ES2913136T3

ES2913136T3 - Gen de fertilidad y usos del mismo

Info

Publication number: ES2913136T3
Application number: ES13853669T
Authority: ES
Inventors: Xiaoyan Tang; Zhufeng Chen; Gang Xie; Na Wang; Jiawei Lu; Zaoxia Li
Original assignee: HUNAN WANGHUA AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY CO Ltd; SHENZHEN XINGWANG BIOSEED CO Ltd; XINGWANG INVEST CO Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Current assignee: HUNAN WANGHUA AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY CO Ltd; SHENZHEN XINGWANG BIOSEED CO Ltd; XINGWANG INVEST CO Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2033-11-07
Also published as: CN105746362B; US20180187208A1; CN107630031A; EP2918681A1; CN104053778A; US9938538B2; EP2918681B1; CN105755009A; CN107630031B; CN105746362A; CN105669848A; CN105602952A; WO2014071849A1; US10619168B2; CN105567732A; CN105585622A; US20180187209A1; CN105602952B; US10612040B2; EP2918681A4

Abstract

Un ADN, que tiene una función de conducir a esterilidad masculina en arroz, caracterizado por que el ADN tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen de fertilidad y usos del mismo

Campo

La presente divulgación se refiere al campo de la biotecnología, en particular a métodos para híbridos de plantas, incluyendo la preparación de una línea estéril y la producción de semillas híbridas, más particularmente a un gen de fertilidad FL2 y su mutante, y a su uso en mejoramiento genético híbrido.

Antecedentes

El mejoramiento genético híbrido es una forma eficaz de mejorar la producción de los cultivos. En comparación con las plantas convencionales, los híbridos a menudo presentan heterosis y, habitualmente, tienen un rendimiento significativamente aumentado, mejor resistencia y mayor adaptabilidad. Además, el mejoramiento genético híbrido es menos lento y tiene un ciclo de mejoramiento genético más corto que el mejoramiento genético convencional. Por lo tanto, el mejoramiento genético híbrido se ha convertido en un enfoque importante en el mejoramiento genético de muchos cultivos.

Una línea estéril masculina eficaz es el factor clave en el mejoramiento genético híbrido. La línea masculina estéril, que no puede producir gametos masculinos eficaces, se utiliza como línea materna a polinizar por una línea paterna. Durante la selección y generación de líneas estériles masculinas deben considerase los siguientes factores:

1. El vigor híbrido con otras líneas: la línea estéril masculina puede cruzarse con otras líneas fértiles masculinas para producir híbridos con una mejor combinación de rasgos;

2. La reproducción de la línea estéril masculina: la línea estéril puede restablecer la fertilidad para automantenerse en determinadas condiciones;

3. La eficacia de la reproducción y la producción de semillas híbridas utilizando la línea estéril masculina: una buena línea estéril debe ser fácil de cruzar y conducir a una producción eficaz de semillas híbridas.

La esterilidad masculina puede ser citoplasmática o nuclear. El mejoramiento genético actual del arroz híbrido utiliza la combinación de ambos tipos de esterilidad masculina. La esterilidad masculina citoplasmática (CMS, forma siglada del inglés cytoplasmic male sterility) está provocada por mutaciones en genes extranucleares y presenta herencia materna. La manifestación de esterilidad masculina en líneas con CMS puede controlarse mediante la interacción entre factores citoplasmáticos y nucleares. El método de tres líneas extensamente utilizado en el cultivo de arroz híbrido implica una línea estéril masculina, una línea de restablecimiento y una línea de mantenimiento. El método de tres líneas precisa líneas de restablecimiento específicas, que se generan a través de un proceso complejo y limitan en gran medida la utilización de la heterosis entre distintas variedades. Por el contrario, el método de dos líneas utiliza una línea estéril masculina, en que la esterilidad está controlada por un gen nuclear y la fertilidad puede restablecerse en condiciones de cultivo específicas y, por lo tanto, combina la línea de restablecimiento y la línea de mantenimiento en una sola línea. En comparación con el método de tres líneas, el método de dos líneas ha simplificado enormemente el proceso de producción de semillas híbridas al eliminar la demanda de líneas de mantenimiento, y ha expandido significativamente el uso de la esterilidad masculina en el mejoramiento genético híbrido. Sin embargo, también existen limitaciones en la utilización del método de mejoramiento genético híbrido de dos líneas. La línea estéril masculina necesita cambiar la fertilidad entre ACTIVADA (ON en inglés) e INACTIVADA (OFF en inglés) en distintas condiciones. Tiene que permanecer con esterilidad masculina para la producción de semillas híbridas, pero ser fértil para autopropagarse. Las líneas estériles masculinas ampliamente utilizadas en el método de dos líneas son en su mayoría estériles fototermosensibles (PTGMS, forma siglada de photo-thermo-sensitive sterile), y su fertilidad está influenciada por la temperatura y la luz. Por lo tanto, la inestabilidad del entorno puede ocasionar inestabilidad de la fertilidad de las líneas estériles, lo que conduce a mejoramiento genético espontáneo y a la reducción de la pureza de la semilla híbrida, aumentando de este modo el riesgo de producción de semillas. Adicionalmente, la metodología utilizada para la selección y generación de líneas estériles para el método de dos líneas es muy limitada. Por ejemplo, casi no hay líneas estériles masculinas adecuadas para el método de dos líneas en arroz tipo japonica, lo que restringe un uso extendido de recursos de variedades de arroz.

Para eludir los problemas existentes en los métodos actuales de mejoramiento genético de arroz híbrido, tales como la estabilidad de la línea estéril, la limitación de recursos de variedades híbridas, la complejidad en la producción de semillas y el alto costo de la producción de semillas, etc., una nueva técnica de mejoramiento genético híbrido que puede utilizar enteramente la esterilidad masculina controlada por genes nucleares recesivos para construir líneas estériles estables que no se ven afectadas por los cambios ambientales para eliminar el riesgo potencial de producción de semillas. Por otra parte, el gen de esterilidad nuclear recesivo es adecuado, para la gran mayoría de las variedades de cultivos, para mejorar la utilización de la heterosis. Las realizaciones de la presente divulgación proporcionan un gen que regula la fertilidad vegetal, cuya mutación da como resultado esterilidad masculina, y la esterilidad es estable y no está influenciada por el entorno, y puede revertirse mediante la introducción del gen de tipo silvestre en las plantas. El gen y la línea estéril generada por la mutación del gen proporcionan los componentes necesarios para un nuevo sistema de mejoramiento genético híbrido.

Sumario

La presente divulgación proporciona un ADN, que tiene una función de regulación de la fertilidad vegetal que conduce a esterilidad masculina en el arroz, y el ADN tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.

El ADN mencionado anteriormente puede codificar una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

La presente divulgación también proporciona un casete de expresión que comprende el ADN mencionado anteriormente.

La presente divulgación también proporciona un vector de expresión que comprende el casete mencionado anteriormente.

La presente divulgación también proporciona una bacteria genomanipulada que comprende el vector de expresión mencionado anteriormente.

La presente divulgación también proporciona el uso de un gen en la regulación de la fertilidad vegetal para obtener esterilidad de mutantes masculinos en arroz, y el gen que regula la fertilidad vegetal comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.

Además, se divulga un método de referencia para obtener un material estéril masculino a través de la mutación del gen que regula la fertilidad vegetal de la SEQ ID NO: 1, 5, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 21, 22 o 27.

El término "mutación" utilizado en el presente documento comprende la sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos en el ADN del gen que regula la fertilidad vegetal.

La presente divulgación también proporciona un método para la recuperación de la fertilidad en material estéril masculino de arroz introduciendo el ADN de la SEQ ID NO: 1, 5 o 27 mediante transformación en el material estéril masculino que tiene el ADN mencionado anteriormente.

Un aspecto de referencia de la presente divulgación también describe el uso de un material mutante obtenido por una mutación de una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 1, 5, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 21, 22 o 27. La "mutación" mencionada anteriormente puede ser una mutación puntual, deleción de ADN, mutación de inserción o silenciamiento génico mediante ARNi o mutagénesis dirigida al sitio.

Los aspectos de referencia de la presente divulgación describen un método para utilizar el material y las secuencias de ADN mencionadas anteriormente en mejoramiento genético, que comprende, en particular, cruzar una planta estéril masculina como un progenitor femenino a cruzar con una línea de restablecimiento para producir una semilla híbrida. Un aspecto de referencia de la presente divulgación también describe un promotor que tiene una característica de expresión específica en la antera, que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o 9. La presente divulgación también incluye un casete de expresión que comprende el ADN mencionado anteriormente, un vector de expresión que contiene el casete de expresión descrito y/o una bacteria genomanipulada que contiene el vector de expresión descrito.

Un aspecto de referencia de la presente divulgación también describe un método de expresión de una secuencia polinucleotídica diana en una planta, que comprende:

introducir una construcción de ADN en la planta, y

la construcción de ADN comprende:

un promotor que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o 9; y

la secuencia de nucleótidos diana unida operativamente al promotor.

La expresión de la "secuencia de nucleótidos diana" utilizada en el presente documento puede ser un gen estructural, un gen de regulación, una secuencia antisentido del gen estructural, una secuencia antisentido del gen de regulación o microARN que interfiere con la expresión de un gen endógeno, que se expresa específicamente al final del desarrollo del polen y regula la fertilidad y la germinación del polen.

Un aspecto de referencia de la presente divulgación también describe el uso de la secuencia de ADN descrita anteriormente o el promotor en uno cualquiera de (a) a (d):

(a) mejoramiento genético de variedades o cepas vegetales;

(b) mejoramiento genético de variedades o cepas vegetales para mejorar la fertilidad;

(c) mejoramiento genético de variedades o cepas vegetales para reducir la fertilidad;

(d) mejoramiento genético de variedades o cepas vegetales masculina estériles.

Un aspecto de referencia de la presente divulgación también describe un método de mantenimiento de una planta masculina estéril en un estado recesivo homocigótico, que comprende:

(a) proporcionar que la primera planta sea estéril masculina y sea homocigótica para el alelo recesivo del gen FL2; (b) generar que la segunda planta sea homocigótica para el alelo recesivo del gen FL2 y sea hemicigótica para una construcción introduciendo en la primera planta la construcción, y comprendiendo la construcción:

i) la primera secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de nucleótidos de FL2 para recuperar la fertilidad masculina de la primera planta cuando se expresa en la primera planta;

ii) la segunda secuencia de nucleótidos para inhibir la formación o función de un gameto de fertilidad masculina cuando se expresa en la segunda planta, siendo la segunda secuencia de nucleótidos un gen de inactivación de polen ZM-PA; y

(c) fertilizar la primera planta con el gameto masculino de la segunda planta para mantener una descendencia de la primera planta en un estado homocigótico.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1- La morfología de las espiguillas de Huanghuazhan con OsFL2 mutante u OsFL2 de tipo silvestre.

Fig. 2- Representa la morfología de las anteras de Huanghuazhan con OsFL2 mutante u OsFL2 de tipo silvestre. Fig. 3- Representa el análisis de tinción con colorante de polen de Huanghuazhan con OsFL2 mutante u OsFL2 de tipo silvestre.

Fig. 4- Representa la comparación morfológica de órganos femeninos de Huanghuazhan con OsFL2 mutante y OsFL2 de tipo silvestre.

Fig. 5- Representa el estigma expuesto de la planta mutante y una flecha indica el estigma expuesto.

Fig. 6- Alineamiento de secuencias relacionadas del ADNc de OsFL2, incluyendo OsFL2 de tipo silvestre de Huanghuazhan, el ADNc de OsFL2 mutante de Huanghuazhan y el ADNc de OsFL2 de tipo silvestre de Nipponbare. HHZ representa la secuencia de OsFL2 de tipo silvestre de Huanghuazhan, Mutante representa la secuencia de OsFL2 mutante de Huanghuazhan, Nip representa la secuencia de OsFL2 de tipo silvestre de Nipponbare.

Fig.7- Alineamiento de secuencias proteicas relacionadas con OsFL2, incluyendo OsFL2 de guanghuazhan de tipo silvestre, OsFL2 mutante de Huanghuazhan y OsFL2 de tipo silvestre de Nipponbare. HHZ representa la secuencia proteica de OsFL2 de tipo silvestre de Huanghuazhan, Mutante representa la secuencia proteica de OsFL2 mutante de Huanghuazhan, Nip representa la secuencia proteica de OsFL2 de tipo silvestre de Nipponbare.

Fig. 8- Análisis del nivel de expresión de OsFL2 en distintos tejidos y órganos de arroz.

Fig. 9- Vector de expresión del promotor del gen OsFL2.

Fig. 10- Representa el promotor del gen OsFL2 que activa el gen de GUS para la expresión de forma específica en la antera de arroz.

Fig. 11- Representa el vector de complementación transgénica del mutante estéril masculino de arroz (OsFL2). Fig. 12- Representa el vector de interferencia por ARN del gen OsFL2.

Fig. 13- Representa la expresión del gen OsFL2 en anteras de panojas jóvenes de plantas transgénicas con el vector de interferencia por ARN, y 1-10 representan plantas transgénicas, 11 representa una planta de tipo silvestre.

Fig. 14- Alineamiento de secuencias proteicas codificadas por el gen OsFL2 y sus genes homólogos de cebada, sorgo, mijo, Brachypodium distachyon y maíz, respectivamente.

La Fig. 15 representa el vector pZN3.

La Fig. 16 muestra granos de polen fértiles y granos de polen estériles después de la tinción con colorante. La Fig. 17 representa el análisis de la relación de segregación por fluorescencia de semillas recogidas de plantas transgénicas, y la relación de segregación de las semillas es de 1:1.

Descripción detallada

A menos que se defina específicamente de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. A menos que se definan de otra manera, las técnicas utilizadas o citadas en la presente divulgación son técnicas convencionales muy conocidas por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.

Los materiales, métodos y realizaciones descritos en el presente documento son explicativos, y solo ilustrativos, lo que no debe interpretarse como una limitación del alcance de la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona un gen de fertilidad, una secuencia de nucleótidos, una secuencia proteica del mismo, y el uso del gen de fertilidad en la regulación de la fertilidad masculina vegetal, como se define adicionalmente en las reivindicaciones. A modo de ejemplos no limitantes, puede utilizarse cualquier método descrito a continuación junto con la secuencia de nucleótidos correspondiente de la presente divulgación, por ejemplo, puede utilizarse cualquier método seleccionado de los siguientes: introducción de la secuencia mutante del gen de fertilidad en una planta para obtener esterilidad masculina de la planta, mutación de una secuencia endógena de la planta, introducción de una secuencia antisentido del gen de fertilidad en la planta, utilizando una forma de horquilla, ligar la secuencia de nucleótidos correspondiente con otra secuencia de nucleótidos para regular un fenotipo de la planta, o cualquier método para influir en la fertilidad masculina de las plantas conocido por los expertos en la materia.

El gen de fertilidad FL2 proporcionado en el presente documento es un gen implicado en el desarrollo del polen. El gen de fertilidad FL2 se ubica en el cromosoma 10 del arroz. El gen de fertilidad FL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 4 o 27 en Oryza sativa ssp. indica, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID NO: 2. El gen de fertilidad FL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 en Oryza japónica, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la ID SEQ ID NO: 6. El gen de fertilidad FL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10 u 11 en la cebada, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID NO: 12. El gen de fertilidad FL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o 14 en el sorgo, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID NO: 15. El gen de fertilidad ZmFL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o 14 en el maíz, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID SEQ ID NO: 15. El gen de fertilidad ZmFL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16 o 17 en el maíz, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID SEQ ID NO: 18. El gen de fertilidad FL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19 en el mijo, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID NO: 20. El gen de fertilidad FL2 tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 21 o 22 en Brachypodium distachyon, y la secuencia de aminoácidos correspondiente es la SEQ ID NO: 23.

Un aspecto de referencia de la presente divulgación también describe las siguientes secuencias: a) una secuencia de ADN con al menos el 90 % (preferentemente al menos el 95 %) de similitud de secuencia del gen FL2 descrito anteriormente y una función homóloga, b) una secuencia de ADN que puede hibridar con la secuencia de ADN de a) en condiciones rigurosas; c) una secuencia de ADN complementaria a una cualquiera de las secuencias de ADN descritas anteriormente en a)-b).

El gen de fertilidad descrito anteriormente puede aislarse de diversas plantas. Como sabe el experto en la materia, el gen de fertilidad descrito en el presente documento comprende secuencias funcionalmente equivalentes que son altamente homólogas al gen FL2 y regulan la fertilidad del mismo modo. Las secuencias altamente homólogas y funcionalmente equivalentes incluyen secuencias de ADN que pueden hibridar con el gen FL2 de la presente divulgación en condiciones rigurosas. "Una condición rigurosa" utilizada en la presente divulgación es comúnmente conocida por un experto en la materia y puede comprender: hibridación en una solución de hibridación que consiste en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM (pH 6,4) y EDTA 1 mM a 60 °C durante 12-16 h, luego se lava con la solución de ^{lavado que consiste en SDS al 0,1 % y}sSC ^{0,13 a 65 °C durante 15-60 min.}

La secuencia funcionalmente equivalente también incluye una secuencia de ADN que regula la fertilidad de la planta en al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de similitud de secuencia del gen FL2 en la presente divulgación, que puede aislarse de cualquier planta. El porcentaje de similitud de secuencia puede obtenerse mediante algoritmos bioinformáticos comúnmente conocidos por un experto en la materia, incluyendo el algoritmo de Myers y Miller (Bioinformatics, 4(1): 11-17, 1988), el método de alineamiento global de Needleman-Wunsch (J.Mol.Biol., 48(3): 443-53, 1970), el método de alineamiento local de Smith-Waterman (J.Mol.Biol., 147: 195-197, 1981), el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (PNAS, 85(8): 2444-2448, 1988), el algoritmo de Karlin y Altschul (Altschul et al, J.Mol.Biol., 215(3): 403-410, 1990; PNAS, 90: 5873-5877, 1993), que son bien conocidos por los expertos en la materia.

La secuencia de nucleótidos del gen de fertilidad de la presente divulgación se aísla del arroz.

Además, en el presente documento se describe un método para influir en la fertilidad vegetal influyendo en una secuencia de nucleótidos de FL2 o regulando la transcripción y expresión del gen FL2. La expresión "influir en la fertilidad de la planta" significa cambiar la fertilidad de una planta, por ejemplo, obtener esterilidad masculina, regulando la expresión del gen FL2. En particular, dependiendo de las aplicaciones específicas, la expresión del gen FL2 en la planta puede estar influenciada por muchos métodos para regular la fertilidad masculina de la planta. Más particularmente, la expresión del gen FL2 puede manipularse mediante todo tipo de herramientas disponibles para un experto en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse mutación, mutagénesis, introducción de un gen antisentido, cosupresión, introducción de una horquilla, y similares, para interferir en la expresión normal del gen FL2, y obtener la planta estéril masculina. En una realización, la presente divulgación también incluye la manera de recuperar la fertilidad masculina en la planta con la expresión alterada de FL2 introduciendo la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre de FL2 en la planta.

Además, en la presente divulgación se proporciona una secuencia de nucleótidos mutante del gen FL2 que conduce a esterilidad masculina. Más particularmente, el material mutante estéril masculino se obtiene mediante un proceso de mutación del gen FL2 endógeno del arroz, o mutación de la secuencia de nucleótidos de un gen altamente homólogo al gen FL2, que conduce a la pérdida de la fertilidad masculina. El término "mutar" incluye, pero sin limitación a los siguientes métodos, por ejemplo, mutación génica inducida por métodos físicos o químicos. El método químico incluye mutagénesis inducida por un mutágeno tal como EMS, etc. La mutación puede ser mutación puntual, deleción de nucleótidos, o inserción de nucleótidos, o silenciamiento génico mediante ARNi, mutagénesis dirigida al sitio, etc.

En particular, en el presente documento se describe un mutante masculino estéril de arroz, que contiene el gen FL2 mutante. La secuencia de nucleótidos del gen de esterilidad masculina mutante se muestra como la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del mismo es la SEQ ID NO: 8. En comparación con el tipo silvestre, en el mutante masculino estéril, G está mutada en A en el 1688° nucleótido de la secuencia codificante del gen de esterilidad masculina mutante (Fig. 6), lo que conduce a un cambio de glicina (G) a ácido aspártico (D) en el 563er aminoácido en la correspondiente secuencia proteica codificada. Como sabe un experto en la materia, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 puede construirse en un vector de expresión en plantas para transformar una planta y obtener un nuevo material mutante estéril masculino transgénico.

En el presente documento se describe además el promotor del gen FL2 con una función de expresión específica en antera, y la secuencia de nucleótidos correspondiente del promotor es una secuencia de nucleótidos de 700 pb a 2500 pb secuencia arriba del ATG del gen FL2. Más particularmente, en arroz, la secuencia de nucleótidos del promotor del gen OsFL es la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9. Las secuencias de nucleótidos mostradas como la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9 se ligaron respectivamente con el gen indicador de GUS y se transformaron plantas. Se analizaron las plantas transgénicas resultantes. Específicamente, las raíces, tallos, hojas y flores se tiñeron para detectar la actividad de GUS. Se descubrió que el gen de GUS impulsado por el promotor del gen OsFL2 se expresa principalmente en anteras de arroz, en particular se expresa de forma elevada específicamente en la fase P7 del desarrollo de la antera. Por lo tanto, el promotor de la s Eq ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9 es un promotor específico para antera.

El promotor específico para antera descrito en el presente documento incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9, una secuencia de nucleótidos con al menos el 90 % de similitud de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9, o un fragmento de nucleótidos secuencial de al menos 100 pb de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9, que puede activar la expresión de secuencias de nucleótidos unidas operativamente al promotor en la antera de la planta. Un vector de expresión, un casete de expresión, una bacteria hospedadora, etcétera, que contengan la secuencia de nucleótidos descrita anteriormente también se encuentran dentro del alcance de protección de la presente divulgación. Además, se describe un pareja de cebadores para amplificar una cualquiera de las secuencias de nucleótidos del promotor de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9.

La secuencia de nucleótidos del promotor descrito en el presente documento puede utilizarse para aislar las secuencias de nucleótidos correspondientes de plantas distintas del arroz, en particular, mediante clonación basada en homología a partir de otras monocotiledóneas. Estas secuencias de nucleótidos correspondientes pueden aislarse e identificarse mediante PCR, hibridación, etc., basadas en la homología entre estas secuencias de nucleótidos correspondientes y el promotor de la presente divulgación o el promotor. Por lo tanto, las realizaciones de referencia de la presente divulgación también comprenden los fragmentos correspondientes, que tienen similitudes de secuencia con la secuencia promotora de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9 (o fragmentos de la misma) y pueden aislarse en base a las similitudes.

El término "promotor" utilizado en el presente documento significa una región de ADN reguladora, que comúnmente incluye la caja TATA que guía a la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en un sitio de inicio de la transcripción apropiado de una secuencia codificante específica. El promotor también puede incluir otras secuencias de reconocimiento comúnmente ubicadas secuencia arriba de la caja TATA, llamado elemento promotor secuencia arriba, con la función de regular la eficacia transcripcional. Como saben los expertos en la materia, aunque se ha identificado la secuencia de nucleótidos de la región promotora descrita en el presente documento, el aislamiento y la identificación de otro elemento regulador en la región corriente arriba de la caja TATA de una región promotora específica identificada en la presente divulgación también se encuentra dentro del alcance de la presente divulgación. Por lo tanto, el promotor descrito en el presente documento puede definirse adicionalmente en general para incluir los elementos reguladores corriente arriba que regulan los patrones de expresión espacial y temporal de la secuencia codificante. Los elementos promotores expresados en un tejido diana (tal como los órganos reproductores masculinos) pueden identificarse y aislarse de la misma manera, y estos elementos promotores pueden utilizarse junto con un promotor central para examinar la expresión preferencial en tejidos específicos masculinos. Promotor central significa una secuencia mínima para el inicio de la transcripción, por ejemplo, una secuencia conocida como la caja TATA, que comúnmente existe en el promotor del gen que codifica una proteína. Por lo tanto, de manera alternativa, el promotor corriente arriba del gen FL2 puede utilizarse en asociación con el promotor central del gen FL2 o con promotores centrales de otras fuentes.

El promotor central puede ser uno de los promotores centrales conocidos, tales como el promotor 35S o 19S del virus del mosaico de la coliflor (patente de EE.UU., N.° 5.352.605), el promotor de Ubiquitina (patente de EE.UU. N.° 5.510.474), el promotor central de IN2 (patente de EE. UU. N.° 5.364.780) o el promotor del virus del mosaico de la escrofularia.

La función del promotor del gen puede analizarse mediante los siguientes métodos: la secuencia de nucleótidos del promotor se une operativamente al gen indicador para formar una construcción transformable, luego la construcción se transforma en plantas para obtener una progenie transgénica, y se examina la expresión del gen indicador en la progenie transgénica para determinar el patrón de expresión del promotor. De manera alternativa, la secuencia del promotor unida a un gen informador se subclona en un vector de expresión y la función del promotor u otras regiones reguladoras del mismo se detecta a través del experimento de expresión transitoria.

La selección de vectores de expresión adecuados para probar la función del promotor o regiones reguladoras del mismo depende del hospedador y del método de introducción del vector de expresión en el hospedador, y el método es bien conocido por los expertos en la materia. Para un gen eucariótico, la secuencia que debe subclonarse en el vector de expresión comprende una región que controla el inicio y la regulación de la transcripción. Estas regiones están unidas operativamente a un gen indicador que incluye GFP, UidA, el gen de GUS o la luciferasa. El vector de expresión con una supuesta región reguladora ubicada en el genoma puede transformarse en un órgano entero, tal como polen en fases específicas, o en callos, para examinar sus funciones.

Adicionalmente, el promotor descrito en el presente documento puede unirse a secuencias de nucleótidos heterogéneas distintas del gen FL2 para impulsar su expresión. La secuencia de nucleótidos del promotor descrito en el presente documento y fragmento y variante de la misma, y la secuencia de nucleótidos heterogénea pueden ensamblarse en un casete de expresión para la expresión en plantas diana, más particularmente en los órganos masculinos de la planta. El casete de expresión tiene un sitio de restricción apropiado para insertar el promotor y la secuencia de nucleótidos heterogénea. Los casetes de expresión pueden utilizarse para manipular genéticamente cualquier planta para obtener el fenotipo correspondiente deseado.

El promotor del gen FL2 descrito en el presente documento, más particularmente el promotor del gen FL2 de arroz, puede utilizarse para activar la expresión de varias secuencias de nucleótidos heterogéneas para hacer que la planta transformada sea masculina estéril. Específicamente, la secuencia de nucleótidos heterogénea puede codificar enzimas que aceleran la degradación de carbohidratos, una enzima de modificación de carbohidratos, una amilasa, una enzima desramificadora, o pectinasa, tal como el gen de la amilasa a, una auxina, rot B, un gen de citotoxina, la toxina diftérica, una DAM metilasa, avidina, o secuencias de nucleótidos heterogéneas seleccionadas de un sistema de control de regulación procariota. La secuencia de nucleótidos heterogénea también puede ser un gen de esterilidad masculina dominante.

El ácido nucleico unido operativamente secuencia abajo del promotor en la presente divulgación puede estar unido operativamente a un gen estructural, un gen regulador, una secuencia antisentido del gen estructural, una secuencia antisentido del gen de regulación, o microARN que interfiere con la expresión de un gen endógeno particular.

De manera más explícita, el gen de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 que regula la fertilidad de la planta descrito en el presente documento puede construirse corriente abajo del promotor de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9 para impulsar la expresión específica del gen en la antera, o puede utilizarse para construir un vector de ARNi dirigido al gen de la SEQ ID NO: 1 impulsado por el promotor de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9, para silenciar la expresión del gen FL2 y obtener el mutante estéril masculino del gen de la SEQ ID NO: 1.

La secuencia de nucleótidos del promotor descrita en el presente documento puede aislarse de cualquier planta, incluyen, pero sin limitación, Brassica, maíz, trigo, sorgo, Crambe linn., Sinapis alba, semilla de ricino, sésamo, semilla de algodón, linaza, soja, Arabidopsis, Phaseolus, cacahuete, alfalfa, avena, colza, cebada, avena, centeno, mijo, durra, triticale, escaña, espelta, trigo farro, lino, grama, Tripsacum, Euchlaena mexicana, Festuca ovina, pasto de trigo perenne, caña de azúcar, Vaccinium oxycoccos, papaya, plátano, cártamo, palma aceitera, melón, manzana, pepino, dendrobio, gladiolo, crisantemo, Liliaceae, algodón, eucalipto, girasol, Brassica rapa, remolacha, café, planta ornamental, conífera, etcétera. La planta puede incluir maíz, soja, cártamo, mostaza de hoja, trigo, mostaza de hoja, cebada, centeno, arroz, algodón y sorgo.

La presente divulgación también proporciona una construcción que comprende el gen FL2 y/o el promotor del gen FL2, que incluye un denominado vector o casete de expresión. El promotor de la construcción que impulsa la secuencia de nucleótidos unida para que se exprese en la planta puede ser un promotor natural o un promotor sustituido. El promotor de la construcción puede ser un promotor inducible. La secuencia de nucleótidos del gen FL2 puede estar unida a un promotor específico para antera, preferentemente, que pueda impulsar la secuencia de nucleótidos del gen FL2 para expresarse completamente en el desarrollo temprano de la antera, por ejemplo específicamente en P7 del desarrollo de la antera. En particular, los tipos de promotores útiles incluyen un promotor vírico constitutivo, tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 19s del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia y el promotor de la ubiquitina.

Para potenciar la transcripción y/o la expresión dirigida a un tejido vegetal específico puede utilizarse un promotor específico para un tejido. El promotor puede expresarse tanto en el tejido diana como en otros tejidos vegetales, o expresarse principalmente en el tejido diana, o expresarse menos en el tejido diana que en los otros tejidos vegetales, o expresarse muy preferentemente en el tejido diana. En una realización, el promotor tiene preferencia por expresarse en particular en tejidos masculinos de la planta o tejidos femeninos de la planta. Para el método de la presente divulgación, el promotor puede no estar limitado a ningún promotor específico con preferencia por tejido masculino, y pueden utilizarse muchos promotores de este tipo conocidos por los expertos en la materia.

El promotor FL2 natural descrito en el presente documento es un ejemplo de los promotores útiles. Otro tipo de tales promotores comprende el promotor 5126, el promotor de MS45, el promotor de MS26, el promotor BS92-7, el elemento regulador SGB6 y promotor TA29, etcétera, que impulsan al gen vinculado a expresarse en tejidos masculinos vegetales. La construcción también comprende el promotor con especificidad de expresión en gametos. Los promotores con especificidad de expresión en tejido de gametos incluyen el promotor PG47 y el promotor ZM13.

La construcción descrita anteriormente también puede comprender otros componentes, dependiendo del fin y el uso de la construcción de vector. Por ejemplo, la construcción puede comprender además un gen marcador de selección, una secuencia de direccionamiento o reguladora, una secuencia de estabilización, una secuencia de guía, o un intrón. El casete de expresión incluye una secuencia de nucleótidos heterogénea diana con un terminador de la transcripción y un terminador de la traducción en el extremo 3' de la misma que funcionan en una planta. El terminador puede ser el terminador del gen de la presente divulgación o un terminador exógeno. Más particularmente, el terminador mencionado anteriormente puede ser una región de terminación de nopalina sintasa u octopina sintasa.

Si se desea dirigir el producto de expresión de la secuencia heterogénea de nucleótidos a un orgánulo específico, tal como plástidos, amiloplastos, el retículo endoplásmico, o a la superficie celular o a secreción extracelular, el casete de expresión también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un péptido de tránsito. El péptido de tránsito es conocido por el experto en la materia y puede ser, pero sin limitación, un péptido de tránsito de la subunidad pequeña de la Rubisco, de una EPSP sintasa vegetal, de cloroplastos de Brittle-1 etc.

En el proceso de preparación del casete de expresión, pueden manipularse múltiples fragmentos de ADN para proporcionar una secuencia de ADN en una dirección apropiada o en un marco de lectura correcto. Para alcanzar este objetivo, los fragmentos de ADN pueden unirse entre sí a través de un adaptador o un enlazador, u otros sitios múltiple de clonación convenientes a través de otras operaciones, etc.

Además, la construcción proporcionada en la presente divulgación también incluye un gen marcador de selección para seleccionar células transformadas o tejidos transformados. El gen marcador de selección incluye un gen de resistencia a antibióticos o un gen de resistencia a herbicidas. El gen marcador de selección adecuado incluye, pero sin limitación, un gen de resistencia al cloranfenicol, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la estreptomicina, un gen de resistencia a la miramicina, un gen de resistencia a las sulfonamidas, un gen de resistencia al glifosato, un gen de resistencia a la fosfinotricina. El gen marcador de selección puede ser también un gen de la proteína fluorescente roja, un gen de la proteína fluorescente cian, un gen de la proteína fluorescente amarilla, un gen de la luciferasa, un gen de la proteína fluorescente verde y un gen biosintético de antocianina, etc.

El casete de expresión o el vector proporcionado en la presente divulgación puede insertarse en un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial de levadura, un cromosoma artificial bacteriano o cualquier otro vector adecuado para su transformación en una célula hospedadora. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula bacteriana, especialmente la célula utilizada para clonar polinucleótidos, mantener un polinucleótido, o transformar una célula vegetal, tal como Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens y bacterias del suelo de pelos radiculares. En el caso de que la célula hospedadora sea una célula vegetal, el casete de expresión o el vector pueden insertarse en el genoma de la célula vegetal transformada, y la inserción puede ser específica del sitio o aleatoria. Preferentemente, la inserción puede realizarse a través de recombinación homóloga. Además, el casete de expresión o el vector pueden no estar asociados a cromosoma alguno. El casete de expresión o el vector de la presente divulgación puede estar en el núcleo, cloroplasto, mitocondrias y/o plástidos de una célula vegetal. Preferentemente, el casete de expresión o el vector pueden insertarse en el ADN cromosómico en el núcleo de la célula vegetal.

La presente divulgación también comprende el uso del gen FL2 divulgado en la presente divulgación y el promotor del mismo. En algunas realizaciones de aplicaciones, el gen FL2 o el promotor del mismo puede utilizarse para propagar y mantener la línea masculina estéril obtenida mediante la mutación del gen FL2 u otros genes relacionados con la fertilidad.

En detalle, la propagación y el mantenimiento de la línea estéril masculina mencionada anteriormente implica el uso de un mutante estéril masculino con un gen nuclear recesivo homocigótico como aceptor transgénico y la transformación de tres genes diana estrechamente unidos en el mutante estéril masculino. Los tres genes estrechamente unidos comprenden un gen de restablecimiento de la fertilidad, un gen de inactivación del polen y un gen de cribado de marcador de color/fluorescencia. El gen de restablecimiento de la fertilidad puede recuperar la fertilidad del aceptor transgénico estéril. El gen de inactivación del polen puede inactivar cualquier polen que contenga el gen exógeno transformado. Y el gen de cribado de marcador de color/fluorescencia puede utilizarse para clasificar las semillas transgénicas de las semillas no transgénicas, y las semillas no transgénicas clasificadas pueden utilizarse como una línea estéril para producir semillas híbridas, mientras que las semillas transgénicas clasificadas pueden utilizarse como una línea de mantenimiento para producir una línea estéril de forma continua y estable.

De manera más explícita, de acuerdo con una realización de la presente divulgación, el mutante fl2/fl2 recesivo estéril nuclear de arroz puede utilizarse como receptor, y 3 genes estrechamente unidos se transforman en la línea estéril, en donde un gen de restablecimiento de la fertilidad OsFL2 puede recuperar la fertilidad del aceptor transformado, un gen de inactivación del polen Zm-PA puede inactivar el polen, y se utiliza un gen RFP(r) de cribado por fluorescencia (clasificación por color) para clasificar las semillas transgénicas a partir de las semillas no transgénicas, y las semillas no transgénicas clasificadas pueden utilizarse como una línea estéril para producir semillas híbridas, y las semillas transgénicas seleccionadas pueden utilizarse como una línea de mantenimiento para producir una línea estéril de forma continua y estable. Esta tecnología produce un producto no transgénico y elude el problema de la demora en el proceso de preparación de semillas híbridas de arroz que reduce la utilización de recursos en el método de tres líneas y una fertilidad inestable de la línea estéril en el método de dos líneas.

Puede utilizarse un promotor específico para antera descrito en el presente documento para impulsar la expresión específica de un gen exógeno en la antera, para evitar la expresión continua del gen exógeno en otros tejidos de la planta y cualquier efecto adverso causado por ello. El promotor específico para antera también puede utilizarse en el análisis funcional y la identificación de genes relacionados con el desarrollo del polen de la planta, el establecimiento de la línea estéril masculina y la línea de restablecimiento, y un experimento de aborto de polen, y se puede evitar el problema de bioseguridad provocado por el flujo de transgenes de la planta o el escape de polen, lo cual es importante para establecer la línea masculina estéril y la línea de restablecimiento.

Además, se describe un método de producción de una planta, que comprende:

(1) la construcción de un casete de expresión proporcionado en el presente documento,

(2) la introducción del casete de expresión resultante de la etapa (1) en células vegetales,

(3) la regeneración de plantas transgénicas a partir de células vegetales transformadas, y

(4) el cribado de las plantas transgénicas, y

(5) opcionalmente, la propagación de la planta de la etapa (4) para obtener descendencias.

La planta transgénica descrita en el presente documento se prepara mediante métodos de transformación conocidos por los expertos en la materia de biotecnología vegetal. Para transformar un vector de expresión recombinante en la célula vegetal para generar la planta transgénica de la presente divulgación puede utilizarse cualquier método. Los métodos de transformación incluyen un método de transformación directa y un método de transformación indirecta. El método de transformación directa apropiado incluye la captación de ADN inducida por polietilenglicol, la transformación mediada por liposomas, la introducción por cañón de partículas, la electroporación y la microinyección, etcétera. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la presente divulgación utiliza técnicas de transformación basadas en agrobacterias (en referencia a Horsch RB et al (1985) Science 225: 1229; White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic plantss, Volumen 1, Engineering and Utilization, Academic Press, 1993, pág. 15-38; Jenes B et al.Techniques for Gene Transfer, Transgenic plants, Volumen 1, Engineering and Utilization, Academic Press, 1993, pág. 128-143, etc.). Las cepas de Agrobacterium (tales como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) contienen un plásmido (plásmido Ti o plásmido Ri) con un elemento ADN-T. El plásmido con el ADN-T se transfiere a la planta después de la transfección con Agrobacterium, integrándose finalmente el ADN-T en el genoma de la célula vegetal. El ADN-T se encuentra en el plásmido Ri o en el plásmido Ti, o está contenido en un vector binario. En los ejemplos se describe un método de transformación mediado por Agrobacterium. El método de transformación mediado por Agrobacterium es el más adecuado para las dicotiledóneas, pero también es apto para monocotiledóneas. La manera de transformar Agrobacterium en plantas se describe en los ejemplos. La transformación puede conducir tanto a una transformación y expresión transitorias como a una transformación y expresión estables. Aunque la secuencia de nucleótidos de la presente divulgación puede insertarse en diversas plantas y en diversos tipos de células vegetales, es especialmente adecuada para células de cultivos.

En comparación con la técnica anterior, la presente divulgación tiene las siguientes beneficios: en la presente divulgación se proporcionan un gen de desarrollo de la antera de arroz y la línea estéril masculina generada por la mutación del gen de desarrollo de la antera de arroz. La esterilidad masculina no está influenciada por el medio ambiente y puede recuperarse mediante un transgén de tipo silvestre. El gen de desarrollo de la antera de arroz y la línea estéril masculina generada por la mutación del gen de desarrollo del polen de arroz proporcionan los componentes necesarios para construir el sistema de mejoramiento genético híbrido de tercera generación. La línea estéril masculina generada por la mutación del gen de desarrollo del polen de arroz puede utilizarse para producir semillas híbridas y es vital para mejorar los métodos existentes de tres y dos líneas.

Ejemplos

La invención se describe ahora con referencia a los siguientes Ejemplos. Los Ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos.

Ejemplo 1: Cribado de un mutante estéril masculino de arroz (Osfl2)

Se mutagenizaron semillas de la variedad de arroz (Oriza sativa L. spp. Indica) Huanghuazhan (M0) mediante EMS (al 0,7 %) durante 12 horas para obtener la población mutagenizada (M1). Las semillas generadas por las plantas mutagenizadas a partir de las semillas M1 se recogieron y mezclaron para obtener una biblioteca de mutantes (M2).

Las plantas a partir de la semilla de la generación M2 se cribaron para obtener plantas estériles masculinas en la fase de maduración de la semilla. La planta estéril se reprodujo cortando rastrojos de arroz, y se analizó el desarrollo del polen en la planta reproducida mediante tinción con 12-KI en el período reproductivo. Un mutante estéril masculino no mostró polen y se lo llamó Osfl2.

Ejemplo 2: Análisis genético del mutante estéril masculino de arroz (Osfl2)

La planta estéril del mutante de Osfl2 se cruzó con Huanghuazhan de tipo silvestre, y las 80 plantas de la generación F1 fueron todas fértiles. Las plantas de generación F1 se autofertilizaron para obtener 300 plantas F2, de las cuales 78 plantas no manifestaron esterilidad del polen y 222 plantas mostraron fertilidad completa. La relación de segregación entre las plantas estériles y las plantas fértiles es muy cercana a 1:3, lo que reveló que el fenotipo estaba controlado por un gen nuclear recesivo.

Ejemplo 3: Análisis de estabilidad del mutante estéril masculino de arroz (Osfl2)

Para confirmar si la esterilidad del mutante de osfl2 estaba influenciada por condiciones ambientales tales como la luz o la temperatura, etc., las plantas de la generación F2 obtenidas al cruzar la planta estéril con Huanghuazhan de tipo silvestre se cultivaron en Shenzhen, Sanya, Hunan, Pekín, para seguir observando la esterilidad y la relación de segregación. En todas las áreas, la relación de segregación entre las plantas estériles y las plantas fértiles es de 1:3 (Fig. 1, y las plantas reproducidas a partir del restrojo de arroz estéril todavía manifestaron esterilidad, por tanto, la esterilidad del mutante no estuvo influenciada por factores ambientales.

Tabla 1: La relación de segregación en la planta de generación F2 obtenida por autofecundación de las plantas F1 l n n i l m n fl2 l i ilv r H n h zh n

Ejemplo 4 Análisis fenotípico del órgano reproductor del mutante estéril masculino de arroz (osfl2)

En comparación con la planta de tipo silvestre, la planta mutante creció y se desarrolló normalmente, floreciendo en la misma fase. El tamaño, la morfología, el tamaño de apertura y el tiempo de apertura de la ley la gluma de la planta mutante no fueron distintos de la planta de tipo silvestre (Fig. 1). Sin embargo, la antera de la planta mutante era blanca, fina, pequeña e indehiscentes (Fig. 2), sin polen. Se realizó una tinción adicional con 12-KI para detectar si había polen en la planta mutante, y mostró que el polen de tipo silvestre se teñía normalmente mientras que la planta mutante no tenía polen (véase la Fig. 3). Los órganos femeninos de la planta mutante (incluyendo el ovario, el estilo y el estigma) eran ligeramente más grandes que sus equivalentes de la planta de tipo silvestre (Fig. 4). La tasa de exposición del estigma de la planta mutante fue de al menos el 89 % (Fig. 5), mientras que los estigmas de Huanghuazhan de tipo silvestre rara vez están expuestos. Las plantas mutantes estériles se mezclaron con la planta fértil y se sembraron en condiciones naturales, de modo que la planta mutante estéril pudiera ser polinizada de forma cruzada por la planta fértil para recuperar la capacidad de fructificación. El análisis estadístico de 100 plantas mutantes mostró que, de esta manera, la tasa de formación de semillas aumentó al menos en un 40 %. Por el contrario, en una condición artificial, la planta mutante estéril puede polinizarse de forma cruzada a partir de la planta fértil, y la tasa de formación de semillas aumentó al 70 %-80 %. Además, la semilla de la planta mutante se desarrolló normalmente, sin ningún defecto.

Ejemplo 5: Clonación de genes del mutante estéril masculino de arroz

La clonación de genes mutantes se basó en el método Mutmap, que implica la construcción de progenies F2 cruzando el mutante con el padre de tipo silvestre y el mapeo del gen mediante resecuenciación. La planta estéril se cruzó con Huanghuazhan de tipo silvestre, luego se seleccionaron 30 plantas estériles de la generación F2 para la extracción de ADN genómico, y el ADN genómico se mezcló por igual para la secuenciación del genoma de alto rendimiento para obtener datos de secuencia de 20 Gb que suman 50 X el genoma del arroz. El gen mutante puede ser el alelo Os10g38050 ubicado en el 10° cromosoma, en comparación con la secuencia genómica de Huanghuazhan de tipo silvestre. La secuencia codificante de longitud completa del gen de Huanghuazhan de tipo silvestre es de 1767 pb, y la secuencia de nucleótidos del gen se mostró como la SEQ ID NO: 1. La proteína codificada por la SEQ ID NO: 1 contiene 588 aminoácidos y la secuencia de aminoácidos se mostró como la SEQ ID NO: 2. En el mutante estéril, G estaba mutada a A en el 1688o nucleótido de la secuencia codificante del gen (Fig. 6), y como resultado, la glicina (G) cambió a ácido aspártico (D) en el 563er aminoácido de la correspondiente secuencia proteica codificada por el gen (Fig. 7). Se realizó el análisis HRM (forma siglada de High Resolution Melt, alta resolución de la temperatura de fusión) más reciente de la herramienta de investigación SNP (forma siglada de Single Nucleotide Polymorphism, polimorfismo de nucleótido único) para confirmar aún más que todas las plantas sin polen portaban la mutación homocigótica mientras que la planta fértil portaba un sitio de tipo silvestre homocigótico o un sitio heterocigótico. La descendencia procedente de la autopolinización de la planta homocigótica de tipo silvestre fue fértil, y la descendencia procedente de la autopolinización de la planta heterocigótica muestra una relación de segregación de 1:3 entre la descendencia estéril y la descendencia fértil. La secuencia codificante del ADNc del gen contiene varios polimorfismos de secuencia entre el arroz Nipponbare de japónica y el Huanghuazhan de tipo silvestre (Fig. 6). En comparación con OsFL2 de Huanghuazhan, OsFL2 de Nipponbare contiene una deleción de nucleótidos de 6 pb, del 59o al 64o de la secuencia codificante, una sustitución de nucleótido G a T en la posición 451 y una sustitución de nucleótido G a A en la posición 1371 de la secuencia codificante. Como resultado, se detectaron dos polimorfismos de proteínas, una deleción que contiene los aminoácidos 20o y 21o de la secuencia proteica, y una sustitución de Alanina (A) a Serina (S) en la posición 151 de la proteína (Fig. 7). La secuencia de nucleótidos del gen de Nipponbare se mostró como la SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos codificante del mismo fue la SEQ ID NO: 6. Un análisis adicional demostró que el gen no muestra ningún polimorfismo entre la variedad de arroz indica 9311 y Huanghuazhan de tipo silvestre.

Ejemplo 6: Análisis del patrón de expresión del gen OsFL2 en distintos órganos del arroz

Se diseñó una pareja de cebadores basados en la secuencia de ADNc de OsFL2, con el cebador directo F1 5' GCCTCACCGTCCTCCTCTAC 3' (SEQ ID NO: 33) y el cebador inverso R1 5' CGGGTCCGAGAACACCAC 3' (SEQ ID NO: 34). Por otra parte, se diseñaron cebadores para controles internos para un gen de actina de arroz, con un cebador directo 5' GCTATGTACGTCGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 35) y un cebador inverso 5' GGACAGTGTGGCTGACACCAT 3' (SEQ ID NO: 36). Se extrajo el ARN total de arroz Huanghuazhan y se utilizó como molde para la síntesis del 1‘ cadena del ADNc. Se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real para analizar el perfil de expresión del gen OsFL2 en la raíz, tallo, hoja, lema, palea, gluma, pistilo y antera joven en la fase de diferenciación del primordio (fase 6), antera joven en la fase meiótica de las células madre del polen temprano (fase 7), fase de formación de tétradas (fase 8), fase de microsporas tempranas (fase 9), fase de microsporas intermedias y tardías (fase 10), fase de maduración del polen (fase 12), y el resultado, como se representa en la Fig. 8, demostró que el gen OsFL2 tenía una expresión alta y específica en la antera joven en la fase de meiosis de la células madres del polen (fase 7). La expresión del gen OsFL2 comenzó a disminuir en la fase de formación de tétradas (fase 8), mientras que la expresión del gen OsFL2 fue muy baja en la raíz, tallo, hoja, semilla y otra fase de desarrollo de la antera.

Ejemplo 7: Construcción del vector de expresión del gen OsFL2 y análisis funcional del promotor del gen

Se construyó el vector de expresión del gen OsFL2 (Fig. 9) para el análisis funcional del promotor del gen. En primer lugar, se utilizaron el cebador OsFL2-Pro-F (ggatccGGATTTCGAGGATCAAGCT, Se Q ID NO: 37) y el cebador OsFL2-Pro-R (gtcgacTTTCGCCGGGCAAATTCGC, SEQ ID NO: 38) para amplificar la región promotora de 2520 pb secuencia arriba del gen OsFL2 (SEQ ID NO: 3) procedente del ADN genómico de Huanghuazhan de tipo silvestre. El producto amplificado se digirió mediante SalI y BamHI y se ligó en un vector de detección de promotores para obtener el vector (plásmido) pOsFL2-pro. El vector pOsFL2-pro obtenido se transformó en callos de arroz de tipo silvestre mediante el método de transformación mediada por Agrobacterium, y se seleccionaron y regeneraron 12 plantas de arroz transgénicas. El patrón de expresión del promotor de OsFL2 se analizó detectando la actividad de pgalactosidasa. La tinción de GUS en la raíz, tallo, hoja y flor de las plantas transgénicas demostró que el gen de GUS impulsado por el promotor del gen OsFL2 se expresaba principalmente en la antera del arroz (mostrado en la Fig. 10). Además, el análisis funcional del promotor mostrado como la SEQ ID NO: 9 unido a GUS demostró que el resultado de la tinción de la SEQ ID NO: 9 era concordante con el resultado de la tinción de la SEQ ID NO: 3, y ambos eran promotores específicos para la antera.

Ejemplo 8: Pruebas de complementación del mutante estéril masculino (osfl2) de arroz

Para confirmar que la mutación de OsFL2 era responsable del fenotipo estéril masculino en el mutante, se construyó un vector de complementación que contenía el gen OsFL2 de tipo silvestre de longitud completa y se transformó en plantas para complementar el fenotipo Osfl2. Específicamente, se amplificó el fragmento genómico de longitud completa desde 2500 pb secuencia arriba del codón de iniciación ATG de OsFL2 hasta aproximadamente 497 pb secuencia abajo del codón de terminación TGA de OsFL2 (SEQ ID NO: 4) utilizando el cebador OsFL2-Res-F (gtttaaacGGATTTCGAGGATCAAGCT, SEQ ID NO: 39) y el cebador OsFL2-Res-R (ggatccACCCTGCATTTTTTATGCC, SEQ ID NO: 40). El fragmento se digirió mediante PmeI y BamHI y se ligó en un vector de complementación para obtener el vector (plásmido) pOsFL2-Res. El vector pOsFL2-Res obtenido se transformó en callos inducidos a partir de semillas de mutante de osfl2 de Huanghuazhan mediante el método de transformación mediado por Agrobacterium, y se seleccionaros y regeneraron las plantas transgénicas. Se obtuvieron 8 plantas transgénicas positivas y todas ellas mostraron una fertilidad restablecida. Este análisis demostró además que el gen OsFL2 estaba implicado en la regulación del desarrollo del polen y que la mutación en el gen OsFL2 conducía al fenotipo sin polen.

Ejemplo 9: Adquisición y análisis fenotípico de la línea de ARNi del gen OsFL2

Para confirmar adicionalmente que la expresión alterada del gen OsFL2 da como resultado esterilidad masculina, se construyó una línea de ARNi para genosuprimir específicamente OsFL2. Específicamente, se amplificó un fragmento de ADNc de OsFL2 de 474 pb utilizando el cebador OsFL2-Flag-F (GCGTCGCCGACAACCC, SEQ ID NO: 41) y el cebador OsFL2-Flag-R (t Gg AGAAGGCCCGCGAC, SEQ ID NO: 42). El producto amplificado se amplificó adicionalmente con dos parejas de cebadores de amplificación para obtener un fragmento 1 directo del gen OsFL2 con un sitio Kpnl y un fragmento 2 inverso del gen OsFL2 con un sitio BamHI. Los dos fragmentos se digirieron, ligaron e incorporaron en un vector pRNAi para obtener pOsFL2-pRNAi. El pOsFL2-pRNAi obtenido se transformó en callo de nipponbare mediante el método de transformación mediado por Agrobacterium, y se seleccionaron y regeneraron 10 plantas transgénicas, y la fertilidad masculina en 7 de las plantas transgénicas estaba significativamente reducida. Se llevó a cabo una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando la pareja de cebadores del Ejemplo 6 basada en OsFL2 y ADNc de Actina para analizar el nivel de expresión del gen OsFL2 en antera joven en la fase de meiosis de células madre de polen y la fase de formación de tétradas (P7) de las plantas de ARNi, y el resultado demostró que el nivel de expresión de ARN del gen OsFL2 de las plantas estériles transgénicas se redujo significativamente (Fig. 13). Este análisis demostró además que el gen OsFL2 estaba implicado en la regulación del desarrollo del polen y que la mutación del gen OsFL2 conducía a un fenotipo sin polen.

Ejemplo 10: Análisis de polinización cruzada de la planta mutante de OsFL2 con la línea de restablecimiento

La planta mutante de OsFL2 de Huanghuazhan puede polinizarse de forma cruzada por varias líneas de restablecimiento de uso frecuente para la producción de semillas híbridas. Las semillas híbridas de algunas combinaciones muestran una heterosis evidente, lo que demuestra que el mutante de Huanghuazhan es valioso en el mejoramiento genético híbrido y puede utilizarse como material candidato para la línea estéril. La planta mutante de OsFL2 de Huanghuazhan se cruzó con varias líneas de restablecimiento, y los estigmas de la planta estéril de la generación F2 todavía estaban muy expuestos (la tasa de exposición del estigma fue de hasta el 60-88 %) lo que demostró una herencia de ligamiento existente en el gen mutante y un riesgo de exposición de estigmas. La alta exposición del estigma fue beneficiosa para la polinización cruzada y una eficacia mejorada de la producción de semillas híbridas.

Ejemplo 11 Alineamiento de la proteína OsFL2 con los homólogos proteicos predichos de cebada, sorgo y maíz

En la base de datos del NCBI, utilizando blast para proteínas, se utilizó la secuencia completa de la proteína OsFL2 de arroz como consulta para buscar en la base de datos de proteínas sus proteínas homólogas en los genomas de cebada, sorgo, maíz, mijo y Brachypodium distachyon. Las secuencias proteicas obtenidas se alinearon y el resultado mostró que eran altamente homólogas entre sí (Fig. 14), lo que indica que la proteína homóloga tiene una función biológica conservada y desempeña un papel importante en el desarrollo de la fertilidad masculina de la planta.

En el presente documento, la secuencia de nucleótidos del gen de fertilidad de la cebada se mostró como la SEQ ID NO: 10 u 11, y la secuencia de aminoácidos del gen de fertilidad de la cebada se mostró como la SEQ ID NO: 12, la secuencia de nucleótidos del gen de fertilidad del sorgo se mostró como la SEQ ID NO: 13 o 14, y la secuencia de aminoácidos del gen de fertilidad del sorgo se mostró como la SEQ ID NO: 15, la secuencia de nucleótidos del gen de fertilidad ZmFL2 del maíz se mostró como la SEQ ID NO: 16 o 17, y la secuencia de aminoácidos del gen de fertilidad ZmFL2 del maíz se mostró como la SEQ ID NO: 18, la secuencia de nucleótidos del gen de fertilidad del mijo se mostró como la SEQ ID NO: 19, y la secuencia de aminoácidos del gen de fertilidad del mijo se mostró como la SEQ ID NO: 20, la secuencia de nucleótidos del gen de fertilidad de Brachypodium distachyon se mostró como la SEQ ID NO: 21 o 22, y la secuencia de aminoácidos del gen de fertilidad de Brachypodium distachyon se mostró como la SEQ ID NO: 23.

Ejemplo 12 La aplicación del gen OsFL2 en la innovación de una nueva técnica de mejoramiento genético híbrido

El gen OsFL2 puede aplicarse en la nueva generación de técnicas de mejoramiento genético híbrido, y la idea central de la técnica fue: el mutante estéril masculino nuclear de arroz recesivo se utilizó como material aceptor de transformación, y tres genes estrechamente unidos se transformaron en el mutante estéril. Así pues, un gen de recuperación de la fertilidad puede recuperar la fertilidad del aceptor de transformación, un gen de inactivación del polen puede inactivar el polen que contiene el transgén, un gen de marcador por color puede utilizarse para clasificar una semilla transgénica de una semilla no transgénica, y la semilla no transgénica clasificada se utilizó como la línea estéril, mientras que la semilla transgénica se utilizó como la línea de mantenimiento. La línea de mantenimiento puede polinizar la línea estéril para propagar la línea estéril, mientras que la línea de mantenimiento puede autopolinizarse. Como la técnica utiliza la biotecnología para producir un producto no transgénico, se resuelve el problema de la demora en la producción de semillas híbridas de arroz, especialmente la baja utilización de recursos del método de tres líneas y la inestabilidad de la línea estéril del método de dos líneas.

Basándose en el principio mencionado anteriormente, los inventores utilizaron el gen OsFL2 del arroz para construir el vector de expresión pZN3. Antes de construir el vector de expresión en arroz, los inventores transformaron primero cada uno de los tres casetes de expresión, Zm-PA, OsFL2 y r Fp , en arroz, respectivamente, y además verificaron la función de cada casete de expresión. El resultado indicó que cada casete de expresión puede funcionar bien como se designó inicialmente cuando se transforma solo en arroz.

Además, el inventor construyó el vector pZN3 representado en la Fig. 15 ensamblando los siguientes elementos de ADN:

1) el vector pCAMBIA2300 como la estructura principal;

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ADN, que tiene una función de conducir a esterilidad masculina en arroz, caracterizado por que el ADN tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.

2. EL ADN de la reivindicación 1, caracterizado por que el ADN codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

3. Un casete de expresión, caracterizado por que comprende el ADN de la reivindicación 1 o 2.

4. Un vector de expresión, caracterizado por que comprende el casete de expresión de la reivindicación 3.

5. Una bacteria genomanipulada, caracterizada por que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.

6. Uso de un gen para obtener esterilidad de mutantes masculinos en arroz por transformación, caracterizado por que el gen comprende una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 1.

7. El uso de la reivindicación 6, en donde el ADN codifica una secuencia de aminoácidos como se define en la reivindicación 2.

8. Un método para recuperar la fertilidad en material estéril masculino de arroz que tiene el ADN de la reivindicación 1 o 2 introduciendo el ADN de la SEQ ID NO: 1, 5 o 27 en el material estéril masculino de arroz mediante transformación.