ES2901516T3 - Dispositivos para el cultivo de membranas celularizadas y kits - Google Patents

Dispositivos para el cultivo de membranas celularizadas y kits Download PDF

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Abstract

Dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas, que comprende: un recipiente de cultivo (20) que tiene una o más primeras paredes laterales, una superficie inferior, y un espacio de cultivo que está formado en un interior del recipiente de cultivo, y una tapa (2) configurada para acoplarse al recipiente de cultivo, en el que el espacio de cultivo está configurado para recibir una membrana para crecimiento de células y de tejido en la superficie inferior del recipiente de cultivo, caracterizado por el hecho de que la tapa (2) comprende primeros conectores de tapa (6) y las primeras paredes laterales (22) del recipiente de cultivo (20) comprenden primeros conectores de recipiente (22a) que están adaptados para acoplarse a los primeros conectores de tapa (6) de manera que, en funcionamiento, los primeros conectores de la tapa (6) presionan la membrana contra la superficie inferior del recipiente de cultivo para evitar que la membrana (24) se mueva.

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivos para el cultivo de membranas celularizadas y kits
La presente descripción se refiere a dispositivos para cultivar células y crecimiento de tejidos. La presente descripción se refiere, además, a kits que incluyen tales dispositivos.
ANTECEDENTES
Para requerimientos de laboratorio, es conocido realizar cultivos de células en un recipiente de cultivo poco profundo, simplemente colocando las células en el recipiente de cultivo y añadiendo el medio de cultivo. A continuación, puede montarse una tapa de manera desmontable en el recipiente de cultivo para encerrar selectivamente un interior del recipiente de cultivo de células. Dichos dispositivos para el cultivo de células también pueden estar provistos de una membrana biocompatible (ya sea natural o sintética), dispuesta en el interior del dispositivo, para el cultivo de células y el crecimiento de tejidos.
Pueden utilizarse membranas celularizadas, por ejemplo, en ingeniería de tejidos. La ingeniería de tejidos se refiere particularmente al uso de cultivo de células para mejorar o reemplazar tejidos biológicos, por ejemplo, para reparar o reemplazar partes de hueso, cartílago, vasos sanguíneos, piel, músculo u otro tejido biológico.
En este caso, el cultivo de células puede realizarse en un entorno controlado y estéril en una sala limpia. Una vez que el tejido ha crecido, es necesario transportarlo al quirófano donde puede ser implantado en un paciente.
Se ha encontrado que, con los dispositivos conocidos, las membranas tienden a encogerse después de añadirse fluido nutritivo. En este sentido, una membrana para cultivar células y crecimiento de tejidos que no se estire adecuadamente, es decir, una membrana encogida, puede no permitir que las células se adhieran adecuadamente a la membrana y crezcan.
Adicionalmente, los cultivos de células en el interior de recipientes pueden quedar expuestos a contaminación por agentes del entorno durante la manipulación y, por ejemplo, el transporte al quirófano, dado que los contenedores suelen estar abiertos. O éstos pueden diseñarse para cerrarse utilizando la tapa mencionada anteriormente, la cual, sin embargo, no proporciona necesariamente un sellado completo. En este sentido, la tapa puede salirse accidentalmente. Por lo tanto, la esterilidad no queda garantizada una vez que el tejido sale de la sala limpia.
También es conocido el uso de un dispositivo cerrado tal como, por ejemplo, un matraz estéril que comprende un receptáculo con tapa o elemento de cierre. Sin embargo, un problema con este tipo de matraces es que acceder al interior puede llevar mucho tiempo y puede resultar una tarea engorrosa de realizar. En particular, retirar las células del interior de dichos dispositivos puede resultar muy laborioso y llevar mucho tiempo. Otro problema puede ser que estos dispositivos cerrados no pueden intercambiar fácilmente gases, particularmente oxígeno, con las células, especialmente cuando éstas se colocan en zonas de los sistemas cerrados que se encuentran lejos de puntos de entrada de oxígeno.
US5462874 describe una placa de cultivo de tejidos de múltiples cavidades que tiene una pluralidad de cavidades de fondo abierto con una membrana semipermeable en los fondos de una pluralidad de dichas cavidades.
JP2001299326 describe un incubador adecuado para transporte y manipulación.
Ejemplos de la presente descripción buscan reducir por lo menos parcialmente uno o más de los problemas mencionados anteriormente.
DESCRIPCIÓN
De acuerdo con un primer aspecto, se presenta un dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas. El dispositivo comprende un recipiente de cultivo que presenta una o más primeras paredes laterales, una superficie inferior, y un espacio de cultivo que está formado en el interior del recipiente de cultivo, estando configurado el espacio de cultivo para alojar una membrana para crecimiento de células y de tejido en la superficie inferior del recipiente de cultivo. El dispositivo comprende, además, una tapa configurada para acoplarse al recipiente de cultivo, en la que la tapa comprende primeros conectores de tapa y las primeras paredes laterales del recipiente de cultivo comprenden primeros conectores de recipiente que están adaptados para acoplarse a los primeros conectores de tapa de modo que, en funcionamiento, los primeros conectores de tapa presionan la membrana contra la superficie inferior del recipiente de cultivo para evitar que la membrana se mueva.
De acuerdo con este primer aspecto, se presenta un dispositivo que garantiza mantener una membrana en posición para crecimiento de células y de tejido. A este fin, el dispositivo comprende primeros conectores de tapa y primeros conectores de recipiente. Mediante la simple operación de desplazar la tapa respecto al recipiente, los primeros conectores de tapa pueden sujetarse a los primeros conectores de recipiente de manera que los primeros conectores de tapa pueden presionar fácilmente la membrana contra la superficie inferior del recipiente de cultivo. Por lo tanto, puede evitarse que la membrana se contraiga o se mueva y, por lo tanto, las células pueden adherirse adecuadamente a la membrana y crecer.
De esta manera, se presenta un dispositivo en el que la membrana para cultivo de células puede estirarse de manera sencilla, económica y versátil y que puede utilizarse de manera eficaz con todo tipo de incubadores de CO2 para cultivo de células y diferentes tipos de membranas.
En ejemplos, en funcionamiento, la unión entre los primeros conectores de tapa y los primeros conectores de recipiente define un primer sellado de manera que se dispone un medio de cultivo y estanqueidad al aire.
Este primer sellado proporciona un primer espacio de cultivo sellado. Por lo tanto, el cultivo puede llevarse a cabo fuera de la sala limpia en condiciones sustancialmente asépticas, es decir, evitando contaminaciones externas y, en particular, durante el transporte desde una sala limpia a un quirófano.
En otros ejemplos, el recipiente de cultivo comprende, además, una o más segundas paredes laterales que se extienden entre la parte superior y la parte inferior del recipiente de cultivo, en el que las segundas paredes laterales quedan dispuestas radialmente hacia fuera respecto a las primeras paredes laterales. Radialmente hacia fuera significa aquí que las segundas paredes laterales quedan más alejadas del centro del recipiente que las primeras paredes laterales. La tapa puede comprender, además, segundos conectores de tapa y las segundas paredes laterales del recipiente de cultivo comprenden segundos conectores de recipiente que están adaptados para acoplarse a los segundos conectores de tapa. A este fin, durante el funcionamiento, la unión entre los segundos conectores de tapa y los segundos conectores de recipiente puede definir un segundo sellado de manera que se proporciona un medio de cultivo y estanqueidad al aire en el espacio de cultivo formado en el interior del dispositivo.
La combinación del primer sellado y el segundo sellado (situado radialmente hacia afuera respecto al primer sellado) proporciona un espacio interior de cultivo sellado todavía mejor. De esta manera, el cultivo puede realizarse en condiciones óptimas de asepsia, es decir, evitando contaminaciones externas.
En otro aspecto, se presenta un kit para el cultivo de membranas celularizadas. El kit comprende un dispositivo de acuerdo con cualquiera de los ejemplos descritos aquí y comprende, además, una o más válvulas "luer-lock". Además, los kits pueden comprender una membrana para crecimiento y cultivo de células.
Dichos kits pueden ir envasados como una unidad en un envase esterilizado.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
A continuación, se describirán unos ejemplos no limitativos de la presente descripción, con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
Las figuras 1a - 1b ilustran esquemáticamente un ejemplo de una tapa que puede formar parte de un dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas;
Las figuras 2a - 2b ilustran esquemáticamente un ejemplo de un recipiente de cultivo que puede formar parte de un dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas;
La figura 3 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas que comprende una tapa descrita en las figuras 1a - 1b unida a un recipiente de cultivo descrito en las figuras 2a - 2b. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE EJEMPLOS
A lo largo de la presente descripción y reivindicaciones, el término "membrana para crecimiento de células y de tejido" se utiliza para referirse a la lamina de crecimiento que puede disponerse sobre un recipiente de cultivo de células, donde las células crecen y se adhieren. La membrana puede ser biológica o sintética.
Se observa que no se proporcionan condiciones de cultivo, en particular, la selección de medios de cultivo, el diseño de protocolos de cultivo (el suministro y eliminación de medios particulares de acuerdo con una programación particular) y condiciones físicas tales como, por ejemplo, la temperatura, presión, humedad del aire e iluminación, ya que éstas se conocen por métodos de cultivo convencionales y pueden adaptarse para usos específicos.
Las figuras 1a - 1b ilustran esquemáticamente un ejemplo de una tapa que puede utilizarse en un dispositivo para cultivo de membranas celularizadas. La figura 1a ilustra una vista en sección transversal de la tapa. En este ejemplo, se dispone una tapa 2. La tapa 2 en este ejemplo es una tapa sustancialmente cuadrada (véase la figura 1b). Sin embargo, son posibles otras formas de la tapa, por ejemplo, de forma sustancialmente circular. La longitud de cada uno de los lados que forman la tapa cuadrada puede ser, por ejemplo, entre 5 cm y 20 cm. En un ejemplo particular, la tapa tiene una longitud y una anchura de 13 cm.
El tamaño del recipiente de cultivo (y la tapa correspondiente) puede ajustarse de acuerdo con su objetivo y, por lo tanto, puede variarse para diferentes aplicaciones de crecimiento de células.
Siguiendo el ejemplo, la tapa 2 comprende una base 5 y un borde doble "dual". Tal como se muestra en el detalle ampliado de la figura 1a, el borde puede comprender un primer conector de tapa 6, un segundo conector de tapa 7 y una parte de transición inclinada 3 entre estos conectores o "elementos de acoplamiento". El primer conector de tapa está configurado para acoplarse de manera estanca a un primer conector en el recipiente de cultivo y el segundo conector de tapa está configurado para acoplarse de manera estanca a un segundo conector en el recipiente de cultivo, tal como se explicará más adelante.
En este ejemplo, tanto el primer conector de tapa como el segundo conector de tapa forman perímetros continuos. El primer conector de tapa 6 está dispuesto radialmente hacia adentro (es decir, más cerca de un centro geométrico de la tapa) respecto al segundo conector de tapa 7. El primer conector de tapa 6 y el segundo conector de tapa 7 pueden tener una altura constante a lo largo de sus perímetros tal como se muestra en este ejemplo. Tal como también se muestra en este ejemplo, la altura del primer conector de tapa (flecha A) puede ser diferente de la altura del segundo conector de tapa (flecha B).
En particular, la altura del primer conector de tapa (flecha A) respecto a un borde superior de la tapa en este ejemplo es mayor que la altura del segundo conector de tapa (flecha B).
El primer conector de tapa 6 puede comprender un par de salientes paralelos separados 6a, 6b que se extiendan sustancialmente perpendiculares al plano definido por la base 5. Además, los primeros conectores de tapa comprenden una cavidad 15 entre los salientes 6a, 6b. De manera similar, los segundos conectores de tapa 7 comprenden una cavidad adicional 16. Las cavidades 15, 16 forman elementos de acoplamiento hembra y están adaptadas para recibir y acoplarse a otros conectores o elementos de acoplamiento macho situados, por ejemplo, en un recipiente de cultivo, tal como se explicará más adelante. En algunos ejemplos, con el fin de proporcionar un acoplamiento estanco de los elementos de acoplamiento macho y hembra, puede utilizarse un ajuste a presión. En el ejemplo representado en las figuras 1 y 2, el primer conector de tapa forma un clip de sellado configurado para encajar a presión en el conector macho en el recipiente de cultivo. En cualquier caso, la forma y el tamaño de las cavidades 15, 16 pueden variar dependiendo de la forma y el tamaño de, por ejemplo, los conectores situados, por ejemplo, en un recipiente de cultivo que para unirse a la tapa 2. Con esta disposición, la tapa 2 puede unirse de manera liberable al recipiente de cultivo (no mostrado en esta figura) utilizando, por ejemplo, un mecanismo de bloqueo de ajuste a presión.
Además, las dimensiones de la tapa 2 se seleccionan de manera que la tapa pueda acoplarse al recipiente 20 de una manera adecuada. La tapa 2 puede estar formada por cualquier material adecuado tal como, por ejemplo, metal, resina sintética, vidrio, un material polimérico o similar, siendo preferiblemente un material no poroso y relativamente no frágil capaz de resistir la esterilización.
La tapa 2 puede comprender un mango (no mostrado) situado, por ejemplo, en la parte exterior de la pared lateral 3 de la tapa 2, por lo que puede mejorarse el acoplamiento, la extracción y la manipulación de la tapa 2. El mango puede tener una forma tal que permita sujetarse fácilmente entre los dedos de un usuario. El mango también puede presentar una cierta rugosidad superficial, opcionalmente proporcionada por un revestimiento. Con esta disposición, la tapa 2 puede manipularse y utilizarse de manera eficaz con mayor precisión. En particular, la tapa 2 puede desplazarse axialmente fácilmente respecto al recipiente de cultivo, de modo que la tapa queda unida correctamente a un recipiente de cultivo y una membrana para cultivo de células queda fijada fácilmente contra una superficie del fondo del recipiente de cultivo, tal como se explicará de nuevo más adelante con referencia a la figura 3.
La tapa también puede estar provista de uno o más puertos de acceso para acceder al espacio que hay formado en el interior de un recipiente de cultivo. Particularmente, tal como se muestra en la figura 1b, pueden disponerse tres puertos de acceso 8, 9 y 10. Los puertos de acceso están configurados en este ejemplo como receptáculos troncocónicos. Debe quedar claro que pueden utilizarse otras cavidades o receptáculos.
Los puertos de acceso 8-10 pueden estar provistos de una válvula, y específicamente una válvula unidireccional. En particular, las válvulas pueden ser válvulas "Luer-Lock". De esta manera, por ejemplo, puede insertarse una jeringa en el cuerpo del recipiente a través del puerto de acceso correspondiente de manera segura y limpia, sin contaminar el espacio formado en el interior del recipiente. A través de una válvula "Luer-lock" pueden conectarse otros elementos tales como, por ejemplo, un filtro o un tubo de conexión de entrada flexible al puerto de acceso correspondiente. La válvula "Luer-Lock" puede ser, por ejemplo, una válvula de lengüeta desinfectable. La válvula de lengüeta desinfectable está configurada para proporcionar un sellado estanco al agua. Esta válvula también puede estar provista de un puerto de cierre luer hembra que proporcione una válvula de acceso sin aguja para una jeringa. Por ejemplo, el puerto de acceso 8 puede configurarse para recibir y descargar un líquido tal como, por ejemplo, un medio de crecimiento o un medio de cultivo, una solución de cultivo mezclada con células, aditivos, etc. El intercambio del líquido puede realizarse utilizando, por ejemplo, un acoplamiento de jeringa con la válvula "Luer-lock".
En algunos otros ejemplos no ilustrados, puede disponerse un tubo de conexión de entrada flexible y/o un tubo de conexión de salida flexible. Los tubos de conexión pueden conectarse, por ejemplo, al puerto de acceso 8 para introducir/extraer un líquido a través de la correspondiente válvula "Luer-lock". El (los) tubo(s) de entrada puede(n) conectarse a un extremo de una o más bolsas de irrigación. De este modo, en el recipiente de cultivo puede introducirse fluido tal como, por ejemplo, líquido de cultivo, a través del tubo de entrada y la válvula "Luer-lock" correspondiente y el líquido pueden ser conducido fuera del recipiente de cultivo a través del tubo de salida.
El puerto de acceso 9 puede configurarse para un intercambio de gas a través de la correspondiente válvula "Luerlock". En ejemplos, el puerto de acceso 9 puede estar provisto de una membrana hidrófoba (no mostrada). La membrana hidrófoba puede presentar un poro que tenga un diámetro de, por ejemplo, 0,5 pm o menos, preferiblemente 0,2 pm. Dado que puede realizarse un intercambio de gases entre el interior y el exterior del recipiente de cultivo 20 utilizando el puerto de acceso 9, una concentración de gas de oxígeno, dióxido de carbono o similar en el medio de cultivo puede mantenerse constante y/o modificarse fácilmente. Normalmente, el filtro puede estar realizado en politetrafluoroetileno (PTFE). En algunos otros ejemplos, la válvula "Luer-lock" simplemente puede estar provista de un filtro estándar para evitar contaminación.
El puerto de acceso 10 puede configurarse para controlar la presión en el interior del dispositivo. Para este fin, cuando se introducen células o reactivos en el interior del dispositivo, la presión en el interior del dispositivo puede aumentar. Por el contrario, cuando se extraen células o reactivos del dispositivo, la presión en el interior de dicho dispositivo puede reducirse. En ejemplos, puede disponerse una válvula de presión de tres vías y conectarse al puerto de acceso a través de la válvula "Luer-lock" correspondiente. Esta válvula de presión de tres vías está configurada para cerrarse / abrirse para controlar la presión en el interior del dispositivo.
Puede disponerse también una o más válvulas de retención de tres vías (no mostradas) con conectores Luer. Las válvulas de retención de tres vías pueden conectarse a la válvula "luer-lock" del puerto de acceso correspondiente. Por lo tanto, pueden conectarse, de este modo, varios elementos tales como, por ejemplo, jeringas, al mismo puerto de acceso a través de la válvula de retención correspondiente. Tal como se ha indicado anteriormente, los medios de acoplamiento que se utilizan para conectar la válvula de retención de 3 vías a las correspondientes jeringas pueden ser conectores universales o "luer-lock", que se utilizan en la práctica médica. En ejemplos, también pueden disponerse filtros en los conectores Luer de las válvulas de retención de tres vías.
Además, los puertos de acceso 8 -10 pueden estar provistos respectivamente de una tapa o tapón (no mostrado) de modo que los puertos de acceso puedan cerrarse / abrirse selectivamente.
En un ejemplo alternativo, en lugar de tres puertos de acceso, solamente se disponen dos puertos de acceso. En este caso, las funciones de intercambio de gases y control de presión pueden realizarse a través de un solo puerto, mientras que el otro puerto puede utilizarse para la introducción de un medio de crecimiento o de cultivo.
Las figuras 2a - 2b ilustran esquemáticamente un ejemplo de un recipiente de cultivo que puede utilizarse en un dispositivo para cultivo de células. El recipiente de cultivo 20 mostrado en este ejemplo comprende una superficie interior inferior 21, una primera pared lateral 22 y una segunda pared lateral 23. La primera pared lateral 22 y la superficie inferior 21 definen un espacio de cultivo, que queda cerrado por una tapa tal como la mostrada en la figura 1.
Tal como se muestra en la figura 2a, la segunda pared lateral 23 queda dispuesta radialmente hacia fuera respecto a la primera pared lateral 22. Las paredes laterales pueden formarse integralmente con el recipiente de cultivo. Se observa además que, tal como se muestra en la figura, la altura de la segunda pared lateral puede ser mayor que la altura de la primera pared lateral.
En ejemplos, el material del recipiente de cultivo puede ser diferente del material de la tapa (mostrada en las figuras 1a - 1b). Para cuestiones de sellado, puede ser beneficioso que el material del recipiente de cultivo sea más rígido que el material de la tapa. En cualquier caso, los materiales empleados pueden ser materiales transparentes, esterilizables y biocompatibles.
La tapa (tal como la mostrada en la figura 1) puede estar realizada en cualquier material polimérico biocompatible adecuado para esterilización, por ejemplo, caucho de silicona líquida (LSR). Las siliconas pueden utilizarse en un rango de dureza de 30-80 Shore A. En este ejemplo particular, la silicona utilizada puede ser en un rango de dureza de 50-60 Shore A, de modo que la tapa es más suave y adaptable a un recipiente. También puede mejorarse la estanqueidad al agua del dispositivo. La tapa también puede realizarse con elastómeros termoplásticos en un rango de dureza de entre 50 Shore A y 60 Shore D, poliuretanos, policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), polimetil metacrilato (PMMA), etc.
El recipiente de cultivo también puede estar realizado en cualquier material polimérico biocompatible adecuado para esterilización tal como, por ejemplo, caucho de silicona líquida (LSR). Las siliconas pueden utilizarse en un rango de dureza de 30-80 Shore A. En este ejemplo particular, la silicona utilizada puede ser en un rango de dureza de 70 - 80 Shore A, de manera que el recipiente es relativamente duro y rígido. El recipiente de cultivo 20 también puede fabricarse utilizando elastómeros termoplásticos en un rango de dureza de entre 30 Shore A y 60 Shore D, poliuretanos, policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), polimetil metacrilato (PMMA), etc.
Tal como se muestra en el detalle ampliado de la figura 2a, la primera pared lateral 22 comprende primeros conectores de recipiente 22a, por ejemplo, un nervio macho para acoplarse de manera estanca al clip hembra de la tapa. En particular, los primeros conectores de recipiente adaptados para acoplarse al conector mostrado en la figura 1 pueden ser una parte de bulbo redondeada. La parte de bulbo redondeada 22a puede definir un plano de simetría sustancialmente vertical. El plano vertical de la parte de bulbo redondeada puede disponerse respecto a la superficie interior inferior 21 del recipiente de cultivo 20 formando un ángulo de aproximadamente 90 grados. Sin embargo, los primeros conectores de recipiente 22a pueden estar inclinados en diferentes ángulos respecto al plano definido por la superficie inferior 21 del recipiente de cultivo para mejorar la unión entre una tapa y el recipiente de cultivo. La anchura de la parte de bulbo redondeada puede ser, por ejemplo, 2,2 mm. En un ejemplo específico, los conectores de tapa pueden tener una cierta flexibilidad y la anchura del bulbo 22a puede ser ligeramente mayor que la cavidad 15 cuando no está deformado.
Además, la segunda pared lateral 23 comprende segundos conectores de recipiente. Los segundos conectores de recipiente pueden comprender unos salientes verticales 23a. En el extremo de los salientes 23a, pueden disponerse protuberancias 23b. Las protuberancias 23a pueden ser elásticamente deformables.
En resumen, los primeros conectores de recipiente 22 y los segundos conectores de recipiente 23 del recipiente de cultivo pueden adaptarse para acoplarse respectivamente a los primeros conectores de tapa y los segundos conectores de tapa descritos en las figuras 1a - 1b. La estructura y el funcionamiento de la unión entre la tapa y el recipiente de cultivo se explicarán con más detalle con referencia a la figura 3.
Tal como se muestra en la figura 2b, el recipiente de cultivo puede comprender, además, dos o más nervios de refuerzo 50, 51 situados en una parte inferior 52 del recipiente de cultivo.
De nuevo en la figura 2a, también puede disponerse una membrana de cultivo de células en una posición indicada con el signo de referencia 24. La membrana de cultivo de células puede disponerse de manera separable sobre la superficie interior inferior 21 del recipiente de cultivo. La membrana de cultivo de células puede ser una membrana biocompatible estéril previamente tratada con, por ejemplo, una solución salina fosfatada (PBS) tampón. Se observó que, si la membrana se encuentra situada sobre la superficie 21 del recipiente de cultivo, debe evitarse que se formen burbujas de aire entre la membrana y la superficie 21.
La superficie inferior del recipiente de cultivo 20 puede no ser adhesiva a las células y, preferiblemente, no puede someterse a un tratamiento superficial para una superficie adhesiva ni a un revestimiento adhesivo a las células. De hecho, la superficie interior del recipiente de cultivo 20 puede estar provista de un revestimiento repelente de células. De esta manera, dado que el interior del recipiente no es adhesivo a las células, las células a cultivar crecerán preferiblemente en la membrana de cultivo de células.
La figura 3 ilustra esquemáticamente un ejemplo de un dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas que comprende una tapa 2 tal como se ha descrito en las figuras 1a - 1b unida a un recipiente de cultivo 20 tal como se ha descrito en las figuras 2a - 2b. Para este fin, la tapa 2 está configurada para desplazarse axialmente en la dirección de la flecha (flecha C) y acoplarse al recipiente de cultivo 20, por lo que, en funcionamiento, la tapa cierra la parte superior del recipiente de cultivo 20.
La tapa 2 comprende primeros conectores de tapa 6 y segundos conectores de tapa 7, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figuras 1a - 1b. Además, el recipiente de cultivo 20 comprende primeros conectores de recipiente 22a y segundos conectores de recipiente 23a, tal como se ha descrito anteriormente con referencia a las figuras 2a - 2b.
Tal como se muestra en el detalle ampliado de la figura 3, a medida que la tapa 2 se desplaza en la dirección de la flecha (flecha C), el bulbo redondeado 22a del recipiente de cultivo puede empujar los salientes 6a, 6b del primer elemento de acoplamiento de la tapa ligeramente hacia afuera. Una vez que el bulbo redondeado 22a ha quedado situado más allá de la parte proximal de los salientes, éstos, debido a la capacidad de deformación elástica de dichos salientes, se mueven hacia dentro. Los primeros conectores de tapa 6 y los primeros conectores de recipiente 22a quedan, de este modo, unidos entre sí.
Adicionalmente, a medida que la tapa 2 se desplaza en la dirección de la flecha (flecha C), el saliente interior 6a puede presionar la membrana de cultivo de células 24 previamente situada sobre la superficie interior inferior 21 del recipiente 20. Por lo tanto, se evitan desplazamientos no deseados de la membrana. Se observa que la presión de la membrana de cultivo de células contra la superficie inferior del recipiente de cultivo se realiza utilizando un elemento que ya forma parte del mecanismo de bloqueo para unir la tapa al recipiente de cultivo. De este modo, se evitan otros elementos para mantener la membrana en posición.
En un ejemplo específico, en ausencia de una membrana, el extremo distal del saliente 6a puede quedar separado entre 0 y 1 mm de la superficie inferior 21. El extremo distal del saliente 6a puede incluso hacer contacto con la superficie inferior 21.
En ejemplos, una superficie definida por la membrana puede ser un poco más grande que la superficie inferior del recipiente de cultivo sobre el cual se encuentra situada la membrana. De este modo, puede facilitarse la presión de la membrana contra la superficie inferior del recipiente de cultivo utilizando el saliente correspondiente de los primeros elementos de acoplamiento.
De manera similar, cuando la tapa se desplaza en la dirección de la flecha (flecha C), la cavidad 16 recibe los salientes verticales 23a y unas proyecciones 80a, 80b del segundo conector de tapa pueden deformarse. Una vez que las protuberancias 23b del segundo elemento de acoplamiento del recipiente se han introducido en una cavidad 82, las proyecciones 80a, 80b, debido a su capacidad de deformación elástica, vuelven a su forma original. Por ejemplo, la proyección 80b puede tener una anchura de, por ejemplo, 2,25 mm, y puede tener una longitud de, por ejemplo, 8 mm.
En resumen, puede lograrse, de este modo, un acoplamiento a presión de los primeros conectores de tapa y los segundos conectores de tapa al primer y segundo conector de recipiente.
De esta manera, se proporciona un sellado hermético doble interno y externo en el dispositivo para cultivar células de manera que se consigue un entorno cerrado aséptico en el cual pueden cultivarse células adecuadamente.
Se observa que, una vez que la tapa y el recipiente se han unido entre sí, en el interior del dispositivo se forma un espacio de cultivo adecuado. En particular, el espacio de cultivo puede proporcionarse de manera que, en funcionamiento, un medio de cultivo pueda cubrir la membrana y, al mismo tiempo, pueda disponerse por lo menos una fina capa de aire entre la base de la tapa y el medio de cultivo que cubre la membrana, para evitar que el medio de cultivo se adhiera a la tapa. El espacio de cultivo formado puede tener una altura de, por ejemplo, entre 9 y 11 mm. En este ejemplo particular, puede tener una altura de 10,7 mm.
En ejemplos, la tapa 2 y el recipiente de cultivo 20 pueden esterilizarse y envasarse en un envase estéril, por ejemplo, una envoltura.
De acuerdo con un aspecto, las células pueden cultivarse en el dispositivo para el cultivo de membrana celularizada sustancialmente tal como sigue:
Puede disponerse un recipiente de cultivo 20. El recipiente de cultivo puede introducirse en una sala limpia o en una cabina de flujo laminar que es un banco cerrado diseñado para evitar la contaminación. Además, puede disponerse una membrana impregnada con una solución salina tamponada con fosfato tal como se ha descrito anteriormente. La membrana puede quedar situada en la superficie del fondo del recipiente.
En esta etapa, puede acercarse la tapa 2 al recipiente de cultivo 20. La tapa 2 puede alinearse, además, con el recipiente de cultivo 20 y unirse al recipiente de cultivo 20, cerrando, de este modo, el recipiente de cultivo 20. En primer lugar, puede realizarse la unión entre el primer conector de tapa y el primer elemento de acoplamiento del recipiente. Como resultado, la membrana puede mantenerse en posición sobre la superficie del fondo del recipiente tal como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, esta unión puede proporcionar un primer sellado contra contaminación externa.
Al mismo tiempo, o poco después, puede realizarse la unión entre los segundos conectores de tapa y los segundos conectores de recipiente. Por lo tanto, esta unión puede proporcionar un segundo sellado contra la contaminación externa.
En resumen, la tapa y el recipiente de cultivo pueden unirse entre sí proporcionando un doble sellado contra contaminación externa. Por lo tanto, pueden cultivarse células en un entorno aséptico.
Siguiendo el ejemplo, en el recipiente puede introducirse un medio de cultivo, que es un líquido para cultivar células. El líquido también puede comprender células a cultivar. El medio de cultivo mezclado con las células puede introducirse utilizando uno de los puertos de acceso con un conector "Luer-Lock", tal como se ha descrito anteriormente. Esto puede realizarse utilizando, por ejemplo, una jeringa, o una o más bolsas de irrigación conectadas a correspondientes entradas, tal como se ha indicado anteriormente.
Una vez que se han introducido de manera aséptica las células en el espacio de cultivo, uno o más de los puertos de acceso, por ejemplo, el puerto de acceso configurado para recibir y descargar un líquido, se cierran mediante la tapa correspondiente de modo que puede evitarse la contaminación en el interior del recipiente de cultivo. Además, la válvula de presión de tres vías comentada anteriormente conectada al puerto de acceso 10 a través de la válvula "Luer-lock" correspondiente también puede estar cerrada. El recipiente de cultivo 20 puede colocarse, por ejemplo, en un incubador (no mostrado) cuya temperatura interna, por ejemplo, 37° C, y humedad se mantengan constantes. En este punto, las células pueden crecer durante el tiempo necesario hasta que la membrana 24 quede cubierta por lo menos parcialmente con células cultivadas. Durante el período de crecimiento de las células, si es necesario un cambio en el medio de cultivo, el medio de cultivo introducido previamente puede extraerse del recipiente de cultivo utilizando el puerto correspondiente (por ejemplo, utilizando una jeringa o una línea de salida y una bolsa correspondiente). El nuevo medio de cultivo puede introducirse de una manera sustancialmente similar a la comentada anteriormente.
Cuando las células han crecido, el dispositivo puede transportarse a la ubicación deseada (por ejemplo, un quirófano). El medio de cultivo se retira del recipiente de cultivo y la membrana celularizada puede retirarse, por ejemplo, para implantación. En los ejemplos, puede introducirse PBS en el dispositivo para lavar el interior del dispositivo.
Aunque solamente se han descrito aquí varios ejemplos, son posibles otras alternativas, modificaciones, usos y/o equivalentes de los mismos. Además, todas las posibles combinaciones de los ejemplos descritos quedan también cubiertas. Por lo tanto, el alcance de la presente descripción no debe quedar limitado por ejemplos particulares, sino que debe determinarse únicamente mediante una lectura adecuada de las siguientes reivindicaciones. Si hay signos de referencia relacionados con los dibujos entre paréntesis en una reivindicación, éstos son únicamente para intentar aumentar la inteligibilidad de la reivindicación y no deben interpretarse como una limitación del alcance de la reivindicación.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas, que comprende:
un recipiente de cultivo (20) que tiene una o más primeras paredes laterales, una superficie inferior, y un espacio de cultivo que está formado en un interior del recipiente de cultivo, y
una tapa (2) configurada para acoplarse al recipiente de cultivo, en el que
el espacio de cultivo está configurado para recibir una membrana para crecimiento de células y de tejido en la superficie inferior del recipiente de cultivo, caracterizado por el hecho de que
la tapa (2) comprende primeros conectores de tapa (6) y las primeras paredes laterales (22) del recipiente de cultivo (20) comprenden primeros conectores de recipiente (22a) que están adaptados para acoplarse a los primeros conectores de tapa (6) de manera que, en funcionamiento, los primeros conectores de la tapa (6) presionan la membrana contra la superficie inferior del recipiente de cultivo para evitar que la membrana (24) se mueva.
2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los primeros conectores de recipiente (22a) comprenden un nervio macho y los primeros conectores de tapa (6) comprenden un clip de sellado hembra configurado para encajar a presión sobre el nervio.
3. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el clip de sellado hembra comprende dos salientes configurados para encajar a presión alrededor de una parte de bulbo en el nervio, en el que uno de los salientes presiona la membrana contra la superficie inferior del recipiente de cultivo (20).
4. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, caracterizado por el hecho de que los primeros conectores de tapa (6) están dispuestos formando un ángulo de 90 grados respecto a un plano definido por la superficie del fondo del recipiente de cultivo (20).
5. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado por el hecho de que el recipiente de cultivo (20) comprende, además, una o más segundas paredes laterales (23) que se extienden entre una parte superior e inferior del recipiente de cultivo (20), en el que las segundas paredes laterales (23) están dispuestas radialmente hacia fuera respecto a las primeras paredes laterales (22).
6. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que una altura de las primeras paredes laterales es menor que una altura de las segundas paredes laterales (23).
7. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 - 6, caracterizado por el hecho de que las primeras paredes laterales (22) y las segundas paredes laterales (23) están formadas integralmente con el recipiente de cultivo (20).
8. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, caracterizado por el hecho de que, durante el funcionamiento, la unión entre los primeros conectores de tapa (6) y los primeros conectores de recipiente (22a) define un primer sellado de manera que el primer sellado proporciona estanqueidad al agua y al aire.
9. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado por el hecho de que la tapa (2) comprende, además, segundos conectores de tapa (7) y las segundas paredes laterales (23) del recipiente de cultivo comprenden segundos conectores de recipiente (23a) que están adaptados para acoplarse a los segundos conectores de tapa (7).
10. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que los segundos conectores de recipiente (23a) comprenden uno o más salientes verticales, presentando los salientes unas protuberancias en sus extremos, o cerca de los mimos, y en el que los segundos conectores de tapa (7) están configurados para acoplarse a los salientes encajando a presión sobre las protuberancias.
11. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 - 10, caracterizado por el hecho de que, en funcionamiento, la unión entre los segundos conectores de tapa (7) y los segundos conectores de recipiente (23a) definen un segundo sellado de manera que el segundo sellado proporciona estanqueidad al agua y al aire.
12. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -11, caracterizado por el hecho de que la tapa (2) es una tapa sustancialmente cuadrada y el recipiente de cultivo es un recipiente de cultivo sustancialmente cuadrado, en el que los elementos de acoplamiento están configurados para un movimiento axial de la tapa respecto al recipiente durante el acoplamiento.
13. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, caracterizado por el hecho de que la tapa comprende, además, uno o más puertos de acceso para acceder al espacio de cultivo.
14. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que uno o más de los puertos de acceso (8-10) son adecuados para el intercambio de gases en el espacio de cultivo y/o uno o más de los puertos de acceso son adecuados para la extracción e introducción de un líquido en el espacio de cultivo y/o uno o más de los puertos de acceso son adecuados para controlar la presión en el interior del dispositivo
15. Kit para el cultivo de membranas celularizadas, que comprende un dispositivo para el cultivo de membranas celularizadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, y comprendiendo, además, una o más válvulas "luer-lock".
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