JP2022003060A - リソソーム蓄積症治療のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年11月19日に出願した米国特許仮出願第62/081,696号に基づく優先権を
主張するものであり、上記出願の開示全体を参照により本明細書に組み入れる。
技術分野
本発明は、全体的にリソソーム蓄積症の治療のための組成物及び方法に関する。
である(1〜3)。リソソームは古典的には老廃物を管理するオルガネラとして同定され、
発生における分解、プログラムされた細胞死、及び栄養反応等の主要な細胞内プロセスに
関与することが示されている(2,4〜8)。リソソームの多様な役割及び異なる刺激に対す
る応答から、リソソーム遺伝子の発現の協調的な調節が示唆される(9,10)。近年の研究
から、リソソーム遺伝子の調節に関する情報がもたらされた(11,12)が、リソソーム遺
伝子のパターン発見解析から、bHLH(塩基性へリックス-ループ-へリックス)因子の小眼
球症転写因子E(MiT/TFE)サブファミリーのメンバーである転写因子EB(TFEB)の潜在的
結合部位である協調的なリソソームの発現及び調節(Coordinated Lysosomal Expression
and Regulation (CLEAR))エレメントの存在が明らかとなった。研究から、TFEBとリソ
ソーム生合成とが関連する可能性が報告されている(9,10,12)。
破骨細胞において、RANKL依存性シグナル伝達経路によって、TFEB活性化誘導性のリソソ
ーム生合成が誘導される(13)。飢餓又はストレス条件も、通常はmTORC1によって不活性
化状態に維持されているTFEBを活性化し得る(14,15)。ある研究では、飢餓によって誘
導されたTFEB活性が脂質代謝において重要な役割を果たしており、また活性化されたTFEB
はそれ自身の遺伝子発現を自己調節することもできることが示されている(16)。
伝性代謝障害のグループである。LSDの症状は、特定の疾患及び他の変動要因、例えば発
症年齢に依存して異なり、軽度から重度のものであり得る。症状としては、発育遅延、運
動障害、発作、認知症、難聴及び/又は盲を挙げることができる。LSDを有する人々の一
部は、肝臓の肥大(肝腫大)、脾臓の肥大(脾腫)、肺及び心臓の疾患、及び異常に成長
する骨を有している。
本発明の一態様は、LSDの治療方法を提供する。本方法は、転写因子EB(TFEB)のアッ
プレギュレーションを仲介する薬剤の治療的有効量を含有する組成物を、治療を必要とす
る被験体に投与することを含み得る。
、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、
又はシムバスタチンであり得る。薬剤はまた、例えば脂質低下剤、例えばフィブラートで
あり得る。一部の実施形態において、フィブラートはゲムフィブロジル又はフェノフィブ
ラートである。他の実施形態において、薬剤は、鎮痛剤、解熱剤、アスピリン、桂皮(ci
nnamon)代謝産物、桂皮酸、フェニル酪酸ナトリウム又は安息香酸ナトリウムである。更
に他の実施形態において、組成物は、上記薬剤の少なくとも2種の組合せを含有し得る。
組成物は、スタチン又はフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンA
を含有し得る。薬剤とオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAとのこの組合せによ
って、オールトランス型レチノイン酸、ビタミンA又はフィブラート単独の投与よりも被
験体においてより大きな治療効果がもたらされ得る。組合せは相乗的な組合せであり得る
。TFEBはまた、転写因子EB mRNAレベルの上昇、転写因子EBタンパク質レベルの上昇、又
はPPARa-RXRaヘテロ二量体の活性化によって、アップレギュレートされ得る。
チントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多系統萎縮症(MSA)等のパーキンソン様疾患
(Parkinson's plus diseases)を含むパーキンソン病、進行性核上性麻痺(PSP)、大脳
皮質基底核変性症(CBD)又はレビー小体型認知症(DLB)であり得る。別の実施形態にお
いて、LSDは、オートファジー経路の障害であり、薬剤はリソソームの生合成を増大させ
るものである。
、ゴーシェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症(Aspa
rtylglucosaminuria)、コレステロールエステル蓄積症(Cholesteryl ester storage di
sease)、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フ
コシドーシス、ガラクトシアリドーシス、又は遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテ
ン病を含むバッテン病である。
効量を含有する組成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、LSDの治療方
法を提供する。更に別の態様は、TFEB活性を回復させる薬剤の治療的有効量を含有する組
成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、LSDの治療方法を提供する。
他に定義のない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が
属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。相反する場合には、本明細
書中の定義を含む記載が優先する。好ましい方法及び物質をを以下に記載するが、本発明
の実施又は試験において、本明細書中に記載したものと類似又は等価の方法及び物質を使
用することができる。
「the」及び類似の用語の使用は、本明細書中で他に示さない限り、又は文脈によって明
らかに矛盾のない限り、単数及び複数の双方を包含すると解釈されるべきである。本明細
書における数値範囲の記載は、本明細書中で他に示さない限り、単にその範囲内に含まれ
るそれぞれ別個の数値への個々の言及の省略法として機能するものであることが意図され
、それぞれ別個の数値は、本明細書中に個々に記載されているように明細書中に組み込ま
れる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に示さない限り、又は文脈
によって明らかに矛盾のない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書
中に提供する任意及び全ての例、又は例示的な語句(「等の」、「例えば」等)の使用は
、単に本発明をより良く説明することを意図するものであり、他に主張のない限り、本発
明の範囲に制限を課すものではない。明細書中のいかなる語句も、請求項に記載のない要
素を本発明の実施に必須のものとして示すものと解釈されるべきではない。
。本明細書において使用する用語「治療効果」は、被験体の疾患、例えばLSDと関連する
病的症状、疾患の進行若しくは生理学的状態における改善、又は疾患に対する抵抗性、を
誘導する、軽減する、あるいは引き起こす効果を意味する。薬剤に関連して使用する用語
「治療的有効量」は、被験体に治療効果を与える薬剤の量を意味する。
より大きいことを意味する。相乗的効果は、活性成分が(1)組み合わされた単位投与製剤
に共に製剤化されて同時に投与若しくは送達されるか、(2)別個の製剤として交互に若し
くは並行して送達されるか、又は(3)他のレジメンによる、場合に達成し得る。
本発明の原理の理解を促進する目的で、以下で実施形態について言及し、その一部は図
面に示し、これを説明するために特定の用語を使用する。しかしながら、これらによって
本発明の範囲を制限することが意図されるものではないことが理解されるであろう。記載
された実施形態における任意の変更及び更なる改変、及び本明細書に記載した本発明の原
理の任意の更なる応用が、本発明が関連する分野の熟練者によって通常行われるように想
定される。
イ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシェ病、ハンター症候群、α
マンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘ
キソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドーシス、ガ
ラクトシアリドーシス、又は遅発型小児性バッテン病及び若年性バッテン病を含むバッテ
ン病であり得る。LSDはまた、オートファジー-リソソーム経路に関与する神経変性疾患、
例えば神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索
硬化症(ALS)、多系統萎縮症(MSA)等のパーキンソン様疾患を含むパーキンソン病、進
行性核上性麻痺(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)又はレビー小体型認知症(DLB)
であり得る。神経変性疾患は不完全なオートファジー(defective autophage)によって
特徴づけることができる。そのような疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病
、及びハンチントン病が挙げられる。
をLSDに罹患している被験体に投与することを含む。アップレギュレーションはTfebのmRN
Aレベルを上昇させることを含み得る。本発明の方法はまた、TFEBをアップレギュレート
させるか又はTFEB活性を回復させる薬剤をLSDに罹患している被験体に投与することを含
む。アップレギュレーションは、TFEBのmRNAレベルを上昇させる、TFEBタンパク質レベル
を上昇させる、又はTFEB活性を上昇させることを含み得る。PPARα/RXRαヘテロ二量体の
活性化はTFEBのアップレギュレーションをもたらす。本発明者等はまた、驚くべきことに
、PPARαの活性又は関与を通してTFEBがアップレギュレートされるが、PPARβ又はPPARγ
ではアップレギュレートされないことを示した。
、フェノフィブラート、又はクロフィブラートであり得る。薬剤は、オールトランス型レ
チノイン酸又はビタミンAであり得る。驚くべきことに、また予想外なことに、オールト
ランス型レチノイン酸又はビタミンAと組み合わせてフィブラートを被験体に投与すると
、フィブラート又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAを単独で投与するより
もTFEBをよりアップレギュレートし得る。フィブラート及びオールトランス型レチノイン
酸又はビタミンAを被験体に一緒に投与した場合、TFEBのアップレギュレーションを共同
的に促進してTFEBを相乗的にアップレギュレートし得る。より高用量のフィブラートを被
験体に投与した場合にのみ生じるのと同じ程度のTFEBアップレギュレーションを達成する
ために必要とされ得るフィブラートの用量は、オールトランス型レチノイン酸又はビタミ
ンAの存在下ではより低い。フィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミ
ンAの組み合わせは相乗的な組み合わせであり得る。
スタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバス
タチン、シムバスタチン、又はこれらの薬剤の少なくとも2種の組み合わせであり得る。1
種以上のスタチンを単独で、又はフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸若しく
はビタミンAと組み合わせて使用し得る。更に別の実施形態において、薬剤は、鎮痛剤又
は解熱剤、例えばアスピリン;フェニルブチレート;安息香酸ナトリウム;又は桂皮代謝
産物、例えばケイ皮酸であり得る。このような薬剤も、オールトランス型レチノイン酸又
はビタミンAと組み合わせて使用することができ、TFEBのアップレギュレーションを共同
的に促進するために被験体に一緒に投与して、TFEBを相乗的にアップレギュレートし得る
。
り得る。更に、脂質低下剤は、脂質異常症のリスクを低下させる薬剤であり得る。フィブ
ラートはPPARαを介してTFEBのアップレギュレーションを仲介し得るが、PPARβ及びPPAR
γを介しては仲介しない。TFEBのアップレギュレーションの間、PPARαはRXR-αとヘテロ
二量体を形成し、RXRα/PPAR-aヘテロ二量体は、RXR結合部位を介してTfeb遺伝子のプロ
モーターにリクルートされる。
され得る。オールトランス型レチノイン酸は、ATRA、レチノイン酸、トレチノイン、及び
ビタミンA酸としても知られている。オールトランス型レチノイン酸は、レチノイドX受容
体-α(RXR-α)を介してTFEBのアップレギュレーションを仲介し得る。TFEBのアップレ
ギュレーションの間、RXR-αはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-a(PPAR-α)と
ヘテロ二量体を形成し、RXR-α/PPAR-αヘテロ二量体は、RXR結合部位を介してTfeb遺伝
子のプロモーターにリクルートされる。
ルトランス型レチノイン酸又はビタミンAとの組み合わせを含有し得る。このような組み
合わせは、薬剤又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンA単独の投与と比較して
、TFEBのアップレギュレーションを共同的に仲介又は増大し得る。この組み合わせは、脂
質低下剤又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミンA単独の投与と比較して、TFEB
のアップレギュレーションを約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、又は約10倍共同的に増大し得
る。特に、この組み合わせは、脂質低下剤又はオールトランス型レチノイン酸又はビタミ
ンA単独の投与と比較して、TFEBのアップレギュレーションを約3倍共同的に増大し得る。
医薬組成物は、オールトランス型レチノイン酸又はビタミンAも含有し得る。例えば、医
薬組成物は、ゲムフィブロジル、又はゲムフィブロジルとオールトランス型レチノイン酸
若しくはビタミンAとの組み合わせ、又はアスピリンとオールトランス型レチノイン酸若
しくはビタミンAとの組み合わせを含有し得る。
、ペレット、水性、脂質性、油性若しくは他の溶液、水中油型エマルジョン等のエマルジ
ョン、リポソーム、水性若しくは油性の懸濁液、シロップ、エリクシル(alixier)、固
形エマルジョン、固形分散液又は分散性粉末の形態であり得る。経口投与のための医薬組
成物では、薬剤は、一般的に知られ、使用されている助剤及び賦形剤、例えばアラビアガ
ム、タルク、デンプン、糖類(例えばマンニトース(mannitose)、メチルセルロース、ラ
クトース)、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、水性若しくは非水性溶
媒、パラフィン誘導体、架橋剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存剤、風味剤(例えばエー
テル油)、溶解促進剤(例えば安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール)又はバイオア
ベイラビリティー促進剤(例えばGELUCIRE)と、混合することができる。医薬組成物にお
いて、薬剤はまた、微粒子、例えばナノ粒子状の組成物中に分散していても良い。
えば水、緩衝液、可溶化剤を含むか含まない油、界面活性剤、分散剤又は乳化剤中に溶解
又は懸濁させることができる。油としては、限定するものではないが、例えばオリーブ油
、落花生油、綿実油、大豆油、ヒマシ油及びゴマ油を使用し得る。より一般的には、非経
口投与では、薬剤、又は薬剤の医薬組成物は、水性、脂質性、油性若しくは他の種類の溶
液又は懸濁液の形態であることができ、あるいはリポソーム若しくはナノ懸濁液の形態で
投与することもできる。
上記の薬剤、又はこれらの薬剤を含有する医薬組成物は、治療的有効量の薬剤を被験体
に送達することを可能とする任意の方法によって投与することができる。投与方法として
は、限定するものではないが、経口、局所、経皮及び非経口経路、並びに組織への直接注
入、及びカテーテルによる送達を挙げることができる。非経口経路としては、限定するも
のではないが、皮下、皮内、関節内、静脈内、腹腔内、及び筋肉内経路が挙げられる。一
実施形態において、投与経路は、例えばローション、クリーム、パッチ、注射、インプラ
ントデバイス、移植片(graft)又は他の制御放出担体による、局所又は経皮投与による
ものである。投与経路には、任意の非経口経路を含む、(例えば注射によって)体循環に
組成物を直接送達する任意の経路が含まれる。
分な投与量、濃度及び時間で、少なくとも1種の薬剤、例えばゲムフィブロジル又はゲム
フィブロジルとATRAとの組み合わせを投与することを含む。特定の実施形態は、被験体の
体重1kgあたり約0.1μg〜約100mg、被験体の体重1kgあたり約0.1μg〜約10mg、被験体の
体重1kgあたり約0.1μg〜約1mgの投与量で少なくとも1種の薬剤を全身投与することを含
む。この方法の実施において、薬剤、又は薬剤を含有する治療用組成物は、単回の一日用
量で、又は一日あたり複数回の投与量で投与することができる。この治療方法は長期間の
投与を必要とし得る。投与される用量中の量又は総投与量は医師によって決定され、患者
の体重、患者の年齢及び全身状態、及び化合物に対する患者の耐性等の因子に依存するで
あろう。
発明の範囲を制限するものではない。
試薬:DMEM/F-12 50/50 1x、ハンクス液(HBSS)及び0.05%トリプシンはMediatech(W
ashington, DC)から購入した。ウシ胎児血清(FBS)はAtlas Biologicals(Fort Collin
s, CO)から入手した。抗生物質、抗真菌薬、ゲムフィブロジル及びオールトランス型レ
チノイン酸(ATRA)はSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から入手した。
、記載されたように(24、25)混合グリア細胞培養物から単離した。簡潔に説明すると、
9日目に混合グリア細胞培養物をダルベッコ改変イーグル培地/F-12で3回洗浄し、ロータ
リーシェイカーで37℃で2時間、240rpmで振とうしてミクログリアを除去した。2日後、乏
突起膠細胞の除去のために24時間振とうを繰り返し、全ての非星状膠細胞の完全な除去を
確実にした。付着した細胞を更なる試験のために新しいプレートにまいた。
)に改変を加えて調製した。脳全体を取り出し、細胞を1200rpmで10分間の遠心分離を3回
行って洗浄し、ペレットを解離させ、ポリ-D-リシン(Sigma, St. Louis, MO)で2時間超
前処理した8-ウェルチャンバースライドに10%コンフルエンスで細胞を播種した。4分後
、非接着細胞の懸濁液を吸引し、2% B27を添加した500mlの完全Neurobasal培地(Invitr
ogen)を各ウェルに添加した。実験前に4日間細胞をインキュベートした。β-チューブリ
ン、及びGFAP又はCD11bの二重標識免疫蛍光から、ニューロンが98%超純粋であることが
明らかとなった(データは示さない)。2% B27を添加し、抗酸化剤を含まないNeurobasa
l培地(Invitrogen)中、ゲムフィブロジルで細胞を24時間刺激し、メタノール固定及び
免疫染色を行った。
ト初代星状細胞から、RNA-Easy Qiagen(Valencia, CA)キットを使用し、製造業者のプ
ロトコルに従って、全RNAを単離した。半定量的RT-PCRは、プライマーとしてのオリゴ(d
T)12-18、及び20μlの反応混合液中のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV-
RT, Invitrogen)を使用して、先に記載されているように(28)実施した。得られたcDNA
をPromega Master Mix(Madison, WI)及びマウスの遺伝子のための以下のプライマー(I
nvitrogen)を使用して適切に増幅した:
ンス、5’-CAG CTC GGC CAT ATT CAC AC-3’(配列番号2);マウスLamp2:センス、5’
-GGT GCT GGT CTT TCA GGC TTG ATT-3’(配列番号3);アンチセンス、5’-ACC ACC CA
A TCT AAG AGC AGG ACT-3’(配列番号4);マウスLimp2:センス、5’-TGT TGA AAC GG
G AGA CAT CA-3’(配列番号5);アンチセンス、5’-TGG TGA CAA CCA AAG TCG TG-3’
(配列番号6);マウスNpc1:センス、5’-GGG ATG CCC GTG CCT GCA AT-3’(配列番号
7);アンチセンス、5’-CTG GCA GCT ACA TGG CCC CG-3’(配列番号8);マウスGapd
h:センス、5’-GCA CAG TCA AGG CCG AGA AT-3’(配列番号9);アンチセンス、5’-G
CC TTC TCC ATG GTG GTG AA-3’(配列番号10)。
(Invitrogen)染色によって可視化した。グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナー
ゼ(Gapdh)mRNAをローディング対照として使用して、各サンプルから同量のcDNAが合成
されていることを確認した。
iosystems, Foster City, CA)を使用し、SYBR Select master mix(Applied Biosystems
)を用いて実施した。標的化遺伝子のmRNA発現をGapdh mRNAのレベルに正規化し、ABI Se
quence Detection System 1.6ソフトウェアによってデータを処理した。
記載すると、マウス初代星状細胞、マウスニューロンを含む8ウェルのチャンバースライ
ドを70〜80%コンフルエンスになるまで培養し、冷メタノール(Fisher Scientific, Wal
tham, MA)で一晩かけて固定し、ろ過したPBSで短時間で2回洗浄した。サンプルを、Twee
n20(Sigma)及びTritonX-100(Sigma)を含有するPBS中の2% BSA(Fisher Scientific
)で30分間ブロックし、以下の抗マウス一次抗体:TFEB (1:1000; Abcam)、GFAP、(1:100
0; DAKO)、LAMP2 (1:500, Abcam)、NeuN (1:500, Millipore)、及びMAP2 (1:200, Millip
ore)を含むPBS中で2時間、室温で振とう条件下でインキュベートした。ろ過したPBS中で1
5分間の洗浄を4回行った後、スライドを、Cy2又はCy5標識二次抗体(全て1:200;Jackson
ImmunoResearch, West Grove, PA)と共に同様の振とう条件下で更に1時間インキュベー
トした。ろ過したPBSで15分間の洗浄を4回行った後、細胞を4',6-ジアミジノ-2-フェニル
インドール(DAPI, 1:10,000; Sigma)と共に4-5分間インキュベートした。サンプルをEt
OH及びキシレン(Fisher)勾配中で流し、マウントし、Olympus BX41蛍光顕微鏡下で観察
した。
理した。異なる脳の領域から切片を作製し、新鮮凍結切片での免疫蛍光染色のために抗マ
ウスTFEB(1:500)、抗マウスLAMP2(1:200)及び抗マウスNeuN(1:500)を使用した。サ
ンプルを載せ、Olympus BX41蛍光顕微鏡(30)下で観察した。
を、血清量を減らした(2%)DMEM培地中で様々な刺激にかけ、続いて75nMのリソトラッ
カーレッド(LysoTracker Red)DND99(Invitrogen)と共に45分間インキュベートした。
次いで、細胞をろ過したPBSで完全に洗浄し、ガラススライド上に載せてBX41蛍光顕微鏡
で観察した。
実施した。簡単に説明すると、細胞を1×RIPAバッファー中でこすり取り(scraped)、Br
adford試薬を使用してタンパク質を測定し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)バッファー
を添加してNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)4-12% Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で電
気泳動し、Thermo-Pierce Fast Semi-Dry Blotterを使用してタンパク質をニトロセルロ
ース膜(Bio-Rad)上に転写した。
ブロックした。次に、以下の一次抗体:TFEB(1:1000、Abcam)、LAMP2(1:500、Abcam)
及びβ-アクチン(1:800、Abcam, Cambridge, MA)を用いて振とう条件下、4℃で一晩膜
をインキュベートした。翌日、膜をTBST中で1時間洗浄し、一次抗体に対する二次抗体(
全て1:10,000;Jackson ImmunoResearch)と共に室温で1時間インキュベートし、更に1時
間洗浄して、Odyssey(登録商標)Infrared Imaging System(Li-COR, Lincoln, NE)下で
可視化した。
されたマウスゲノムDNAをPCRの鋳型として使用した。マウスTFEB(-916/+61)遺伝子の5
’隣接配列をPCRによって単離した。プライマーは遺伝子バンクの配列から設計した。Tfe
b:センス:5’-acgcgt CCA GGA GCC AGG GAC GGG GTA CAT CTC-3’(配列番号11);
アンチセンス:5’-agatct AAG GAG AAA CTG AGT CCG GGC AGA AGG-3’(配列番号12)
。センスプライマーはMlu1制限酵素部位でタグ付けし、アンチセンスプライマーはBglII
でタグ付けした。Advantage-2 PCRキット(Clontech)を使用して、製造業者の説明書に
従ってPCRを実施した。得られた断片をゲル精製し、PGEM-TEasyベクター(Promega)中に
ライゲートした。これらの断片を、対応する制限酵素による消化及び配列決定による確認
(ACGT Inc. DNA Sequencinc Services)の後、更にPGL-3エンハンサーベクター中にサブ
クローニングした。
発は、部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, USA)を使用して行った。反対方向
の2つのプライマーを使用して、一回のPCR反応で変異したプラスミドを増幅した。変異し
たプロモーター部位に対するプライマー配列は以下の通り:変異型:センス:5’-GCA AC
A GCA AGT GCG GAT TTG AGG GGG GGG GAC GGT GGG-3’(配列番号13);アンチセンス
:5’-CCC ACC GTC CCC CCC CCT CAA ATC CGC ACT TGC TGT TGC-3’(配列番号14)。P
CR産物をエタノールで沈殿させ、次いでT4キナーゼでリン酸化した。リン酸化断片をT4 D
NAリガーゼで自己ライゲート(self-ligated)させ、制限酵素DpnIで消化して変異してい
ない鋳型を除いた。変異したプラスミドをクローニングし、大腸菌(DH5-α株)コンピテ
ント細胞中で増幅した。
フルエンスでまいた細胞に、Lipofectamine Plus(Invitrogen)を使用して、0.25μgのp
TFEB(WT)-Luc、pTFEB(Mu)-Lucを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24
時間後、無血清条件下で6時間、異なる薬剤で細胞を刺激した。先に記載されているよう
にして(33、34)、Luciferase Assay Systemキット(Promega)を使用して、細胞抽出物
中のホタルルシフェラーゼ活性をTD-20/20 Luminometer(Turner Designs)で分析した。
してChIPアッセイを実施した。簡単に記載すると、マウス初代星状細胞を10μMゲムフィ
ブロジル及び0.5μM RAで6時間刺激した後、ホルムアルデヒド(最終体積の1.42%)で固
定し、125mM グリシンでクエンチした。細胞をペレット化し、150 mM NaCl、50 mM Tris-
HCl (pH 7.5)、5 mM EDTA、NP-40 (0.5% vol/vol)、Triton X-100 (1.0% vol/vol)を含
有するIPバッファー中で溶解した。500 mlに対して、4.383 gのNaCl、25 mlの100 mM EDT
A (pH 8.0)、25 mlの1 M Tris-HCl (pH 7.5)、25 mlの10% (vol/vol) NP-40、及び以下
の阻害剤を含む50 mlの10% (vol/vol) Triton X-100を添加した:10 μg/ml ロイペプチ
ン、0.5 mM フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)、30 mM p-ニトロフェニルホスフェ
ート、10 mM NaF、0.1 mM Na3VO4、0.1 mM Na2MoO4及び10 mM β-グリセロホスフェート
。
Pバッファーに再懸濁し、超音波処理して、せん断したクロマチンを2つの画分に分けた(
一方をインプットとして使用する)。残りの画分を4℃で一晩、回転させながら5〜7μgの
抗PPARα若しくは抗RXRα抗体又は抗PGC1α若しくはRNApol若しくは正常IgG(Santa Cruz
)と共にインキュベートし、続いてProtein G-アガロース(Santa Cruz)と共に4℃で2時
間、回転させながらインキュベートした。次いでビーズを冷IPバッファーで5回洗浄し、
合計100μlの10%Chelex(10g/100ml H2O)を洗浄したprotein Gビーズに直接添加してボ
ルテックスした。10分間沸騰させた後、Chelex/protein Gビーズ懸濁液を室温まで冷まし
た。次いでプロテイナーゼK(100μg/ml)を添加し、ビーズを55℃で30分間振とうしなが
らインキュベートした後、10分間の沸騰をもう一回行った。懸濁液を遠心分離し、上清を
回収した。Chelex/protein Gビーズ画分を別の100μlの水と共にボルテックスし、再び遠
心分離して、第1及び第2の上清を合わせた。溶出液をPCRの鋳型としてそのまま使用した
。
(flanking)断片を増幅した:セット1:センス:5’-GAA CAT TCC AGG TGG AGG CA-3’
(配列番号15)、アンチセンス:5’-CCC CCA ACA CAT GCT TCT CT-3’(配列番号16
);セット2:センス:5’-GAG TCT CTC GGA GGA GGT GA-3’(配列番号17)、アンチ
センス:5’-ACT CCA GGC ATG CTT TCT CC-3’(配列番号18)。PCRは様々なサイクル
数及び異なる量の鋳型で繰り返し、結果がPCRの線形範囲内にあることを確認した。qRT-P
CRは同じプライマーとSYBR select mastermixを使用して実施した。データはインプット
及び非特異的IgGに対して正規化し、対照に対する増加倍率を算出した。
て解析し、バンドはそれぞれのβ-アクチンローディング対照に対して正規化した。デー
タは、3回の独立した実験セットからの条件毎に少なくとも25個の異なる画像についての
対照に対する平均倍率変化を示す。
計解析はスチューデントT検定で実施した。統計的有意性についての基準はp<0.05とした
。
る]
FDAで承認されている薬剤であるゲムフィブロジル等のPPAR活性化剤を、マウス脳細胞
におけるTFEBの発現をアップレギュレートすることができるかどうかを決定するために検
討した。PPARα及びRXRαが転写的に活性のある複合体を形成することが知られているた
め(21、36、37)、我々は、ゲムフィブロジル、及びRXRαを活性化するATRAの双方を使
用して、二重の処理によって何らかの相加的効果があるか否かをチェックした。マウス初
代星状細胞(MPA)を無血清培地中で単回用量のゲムフィブロジル及びATRA、及び組み合
わせでも処置した。定量的リアルタイムPCRデータから、3つの群の全てでTfebの発現の上
昇が示され、上昇は併用処理でわずかに高かった(が、個々の処理に対して統計的に有意
ではなかった)(図1A)。ゲムフィブロジル及びATRAの双方の組み合わせを使用した場合
、我々は、25μMのゲムフィブロジル及び0.5μMのATRAと比較して双方の化合物がずっと
低い用量(それぞれ10μM及び0.2μM)でTfebの同様のレベルの発現を達成することがで
きた。併用処理を用いた時点分析(time point analysis)から、Tfeb発現が早期の6時間
から24時間まで誘導できることが示された(図1D)。用量及び時間の双方についてのqRT-
PCRデータをウェスタンブロットによって評価したところ、TFEBレベルの上昇の同様のパ
ターンが示された(図1B、1C、1E&1F)。
で24時間、ゲムフィブロジル及びATRAの組み合わせで処理し、免疫細胞化学を実施した。
データから、星状細胞及びニューロンの双方におけるTFEBレベルの明らかな上昇、並びに
核内及びその周囲でのTFEBの局在が示された(図1G&1I)。TFEB免疫反応性をImageJを使
用して定量化し、TFEBの全体レベルの約4倍の上昇と、処理後の核内のTFEBの局在の約5〜
6倍の上昇を観察した(図1H及び1J)。飢餓状態及び栄養欠乏状態がTFEBの活性化に到る
ことが先に示されており、従って本試験では未処理の細胞の全てを処理時間中、同様に無
血清条件下で維持し、TFEBレベルのベースラインの変化が群間で同じであるようにした。
]
RXRαと併用したPPARαが薬剤仲介性のTFEBのアップレギュレーションに関与できると
いう仮説を、PPARα(-/-)動物由来のマウス初代星状細胞を使用し、WTマウス初代星状細
胞のRXRαをノックダウンすることによって試験した。WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)
動物から得られたMPAを上記と同様の条件下で処理し、TFEBのmRNA及びタンパク質発現に
ついてチェックした。TFEBについてのリアルタイムPCR及びウェスタンブロットの双方か
ら、TFEBがWT及びPPARβ(-/-)の星状細胞でアップレギュレートされることができたが、P
PARα(-/-)の星状細胞では同じレベルではなかった(図2A、2B&2C)。この知見は、WT及
びPPARβ(-/-)でTFEBレベルのほぼ3〜4倍の上昇が観察されたがPPARα(-/-)では観察され
なかった免疫細胞化学によって更に確認された(図2F&2G)。
いるため、我々は、PPARγがこの特定の薬剤仲介性TFEB発現に関与しているか否かをPPAR
γ阻害剤を使用して試験した。薬剤で処理する前にPPARγ特異的阻害剤での前処理を行っ
た場合のTFEBのウェスタンブロットから、ゲムフィブロジル及びATRAがTFEBのアップレギ
ュレーションのためにPPARγ仲介性の経路を利用していない可能性が示される(図2D&2E
)。PPARα及びRXRαは転写複合体を形成することが知られており、我々のデータは、ATR
Aの存在下でのTFEBのわずかな上昇を示した。我々はATRAがRXRαを介してその効果を発揮
するか否かを知りたかった。WT MPAをRXRα特異的siRNAで処理した後にゲムフィブロジル
及びATRAの組み合わせで処理し、mRNA及びタンパク質双方の分析を実施した。データから
、RXRα遺伝子のノックダウンの成功と、その結果、薬剤の効果がRXRαの不在下で部分的
に取り消されたことが示され、これはRXRαサイレンシング後のTfeb mRNAレベルから明ら
かであった(図2H&2I)。ウェスタンブロットからも、スクランブルsiRNAの処理後と比
較して、RXRαサイレンシングした細胞でTFEBレベルが有意に低い同様の結果が示された
(図2J&2K)。まとめると、これらのデータから、PPARα及びRXRαがゲムフィブロジル
及びATRAによるTFEBのアップレギュレーションに関与し得ることが示される。
PPARα及びRXRαは一緒に転写複合体を形成するため、これらの受容体はTfebをアップ
レギュレートするであろうと判断し、我々はこの受容体がTfeb発現を転写的に制御するか
否かを試験した。Tfebのプロモーター部位の分析後、我々は、Tfebの転写開始部位(TSS
)から約480bp上流にペルオキシソーム増殖因子応答エレメント(Peroxisomal Prolifera
tor Response Element、PPRE)の存在を見出した。PEROを含むTfebプロモーター(pTFEB(
WT))をpGL3エンハンサーベクター中にクローニングした。我々はまた、PPREのコア配列
を変異させ、変異したプロモーター構築物(pTFEB(Mu))もPGL3ベクター中にクローニン
グした。野生型ルシフェラーゼ構築物は、BV2細胞にトランスフェクトすると、ルシフェ
ラーゼ活性の顕著な上昇を示した(図3B)。pTFEB(WT)ルシフェラーゼ構築物を含む細胞
をPPARα-アンタゴニスト(GW6471; 250nM)、PPARβ-アンタゴニスト(GSK0660; 250nM
)、PPARγ-アンタゴニスト(GW9662; 5nM)で処理すると、PPARα-アンタゴニストで処
理した細胞では未処理の細胞と同様のルシフェラーゼ活性が観察されたが、PPARβ-又はP
PARγ-アンタゴニストで処理した細胞では観察されなかった(図3C)。
PPARβ(-/-)細胞におけるルシフェラーゼ活性の上昇が観察されたが、PPARα(-/-)では観
察されなかった(図3D)。更に、変異型PPRE部位を有する構築物(pTFEB(Mu)-Luc)をBV2
及びマウス初代星状細胞にトランスフェクトすると、変異型構築物を含む細胞でルシフェ
ラーゼ活性の劇的な低下が見出された(図3E&3F)。まとめると、これらのデータから、
ゲムフィブロジル及びレチノイン酸での処理後のTfebの誘導においてPPARαの活性化が重
要な役割を果たしていることが示される。
を調べることにした。PPARαの活性化の後、RXRα及びPGC1αが複合体を形成し、これが
多くの遺伝子の転写活性化を開始することが示されており(38〜42);我々はここでも同
様であるかを検討した。30分〜240分の様々な時点でゲムフィブロジル及びレチノイン酸
で処理したマウス初代星状細胞を、抗-PPARα、-RXRα、及び-PGC1α抗体でクロマチン断
片を免疫沈降させることによってChIP解析に供し、抗-RNA Pol及び正常IgGを対照として
用いた。半定量的PCR及び定量的RT-PCRの双方から、特定の抗体によるプルダウンでアン
プリコンの濃縮が経時的に増大することが示された(図4B&4C)。免疫沈降に次ぐ正常Ig
Gを用いたPCRではRT-PCRでほとんど検出できないバンドが示され、全断片化DNAを用いたP
CRではRT-PCRで均一なシグナルが示され、結果の均一性及び特異性が示された。リアルタ
イムPCRでは、Ct値をインプットに対する%に正規化し、更にIgGシグナルを用いて正規化
してノイズ値を超えるシグナルを得、結果の特異性を実証した。実験は同じ条件及びサイ
クルで少なくとも3回繰り返し、PCR産物の希釈はデータがPCRの線形範囲内になるように
調整した。これまでの知見の全てはPPARα及びRXRα受容体の活性化が実際にTfebの発現
を転写的に直接調節できることを示している。
TFEBはリソソーム遺伝子の発現及び生合成の主たるレギュレーターであるため(9、12
、16)、我々はTFEBのアップレギュレーションと共にリソソームマーカーの生合成の上昇
を予想した。同じ条件下で処理したMPAを、いくつかのリソソームマーカー、例えばLamp2
、Limp2及びNpc1についてmRNA解析した。予想された通り、データから、WT及びPPARβ(-/
-)細胞での処理条件下でこれらの遺伝子のレベルの上昇が示されたが、PPARα(-/-)細胞
では示されなかった(図5A)。WT及びK.O.細胞でのLAMP2についてのウェスタンブロット
解析及び免疫細胞化学からも、同様のタンパク質発現パターンが示された(図5B、5C&5D
)。LAMP2のレベルの上昇はマウス初代ニューロンでも観察された(図5E)。更に、細胞
をリソトラッカーレッドで染色すると、薬剤で処理したWT及びPPARβ(-/-)細胞の場合に
細胞あたりのリソソーム含量の増加が観察されたが、PPARα(-/-)では観察されず(図5F
)、これはTFEB及び他のリソソームマーカーについての我々の以前の知見と合致している
。これらのデータから、ゲムフィブロジル及びATRAがPPARα/RXRα経路を介してTFEB発現
を誘導することができ、これが最終的にはリソソームの生合成の増大につながることが示
唆される。
vivoでのリソソーム生合成を誘導するが、PPARα-/-マウスでは誘導しない]
フィブラート仲介性のTFEBのアップレギュレーションでPPARαの関与が確認されたため
、我々は更に、in vivoの状況で同じ結果が再現できるか否かをチェックした。同じバッ
クグラウンドのWT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスに、ベヒクルとしても使用する0.
1%メチルセルロースに溶解した7.5mg/kg体重/日のゲムフィブロジル及び0.1mg/kg体重の
ATRAを60日間経口投与した。処置の最後にマウスを犠牲にし、大脳皮質を切片化し、TFEB
の存在について免疫蛍光を実施した。ベヒクル対照と比較してPPARα(-/-)処理した動物
の皮質でTFEBレベルの顕著な上昇を観察しなかったが、WT及びPPARβ(-/-)動物で著しい
応答が観察され(図6A、6D&6G)、このin vivoの免疫組織化学データから、我々の細胞
培養での知見が認証された。
値を総面積のパーセンテージとして表した。定量的解析から、WT及びPPARβ(-/-)動物で
のTFEB陽性シグナルの有意な増大が確認されたが、PPARα(-/-)動物では確認されなかっ
た(図6B、6E&6H)。同じ動物の皮質の他の切片を、LAMP2の存在についての免疫組織化
学に供した。その結果から、WT及びPPARβ(-/-)動物におけるLAMP2免疫反応性の上昇が示
されるが、PPARα(-/-)動物では示されない(図7A、7D&7G)。定量的データからも、WT
及びPPARβ(-/-)においてLAMP2陽性シグナルが有意に増大するが、PPARα(-/-)動物では
増大しないことが示唆された(図7B、7E&7H)。
合成を誘導した]
患者の細胞で同様の結果を再現できるか否かを試験するために、我々は正常及びLINCL
罹患患者から皮膚線維芽細胞を取得し、低血清培地(reduced serum media)(2%血清)
中で同様の濃度のゲムフィブロジル及びATRAで細胞を処理した。血清の欠乏(starvation
)のために生じ得る変化を説明するために、未処理の細胞を処理時間中(24時間)同様の
血清条件下で維持した。その後、線維芽細胞をリソトラッカーレッドで染色し、ボード全
体で細胞中のリソソーム蓄積の増大の類似のパターンを観察した。正常線維芽細胞(WT#1
〜WT#3)及びCln2変異を有するLINCL患者由来の線維芽細胞(NCL#1〜NCL#5)並びにLINCL
保因者(NCL/C)の線維芽細胞で、細胞あたりのリソソームの同様の増大が示された(図
8)。画像中の細胞の数及びサイズについて正規化するために、我々は、細胞あたり単位
面積あたりのリソトラッカー陽性シグナルを算出し、対照に対する倍率を分析した(fold
over control analysis)。群あたり少なくとも25個の視野でリソトラッカー陽性シグナ
ルについて分析し、データから、疾患状態に関わらず全ての線維芽細胞で有意な上昇が示
唆されたが、細胞中のリソソームの基底レベル、及び上昇のレベルは細胞毎に異なってい
た。このデータから、処理の効果がLINCL患者の疾患状態に依存しないことが示唆される
。
リソソームは、細胞の廃棄物処理機構として機能するのみでなく、抗原提示、特定のホ
ルモンの制御、骨のリモデリング、ネクローシス細胞死、細胞表面の修復、及び発生及び
他のシグナル伝達経路等の他の生物学的プロセスにおいても重要な役割を果たす細胞内の
主要な器官の一つである(2、43〜47)。これらの様々な機能を果たすために、リソソー
ムの生合成及び活性は厳密に調節される必要がある。近年の知見によれば、TFEBはリソソ
ーム生合成の主要なレギュレーターである(9、12、15)。長年にわたり、異なるグルー
プが異なる疾患の状況でのリソソームの役割を強調してきた(48〜53)。リソソーム関連
遺伝子はグレーブス眼症に罹患している患者の眼窩脂肪体で密接に調節されていることが
報告されており、一方リソソームでのプロセシングのダウンレギュレーションによって、
PEG化リポポリプレックス(lipopolyplex)仲介型の遺伝子のトランスフェクションが改
善されている(53、54)。リソソーム生合成の増大は、必ずしも全ての疾患及び細胞型に
おいて有益であると証明されないかも知れないが、一部の場合では、オートファジー-リ
ソソーム経路の誘導が毒性廃棄物の細胞からのクリアランスのために役立ち得るであろう
(55、56)。
上してきた。Taiji Tsunemi等は、PGC1αを介して転写因子EB(TFEB)を活性化すること
によって、httのターンオーバーの上昇及びタンパク質凝集物の排除がもたらされ得るこ
とを報告した(57、58)。α-シヌクレイン毒性及びTFEBの機能障害との関係を示唆する
報告があり、PDにおける神経保護療法のための標的としてTFEBを同定している(59)。TF
EBの活性化は、ゴーシェ病における不安定化グルコセレブロシダーゼ(GC)変異型のフォ
ールディング、トラフィッキング及び活性を促進することが示されている。もう一つのLS
Dであるテイ・サックス病の場合、TFEBはβ-ヘキソサミニダーゼ変異体の活性を回復させ
ることが示されている。これらの知見では、TFEBがリソソームのタンパク質恒常性の特定
のレギュレーター、及びLSDにおける酵素のホメオスタシスを回復させるための治療標的
として記載されている(60、61)。
おける病的な貯蔵を回復させ、正常な細胞形態に回復させ得ることも報告されている(62
)。LSDとは別に、TFEBは脂質の異化及びクリアランスを誘導することが示されており、
マウスにおいて肥満及びメタボリックシンドロームを治療できている(15、16)。全体的
に見て、近年、TFEBは、その役割のために、リソソーム生合成だけでなく、その関連性の
ために疾患状態における治療標的としても、重要な転写因子の可能性を有するものとなっ
ている。TFEB活性を標的とする治療的に使用可能な化合物は多くは同定されていないが、
近年、FDAで認可された賦形剤である2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP
βCD)が、LINCLに罹患した患者の細胞におけるプロテオリピドの凝集物のTFEB仲介性の
クリアランスを促進することが示された(56)。また、別の研究において、ムコ多糖症(
MPS)のための基質削減療法(SRT)における使用のための潜在的薬剤であるゲニステイン
(5,7-ジヒドロキシ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4-オン)によって、
TFEBレベル及び活性、並びにリソソーム生合成が誘導されることが明らかになった(63)
。
れている(14〜16、55、64、65)。TFEBと脂質代謝との相互作用の可能性から、我々は、
脂質代謝における2つの重要な因子であるPPARα及びRXRαの潜在的活性化剤であるゲムフ
ィブロジル及びATRAの役割を調べることにした。「Lopid」として販売されているゲムフ
ィブロジルは、脂質異常症に対して処方されるFDA認可された薬剤である(17、19)が、
複数の有益な効果を有することが示されている(22)。ゲムフィブロジルが血液脳関門(
BBB)を通過できる能力は既に報告されている(20)。我々は以前、ATRAと組み合わせた
ゲムフィブロジルが脳細胞におけるCln2遺伝子のレベルを誘導できることを報告した(66
)。我々は更に、リソソーム生合成の主要なレギュレーターであるTFEBが、薬剤によって
影響を受け得るか否かを見るために検討した。我々のデータから、ゲムフィブロジルが、
単独若しくはATRAと組み合わせて脳細胞におけるTFEBの発現を効果的に誘導できたことが
示される。
αは、様々な調節性経路において重要な役割を果たしていることが示されている(67〜71
)。特定の多価不飽和脂肪酸及び酸化型誘導体、及びフェノフィブラート及びゲムフィブ
ロジルを含むフィブラートファミリーの脂質修飾薬が、PPARαを活性化することが知られ
ている。フィブラート薬はサイトゾル中でPPARαを隔離するHSP90リプレッサー複合体を
置き換え、PPARαの転写活性の回復に役立つ(21)。従って、我々は、この現象における
受容体のPPAR群の役割を評価した。我々のデータから、ゲムフィブロジルによるTFEBのア
ップレギュレーションのプロセスにおいて、PPARαが関与しているが、PPARβ及びPPARγ
は関与しないことが明確に示される。このin vitroの研究は、PPARα及びPPARβのノック
アウトマウスを使用したin vivoの研究によって更に検証された。我々のin vivoの結果も
細胞培養のデータを支持するものであった。
ター領域の分析を行った。マウスTfebプロモーターにPERO部位並びにRXR結合部位が見出
された。以前の研究によれば、PPAR/RXRヘテロ二量体はDNA結合活性を示した(70)。ま
た、PPAR/RXRヘテロ二量体は、その産物が脂質のホメオスタシス、細胞増殖、及び分化に
関与する遺伝子の転写を調節する(69、72)。Tfebアップレギュレーションの経路はPPAR
及びRXR双方の共同的な作用を必要とすることが観察された。更に、ゲムフィブロジル及
びRA双方の効果は、RXRα又はPPARαのいずれかの不在下では取り消された。Tfebプロモ
ーター上のPEROのWT及び変異型ルシフェラーゼ構築物を使用したルシフェラーゼアッセイ
の結果から、WT構築物で刺激後にTfebプロモーター依存性の活性の増大が示された。しか
しながら、pTFEB(WT)-Luc構築物でトランスフェクトされたPPARα(-/-)細胞、及びpTFEB(
Mu)-Luc構築物でトランスフェクトされたWT細胞は、ルシフェラーゼ活性の有意な上昇を
示さなかった。最後に、ChIPデータから、PGC1α及びRNA Polと共にPPARα及びRXRαのTF
EBプロモーターのPERO部位上へのリクルートメントが示された。実験データは、知見の特
異性を確実にするために、適切な対照を組み込んで厳密に解析された。
のアゴニストであるATRAとが、PPARα/RXRαヘテロ二量体を介して脳細胞におけるTFEBを
一緒にアップレギュレートする独特なメカニズムを説明する。ある研究ではPPARγ-ヌル
のトロホブラスト幹(TS)細胞が分化4日目に低レベルのTFEBを有すると報告されている
が、脳細胞における強力な公知のPPARγアンタゴニストであるGW9662を用いた研究ではPP
ARγの実質的な関与は明らかにされなかった(73)。これは細胞型の違い、すなわち分化
しているTS細胞と成熟した初代脳星状細胞/ニューロンの違い、又はPPARαの活性化のた
めのポテンシャルのレベルの相違によるものである可能性がある。Settembre等によるあ
る包括的な研究によれば、著者等は、PPARα及びPGC1αが飢餓によって誘導されるストレ
ス下でTFEBの標的であること、及び飢餓ストレスの場合にTFEBが自己制御されていること
を報告しているが、Tsunemi等による別の研究ではハンチントン病の状況下でTFEBの上流
にPGC1αが置かれている。TFEBが、いずれも脂質代謝の調節において非常に重要な役割を
有するPPARα及びPGC1αを介して脂質代謝を調節する可能性が十分ある。しかしながら、
一方で本出願のデータは、PPARαの直接的な刺激がPPARα-RXRα-PGC1α複合体のTFEBプ
ロモーター上へのリクルートメントを誘導し、それによってリソソーム生合成に影響し得
ることを示している。
による活性化もTFEBを調節することができ、これが次にPPARα又は脂質代謝に関わる他の
遺伝子の発現を制御し得ることを示唆する。しかしながら、そのようなフィードフォワー
ド制御メカニズムの存在、及び脂質代謝とリソソーム生合成との見かけ上の二方向性の相
互作用を解釈するためには、より詳細な研究が必要とされる。
性化を介して脳細胞中のリソソーム生合成をアップレギュレートすることができるという
新規な仮説を試験した。特定の疾患状況においてTFEBが果たす重要な役割を考慮すると、
治療標的としてのTFEBの同定に関心が高まりつつある。本研究の結果は、PPARαの未知の
性質を明らかにし、LSDに対する新たな治療選択肢を記載し、TFEBのより劇的な調節を明
らかにし、脂質代謝経路とリソソーム生合成との関係の理解に対する関心を高める。
プレギュレーション]
図9は、コレステロール低下剤(シムバスタチン及びプラバスタチン)、アスピリン(
鎮痛剤及び解熱剤)、ケイ皮酸(桂皮代謝産物)、及び尿素サイクル異常症のための薬剤
(フェニル酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウム)によるマウス星状細胞におけるTFEB
mRNA発現のアップレギュレーションを示す。マウス初代星状細胞を様々な濃度(図9参
照)のシムバスタチン及びプラバスタチン(A)、(B)、ケイ皮酸(C)、及びフェニル酪酸ナ
トリウム及び安息香酸ナトリウム(D)と共に無血清条件下で5時間インキュベートした後、
半定量的RT-PCRでTFEBのmRNA発現をモニタリングした。フェニル酪酸ナトリウム及び安息
香酸ナトリウムの陰性対照としてギ酸ナトリウム(D)を使用した。
世界で最も広く使用されている薬剤の一つであるアスピリンがマウスの脳細胞における
リソソーム生合成をアップレギュレートできるか否かを検討した。星状細胞を、無血清培
地中で様々な用量のアスピリンで処理した後、リソトラッカー(lyso-tracker)染色を行
った。リソトラッカー染色の増大から明らかなように、アスピリンは2及び5μMの用量で
星状細胞におけるリソソーム生合成を顕著に増大させた(図10)。しかしながら、10μM
の用量では、アスピリンはリソソーム生合成の増大においてそれ程強力ではなかった(図
10)。
LAMP2は、新しいリソソームの形成において鍵となる役割を果たす重要なリソソーム膜
タンパク質である。我々は、星状細胞においてアスピリンによるLAMP2 mRNA(図11A)及
びタンパク質(図11C)発現の経時的な増大を観察した。用量依存性試験からも、2及び5
μMの用量のアスピリンでLAMP2タンパク質発現の上昇が示された(図11B)。アスピリン
によるLAMP2の上昇は、免疫染色によって更に確認された(図11D)。
ギュレートさせる]
トリペプチジルペプチダーゼ1(TPP1)は、このタンパク質の活性が遅発型小児性バッ
テン病において欠損しているため、この疾患における標的分子である。我々は、アスピリ
ンが星状細胞においてTPP1をアップレギュレートさせることができるか否かを検討した。
用量依存性試験から、低用量のアスピリン(2及び5μM)でTPP1タンパク質の増大が示さ
れた(図12A)。5μMのアスピリンに応答したTPP1タンパク質の増大は2時間で早くも明ら
かであり、12時間のインキュベーションで最大となった(図12B)。今回も、我々は2及び
5μMのアスピリンでTPP1活性の上昇を観察したが、10μMでは観察されなかった(図12C)
。
トする]
近年の知見によれば、TFEBはリソソーム生合成の主要なレギュレーターである(9、12
、15)。長年にわたり、異なるグループが異なる疾患の状況でのリソソームの役割を強調
してきた(48、49、52、53)。リソソーム関連遺伝子はグレーブス眼症に罹患している患
者の眼窩脂肪体で密接に調節されていることが報告されており、一方リソソームでのプロ
セシングのダウンレギュレーションによって、PEG化リポポリプレックス仲介型の遺伝子
のトランスフェクションが改善される(53、54)。リソソーム生合成の増大は、必ずしも
全ての疾患及び細胞型において有益であると証明されないかも知れないが、一部の場合で
は、オートファジー-リソソーム経路の誘導が毒性廃棄物の細胞からのクリアランスのた
めに役立ち得るであろう(55、56)。過去数年間にわたり、TFEBはいくつかのリソソーム
関連疾患の潜在的治療標的として浮上してきた。Tsunemi等によれば(57)、PGC1αを介
して転写因子EB(TFEB)を活性化することによって、httのターンオーバーの上昇及びタ
ンパク質凝集物の排除がもたらされ得る。α-シヌクレイン毒性及びTFEBの機能障害との
関係を示唆し、PDにおける神経保護療法のための標的としてTFEBを同定する報告がある(
59)。TFEBの活性化は、ゴーシェ病における不安定化グルコセレブロシダーゼ(GC)変異
型のフォールディング、トラフィッキング及び活性を促進することも示されている。もう
一つのLSDであるテイ・サックス病の場合、TFEBはβ-ヘキソサミニダーゼ変異体の活性を
回復させることが示されている。これらの知見では、TFEBがリソソームのタンパク質恒常
性の特定のレギュレーター、及びLSDにおける酵素のホメオスタシスを回復させるための
治療標的として記載されている(60、61)。
かを検討した。用量依存性の研究から、アスピリンが2及び5μMの用量でTFEBのタンパク
質レベルを増大させることができることが示された(図13A)。免疫蛍光分析によって
、アスピリンによるTFEBのアップレギュレーションを更に確認した(図13B)。我々は
又、TfebプロモーターをpGL3エンハンサーベクター中にクローニングし、Tfebプロモータ
ーによって駆動されるレポーター活性を調べた。興味深いことに、アスピリンは星状細胞
においてTfebプロモーターで駆動されるルシフェラーゼ活性を誘導し(図13C)、アス
ピリンがTfeb遺伝子の転写を増大させることが示唆された。
近年、我々は、PPARαがTfebの転写において重要な役割を果たしていることを発見した
。従って、我々はここで、アスピリンが星状細胞においてPPARαの活性化を誘導できるか
否かを検討した。まず、我々はPPARαのDNA結合活性をモニタリングするために、電気泳
動移動度シフトアッセイ(EMSA)を用い、アスピリンによるPPARα活性化の経時的上昇を
見出した(図14A)。これらの結果を確認するために、我々はWT、PPARα(-/-)及びPPARβ
(-/-)マウスから星状細胞を単離し、PPARの転写活性をモニタリングした。興味深いこと
に、アスピリンはWT及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞におけるPPRE-駆動性
ルシフェラーゼ活性を上昇させたが、PPARα(-/-)マウスでは上昇させず(図14B)、アス
ピリンはPPARαの活性化を誘導することができるが、PPARβの活性化は誘導することがで
きないことが示唆された。
ギュレートする]
WT、PPARα(-/-)及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞を5μMのアスピリンで
処理し、続いてTFEBの免疫蛍光分析を行った。図15は、アスピリンが、WT及びPPARβ(-/-
)マウスから単離された星状細胞におけるTFEBの発現を誘導したが、PPARα(-/-)マウスで
は誘導しなかったことを示す。これらの結果から、アスピリンが星状細胞においてTFEBを
増大させるためにはPPARαを必要とするが、PPARβは必要としないことが示される。
合成を増大させる]
TFEBはリソソーム遺伝子の発現及び生合成の主たるレギュレーターであるため(9, 12,
16)、我々はリソソーム生合成に対するアスピリンの効果を検討した。WT、PPARα(-/-)
及びPPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞を異なる用量のアスピリンで処置した後
、LAMP2のレベルをモニタリングした。図16A-Bから明らかなように、アスピリンはWT及び
PPARβ(-/-)マウスから単離された星状細胞におけるLAMP2のレベルを用量依存的に上昇さ
せたが、PPARα(-/-)マウスでは上昇させなかった。我々はまた、リソトラッカー染色に
よってリソソームの状態を検討した。LAMP2の結果と同様に、アスピリンはWT及びPPARβ(
-/-)マウスから単離された星状細胞におけるリソソーム生合成を増大させたが、PPARα(-
/-)マウスでは増大させなかった(図17)。
リソソーム蓄積症のための他の利用可能な治療法と比較してアスピリンにはいくつかの
利点がある。一方で、アスピリンは世界中で数十年間鎮痛剤として広く使用されてきた。
他方では、アスピリンは、最も痛みの少ない経路である経口によって服用することができ
る。アスピリンは高用量ではいくつかの毒性作用(胃潰瘍、胃内出血、及び耳鳴り等)を
示すことが報告されているが(74)、我々の研究では、アスピリンは低用量(2及び5μM
)でリソソーム生合成を促進しており、低用量ではアスピリンは毒性を有さない可能性が
ある。しかしながら、アスピリンが低用量においても何らかの毒性作用(例えば胃潰瘍)
を示す場合には、その副作用を低減する方法が存在する。例えば、経口的使用のために、
かつ胃での分解を回避するために、腸溶性被覆したアスピリンが利用可能である。ランダ
ム化非盲検(open)試験において、徐放性製剤中の低用量のアスピリンが顕著な副作用の
ない抗血小板薬として効果を示している(75)。ある研究(76)では体内で天然に形成さ
れるアミノ酸であるS-アデノシル-メチオニン(SAM)を使用しており、高用量のアスピリ
ン(1300mg)と共に500mg SAMの用量を投与して、胃の損傷を90%低減させることが見出
されている。
EBのアップレギュレーションを介して星状細胞におけるリソソーム生合成を増大させるこ
とを実証した。これらの結果は、この薬剤が遅発型小児性バッテン病及び他のLSDにおけ
る治療的介入のための主たる治療又は補助的治療として使用できることを強調する。
本発明をその具体的な例示的実施形態を参照して記載及び説明したが、本発明がこれら
の例示的実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者であれば、添付する
請求の範囲によって規定される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく変更及び改変
が可能であることを認識するであろう。従って、そのような変更及び改変の全てが添付す
る請求の範囲及びその等価物の範囲内に含まれるように本発明に含まれることが意図され
る。
Claims (26)
- リソソーム蓄積症の治療のための方法であって、転写因子EBのアップレギュレーション
を仲介する薬剤を含有する組成物の治療的有効量を、そのような治療を必要とする被験体
に投与することを含む、上記方法。 - 薬剤がスタチンである、請求項1記載の方法。
- スタチンがアトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラ
バスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン、及びこれらの組合せからなる群より選択
される、請求項2記載の方法。 - 薬剤が、鎮痛剤、解熱剤、アスピリン、桂皮(cinnamon)代謝産物、桂皮酸、フェニル
酪酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項1記載の方法
。 - 薬剤が脂質低下剤である、請求項1記載の方法。
- 脂質低下剤がフィブラートである、請求項5記載の方法。
- フィブラートがゲムフィブロジル又はフェノフィブラートである、請求項6記載の方法
。 - 組成物が更に治療的有効量のオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAを含有する
、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。 - 組成物がフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAを含有する、
請求項8記載の方法。 - 組成物がフィブラート及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAの相乗的組合
せを含有する、請求項9記載の方法。 - リソソーム蓄積症が、神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン
病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多系統萎縮症(MSA)等のパーキンソン様疾患を含むパ
ーキンソン病、進行性核上性麻痺(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)及びレビー小体
型認知症(DLB)からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項1〜10のいず
れか1項記載の方法。 - リソソーム蓄積症がオートファジー経路の障害であり、薬剤がリソソームの生合成を増
大させる、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。 - リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシ
ェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症(Aspartylgluc
osaminuria)、コレステロールエステル蓄積症(Cholesteryl ester storage disease)
、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバー病、フコシドー
シス、及びガラクトシアリドーシスからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれ
か1項記載の方法。 - 転写因子EBが、転写因子EB mRNAレベルの上昇、転写因子EBタンパク質レベルの上昇、
又はPPARa-RXRaヘテロ二量体の活性化によってアップレギュレートされる、請求項1〜1
0のいずれか1項記載の方法。 - リソソーム蓄積症の治療のための方法であって、治療的有効量の薬剤を含有する組成物
をそのような治療を必要とする被験体に投与することを含み、薬剤が転写因子EB活性を回
復させるものである、上記方法。 - 薬剤がフィブラートである、請求項15記載の方法。
- フィブラートがゲムフィブロジル又はフェノフィブラートである、請求項16記載の方
法。 - フィブラートをオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAと組み合わせて投与する
場合にフィブラートの治療的有効量がより低い、請求項16記載の方法。 - リソソーム蓄積症の治療のための方法であって、遺伝子のアップレギュレートを仲介す
る薬剤の治療的有効量を含有する組成物を、そのような治療を必要とする被験体に投与す
ることを含み、遺伝子がTfeb遺伝子である、上記方法。 - リソソーム蓄積症が、神経セロイドリポフスチン症、アルツハイマー病、ハンチントン
病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多系統萎縮症(MSA)等のパーキンソン様疾患を含むパ
ーキンソン病、進行性核上性麻痺(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)及びレビー小体
型認知症(DLB)からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項19記載の方法
。 - スタチン及びオールトランス型レチノイン酸又はビタミンAを含有する医薬の組合せ。
- 製薬上許容される担体を更に含有する、請求項21記載の医薬の組合せ。
- 医薬の組合せが相乗的な医薬の組合せである、請求項21記載の医薬の組合せ。
- 薬剤がアスピリンである、請求項4記載の方法。
- リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシ
ェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロー
ルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバ
ー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、及び遅発型小児性バッテン病及び若年
性バッテン病を含むバッテン病からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか1
項記載の方法。 - リソソーム蓄積症が、テイ・サックス病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ゴーシ
ェ病、ハンター症候群、αマンノース症、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロー
ルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症、シスチン症、ダノン病、ファーバ
ー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、及び遅発型小児性バッテン病及び若年
性バッテン病を含むバッテン病からなる群より選択される、請求項15〜18のいずれか
1項記載の方法。
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