞股蓝多糖无任何毒副作用，且能对抗化疗药物引 起的骨髓抑制等不良反应，保护细胞免受自由基的攻击，对机体的免 疫机能有一定的增强作用，并有抗氧化、抗衰老等作用。
目前，鲜少有将荷叶提取物和绞股蓝多糖应用于鱼类精液的冷冻 保存上。所以，本研究通过大量反复试验和剂量冷冻筛选，发现了荷 叶提取物和绞股蓝多糖在鱼类精液冷冻保护中具有显著的效果。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂， 以提高对异齿裂腹鱼精液的保护，减少冷冻过程中的活性氧对精子的 损伤。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，由冷冻基础液、荷叶提取 物和绞股蓝多糖组成，所述荷叶提取物由包括如下步骤的方法制备得 到：
1)称取新鲜荷叶和干荷叶，并分别进行粉碎，将得到的新鲜荷 叶碎和干荷叶碎用纤维素酶预处理1-2h；
2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:5-10加 入到高浓度乙醇溶液中常温浸泡3-6h，同时进行超声处理；
3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化 水，使料液比达到1：20-30，常温下，超声处理6-12h；
4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷 叶提取物和干荷叶提取物备用；
5)将新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物按照重量份数比0.5-2:1混 合得到荷叶提取物。
进一步，所述冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖的重量份数 比为90-120:0.5-1:0.05-0.1。
进一步，所述冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖的重量份数 比为100:0.8:0.06。
进一步，每1000ml冷冻基础液中含有葡萄糖1-1.5g、甘油5-10ml、 柠檬酸1.2-1.6g、甘氨酸0.3-0.6g、咖啡因20-50mg。
本发明还提供了一种如上述任一项所述的野生异齿裂腹鱼精液 冷冻保护剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)称取新鲜荷叶和干荷叶，并分别进行粉碎，将得到的新鲜荷 叶碎和干荷叶碎用纤维素酶预处理1-2h；
2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:5-10加 入到高浓度乙醇溶液中常温浸泡3-6h，同时进行200-300W超声处理；
3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化 水，使料液比达到1：20-30，常温下，200-300W超声处理6-12h；
4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷 叶提取物和干荷叶提取物备用；
5)将新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物按照重量份数比0.5-2:1混 合得到荷叶提取物，并将荷叶提取物放置在0-4℃储存备用；
6)将配方量葡萄糖、甘油、柠檬酸、甘氨酸、咖啡因溶于纯化 水中，得到冷冻基础液；之后向冷冻基础液中加入荷叶提取物和绞股 蓝多糖混匀，并使用0.2-0.5μm的过滤器过滤得到冷冻保护剂；
7)将过滤得到的冷冻保护剂在低温环境下保存备用。
进一步，所述高浓度乙醇的质量浓度为90-95％。
进一步，所述步骤3)中，超声处理之后进行过滤，向过滤后的 荷叶碎中添加质量浓度为20-35％的乙醇溶液，料液比为1:20-30，并 再次用超声处理3-8h。
相对于现有技术，本发明所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂 具有以下优势：
本发明所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂同时添加荷叶提 取物和绞股蓝多糖的冷冻保护剂能够对异齿裂腹鱼精液起到很好的 保护作用，解冻后的精子活力基本保持为冷冻之前的活力，可能是荷 叶提取物和绞股蓝多糖在精液冷冻过程中减少了活性氧对精子的损 伤，维持了精子的正常形态和功能，同时还提高冷冻精液的复苏率， 减少了冷冻对受精的影响。而且通过实验比较可知，虽然单独使用荷 叶提取物和绞股蓝多糖也能够保护精子，但其效果不够显著，只有当 荷叶提取物和绞股蓝多糖同时使用时，其对精液的保护效果最好，二 者之间存在协同作用，起到了相互促进的作用。通过实验组I-V比较 可知，只有同时添加新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物对精子的保护效 果最好，新鲜荷叶与干荷叶中的成分有些许差异，导致了提取物中的 有效成分也会有差异，而且当新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物添加量 相当时，对精子的保护效果是最好的。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例 中的特征可以相互组合。
下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1荷叶提取物的制备
1)分别称取1000g新鲜荷叶和1000g干荷叶，并分别进行粉碎， 将得到的新鲜荷叶碎和干荷叶碎分别加入2倍重量的纯化水中，并加 入300g纤维素酶预处理1.5h，处理后将荷叶碎捞出；
2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:10加入 到重量浓度为95％的乙醇溶液中常温浸泡4h，同时进行300W超声 处理；
3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化 水，使料液比达到1：30，常温下，300W超声处理10h；
并在超声处理之后进行过滤，向过滤后的荷叶碎中添加质量浓度 为25％的乙醇溶液，料液比为1:30，并再次用超声处理5h；
4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷 叶提取物和干荷叶提取物备用；
5)取3g新鲜荷叶提取物和5g干荷叶提取物混合后得到荷叶提 取物A，取4g新鲜荷叶提取物和4g干荷叶提取物混合后得到荷叶提 取物B，取5g新鲜荷叶提取物和3g干荷叶提取物混合后得到荷叶提 取物C，取8g新鲜荷叶提取物记为荷叶提取物D，取8g干荷叶提取物记为荷叶提取物E，并将荷叶提取物A、B、C、D、E放置在4℃ 储存备用。
实施例2冷冻保护剂的制备
分别按照表1所示混合各组分，制备冷冻保护剂I、冷冻保护剂 II、冷冻保护剂III、冷冻保护剂IV、冷冻保护剂V、冷冻保护剂VI、 冷冻保护剂VII、冷冻保护剂VIII。
其中，每1000ml冷冻基础液中含有葡萄糖1.25g、甘油10ml、 柠檬酸1.3g、甘氨酸0.45g、咖啡因25mg。
表1冷冻保护剂成分表
Figure BDA0002868835870000061
Figure BDA0002868835870000071
发明人对该实施例的冷冻保护剂使用效果进行了如下试验：
1、精液采集
选择人工养殖的性腺发育成熟的雄性异齿裂腹鱼亲鱼，抓取雄鱼 放入干毛巾中，吸干体表水后，用手指挤压其腹部两侧，待精液流出 后，用经75％酒精消毒的胶头滴管地区精液。
取2μL精液，加入15μL去离子水混匀置于载玻片上，盖上玻 片，用光学显微镜检测，只有能向前运动的精子被认为有活力(静止 在同一地方运动的则视为无活力)，以百分比来计算其能动性，测得 精子能动性为87.52％。
2、精液冷冻储存
取9个干净的2ml的冻存管，每个冻存管中加入0.5ml精液，其 中一个冻存管做空白对照组，什么也不加，其余8个冻存管作为实验 组I-VIII，分别加入1ml的冷冻保护剂I、冷冻保护剂II、冷冻保护 剂III、冷冻保护剂IV、冷冻保护剂V、冷冻保护剂VI、冷冻保护剂VII和冷冻保护剂VIII，并混匀。然后按照三步降温法进行冷冻保存， 即液氮罐顶部(-15℃)停留2min，液氮面上约4cm处(约-160℃) 停留5min，再直接投入液氮中保存。
3、精子复苏
解冻时，先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留约2min，然 后将冻存管取出迅速置于28℃水浴中解冻90s，取出置于室温下至完 全融化。
4、精子激活后的活力检验
室温条件下，取2μL解冻精液，加20μL人工养殖异齿裂腹鱼 的养殖水激活精子，同样在显微镜下检查精子活力，统计精子快速运 动时间，如表2。
表2精子活力及快速运动时间
Figure BDA0002868835870000081
5、受精效果检验
人工采集成熟异齿裂腹鱼卵子，分别使用实验组I-VIII解冻后的 精液与新鲜精液作为对照组，与刚采集的卵子进行人工受精，将受精 卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。
其方法是：将解冻后的精液用养殖水激活后即刻对卵子受精，受 精时间10min，用养殖水冲洗卵子并将沉卵和漂浮卵分离，将各组处 理中的浮卵分别计数500粒，分别移入容积为10000ml的玻璃钢内， 用控温仪控温11-12℃孵化，连续微量充气流水孵化，3h后检查受精 率，210h后胚胎孵化出膜，统计孵化率，如表3。
表3受精率及孵化率
Figure BDA0002868835870000091
从表2和表3可以看出，同时添加荷叶提取物和绞股蓝多糖的冷 冻保护剂能够对异齿裂腹鱼精液起到很好的保护作用，解冻后的精子 活力基本保持为冷冻之前的活力，可能是荷叶提取物和绞股蓝多糖在 精液冷冻过程中减少了活性氧对精子的损伤，维持了精子的正常形态 和功能，同时还提高冷冻精液的复苏率，减少了冷冻对受精的影响。 而且通过实验组I-V与实验组VI-VII比较可知，虽然单独使用荷叶 提取物和绞股蓝多糖也能够保护精子，但其效果不够显著，只有当荷 叶提取物和绞股蓝多糖同时使用时，其对精液的保护效果最好，二者 之间存在协同作用，起到了相互促进的作用。通过实验组I-V比较可 知，只有同时添加新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物对精子的保护效果 最好，新鲜荷叶与干荷叶中的成分有些许差异，导致了提取物中的有 效成分也会有差异，而且当新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物添加量相 当时，对精子的保护效果是最好的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，其特征在于：由冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖组成，所述荷叶提取物由包括如下步骤的方法制备得到：
1)称取新鲜荷叶和干荷叶，并分别进行粉碎，将得到的新鲜荷叶碎和干荷叶碎用纤维素酶预处理1-2h；
2)分别将预处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:5-10加入到高浓度乙醇溶液中常温浸泡3-6h，同时进行超声处理；
3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化水，使料液比达到1：20-30，常温下，超声处理6-12h；
4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物备用；
5)将新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物按照重量份数比0.5-2:1混合得到荷叶提取物。
2.根据权利要求1所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖的重量份数比为90-120:0.5-1:0.05-0.1。
3.根据权利要求1或2所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖的重量份数比为100:0.8:0.06。
4.根据权利要求1所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，其特征在于：每1000ml冷冻基础液中含有葡萄糖1-1.5g、甘油5-10ml、柠檬酸1.2-1.6g、甘氨酸0.3-0.6g、咖啡因20-50mg。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)称取新鲜荷叶和干荷叶，并分别进行粉碎，将得到的新鲜荷叶碎和干荷叶碎用纤维素酶预处理1-2h；
2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:5-10加入到高浓度乙醇溶液中常温浸泡3-6h，同时进行200-300W超声处理；
3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化水，使料液比达到1：20-30，常温下，200-300W超声处理6-12h；
4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物备用；
5)将新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物按照重量份数比0.5-2:1混合得到荷叶提取物，并将荷叶提取物放置在0-4℃储存备用；
6)将配方量葡萄糖、甘油、柠檬酸、甘氨酸、咖啡因溶于纯化水中，得到冷冻基础液；之后向冷冻基础液中加入荷叶提取物和绞股蓝多糖混匀，并使用0.2-0.5μm的过滤器过滤得到冷冻保护剂；
7)将过滤得到的冷冻保护剂在低温环境下保存备用。
6.根据权利要求5所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，其特征在于：所述高浓度乙醇的质量浓度为90-95％。
7.根据权利要求5所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，其特征在于：所述步骤3)中，超声处理之后进行过滤，向过滤后的荷叶碎中添加质量浓度为20-35％的乙醇溶液，料液比为1:20-30，并再次用超声处理3-8h。
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