ES2914085T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos lisosomales - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un agente que facilita la regulación al alza del factor de transcripción EB para el uso en el tratamiento de un trastorno por depósito lisosomal, donde (I) el agente es ácido cinámico; o (Ii) el agente es benzoato de sodio.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos lisosomales
Campo técnico
La presente invención se refiere en términos generales a las composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos por depósito lisosomal.
Antecedentes
Los lisosomas son orgánulos unidos a la membrana que contienen multitud de enzimas hidrolíticas que son altamente activas en medios ácidos (1-3). Se ha demostrado que el lisosoma, que se describe tradicionalmente como el orgánulo de gestión de residuos, participa en importantes procesos celulares, entre los que se incluyen la degradación del desarrollo, la muerte celular programada y respuestas nutricionales (2, 4-8). Las diversas funciones y respuestas del lisosoma a diferentes estímulos sugieren una regulación coordinada de la expresión de genes lisosomales (9, 10). Estudios recientes ofrecen información limitada sobre la regulación de genes lisosomales (11, 12), pero los análisis de detección de patrones para los genes lisosomales revelaron la presencia de un elemento de regulación y expresión lisosomal coordinada (CLEAR), que es un potencial punto de unión para el factor de transcripción EB (TFEB), un miembro de la subfamilia del factor de transcripción asociado a microftalmia E (MiT/TFE) de los factores bHLH (hélice-bucle-hélice básica). El estudio revela un potencial vínculo entre TFEB y la biogénesis lisosomal (9, 10, 12).
La regulación de TFEB parece ser compleja y dependiente del tipo de célula y de los estímulos. En diferentes osteoclastos, una vía de señalización dependiente de RANKL induce la biogénesis lisosomal inducida por la activación de TFEB (13). La inanición o las condiciones de estrés también pueden activar TFEB, que, de lo contrario, se mantiene en un estado desactivado por mTORC1 (14, 15). Un estudio también demostró que la actividad de TFEB inducida por inanición puede desempeñar un papel fundamental en el metabolismo de los lípidos y que el TFEB activado también puede autorregular su propia expresión genética (16).
Las enfermedades por depósito lisosomal (EDL) son un grupo de unos 50 trastornos metabólicos hereditarios poco frecuentes que se producen por defectos en la función lisosomal.
Los síntomas de las EDL varían en función del trastorno en cuestión y de otras variables como la edad de aparición, y pueden ser de leves a graves. Entre ellos se pueden incluir retraso en el desarrollo, trastornos motores, convulsiones, demencia, sordera y/o ceguera. Algunas personas con EDL tienen el hígado agrandado (hepatomegalia) y el bazo agrandado (esplenomegalia), problemas pulmonares y cardíacos, y crecimiento óseo anómalo.
EP 1837056 A2 divulga una composición antienvejecimiento que contiene ácido cinámico y/o retinol.
WO 2014/089449 A1 divulga el uso de gemfibrozilo, en monoterapia o combinado con ácido transretinoico total, en el tratamiento de trastornos por depósito lisosomal.
A. Ghosh et al. "Gemfibrozil and fenofibrate, Food and Drug Administration-approved lipid-lowering drugs, upregulate tripeptidyl-peptidase 1 in brain cells via peroxisome proliferator-activated receptor a: implications for late infantile Batten disease therapy", Journal of Biological Chemistry, Vol. 287, n.° 46, páginas 38922-38935, divulga el uso de gemfibrozilo, en monoterapia o combinado con ácido transretinoico total, en el tratamiento de trastornos por depósito lisosomal.
Resumen de realizaciones preferentes
La invención se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a:
Una composición que comprende un agente que facilita la regulación al alza del factor de transcripción EB para el uso en el tratamiento de un trastorno por depósito lisosomal, donde
(i) el agente es ácido cinámico; o
(ii) el agente es benzoato de sodio.
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de una EDL. El método puede incluir la administración a un sujeto que necesita este tratamiento, de una composición que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que facilita la regulación al alza del factor de transcripción EB (TFEB). En un aspecto de la presente divulgación, el agente es una estatina. Por ejemplo, la estatina puede ser atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina o simvastatina. El agente también puede ser, por ejemplo, un fármaco hipolipemiante, como un fibrato. En algunos aspectos de la presente divulgación, el fibrato es gemfibrozilo o fenofibrato. En otros aspectos de la presente divulgación, el agente es un analgésico, un antipirético, aspirina, un metabolito de canela, ácido cinámico, fenilbutirato de sodio o benzoato de sodio. En otros aspectos más de la presente divulgación, la composición puede incluir una combinación de al menos dos de los agentes anteriores.
La composición también puede incluir ácido transretinoico total o vitamina A. Por ejemplo, la composición puede incluir una estatina o un fibrato y ácido transretinoico total o vitamina A. Esta combinación del agente o los agentes con ácido transretinoico total o vitamina A puede ofrecer un mejor efecto terapéutico en un sujeto que la administración en monoterapia de ácido transretinoico total, vitamina A o solo fibrato. La combinación puede ser sinérgica. TFEB también se puede regular al alza aumentando los niveles de ARNm del factor de transcripción EB, aumentando los niveles de proteína del factor de transcripción EB o activando un heterodímero PPARa-RXRa.
Una EDL puede ser un trastorno neurodegenerativo, por ejemplo, lipofuscinosis ceroide neuronal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosos lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, incluyendo enfermedades parkinsonianas como la atrofia multisistémica (AMS), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (DCB) o demencia con cuerpos de Lewy (DCL). En otro aspecto de la presente divulgación, la EDL es un trastorno de la vía de autofagia y en la que el agente aumenta la biogénesis lisosomal.
En otros aspectos de la presente divulgación, la EDL es la enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Fabry, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, síndrome de Hunter, alfa-manosidosis, aspartilglucosaminuria, enfermedad por depósito de ésteres de colesterol, deficiencia crónica de hexosaminidasa A, cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Farber, fucosidosis, galactosialidosis o enfermedad de Batten, incluyendo enfermedad de Batten de inicio infantil tardío y juvenil.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de una EDL que incluye la administración a un sujeto que necesita este tratamiento de una composición que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que facilita la regulación al alza del gen Tfeb. Otro aspecto más proporciona un método para el tratamiento de una EDL que incluye la administración a un sujeto que necesita este tratamiento de una composición que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, donde el agente restaura la actividad de TFEB.
Breve descripción de las ilustraciones
La Figura 1 muestra gemfibrozilo y ácido retinoico regulando al alza los niveles de proteína y el ARNm de TFEB en células del cerebro. (A, B) Se trataron astrocitos primarios de ratón con diferentes concentraciones de gemfibrozilo y ácido transretinoico total (ATRA) en medio DMEM/F-12 libre de suero durante 12 horas. A continuación se controlaron los niveles de ARNm de Tfeb mediante qRT-PCR (A) y los niveles de proteína de TFEB mediante immunoblot (B). (C) Análisis densitométrico del inmunoblot para TFEB (en relación con ( pactina). (D, E), Se trataron astrocitos primarios de ratón con una combinación de gemfibrozilo (10pM) y ATRA (0.2pM) durante 4, 6, 12 y 24 horas en condiciones de cultivo similares. A continuación se controlaron los niveles de ARNm de TFEB mediante qRT-PCR (D) y los niveles de proteína mediante immunoblot (E). (F) Análisis densitométrico del inmunoblot para TFEB. Todos los resultados son representativos de o la media ± SEM (error estándar de la media) de al menos tres series de experimentos independientes. (G, I) Se trataron astrocitos primarios de ratón (G) y neuronas primarias de ratón (I) con una combinación de gemfibrozilo y ácido retinoico en condiciones libres de suero durante 24 horas y se les añadió una doble etiqueta para TFEB (roja) - GFAP (verde) y TFEB (roja) - Map2 (verde), respectivamente. Se utilizó DAPI para teñir los núcleos. Barra de escala = 20pm (para G), barra de escala = 5pm para imágenes de gran aumento (para G); Barra de escala = 50pm (para I), barra de escala = 10pm para imágenes de gran aumento (para I). (H,J) Cuantificación de inmunorreactividad de TFEB (TFEB IR) en la célula completa y en el núcleo, para astrocitos primarios de ratón (H) y neuronas primarias de ratón (j) calculada como múltiplo respecto del control. Al menos 25 imágenes distintas por condición de tres series independientes de experimentos se cuantificaron utilizando ImageJ. p f < 0,05 frente al control sin tratar.
La Figura 2 muestra la participación de PPARa y RXRa en la regulación al alza de proteína y ARNm de TFEB mediada por un fármaco de fibratos: (A, B) Se trataron astrocitos primarios de ratón aislados de ratones PPARa-/- y PPARp-/- y tipo salvaje (WT) con una combinación de gemfibrozilo (10pM) y ácido retinoico (0,2pM) en DMEM/F12 libre de suero durante 24 horas. A continuación, se controló la expresión de ARNm de Tfeb por PCR en tiempo real (A) y el nivel de proteína de TFEB por inmunoblot (B). (C) Análisis densitométrico de nivel de TFEB (en relación con (p-actina) en astrocitos PPARa-/- y PPARp-/- y WT pa<0,05 frente a control WT; pb<0,05 frente a control PPARa-/-; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. (D) Se pretrataron astrocitos primarios de ratón aislados de ratones WT con GW9662 durante 30 min y se aplicó un tratamiento con gemfibrozilo y ácido retinoico en condiciones de cultivo similares. A continuación se controlaron los niveles de expresión de la proteína TFEB mediante inmunoblot. (E) Análisis densitométrico de inmunoblot para TFEB (en relación con (p-actina) pf<0,05 frente al control; ns- no significativo respecto del control. (F) Se trataron astrocitos primarios de ratón aislados de ratones PPARa-/- y PPARp-/- y WT con 10pM de gemfibrozilo y 0,2pM de ácido retinoico en DMEM/F12 libre de suero durante 24 horas y se utilizó una doble etiqueta para TFEB (rojo) y GFAP (verde). Se utilizó DAPI para teñir los núcleos. UN- Sin tratamiento. Barra de escala = 20pM. (G) Cuantificación de inmunorreactividad de TFEB (TFEB IR) para astrocitos primarios de ratón calculada como múltiplo respecto del control. Al menos 25 imágenes diferentes por condición de tres series independientes de experimentos se cuantificaron utilizando ImageJ. pa<0,05 frente al control WT; pb<0,05 frente a control PPARp-/-; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. (H, I, J) Astrocitos primarios de ratón fueron no transfectados, transfectados con siARN aleatorio (1,0pg) o siARN RXR (1,0pg) durante 36 horas y se aplicó un tratamiento con RA (0,2pM) y gemfibrozilo (10pM) en combinación durante 24 horas en medio DMEM/F12 libre de suero. A continuación se realizó una RT-PCR para RXRa para comprobar el nivel de silenciamiento del gen (H) y una PCR cuantitativa en tiempo real para TFEB (J) e inmunoblot para TFEB (J). (K) Análisis densitométrico del inmunoblot para TFEB (en relación con (p actina). p* < 0,05 frente a control no transfectado; p** < 0,05 frente a control transfectado de siARN aleatorio; ns- no significativo respecto del control transfectado de RXR-a siRNA. Todos los resultados son representativos de o la media ± SEM (error estándar de la media) de al menos tres series de experimentos independientes.
La Figura 3 muestra PPARa que regula transcripcionalmente la expresión de TFEB en condiciones de tratamiento: (A) Mapa del sitio PPRE de tipo salvaje y mutado de construcciones del promotor de TFEB-luciferasa. (B) Las células BV2 se transfectaron con TFEB(WT)-Luc durante 24 horas seguido de un tratamiento con diferentes concentraciones de gemfibrozilo y ácido retinoico solos y combinados. Después se sometió a un ensayo de luciferasa, p* < 0,05 frente al control sin tratar. (C) Las células BV2 se transfectaron con pTFEB(WT)-Luc durante 24 horas y se aplicó un pretratamiento con antagonistas de PPARa-, PPARp-, PPARy-. A continuación se aplicó un tratamiento con gemfibrozilo y ácido retinoico y se sometió a un ensayo de luciferasa, p* < 0,05 frente al control sin tratar. p# < 0,05 frente al tratamiento. (D) Los astrocitos primarios de ratón aislados de ratones PPARa-/- (centro) y PPARp-/- (derecha) y WT (izquierda) se transfectaron con pTFEB(WT)-Luc durante 24 horas. A continuación se aplicó un tratamiento con gemfibrozilo y ácido retinoico y se sometió a un ensayo de luciferasa, p* < 0,05 frente al control WT sin tratar.. p# - no significativo frente al control PPARp-/- sin tratar. . p f < 0,05 frente al control PPARp-/- sin tratar. (E, F) Las células BV2 (E) y astrocitos primarios de ratón (F) se transfectaron con pTFEB(WT)-Luc y pTFEB(Mu)-Luc durante 24 horas. A continuación se aplicó un tratamiento con gemfibrozilo y ácido retinoico y se sometió a un ensayo de luciferasa, p* < 0,05 frente a control transfectado con pTFEB(wT)-Luc sin tratar, ns- no significativo respecto del control transfectado con pTFEB(Mu)-Luc sin tratar. Todos los resultados son representativos de la media ± SEM de al menos seis series de experimentos independientes.
La Figura 4 muestra la activación de transcripción de TFEB con un complejo PPARa-RXRa-PGC1a (A) Mapa de PPRE en el promotor de TFEB con la secuencia central y la longitud del amplicón para un ensayo ChlP. (B,C) Se trataron astrocitos de ratón con la combinación de gemfibrozilo (10pM) y RA (0,2pM) durante 30, 60, 120 y 240 minutos y se controló la captación de PPARa (extremo izquierdo), RXRa (centro izquierda), PGC1a (centro derecha) y ARN polimerasa (extremo derecho) en el sitio de unión de PPRE del promotor de Tfeb mediante ChIP seguido de RT-PCR (B) y qRT-PCR (C). La IgG normal se utilizó como control, p* < 0,05 frente al control sin tratar. Todos los resultados son representativos de o la media ± SEM de al menos tres series de experimentos independientes. (D) Representación sistemática de la inducción de biogénesis lisosomal mediante activación de proliferadores peroxisomales.
La Figura 5 muestra la regulación al alza de TFEB dependiente de PPARa que induce la biogénesis lisosomal: (A, B) Se trataron astrocitos primarios de ratón aislados de ratones PPARa-/- y PPARp-/- y de tipo salvaje (WT) con una combinación de gemfibrozilo (10pM) y ácido retinoico (0,2pM) en DMEM/F12 libre de suero durante 24 horas. A continuación, se controló la expresión de ARNm de genes lisosomales (Lamp2 (izquierda), Limp2 (centro), Npc1 (derecha)) por PCR en tiempo real (A) y el nivel de proteínas de LAMP2 por inmunoblot (B). (C) Análisis densitométrico de niveles de LAMP2 (en relación con (p-actina) en PPARa-/- y PPARp-/- y astrocitos de tipo salvaje (WT). pa<0,05 frente a control WT; pb<0,05 frente a control PPARp-/-; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. Todos los resultados son representativos de o la media ± SEM de al menos tres series de experimentos independientes. (F) Se trataron astrocitos primarios de ratón aislados de ratones PPARa-/- y PPARp-/- y WT (tipo salvaje) con 10pM de gemfibrozilo y 0,2pM de ácido retinoico en DMEM/F12 libre de suero durante 24 horas y se utilizó una doble etiqueta para LAMP2 (rojo) y GFAP (verde). Se utilizó DAPI para teñir los núcleos. (E) Cuantificación de inmunorreactividad de LAMP2 (Lamp2 iR) para astrocitos primarios de ratón calculado como múltiplo sobre el control. pa<0,05 frente al control WT; pb<0,05 frente al control PPARp-/-; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. (F) Se trataron neuronas primarias de ratón aisladas de ratones WT con 10pM de gemfibrozilo y 0,2pM de ácido retinoico en DMEM/F12 libre de suero durante 24 horas y se utilizó una doble etiqueta para LAMP2 (rojo) y Map2 (verde). Se utilizó DAPI para teñir los núcleos. (G) Cuantificación de inmunorreactividad de LAMP2 (Lamp2 IR) para neuronas primarias de ratón calculado como múltiplo respecto del control. p*<0,05 frente al control sin tratar. (H) Se trataron astrocitos primarios de ratón aislados de ratones PPARa-/- y PPARp-/- y WT con 10pM de gemfibrozilo y 0,2pM de ácido retinoico en DMEM/F12 libre de suero durante 24 horas y se utilizó una doble etiqueta para Lyso Tracker Red (rojo) y GFAP (verde). (I) Cuantificación de inmunorreactividad de LAMP2 (Lamp2 IR) para astrocitos primarios de ratón calculado como múltiplo sobre el control. pa<0,05 frente al control WT; pb<0,05 frente al control PPARp-/-; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. UN- Sin tratamiento. Barra de escala = 20pm (para D, E y F), barra de escala = 10pm para imágenes de gran aumento (para E). Se analizaron al menos 25 imágenes por condición de tres series de experimentos diferentes para todos los datos de cuantificación de imágenes utilizando ImageJ.
La Figura 6 muestra que la administración oral de gemfibrozilo regula al alza TFEB in vivo en la corteza cerebral de ratones WT y PPARp-/-, pero no en PPARa-/-: (A, D, G) Se trataron ratones WT, PPARa-/- y PPARp-/- (n=6 en cada grupo) con 7,5mg/kg de peso corporal/día de gemfibrozilo y 0,1mg/kg de peso corporal de ácido transretinoico total (disuelto en 0,1% metilcelulosa) o vehículo (0,1% metilcelulosa) vía sonda. Tras 60 días de tratamiento los ratones fueron sacrificados y se aplicó una doble etiqueta a las secciones corticales: para TFEB (rojo) y NeuN (verde). Se utilizó DAPI para visualizar el núcleo (C, F, I) de imágenes de gran aumento que muestran la localización de TFEB y NeuN en la neurona cortical de los ratones del grupo de tratamiento (Wt , PPARa-/- y PPARp-/-). (B, E, H) Cuantificación de inmunorreactividad de TFEB (TFEB IR) en muestras tratadas y no tratadas de cada grupo (WT, PPARa-/- y PPARp-/-) expresada como porcentaje de área. pa<0,05 frente al control WT; pb<0,05 frente al control PPARp-/- control; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. Se cuantificaron al menos 12 secciones de cada grupo (dos secciones por animal) utilizando ImageJ. Barra de escala = 50|iM y 10|im (para imágenes de gran aumento).
La Figura 7 muestra que la administración oral de gemfibrozilo regula al alza LAMP2 in vivo en la corteza cerebral de ratones WT y PPARp-/-, pero no PPARa-/-: (A, D, G) Se trataron ratones WT, PPARa-/- y PPARp-/-(n=6 en cada grupo) con 7,5mg/kg de peso corporal/día de gemfibrozilo y 0,1mg/kg de peso corporal de ácido transretinoico total (disuelto en 0,1% metilcelulosa) o vehículo (0,1% metilcelulosa) vía sonda. Tras 60 días de tratamiento los ratones fueron sacrificados y se aplicó una doble etiqueta a las secciones corticales: para LAMP2 (rojo) y NeuN (verde). Se utilizó DAPi para visualizar el núcleo (C, F, I) de imágenes de gran aumento que muestran la localización de LAMP2 y NeuN en la neurona cortical de los ratones del grupo de tratamiento (WT, PPARa-/- y PPARp-/-). (B, E, I) Cuantificación de inmunorreactividad de LAMP2 (LAMP2 IR) en muestras tratadas y no tratadas de cada grupo (WT, PPARa-/- y PPARp-/-) expresado como porcentaje de área. pa<0,05 frente al control WT; pb<0,05 frente al control PPARp-/- control; ns- no significativo respecto del control PPARa-/-. Se cuantificaron al menos 12 secciones de cada grupo (dos secciones por animal) utilizando ImageJ. Barra de escala = 50|iM y 10|im (para imágenes de gran aumento).
La Figura 8 muestra que la regulación al alza de TFEB induce la biogénesis lisosomal tanto en fibroblastos de pacientes que padecen LINCL como sanos: Se trataron fibroblastos de individuos sanos (WT#1-3) y pacientes de LINCL (NCL#1-5) y vehículo de LINCL (NCL/C) con gemfibrozilo (10|iM) y ácido retinoico (0,2|iM) en medio DMEM bajo en suero (2%) durante 24 horas, seguido de tinción con Lyso Tracker Red (rojo). Se utilizó un microscopio de campo claro para detectar la morfología de las células. Barra de escala = 20|iM. Los correspondientes gráficos representan el cambio múltiplo en las señales LysoTracker positivas en un grupo tratado frente al control para cada tipo de célula, p*< 0,05 frente al control sin tratar. ROI - líneas de puntos blancas, representan el área de la célula. Cambio múltiplo calculado como la señal LysoT positiva por área unitaria y célula en tratamiento frente al control. Al menos 25 imágenes individuales por condición por tipo de célula se cuantificaron utilizando ImageJ.
Las Figuras 9(A)- 9(D) ilustran la regulación al alza de la expresión de ARNm de TFEB en astrocitos de ratón con fármacos para reducir el colesterol (simvastatina y pravastatina), aspirina (analgésico y antipirético), ácido cinámico (metabolito de canela), y fármacos para trastornos del ciclo de la urea (fenilbutirato de sodio y benzoato de sodio).
La Figura 10 ilustra un aumento de la biogénesis lisosomal provocado por aspirina en astrocitos primarios de ratones. Las células se trataron con diferentes concentraciones de aspirina durante 24 horas en condiciones libres de suero seguido de tinción Lyso Tracker. Los resultados representan tres experimentos independientes. La Figura 11 (A)-(D) muestra la regulación al alza de la expresión de LAMP2 con aspirina en astrocitos primarios de ratón. 11 (A) Las células se trataron con 5 |iM de aspirina durante diferentes periodos de tiempo en condiciones libres de suero, mediante monitorización de la expresión de ARNm de LAMP2 por PCR en tiempo real. Los resultados son la media SD de tres experimentos diferentes, ap < 0,05 frente al control bp < 0,001 frente al control. 11(B) Las células se trataron con diferentes concentraciones de aspirina durante 24 horas en condiciones libres de suero, seguido de Western blot para LAMP2. 11 (C) Las células se trataron con 5 |iM de aspirina durante diferentes periodos de tiempo en condiciones libres de suero, seguido de Western blot para LAMP2. 11 (D) Tras 24 horas de tratamiento con aspirina, las células se etiquetaron doblemente para LAMP2 y GFAP. Los resultados representan tres experimentos independientes.
La Figura 12 (A)-(C) muestra un aumento de TPP1 provocado por aspirina en astrocitos primarios de ratones.
12(A) Las células se trataron con diferentes concentraciones de aspirina durante 24 horas en condiciones libres de suero seguido de Western blot para TPP1. 12 (B) Las células se trataron con 5 |iM de aspirina durante diferentes periodos de tiempo en condiciones libres de suero seguido de Western blot para TPP1. Se utilizó actina como molécula constitutiva. 12(C) Se trataron células con diferentes concentraciones de aspirina durante 24 horas en condiciones libres de suero. A continuación se realizó un ensayo de actividad de TPP1 utilizando un extracto de células que contenía 5 |ig de proteína total y Ala-Ala-Fe 7-amido-4-metilcoumarina como sustrato. Los resultados representan tres experimentos independientes.
La Figura 13(A)-(C) ilustra la regulación al alza de TFEB con aspirina en astrocitos primarios de ratón. 13(A) Las células se trataron con diferentes concentraciones de aspirina durante 12 horas en condiciones libres de suero seguido de Western blot para TFEB. Se utilizó actina como molécula constitutiva. 13 (B) Las células se trataron con 5 |iM de aspirina durante 12 horas en condiciones libres de suero seguido por doble etiqueta con GFAP y TFEB. Estos resultados son la media de dos experimentos independientes. 13(C) Se transfectaron células con plásmido p(WT)Tfeb-Luc y tras 24 horas de transfección, se estimularon las células con diferentes dosis de aspirina. Pasadas 4 horas, se midió la actividad de luciferasa de luciérnaga en los extractos celulares totales. Los resultados son la media SD de tres experimentos diferentes. ap < 0,001 frente al control.
La Figura 14(A)-(B) ilustra la activación de PPARa con aspirina en astrocitos primarios de ratón. 14(A) Las células se trataron con 5 pM de aspirina durante intervalos de minutos diferentes, se aislaron los extractos nucleares y se realizó un ensayo de cambio de movilidad electroforética para controlar la actividad de unión a ADN de PPARa utilizando el sitio de unión de PPARa del promotor de Tfeb como sonda. 14(B) Los astrocitos aislados de ratones de tipo salvaje, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) se transfectaron con el plásmido del reporter de luciferasa PPAR (PPRE-x3-TK-luc) y tras 24 horas de transfección, las células se estimularon con diferentes dosis de aspirina. Pasadas 4 horas, se midió la actividad de luciferasa de luciérnaga en los extractos celulares totales. Los resultados son la media SD de tres experimentos diferentes. ap < 0,001 frente al control.
La Figura15(A)-(C) ilustra que la aspirina eleva el nivel de TFEB en astrocitos vía PPARa. Los astrocitos aislados de ratones WT 15(A), PPARa (-/-) 15(B) y PPARp (-/-) 15(C) se trataron con 5 pM de aspirina durante 12 horas en condiciones libres de suero seguido por doble etiqueta para TFEB y GFAP. Los resultados representan tres experimentos independientes.
La Figura16(A)-(B) ilustra que la aspirina eleva el nivel de LAMP2 en astrocitos vía PPARa. Los astrocitos aislados de ratones WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) se trataron con diferentes concentraciones de aspirina durante 24 horas en condiciones libres de suero seguido de Western blot para LAMP2 16(A). Se utilizó actina como molécula constitutiva. Las bandas se escanearon y expresaron en relación al control 16(B). Los resultados son la media SD de tres experimentos diferentes. ap < 0,05 frente al control; bp < 0,001 frente al control, ns, no significativo.
La Figura17(A)-(C) ilustra que la aspirina aumenta la biogénesis lisosomal en astrocitos vía PPARa. Los astrocitos aislados de ratones WT 17(A), PPARa (-/-) 17(B) y PPARp (-/-) 17(C) se trataron con 5 pM de aspirina durante 24 horas en condiciones libres de suero seguido de tinción Lyso Tracker. Los resultados representan tres experimentos independientes.
Descripción detallada de las realizaciones preferentes Definiciones
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que comúnmente comprendería un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluyendo las definiciones. A continuación se describen los métodos y materiales preferentes, aunque en la práctica o en las pruebas de la presente divulgación se pueden usar métodos o materiales similares o equivalentes a los aquí descritos.
Se interpretará que el uso de los términos "un/una" y "el/la" y referencias similares en el contexto de la descripción de la presente divulgación (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarca tanto el singular como el plural, salvo que se indique lo contrario o que el contexto lo impida claramente. Los intervalos de valores incluidos aquí sirven simplemente como método abreviado para referirse individualmente a cada uno de los valores independientes incluidos en el rango, salvo que se indique lo contrario, y cada valor independiente se incorpora a la especificación como si se hubiese mencionado individualmente en el presente documento. Todos los métodos aquí descritos se pueden realizar en cualquier orden adecuado, salvo que se indique lo contrario o que el contexto lo impida claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o las expresiones que indican ejemplo (por ej., "tal como", "por ejemplo") utilizados aquí pretenden únicamente ilustrar mejor la invención y no limitan su alcance salvo que se indique lo contrario. No se interpretará que una expresión en la especificación indica algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
Tal como se usa aquí, el término "sujeto" se refiere a un sujeto humano o veterinario. Tal como se usa aquí, el término "efecto terapéutico" significa un efecto que induce, alivia o causa de otro modo una mejora de los síntomas patológicos, la progresión de la enfermedad o condiciones fisiológicas asociadas a un trastorno o a la resistencia a sucumbir a un trastorno, por ejemplo, una EDL, de un sujeto. El término "cantidad terapéuticamente efectiva", cuando se usa con respecto a un fármaco, significa una cantidad del fármaco que causa un efecto terapéutico en el sujeto.
Los términos "sinergia" o "sinérgico" significan un efecto aditivo mayor de lo esperado de una combinación. Un efecto sinérgico se puede lograr cuando los ingredientes activos son: (1) formulados conjuntamente y administrados de forma simultánea en una formulación combinada de dosis unitaria; (2) administrados por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) mediante algún otro régimen.
Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos por depósito lisosomal
Con el fin de facilitar la comprensión de los principios de la presente divulgación, a continuación se hará referencia a ciertos aspectos de la misma, algunos de los cuales se ilustran en las figuras, y se usará un lenguaje específico para describirlos. Cualquier alteración y modificación adicional de los aspectos descritos de la presente divulgación, así como cualquier aplicación adicional de los principios de la presente divulgación aquí descritos se contemplan como normalmente los contemplaría un experto en la técnica a la que se refiere la presente divulgación.
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a métodos de tratamiento de un trastorno (o enfermedad) por depósito lisosomal (EDL). Una EDL puede ser, por ejemplo, la enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Fabry, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, síndrome de Hunter, alfa-manosidosis, aspartilglucosaminuria, enfermedad por depósito de ésteres de colesterol, deficiencia crónica de hexosaminidasa A, cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Farber, fucosidosis, galactosialidosis o enfermedad de Batten, incluyendo enfermedad de Batten de inicio infantil tardío y juvenil. Una EDL también puede ser una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la vía de autofagia del lisosoma, por ejemplo lipofuscinosis ceroide neuronal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosos lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, incluyendo enfermedades parkinsonianas como la atrofia multisistémica (AMS), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (DCB) o demencia con cuerpos de Lewy (DCL). El trastorno neurodegenerativo se puede caracterizar por una autofagia defectuosa. Entre estos trastornos se incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington.
Un aspecto de la presente divulgación incluye la administración a un sujeto que padece una EDL, de un agente que regula al alza o mejora la expresión del gen Tfeb. La regulación al alza puede incluir el aumento de los niveles de ARNm para Tfeb. Los métodos de la presente divulgación incluyen asimismo la administración a un sujeto que padece una EDL de un agente que regula al alza TFEB o restaura la actividad de TFEB. La regulación al alza puede incluir el aumento de los niveles de ARNm de TFEB, el aumento de los niveles de proteína de TFEB o el aumento de la actividad de TFEB. La activación de un heterodímero PPARa/RXRa resulta en la regulación al alza de TFEB. El inventor también ha demostrado sorprendentemente que TFEB se regula al alza a través de la actividad o participación de PPARa, pero no de PPARp o PPARy.
El agente puede ser un fármaco hipolipemiante como un fibrato. El fibrato puede ser gemfibrozil, fenofibrato o clofibrato. El agente puede ser ácido transretinoico total o vitamina A. Sorprendentemente y de forma inesperada, la administración al sujeto del fibrato en combinación con ácido transretinoico total o vitamina A puede regular al alza TFEB más que la administración del fibrato o del ácido transretinoico total o de la vitamina A solos. El fibrato y el ácido transretinoico total o vitamina A, cuando se administran juntos al sujeto, pueden mejorar de forma cooperativa la regulación al alza de TFEB para regular al alza TFEB de forma sinérgica. Una dosis menor de fibrato puede ser necesaria en presencia de ácido transretinoico o vitamina A para conseguir el mismo grado de regulación al alza de TFEB que se produce cuando se administra solo una dosis mayor de fibrato al sujeto. La combinación de fibrato con ácido transretinoico total o vitamina A puede ser una combinación sinérgica.
En otros aspectos de la presente divulgación, el fármaco hipolipemiante es una estatina. Por ejemplo, la estatina puede ser atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o una combinación de al menos dos de estos fármacos. La estatina o estatinas se pueden utilizar solas o en combinación con un fibrato y/o ácido transretinoico total o vitamina A. En otros aspectos adicionales de la presente divulgación, el agente puede ser un analgésico o antipirético, por ejemplo, aspirina, fenilbutirato, benzoato de sodio, o un metabolito de canela, como ácido cinámico. Una vez más, estos agentes se pueden utilizar en combinación con ácido transretinoico total o vitamina A y se pueden administrar juntos al sujeto para mejorar de forma cooperativa la regulación al alza de TFEB de forma sinérgica.
Los fármacos hipolipemiantes pueden ser fármacos que reducen el nivel de triglicéridos circulantes en la sangre del sujeto. Adicionalmente, los fármacos hipolipemiantes pueden ser fármacos que reducen el riesgo de hiperlipidemia. El fibrato puede facilitar la regulación al alza de TFEB vía PPARa, pero no PPARp ni PPARy. Durante la regulación al alza de TFEB, PPARa forma un heterodímero con RXR-a y el heterodímero RXRa/PPAR-a es captado en el promotor del gen Tfeb a través de un sitio de unión RXR.
La regulación al alza de TFEB también puede estar mediada por ácido transretinoico total. El ácido transretinoico total también se conoce como ATRA, ácido retinoico, tretinoína y ácido de vitamina A. El ácido transretinoico total puede facilitar la regulación al alza de TFEB a través del receptor X retinoide-a (RXR-a). Durante la regulación al alza de TFEB, RXR-a forma un heterodímero con el receptor activado por proliferadores peroxisomales-a (PPAR-a) y el heterodímero RXR-a/PPAR-a es captado en el promotor del gen Tfeb a través de un sitio de unión RXR.
La composición que facilita la regulación al alza de TFEB puede incluir una combinación del agente, por ejemplo, un fármaco hipolipemiante, y ácido transretinoico total o vitamina A. Esta combinación puede facilitar o mejorar de forma cooperativa la regulación al alza de TFEB en comparación con la administración del agente o de ácido transretinoico o de vitamina A solos. La combinación puede mejorar cooperativamente la regulación al alza de TFEB unas dos veces, unas tres veces, unas cuatro veces, unas cinco veces o unas 10 veces, en comparación con la administración del fármaco hipolipemiante o de ácido transretinoico total o de vitamina A solos. En particular, la combinación puede mejorar cooperativamente la regulación al alza de TFEB unas tres veces, en comparación con la administración del fármaco hipolipemiante o de ácido transretinoico total o de vitamina A solos.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen al menos uno de los agentes anteriormente divulgados. La composición farmacéutica puede incluir también ácido transretinoico total o vitamina A. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir gemfibrozilo o una combinación de gemfibrozilo y ácido transretinoico total o vitamina A o una combinación de aspirina y ácido transretinoico total o vitamina A.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser en forma de, por ejemplo, tabletas, píldoras, grageas, cápsulas de gel duras y blandas, gránulos, perlas, soluciones acuosas, lipídicas, oleosas u otras, emulsiones como emulsiones de aceite en agua, liposomas, suspensiones acuosas y oleosas, jarabes, elixires, emulsiones sólidas, dispersiones sólidas o polvos dispersables. En composiciones farmacéuticas para administración oral, el agente puede mezclarse con adyuvantes y excipientes normalmente conocidos y utilizados, por ejemplo, goma arábiga, talco, almidón, azúcares (como por ej., manitosa, metilcelulosa, lactosa), gelatina, agentes tesioactivos, estearato de magnesio, solventes acuosos o no acuosos, derivados de parafina, agentes reticulantes, dispersantes, emulsionantes, lubricantes, conservantes, aromatizantes (por ej., aceites etéreos), potenciadores solubilizantes (por ej., benzoato de bencilo o alcohol de bencilo) o potenciadores de biodisponibilidad (por ej., GELUCIRE). En la composición farmacéutica, el agente también se puede dispersar en una micropartícula, por ej., una composición de micropartículas.
Para la administración parenteral, el agente o las composiciones farmacéuticas del agente se pueden disolver o suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable, como agua, solución tampón, aceites con o sin solubilizantes, agentes tensioactivos, dispersantes o emulsionantes. Como aceite se puede utilizar, por ejemplo y entre otros, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de soja, aceite de ricino y aceite de sésamo. Más generalmente, para administración parenteral el agente o las composiciones farmacéuticas del agente pueden ser en forma de una solución o suspensión acuosa, lipídica, oleosa o de otro tipo, o incluso administrarse en forma de liposomas o nanosuspensiones.
Formas de administración
Los agentes divulgados antes o las composiciones farmacéuticas que incluyen estos agentes se pueden administrar a través de cualquier método que permita la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente al sujeto. Las formas de administración pueden incluir, entre otras, la vía oral, tópica, transdérmica y parenteral, así como la inyección directa en un tejido y la administración a través de un catéter. Las vías parenterales pueden incluir, entre otras, vías subcutáneas, intradérmicas, intraarticulares, intravenosas, intraperitoneales e intramusculares. En un aspecto de la presente divulgación, la vía de administración es tópica o transdérmica, como una loción, una crema, un parche, una inyección, un dispositivo implantado, un injerto u otro vehículo de liberación controlada. Las vías de administración incluyen cualquier vía que suministre directamente la composición en la circulación sistémica (por ej., mediante inyección), incluyendo cualquier vía parenteral.
Un aspecto del método de la presente divulgación comprende la administración de al menos un agente, por ejemplo gemfibrozilo o una combinación de gemfibrozilo y ATRA, en una dosis, concentración y durante un tiempo suficiente para evitar el desarrollo o reducir el alcance de una EDL. Determinados aspectos de la presente divulgación incluyen la administración sistémica de al menos un agente en una dosis de entre unos 0,1 microgramos y unos 100 miligramos por kilogramo de peso corporal del sujeto, de entre unos 0,1 microgramos y unos 10 miligramos por kilogramo de peso corporal del sujeto, de entre unos 0,1 microgramos y aproximadamente 1 miligramo por kilogramo de peso corporal del sujeto. En la práctica de este método, el agente o la composición terapéutica que contiene el agente se puede administrar en una única dosis diaria o en múltiples dosis al día. Este método de tratamiento puede requerir la administración durante periodos de tiempo prolongados. El médico determinará la cantidad por dosis administrada o la cantidad total administrada y dependerá de factores como la masa del paciente, la edad y el estado de salud general del paciente, así como de su tolerancia al compuesto.
En los siguientes ejemplos se describirán más detalladamente las realizaciones de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Materiales y métodos
Reactivos: Se adquirió DMEM/F-12 50/50 1x, solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y 0,05% tripsina de Mediatech (Washington, DC). Se obtuvo suero fetal bovino (f Bs ) de Atlas Biologicals (Fort Collins, CO). El antibiótico-antimicótico, gemfibrozilo y ácido transretinoico total (ATRA) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Aislamiento de astroglía primaria de ratón: Se aislaron astroglías de cultivos gliales mixtos tal y como se describe (24, 25) de acuerdo con el procedimiento de Giulian y Baker (26). En resumen, el día 9 los cultivos gliales mixtos se lavaron tres veces con medio de Eagle modificado de Dulbecco/F-12 y se sometieron a agitación a 240 rpm durante 2 h a 37°C en un agitador giratorio para retirar las microglías. Después de dos días se repitió la agitación durante 24 h para eliminar las oligodendroglías y para garantizar la eliminación completa de todas las células no astrogliales. Las células fijadas se sembraron en placas nuevas para posteriores estudios.
Aislamiento de neuronas primarias de ratón: Las neuronas fetales de ratón (E18-E16) se prepararon como se ha descrito antes (27) con modificaciones. Se extirparon los cerebros completos y las células se lavaron mediante centrifugación tres veces a 1200 rpm durante 10 min, se separaron los gránulos y las células se colocaron en confluencia del 10% en portaobjetos de cámara de ocho pocilios pretratados durante más de 2 h con poli-D-lisina (Sigma, St. Louis, MO). Después de 4 minutos, la suspensión de células no adherentes se aspiró y se añadieron 500 ml de medio neurobasal completo (Invitrogen) suplementado con B27 al 2% a cada pocillo. Las células se incubaron durante 4 días antes de la experimentación. La inmunofluorescencia de doble etiqueta con p-tubulina y GFAP o CD11b reveló que las neuronas eran más de un 98% puras (datos no mostrados). Las células se estimularon con gemfibrozilo en medio neurobasal suplementado con B27 al 2% menos antioxidantes (Invitrogen) durante 24 h antes de la fijación con metanol y la inmunotinción.
Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa semicuantitativa (RT-PCR): Se aisló ARN total de astrocitos primarios de ratón y astrocitos primarios humanos utilizando el kit de RNA-Easy Qiagen (Valencia, CA) conforme al protocolo del fabricante. La RT-PCR semicuantitativa se realizó como se ha descrito antes (28) utilizando oligo (dT) 12-18 como cebador y transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT, Invitrogen) en 20 pl de mezcla de reacción. El ADNc resultante se amplificó convenientemente utilizando Promega Master Mix (Madison, WI) y los siguientes cebadores (Invitrogen) para genes murinos:
Tfeb de ratón: Sentido, 5'-AAC AAA GGC ACC ATC CTC AA-3' (SEQ ID NO.: 1); Antisentido, 5'-CAG CTC GGC CAT ATT CAC AC-3' (SEQ ID NO.: 2); Lamp2 de ratón: Sentido, 5'-GGT GCT GGT CTT TCA GGC TTG ATT -3' (SEQ ID NO.: 3); Antisentido, 5'-ACC ACC CAA TCT AAG AGC AGG ACT-3 (SEQ ID NO.: 4)'; Limp2 de ratón: Sentido, 5'- TGT TGA AAC GGG AGA CAT CA-3' (SEQ ID NO.: 5); Antisentido, 5'-TGG TGA CAA CCA AAG TCG TG-3' (SEQ ID NO.: 6); Npc1 de ratón: Sentido, 5'-GGG ATG CCC GTG CCT GCA AT-3'(SEQ ID NO.: 7); Antisentido, 5'-CTG GCA GCT ACA TGG CCC CG-3' (SEQ ID NO.: 8); Gapdh de ratón: Sentido, 5'-GCA CAG TCA AGG CCG AGA AT-3'(SEQ ID NO.: 9); Antisentido, 5'-GCC TTC TCC ATG GTG Gandhi AA-3'(SEQ ID NO.: 10).
Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa 2% (Invitrogen) y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio (Invitrogen). Se utilizó ARNm de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh) como control de carga para comprobar que se sintetizó de cada muestra una cantidad equivalente de ADNc.
PCR cuantitativa en tiempo real: La cuantificación de ARNm se realizó utilizando el sistema de detección de secuencias ABIPrism7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) con SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems). La expresión de ARNm de los genes seleccionados se normalizó para el nivel de ARNm de Gapdh y los datos se procesaron con el software ABI Sequence Detection System 1.6.
Inmunotinción de células: Se realizó la inmunocitoquímica como se ha descrito antes (29). En resumen, los portaobjetos de cámara de ocho pocillos que contenían astrocitos primarios de neuronas de ratón se cultivaron en confluencia del 70-80%, se fijaron con metanol refrigerado (Fisher Scientific, Waltham, MA) durante una noche y se sometieron a dos breves enjuagues con PBS filtrado. Las muestras se bloquearon con BSA 2% (Fisher Scientific) en PBS que contenía Tween 20 (Sigma) y Triton X-100 (Sigma) durante 30 min y se incubaron a temperatura ambiente en condiciones de agitación durante 2 h en PBS que contenía los siguientes anticuerpos primarios anti-ratón: TFEB (1:1000; Abeam), GFAP, (1:1000; DAkO), LAMP2 (1:500, Abeam), NeuN (1:500, Millipore), y MAP2 (1:200, Millipore). Tras cuatro lavados de 15 min en PbS filtrado, los portaobjetos se incubaron nuevamente con anticuerpos secundarios etiquetados Cy2 o Cy5 (todos 1:200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) durante 1 h en condiciones de agitación similares. Tras cuatro lavados de 15 min con PBS filtrado, las células se incubaron durante 4-5 min con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:10,000; Sigma). Las muestras se sometieron a un gradiente de EtOH y xileno (Fisher), se montaron y se observaron en un microscopio de fluorescencia Olympus BX41.
Inmunotinción de secciones de tejido: Tras 60 días de tratamiento, los ratones fueron sacrificados y sus cerebros se fijaron, integraron y procesaron. Se obtuvieron secciones de diferentes regiones del cerebro y para la tinción de inmunofluorescencia en secciones recién congeladas se utilizó TFEB anti-ratón (1:500), LAMP2 anti-ratón (1:200) y NeuN anti-ratón (1:500). Las muestras se montaron y observaron en un microscopio de fluorescencia Olympus BX41 (30).
Tinción LysoTracker: Se sometieron fibroblastos cultivados a confluencia de 70-80% a diferentes estímulos en medio DMEM bajo en suero (2%), y posteriormente se incubaron con 75nM LysoTracker Red DND99 (Invitrogen) durante 45 min. Después las células se lavaron a fondo con PBS filtrado y se montaron en el portaobjetos para observarlas en un microscopio de fluorescencia BX41.
Immunoblot: Se realizó un Western blot como se ha descrito antes (31, 32) con modificaciones. En resumen, las células se rasparon en solución tampón 1X RIPA, se midió la proteína utilizando reactivo de Bradford, se añadió solución tampón de dodecilsulfato sódico (SDS) y se sometió a electroforesis en 4-12% de geles Bis-Tris PAGE® Novex® (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad) utilizando Thermo-Pierce Fast Semi-Dry Blotter.
Después la membrana se lavó durante 15 min en TBS más Tween 20 (TBST) y se bloqueó durante 1 h en TBST que contenía BSA. A continuación, las membranas se incubaron durante una noche a 4°C en condiciones de agitación con los siguientes anticuerpos primarios: TFEB (1:1000, Abeam), LAMP2 (1:500, Abeam) y pactina (1:800; Abeam, Cambridge, MA). Al día siguiente, las membranas se lavaron en TBST durante 1 h, se incubaron en anticuerpos secundarios contra huéspedes de anticuerpos primarios (todos 1:10,000; Jackson ImmunoResearch) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron durante más de una hora y se visualizaron en Odyssey® Infrared Imaging System (Li-COR, Lincoln, NE).
Construcción del constructo reporter impulsada por promotor Tfeb de ratón: Se utilizó ADN genómico de ratón aislado de astrocitos de ratón primarios como plantilla durante la PCR. La secuencia flanqueante 5' del gen de TFEB de ratón (-916/+61) se aisló por PCR. Los cebadores se diseñaron a partir de secuencias de bancos de genes. Tfeb: sentido: 5'- acgcgt CCA GGA GCC AGG GAC GGG GTA CAT CTC -3' (SEQ ID NO.: 11); antisentido: 5'- agatct AAG GAG AAA CTG AGT CCG GGC AGAAGG-3' (SEQ ID NO.: 12). El cebador de sentido se etiquetó con un sitio de enzima de restricción Mlu1 mientras que el cebador antisentido se etiquetó con Bgl II. La PCR se realizó utilizando un kit Advantage-2 PCR (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos resultantes se purificaron en gel y se ligaron en el vector PGEM-TEasy (Promega). Estos fragmentos fueron posteriormente subclonados en el vector PGL-3 Enhancer tras la digestión con las correspondientes enzimas de restricción y la verificación mediante secuenciación con ACGT Inc. DNA Sequencing Services.
Clonación del promotor de Tfeb y mutagénesis dirigida: La mutagénesis dirigida se realizó utilizando el kit de mutagénesis dirigida (Stratagene, USA). Se utilizaron dos cebadores en orientación opuesta para amplificar el plásmido mutado en una única reacción PCR. La secuencia del cebador para el sitio del promotor mutado fue: Mutado: Sentido: 5'-GCA ACA GCA AGT GCG GAT TTG AGG GGG Estratagema GAC GGT GGG-3' (SEQ ID NO.: 13); Antisentido:5'-CCC ACC GTC CCC Estratagema CCT CAA ATC CGC ACT TGC TGT TGC-3' (SEQ ID NO.: 14). El producto de la PCR se precipitó con etanol y a continuación se sometió a fosforilación con T4 quinasa. El fragmento fosforilado se autoligó mediante T4 ADN ligasa y se digirió con enzima de restricción Dpnl para eliminar la plantilla no mutada. El plásmido mutado se clonó y amplificó en células competentes de Escherichia coli (cepa DH5-a).
Ensayo de actividad del reporter impulsada por el promotor de Tfeb: Las células colocadas en confluencia 50-60% en placas de 12 pocilios se cotransfectaron con 0,25 pg de pTFEB(WT)-Luc, pTFEB(Mu)-Luc y utilizando Lipofectamine Plus (Invitrogen). Tras 24 h de transfección, las células se estimularon con diferentes agentes en condiciones libres de suero durante 6 h. Las actividades de luciferasa de luciérnaga se analizaron en extractos de células utilizando el kit Luciferase Assay System (Promega) en un TD-20/20 Luminometer (Turner Designs) como se ha descrito anteriormente (33, 34).
Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: Se realizaron ensayos ChIP utilizando el método descrito por Nelson et al (35) con ciertas modificaciones. Brevemente, los astrocitos primarios de ratón se estimularon con 10pM de gemfibrozilo y 0,5 pM de RA juntos durante 6 h; posteriormente se fijaron con formaldehído (1,42% volumen final) y se sometieron a quenching con 125 mM de glicina. Las células se peletizaron y lisaron en solución tampón IP con 150 mM de NaCI, 50 mM de Tris-HCI (pH 7.5), 5 mM de EDtA, NP-40 (0,5% vol/vol), Triton X-100 (1,0% vol/vol). Para 500 ml, se añaden 4,383 g NaCI, 25 ml de 100 mM EDTA (pH 8.0), 25 ml de 1 M Tris-HCI (pH 7.5), 25 ml de 10% (vol/vol) NP-40 y 50 ml de 10% (vol/vol) Triton X-100 con los siguientes inhibidores; 10 pg/ml leupeptina, 0,5 mM de fenilmetisulfonil fluoruro (PMSF), 30 mM de p-nitrofenil fosfato, 10 mM de NaF, 0,1 mM de Na3V04, 0,1 mM de Na2Mo04 y 10 mM de p-glicerofosfato.
Tras un lavado con 1,0 ml de solución tampón IP, se resuspendieron los gránulos en 1 ml de solución tampón IP (con todos los inhibidores), se sometieron a un baño de ultrasonidos y la cromatina extraída se dividió en dos fracciones (una para utilizarla como entrada). La fracción restante se incubó durante una noche bajo rotación a 4 °C con 5-7pg de anti- PPARa o anti-RXRa Abs o anti-PGC1a o RNA Pol o IgG normal (Santa Cruz) y posteriormente se sometió a incubación con Protein G-Agarose (Santa Cruz) durante 2 h a 4 °C bajo rotación. Posteriormente las perlas se lavaron cinco veces con solución tampón IP fría y se añadió un total de 100 pl de 10% Chelex (10 g/100 ml H20) directamente a las perlas de proteína G lavadas con agitación. Tras hervir durante 10 min, se dejó que la suspensión de perlas de Chelex/proteína G se enfriara hasta alcanzar la temperatura ambiente. A continuación se añadió proteinasa K (100 pg/ml) y las perlas se incubaron durante 30 min a 55 °C con agitación, seguido de otra ronda de ebullición durante 10 min. La suspensión se sometió a centrifugación y se recogió el supernatante. La fracción de perlas de Chelex/proteína G se agitó con otros 100 pl de agua, se centrifugó de nuevo y se combinaron el primer y el segundo supernatante. El eluato se utilizó directamente como plantilla en la PCR.
Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar los fragmentos que flanquean el elemento de unión RXR en el promotor de Tfeb de ratón: Set1: sentido: 5'- GAA CAT TCC aGg TgG AGG CA-3' (SEQ ID NO.: 15), antisentido: 5'- CCC CCA ACA CAT GCT TCT CT -3' (SEQ ID NO.: 16); Set2: sentido: 5'- GAG TCT CTC GGA GGA GGT GA - 3' (SEQ ID NO.: 17), antisentido: 5'- ACT CCA GGC ATG CTT TCT CC -3'(SEQ ID NO.: 18). Las PCR se repitieron utilizando diversos números de ciclos y diferentes cantidades de plantillas para garantizar que los resultados estuviesen en el rango lineal de la PCR. La qRT-PCR se realizó utilizando los mismos cebadores y SYBR Select Mastermix. Los datos se normalizaron al inicio y se calculó la IgG no específica y el aumento múltiplo frente al control.
Análisis densitométrico: Los blots de proteínas se analizaron utilizando ImageJ (NIH, Bethesda, MD) y las bandas se normalizaron para sus respectivos controles de carga de p-actina. Los datos son representativos de la media de cambio múltiplo con respecto al control en al menos 25 imágenes diferentes por condición de tres series de experimentos independientes.
Estadísticas: Los valores se expresan como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes Los análisis estadísticos para las diferencias se realizaron con la prueba T de Student. Este criterio para la significancia estadística fue p<0,05.
Ejemplo 2 - La activación de PPARa y RXRa induce la expresión de TFEB en células primarias de cerebro de ratón
Se examinaron activadores de PPAR, como el fármaco aprobado por la FDA gemfibrozil, para determinar si podrían regular al alza la expresión de TFEB en células de cerebro de ratón. Dado que se conoce que PPARa y RXRa forman un complejo transcripcionalmente activo (21,36, 37), utilizamos tanto gemfibrozilo como ATRA, que activa RXRa, para comprobar si existe algún efecto aditivo debido al tratamiento dual. Los astrocitos primarios de ratón (MPA) se trataron en medio libre de suero con dosis únicas de femfibrozil y ATRA, y también con la combinación de ambos. Los datos de la PCR cuantitativa en tiempo real demostraron una expresión aumentada de Tfeb en los tres grupos, con un incremento ligeramente superior en el tratamiento combinado (pero no estadísticamente significativo en comparación con los tratamientos individuales) (Fig. 1 A). Cuando se utilizó una combinación de gemfibrozilo y ATRA, pudimos conseguir una expresión de nivel similar de Tfeb con dosis muy inferiores de ambos compuestos (10pM y 0,2pM, respectivamente) en comparación con 25pM de gemfibrozilo y 0,5pM de ATRA. El análisis temporal con el tratamiento combinado demostró que la expresión de Tfeb se podía inducir ya a las 6 horas y hasta 24 horas. (Fig. 1D). Los datos de qRT-PCR tanto por lo que respecta a la dosis como al tiempo se validaron mediante ensayos Western blot y demostraron un patrón similar de aumento de los niveles de TFEB (Fig. 1B, 1C, 1E y 1F).
Además, utilizamos astrocitos primarios y neuronas primarias de ratón y los tratamos con una combinación de gemfibrozilo y ATRA en medio libre de suero durante 24 horas, y realizamos una inmunocitoquímica. Los datos demostraron un aumento distinto de los niveles de TFEB tanto en los astrocitos como en las neuronas, así como en la localización de TFEB en y alrededor del núcleo (Fig. 1G y 11). La inmunoreactividad de TFEB se cuantificó utilizando ImageJ y observamos un aumento de unas 4 veces de los niveles globales de TFEB y un aumento de unas 5 o 6 veces de la localización de TFEB en el núcleo tras el tratamiento (Fig. 1H & 1 J). Se ha demostrado anteriormente que la inanición y la deficiencia de nutrientes provoca la activación de TFEB, por lo que en este estudio todas las células no tratadas se mantuvieron en condiciones libres de suero durante toda la duración del tratamiento, de forma que el cambio en el valor basal de los niveles de TFEB se mantuviera igual en todos los grupos.
Ejemplo 3 - PPARa y RXRa participan en la regulación al alza de TFEB mediada por fármacos
La hipótesis de que PPARa en combinación con RXRa podría participar en la regulación al alza de TFEB mediada por fármacos se testó utilizando astrocitos primarios de ratón de animales PPARa (-/-) y eliminando RXRa en astrocitos primarios de ratón WT. Los MPA obtenidos de animales WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) se trataron en condiciones similares a las antes descritas y se comprobó la expresión de ARNm y proteína de TFEB. Tanto la PCR en tiempo real como los ensayos Western blot de TFEB demostraron que TFEB podría ser regulado al alza en astrocitos de WT y PPARp (-/-), pero no al mismo nivel en astrocitos de PPARa (-/-) (Fig. 2A, 2B y 2C). Las conclusiones se confirmaron también mediante inmunocitoquímica, donde observamos un incremento de casi 3-4 veces en los niveles de TFEB en WT y PPARp (-/-), pero no en PPARa (-/-) (Fig. 2F y 2G).
Se notificó que el coactivador-1a de PPARy (PGC1A) podría participar en la activación transcripcional de Tfeb, por lo que probamos si PPARy participa en esta expresión de TFEB mediada por fármacos en particular utilizando inhibidores de PPARy. El Western blot de TFEB utilizando un tratamiento previo con inhibidores específicos de PPARy antes del tratamiento indica que gemfibrozilo y ATRA podrían no utilizar la vía mediada por PPARy para la regulación al alza de TFEB (Fig. 2D y 2E). Se ha sabido que PPARa y RXRa forman un complejo transcripcional y nuestros datos demostraron un ligero aumento de TFEB en presencia de ATRA. Queríamos saber si ATRA ejerce sus efectos a través de RXRa. Los MPA de WT se trataron con siARN específico de RXRa y posteriormente se trataron con la combinación de gemfibrozilo y ATRA, y se realizaron análisis tanto del ARNm como de proteínas. Los datos demostraron una eliminación exitosa del gen RXRa y, por consiguiente, el efecto de los fármacos se anuló parcialmente en ausencia de RXRa, lo que se puso de manifiesto por los niveles de ARNm de Tfeb tras silenciar RXRa (Fig. 2H y 21). El Western blot también demostró resultados similares, con los niveles de TFEB notablemente más bajos en células silenciadas RXRa en comparación con el siARN aleatorio tras el tratamiento (Fig. 2J y 2K). Conjuntamente estos datos indican que PPARa y RXRa podrían participar en la regulación al alza de TFEB por gemfibrozilo y ATRA.
Ejemplo 4 - El heterodímero PPARa/RXRa regula transcripcionalmente la expresión de TFEB en condiciones de tratamiento
PPARa y RXRa forman juntos un complejo transcripcional, por lo que habiendo determinado que estos receptores parecen regular al alza Tfeb, probamos si los receptores regulan transcripcionalmente la expresión de Tfeb. Tras el análisis del sitio del promotor de Tfeb, encontramos la presencia de un elemento de respuesta del proliferador peroxisomal (PPRE) unos 480 bp secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de Tfeb. El promotor de Tfeb (pTFEB(WT)) que contenía el PERO se clonó en el vector potenciador de pGL3. También mutamos la secuencia central de PPRE y el constructo del promotor mutado (pTFEB(Mu)) se clonó asimismo en el vector PGL3. El constructo de luciferasa de tipo salvaje, cuando se transfecta en células BV2, demostró un marcado aumento de la actividad de la luciferasa (Fig. 3B). Cuando las células que contenían el constructo de luciferasa pTFEB(WT) se trataron con PPARa-antagonista (GW6471; 250nM), PPARp -antagonista (GSK0660; 250nM), PPARy-antagonista (GW9662; 5nM), observamos que la actividad de la luciferasa era similar a la de las células no tratadas en las células tratadas con PPARa antagonista, pero no así en las células tratadas con PPARp- o PPARy-antagonista (Fig. 3C).
En astrocitos primarios de ratón aislados de animales WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-), observamos una mayor actividad de la luciferasa en células de WT y PPARp (-/-), pero no en PPARa (-/-) (Fig. 3D). Aún más, cuando el constructo con el sitio PPRE mutado (pTFEB(Mu)-Luc) fue transfectado en BV2 y astrocitos primarios de ratón, detectamos un drástico descenso de la actividad de la luciferasa en las células que contenían el constructo mutante (Fig. 3E y 3F). Conjuntamente, estos datos indican que la activación de PPARa desempeña un importante papel en la inducción de Tfeb tras el tratamiento con gemfibrozilo y ácido retinoico.
Por último, decidimos investigar el papel real de la unión de ADN de PPARa sobre el promotor de Tfeb en este contexto. Se ha demostrado que tras la activación, PPARa, RXRa y PGC1a forman un complejo que inicia la activación transcripcional de muchos genes (38-42); investigamos si este es el caso aquí. Se trataron astrocitos primarios de ratón con gemfibrozilo y ácido retinoico en diferentes puntos temporales, de 30 a 240 min; se sometieron a análisis ChIP mediante inmunoprecipitación de los fragmentos de cromatina con anticuerpos anti-PPARa, -RXRa y -PGC1a y se mantuvieron como controles anti-RNA Pol e IgG normal. Tanto la PCR semicuantitativa como la RT-PCR cuantitativa demostraron un mayor enriquecimiento del amplicón con el tiempo con el arrastre por anticuerpos específicos (Fig. 4B y 4C). La inmunoprecipitación seguida de PCR con IgG normal demostró bandas casi indetectables en la RT-PCr y la PCR con ADN fragmentado total reveló una señal uniforme en la RT-PCR, lo que demuestra la uniformidad y especificidad de los resultados. En la PCR en tiempo real, los valores de Ct se normalizaron en el % de partida y también se normalizaron con la señal de IgG para obtener un valor de señal sobre ruido, a fin de verificar la especificidad de los resultados. Los experimentos se repitieron al menos tres veces en las mismas condiciones, y los ciclos y la dilución de los productos de la PCR se ajustaron para garantizar que los datos estuviesen en el rango lineal de la PCR. Todas estas conclusiones obtenidas hasta el momento indican que la activación del receptor de PPARa y RXRa puede regular de hecho directamente transcripcionalmente la expresión de Tfeb.
Ejemplo 5 - La regulación al alza de TFEB provoca un aumento de la biogénesis lisosomal
TFEB es el principal regulador de la expresión de genes lisosomales y de la biogénesis lisosomal (9, 12, 16), por lo que esperábamos un aumento en la biogénesis y en los marcadores lisosomales con la regulación al alza de TFEB. Los MPA tratados bajo las mismas condiciones se sometieron a análisis de ARNm en busca de algunos marcadores lisosomales como Lamp2, Limp2 y Npc1. Como se esperaba, los datos mostraron niveles elevados de esos genes en condiciones de tratamiento en células WT y PPARp (-/-), pero no así en las PPARa (-/-). (Fig. 5A) Los análisis Western blot y la inmunocitoquímica de LAMP2 en células WT y K.O. también demostraron un patrón de expresión de proteínas similar (Fig. 5B, 5C & 5D). El aumento de los niveles de LAMP2 también se observó en neuronas primarias de ratón (Fig. 5E). Además, cuando las células se tiñeron con Lyso Tracker Red, observamos un mayor contenido de lisosomas por célula en el caso de las células WT y PPARp (-/-) tratadas con fármacos, pero no así en las PPARa (-/-) (Fig 5F), lo que es coherente con nuestras conclusiones previas para TFEB y otros marcadores lisosomales. Estos datos sugieren que gemfibrozilo y ATRA pueden inducir la expresión de TFEB vía PPARa/RXRa y que esto finalmente da lugar a un aumento de la biogénesis lisosomal.
Ejemplo 6 - Los agonistas de PPARa y RXRa inducen la biogénesis lisosomal in vivo en el SNC de los ratones WT y PPARp/-, pero no así en PPARa-/-
Una vez confirmada la participación de PPARa en la regulación al alza de TFEB mediada por fibrato, comprobamos asimismo si los mismos resultados se podrían replicar en entornos in vivo. Se trataron ratones WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) de la misma procedencia por vía oral durante 60 días con 7,5 mg/kg de peso corporal/día de gemfibrozilo y 0,1 mg/kg de peso corporal de ATRA disuelto en 0,1% de metilcelulosa, que también se utilizó como vehículo. Al final del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se seccionó la corteza cerebral. A continuación se realizó un estudio de inmunofluorescencia para detectar la presencia de TFEB. Estos datos de la inmunohistoquímica in vivo validaron las conclusiones de nuestro cultivo celular, dado que no observamos ningún aumento reseñable de los niveles de TFEB en la corteza de los animales tratados con PPARa (-/-) en comparación con los controles, pero sí se observó una respuesta considerable en los animales WT y PPARp (-/-) (Fig 6A, 6D y 6G).
También cuantificamos las señales positivas de TFEB en al menos 12 secciones por grupo y los valores se representaron en forma de porcentaje del área total. El análisis cuantitativo confirmó un aumento significativo de las señales positivas de TFEB en el grupo de los animales WT y PPARp (-/-), pero no así en los animales PPARa (-/-) (Fig 6B, 6E y 6H). Otras secciones de la corteza de los mismos animales se sometieron a inmunohistoquímica para determinar la presencia de LAMP2. Los resultados indican una mayor inmunorreactividad de LAMP2 en animales WT y PPARp (-/-), pero no así en animales PPARa (-/-) (Fig. 7A, 7D y 7G). Los datos cuantitativos sugieren también un aumento significativo de las señales positivas de LAMP2 en el grupo de los animales WT y PPARp (-/-), pero no en los animales PPARa (-/-) (Fig 7B, 7E y 7H).
Ejemplo 7 - El gemfibrozilo y ATRA indujeron la biogénesis lisosomal en fibroblastos de pacientes de LINCL
A fin de comprobar si se podrían replicar unos resultados similares en células de pacientes, obtuvimos fibroblastos de piel de personas sanas y pacientes afectados de LINCL, y tratamos las células con concentraciones similares de gemfibrozilo y ATRA en un medio bajo en suero (2% de suero). Para tener en cuenta cualquier cambio debido a la escasez de suero, los controles sin tratar se mantuvieron en condiciones similares de suero durante todo el tratamiento (24 horas). Después de teñir los fibroblastos con Lyso Tracker Red, observamos un patrón similar de aumento de la acumulación de lisosomas en las células en general. Los fibroblastos normales (WT#1 a WT#3) y los fibroblastos de pacientes de LINCL con mutaciones Cln2 (NCL#1 a NCL#5), así como los fibroblastos del vehículo LINCL (NCL/C) demostraron un aumento similar en lisosomas por célula (Fig. 8). Para normalizar el número y el tamaño de las células en las imágenes, calculamos las señales positivas en Lyso Tracker por área unitaria y célula y, a continuación, realizamos un análisis para calcular el cambio múltiplo respecto del control. Se analizaron al menos 25 campos por grupo para detectar señales Lyso Tracker positivas y los datos sugieren un notable aumento en todos los fibroblastos con independencia del estado de la enfermedad, aunque el nivel basal de lisosomas en la célula y el nivel de aumento varió de una célula a otra. Los datos sugieren que el efecto del tratamiento es dependiente del estado de la enfermedad en el caso de los pacientes LINCL.
Ejemplo 8 - Debate de los Ejemplos 2 a 7
Los lisosomas son uno de los principales orgánulos de las células, que no solo actúan como la maquinaria de gestión de residuos de la célula, sino que también desempeñan importantes funciones en otros procesos biológicos como la presentación de antígenos, la regulación de ciertas hormonas, la remodelación ósea, la muerte celular necrótica, la reparación de la superficie celular, el desarrollo y otras vías de señalización (2, 43­ 47). Para desempeñar estas variadas funciones, la biogénesis y la actividad de los lisosomas necesitan estar fuertemente reguladas. Según conclusiones recientes, TFEB es un regulador principal de la biogénesis lisosomal (9, 12, 15). Con el paso de los años, diferentes grupos han subrayado el papel del lisosoma en diferentes escenarios de enfermedad (48-53). Se ha documentado que los genes relacionados con lisosomas están fuertemente regulados en la grasa orbitaria de pacientes que sufren oftalmopatía de Graves, mientras que la regulación a la baja del procesamiento lisosomal mejoró la transfección de genes mediada por lipopoliplex pegilado (53, 54). El aumento de la biogénesis lisosomal puede no resultar necesariamente beneficioso en todas las enfermedades y tipos de células, pero en algunos casos la inducción de la vía de autofagia-lisosomal podría resultar útil para la eliminación de residuos tóxicos de la célula (55, 56).
En los últimos años, el TFEB se ha definido como un potencial objetivo terapéutico para algunas enfermedades relacionadas con los lisosomas. Taiji Tsunemi et al señalaron que la activación del factor de transcripción EB (TFEB) vía PGC1a podría provocar una mayor rotación de HTT y la eliminación de agregados de proteína (57, 58). Existen informes que sugieren un vínculo entre la toxicidad de a-sinucleína y la función deteriorada de TFEB, y que identificaron TFEB como objetivo para la terapia neuroprotectora en la enfermedad de Parkinson (59). Se ha demostrado que la activación de TFEB mejora el múltiplo, el tráfico y la actividad de una variante de glucocerebrosidasa (GC) desestabilizada en la enfermedad de Gaucher. En el caso de otra EDL, la enfermedad de Tay-Sachs, se ha demostrado que el TFEB rescata la actividad de un mutante de phexosaminidasa. Las conclusiones describen TFEB como regulador específico de la proteostasis lisosomal y un objetivo terapéutico para el rescate de la homeostasis de las enzimas en las EDL (60, 61).
También se ha documentado que la inducción de exocitosis lisosomal por sobreexpresión de TFEB puede resolver el depósito patológico y restaurar una morfología celular normal en las EDL (62). Aparte de las EDL, también se ha demostrado que TFEB induce el catabolismo y la eliminación de lípidos, y podría resolver la obesidad y el síndrome metabólico en ratones (15, 16). En general, en los últimos años el TFEB se ha convertido en un factor de transcripción potencialmente importante por su función no solo en la biogénesis lisosomal, sino también por sus implicaciones como objetivo terapéutico en estados patológicos. No se han identificado muchos compuestos terapéuticamente viables dirigidos a la actividad de TFEB, aunque recientemente se ha demostrado que 2-hidroxipropil-(3-ciclodextrin (HP(3CD) es un excipiente aprobado por la FDA que promueve la eliminación mediada por TFEB de agregados proteolípidos en células de pacientes que padecen LINCL (56). Otro estudio también reveló la inducción de niveles y actividad de TFEB, así como la biogénesis lisosomal de la genisteína (5,7-dihidroxi-3-(4-hidroxifenil)-4H-1-benzopiran-4-ona), un potencial fármaco para el uso en la terapia de reducción de sustrato (SRT) para mucopolisacaridosis (MPSs) (63).
Estudios recientes han vinculado el TFEB, la biogénesis lisosomal y la autofagia con el metabolismo de los lípidos (14-16, 55, 64, 65). La potencial interrelación entre TFEB y el metabolismo de los lípidos nos lleva a investigar el papel del gemfibrozilo y ATRA, que son potenciales activadores de PPARa y RXRa, dos importantes factores en el metabolismo de los lípidos. El gemfibrozilo, que se comercializa como "Lopid", es un fármaco aprobado por la FDA que se prescribe para la hiperlipidemia (17, 19), aunque se ha demostrado que tiene múltiples efectos beneficiosos (22). La capacidad del gemfibrozilo para cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) ya se ha documentado (20). Anteriormente hemos señalado que el gemfibrozilo conjuntamente con el ATRA podría aumentar los niveles del gen Cln2 en las células cerebrales (66). También investigamos si el TFEB, el principal regulador de la biogénesis lisosomal, podría verse afectado por los fármacos. Nuestros datos indican que el gemfibrozilo solo o combinado con ATRA podría inducir efectivamente la expresión de TFEB en las células cerebrales.
Otra investigación sugirió el posible papel de PPARa en el proceso. Se ha demostrado que PPARa juega un papel importante en diferentes vías reguladoras y moduladoras (67-71). Se ha descubierto que determinados ácidos grasos poliinsaturados y derivados oxidados, así como fármacos modificadores de lípidos de la familia de los fibratos, incluyendo el fenofibrato y el gemfibrozil, activan PPARa. Los fibratos sustituyen el complejo represor de HSP90 que secuestra PPARa en el citosol y ayudan a rescatar la actividad transcripcional de PPARa (21). Por consiguiente, analizamos el papel del grupo de receptores PPAR para verificar este fenómeno. Nuestros datos indican claramente la implicación de PPARa, pero no así de PPARp y PPARy, en el proceso de regulación al alza de TFEB con gemfibrozilo. Los estudios in vitro se validaron también con estudios in vivo, en los que utilizamos el ratón knockout para PPARa y PPARp. Nuestros resultados in vivo también confirmaron los datos del cultivo de células.
Se realizó un análisis de la región del promotor del gen Tfeb para identificar el mecanismo de regulación al alza de TFEB. Se encontró un sitio PERO en el promotor Tfeb de ratón, así como un sitio de unión RXR. Según estudios previos, el heterodímero PPAR/RXR ha demostrado actividad de unión a ADN. (70). En conjunto, el heterodímero PPAR/RXR regula la transcripción de genes cuyos productos participan en la homeostasis de los lípidos, el crecimiento y la diferenciación celular (69, 72). Se observó que la vía de regulación al alza de Tfeb requiere un efecto cooperativo tanto de PPAR como de RXR. Además, el efecto tanto de gemfibrozilo como de RA se anularon en ausencia de RXRa o PPARa. Los resultados de los ensayos de luciferasa utilizando tanto de WT como del constructo de luciferasa mutante de PERO en el promotor de Tfeb demostraron una mayor actividad dependiente del promotor de Tfeb en el constructo de W t tras la estimulación. Sin embargo, las células PPARa (-/-) cuando se transfectaron con el constructo pTFEB(WT)-Luc y también las células de WT cuando se transfectaron con el constructo pTFEB(Mu)-Luc no demostraron ningún aumento significativo de la actividad de luciferasa. Por último, los datos del ChIP indicaron la captación de PPARa y RXRa junto con PGC1 a y RNA polimerasa en el sitio PERO del promotor de TFEB. Los datos experimentales se analizaron de forma crítica con la incorporación de controles apropiados para garantizar la especificidad de las conclusiones.
Colectivamente, estos datos definen un mecanismo único en el que el gemfibrozilo, un activador de PPARa, y ATRA, un agonista de RXRa, regulan juntos al alza el TFEB en las células cerebrales vía heterodímero PPARa/RXRa. Si bien un estudio reveló que las células madre trofoblásticas (TS) carentes de PPARy tienen niveles más bajos del TFEB el Día 4 de diferenciación, otro estudio que utilizó GW9662, un potente y conocido antagonista de PPARy de las células cerebrales no demostró ninguna participación sustancial de PPARy (73). Esto puede deberse a la variación de los tipos de células, es decir células TS de diferenciación frente a neuronas/astrocitos primarios de cerebro maduro o al nivel diferencial de potencial de activación de PPARa. En un completo estudio de Settembre et al., los autores publicaron que PPARa y PGC1a son objetivos de TFEB en condiciones de estrés inducido por inanición y que TFEB se autorregula en estas condiciones; sin embargo, otro estudio de Tsunemi et al. sitúa PGC1a secuencia arriba de TFEB en el escenario de la enfermedad de Huntington. Es bastante posible que TFEB regule el metabolismo de los lípidos a través de PPARa y PGC1 a, que en ambos casos tienen una función muy importante en la regulación del metabolismo de los lípidos. Pero, por otra parte, los datos actuales indican que una estimulación directa de PPARa puede inducir la captación del complejo PPARa-RXRa-PGC1a en el promotor de TFEB y por consiguiente influir en la biogénesis lisosomal.
Mientras que la respuesta al estrés regula directamente la función de TFEB, el presente hallazgo sugiere que la activación de PPARa y RXRa por estímulos externos también puede regular TFEB, que a su vez puede controlar la expresión de PPARa u otros genes responsables del metabolismo de los lípidos. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados para descifrar la presencia de cualquier mecanismo regulador de este tipo y la supuesta interrelación bidireccional entre el metabolismo de los lípidos y la biogénesis lisosomal.
En resumen, este estudio comprueba la hipótesis novedosa de que los fármacos hipolipemiantes como el gemfibrozilo pueden regular al alza la biogénesis lisosomal en las células cerebrales a través de la activación de TFEB mediada por PPARa. Teniendo en cuenta las importantes funciones que desempeña TFEB en determinados escenarios patológicos, se observa un creciente interés por identificar TFEB como objetivo terapéutico. El resultado de esta investigación pone de relieve propiedades desconocidas de PPARa, describe una nueva opción de tratamiento para las EDL, y revela una regulación más dinámica de TFEB, además de promover el interés por entender el vínculo existente entre el metabolismo de los lípidos y la biogénesis lisosomal.
Ejemplo 9 - Regulación al alza de la expresión de ARNm de TFEB en astrocitos de ratón con fármacos para reducir el colesterol
La Figura 9 ilustra la regulación al alza de la expresión de ARNm de TFEB en astrocitos de ratón con fármacos para reducir el colesterol (simvastatina y pravastatina), aspirina (analgésico y antipirético), ácido cinámico (metabolito de canela), y fármacos para trastornos del ciclo de la urea (fenilbutirato de sodio y benzoato de sodio). Los astrocitos primarios de ratón se incubaron con diferentes concentraciones (ver Figura 9) de simvastatina y pravastatina (A), (B), ácido cinámico (C), y fenilbutirato de sodio y benzoato de sodio (D) durante 5 horas en condiciones libres de suero. A continuación se controló la expresión de ARNm de TFEB mediante RT-PCR semicuantitativa. Se utilizó formiato de sodio (D) como control negativo para el fenilbutirato de sodio y benzoato de sodio.
Ejemplo 10 (ejemplo de referencia) - La aspirina induce la biogénesis lisosomal en astrocitos primarios de ratón
Examinamos si la aspirina, uno de los medicamentos más utilizados del mundo, podría regular al alza la biogénesis lisosomal en células cerebrales de ratón. Los astrocitos se trataron en medio libre de suero con diferentes dosis de aspirina y después se procedió a la tinción con Lyso Tracker. La aspirina a dosis de 2 y 5 pM aumentó de forma significativa la biogénesis lisosomal, tal y como se evidencia en una mayor tinción con Lyso Tracker (Fig. 10). Sin embargo, a una dosis de 10 pM, la aspirina no resultó muy potente a la hora de aumentar la biogénesis lisosomal (Fig. 10).
Ejemplo 11 (ejemplo de referencia) - La aspirina aumenta la expresión de LAMP2 en astrocitos primarios de ratón
LAMP2 es una importante proteína de la membrana lisosomal, que desempeña un papel fundamental en la formación de nuevos lisosomas. Observamos un aumento de la expresión de ARNm de LAMP2 (Fig. 11A) y proteína (Fig. 11C) dependiente del tiempo mediado por la aspirina en los astrocitos. Una vez más, el experimento dependiente de la dosis demostró un aumento de la expresión de proteína LAMP2 a dosis de 2 y 5 pM de aspirina (Fig. 11B). El aumento de LAMP2 provocado por la aspirina se confirmó también mediante inmunotinción (Fig. 11D).
Ejemplo 12 (ejemplo de referencia) - La aspirina regula al alza la expresión y la actividad de TPP1 en astrocitos primarios de ratón
La tripeptidilpeptidasa 1 (TPP1) es la molécula diana en la enfermedad de Batten de inicio infantil tardío, dado que la actividad de esta proteína es deficiente en esta enfermedad. Examinamos si la aspirina podría regular al alza la TPP1 en los astrocitos. Una vez más, los estudios dependientes de la dosis demostraron un aumento de la proteína TPP1 a dosis inferiores (2 y 5 pM) de aspirina (Fig. 12A). El aumento de la proteína TPP1 en respuesta a 5 pM de aspirina ya se hizo evidente a las 2 horas, aunque fue máximo a las 12 horas de incubación (Fig. 12B). Una vez más, observamos un aumento de la actividad de TPP1 a 2 y 5 pM, pero no a 10 pM de aspirina (Fig. 12C).
Ejemplo 13 (ejemplo de referencia) - La aspirina regula al alza la expresión de TFEB en astrocitos primarios de ratón
Según conclusiones recientes, TFEB es un regulador principal de la biogénesis lisosomal (9, 12, 25). Con el paso de los años, diferentes grupos han subrayado el papel del lisosoma en diferentes escenarios de enfermedad (48, 49, 52, 53). Se ha documentado que los genes relacionados con lisosomas están fuertemente regulados en la grasa orbitaria de pacientes que sufren oftalmopatía de Graves, mientras que la regulación a la baja del procesamiento lisosomal mejoró la transfección de genes mediada por lipopoliplex pegilado (53, 54). El aumento de la biogénesis lisosomal puede no resultar necesariamente beneficioso en todas las enfermedades y tipos de células, pero en algunos casos la inducción de la vía de autofagia-lisosomal podría resultar útil para la eliminación de residuos tóxicos de la célula (55, 56). En los últimos años, el TFEB se ha definido como un potencial objetivo terapéutico para algunas enfermedades relacionadas con los lisosomas. Según Tsunemi et al (57), la activación del factor de transcripción EB (TFEB) vía PGC1a podría provocar una mayor rotación de HTT y la eliminación de agregados de proteína. Existen informes que sugieren un vínculo entre la toxicidad de a-sinucleína y la función deteriorada de TFEB, y que identificaron TFEB como objetivo para la terapia neuroprotectora en la enfermedad de Parkinson (59). Se ha demostrado también que la activación de TFEB mejora el múltiplo, el tráfico y la actividad de una variante de glucocerebrosidasa (GC) desestabilizada en la enfermedad de Gaucher. En el caso de la enfermedad de Tay-Sachs, se ha demostrado que el TFEB rescata la actividad de un mutante de p-hexosaminidasa. Estas conclusiones describen TFEB como el regulador específico de la proteostasis lisosomal y un objetivo terapéutico para el rescate de la homeostasis de enzimas en las EDL (60, 61).
Por consiguiente, examinamos si la aspirina podría regular al alza el TFEB en los astrocitos. Estudios dependientes de la dosis demostraron que la aspirina era capaz de aumentar el nivel de proteína de TFEB a dosis de 2 y 5 pM de aspirina (Fig. 13A). La regulación al alza de TFEB con aspirina se confirmó también mediante análisis de inmunofluorescencia (Fig. 13B). También clonamos el promotor de Tfeb en el vector potenciador de pGL3 y examinamos la actividad del reporter impulsada por el promotor de Tfeb. Es interesante señalar que la aspirina indujo la actividad de luciferasa impulsada por el promotor de Tfeb en astrocitos (Fig. 13C), lo que sugiere que la aspirina aumenta la transcripción del gen de Tfeb.
Ejemplo 14 (ejemplo de referencia) - La aspirina induce la expresión de PPARa en astrocitos primarios de ratón.
Recientemente hemos descubierto que PPARa desempeña un papel fundamental en la transcripción de Tfeb. Por consiguiente, aquí examinamos si la aspirina podría inducir la activación de PPARa en astrocitos. Primero, empleamos un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) para monitorizar la actividad de unión a ADN de PPARa y descubrimos un aumento dependiente del tiempo de la activación de PPARa con la aspirina (Fig. 14A). Para confirmar estos resultados, aislamos astrocitos de ratones WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) y controlamos la actividad de transcripción de PPAR. Es interesante señalar que la aspirina aumentó la actividad de luciferasa impulsada por PPRE en astrocitos aislados de ratones WT y PPARp (-/-), pero no así en el caso de los PPARa (-/-) (Fig. 14B), lo que sugiere que la aspirina es capaz de inducir la activación de PPARa, pero no de PPARp.
Ejemplo 15 (ejemplo de referencia) - La aspirina regula al alza el TFEB en astrocitos primarios de ratón vía PPAR a
Los astrocitos aislados de ratones WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) se trataron con 5 pM de aspirina y se procedió a un ensayo de inmunofluorescencia de TFEB. La Fig. 15 muestra que la aspirina indujo la expresión de TFEB en astrocitos aislados de ratones WT y PPARp (-/-), pero no así en el caso de los PPARa (-/-). Estos resultados indican que la aspirina requiere PPARa, pero no PPARp, para aumentar el TFEB en astrocitos.
Ejemplo 16 (ejemplo de referencia) - La aspirina aumenta la biogénesis lisosomal en astrocitos primarios de ratón vía PPARa
Dado que el TFEB es el principal regulador de la expresión génica y de la biogénesis lisosomal (9, 12, 16), examinamos el efecto de la aspirina sobre la biogénesis lisosomal. Los astrocitos aislados de ratones WT, PPARa (-/-) y PPARp (-/-) se trataron con diferentes dosis de aspirina y se controló el nivel de LAMP2. Tal y como evidencia la Figura 16A-B, la aspirina aumentó de forma dependiente de la dosis el nivel de LAMP2 en astrocitos aislados de ratones WT y PPARp (-/-), pero no así en el caso de los PPARa (-/-). También examinamos el estado de los lisosomas mediante tinción con Lyso Tracker. De forma similar a lo sucedido con LAMP2, la aspirina aumentó la biogénesis lisosomal en astrocitos aislados de ratones WT y PPARp (-/-), pero no de PPARa (-/-) (Fig. 17).
Ejemplo 17 (ejemplo de referencia) - Debate de los Ejemplos 10 a 16
Existen varias ventajas de la aspirina sobre otras terapias disponibles para los trastornos por depósito lisosomal. Por una parte, la aspirina se ha utilizado ampliamente como analgésico en todo el mundo durante décadas. Por otra parte, se puede tomar por vía oral, que es la menos molesta. A pesar de que se ha documentado que la aspirina presenta algunos efectos tóxicos (úlceras gástricas, sangrado en el estómago y tinnitus, etc.) a dosis elevadas (74), en nuestro estudio la aspirina promueve la biogénesis lisosomal a bajas dosis (2 y 5 pM) y a dosis bajas la aspirina no puede resultar tóxica. Sin embargo, si la aspirina presenta algún efecto tóxico incluso a dosis más bajas (por ej., úlcera gástrica), existen formas de reducir sus efectos secundarios. Por ejemplo, la aspirina con recubrimiento entérico está disponible para uso oral y evita la degradación en el estómago. En un ensayo aleatorizado abierto, una dosis baja de aspirina con una formulación de liberación lenta demostró eficacia como agente antiplaquetario (75) sin efectos secundarios demasiado apreciables. Un estudio de investigación (76) utilizó S-adenosil-metionina (SAM), un aminoácido que se forma naturalmente en el organismo, y se descubrió que una dosis de 500 mg de SAM administrada junto con una dosis alta de aspirina (1300 mg) redujo la cantidad de daños en el estómago en un 90%.
En resumen, hemos demostrado que la aspirina, un analgésico ampliamente utilizado, aumenta la biogénesis lisosomal en astrocitos a través de la regulación al alza de TFEB mediada por PPARa. Estos resultados ponen de manifiesto que este fármaco se puede utilizar para la intervención terapéutica en la enfermedad de Batten de inicio infantil tardío y otras EDL como terapia primaria o complementaria.
Referencias
1. de Duve, C. (1959) Lysosomes, a new group of cytoplasmic particles. Subcellular partióles 60, 128-159
2. De Duve, C, y Wattiaux, R. (1966) Functions of lysosomes. Annu Rev Physiol 28, 435-492
3. Saftig, P. (2006) Physiology of the lysosome.
4. Perez-Sala, D., Boya, P., Ramos, I., Herrera, M., y Stamatakis, K. (2009) The C-terminal sequence of RhoB directs protein degradation through an endo-lysosomal pathway. PLoS One 4, e8117
5. Fuster, J. J., Gonzalez, J. M., Edo, M. D., Viana, R., Boya, P., Cervera, J., Verges, M., Rivera, J., y Andres, V. (2010) Tumor suppressor p27(Kip1) undergoes endolysosomal degradation through its interaction with sorting nexin 6. FASEB J 24, 2998-3009
6. Korolchuk, V. I., Saiki, S., Lichtenberg, M., Siddiqi, F. H., Roberts, E. A., Imarisio, S., Jahreiss, L, Sarkar, S., Futter, M., Menzies, F. M., O'Kane, C. J., Deretic, V., y Rubinsztein, D. C. (2011) Lysosomal positioning coordinates cellular nutrient responses. Nat Cell Biol 13, 453-460
7. Boya, P., y Kroemer, G. (2008) Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene 27, 6434­ 6451
Martina, J. A., Diab, H. I., Lishu, L., Jeong, A. L., Patange, S., Raben, N., y Puertollano, R. (2014) The nutrient-responsive transcription factor TFE3 promotes autophagy, lysosomal biogenesis, and clearance of cellular debris. Sci Signa! 7, ra9
Palmieri, M., Impey, S., Kang, H., di Ronza, A., Pelz, C, Sardiello, M., y Ballabio, A. (2011) Characterization of the CLEAR network reveals an integrated control of cellular clearance pathways. Hum Mo! Genet 20, 3852-3866
Sardiello, M., Palmieri, M., di Ronza, A., Medina, D. L., Valenza, M., Gennarino, V. A., Di Malta, C, Donaudy, F., Embrione, V., Polishchuk, R. S., Banfi, S., Parenti, G., Cattaneo, E., y Ballabio, A. (2009) A gene network regulating lysosomal biogenesis and function. Science 325, 473-477
Marschner, K., Kollmann, K., Schweizer, M., Braulke, T., y Pohl, S. (2011) A key enzyme in the biogenesis of lysosomes is a protease that regulates cholesterol metabolism. Science 333, 87-90 Settembre, C, Di Malta, C, Polito, V. A., Garcia Arencibia, M., Vetrini, F., Erdin, S., Erdin, S. U., Huynh, T., Medina, D., Colella, P., Sardiello, M., Rubinsztein, D. C, y Ballabio, A. (2011) TFEB links autophagy to lysosomal biogenesis. Science 332, 1429-1433
Ferron, M., Settembre, C, Shimazu, J., Lacombe, J., Kato, S., Rawlings, D. J., Ballabio, A., y Karsenty, G. (2013) A RANKL-PKCbeta-TFEB signaling cascade is necessary for lysosomal biogenesis in osteoclasts. Genes Devi!, 955-969
Settembre, C, Zoncu, R., Medina, D. L, Vetrini, F., Erdin, S., Huynh, T., Ferron, M., Karsenty, G., Vellard, M. C, Facchinetti, V., Sabatini, D. M., y Ballabio, A. (2012) A lysosome-to-nucleus signalling mechanism senses and regulates the lysosome via mTOR and Tf EB. EMBO J 31, 1095-1108
Settembre, C, Fraldi, A., Medina, D. L, y Ballabio, A. (2013) Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol 14, 283-296
Settembre, C, De Cegli, R., Mansueto, G., Saha, P. K., Vetrini, F., Visvikis, O., Huynh, T., Carissimo, A., Palmer, D., Klisch, T. J., Wollenberg, A. C, Di Bernardo, D., Chan, L, Irazoqui, J. E., y Ballabio, A. (2013) TFEB controls cellular lipid metabolism through a starvation-induced autoregulatory loop. Nat Cell Biol 15, 647-658
Robins, S. J., Collins, D., Wittes, J. T., Papademetriou, V., Deedwania, P. C, Schaefer, E. J., McNamara, J. R., Kashyap, M. L, Hershman, J. M., Wexler, L. F., y Rubins, H. B. (2001) Relation of gemfibrozil treatment and lipid levels with major coronary events: VA-HIT: a randomized controlled trial. JAMA 285, 1585-1591
Rubins, H. B., y Robins, S. J. (1992) Effect of reduction of plasma triglycerides with gemfibrozil on highdensity-lipoprotein-cholesterol concentrations. J Intern Med 231, 421-426
Rubins, H. B., Robins, S. J., Collins, D., Fye, C. L, Anderson, J. W., Elam, M. B., Faas, F. H., Linares, E., Schaefer, E. J., Schectman, G., Wilt, T. J., y Wittes, J. (1999) Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med 341,410-418
Dasgupta, S., Roy, A., Jana, M., Hartley, D. M., y Pahan, K. (2007) Gemfibrozil ameliorates relapsingremitting experimental autoimmune encephalomyelitis independent of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha. Mol Pharmacol 72, 934-946
Pahan, K., Jana, M., Liu, X., Taylor, B. S., Wood, C, y Fischer, S. M. (2002) Gemfibrozil, a lipidlowering drug, inhibits the induction of nitric-oxide synthase in human astrocytes. J Biol Chem 277, 45984-45991
Roy, A., y Pahan, K. (2009) Gemfibrozil, stretching arms beyond lipid lowering. Immunopharmacol Immunotoxicol 31,339-351
Corbett, G. T., Roy, A., y Pahan, K. (2012) Gemfibrozil, a lipid-lowering drug, upregulates IL-1 receptor antagonist in mouse cortical neurons: implications for neuronal self-defense. J Immunol 189, 1002-1013
Brahmachari, S., y Pahan, K. (2007) Sodium benzoate, a food additive and a metabolite of cinnamon, modifies T cells at multiple steps and inhibits adoptive transfer of experimental allergic encephalomyelitis. J Immunol 179, 275-283
Saha, R. N., y Pahan, K. (2007) Differential regulation of Mn-superoxide dismutase in neurons and astroglia by HIV-1 gp120: Implications for HIV-associated dementia. Free Radic Biol Med 42, 1866-1878
Giulian, D., y Baker, T. J. (1986) Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci 6, 2163-2178
Jana, M., y Pahan, K. (2005) Redox regulation of cytokine-mediated inhibition of myelin gene expression in human primary oligodendrocytes. Free Radic Biol Med 39, 823-831
Khasnavis, S., Jana, A., Roy, A., Wood, T., Ghosh, S., Watson, R., y Pahan, K. Suppression of nuclear factor-kappa B activation and inflammation in microglia by a physically-modified saline. J Biol Chem Khasnavis, S., y Pahan, K. Sodium benzoate, a metabolite of cinnamon and a food additive, upregulates neuroprotective Parkinson disease protein DJ-1 in astrocytes and neurons. J Neuroimmune Pharmacol 7, 424-435
Dasgupta, S., Jana, M., Zhou, Y., Fung, Y. K., Ghosh, S., y Pahan, K. (2004) Antineuroinflammatory effect of NF-kappaB essential modifier-binding domain peptides in the adoptive transfer model of experimental allergic encephalomyelitis. J Immunol 173, 1344-1354
Corbett, G. T., Roy, A., y Pahan, K. Gemfibrozil, a Lipid-Lowering Drug, Upregulates IL-1 Receptor Antagonist in Mouse Cortical Neurons: Implications for Neuronal Self-Defense. J Immunol 189, 1002­ 1013
Saha, R. N., Liu, X., y Pahan, K. (2006) Up-regulation of BDNF in astrocytes by TNF-alpha: a case for the neuroprotective role of cytokine. J Neuroimmune Pharmacol 1,212-222
Jana, M., Jana, A., Liu, X., Ghosh, S., y Pahan, K. (2007) Involvement of phosphatidylinositol 3- kinasemediated up-regulation of I kappa B alpha in anti-inflammatory effect of gemfibrozil in microglia. J Immunol 179, 4142-4152
Jana, M., y Pahan, K. Gemfibrozil, a lipid lowering drug, inhibits the activation of primary human microglia via peroxisome proliferator-activated receptor beta. Neurochem Res 37, 1718-1729
Nelson, J. D., Denisenko, O., y Bomsztyk, K. (2006) Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc 1, 179-185
Cullingford, T. E., Bhakoo, K., Peuchen, S., Dolphin, C. T., Patel, R., y Clark, J. B. (1998) Distribution of mRNAs encoding the peroxisome proliferator-activated receptor alpha, beta, and gamma and the retinoid X receptor alpha, beta, and gamma in rat central nervous system. J Neurochem 70, 1366-1375 Nishizawa, H., Manabe, N., Morita, M., Sugimoto, M., Imanishi, S., y Miyamoto, H. (2003) Effects of in utero exposure to bisphenol A on expression of RARalpha and RXRalpha mRNAs in murine embryos. J Reprod Dev 49, 539-545
Chinetti, G., Griglio, S., Antonucci, M., Torra, I. P., Delerive, P., Majd, Z., Fruchart, J. C, Chapman, J., Najib, J., y Staels, B. (1998) Activation of proliferator-activated receptors alpha and gamma induces apoptosis of human monocyte-derived macrophages. J Biol Chem 273, 25573-25580
Brun, S., Carmona, M. C, Mampel, T., Vinas, O., Giralt, M., Iglesias, R., y Villarroya, F. (1999) Activators of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha induce the expression of the uncoupling protein-3 gene in skeletal muscle: a potential mechanism for the lipid intakedependent activation of uncoupling protein-3 gene expression at birth. Diabetes 48, 1217-1222
Chinetti, G., Lestavel, S., Bocher, V., Remaley, A. T., Neve, B., Torra, I. P., Teissier, E., Minnich, A., Jaye, M., Duverger, N., Brewer, H. B., Fruchart, J. C, Clavey, V., y Staels, B. (2001) PPAR-alpha and PPAR-gamma activators induce cholesterol removal from human macrophage foam cells through stimulation of the ABCA1 pathway. Nat Med 7, 53-58
Kelly, D. P. (2001) The pleiotropic nature of the vascular PPAR gene regulatory pathway. Circ Res 89, 935-937
Boitier, E., Gautier, J. C, y Roberts, R. (2003) Advances in understanding the regulation of apoptosis and mitosis by peroxisome-proliferator activated receptors in pre-clinical models: relevance for human health and disease. Comp Hepatol 2, 3
Pshezhetsky, A. V., y Ashmarina, M. (2001) Lysosomal multienzyme complex: biochemistry, genetics, and molecular pathophysiology. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 69, 81-114
Karageorgos, L. E., Isaac, E. L, Brooks, D. A., Ravenscroft, E. M., Davey, R., Hopwood, J. J., y Meikle, P. J. (1997) Lysosomal biogenesis in lysosomal storage disorders. Exp Cell Res 234, 85-97 Weissmann, G. (1967) The role of lysosomes in inflammation and disease. Annu Rev Med 18, 97-112 Eskelinen, E. L., Tanaka, Y., y Saftig, P. (2003) At the acidic edge: emerging functions for lysosomal membrane proteins. Trends Cell Biol 13, 137-145
Brignull, L. M., Czimmerer, Z., Saidi, H., Daniel, B., Villela, I., Bartlett, N. W., Johnston, S. L, Meira, L. B., Nagy, L, y Nohturfft, A. (2013) Reprogramming of lysosomal gene expression by interleukin-4 and Stat6. BMC Genomics 14, 853
Neufeld, E. F. (1991) Lysosomal storage diseases. Annu Rev Biochem 60, 257-280
Gieselmann, V. (1995) Lysosomal storage diseases. Biochim Biophys Acta 1270, 103-136 Khatiwada, B., y Pokharel, A. (2009) Lysosomal storage disease. JNMA J Nepal Med Assoc 48, 242-245 Jolly, R. D. (1978) LYSOSOMAL STORAGE DISEASES. Neuropathology and Applied Neurobiology 4, 419-427
Appelqvist, H., Waster, P., Kagedal, K., y Ollinger, K. (2013) The lysosome: from waste bag to potential therapeutic target. J Mol Cell Biol 5, 214-226
Bai, J., Liu, Y., Sun, W., Chen, J., Miller, A. D., y Xu, Y. (2013) Down-regulated lysosomal processing improved pegylated lipopolyplex-mediated gene transfection. J Gene Med 15, 182-192
Chen, M. H., Liao, S. L., Tsou, P. L., Shih, M. J., Chang, T. C, y Chuang, L. M. (2008) Lysosomerelated genes are regulated in the orbital fat of patients with graves' ophthalmopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci 49, 4760-4764
Sarkar, S., Carroll, B., Buganim, Y., Maetzel, D., Ng, A. H., Cassady, J. P., Cohen, M. A., Chakraborty, S., Wang, H., Spooner, E., Ploegh, H., Gsponer, J., Korolchuk, V. I., y Jaenisch, R. (2013) Impaired autophagy in the lipid -storage disorder Niemann-Pick type C1 disease. Cell Rep 5, 1302-1315 Song, W., Wang, F., Lotfi, P., Sardiello, M., y Segatori, L. (2014) 2-Hydroxypropyl-betacyclodextrin promotes transcription factor EB-mediated activation of autophagy: implications for therapy. J Biol Chem 289, 10211-10222
Tsunemi, T., Ashe, T. D., Morrison, B. E., Soriano, K. R., Au, J., Roque, R. A., Lazarowski, E. R., Damian, V. A., Masliah, E., y La Spada, A. R. (2012) PGC-1 alpha rescues Huntington's disease proteotoxicity by preventing oxidative stress and promoting TFEB function. Sci Transl Med 4, 142ra197
La Spada, A. R. (2012) PPARGC1A/PGC-1 alpha, TFEB and enhanced proteostasis in Huntington disease: defining regulatory linkages between energy production and protein-organelle quality control. Autophagy 8, 1845-1847
Decressac, M., Mattsson, B., Weikop, P., Lundblad, M., Jakobsson, J., y Bjorklund, A. (2013) TFEB-mediated autophagy rescues midbrain dopamine neurons from alpha-synuclein toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 110, E1817-1826
Wang, F., y Segatori, L. (2013) Remodeling the proteostasis network to rescue glucocerebrosidase variants by inhibiting ER-associated degradation and enhancing ER folding. PLoS One 8, e61418 Song, W., Wang, F., Savini, M., Ake, A., di Ronza, A., Sardiello, M., y Segatori, L. (2013) TFEB regulates lysosomal proteostasis. Hum Mol Genet 22, 1994-2009
Medina, D. L., Fraldi, A., Bouche, V., Annunziata, F., Mansueto, G., Spampanato, C, Puri, C, Pignata, A., Martina, J. A., Sardiello, M., Palmieri, M., Polishchuk, R., Puertollano, R., y Ballabio, A. (2011) Transcriptional activation of lysosomal exocytosis promotes cellular clearance. Dev Cell 21, 421-430 Moskot, M., Montefusco, S., Jakobkiewicz-Banecka, J., Mozolewski, P., Wegrzyn, A., Di Bernardo, D., Wegrzyn, G., Medina, D. L, Ballabio, A., y Gabig-Ciminska, M. (2014) The phytoestrogen genistein modulates lysosomal metabolism and Transcription Factor EB (TFEB) activation. J Biol Chem
Xu, X., Grijalva, A., Skowronski, A., van Eijk, M., Serlie, M. J., y Ferrante, A. W., Jr. (2013) Obesity activates a program of lysosomal-dependent lipid metabolism in adipose tissue macrophages independently of classic activation. Cell Metab 18, 816-830
Singh, R., y Cuervo, A. M. (2012) Lipophagy: connecting autophagy and lipid metabolism. Int J Cell Biol 2012, 282041
Ghosh, A., Corbett, G. T., Gonzalez, F. J., y Pahan, K. (2012) Gemfibrozil and fenofibrate, Food and Drug Administration-approved lipid-lowering drugs, up-regulate tripeptidyl-peptidase 1 in brain cells via peroxisome proliterator-activated receptor alpha: implications for late infantile Batten disease therapy. J Biol Chem 287, 38922-38935
Xu, J., Racke, M. K., y Drew, P. D. (2007) Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist fenofibrate regulates iL-12 family cytokine expression in the CNS: relevance to multiple sclerosis. J Neurochem 103, 1801-1810
Xu, J., Chavis, J. A., Racke, M. K., y Drew, P. D. (2006) Peroxisome proliterator-activated receptor-alpha and retinoid X receptor agonists inhibit inflammatory responses of astrocytes. J Neuroimmunol 176, 95­ 105
Krey, G., Mahfoudi, A., y Wahli, W. (1995) Functional interactions of peroxisome proliferatoractivated receptor, retinoid-X receptor, and Sp1 in the transcriptional regulation of the acylcoenzyme- A oxidase promoter. Mol Endocrinol 9, 219-231
Juge-Aubry, C. E., Gorla-Bajszczak, A., Pernin, A., Lemberger, T., Wahli, W., Burger, A. G., y Meier, C. A. (1995) Peroxisome proliferator-activated receptor mediates cross-talk with thyroid hormone receptor by competition for retinoid X receptor. Possible role of a leucine zipper-like heptad repeat. J Biol Chem 270, 18117-18122
Roy, A., Jana, M., Corbett, G. T., Ramaswamy, S., Kordower, J. H., Gonzalez, F. J., y Pahan, K. (2013) Regulation of cyclic AMP response element binding and hippocampal plasticity-related genes by peroxisome proliferator-activated receptor alpha. Cell Rep 4, 724-737
Marcus, S. L, Miyata, K. S., Rachubinski, R. A., y Capone, J. P. (1995) Transactivation by PPAR/RXR heterodimers in yeast is potentiated by exogenous fatty acid via a pathway requiring intact peroxisomes. Gene Expr 4, 227-239
Parast, M. M., Yu, H., Ciric, A., Salata, M. W., Davis, V., y Milstone, D. S. (2009) PPARgamma regulates trophoblast proliferation and promotes labyrinthine trilineage differentiation. PLoS One 4, e8055 Leung, F. W. (2008) Risk factors for gastrointestinal complications in aspirin users: review of clinical and experimental data. Dig Dis Sci 53, 2604-2615
Budd, J. S., Allen, K., Walsh, A., y Bell, P. R. (1993) The effectiveness of low dose slow release aspirin as an antiplatelet agent. J R Soc Med 86, 261-263
Laudanno, O. M. (1987) Cytoprotective effect of S-adenosylmethionine compared with that of misoprostol against ethanol-, aspirin-, and stress-induced gastric damage. Am J Med 83, 43-47

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un agente que facilita la regulación al alza del factor de transcripción EB para el uso en el tratamiento de un trastorno por depósito lisosomal, donde
(I) el agente es ácido cinámico; o
(Ii) el agente es benzoato de sodio.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, donde la composición comprende asimismo una cantidad terapéuticamente efectiva de ácido transretinoico total o vitamina A.
3. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el trastorno por depósito lisosomal es un trastorno neurodegenerativo seleccionado del grupo compuesto por lipofuscinosis ceroide neuronal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosos lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, incluyendo enfermedades parkinsonianas como la atrofia multisistémica (AMS), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (DCB) o demencia con cuerpos de Lewy (DCL).
4. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el trastorno por depósito lisosomal es un trastorno de la vía de autofagia y en la que el agente aumenta la biogénesis lisosomal
5. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el trastorno por depósito lisosomal se selecciona del grupo compuesto por enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Fabry, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, síndrome de Hunter, alfa-manosidosis, aspartilglucosaminuria, enfermedad por depósito de ésteres de colesterol, deficiencia crónica de hexosaminidasa A, cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Farber, fucosidosis, galactosialidosis o enfermedad de Batten, incluyendo enfermedad de Batten de inicio infantil tardío y juvenil.
6. La composición para el uso de las reivindicaciones 1, 2 o 5, donde el trastorno por depósito lisosomal es la enfermedad de Tay-Sachs.
7. La composición para el uso de las reivindicaciones 1, 2 o 5, donde el trastorno por depósito lisosomal es la enfermedad de Niemann-Pick.
8. La composición para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el factor de transcripción EB se regula al alza aumentando los niveles de ARNm del factor de transcripción EB, aumentando los niveles de proteína del factor de transcripción EB o activando un heterodímero PPARa-RXRa.
9. La composición para el uso de la reivindicación 1, donde la composición comprende: ácido cinámico y ácido transretinoico total o vitamina A
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170083146A (ko) * 2014-11-19 2017-07-17 러쉬 유니버시티 메디컬 센터 리소좀 질환들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들
KR102338171B1 (ko) 2016-06-13 2021-12-09 신유알엑스 인터내셔널 (타이완) 코포레이션 벤조산리튬의 공-결정 및 그의 용도
ES2936094T3 (es) * 2016-06-13 2023-03-14 Syneurx Int Taiwan Corp Cocristales de benzoato de sodio y usos de los mismos
CN110167545A (zh) * 2016-12-29 2019-08-23 拉什大学医学中心 吉非罗齐对晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积症患者寿命的增加和自发活动的改善
EP3580237A1 (en) * 2017-02-08 2019-12-18 Novartis AG Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof
JP2021511799A (ja) * 2018-01-30 2021-05-13 ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センター 組織および細胞の多重分析のための連続染色
JP7366408B2 (ja) * 2018-02-06 2023-10-23 国立大学法人京都大学 ライソゾーム病の予防及び治療剤
EP3796939A4 (en) * 2018-05-22 2022-03-23 Duke University COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES WITH RIFAXIMIN
CA3118918A1 (en) * 2018-11-05 2020-05-14 Rush University Medical Center Nasal delivery of low-dose aspirin for the treatment of neurodegenerative and lysosomal storage diseases
CN113316453A (zh) * 2019-01-03 2021-08-27 匹兹堡大学联邦系统高等教育 用于提高转录因子eb多肽水平的方法和材料
US20220133664A1 (en) * 2019-02-25 2022-05-05 Rush University Medical Center Compositions including cinnamic acid and methods of use thereof
AU2020344449A1 (en) * 2019-09-09 2022-04-07 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of restoring lysosomal function of retinal pigment epithelial cells by activation of TFEB
BR112022006012A2 (pt) * 2019-10-01 2022-07-12 Seelos Therapeutics Inc Formulações de trealose e usos das mesmas
WO2023114414A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Benzoic acid salts for treatment of nervous system injuries and disorders
US12042476B2 (en) * 2022-02-04 2024-07-23 Mcmaster University Methods for the treatment of lysosomal storage diseases

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002501887A (ja) 1998-01-28 2002-01-22 ワーナー−ランバート・カンパニー アルツハイマー病の治療方法
AU2001233299A1 (en) 2000-02-04 2001-08-14 Esperion Therapeutics Inc. Methods for treating alzheimer's disease
PL1732605T3 (pl) * 2004-03-29 2019-09-30 Wyeth Llc Multiwitaminowe i mineralne suplementy odżywcze
US20060135612A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 U.S. Department Of Veterans Affairs Method of ameliorating or abrogating the effects of a neurodegenerative disorder, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), by using a HDAC inhibiting agent
ES2246737B1 (es) * 2005-06-09 2006-12-01 Jose Juan Rodriguez Jerez "composicion farmaceutica que comprende lisina y usos correspondientes".
JP2009084155A (ja) * 2006-01-16 2009-04-23 Kanazawa Univ レビー小体病治療薬及びレビー小体病予防薬
US20070225360A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 L'oreal Anti-aging composition containing phloretin
GB0718824D0 (en) * 2007-09-26 2007-11-07 Univ Ramot Methods of treating lysosomal storage disorders
US20120114670A1 (en) * 2007-10-02 2012-05-10 University Of Rochester Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations
US9388413B2 (en) * 2008-10-08 2016-07-12 Trustees Of Dartmouth College Method for selectively inhibiting ACAT1 in the treatment of neurodegenerative diseases
US9388414B2 (en) * 2008-10-08 2016-07-12 Trustees Of Dartmouth College Method for selectively inhibiting ACAT1 in the treatment of neurodegenerative diseases
JP2010106001A (ja) * 2008-10-31 2010-05-13 Theravalues Corp Ｐｐａｒ活性化剤
EP2218458A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-18 Fondazione Telethon Molecules able to modulate the expression of at least a gene involved in degradative pathways and uses thereof
ES2555533T3 (es) * 2009-10-19 2016-01-04 Amicus Therapeutics, Inc. Nuevas composiciones para prevenir y/o tratar trastornos de almacenamiento lisosomal
KR20130131461A (ko) * 2011-03-07 2013-12-03 폰다지오네 텔레톤 Tfeb 변종 및 그의 용도
JP6061922B2 (ja) * 2011-06-22 2017-01-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション プロテイノパチーの処置方法
PL399467A1 (pl) * 2012-06-08 2013-12-09 3G Therapeutics Inc. Zastosowanie genisteiny do obnizania poziomu zwiazków organicznych spichrzanych w komórkach w leczeniu i/lub zapobieganiu lizosomalnych chorób spichrzeniowych (LChS)
WO2014089449A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 Rush University Nedical Center Composition and method for treating neuronal ceroid lipofuscinosis
KR20170083146A (ko) * 2014-11-19 2017-07-17 러쉬 유니버시티 메디컬 센터 리소좀 질환들의 치료를 위한 방법들 및 조성물들

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