ES2899002T3 - Nuevos derivados y su uso como inhibidores selectivos de Caspasa-2 - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I): **(Ver fórmula)** en donde: - Z1 es un grupo alquilo (C1-C6); - P5 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** - P1 y P4, idénticos o diferentes, se seleccionan de los siguientes residuos de aminoácidos **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** en el que Z2 y Z3, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo (C1-C6); - P3 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos **(Ver fórmula)** - R1 se selecciona de **(Ver fórmula)** - R2 se selecciona de **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** en el cual - m es 0, 1 o 2; - p es 1, 2, 3 o 4; - Z4 es un átomo de halógeno; y - Z8 y Z9, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de halógeno y un grupo alquilo (C1-C6); o una de sus sales; estando dicho compuesto de fórmula (I) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevos derivados y su uso como inhibidores selectivos de Caspasa-2
La presente invención se refiere a nuevos compuestos que son útiles como inhibidores selectivos de Caspasa-2. Esta invención también se refiere al uso terapéutico de estos compuestos.
Las caspasas son una familia de endoproteasas intracelulares que utilizan un residuo de cisteína al inicio de la escisión de los sustratos peptídicos. Se sabe que tienen importantes implicaciones en la regulación de la inflamación, así como un papel crucial en el control de la muerte celular programada por apoptosis.
Las caspasas se clasifican en dos grupos principales: aquellos implicados en la regulación de procesos inflamatorios (-1, -4, -5, -11, -12) y aquellos que son fundamentales para el inicio y ejecución de la apoptosis. Hay dos grupos entre las caspasas apoptóticas, los "iniciadores" que tienen un pro-dominio N-terminal largo (Caspasa-2, - 8 , -9, -10) y aquellos con un pro-dominio corto (residuos 20-30) que son los "ejecutores" de la apoptosis (Caspasa-3, - 6 , -7). Las caspasas implicadas en la inflamación y el inicio de la apoptosis tienen unidades estructurales implicadas en la transducción de la señal apoptótica, tales como "Dominio Efector de Muerte" (DED) y "Dominio de Reclutamiento de Caspasa" (CARD). Cada uno de estos dominios permite la interacción homotípica con otras proteínas asociadas.
Las propiedades enzimáticas de las caspasas se rigen por la existencia de una díada catalítica (cisteína, histidina) donde la cisteína actúa como nucleófilo para el inicio de la escisión de los enlaces peptídicos. El sitio activo de las caspasas está altamente conservado, con la cisteína catalítica incluida en una secuencia peptídica QACXG (donde X es arginina (R), glutamina (Q) o glicina (G)) y un subsitio básico S1, lo que les da especificidad por la escisión del sustrato después de un residuo de aspartato, que es único entre las proteasas de mamíferos, excepto la serina proteasa granzima B. Generalmente, las caspasas reconocen un motivo tetrapéptido, P1-P4 en N-ter del enlace escindible, reconocido respectivamente por los subsitios S1-S4 de la enzima. Las posiciones de aspartato posteriores (P'1 y P'2) también están implicadas en el reconocimiento y la especificidad frente a las Caspasas.
Las caspasas se han clasificado en tres grupos basándose en las secuencias de péptidos del sustrato que reconocen preferentemente. Las caspasas del grupo I (-1, -4 y -5) tienen preferencia por un residuo hidrófobo en P4. Mientras que las enzimas del grupo II (-2, -3, -7) tienen una fuerte preferencia por un aspartato en esta posición, el grupo III ( 6 , - 8 , -9, -10) favorece las pequeñas cadenas alifáticas P4. En el grupo II, la Caspasa-2 tiene una modalidad de reconocimiento única; de hecho, requiere el reconocimiento de un residuo en la posición P5 (preferiblemente una leucina, isoleucina, valina o alanina) para ejercer su actividad catalítica. Las Caspasa-3 y -7 también reconocen un residuo P5 de forma no obligatoria.
Originalmente llamado Nedd-2, "Célula precursora neural expresada con regulación negativa del desarrollo 2 " en ratones e Ich-1, "homólogo de ICE y CED3" en humanos, Caspasa-2, codificada por el gen CASP2 (chr. 7q34-q35), es el miembro más conservado de esta familia de enzimas. Su actividad está finamente regulada durante el desarrollo neuronal en humanos. Hay dos isoformas de la isoforma 2L proapoptótica de la Caspasa-2 y la isoforma 2S (truncada) antiapoptótica. La isoforma 2L es la forma predominante en la mayoría de los tejidos, pero la isoforma 2S se expresa a niveles similares en el cerebro, el músculo esquelético y el corazón.
La caspasa-2 actúa como una caspasa iniciadora que escinde de forma leve otras caspasas, pero puede iniciar la permeabilización de la membrana externa mitocondrial y regula diversas vías de señalización inducidas por el estrés, que incluyen choque térmico, daño al ADN, estrés oxidativo de las mitocondrias y alteración del citoesqueleto.
Además de la apoptosis, la Caspasa-2 participa en la regulación del estrés oxidativo. Por ejemplo, los ratones Casp-2-/- ancianos muestran actividades reducidas de superóxido dismutasa y glutation peroxidasa. En algunas circunstancias específicas, la caspasa-2 puede actuar como un supresor de tumores. De hecho, bajo estrés oncogénico (como en el modelo de ratón transgénico E^-Myc), la deficiencia de Caspasa-2 potencia la tumorigénesis. Los datos recientes también sugieren que la caspasa-2 podría inhibir la autofagia.
Se descubrió que la inhibición genética de Caspasa-2 es neuroprotectora en ratones recién nacidos expuestos a desafíos hipóxico-isquémicos o excitotóxicos, lo que sugiere que la muerte celular mediada por Caspasa-2 podría contribuir a la fisiopatología de la lesión cerebral perinatal (Carlsson et al., Annals of Neurology 2011, 70 (5): 781 -9). Además, la inhibición genética de Caspasa-2 confiere neuroprotección ocular (Amhed Z et al., Cell Death Dis. 16 de junio de 2011; 2:e173).
En modelos celulares de la enfermedad de Alzheimer (Carol M. Troy et al. The Journal of Neuroscience, 15 de febrero de 2000, 20 (4): 1386-1392), La caspasa-2 es un efector clave de la muerte neuronal inducida por el péptido amiloide Ap (Ribe EM et al., Biochem J. 2012444 (3): 591-9).
Además, utilizando ratones transgénicos de proteína precursora amiloide, Pozueta et al. (Nat Commun. 2013; 4:1939) han demostrado que:
(i) Se requiere caspasa-2 para el deterioro cognitivo en este modelo animal de Alzheimer,
(ii) las neuronas del hipocampo cultivadas que carecen de Caspasa-2 son inmunes a los efectos sinaptotóxicos de Ap, y
(iii) la caspasa-2 es un mediador crítico en la activación de la vía de señalización RhoA/ROCK-II, que conduce al colapso de las espinas dendríticas.
lo que sugiere que la caspasa-2 es un factor clave de la disfunción sináptica en la enfermedad de Alzheimer.
La caspasa-2 también parece promover la obesidad, el síndrome metabólico y la enfermedad del hígado graso no alcohólico. De hecho, se ha demostrado que los ratones deficientes en Caspasa-2 estaban protegidos de estas condiciones (Machado MV et al. Cell Death Dis.18 de febrero de 2016; 7: e2096).
Las primeras generaciones de inhibidores de caspasas fueron péptidos aldehídos que inhiben reversiblemente caspasas. Se han desarrollado varias secuencias que supuestamente confieren efectos preferenciales frente a algunos miembros de la familia de las caspasas, incluyendo Ac-DEVD-CHO (un inhibidor preferencial de Caspasa-3 y Caspasa-7) y Ac-VDVAD-CHO (un inhibidor preferencial de Caspasa-2, -3 y -7).
En la segunda generación de inhibidores de caspasas, el grupo aldehído ha sido reemplazado por cetonas a sustituidas con un grupo fluorometilcetona (fink). Este tipo de inhibidor inactiva la enzima formando un aducto con la cisteína del sitio activo. Z (Benciloxoilcarbonilo)-VAD-fmk es un inhibidor de amplio espectro de esta generación. Estas moléculas son tóxicas in vivo, porque la liberación del grupo fluoroacetato, particularmente en el hígado, conduce a la inhibición de la aconitasa. Así, el desarrollo de inhibidores con un grupo fmk, fue abandonado en la fase preclínica debido a su hepatotoxicidad. Después se han sintetizado varios inhibidores de caspasa en la técnica (Poreba et al., Chem Rev.2015 25 de noviembre; 115 (22): 12546-629). En particular, se han informado compuestos capaces de inhibir la actividad de Caspasa-2, por ejemplo, en los documentos WO 2005/105829 y EP2670774. Sin embargo, estos inhibidores de Caspasa-2 conocidos también tienen una actividad demasiado alta con respecto a Caspasa-3. Por tanto, no pueden calificarse como inhibidores selectivos de la caspasa- 2 .
Más recientemente, se ha informado de una serie de inhibidores reversibles de la caspasa-2. Cuando se evaluó in vitro en caspasas recombinantes humanas, se encontró que estos compuestos inhiben preferentemente la caspasa- 2 , pero tienen efectos moderados en ensayos celulares y propiedades estructurales que son incompatibles con uso in vivo (Maillard et al., Biorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 5833-5851).
Por consiguiente, todavía existe la necesidad de inhibidores de Caspasa-2 potentes y selectivos, más particularmente con una actividad significativamente reducida contra Caspasa-3. En particular, sería muy ventajoso proporcionar inhibidores de Caspasa-2 más selectivos y eficientes para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o lesiones en las que está implicada la actividad de Caspasa-2, tales como isquemia cerebral neonatal, isquemia cardíaca y enfermedades crónicas degenerativas como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.
También sería muy ventajoso proporcionar inhibidores de Caspasa-2 más eficaces y selectivos para su uso como una sonda basada en actividad para detectar específicamente la actividad de Caspasa-2.
Los compuestos de la invención tienen como objetivo satisfacer estas necesidades.
Así, según uno de sus aspectos, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I):
en donde:
- Z 1 es un grupo alquilo (C1 -C6);
- P5 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos
- Pi y P4, idénticos o diferentes, se seleccionan de los siguientes residuos de aminoácidos
y
en el que Z2 y Z3 , idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo(C1-C 6 );
- P 3 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos
- R 1 se selecciona de
- R2 se selecciona de
en el cual
• m es 0, 1 o 2;
• p es 1,2, 3 o 4;
• Z4 es un átomo de halógeno;
• Z 8 y Z9, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de halógeno y un grupo alquilo (C1-C 6 );
o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (I) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
Después de una extensa investigación, el inventor ha descubierto que estos compuestos de fórmula (I) actúan como inhibidores selectivos y eficaces de la actividad Caspasa-2, como se demuestra en los siguientes ejemplos.
De hecho, los compuestos de la presente invención son mucho más eficaces para inhibir Caspasa-2 que para inhibir Caspasa-3.
En particular, como se muestra en los siguientes ejemplos, algunos compuestos de la invención presentan un efecto inhibidor sobre la Caspasa-2 al menos dos veces, preferiblemente al menos 5 veces, más preferiblemente al menos 10 veces, e incluso más preferiblemente al menos 15 veces mayor. que su efecto inhibidor sobre la caspasa-3. El efecto inhibidor de los compuestos de la invención con respecto a Caspasa-2 y Caspasa-3 puede evaluarse mediante enfoques cinéticos usando caspasas recombinantes humanas. Para inhibidores irreversibles, la relación kinact/KI se determina utilizando el método descrito en el ejemplo 2. Para inhibidores reversibles kI está determinado. Además, el hecho de que algunos de estos inhibidores sean irreversibles es muy ventajoso ya que este tipo de inhibidores pueden usarse en la supresión prolongada de Caspasa-2, limitada solo por la tasa normal de resíntesis de proteínas, también llamada recambio.
En el sentido de la presente invención:
- Un "Inhibidor de caspasa" pretende significar un compuesto que reduce o suprime la actividad de la caspasa diana, en comparación con dicha actividad determinada sin dicho inhibidor.
- Un "inhibidor selectivo de caspasa-2"pretende significar un compuesto que disminuye la actividad de Caspasa-2 más que la actividad de otras Caspasas, en particular Caspasa-3.
Por tanto, según un segundo aspecto, la invención se dirige a un compuesto de la invención para su uso como inhibidor selectivo de Caspasa-2.
Según una forma de realización, el radical R 2 de los compuestos de la invención se selecciona de
en el que m, p, Z 4 , Z 8 y Z 9 son los definidos anteriormente.
Estos compuestos se pueden introducir ventajosamente en una composición farmacéutica. Estos compuestos se pueden usar como un medicamento. Más particularmente, pueden usarse en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y/o lesiones en las que está implicada la actividad de Caspasa-2.
Para los propósitos de la presente invención, el término "prevención" significa reducir al menos en parte el riesgo de manifestación de un fenómeno dado, es decir., en la presente invención, una enfermedad y/o lesión en la que está implicada la actividad de Caspasa-2. Una reducción parcial implica que el riesgo permanece, pero en menor medida que antes de implementar la invención.
Para los propósitos de la presente invención, el término "tratamiento" pretende significar curar total o parcialmente un fenómeno dado, es decir., en la presente invención, una enfermedad y/o lesión en la que está implicada la actividad de Caspasa-2, que incluye disminuir, minimizar o reducir dicho fenómeno dado.
Por tanto, de acuerdo con un tercer aspecto, la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde R2 se selecciona de
en el que m, p, Z4, Zs y Z9 son como se definen en la fórmula (I).
Según un cuarto aspecto, la invención se dirige a un compuesto de la invención para su uso como un medicamento, en el que R2 se selecciona de
en el que m, p, Z4, Z 8 y Z9 son como se definen en la fórmula (I).
Según un quinto aspecto, la invención se dirige a un compuesto de la invención para su uso en la prevención y/o tratamiento de patologías con muerte celular, en donde R2 se selecciona de
en el que m, p, Z4 , Zs y Z9 son como se definen en la fórmula (I).
En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas y fórmulas empíricas:
- Boc Terc-butiloxicarbonilo
- °C Grado Celsius
- Me Metilo
- Bn Bencilo
- AMC 7-amino-4-metilcumarina
- PBS Solución salina tamponada con fosfato
- Ac Acetilo
- RFU Unidades de fluorescencia relativa
- HEPES 4- Ácido (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico
- DTT Ditiotreitol
- EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
- CHAPS (3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propanosulfonato)
- DMSO Dimetilsulfóxido
De acuerdo con la nomenclatura estándar de polipéptidos (J. Biol. Chem., 243: 3552 - 59 (1969).)) Las abreviaturas de los residuos de aminoácidos utilizadas en la presente invención son las siguientes:
- A Alanina
- V Valina
- D Ácido aspártico
- E Ácido glutámico
Debe observarse además que en todas las secuencias de residuos de aminoácidos que se representan en la presente invención mediante el uso de las abreviaturas mencionadas anteriormente, la orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxi.
Por consiguiente, parece claramente que en una fórmula que define un péptido según la invención, cuando se indica una secuencia de aminoácidos como R1-P5P4P3- o -P1-R2:
(i) la parte
del residuo de aminoácido P5 está unido a R1;
el uno del residuo de aminoácido P4 está unido al residuo de aminoácido P5;
el uno del residuo de aminoácido P3 está unido al residuo de aminoácido P4; y
el uno del residuo de aminoácido P1 está unido a
en el opuesto de R2 como se representa en la fórmula (I); y
(ii) la parte
del residuo de aminoácido P5 está unido al residuo de aminoácido P4;
el uno del residuo de aminoácido P4 está unido al residuo de aminoácido P3;
el uno del residuo de aminoácido P3 está unido al
en el opuesto del residuo de aminoácido P4 como se representa en la fórmula (I); y
el uno del residuo de aminoácido P1 está unido a R2.
Otras características y ventajas de la invención se desprenderán más claramente de la descripción, los ejemplos que siguen se dan a modo de ilustración no limitativa y de la figura 1.
La figura 1 representa un gráfico que muestra el porcentaje de células muertas en función del tratamiento aplicado a las células analizadas (situaciones A a E en donde la vinctistina se aplica sola (20 nM) a las células (situación A) o en combinación con varias cantidades de compuesto 2 según la invención (respectivamente 3, 10, 30 y 60 pM para las situaciones B, C, D y E) y control (sin tratamiento)). (% ± S.D.; n = 3)
COMPUESTOS DE LA INVENCION
Como se mencionó anteriormente, los compuestos según la invención corresponden a la fórmula general (I):
en donde:
- Z 1 es un grupo alquilo (C1-C6);
- P5 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos
- P1 y P4 , idénticos o diferentes, se seleccionan de los siguientes residuos de aminoácidos
en el que Z2 y Z3 , idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo (C1-C 6 );
- P 3 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos
- Ri se selecciona de
- R 2 se selecciona de
y en que
• m es 0 , 1 o 2 ;
• p es 1,2, 3 o 4;
• Z4 es un átomo de halógeno;
• Z 8 y Z9, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de halógeno y un grupo alquilo (C1-C6); o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (I) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
Por consiguiente, los compuestos de la invención comprenden varios átomos de carbono asimétricos. Por tanto, pueden existir en forma de enantiómeros o diastereoisómeros. Estos enantiómeros y diastereoisómerost también sus mezclas, incluidas las mezclas racémicas, forman parte de la invención.
Los compuestos de la invención también pueden existir en forma de bases o de sales de adición de ácido. Estas sales pueden prepararse con ácidos farmacéuticamente aceptables, pero las sales de otros ácidos que son útiles, por ejemplo, para purificar o aislar los compuestos de fórmula (I) también forman parte de la invención.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa lo que es útil para preparar una composición farmacéutica generalmente segura, no tóxica y ni biológica ni de otro modo indeseable e incluye lo que es aceptable para uso farmacéutico tanto veterinario como humano.
Los compuestos de la invención también pueden existir en forma de hidratos o solvatos, es decir. en forma de asociaciones o combinaciones con una o más moléculas de agua o con un disolvente. Tales hidratos y solvatos también forman parte de la invención.
En el contexto de la presente invención, se aplican las siguientes definiciones:
- un átomo de halógeno: un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Los átomos de halógeno pueden ser más particularmente átomos de flúor.
- Ct-Cz : una cadena a base de carbono que posiblemente contenga de t a z átomos de carbono en la que t y z pueden tomar valores de 1 a 10; por ejemplo, C1-C3 es una cadena a base de en carbono que posiblemente contiene de 1 a 3 átomos de carbono.
- un alquilo: un grupo alifático saturado lineal o ramificado, que comprende en particular de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos que se pueden mencionar incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, tercbutilo, pentilo, neopentilo, etc.
- un alcoxi: un radical -O-alquilo en el que el grupo alquilo es como se definió previamente.
- un arilo: un grupo aromático monocíclico o bicíclico que contiene entre 5 y 10 átomos de carbono, en particular entre 6 y 10 átomos de carbono. A modo de ejemplos de grupo arilo, se puede citar el grupo fenilo o naftilo. Preferiblemente, el grupo arilo es fenilo.
Entre los compuestos de fórmula general (I) según la invención, un subgrupo de compuestos está constituido por los compuestos de fórmula (II):
en donde:
- R 1 , R 2 y Z 1 son como se definen en la fórmula (I);
- R 3 se selecciona de un grupo -CH 3 , a -CH (CH3)2, a -CH 2 CH (CH3)2 y un -CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 ;
- A y B, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de nitrógeno y un grupo -CH-;
- R 5 y R 6 , idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo (C 1 -C 6 ); y - R 4 se selecciona de un grupo -CH 3 , a -CH (CH3)2, a -CH 2 CH (CH3)2, a -CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 y a - (CH 2 ) 2 CO 2 H; o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (II) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
Preferiblemente, en la fórmula (II), al menos uno de A y B es un grupo -CH, más preferiblemente, A y B son grupos -CH.
Según un modo preferido de la invención, los compuestos según la invención pueden ser de fórmula
o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (III) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
Según una forma de realización preferida, los compuestos según la invención pueden ser de fórmula (IV):
en donde R 1 y R 2 son como se definen en la fórmula (I);
o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (IV) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
Según otra realización preferida más, en la fórmula (I), (II), (III) y/o (IV), R 1 es
Según otra realización preferida, en la fórmula (I), (II), (III) y/o (IV), R 2 se selecciona de
en el que Z 'es un átomo de flúor
Preferiblemente, R2 es
Según aún una realización preferida, los compuestos según la invención tienen al menos uno, preferiblemente al menos tres átomos de carbono asimétricos de configuración (S). Más preferiblemente, todos los átomos de carbono asimétricos de los compuestos según la invención son de configuración (S).
Entre los compuestos de fórmula general (I) según la invención, se pueden citar especialmente los siguientes compuestos:
1
Preferiblemente, el compuesto de fórmula general (I) es:
PREPARACION DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION
Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante síntesis orgánica y de péptidos. El ensamblaje de la estructura por síntesis de péptidos pertenece al conocimiento general del experto en la materia y se describen más detalles en Linton et al., J. Med. Chem. 2005, 48, 6779-6782 y en Chauvier et al. Cell Death Dis 2011,2: e203. Los precursores de R1, R2 , P1, P3 , P4 y P5 que conducen a los compuestos de la invención se introducen en las diferentes etapas del proceso.
El precursor puede ser tanto un producto comercial como un producto comercial que se ha funcionalizado según los protocolos bien conocidos para el experto en la materia. Se pueden hacer más detalles y referencias a "Design of Caspase inhibitors as potential clinical agents; CRC press; CRC Enzyme inhibitors series, Edired by Tom O’Brien & Steven D. Linton capítulo 7 por BR Ullman.
En particular, el ejemplo 1 de la presente invención ilustra el protocolo de preparación del compuesto 2 según la invención.
APLICACIONES
Como se ha especificado previamente y claramente ilustrado por los siguientes ejemplos, los compuestos de acuerdo con la presente invención son útiles como inhibidores selectivos de Caspasa-2.
De hecho, como se señala en los ejemplos, muestran un efecto inhibidor mucho mejor para Caspasa-2 que para Caspasa-3. Como consecuencia, son eficientes para inhibir selectivamente Caspasa-2 con respecto a Caspasa-3 en un ensayo in vitro.
Campo terapéutico
En vista de lo anterior, los compuestos de la presente invención, y más particularmente los compuestos para los que el radical R2 se selecciona de
y
en el que m, p, Z4, Zs y Z9 son como se definieron anteriormente,
puede utilizarse en el campo terapéutico.
Según uno de sus aspectos, la presente invención se refiere por tanto a un compuesto de la invención en el que R2 es como se ha definido anteriormente, para su uso como un medicamento, en particular un medicamento destinado a inhibir selectivamente la actividad de Caspasa-2.
En otros términos, la invención se refiere al uso de un compuesto según la invención en el que R2 es como se definió anteriormente para la preparación de una medicina, en particular de un fármaco para inhibir selectivamente la actividad de Caspasa-2.
En otras palabras, la presente invención se refiere a un medicamento que comprende al menos un compuesto según la invención en el que R2 es como se definió anteriormente, en particular un medicamento para inhibir selectivamente la actividad de Caspasa-2.
Por tanto, según otro de sus aspectos, la invención se dirige a un compuesto de la invención en donde R2 es como se definió anteriormente, para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o lesiones en las que está implicada la actividad de Caspasa-2.
En otros términos, la invención se refiere al uso de un compuesto según la invención en el que R2 es como se definió anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a prevenir y/o tratar enfermedades y/o lesiones en las que está implicada la actividad de Caspasa-2.
En particular, dichas enfermedades y/o lesiones pueden seleccionarse entre patologías con muerte celular, particularmente entre:
- enfermedades crónico degenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson;
- daño cerebral neonatal, en particular isquemia cerebral neonatal;
- lesión cerebral traumática;
- isquemia renal;
- lesiones por hipoxia-isquemia (H-I);
- situaciones similares a accidentes cerebrovasculares lesiones cerebrales;
- isquemia cardíaca;
- infarto de miocardio;
- esclerosis lateral amiotrófica (ELA);
- daños retinianos;
- enfermedades oftálmicas tales como neuropatía óptica isquémica y glaucoma;
- daños en la piel;
- enfermedades inflamatorias estériles tales como diabetes, aterosclerosis, isquemia cardíaca, gota, pseudogota, aflojamiento de las articulaciones, aterosclerosis, síndromes desencadenados por sales de aluminio, neuropatía óptica isquémica no arterítica (NAION), glaucoma, enfermedades metabólicas;
- enfermedades inflamatorias no estériles tales como infección bacteriana, en particular con bacterias que producen toxinas formadoras de poros, infección por virus de la influenza e infección por ARN monocatenario (ss) por Rhabdoviridae tales como virus Maraba o virus de la estomatitis vesicular (VSV);
- enfermedades causadas por bacterias patógenas, tales como Brucella, Staphylococcus aureus y Salmonela;
- obesidad;
- síndrome metabólico; y
- enfermedad del hígado graso no alcohólico.
Más particularmente, dichas enfermedades y/o lesiones se seleccionan de enfermedades crónico degenerativas. Preferiblemente, se eligen entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson, más específicamente la enfermedad de Alzheimer.
Según otro más de sus aspectos, la invención se dirige a un método para prevenir y/o tratar enfermedades y/o lesiones en las que está implicada la actividad de Caspasa-2, que comprende al menos una etapa de administrar a un individuo que lo necesite al menos una cantidad eficaz de al menos un compuesto de acuerdo con la invención, en el que R 2 es como se definió anteriormente.
Según otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto según la invención en el que R 2 es como se definió anteriormente, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener más particularmente una dosis eficaz de al menos un compuesto según la invención en el que R 2 es como se definió anteriormente.
Un "dosis eficaz” significa una cantidad suficiente para inducir una modificación positiva en la afección que se va a regular o tratar, pero lo suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves. Una dosis eficaz puede variar con el efecto farmacéutico que se obtenga o con la afección particular que se esté tratando, la edad y la condición física del usuario final, la gravedad de la afección que se esté tratando/previniendo, la duración del tratamiento, la naturaleza de otros tratamientos, el compuesto o composición específicos empleados, la vía de administración y factores similares.
Un compuesto de fórmula (I) según la invención en el que R 2 es como se definió anteriormente puede administrarse en una dosis eficaz mediante cualquiera de los modos de administración aceptados en la técnica.
En una realización, este compuesto puede usarse en una composición destinada a ser administrada por vía de inyección oral, nasal, sublingual, oftálmica, tópica, rectal, vaginal, uretral o parenteral.
La vía de administración y la formulación galénica serán adaptadas por un experto en la técnica de acuerdo con el efecto farmacéutico deseado.
Un experto en la técnica de las formulaciones terapéuticas podrá, sin experimentación indebida y basándose en el conocimiento personal, determinar una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención para una indicación determinada.
Una composición farmacéutica de la invención puede formularse con cualquier excipiente conocido adecuado farmacéuticamente aceptable de acuerdo con la dosis, la forma galénica, la vía de administración y similares.
Como se usa en este documento, "excipientes farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. Excepto en la medida en que cualquier excipiente convencional sea incompatible con los compuestos activos, se contempla su uso en un medicamento o composición farmacéutica de la invención.
Un medicamento o composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de tabletas, píldoras, polvos, pastillas, sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles, sprays, pomadas, geles, cremas, barras, lociones, pastas, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles, envases estériles en polvo y similares.
Según una realización, una composición farmacéutica de la invención puede estar destinada a administrarse por separado, secuencial o simultáneamente con un agente útil para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad, en particular la enfermedad de Alzheimer, siendo dicho agente diferente del compuesto de fórmula (I) de la invención.
La presente invención se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos y la figura 1 que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera de la presente invención.
EJEMPLO 1: preparación del compuesto 2 según la invención
La síntesis de compuesto 2 según la invención se inspira en el proceso de preparación del compuesto TRP601 representado a continuación:
La síntesis de TRP601 se describe en D. Chauvier et al. Cell Death and Disease (2011) 2, e203.
El compuesto 2 de la presente invención se diferencia de TRP601 por que:
- los residuos de aminoácidos P 1 y P 4 están representados por
en lugar de
en TRP601; y
- hay un radical
en lugar de
en TRP601.
Por tanto, el compuesto 2, se ha obtenido mediante la reproducción de las etapas descritos en el artículo mencionado anteriormente para conducir a TRP601 excepto que:
- el precursor
se ha utilizado en lugar de
para presentar la Pi y P 4 residuos de aminoácidos; y
- el precursor
se ha utilizado en lugar de
El precursor de la P 1 y P 4 Los residuos de aminoácidos se han preparado a partir del ácido (S)-aspártico disponible comercialmente en el que la función amina ha sido protegida por un grupo Boc según un protocolo bien conocido por el experto en la materia.
El precursor de
ha sido obtenido según Herdeis C Hubmann H Tetrahedron: Asymetry 1992, 3:1213 y X se obtuvo como se describe por Maillard et al., En Biooganic & Medicinal Chemistry 19 (2011): 5833-5851.
Los otros componentes básicos del compuesto 2 se han introducido de la misma manera que para TRP601 en las publicaciones mencionadas, es decir, con los mismos reactivos, en las mismas condiciones y con las mismas cantidades.
El Compuesto 2 se ha obtenido así con un rendimiento superior al 90% y caracterizado por HPLC.
EJEMPLO 2: Ensayos (in vitro) de inhibición de Caspasa-2 y Caspasa-3
La eficiencia del compuesto 2 de la invención para inhibir Caspasa-2 y Caspasa-3 se ha evaluado utilizando el protocolo explicado a continuación.
La eficiencia del compuesto A2Me-TRP601 comparativo, que es un inhibidor de caspasa del grupo II ya conocido (inhibidor de Caspasa-2, Caspasa-3 y Caspasa-7), se ha evaluado mediante un protocolo similar descrito en Chauvier et al., 2011 Cell Death Dis 2011,2: e203.
Estos dos compuestos probados se representan a continuación:
En este ejemplo, la Caspasa-2 y Caspasa-3 son enzimas activas recombinantes humanas que son proporcionadas respectivamente por Enzo Life® (ALX-201-057-U100) y R&D Systems® (707-C3-010/CF).
La caspasa-2 se usa a una concentración final de 0,1 nM en un "tampón de caspasa-2" que contiene HEPES 20 mM (pH 7,4), DTT 5 mM, EDTA 2 mM, CHAPS al 0,1% y succinato 800 mM. La caspasa-3 se usa a una concentración final de 0,5 nM en un "tampón de caspasa-3" que contiene HEPES 20 mM (pH 7,4), CHAPS al 0,1%, DTT 5 mM y EDTA 2 mM.
Los sustratos peptídicos utilizados para las mediciones de la actividad enzimática son Ac-DEVD-AMC y Ac-VDVAD-AMC comercializados por EnzoLife® (referenciados respectivamente ALX-260-031-M005 y ALX-260-060-M005). Son fluorogénicos debido a la presencia de su grupo terminal AMC (7-amino-4-metilcumarina). La liberación de AMC permite seguir la actividad enzimática en la unidad de fluorescencia RFU a lo largo del tiempo en una microplaca de 96 pocillos (COSTAR 3915).
Los valores de fluorescencia se miden a 37 °C con un espectrofluorómetro con lector de microplacas BMG FLUOstar OPTIMA. Este aparato es accionado por el software Biolise® y está equipado con un dispositivo de enfriamiento termoeléctrico por efecto Peltier. El análisis matemático de los datos experimentales se realiza con el software Kaleidagraph®.
Las propiedades inhibidoras de los compuestos ensayados se evalúan mediante la determinación de la relación kinact/Ki con respecto a Caspasa-2 o Caspasa-3 en donde:
- kinact es la constante de tasa de inactivación máxima, y
- Ki es la constante de disociación según:
que refleja la afinidad del inhibidor con respecto a una enzima.
Por consiguiente, cuanto mayor sea la relación, más eficaz será el inhibidor.
Dicha relación se mide según el método continuo (Allison RD. Curr Protoc Protein Sci. Mayo de 2001; Capítulo 3: Unidad 3.5.; Chauvier et al., 2011 Cell Death Dis 2: e203; Tan y col., J Med Chem 2015, 58: 598-312).
Brevemente, las actividades de las caspasas se determinaron controlando la hidrólisis de sustratos fluorogénicos (Aexc = 355 nm, Aem = 460 nm) en función del tiempo, en presencia de caspasas no tratadas (control) o caspasas que habían sido incubadas con un compuesto de prueba, durante 30 min como mínimo a 37 °C utilizando un lector de microplacas BMG Fluostar (microplacas negras de 96 pocillos) y la velocidad inicial (V 0 ) se determinó a partir de la parte lineal de la curva de progreso.
Los sustratos y compuestos se disolvieron previamente en DMSO a 10 mM, manteniendo la concentración final de disolvente en un 4% (v/v) inferior. V0, velocidades relativas, Km y IC50 se determinaron a partir de datos experimentales utilizando el software Mars datas Analysis 2.0 y Kaleidagraph.
Para los inhibidores irreversibles, la inactivación se puede representar mediante el esquema cinético mínimo, donde E e I son las formas libres de enzima e inhibidor, E*I una quimera cinética del complejo de Michaelis y E-I el complejo covalente o enzima inactivada.
Ki k3
E I E*l -> E-l
La afinidad de unión al inhibidor (constante de disociación, KI) y la constante de velocidad de primer orden (k3) se determinaron los parámetros para Caspasa-2 y Caspasa-3 utilizando el método de la curva de progreso. La relación k3/K i se obtuvo ajustando los datos experimentales a las ecuaciones (F.U., unidad de fluorescencia):
f l „ — Vn X e
F.U. =
j
Jo v¡
d i F.U.0-----------------+ F.U,0
n
71 = - f-c-¡-x--- [-I]-' 
K, + [I]con 1 y
Los ajustes de regresión lineal y no lineal de los datos experimentales a las ecuaciones se realizaron con el software Kaleidagraph.
Determinación de la relación kinact/Ki para la actividad Caspasa-2 y Caspasa-3
Un método continuo de determinación de la relación k inact/K i se usó para evaluar la actividad inhibidora de los compuestos probados frente a Caspasa-2 y Caspasa-3.
La mezcla de reacción se prepara dejando que la enzima y el tampón se incuben a 37 °C.
Los compuestos inhibidores probados se preparan a diferentes concentraciones (1/4 IC50; 1/2 IC50; IC50; 2 IC50; 4 IC50) y poner en la microplaca.
Para el compuesto 2 según la invención, la concentración utilizada con respecto a la inhibición de:
- Caspasa-2 son 0; 0,1625; 0,3125; 0,625; 1,25 y 2,5 nM; y
- Caspasa-3 son 6,25; 12,5; 25; 50 y 100 nM.
Para el compuesto A2Me-TRP-601 (compuesto comparativo), la concentración utilizada con respecto a la inhibición de:
- Caspasa-2 son 0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 y 2,5 nM; y
- Caspasa-3 son 0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 y 2,5 nM.
Después, la mezcla de reacción que comprende la enzima, el tampón y el sustrato se añade rápidamente a los pocillos. Las actividades de la enzima se miden entre 45 y 60 minutos.
Las curvas de RFU (Unidades de fluorescencia relativa) = f (tiempos) se trazan para cada concentración de molécula probada según la siguiente ecuación:
( ( ( ( - V o ) * ( e x p ( - k o b s * m O ) ) ) V o ) / k 0b s * ) R F U o
en la que:
- V0 corresponde a la tasa inicial (RFU.s -1 ) en la concentración de 0 del compuesto inhibidor ensayado;
- kobs es velocidad de inactivación constante;
- RFU0 es el valor de fluorescencia en t = 0 min; y
- m0 es la variable es decir, la concentración de inhibidor.
Se hace un ajuste de la curva f ([I]) = kobs en una hipérbole utilizando el software Kaleigagraph para obtener la relación kinact/k i sobre la base de la siguiente ecuación:
K obs = kinact x [ I ] / ( K l X [ I ] )
Las relaciones l kinact/K i así obtenido se indican en la siguiente tabla.
De esta tabla parece claramente que el compuesto 2 es tan eficiente como A2Me-TRP601 para inhibir la caspasa-2. Sin embargo, estos dos compuestos reaccionan de manera totalmente diferente con respecto a la Caspasa-3. De hecho, compuesto 2 es 57 veces más eficaz para inactivar la Caspasa-2 que para inactivar la Caspasa-3.
Se puede notar que A2Me-TRP-601 no presenta esta selectividad.
Como conclusión, el compuesto 2 no solo es eficaz para inhibir la caspasa-2, sino que también es selectivo con respecto a la caspasa-2 con respecto a la caspasa-3.
EJEMPLO 3: ensayo de protección contra la muerte celular
En este ejemplo, el efecto protector del compuesto 2 de la invención contra la muerte celular inducida por vincristina (un alcaloide de la vinca) se prueba usando un ensayo de muerte celular por citometría de flujo bien conocido basado en tinción con yoduro de propidio.
a) . Modelo celular
Para evaluar el efecto protector del compuesto 2, se usa un modelo celular dependiente de Caspasa.
En este modelo se utilizan células HeLa humanas. Las células HeLa (línea celular de cáncer de cuello uterino) se obtuvieron de American Type Cell Collection (ATCC) y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, High Glucose, GlutaMAX™, Pyruvate) (Gibco, Life Technologies), complementado con FCS al 10%. y antibióticos (Gibco, Life Technologies).
Las células HeLa humanas se tratan con vincristina (Sigma Aldrich) solubilizada en agua a 5 mM. La vincristina actúa en parte uniéndose a la proteína tubulina, impidiendo que la célula separe sus cromosomas durante la metafase; la célula después sufre apoptosis.
El yoduro de propidio (PI) (Sigma Aldrich) se utiliza para evaluar la permeabilización de la membrana plasmática, un signo de muerte celular.
b) . Condiciones de tratamiento y marcado
24 horas antes del tratamiento farmacológico, las células HeLa se sembraron en placas de 24 pocillos. Después se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron con PBS y el medio fresco que contenía el compuesto 2 a diferentes concentraciones (3, 10, 30 y 60 pM) se añadió 1 hora antes de la adición de vincristina. Las células se expusieron o no (control) a vincristina 20 nM durante 48 horas.
Se recoge el contenido de cada pocillo (sobrenadante productos de tripsinización) se añade a PBS y después se centrifuga (900 rpm; 5 min).
El sedimento obtenido se coloca en 300pL de un medio que comprende yoduro de propidio y se incuba (37 °C, 5% CO2) en la oscuridad durante 5 minutos y después se somete a análisis de citometría de flujo.
c) . Análisis de células
A continuación, las células se analizan mediante citometría de flujo con una excitación de 561 nm.
La clasificación de células activadas por fluorescencia se realizó usando un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA). Para cada muestra, los datos de 5.000 células se registraron y analizaron con el software CellQuest Pro™ (Becton Dickinson). El análisis incluyó los parámetros FSC (Forward Scatter/relacionado con el tamaño de las celdas) y SSC (Side Scatter/relacionado con la granularidad de las celdas) junto con los canales FL-1 y FL-3.
Las concentraciones de vincristina y del compuesto 2 se indican en la siguiente tabla para cada tratamiento que se ha aplicado a las células.
El porcentaje de células positivas a yoduro de propidio proporciona una estimación de la muerte celular. Los resultados se muestran en la figura 1, donde los histogramas representan la media de 3 experimentos independientes. Cada valor experimental corresponde al análisis de citometría de flujo de 5000 células.
La composición de control, que no contiene vincristina ni inhibidor, permite estimar la cantidad de células que murieron naturalmente.
La composición A, que contiene vincristina pero no inhibidor, proporciona el número total de células muertas que corresponde a la suma de células muertas naturalmente y de células apoptóticas inducidas por vincristina.
Por tanto, de estos resultados se desprende claramente que el compuesto 2 protege las células contra la muerte apoptótica inducida por vincristina de una manera dependiente de la dosis.
Claims (14)
1. Un compuesto de fórmula (I):
en donde:
- Z 1 es un grupo alquilo (C 1 -C 6 );
- P 5 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos
P 1 y P 4 , idénticos o diferentes, se seleccionan de los siguientes residuos de aminoácidos
en el que Z2 y Z3 , idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo (C1-C6);
- P3 se selecciona de los siguientes residuos de aminoácidos
R 1 se selecciona de
R 2 se selecciona de
• m es 0, 1 o 2;
• p es 1,2, 3 o 4;
• Z4 es un átomo de halógeno; y
• Z 8 y Z9, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de halógeno y un grupo alquilo (C1-C6); o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (I) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
2. Compuesto según la reivindicación 1 de fórmula (II):
en donde:
- R 1 , R 2 y Z 1 son como se definen en la fórmula (I) según la reivindicación 1;
- R 3 se selecciona de un grupo -CH 3 , a -CH (CH3)2, a -CH 2 CH (CH3)2 y -CH (CH3) CH2CH3;
- A y B, idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de nitrógeno y un grupo -CH-;
- R 5 y R 6 , idénticos o diferentes, se seleccionan entre un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo(C 1 -C 6 ); y - R 4 se selecciona de un grupo -CH 3 , a -CH (CH3)2, a -CH 2 CH (CH3)2, a -CH (CH3) CH2CH3 y a - (CH 2 ) 2 CO 2 H; o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (II) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
3. Compuesto de fórmula (II) según la reivindicación 2, en donde al menos uno de A y B es un grupo -CH, preferiblemente A y B son grupos -CH.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores de fórmula (III):
en donde Ri, R 2 y Zi son como se definen en la fórmula (I) según la reivindicación 1;
o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (III) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores de fórmula (IV):
en donde R 1 y R 2 son como se definen en la fórmula (I) según la reivindicación 1; o una de sus sales;
estando dicho compuesto de fórmula (IV) en todas las formas posibles de isómeros racémicos, enantioméricos y diastereoisoméricos.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R 1 es
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R 2 se selecciona de:
en el que Z' es un átomo de flúor y j es 0, 1 o 2; preferiblemente, R 2 es
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene al menos uno, preferiblemente al menos tres átomos de carbono asimétricos de configuración (S), y más preferiblemente todos los átomos de carbono asimétricos de configuración (S).
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionado de:
preferiblemente, el compuesto es:
10. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para inhibir selectivamente la Caspasa-2 con respecto a Caspasa-3 en un ensayo in vitro.
11. Composición farmacéutica, que comprende al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso como medicamento.
13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en la prevención y/o tratamiento de patologías con muerte celular.
14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades crónico degenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson; daño cerebral neonatal, en particular isquemia cerebral neonatal; lesión cerebral traumática; isquemia renal; lesiones por hipoxia-isquemia (H-I); situaciones similares a accidentes cerebrovasculares lesiones cerebrales; isquemia cardíaca; infarto de miocardio; esclerosis lateral amiotrófica (ELA); daños retinianos; enfermedades oftálmicas tales como neuropatía óptica isquémica y glaucoma; daños en la piel; enfermedades inflamatorias estériles tales como diabetes, aterosclerosis, isquemia cardíaca, gota, pseudogota, aflojamiento de las articulaciones, aterosclerosis, síndromes desencadenados por sales de aluminio, neuropatía óptica isquémica no arterítica (NAION), glaucoma, enfermedades metabólicas; enfermedades inflamatorias no estériles tales como infección bacteriana en particular con bacterias que producen toxinas formadoras de poros, infección por virus de la influenza e infección por ARN monocatenario (ss) por Rhabdoviridae, tal como virus Maraba o virus de la estomatitis vesicular (VSV); enfermedades causadas por bacterias patógenas, como Brucella, Staphylococcus aureus y Salmonela; obesidad; síndrome metabólico; y enfermedad del hígado graso no alcohólico.
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