ES2896473T3 - Uso de SH3YL1 como marcador para el diagnóstico de nefropatía - Google Patents

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Abstract

Método para diagnosticar la nefropatía diabética que comprende medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en una muestra biológica, caracterizado por que la nefropatía diabética se identifica por un mayor nivel de expresión del gen SH3YL1 o proteína SH3YL1 en la muestra en comparación con una muestra de control normal.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de SH3YL1 como marcador para el diagnóstico de nefropatía
Campo técnico
La presente invención se refiere al uso de SH3YL1 como un marcador para el diagnóstico de nefropatía diabética. También se describe una composición para el diagnóstico de nefropatía, una micromatriz para el diagnóstico de nefropatía y un kit para el diagnóstico de nefropatía, comprende una sustancia que hace posible medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de una proteína que está codificada por el gen SH3YL1.
Antecedentes de la técnica
Entre las enfermedades renales, la nefropatía diabética, que es una de las complicaciones vasculares diabéticas, es la primera causa principal de enfermedad renal en fase terminal (ESRD). En Corea, los pacientes con insuficiencia renal terminal provocada por diabetes han aumentado constantemente del 30,8 % en 1996 al 42,3 % en 2006 y al 48,0 % en 2013. Esta situación sugiere que sugiere que la dieta, el ejercicio y las terapias con fármacos, que son terapias habituales conocidas hasta la fecha, no son apropiados y que se requieren diversos enfoques de la etiología, además de las terapias existentes para la diabetes y la nefropatía diabética.
En la actualidad, los inhibidores del sistema renina-angiotensina (RAS) se usan principalmente para prevenir que la nefropatía sea causada por la diabetes. Los inhibidores de RAS exhiben no solo efectividad hemodinámica, sino también un excelente efecto de protección de la función renal al inhibir la producción de citocina, quimiocina, factor de crecimiento y similares que inducen respuestas inflamatorias crónicas o fibrosis. Sin embargo, los efectos terapéuticos de los inhibidores de RAS están por debajo de las expectativas debido a propensiones genéticas diferentes entre pacientes, efectos secundarios provocados por la administración a largo plazo y resistencia a los agentes terapéuticos.
Además, aunque en los últimos años se han realizado amplios estudios sobre la identificación de las causas de la nefropatía y los métodos de diagnóstico y métodos terapéuticos contra la nefropatía, todavía no se ha desarrollado un agente terapéutico definitivo capaz de tratar eficazmente la nefropatía en fases tempranas. Por lo tanto, el tratamiento de la nefropatía diabética mediante la identificación en la fase temprana de la nefropatía diabética puede ser el método más eficaz.
La microalbuminuria (albúmina en orina de 24 h de 30-300 mg/día o tasa de excreción de albúmina de 20-200 pg/min) se usa lo más frecuentemente como un biomarcador que predice la progresión de la nefropatía diabética en la fase temprana y que predice complicaciones vasculares distintas de la nefropatía. De acuerdo con los estudios de monitorización existentes, la microalbuminuria no es solo un factor de riesgo que predice una tasa de filtración glomerular reducida, sino también un factor de riesgo independiente que progresa a insuficiencia renal crónica. Por estas razones, las directrices terapéuticas y diagnósticas actuales para la diabetes recomiendan la medición de la microalbuminuria.
Sin embargo, estudios recientes han informado que existe una limitación en el uso de microalbuminuria sola como un marcador para el diagnóstico temprano de la nefropatía y la determinación de la progresión de la nefropatía.
La primera razón es que la frecuencia de desaparición natural de la microalbuminuria en pacientes diabéticos es alta. La desaparición natural de la microalbuminuria se mostró con una frecuencia de aproximadamente el 21-64 % en pacientes diabéticos tipo 1 o tipo 2 con microalbuminuria. Adicionalmente, los resultados de estudios de seguimiento a gran escala de 10 años en pacientes diabéticos tipo 1 indicaron que la frecuencia de pacientes que progresaron a proteinuria prominente fue del 28 % y la frecuencia de pacientes con desaparición natural de microalbuminuria fue tan alta como el 40 %. Además, los estudios de seguimiento de 5 años en pacientes diabéticos tipo 1 que mostraron microalbuminuria continua en 2-3 mediciones durante 1 año han informado la desaparición de la microalbuminuria con una frecuencia del 64 % (Tabaei BP et al., Diabetes Care, 24;1560-1566, 2001; Perkins BA et al., N Eng J Med, 348:2285-2293, 2003, Hovind P et al. BMJ, 328:1105, 2004; Steinke JM et al., Diabetes, 54:2164-2171,2005; De Boer IH et al., Arch Intern Med, 171:412-420, 2011; Gaede P et al., Nephrol Dial Transplant, 19:1784-2788, 2004; Araki S et al., Diabetes, 54:2983-2987, 2005; Yamada T et al., Diabetes Care, 28:2733-2738, 2005; RJ Maclsaac et al, Kidney International, 86:50-57, 2014).
La segunda razón es que la frecuencia de pacientes diabéticos con función renal reducida (tasa de filtración glomerular <60 ml/min/1,73 m2) sin microalbuminuria es alta. De acuerdo con estudios realizados a principios de la década de 1990, los resultados del examen de tejidos en pacientes diabéticos tipo 1 con función renal reducida sin microalbuminuria indicaron que estaba presente un grupo de pacientes que mostraba nefropatía diabética típica y que el deterioro de la función renal progresó en aproximadamente el 30 % de los pacientes diabéticos tipo 1 y tipo 2. Además, los estudios de seguimiento en pacientes diabéticos tipo 2 han indicado que el deterioro de la función renal precedió a la aparición de microalbuminuria (Tsalamandris C et al., Diabetes, 43:649-655, 1994; Yokoyama H et al., Nephrol Dial Transplant, 24:1212-1219, 2009; Molith ME et al., Diabetes Care, 33:1536-1543,2010; Kramer HJ et al., JAMA, 289:3273-3277, 2003).
Cox, S.N., Sallustio, F., Serino, G., Pontrelli, P., Verrienti, R., Pesce, F., Torres, D.D., Ancona, N., Stifanelli, P., Zaza, G. y Schena, F.P., 2010. Altered modulation of WNT-p-catenin and PI3K/Akt pathways in IgA nephropathy. Kidney international, 78(4), pp.396-407, desvelan que el nivel de expresión del gen SH3YL1 es menor en la nefropatía por IgA.
El documento WO 2008/129265 A1 desvela métodos de diagnóstico para la nefropatía diabética usando el gen/proteína CCL18 como el biomarcador.
En consecuencia, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar un método novedoso capaz de diagnosticar precozmente la nefropatía y, como resultado, han descubierto que el nivel de expresión del gen SH3YL1 en la sangre del paciente con nefropatía o el nivel de la proteína SH3YL1 en la sangre aumenta significativamente en comparación con el de la sangre del paciente sin nefropatía, completando de esta manera la presente invención.
Divulgación de la invención
Problema técnico
Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para diagnosticar la nefropatía diabética de acuerdo con el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para proporcionar la información necesaria para el diagnóstico de nefropatía que comprende: medir y detectar el nivel de expresión del gen SH3YL1 y/o el nivel de la proteína SH3YL1.
Otro objeto más de la presente invención es el uso de una micromatriz para diagnosticar la nefropatía diabética detectando el nivel de expresión del gen SH3YL1 y/o el nivel de la proteína SH3YL1.
Otro objeto más de la presente invención es usar un kit para medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 y/o el nivel de la proteína SH3YL1 para diagnosticar precozmente la nefropatía diabética.
Solución técnica
Para conseguir el objeto anterior, la presente invención proporciona un método para diagnosticar la nefropatía diabética que comprende medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en una muestra biológica, caracterizado por que la nefropatía diabética se identifica por un mayor nivel de expresión del gen SH3YL1 o proteína SH3YL1 en la muestra en comparación con una muestra de control normal.
La presente invención también proporciona un método para proporcionar la información necesaria para el diagnóstico de nefropatía que comprende: tratar una muestra biológica, extraída de un paciente, con la composición anteriormente descrita para el diagnóstico de nefropatía para detectar el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en la muestra.
La presente invención también proporciona el uso de una micromatriz para el diagnóstico de nefropatía, que comprende inmovilizada sobre ella una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo.
La presente invención también proporciona el uso de un kit para el diagnóstico de nefropatía, que comprende un par de cebadores capaz de amplificar el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo, una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1 o un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a una proteína codificada por el gen SH3YL1.
La presente invención también proporciona un método para el diagnóstico de nefropatía, que comprende medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en una muestra biológica.
Las realizaciones de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones independientes 1, 4, 6 y 7. Las realizaciones preferidas de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones dependientes 2, 3 y 5.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 muestra la estructura de SH3YL1.
La FIGURA 2 muestra los resultados del análisis que indican que la expresión de SH3YL1 en las células aumenta por LPS.
La FIGURA 3 muestra los resultados de confirmar la secreción extracelular de SH3YL1 provocada por la estimulación de LPS en células HPMEC.
La FIGURA 4 muestra cambios en los niveles de SH3YL1 entre grupos de pacientes.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los métodos experimentales, que se describirán a continuación, son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
Convencionalmente, albúmina en urea, eGFR, UACR, creatina en sangre y similares se han usado como marcadores para el diagnóstico de nefropatías. Sin embargo, el diagnóstico mediante estos marcadores tenía un problema en el sentido de que es posible diagnosticar la nefropatía, sólo después de que se haya estropeado el 70 % o más del riñón.
En la presente invención, se examinaron con el fin de identificar los niveles de expresión de genes o los niveles de proteínas que están codificados por los genes que muestran una diferencia en la expresión entre tejido renal y tejido no renal. Como resultado, se descubrió que el gen SH3YL1 y/o la proteína SH3YL1 se sobreexpresaban en el tejido renal en comparación con el tejido no renal.
Particularmente, basándose en el descubrimiento de que el gen SH3YL1 y/o la proteína SH3YL1 se sobreexpresan en el tejido renal, se descubrió que el gen SH3YL1 y/o la proteína SH3YL1 pueden usarse como un biomarcador capaz de diagnosticar y predecir la aparición de nefropatía, y que una sustancia capaz de inhibir la expresión del gen SH3YL1 y/o el nivel de proteína SH3YL1 puede usarse para la prevención y el tratamiento de la nefropatía.
Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína SH3YL1" se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 % de la secuencia de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "gen SH3YL1" o "sh3yl 1", que es un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la "proteína SH3YL1", se refiere a un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 2 o un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una homología de secuencia de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 99 % de la secuencia de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "nivel de proteína SH3YL1" se refiere a la concentración in vivo o actividad de la proteína SH3YL1 y la expresión "nivel de expresión del gen SH3YL1" se refiere al nivel de expresión in vivo del "gen SH3YL1".
Como se usa en el presente documento, el término "diagnóstico" se refiere a la identificación de afecciones patológicas. Para el fin de la presente invención, el término "diagnóstico" se refiere a detectar la progresión de la nefropatía determinando si se expresó el marcador de diagnóstico de nefropatía. Además, el término "diagnóstico", como se usa en el presente documento, incluye determinar si se desarrolló nefropatía y el alivio de la nefropatía determinando si se expresó el marcador de diagnóstico de nefropatía y el nivel de expresión del marcador de diagnóstico de nefropatía.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se dirige a una composición para el diagnóstico de nefropatía, que comprende una sustancia que hace posible medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de una proteína que está codificada por el gen SH3YL1.
En un ejemplo de la presente invención, se mostró que, en las HAEC (células endoteliales aórticas humanas) y HPMEC (célula endotelial microvascular pulmonar humana) tratadas con el inductor de inflamación LPS, la expresión del gen SH3YL1 aumentó y la secreción extracelular de la proteína SH3YL1 aumentó.
En otro ejemplo de la presente invención, se comparó el nivel de expresión del gen SH3YL1 en la sangre de grupos de pacientes con nefropatía con diferentes valores de albuminuria y el nivel de proteína SH3YL1 en sangre con los de un grupo normal. Como resultado, pudo observarse que el nivel de expresión del gen SH3YL1 en los pacientes con nefropatía aumentó significativamente en comparación con el del grupo normal.
En la presente invención, el nivel de expresión del gen SH3YL1 puede seleccionarse del grupo que consiste en la presencia o ausencia de expresión, la cantidad de expresión y el patrón de expresión y el nivel de la proteína codificada por el gen SH3YL1 pueden seleccionarse del grupo que consiste en la presencia o ausencia, la cantidad de expresión y el patrón de expresión de la proteína.
En la presente invención, la sustancia que permite medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 puede ser un par de cebadores capaz de amplificar el gen SH3YL1 o una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1.
En la presente invención, un método para medir la cantidad de expresión del gen SH3YL1 o la cantidad de la proteína SH3YL1 puede seleccionarse del grupo que consiste en la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, transferencia Western, transferencia Northern, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), radioinmunoensayo (RIA), radioinmunodifusión y ensayo de inmunoprecipitación.
En la presente invención, "el nivel del gen SH3YL1" se refiere preferentemente al nivel de expresión de ARNm del gen SH3YL1, esto es, la cantidad de ARNm y las sustancias capaces de medir el nivel comprenden un cebador o sonda específico para el gen SH3YL1. En la presente invención, el cebador o sonda específicos para el gen SH3YL1 pueden ser un cebador o sonda capaz de amplificar específicamente la longitud completa del gen SH3YL1 representado por SEQ ID NO: 2 o una región específica del gen. El cebador o la sonda pueden diseñarse mediante un método bien conocido en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido monocatenario capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN dirigida por plantilla en condiciones apropiadas (es decir, en presencia de cuatro nucleósidos trifosfatos diferentes y un agente para la polimerización) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. La longitud apropiada del cebador puede variar de acuerdo con diversos factores, por ejemplo, temperaturas y el uso previsto del cebador. Además, no es necesario que el cebador sea perfectamente complementario a la secuencia exacta de una plantilla, pero debe ser lo suficientemente complementario para hibridar con la plantilla. Por lo tanto, el cebador de la presente invención no necesita ser perfectamente complementario a la secuencia de nucleótidos del gen SH3YL1 (plantilla) y debería ser suficientemente complementario para hibridar con la secuencia del gen. Además, el cebador de acuerdo con la presente invención puede usarse en una reacción de amplificación de genes.
Como se usa en el presente documento, la expresión "reacción de amplificación" se refiere a una reacción que amplifica moléculas de ácido nucleico. Tales reacciones de amplificación de genes son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), etc.
Como se usa en el presente documento, el término "sonda" se refiere a un oligómero lineal de monómeros o enlaces naturales o modificados, incluyendo desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y similares, capaz de hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos diana, ya sea que de origen natural o producida sintéticamente. La sonda de la presente invención puede ser monocatenaria. Preferentemente, puede ser un oligodesoxirribonucleótido. La sonda de la presente invención puede incluir dNMP de origen natural (es decir, dAMP, dGMP, dCMP y dTMP), análogos de nucleótidos o derivados de nucleótidos. La sonda de la presente invención también puede incluir ribonucleótidos. Por ejemplo, la sonda de la presente invención puede incluir nucleótidos con modificaciones de la estructura principal tales como péptido (ácido nucleico (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568 (1993)), ADN fosforotioato, A d N fosforoditioato, Ad N fosforamidato, Ad N enlazado a amida, ADN enlazado a MMI, 2'-O-metil-ARN, ADN alfa y ADN metilfosfonato, nucleótidos con modificaciones de azúcar tales como 2'-O-metil ARN, 2'-fluoro-ARN, 2'-amino ARN, 2'-O-alquil ADN, 2'-O-alil ADN, 2'-O-alquinil ADN, ADN hexosa, ARN piranosilo y ADN anhidrohexitol y nucleótidos que tienen modificaciones de bases tales como pirimidinas sustituidas en C-5 (sustituyentes que incluyen fluoro-, bromo-, cloro-, yodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, etinil-, propinil-, alquinil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), 7-desazapurinas con sustituyentes C-7 (sustituyentes que incluyen fluoro-, bromo-, cloro-, yodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, alquinil-, alquenil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), inosina y diaminopurina.
En la presente invención, la sustancia que permite medir el nivel de la proteína SH3YL1 puede ser una sustancia específica de la proteína SH3YL1, preferentemente un anticuerpo o aptámero, pero no está limitado a ellos. La sustancia puede usarse sin ninguna limitación siempre que sea una sustancia que pueda unirse específicamente a la proteína SH3YL1.
En la presente invención, el anticuerpo pretende incluir anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes. El anticuerpo también incluye moléculas de anticuerpos completas así como fragmentos de anticuerpos. En la presente invención, el anticuerpo puede ser todo tipo de moléculas de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) y subtipos de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), pero no se limitan a las mismas. "Fragmentos del anticuerpo" de acuerdo con la presente invención significa fragmentos que tienen al menos la capacidad de unirse a un antígeno. Los fragmentos del anticuerpo incluyen anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fd, scFv, anticuerpos de dominio, minicuerpos, scap (anticuerpo monocatenario, scAb), derivados en regiones constantes de anticuerpos y anticuerpos sintéticos basados en andamios proteicos.
En la presente invención, como se describe anteriormente, la proteína SH3YL1 se identificó como una proteína marcadora capaz de diagnosticar nefropatía. Por lo tanto, puede producirse fácilmente un anticuerpo contra la proteína usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo policlonal contra la proteína usando un método ampliamente conocido en la técnica inyectando antígeno SH3YL1 en un animal, extrayendo sangre del animal y separando el suero que contiene el anticuerpo de la sangre. Este anticuerpo policlonal puede producirse a partir de cualquier especie animal hospedadora, incluyendo cabras, conejos, ovejas, monos, caballos, cerdos, vacas, perros y similares. Puede producirse un anticuerpo monoclonal contra la proteína usando un método de hibridoma (Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976) ampliamente conocido en la técnica o usando tecnología de biblioteca de anticuerpos de fagos (Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991). Adicionalmente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede incluir un anticuerpo intacto que comprende dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, así como fragmentos funcionales de la molécula de anticuerpo. "Fragmentos funcionales de la molécula de anticuerpo" son fragmentos que tienen al menos una función de unión al antígeno, e incluyen Fab, F(ab'), F(ab')2 y Fv.
SH3YL1 (parecido a Ysc84 que contiene dominio SH3 1) es una proteína que tiene dominio de homología 3 Src (SH3) en la región carboxilo terminal y SYLF (SH3YL1, Ysc84p/Lsb4p, Lsb3p, y las proteínas FYVE vegetales que lo contienen) en la región amino terminal (FIGURA 1). La secuencia de nucleótidos del gen SH3YL1 está representada por SEQ ID NO: 2 y la secuencia de aminoácidos de la proteína SH3YL1 está representada por SEQ ID NO: 1.
La región SH3 de SH3YL1 reconoce una región rica en prolina y la región SYLF reconoce el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI(3,4,5)P3) en la membrana. Debido a esta función, se sabe que la región SYLF de SH3YL1 reconoce PI(3,4,5)P3 mediante la estimulación del factor de crecimiento PDGF para regular de esta manera la migración celular (Hasegawa et al, JCB 193;901-916, 2011).
En otro aspecto, la presente invención se dirige a un método para proporcionar la información necesaria para el diagnóstico o la predicción de nefropatía, comprendiendo el método: tratar una muestra biológica, extraída de un paciente, con la composición anteriormente descrita para el diagnóstico de nefropatía para detectar el nivel de expresión del gen SH3YL1 en la muestra o el nivel de la proteína SH3YL1 en la muestra.
En aún otro aspecto, la presente invención se dirige al uso del gen SH3YL1 o la proteína SH3YL1 como marcador para el diagnóstico de nefropatía.
En otro aspecto más, la presente invención se dirige a un método para el diagnóstico de nefropatía, que comprende medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en una muestra biológica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra derivada de un organismo vivo, en el cual el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína de acuerdo con el desarrollo o progresión de la nefropatía difiere del de un grupo de control normal. Los ejemplos de la muestra incluyen, pero no se limitan a, tejidos, células, sangre (completa), suero, plasma, saliva y orina.
La medición del nivel de expresión del gen SH3YL1 incluye preferentemente medir el nivel de ARNm y un método para medir el nivel de ARNm incluye la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, ensayo de protección de ARNasa, análisis de transferencia Northern y chip de ADN, pero no está limitado a ellos.
La medición del nivel de la proteína SH3YL1 puede realizarse usando un anticuerpo que se une específicamente a la proteína SH3YL1, preferentemente un anticuerpo o aptámero específico para la proteína SH3YL1. En este caso, la proteína marcadora SH3YL1 en la muestra biológica y un anticuerpo específico para la proteína marcadora forman un complejo, esto es, un complejo antígeno-anticuerpo, y la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo formado puede medirse cuantitativamente basándose en la magnitud de la señal de un marcador de detección. Este marcador de detección puede seleccionarse del grupo que consiste en enzimas, fluoróforos, ligandos, luminóforos, micropartículas, moléculas redox y radioisótopos, pero no está limitado a ellos. Los métodos de análisis para medir los niveles de proteína incluyen, pero no limitado a, transferencia Western, ELISA, radioinmunoensayo, radioinmunodifusión, inmunodifusión de ouchterlony, inmunoelectroforesis de cohetes, inmunohistoquímica, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de fijación del complemento, FACS y ensayo de chip de proteína.
Por lo tanto, los métodos de detección descritos anteriormente de acuerdo con la presente invención hacen posible determinar el nivel de expresión de ARNm del gen SH3YL1 o el nivel de proteína SH3YL1 en un grupo control, y el nivel de expresión de ARNm del gen SH3YL1 o el nivel de proteína SH3YL1 en un paciente sospechoso de tener nefropatía, y puede predecir y diagnosticar el inicio, etapa de progresión o pronóstico de la nefropatía comparando el nivel de expresión con el del grupo control.
En un ejemplo de la presente invención, se extrajo sangre de pacientes con enfermedad renal, incluyendo pacientes con nefropatía, y el suero se separó de la sangre. El suero se sometió a un ensayo ELISA usando un anticuerpo específico de SH3YL1 para medir de esta manera el nivel de proteína SH3YL1 en la muestra de cada paciente, y los valores medidos se compararon con los de un grupo control.
En otro aspecto, la presente invención se dirige a una micromatriz para el diagnóstico de nefropatía, que tiene inmovilizada sobre ella una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo.
En la micromatriz de la presente invención, un cebador, una sonda o un anticuerpo capaz de medir el nivel de expresión de la proteína SH3YL1 o un gen que codifica la misma se usa como un elemento de matriz hibridable y se inmoviliza sobre un sustrato. Los sustratos preferidos pueden ser cualquier soporte rígido o semirrígido adecuado, incluyendo, por ejemplo, membranas, filtros, chips, portaobjetos, obleas, fibras, perlas magnéticas o no magnéticas, geles, tubos, placas, polímeros, micropartículas y capilares. El elemento de matriz hibridable se dispone y se inmoviliza sobre el sustrato, y esta inmovilización puede realizarse mediante un método de unión química o un método de unión covalente tal como UV. Por ejemplo, el elemento de matriz hibridable puede unirse a una superficie de vidrio modificada para contener un compuesto epoxi o un grupo aldehído y también puede unirse a una superficie revestida con polilisina mediante irradiación UV. Adicionalmente, los elementos de la matriz hibridables también pueden unirse al sustrato a través de enlazadores (por ejemplo, oligómero de etilenglicol y diamina).
Mientras tanto, si una muestra que se aplicará a la micromatriz de la presente invención es ácido nucleico, puede marcarse e hibridarse con el elemento de la matriz en la micromatriz. Son aplicables varias condiciones de hibridación, y la detección y el análisis del grado de hibridación pueden realizarse usando varios métodos dependiendo de los marcadores usados.
En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un kit para el diagnóstico de nefropatía, que contiene un par de cebadores capaz de amplificar el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo, una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1 o un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a una proteína codificada por el gen SH3YL1.
Una composición para el diagnóstico de nefropatía, que se incluye en el kit para el diagnóstico de nefropatía de acuerdo con la presente invención, puede comprender un cebador, sonda o anticuerpo capaces de medir el nivel de expresión de la proteína SH3YL1 o un gen que codifica la misma, y la definición del cebador, la sonda y el anticuerpo es como se describió anteriormente.
Si el kit para el diagnóstico de nefropatía de acuerdo con la presente invención va a aplicarse a un proceso de amplificación por PCR, el kit de la presente invención puede contener los reactivos necesarios para la amplificación por PCR, por ejemplo, tampón, ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa térmicamente estable obtenida de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis o Pyrococcus furiosus (Pfu)), cofactor de ADN polimerasa y dNTP. Si el kit para el diagnóstico de nefropatía de acuerdo con la presente invención va a aplicarse para un inmunoensayo, el kit de la presente invención puede contener opcionalmente un anticuerpo secundario y un sustrato marcado. Adicionalmente, el kit de acuerdo con la invención puede fabricarse como una pluralidad de envases o compartimentos separados que comprenden los ingredientes reactivos mencionados anteriormente.
En un aspecto más adicional, la presente invención se dirige a un método para cribar una sustancia para prevenir o tratar la nefropatía, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner una sustancia candidata en contacto con una célula que expresa el gen SH3YL1; (b) medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 y/o el nivel de la proteína SH3YL1; y (c) seleccionar la sustancia candidata como sustancia para prevenir o tratar la nefropatía, cuando se reduce el nivel de expresión del gen SH3YL1 y/o el nivel de la proteína SH3YL1.
De acuerdo con el método de la presente invención, una muestra a analizar puede ponerse en contacto con una célula que contiene el gen SH3YL1 o la proteína SH3YL1. Como se usa en el presente documento, el término "muestra" o "sustancia candidata" se refiere a una sustancia desconocida que se usa en el cribado para examinar si afecta el nivel de expresión del gen SH3YL1, el nivel de la proteína SH3YL1 o la actividad de la proteína SH3YL1. El término "muestra" o "sustancia candidata" puede incluir sustancias químicas, nucleótidos, ARN antisentido, ARNip (ARN de interferencia pequeño) y extractos de productos naturales, pero no se limita a los mismos. Después, la cantidad de expresión del gen SH3YL1 y el nivel de proteína SH3YL1 pueden medirse en una célula tratada con una muestra. Como resultado de la medición, cuando la cantidad de expresión del gen SH3YL1 y el nivel de proteína SH3YL1 disminuyen, puede determinarse que la muestra es una sustancia capaz de prevenir o tratar la nefropatía.
Puede llevarse a cabo un método para medir la cantidad de expresión del gen SH3YL1 y el nivel de proteína SH3YL1 mediante diversas técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el método que mide la cantidad de expresión del gen SH3YL1 y el nivel de proteína SH3YL1 puede realizarse usando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, transferencia Western, transferencia Northern, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), radioinmunoensayo (RIA), radioinmunodifusión y ensayo de inmunoprecipitación.
También se describe un agente para el tratamiento de la nefropatía, que es una sustancia capaz de reducir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1, y una composición para el tratamiento de la nefropatía, que contiene el mismo. En la presente divulgación, los ejemplos preferidos de sustancia capaz de reducir el nivel de expresión del gen SH3YL1 incluyen sustancias químicas, nucleótidos, ARNip específico para el gen SH3YL1, nucleótidos antisentido específicos para el gen SH3YL1, miARN y similares.
En la presente divulgación, los ejemplos de la sustancia capaz de disminuir el nivel de proteína SH3YL1 pueden incluir anticuerpos, aptámeros o sustancias químicas (moléculas pequeñas), que son específicos de la proteína SH3YL1.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición fisiológicamente aceptable que, cuando se administra a un ser humano, generalmente no provocará reacciones alérgicas, tales como alteraciones gastrointestinales, mareos y reacciones similares. Los ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen vehículos para administración oral, tales como lactosa, almidón, derivados de celulosa, estearato de magnesio y ácido esteárico, y vehículos para administración parenteral, tales como agua, aceite adecuado, solución salina, glucosa acuosa y glicol. La composición de la presente invención puede comprender además un estabilizante y un conservante. Los estabilizantes adecuados incluyen antioxidantes, tales como bisulfito sódico, sulfito sódico y ácido ascórbico. Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno y clorobutanol. Pueden encontrarse otros vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995.
La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede formularse en una forma adecuada junto con el vehículo farmacéuticamente aceptable anterior de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Específicamente, la composición farmacéutica puede formularse en diversas formas de dosificación parenteral u oral de acuerdo con un método convencional. Las formulaciones de dosificación parenteral incluyen normalmente una formulación inyectable, preferentemente, una solución o suspensión isotónica. La formulación inyectable puede prepararse usando un agente dispersante adecuado, agente humectante o agente de suspensión de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la formulación inyectable puede prepararse disolviendo los componentes necesarios en solución salina o tampón. También, las formulaciones de dosificación oral incluyen, pero no se limitan a, polvos, gránulos, comprimidos, píldoras y cápsulas. La composición farmacéutica formulada como se describe anteriormente puede administrarse en una cantidad eficaz por diversas vías, incluyendo las vías oral, transdérmica, subcutánea, intravenosa e intramuscular. El término "administración", como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de una sustancia predeterminada en un paciente usando cualquier método adecuado. La sustancia puede administrarse por cualquier vía general, siempre que pueda alcanzar el tejido diana.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para lograr la prevención o el tratamiento cuando se administra a un paciente. La dosis de la composición farmacéutica de la presente divulgación puede variar dependiendo de diversos factores, tales como el tipo y la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso corporal, sensibilidad a los fármacos, tipo de terapia actual, modo de administración, célula diana, etc. y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la materia. La composición farmacéutica de la presente invención también puede administrarse en combinación con agentes farmacéuticos convencionales, secuencial o simultáneamente con los agentes farmacéuticos convencionales, y en dosis única o dosis múltiples. Preferentemente, teniendo en cuenta todos los factores, puede administrarse la dosis mínima requerida para lograr el máximo efecto sin efectos secundarios. Preferentemente, la composición puede administrarse varias veces al día a una dosis de 1-10000 pg/kg peso/día, y más preferentemente 10-1000 mg/kg peso/día.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Será obvio para un experto habitual en la materia que estos ejemplos solo tienen fines ilustrativos y no han de interpretarse limitantes del alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Análisis del nivel intracelular de SH3YL1 después del tratamiento con LPS
SH3YL1 está presente como proteína citoplásmica y está implicado en la migración celular. HAEC (células endoteliales aórticas humanas, Lonza, cc-2535) y HpMEC (células endoteliales microvasculares pulmonares humanas, Promo Cell, c-12281) se trataron con el inductor de inflamación LPS (100 ng/ml) y después se analizó el nivel de expresión de SH3YL1 en las células.
Específicamente, en las condiciones de 37 °C y 5 % de CO2 , las HAEC se cultivaron usando el kit 2 de medio de crecimiento de células endoteliales (cc-6162; Lonza) y las HPMEC se cultivaron usando el kit MV de medio de crecimiento de células endoteliales (c-22120; Promo Cell). Las células se trataron con LPS (100 ng/ml) durante 24 horas y después se analizaron los niveles de SH3YL1 en los lisados celulares.
Como resultado, como se muestra en la FIGURA 2, pudo verse que la expresión de SH3YL1 en las células se aumentó mediante la estimulación inflamatoria inducida por LPS.
Ejemplo 2: Examen de si SH3YL1 cuya expresión aumentaba se secretaría extracelularmente o no
Se examinó si SH3YL1, cuya expresión aumentaba por el inductor de inflamación LPS, se secretaría extracelularmente o no.
Las células HPMEC se trataron con LPS (100 ng/ml) en diferentes puntos de tiempo y se cultivaron. El cultivo resultante se centrifugó y se midieron los niveles de proteína SH3YL1 en el sobrenadante del cultivo y la fracción celular. El tampón de muestra SDS-PAGE de Laemmli se añadió a la misma cantidad de una muestra cuya concentración se midió mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce) y después la muestra se hirvió a 95 °C durante 10 minutos para preparar una muestra de carga. La muestra se sometió a SDS-PAGE y después se electrotransfirió a una membrana de nitrocelulosa y se incubó en leche desnatada al 5 % durante 30 minutos para retirar las bandas no específicas. A continuación, la membrana se incubó durante la noche con anticuerpo primario (diluido en leche desnatada al 5 %) a 4 °C. Después, la membrana se lavó tres veces con tampón TBS-T durante 10 minutos cada vez, se incubó con IgG de conejo o de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (santacruz biotechnology) a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavó tres veces con tampón TBS-T durante 10 minutos cada vez y después se adquirió una imagen quimioluminiscente del mismo usando un analizador de imagen (LAS-3000, Fujifilm).
Como resultado, como se muestra en la FIGURA 3, se demostró que se detectó proteína SH3YL1 en el sobrenadante, lo que indica que la proteína SH3YL1 fue secretada extracelularmente por estimulación con LPS.
Ejemplo 3: Examen del aumento del nivel de proteína SH3YL1 en plasma en pacientes con nefropatía diabética
Se examinó si aumentaría sustancialmente o no el nivel de proteína SH3YL1 en el plasma de pacientes con nefropatía diabética.
Un solo instituto de investigación realizó estudios transversales en un total de 236 pacientes (65 personas normales y 171 pacientes con diabetes tipo 2).
Los niveles de proteína SH3YL1 en plasma en un total de 223 pacientes se midieron cuantitativamente usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (MBS936559; Myobiosource). Este kit mide los niveles de SH3YL1 en suero o plasma basándose en el principio de ELISA sándwich.
A microplacas de 96 pocillos a las que se aplica un anticuerpo específico de SH3YL1, se añadieron cinco concentraciones diferentes de cada una de una sustancia patrón, una sustancia blanco, sustancias control positivo y negativo y una muestra de suero, se dejaron reaccionar durante 2 horas y se lavaron. Después, se añadió a la placa anticuerpo secundario conjugado con biotina y se dejó reaccionar durante 1 hora. Después del lavado, se añadió a la placa una solución conjugada con peroxidasa de rábano picante junto con estreptavidina y se dejó reaccionar durante 1 hora. Después del lavado, se añadió un reactivo de desarrollo a la placa en una oscuridad y, después de 30 minutos, se midió la absorbancia a 450 nm.
Usando los valores de absorbancia medidos para cinco concentraciones de la sustancia patrón y la sustancia blanco, se obtuvo una curva patrón. Después, el valor de absorbancia medido para cada muestra se convirtió en la concentración de SH3YL1 (pg/ml). La concentración medible fue de 31,25 a 2000 pg/ml; el coeficiente de variación de precisión intraensayo (CV %) fue <8 %; y la precisión interensayo (CV %) fue <10 %.
Los pacientes diabéticos se dividieron de acuerdo con la fase de la nefropatía diabética en un grupo de proteinuria normal (cociente albúmina-creatinina: menos de 30 pg/mg de Cr), un grupo de microalbuminuria (relación albúminacreatinina: 30-300 pg/mg de Cr) y una proteinuria prominente (más de 300 mg/mg de Cr o 300 mg/día). A través de los registros médicos y la consulta del paciente, se comprobaron los datos, incluyendo la enfermedad subyacente, sexo, la edad, altura, peso corporal, índice de masa corporal y presión arterial.
Se recogieron muestras de sangre del paciente y se midieron los niveles de hemoglobina, leucocitos, plaqueta, proteína C-reactiva, urea en sangre (bun), creatinina y lípidos en las muestras. La concentración de la proteína de unión al retinol 4 (RBP4) considerada como otro marcador de nefropatía diabética también se midió usando un kit (Phoenix).
Para la medición de la proteinuria, se recolectaron muestras de orina y se calculó la proporción de microalbúmina a creatinina y la proporción de proteína a creatinina en las muestras de orina. Para calcular la tasa de filtración glomerular, se usó la siguiente ecuación CKD-EPI: tasa de filtración glomerular = 141 x min (Scr/K,1) a x max (Scr/K,1) -1,209 x 0,993 edad x 1,018 (mujer) x 1,159 (persona negra). k = 0,7 (mujer), k = 0,9 (hombre). a == 0,329 (mujer), a = -0,411 (hombre). La resistencia a la insulina se calculó mediante la siguiente ecuación: HOMA-IR (evaluación del modelo homeostático de la resistencia a la insulina = (insulina en sangre en ayunas (mU/I) x glucosa en sangre en ayunas (mmol/l))/22,5).
Para el análisis de datos, se usó el programa IBBM SPSS Statistic 20 y se realizó una prueba de dos colas (significativa cuando P es 0,05). Para normalizar las variables que muestran una distribución anormal, el análisis se realizó después de la conversión a valor logarítmico. Para datos continuos, se realizó la prueba de la t o prueba de suma de rangos de Wilcoxon, prueba ANOVA con análisis post hoc dependiendo de si se cumplía o no el supuesto de normalidad. Para datos dicotómicos, se realizó la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher dependiendo de la distribución de la frecuencia esperada. Para confirmar la correlación, se usó el coeficiente de correlación de Pearson, análisis de regresión lineal y múltiple.
Como resultado, aunque no hubo diferencia en la edad y la proporción de hombres a mujeres entre los grupos, la función renal de todos los grupos con nefropatía diabética fue significativamente menor que la del grupo control y los valores de presión arterial sistólica y resistencia a la insulina de los grupos con nefropatía diabética fueron significativamente mayores que los del grupo control (Tabla 1). Además, no se observó una diferencia en los niveles de proteína C reactiva y lípidos entre los grupos.
El nivel de SH3YL1 fue significativamente más alto en el grupo de pacientes diabéticos que en el grupo de control normal, y fue significativamente alto en todos los grupos de proteinuria normales, el grupo de microalbuminuria y el grupo de proteinuria prominente. Además, se demostró que el nivel de SH3YL1 aumentó significativamente en los pacientes que mostraban proteinuria prominente (Figura 4).
La función renal basal puede influir en SH3YL1 y, por tanto, se examinó la relevancia independiente del mismo. Los resultados del análisis de correlación sencillo indicaron que SH3YL1 mostró una correlación positiva con la proteinuria, la microalbuminuria, la concentración de RBP4, el índice de masa corporal, la presión arterial sistólica y la resistencia a la insulina, y no mostraron correlación con la tasa de filtración glomerular (Tablas 2 y 3). Incluso después de la correlación de edad, sexo y tasa de filtración glomerular, el nivel de SH3YL1 y la microalbuminuria mostraron una correlación positiva independiente, y también mostraron una correlación positiva con la concentración de RBP4 y una correlación negativa con el índice de masa ósea (Tabla 4).
A través de los resultados descritos anteriormente, pudo encontrarse encontrar que la correlación entre microalbuminuria y nefropatía diabética, que son dianas diagnósticas y terapéuticas de la progresión de la nefropatía diabética, y que la proteína SH3YL1 puede usarse como marcador para predecir la progresión de la nefropatía diabética.
T l 1
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T l 2
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T l
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T l 4
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T l
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continuación
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Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, se obtiene el efecto de diagnosticar la nefropatía de manera rápida y precisa en las primeras fases y puede lograrse un diagnóstico preciso solo con la sangre del paciente y, adicionalmente, puede proporcionarse una diana para el desarrollo de un agente terapéutico para la nefropatía.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Método para diagnosticar la nefropatía diabética que comprende medir el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en una muestra biológica, caracterizado por que la nefropatía diabética se identifica por un mayor nivel de expresión del gen SH3YL1 o proteína SH3YL1 en la muestra en comparación con una muestra de control normal.
2. El método de diagnóstico de la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión del gen SH3YL1 se mide mediante un par de cebadores capaz de amplificar el gen SH3YL1 o una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1.
3. El método de diagnóstico de la reivindicación 1, en donde el nivel de proteína SH3YL1 se mide mediante un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a una proteína que está codificada por el gen SH3YL1.
4. Un método para proporcionar la información necesaria para el diagnóstico o la predicción de nefropatía diabética que comprende: tratar una muestra biológica con una sustancia seleccionada del grupo que consiste en un par de cebadores capaz de amplificar el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo; una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1; y un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a una proteína codificada por el gen SH3YL1 para detectar el nivel de expresión del gen SH3YL1 o el nivel de la proteína SH3YL1 en la muestra.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejidos, células, sangre, suero, plasma, saliva y orina.
6. Uso de una micromatriz para el diagnóstico de nefropatía diabética en el método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la micromatriz comprende inmovilizada sobre ella una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo.
7. Uso de un kit para el diagnóstico de nefropatía diabética en el método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el kit comprende una sustancia seleccionada del grupo que consiste en:
un par de cebadores capaz de amplificar el gen SH3YL1 o un fragmento del mismo;
una sonda capaz de hibridar con el gen SH3YL1; y
un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a una proteína codificada por el gen SH3YL1.
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