ES2871117T3 - Procedimientos para modular la microbiota intestinal - Google Patents

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Abstract

Una β-defensina seleccionada de entre el grupo que consiste en hBD-1 (SEQ ID NO: 4), hBD-2 (SEQ ID NO: 5), hBD-3 (SEQ ID NO: 6), hBD-4 (SEQ ID NO: 7), hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) o una β-defensina que difiere de una de entre hBD-1, hBD-2, hBD-3, hBD-4 o hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) en menos de 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras para uso en el tratamiento de diabetes tipo 2, síndrome metabólico, inflamación sistémica de bajo grado, obesidad, resistencia a la insulina y/o intolerancia a la glucosa; donde dicha β-defensina se administra mediante administración por vía oral o subcutánea a un sujeto que lo necesite.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para modular la microbiota intestinal
Campo
La presente descripción se refiere a procedimientos para modular o estabilizar la microbiota intestinal mediante la administración por vía oral de una o más defensinas. Los procedimientos pueden usarse para tratar o prevenir la inflamación intestinal, el cáncer colorrectal, el síndrome metabólico, la obesidad, la prediabetes, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares, así como para promover el crecimiento magro en la producción de carne.
Antecedentes
Microbiología intestinal
La creciente prevalencia de trastornos habituales como la obesidad y las enfermedades relacionadas con la obesidad está estrechamente asociada con nuestro estilo de vida y dieta occidentalizados. Las afecciones más importantes relacionadas con la obesidad son la resistencia a la insulina, la diabetes tipo 2 sintomática (DT2) y ciertos cánceres (Faulds & Dahlman-Wright, 2012). Si bien la etiología de estas enfermedades es compleja, muchas de ellas se caracterizan por un estado general de inflamación de bajo grado, que puede tener su origen en una microbiota intestinal desregulada (Everard & Cani, 2013; Belkaid & Hand, 2014). A pesar de que los desafíos asociados con los estilos de vida humanos modernos y la producción de carne animal pueden parecer lejanos, se prevé que la salud intestinal deteriorada es un denominador común. La salud intestinal desregulada se asocia de hecho con una serie de distintas enfermedades como la obesidad (Ridaura et al, 2013), la diabetes tipo 2 (Qin et al, 2012), la artritis reumatoide (Zhang et al, 2015) y el cáncer colorrectal (Feng et al, 2015). Recientemente se ha informado sobre una conexión entre la microbiota intestinal, y en particular la presencia de ciertos lipopolisacáridos de Bacteroides, y la mayor tasa de aparición de diabetes tipo 1 en Finlandia en comparación con las zonas vecinas (Leviten 2016).
La obesidad y su inflamación de bajo grado concomitante forman un potente impulsor de la homeostasis metabólica desregulada. Turnbaugh y col. (2006) encontraron que la microbiota asociada a la obesidad tenía una mayor capacidad de recogida de energía, y 2 semanas después del trasplante de microbiota de ratones obesos, los ratones asépticos mostraron un aumento considerablemente mayor en la masa grasa que un trasplante similar de ratones delgados. Turnbaugh y col. (2008) descubrieron de manera adicional e importante que los cambios en la composición microbiana intestinal se revirtieron por completo después de un cambio en la dieta original en ratones alimentados temporalmente con una dieta «occidental» alta en grasa /azúcar. Estos hallazgos fueron confirmados en el hombre por Vrieze et al. (2012), quienes demostraron que la transferencia de microbiota intestinal de donantes humanos delgados aumentaba la sensibilidad a la insulina en individuos con síndrome metabólico.
La manipulación de la microbiota intestinal para aumentar el peso y las tasas de ganancia de peso se ha empleado durante muchos años en el ganado agrícola mediante el uso de antibióticos y probióticos en dosis bajas, como Lactobacillus ingluviei. Se ha demostrado la manipulación de la microbiota intestinal para aumentar el peso en pollos (Khan et al, 2007), en patos (Angelakis & Raoult, 2010) y en ratones (Angelakis et al, 2012). En los seres humanos, también se ha descubierto que los bebés que reciben antibióticos son más grandes que sus controles (Trasande et al, 2012), mientras que la exposición temprana a los antibióticos orales se asocia con el sobrepeso en los niños (Ajslev et al, 2014). Y en las mujeres embarazadas, el aumento fisiológico de la adiposidad y el desarrollo potencial de diabetes gestacional en el tercer trimestre parece estar asociado con un cambio profundo en la microbiota intestinal (Koren et al, 2012).
La mucosa intestinal es, con mucho, la superficie corporal más grande (aproximadamente 200 m2) expuesta al ambiente externo. Como tal, la superficie intestinal está en íntimo contacto con materiales extraños, metabolitos derivados de nuestra dieta y las 1014 bacterias estimadas, la microbiota intestinal, que habitan nuestro intestino. Por lo tanto, la barrera intestinal está bajo vigilancia inmunitaria constante e intensa, lo que requiere una diafonía dinámica entre el sistema inmunológico, los componentes de la dieta y la microbiota intestinal. Las intervenciones dietéticas tienen un impacto tremendo en la regulación inmunológica (Mowat & Agace, 2014) y la composición de la microbiota intestinal (Walter, 2015), las cuales influyen de forma independiente y sinérgica en la homeostasis metabólica. En este sentido, dos artículos muy recientes enfatizan el potencial (adverso) de los aditivos alimentarios en los cambios modulados por la microbiota en la homeostasis metabólica. Un artículo reciente (Chassaing et al, 2015) ilustró cómo los emulsionantes dietéticos alteran la tolerancia a la glucosa, lo que aumenta el aumento de peso y la susceptibilidad a la colitis mediante la inducción de una microbiota intestinal desregulada. Las observaciones no pudieron replicarse en ratones asépticos (GF, del inglés germ-free), lo que sugiere un papel fundamental para la microbiota intestinal. Del mismo modo, Suez et al. (2014) demostraron recientemente cómo los edulcorantes artificiales no calóricos inducen disfunción metabólica a través de alteraciones de la microbiota intestinal. Los autores validaron sus hallazgos mediante transferencia fecal a ratones GF, después de lo cual los ratones GF desarrollaron rápidamente intolerancia a la glucosa. Estas observaciones reflejan un estudio pionero en ratones GF (Backhed et al, 2007), que dilucida el papel de los microbios intestinales en el mantenimiento de la salud metabólica. Este estudio mostró que en ausencia de microbios comensales, lo que provoca una homeostasis inmunitaria de la mucosa desequilibrada, los tejidos adiposos disminuyen de tamaño y función en respuesta a una dieta alta en grasas. A pesar de la falta de aumento de peso, que normalmente aparecería como un fenotipo saludable, la acumulación de lípidos ectópicos (esteatosis hepática y niveles altos de triglicéridos en suero) dieron como resultado trastornos metabólicos graves. En el hombre, se ha demostrado que la riqueza genética de la microbiota está asociada con un fenotipo saludable, mientras que la pobreza genética (recuentos de genes bajos) se correlaciona con un mayor riesgo de trastornos metabólicos (Le Chatelier et al, 2013).
Defensinas
Las defensinas representan una de las defensas innatas dominantes del huésped que sirven para mantener un microbioma saludable y protegerse contra posibles patógenos (Wehkamp et al, 2002 y Salzman et al, 2007). Las defensinas son péptidos que poseen actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas y gramnegativas, hongos y arqueas, así como actividad antiinflamatoria que aumenta las citocinas antiinflamatorias y disminuye las citocinas inflamatorias.
Las defensinas humanas son pequeños péptidos catiónicos que se pueden dividir en defensinas a y p según la topología de sus tres enlaces disulfuro de cisteína intramoleculares. Las a-defensinas humanas se pueden subdividir en aquellas que se aislaron por primera vez de los gránulos de neutrófilos (HNP1-4) y las a-defensinas intestinales que son expresadas por las células de Paneth en las criptas del intestino delgado (HD5 y HD6 o DEFA5 y DEFA6 ). Las p-defensinas (DEFBn) son producidas principalmente por células epiteliales en varios tejidos y órganos, incluidos piel, ojos, oído medio, boca, tráquea, pulmones, tracto gastrointestinal, hígado, sistema urogenital, riñones, vagina, páncreas y glándulas mamarias. Los miembros mejor caracterizados de la familia de las p-defensinas humanas son hBD1-4. Algunas de las defensinas humanas se producen de manera constitutiva, mientras que otras son inducidas por citocinas proinflamatorias o productos microbianos exógenos. Algunas de las defensinas humanas ya se expresan en el líquido amniótico en niveles crecientes con la edad gestacional, lo que protege al feto en el útero. La leche materna y, en particular, la primera leche, el calostro, contiene defensinas tanto a como p, pero solo algunas de ellas se encuentran en concentraciones considerables en la leche materna (Armogida et al, 2004).
Liu y col. (2008) y WO 2008/115390, encontraron que HNP-1 y HNP-2, ambos producidos por leucocitos y pertenecientes a un subgrupo de a-defensinas en la sangre, eran capaces de inhibir la glucogenólisis y gluconeogénesis en hepatocitos aislados a través de un mecanismo intracelular claramente distinto de la vía de señalización de la insulina clásica. WO 2007/133373 se refiere a proteínas de fusión que comprenden TNFa y una quimiocina o defensina y su uso como antígeno para inducir una respuesta inmunitaria contra TNFa para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por TNFa patológico, como dolor neuropático crónico, inflamación crónica, resistencia a la insulina, diabetes, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia y arteriosclerosis.
CN104971343 se refiere a una dieta alta en grasas y un modelo de ratón con déficit de vitamina D de trastornos metabólicos y al tratamiento del modelo de ratón con una HD5 mutante (HD5(T7H)). Tang y col. 2015 (Animal Science Journal, 2015, 87 (10), 1258-1266) se refieren al uso de beta defensina 2 porcina (pBD2) para el tratamiento de lechones destetados expuestos a E. coli.
Resumen
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier descripción que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
La presente descripción demuestra que las defensinas a y p intestinales de mamíferos, administradas por vía oral, tienen la capacidad de mantener una composición de microbiota normal en el intestino de un ratón alimentado con una dieta alta en grasas. Los datos de los ejemplos demuestran que la administración por vía oral de a- y/o pdefensinas dan como resultado la estabilización o normalización de una microbiota disbiótica. Por tanto, las defensinas son útiles en el tratamiento o la prevención del cáncer colorrectal, una enfermedad endocrina, nutricional, metabólica o cardiovascular o como promotores del crecimiento magro en la producción de carne.
Como se demostró en los ejemplos 1 y 3, una dosis oral de alfa defensina 5 humana (HD5) o beta-defensina 2 humana (hBD-2) previene o reduce el aumento de peso en ratones que siguen una dieta alta en grasas. El modelo animal es un modelo de síndrome metabólico y diabetes tipo 2 temprana. A menos que se trate, cuando los ratones se alimentan con la dieta alta en grasas desarrollan obesidad al acumular grasa, en particular grasa abdominal y grasa hepática. Los ratones desarrollan aún más signos de diabetes, como resistencia a la insulina y tolerancia alterada a la glucosa.
Sin HD5 o hBD-2 en la dieta, los animales aumentan considerablemente de peso con la dieta alta en grasas y al final desarrollan signos de diabetes y obesidad. El aumento de peso reducido se produjo como una reducción en la acumulación de masa grasa. Los animales que recibieron una dosis de HD5 o hBD-2 muestran una mayor tolerancia a la glucosa y una menor resistencia a la insulina en comparación con los animales no tratados con una dieta alta en grasas.
De manera similar, los ejemplos demuestran que la administración por vía oral de HD5 a animales con una microflora disbiótica puede normalizar al menos parcialmente la microflora. Por lo tanto, la HD5 y otras defensinas pueden usarse para la normalización de la microflora disbiótica o para la normalización de la microflora. Se sabe que las dietas altas en grasas y las dietas con alto contenido de azúcar inducen una microflora disbiótica. Por tanto, las defensinas se pueden utilizar para tratar tal microflora disbiótica. Las defensinas también se pueden usar de forma profiláctica para sujetos que vayan a someterse a tratamientos que se espera que afecten negativamente a la microflora, por ejemplo, tratamiento con antibióticos, tratamiento inmunosupresor, quimioterapia, inmunoterapia o radioterapia.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para el tratamiento de la inflamación intestinal en animales no humanos, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a- y/o p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que lo necesite.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para el tratamiento de la inflamación intestinal en humanos, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a pdefensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que lo necesite.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para el tratamiento de la inflamación intestinal, donde la inflamación se localiza en la boca, esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, recto y/o canal anal de un animal, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a- o p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que lo necesite.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para mantener una composición de microbiota normal en el intestino, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a-defensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1)/GLP-1 análogo a un sujeto que lo necesite.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para el tratamiento de una microbiota disbiótica en el intestino, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una adefensina y/o una p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1 a un sujeto que lo necesite
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para aumentar la riqueza genética de la microbiota intestinal, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una adefensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para aumentar el número de filos de la microbiota intestinal, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una adefensina y/o una p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para aumentar la producción de ácidos grasos cortos en la microbiota intestinal, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a-defensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para aumentar la producción de butirato o disminuir la producción de acetato de la microbiota intestinal, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a-defensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para aumentar el número de bacterias que pertenecen a un género seleccionado de entre un grupo compuesto por Bacterioidetes, Faecalibacterium, Roseburia, Blautia, Ruminococcus, Bifidobacterium, Methanobrevibacter, Lactobacillus, Coprococcus, Clostridium, Allobaculum, Alloprevotella, Akkermansia, Eubacterium en el intestino, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una a-defensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1. Preferiblemente, el género de bacteria incluye uno o más de entre Allobaculum, Alloprevotella, Akkermansia, y Lactobacillus.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para disminuir el número de bacterias seleccionadas de entre un grupo compuesto por Bacteroidetes fragilis, Sutturella wadsworthia, Veillonella parvula, Escherichi coli, Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corodens, Gemella moribillum en el intestino, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de a-defensina y/o pdefensina de mamífero o aves de corral y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para el tratamiento del cáncer colorrectal, una enfermedad endocrina, nutricional, metabólica o cardiovascular, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a-defensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que lo necesite. Como las defensinas pueden usarse para tratar la obesidad y varios síntomas de la diabetes tipo 2, y usarse para normalizar la microflora, también pueden reducir el riesgo de contraer uno o más de las enfermedades mencionadas.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para promover el crecimiento magro en la producción de carne animal, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una defensina, una a-defensina y/o p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que lo necesite. Este aspecto de la presente descripción está respaldado por la demostración de que la administración de HD5 o hBD-2 a ratones obesos conduce a una reducción del porcentaje de grasa, es decir, las defensinas favorecen el crecimiento magro sobre el crecimiento de grasa.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende al menos una a-defensina de mamífero o aves de corral y al menos una p-defensina de mamífero o aves de corral.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende al menos una a- o p-defensina de mamífero junto con insulina / análogos de la insulina y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1 y/o un péptido similar al glucagón 2 (GLP-2) / análogo del GLP-2 y/o un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-lV) y/o metformina y/o un inhibidor del transportador de glucosa de sodio-2 (SGLT-2) y/o un antagonista del receptor de glucagón y/o un antagonista del miembro 1 de la subfamilia V del canal catiónico potencial del receptor transitorio (TRPV1) o una combinación de estos. En un aspecto de la presente descripción, la defensina es HD5 o hBD-2.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende al menos una a- o p-defensina de mamífero para su uso en combinación con quimioterapia, inmunoterapia, radioterapia o una combinación de estas. En un aspecto de la presente descripción, la defensina es HD5 o hBD-2, preferentemente cuando la defensina se administra por vía oral.
Se sabe en la técnica que las defensinas, incluida la beta-defensina 2 humana, son agentes antiinflamatorios potentes (WO 2010/007165). Los presentes inventores han demostrado los efectos antiobesidad y antidiabéticos de la betadefensina 2 humana administrada por vía oral. Otra hormona intestinal, GLP-1, y análogos de GLP-1 tales como liraglutida también pueden usarse para tratar la obesidad y la diabetes. Los presentes inventores demuestran en el Ejemplo 4 que la liraglutida administrada por vía parenteral no tiene ningún efecto sobre distintas citocinas inflamatorias y antiinflamatorias. Por lo tanto, los análogos de GLP-1 y GLP-1 tienen un modo de acción distintos en comparación con las defensinas. Por lo tanto, los presentes inventores contemplan la administración de una combinación de al menos una defensina con al menos un GLP-1 o análogo del GLP-1 para tratar las indicaciones como se describen en esta invención.
Descripción de los dibujos
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier dibujo que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
Figura 1A. Esquema de la configuración experimental para investigar los efectos de las alfa- y/o beta-defensinas de mamíferos en el metabolismo de los ratones. En la semana -1 se dividió a los ratones C57/BL/6J en grupos y jaulas, de modo que había 3 ratones por jaula y jaulas por grupo. Entre la semana -1 y 0 se examinó clínicamente a los ratones por resonancia magnética para estimar la distribución de grasa. En las semanas 0, 1 y 4 se analizó el microbioma de las heces. En la semana 4, además del análisis de la microbiota, se exploró a los ratones y se midieron los niveles de glucosa e insulina en sangre. En la semana 6, se evaluó el consumo de energía analizando el contenido de nitrógeno y lípidos en las heces. En la semana 7, se realizó la prueba de tolerancia a la insulina
(ITT, del inglés insulin tolerance test). En la semana 8, se realizaron la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT, del inglés oral glucose tolerance test) y la de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS, glucosestimulated insulin secretion). En la semana 9 (terminación), se realizaron varios análisis, en particular se pesó y exploró a los ratones, y se evaluaron la composición del plasma y la composición de la microbiota del colon, ciego e intestino delgado. Además, el análisis histológico y el análisis de proteínas/ARN se realizaron en tejido muscular (cuádriceps), iWAT, eWAT, iBAT, hígado, colon, yeyuno, íleon y duodeno.
Figura 1B. Esquema de la configuración experimental para investigar los efectos de las alfa- y/o beta-defensinas de mamíferos en el metabolismo de los ratones. En la semana -1 llegaron los ratones C57/BL/6J. En la semana 0 se recogieron las heces. Durante el periodo de preinclusión entre la semana 0 y la semana 12 se alimentó a los ratones con una dieta alta en grasas. En la semana 12 se examinó clínicamente a los ratones mediante resonancia magnética para estimar la distribución de la grasa, se recogieron las heces y se realizó la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). En la semana 13-0, los ratones se dividieron en grupos y jaulas con 4 ratones por jaula y 3 jaulas por grupo. En las semanas 0, 12 y 13-10 se analizó el microbioma de las heces. En las semanas 13-2, 13-4, 13-6, 13-8 y 13-10 se exploró a los ratones y se midieron los niveles de glucosa e insulina en sangre. En la semana 13-9, se realizó la prueba de tolerancia a la insulina (ITT, del inglés insulin tolerance test). En la semana 13-10 (terminación), se realizaron varios análisis, en particular se pesó y exploró a los ratones, y se evaluaron la composición del plasma y la composición de la microbiota del colon, ciego e intestino delgado. Además, se midieron iWAT, eWAT y el peso del hígado.
Figura 2. Alineación de secuencia múltiple con Clustal W (2.1) de beta defensina humana 1-4.
Figura 3. Alineación de secuencia múltiple con Clustal W (2.1) de alfa defensina humana 5 y 6.
Figura 4: Alineación de secuencia múltiple con Clustal W (2.1) de beta defensina humana 1-3.
Figura 5: Alineación de secuencia múltiple con Clustal W (2.1) de beta defensina 2 humana, de macaco Rhesus chimpancés y orangután.
En las alineaciones con Clustal W:
* indica posiciones que tienen un solo residuo completamente conservado.
indica que uno de los siguientes grupos «fuertes» está completamente conservado:
-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.
indica que uno de los siguientes grupos «más débiles» está completamente conservado:
-C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.
Figura 6: Cambio de peso (A) y desarrollo del peso (B) e ingesta acumulada de alimento (C) durante 7 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (LFD, del inglés low fat diet), dieta alta en grasas (HFD, del inglés high fat diet) o HFD y defensina hBD-2 (HFD P2).
A: cambio de peso. N = 12. Ambas HFD son considerablemente distintas al grupo de referencia de LFD. Los asteriscos representan las diferencias entre HFD y HFD P2. Ambas HFD son considerablemente distintas a la LFD de la semana w (p < 0,001). Análisis de la varianza bidireccional, prueba de Tukey.
B: desarrollo de peso. N = 12. Ambas HFD son considerablemente distintas al grupo de referencia de LFD. Los asteriscos representan las diferencias entre HFD y HFD P2. Ambas HFD son considerablemente distintas a la LFD de la semana w (p < 0,001). Análisis de la varianza bidireccional, prueba de Tukey.
C: ingesta acumulada de alimento. El grupo de referencia LFD tiene la misma cantidad de sacarosa y proteína por gramo de alimento en comparación con los grupos HFD.
Figura 7: desarrollo de masa magra/grasa durante 7 semanas, tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (LFD), dieta alta en grasas (HFD) o HFD y defensina hBD-2 (HFD P2). (A) Desarrollo de masa magra en la semana 1 y en la semana 7. (B) Desarrollo de masa grasa en la semana 1 y en la semana 7. A: masa magra semana -1 y semana 7. N = 12. Análisis de la varianza unidireccional, prueba de Tukey. B: masa grasa semana -1 y semana 7. N = 12. Análisis de la varianza unidireccional, prueba de Tukey.
Figura 8: homeostasis de la glucosa en ratones tratados durante 7 semanas con dieta baja en grasas (LFD), dieta alta en grasas (HFD) o HFD y defensina hBD-2 (HFD P2). (A) Prueba de tolerancia a la insulina (ITT). (B) Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral. (C) Secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS, del inglés Glucose stimulated insulin secretion). (D) Prueba de insulina en ayunas de 5 horas.
A: prueba de tolerancia a la insulina 7 semanas después del inicio de la dieta. N = 6 por grupo. Las HFD se comparan con el grupo de referencia LFD. Solo se muestran los cambios estadísticamente significativos. Los asteriscos sobre la curva superior indican la diferencia entre HFD y LFD.
B: prueba de tolerancia a la glucosa 7 semanas después del inicio de la dieta. N = 11-12 por grupo. Las HFD se comparan con el grupo de referencia LFD. Solo se muestran los cambios estadísticamente significativos. Los asteriscos sobre la curva superior indican la diferencia entre HFD y LFD y los asteriscos debajo de la curva media indican diferencias entre HFD P2 y LFD.
C: secreción de insulina estimulada por glucosa (durante la GTT) 7 semanas después del inicio de la dieta. N = 11-12 por grupo. Las HFD se comparan con el grupo de referencia LFD. Solo se muestran los cambios estadísticamente significativos. Los asteriscos sobre la curva superior indican la diferencia entre HFD y LFD. HFD P2 y LFD no son estadísticamente significativas en ningún momento.
D: insulina en ayunas de 5 h 7 semanas después del inicio de la dieta. N = 11-12 por grupo. A-C: análisis de la varianza bidireccional, prueba de Dunnett.
D: análisis de la varianza unidireccional, prueba de Tukey.
Figura 9A, 9B y 9C: desarrollo de peso (a) eficiencia alimenticia (b) y aporte energético (c) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina hBD-2 (alta en grasas hBD-2). Significado: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B;
alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
9A. Desarrollo de peso. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados)
9B. Eficiencia alimenticia (gramo de peso ganado ajustado por la ingesta promedio de alimento en la jaula). Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey. Obsérvese que NB! n = 4 debido al coenjaulamiento. 9C. Aporte energético. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados)
Figura 10A, 10B y 10C: grasa como porcentaje del peso corporal total (a), peso del hígado en gramos (b) y peso de la grasa epididimaria (eWAT) en gramos (c) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas ( baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina hBD-2 (hBD-2).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B; alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
IOA. Porcentaje de grasa del peso corporal total en distintas semanas. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
IOB. Peso del tejido adiposo epididimario (TA visceral) al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
IOC. Peso al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 11A y 11B: homeostasis de glucosa en ratones tratados durante 10 semanas con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina hBD-2 (alta en grasas hBD-2). (a) Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral. (b) Secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B; alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
11A. Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral de la semana 7. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
11B. Secreción de insulina estimulada por glucosa de la semana 7 tomada durante la oGTT. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figura 12A y 12B: homeostasis de glucosa en ratones tratados durante 10 semanas con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina hBD-2 (alta en grasas hBD-2). (a) Prueba de tolerancia a la insulina (ITT). (b) HOMA-IR. Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B;
alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
12a. Prueba de tolerancia a la insulina de la semana 8. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
12b. Evaluación del modelo de homeostasis (HOMA) de la semana 9. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 13A y 13B: desarrollo de peso (a) y cambio de peso (b) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina hBD-2 (alta en grasas hBD-2).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B; alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
13A. Desarrollo de peso. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
13B. Cambio de peso desde la semana 13 al final del período de preinclusión y las siguientes 10 semanas con dietas experimentales. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figura 14A y 14B: grasa como porcentaje del peso corporal total (a) y cambio en el % de grasa desde la semana 0-4 en gramos (b) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina hBD-2 (hBD-2). Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B; alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
14A. Porcentaje de grasa del peso corporal total en distintas semanas. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
14B. Cambio del porcentaje de grasa desde el final del periodo de preinclusión y 4 semanas en dietas experimentales. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 15A y 15B: peso del hígado en gramos (a) y peso de la grasa epididimaria (eWAT) en gramos (b) durante el tratamiento de 10 semanas de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina hBD-2 (hBD-2).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B; alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
15A. Peso del hígado al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
15B. Peso del tejido adiposo epididimario (grasa visceral) al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 16A, 16B y 16C: homeostasis de glucosa en ratones tratados durante 10 semanas con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina hBD-2 (alta en grasas hBD-2). (a) Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral de la jaula 1. (b) Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral del ratón D1. (c) Prueba de tolerancia a la insulina (ITT).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas hBD-2 = B; alta en grasas vs alta en grasas hBD-2 = C.
16A Pruebas de tolerancia a la glucosa por vía oral repetidas cada dos semanas desde el final del período de preinclusión (semana 13-0) que muestran la primera jaula del grupo alta en grasas hBD-2.
16B. Pruebas de tolerancia a la glucosa por vía oral repetidas cada dos semanas desde el final del período de preinclusión (semana 13-0) que muestran SOLO el ratón D1 del grupo alta en grasas hBD-2.
16C. Prueba de tolerancia a la insulina de la semana 9. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figuras 17A, 17B y 17C: Desarrollo de peso (a) eficiencia alimenticia (b) y aporte energético (c) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina HD5 (alta en grasas HD5). Significación estadística: baja en grasas vs rica en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
17A. Desarrollo de peso. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
17B. Eficiencia alimenticia (gramo de peso ganado ajustado por la ingesta promedio de alimento en la jaula). Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey. Obsérvese que NB! n = 4 debido al coenjaulamiento.
17C. Aporte energético. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figuras 18A, 18B y 18C: Grasa como porcentaje del peso corporal total (a), peso del hígado en gramos (b) y peso de la grasa epididimaria (eWAT) en gramos (c) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina HD5 (HD5).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
18A. Porcentaje de grasa del peso corporal total en distintas semanas. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
18B. Peso del hígado al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
18C. Peso del tejido adiposo epididimario (TA visceral) al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 19A y 19B: Homeostasis de la glucosa en ratones tratados durante 10 semanas con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina HD5 (alta en grasas HD5). (a) Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral. (b) Secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
19A. Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral de la semana 7. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
19B. Secreción de insulina estimulada por glucosa de la semana 7 tomada durante la oGTT. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figura 20A y 20B: Homeostasis de la glucosa en ratones tratados durante 10 semanas con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento preventivo con defensina HD5 (alta en grasas HD5). (A) Prueba de tolerancia a la insulina (ITT). (b) HOMA-IR. Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
20A. Prueba de tolerancia a la insulina de la semana 8. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
20B. Evaluación del modelo de homeostasis (HOMA) de la semana 9. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 21A y 21B. Las figuras ilustran los cambios de la semana 1 (semana 1) a la semana 10 (semana 10) para los cuatro tratamientos en el ejemplo 1: dieta alta en grasas con HD5 - HF HD5; dieta alta en grasas con hBD-2 -HD hBD-2; dieta alta en grasas - sin tratamiento: HF; dieta baja en grasas: LF. Análisis UniFrac ponderado de la microbiota en la semana 1 (21A) y la semana 10 (21B), es decir, abundancia relativa de especies bacterianas. La microbiota de los ratones alimentados con una HFD más HD5 se acercó gradualmente a la flora bacteriana de los ratones alimentados con un LFD, es decir, la normalización de la microbiota. Abreviaturas: Wk 1 - semana 1; Wk 10 - semana 10.
Figura 21C. Ilustración de las especies de microbiota que contribuyen al cambio. Los cambios de la microbiota fueron impulsados principalmente por una mayor abundancia de Allobaculum y Lactobacillus y una disminución en la abundancia de Clostridium. Allobaculum es una especie productora de ácidos grasos de cadena corta. Lactobacillus es una bacteria con propiedades antiinflamatorias.
Figura 22A y 22B: Desarrollo de peso (a) y cambio de peso (b) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina HD5 (alta en grasas HD5).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
22A. Desarrollo de peso. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
22B. Cambio de peso desde la semana 13 al final del período de preinclusión y las siguientes 10 semanas con dietas experimentales. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figura 23A y 23B: Grasa como porcentaje del peso corporal total (a) y cambio en el % de grasa desde la semana 0-4 en gramos (b) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina HD5 (HD5). Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
23A. Porcentaje de grasa del peso corporal total en distintas semanas. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
23B. Cambio del porcentaje de grasa desde el final del periodo de preinclusión y hasta la semana 4 en dietas experimentales. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 24A y 24B: Peso del hígado en gramos (a) y peso de la grasa epididimaria (eWAT) en gramos (b) durante 10 semanas de tratamiento de ratones con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina HD5 (HD5).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
24A. Peso del hígado al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
24B. Peso del tejido adiposo epididimario (TA visceral) al final. Análisis de la varianza unidireccional con corrección de Tukey.
Figura 25A y 25B: homeostasis de la glucosa en ratones tratados durante 10 semanas con dieta baja en grasas (baja en grasas), dieta alta en grasas (alta en grasas) o dieta alta en grasas y tratamiento de intervención con defensina HD5 (alta en grasas HD5). (a) Prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral de la jaula 2. (b) Prueba de tolerancia a la insulina (ITT).
Significación estadística: baja en grasas vs alta en grasas = A; baja en grasas vs alta en grasas HD-5 = B; alta en grasas vs alta en grasas HD-5 = C.
25A. Pruebas de tolerancia a la glucosa por vía oral repetidas cada dos semanas desde el final del período de preinclusión (semana 13-0) que muestran la segunda jaula del grupo alta en grasas HD5.
25B. Prueba de tolerancia a la insulina de la semana 9. Análisis de la varianza bidireccional con corrección de Tukey (valores coincidentes apilados).
Figura 26. Esquema de la configuración experimental para investigar los efectos de un análogo del GLP-1 (Liraglutid) sobre la inflamación intestinal y la microbiota del ratón. En la semana -40 llegaron los ratones C57/BI/6J DIO. Se alimentó a los ratones con una dieta alta en grasas con un 60 % de grasa, SSNIFF (Diet #D12492) o Purina Chow durante 38 semanas para alcanzar un peso corporal promedio de 55 gramos. A partir de la semana -2, los ratones se alojaron en un solo alojamiento. Se recolectaron muestras fecales los días -1 y 27 para el análisis de ARN 16S. Se recogieron muestras de ilion a 2 cm del ciego el día 28.
Figura 27A. Resultados del análisis del microbioma del ejemplo 4. Los ratones se trataron durante cuatro semanas con liraglutida o vehículo (vehículo DIO).
El análisis UniFrac no ponderado de la microbiota en el día -1 y el día 28 ilustra cambios en el microbioma de los dos grupos de tratamiento desde el inicio hasta el final del experimento.
La microbiota de los ratones alimentados con una HFD más liraglutida se acercó gradualmente a la flora bacteriana de los ratones alimentados con una LFD, mientras que la microbiota de los ratones tratados con vehículo no cambió durante el estudio.
Figura 27B. Se agregaron los cambios de microbiota con especies de microbiota. Los cambios fueron impulsados principalmente por una mayor abundancia de Akkermansia y Alloprevotella. Akkermansia es una especie productora de ácidos grasos de cadena corta.
Figura 28. Datos farmacocinéticos tras la administración por vía oral de 4 mg/kg de hBD-2 a ratones NMRI hembra. El eje Y muestra pg/g de hBD-2 en tejido. Los resultados se dan como media del grupo /-SEM.
Figura 29. Datos farmacocinéticos para hBD-2 después de la administración por vía subcutánea (SC) e intravenosa (IV) de 1 mg/kg respectivamente. El eje Y muestra hBD-2 en pg/g. Las distintas curvas representan distintos experimentos y procedimientos de detección (HPLC y ELISA).
Figura 30. Datos farmacocinéticos de la «fusión N-terminal de hBD-2-albúmina» tras la administración por vía subcutánea e intravenosa de 16,5 mg/kg respectivamente. El eje Y muestra la concentración de la proteína de fusión en pg/ml. Los resultados son la media de 4 ratones/momento de muestreo /- DE.
Figura 31. Datos farmacocinéticos de la «fusión C-terminal de hBD-2-albúmina» tras la administración por vía subcutánea e intravenosa de 16,5 mg/kg respectivamente. El eje Y muestra la concentración de la proteína de fusión en pg/ml. Los resultados son la media de 4 ratones/momento de muestreo /- DE.
Descripción detallada
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
Definiciones:
Defensina: el término «defensina» como se usa en esta invención se refiere a polipéptidos reconocidos por una persona experta en la técnica como pertenecientes a la clase de defensina de péptidos antimicrobianos. Las defensinas pertenecen a la clase alfa defensina o a la clase beta defensina. Los ejemplos de defensinas incluyen alfa defensina 5 intestinal humana (HD5; SEQ ID NO. 8); alfa defensina 6 humana (Hd 6; SEQ ID NO. 9); péptido 1 de neutrófilos humanos (HNP-1); péptido 2 de neutrófilos humanos (HNP-2); péptido 3 de neutrófilos humanos (HNP-3), todos pertenecientes a la clase alfa defensina; y también beta defensina 1 humana (hBD1; SEQ ID NO. 4); beta defensina 2 humana (hBD-2; SEQ ID NO. 5); beta defensina 3 humana (hBD3; SEQ ID NO. 6); beta defensina 4 humana (hBD4; SEQ ID NO. 7), beta defensina 2 de chimpancé (SEQ ID NO: 10), beta defensina 2 de macaco (SEQ ID NO: 11), beta defensina 2 de orangután (SEQ ID NO: 3), beta defensina 3 de ratón (SEQ ID NO: 12), beta defensina 2 de caballo (SEQ ID NO: 13), beta defensina 1 porcina (SEQ ID NO: 14), beta defensina 2 de cabra (SEQ ID NO: 15), beta defensina 2 bovina (SEQ ID NO: 1), beta defensina 2 de pollo (SEQ ID NO: 2), LL37 humana (SEQ ID NO: 16), derivada de catelicidina humana, y hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17), pertenecientes a la clase beta defensina. Las defensinas se pueden glicosilar y escindir proteolíticamente en fragmentos bioactivos más pequeños. Las defensinas glicosiladas y los fragmentos de defensina también se incluyen dentro del alcance de la presente descripción.
Las defensinas se expresan como precursores y se procesan mediante la escisión del péptido señal y, en algunos casos, los propéptidos también antes de su secreción en el espacio extracelular. Las secuencias identificadas anteriormente representan las defensinas bioactivas maduras predichas. Un experto en la técnica entenderá que el procesamiento puede diferir de una célula a otra y que el péptido maduro secretado resultante puede diferir en uno o dos aminoácidos C- o N-terminales de las secuencias predichas y aún conservar su bioactividad.
Intestino: el intestino es un tubo utilizado por los animales para transferir alimentos a los órganos digestivos e incluye los propios órganos digestivos. El intestino humano, como se usa en esta invención, se refiere a un sistema digestivo compuesto por boca, esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon, recto y canal anal. Algunas realizaciones de la presente descripción se refieren a partes del intestino humano y, en particular, a la boca, el esófago, el estómago, el duodeno, el yeyuno, el íleon, el ciego, el colon, el recto y el canal anal. Otras realizaciones de la presente descripción se refieren a todas estas partes excepto al colon. El intestino de los rumiantes, como se hace referencia en esta invención, es un intestino compuesto por boca, esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon, recto y canal anal, pero caracterizado por el hecho de que el estómago está dividido en cuatro compartimentos: rumen, retículo, omaso y abomaso. El intestino de las aves de corral, tal como se hace referencia en esta invención, es un intestino compuesto de esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon, recto y canal anal, pero caracterizado por el hecho de que el estómago está dividido en proventrículo o estómago verdadero y molleja. En algunos casos, hay una bolsa muscular a lo largo del esófago llamada buche.
«Péptido-1 similar al glucagón» GLP-1 es un neuropéptido y una incretina derivados del producto de transcripción del gen proglucagón. La fuente fundamental de GLP-1 en la periferia es la célula L intestinal, que secreta GLP-1 como una hormona intestinal. Las formas biológicamente activas de GLP-1 son: GLP-1(7-37) y GLP-1-(7-36)NH2. Estos péptidos son el resultado de la escisión selectiva de la molécula del proglucagón.
La secreción de GLP-1 por las células L del íleon depende de la presencia de nutrientes en la luz del intestino delgado. Los secretagogos (agentes que provocan o estimulan la secreción) de esta hormona incluyen nutrientes importantes como carbohidratos, proteínas y lípidos. Una vez en la circulación, el GLP-1 tiene una vida media de menos de 2 minutos, debido a la rápida degradación por la enzima dipeptidil peptidasa-4.
El GLP-1 es una potente hormona antihiperglucémica que induce a las células beta del páncreas a liberar la hormona insulina en respuesta al aumento de glucosa, mientras que suprime la secreción de glucagón. Tal acción dependiente de la glucosa es en particular atractiva porque una liberación no regulada de insulina, cuando la concentración de glucosa plasmática está en el intervalo normal de ayuno, o las inyecciones de insulina mal sincronizadas, puede provocar una caída peligrosa de la concentración de glucosa en sangre: hipoglucemia. Esto no sucede como resultado del GLP-1 porque el GLP-1 deja de estimular a las células p para que liberen más insulina cuando los niveles de glucosa en sangre están en el intervalo de ayuno. Además, el GLP-1 inhibe la secreción y la motilidad gástricas. Esto retrasa y prolonga la absorción de carbohidratos y contribuye a un efecto saciante.
Identidad: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro «identidad».
El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementó en el programa Needle del Paquete EMBOSS (Rice et al., 2000, http://emboss.org), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como «identidad más larga» (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la manera siguiente:
(residuos idénticos x 100) / (longitud de la alineación - número total de espacios en la alineación)
Promoción del crecimiento magro: El término «promoción del crecimiento magro» o «mejora del crecimiento magro» como se usa en esta invención se refiere a la alimentación de ganado o animales domésticos, por ejemplo, vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos, patos, gansos, palomas, pavos, codornices y pollos en la industria de producción de carne donde el objetivo es un aumento rápido pero magro de la masa corporal.
Ganadería: bovinos, equinos, aves de corral y animales similares mantenidos para uso doméstico.
Microbiota normal: el término «microbiota normal» se utiliza en esta invención para indicar una microbiota que no es disbiótica. La microbiota normal se caracteriza por tener una gran riqueza genética y de filos. La microbiota normal se caracteriza por comprender bacterias pertenecientes a los géneros Bacterioidetes, Faecalibacterium, Roseburia, Blautia, Ruminococcus, Coprococcus, Bifidobacterium, Methanobrevibacter, Lactobacillus, Coprococcus, Clostridium, Akkermansia o Eubacterium
Los términos «tratamiento» y «tratar», como se usan en esta invención se refieren a la gestión y atención de un paciente con el fin de combatir una afección, enfermedad o trastorno. El término pretende incluir el espectro completo de tratamientos para una afección dada de la cual esté padeciendo el paciente, tal como administración del compuesto activo para los efectos de: mejorar o aliviar los síntomas o complicaciones; retrasar la progresión de la afección, enfermedad o trastorno; curar o eliminar la afección, enfermedad o trastorno; y/o prevenir la afección, enfermedad o trastorno, donde "prevenir" o "prevención" se debe entender que se refiere al manejo y cuidado de un paciente para efectos de impedir, reducir o retrasar el desarrollo de la afección, enfermedad o trastorno, e incluye la administración de los compuestos activos para prevenir o reducir el riesgo del inicio de síntomas o complicaciones. El paciente a tratar es preferentemente un mamífero, en particular un ser humano. Los pacientes que se van a tratar pueden tener distintas edades.
Sujeto, paciente: un sujeto es un individuo de una de las especies de mamíferos o aves de corral descritas en esta invención. Un «paciente» es un sujeto que padece, se sospecha que padece o que ha sido diagnosticado con un trastorno particular.
Alfa defensinas de mamíferos y aves de corral y beta defensinas de mamíferos y aves de corral
Esta descripción se refiere a los usos de defensinas, alfa y/o beta defensinas de mamíferos y aves de corral, como de ganado bovino, porcino u ovino, ratón, mono o caballo y beta defensinas de aves de corral como pollo, pavo, pato, ganso, codorniz o paloma, ratón, mono o humanas, más preferentemente de homínidos, más preferentemente alfa y/o beta defensinas humanas en el tratamiento de las indicaciones descritas en esta invención, que incluyen, pero no se limitan a, inflamación intestinal o cáncer colorrectal, o una enfermedad endocrina, nutricional, metabólica o cardiovascular.
El fragmento LL37 de la catelicidina también se contempla para usos según la descripción. LL37 tiene la secuencia de SEQ ID NO 16.
Según realizaciones en particular preferidas de la presente descripción, las defensinas son alfa o beta defensinas.
En una realización de la presente descripción, LL37, las alfa y/o beta defensinas de mamífero tienen un grado de identidad de al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, y lo más preferentemente al menos un 95 % de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 y/o SEQ ID NO 17. En otra realización de la presente descripción, una defensina difiere de una de las SEQ ID NO:1-17 en menos de 10, como menos de 8, por ejemplo, menos de 5, como menos de 4, por ejemplo, menos de 3, como menos de 2 aminoácidos.
En una realización preferida de la presente descripción, las alfa defensinas humanas consisten en (alfa defensina 5 (SEQ ID NO: 8) y/o alfa defensina 6 (SEQ ID NO:9). En una realización preferida de la presente descripción, las beta defensinas de mamíferos consisten en beta defensina 1 humana (SEQ ID NO:4), beta defensina 2 humana (SEQ ID NO:5), beta defensina 3 humana (SEQ ID NO:6), beta defensina 4 humana (Se Q ID NO:7), y/o beta defensina 2 humana truncada (SEQ ID NO 17).
En una realización preferida de la presente descripción, una alfa defensina humana tiene un grado de identidad de al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, y lo más preferentemente al menos un 95 % de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En una realización preferida de la presente descripción, las alfa defensinas de mamífero humana consisten en alfa defensina 5 (SEQ ID NO:8). En una realización preferida de la presente descripción, la beta defensina humana tiene un grado de identidad de al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95 % de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización preferida de la presente descripción, la beta defensina humana consiste en beta defensina 2 humana (SEQ ID NO: 5). Otra beta defensina humana preferida es la beta defensina 2 humana truncada (SEQ ID NO:17). hBD-2 truncado (SE ID NO:17) tiene efectos antiinflamatorios comparables a los de hBD-2 (SEQ iD NO:5) (WO 2013/026794).
En el caso de especies distintas de los seres humanos, los sujetos se tratan preferentemente con una defensina procedente de la misma especie o una especie relacionada o una defensina que comparta al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, y lo más preferentemente al menos un 95 % de la secuencia de aminoácidos de una defensina de esa misma especie (por ejemplo, la defensina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO:1-3 y 10-15). Por ejemplo, es concebible que las aves de corral puedan tratarse con una defensina ortóloga de la misma u otra especie de ave.
En otra realización más de la presente descripción, las alfa defensinas de mamíferos forman parte de alfa defensinas humanas y/o alfa defensinas de ratón y variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Preferiblemente, la alfa defensina de mamífero es una alfa defensina humana, que puede consistir en alfa defensina 5 humana, alfa defensina 6 humana y variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Más preferentemente, las alfa defensinas de mamíferos consisten en alfa defensina 5 humana y variantes u ortólogos funcionalmente equivalentes de las mismas.
En otra realización más de la presente descripción, las beta defensinas de mamíferos consisten en beta defensinas humanas y/o beta defensinas de ratón y variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Preferiblemente, las beta defensinas de mamíferos o aves de corral consisten en beta defensina 1 humana, beta defensina 2 humana, beta defensina 3 humana, beta defensina 4 humana, beta defensina 2 de chimpancé, beta defensina 2 de macaco y beta defensina 3 de ratón, beta defensina 2 de orangután, beta defensina 2 de caballo, beta defensina 1 porcina, beta defensina 2 caprina, beta defensina 2 bovina, beta defensina 2 de pollo y variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Más preferentemente, las beta defensinas de mamífero comprenden beta defensina 1 humana, beta defensina 2 humana, beta defensina 3 humana, beta defensina 4 humana y variantes funcionalmente equivalentes de las mismas. Aún más preferentemente, las beta defensinas de mamíferos consisten en beta defensina 2 humana y variantes u ortólogos funcionalmente equivalentes de las mismas.
En una realización de la presente descripción, los procedimientos comprenden la administración de una cantidad eficaz de al menos una a-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que necesite dicho tratamiento. En otras realizaciones de la presente descripción, los procedimientos proporcionados comprenden la administración de una cantidad eficaz de al menos una p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que necesite dicho tratamiento. En una realización adicional de la presente descripción, los procedimientos proporcionados comprenden la administración de una cantidad eficaz de al menos una a-defensina de mamífero o aves de corral y al menos una pdefensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que necesite dicho tratamiento. Una realización preferida de la presente descripción proporciona la administración de alfa defensina HD5 de mamífero y/o la beta defensina hBD-2 de mamífero.
Una «variante funcionalmente equivalente» de una alfa o beta-defensina de un mamífero (p. ej.,humano) o ave de corral es una beta-defensina modificada de mamífero (p. ej., humano) o ave de corral o que muestra aproximadamente el mismo efecto en la microbiota en el intestino que la alfa y/o beta-defensina original de mamífero (p. ej., humano) o ave de corral. Una variante funcionalmente equivalente de una defensina de mamífero (p. ej., humano) o de ave de corral puede comprender modificaciones de 1-5 aminoácidos, preferentemente modificaciones de 1-4 aminoácidos, más preferentemente modificaciones de 1-3 aminoácidos, más preferentemente modificaciones de 1-2 aminoácidos(s), y en particular una modificación de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la defensina de mamífero (p. ej., humano) o de ave de corral. Preferiblemente, para las beta-defensinas de mamíferos, en comparación con la beta-defensina 2 humana, que tiene la SEQ ID NO 5.
El término «modificación» significa en esta invención cualquier modificación química de una defensina de mamífero (p. ej., humano) o de aves de corral. Las modificaciones pueden ser sustituciones, eliminaciones y/o inserciones del o de los aminoácidos, así como sustituciones de las cadenas laterales de los aminoácidos; o uso de aminoácidos no naturales con características similares en la secuencia de aminoácidos. En particular, la modificación o modificaciones pueden ser amidaciones, tales como amidación del extremo C-terminal.
Preferiblemente, las modificaciones de aminoácidos son de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan considerablemente al plegamiento y/o actividad del polipéptido; eliminaciones únicas; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales; o una pequeña extensión que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, como una etiqueta de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. En una realización de la presente descripción, la pequeña extensión, como una etiqueta de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión se une a la alfa o beta defensina de mamífero (p. ej., humano) o de aves de corral a través de un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos y dicho enlazador puede contener un sitio de escisión de enzima de restricción. Las alineaciones con Clustal W de las figuras 2 a 5 pueden usarse para predecir qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse sin afectar sustancialmente a la actividad biológica de la proteína. Las secuencias se alinearon usando Clustal W 2.1 (http://www.geno.me.ip/tools/clustalw/) y las configuraciones siguientes: Penalización de espacio abierto: 10, Penalización de extensión de espacio: 0,05, Transición de peso: NO, Residuos hidrófilos para proteínas: GPSNDQE, Espacios hidrófilos: SÍ, Matriz de peso: BLOSUM (para PROTEÍNA). Las sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación «fuerte») deberán considerarse sustituciones conservadoras:
-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.
Las sustituciones dentro del grupo siguiente (Clustal W, grupo de conservación «débil») deberán considerarse sustituciones semiconservadoras:
-C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.
Ejemplos de sustituciones conservadoras son sustituciones realizadas dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y pequeños aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por Neurath y Hill (1979). Los intercambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly.
Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina) pueden sustituirse por residuos de aminoácidos de una polipéptido de tipo salvaje. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden sustituirse por residuos de aminoácidos. Los «aminoácidos no naturales» se han modificado después de la síntesis de proteínas, y/o tienen una estructura química en su(s) cadena(s) lateral(es) distinta a la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales se pueden sintetizar químicamente y, preferentemente, están disponibles comercialmente e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.
Los aminoácidos esenciales en una alfa y/o beta defensina de mamíferos o aves de corral se puede identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se analizan para determinar su actividad biológica (es decir, actividad contra una enfermedad inflamatoria intestinal y/o supresión de la actividad de TNF-alfa) para identificar residuos de aminoácidos que sean críticos para la actividad de la molécula. Véase, p. ej., Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir del análisis de identidades con polipéptidos que estén relacionados con las alfa y/o beta defensinas de mamíferos o aves de corral (ver alineación con Clustal W en las figuras 2 a 5).
Pueden realizarse y probarse sustituciones de uno o varios aminoácidos utilizando procedimientos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o transposición, seguido de un procedimiento de selección relevante, como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros procedimientos que pueden usarse incluyen PCR propensa a errores, presentación de fagos (e.g., Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).
Cuando el resultado de una sustitución dada no puede predecirse con certeza, los derivados pueden analizarse fácilmente según los procedimientos anteriormente descritos en esta invención para determinar la presencia o ausencia de actividad biológica.
Las defensinas, tal como se describen en esta invención, pueden estar sujetas a glicosilación. Además, se sabe en la técnica que las defensinas de origen natural pueden someterse a procesamiento proteolítico y escindirse en fragmentos bioactivos más pequeños. Las defensinas glicosiladas y los fragmentos bioactivos de defensinas se incluyen en la presente descripción. Además, dentro del alcance de la presente descripción se incluyen inductores de defensinas. Se sabe en la técnica que, por ejemplo, la vitamina D y E. coli Nissle pueden inducir la secreción de defensinas y, por tanto, pueden usarse para tratar las indicaciones descritas en esta invención.
Combinaciones de alfa y beta-defensinas
En un aspecto de la presente descripción se proporciona una composición que comprende al menos una a-defensina de mamífero o aves de corral y al menos una p-defensina de mamífero o aves de corral. Como se demuestra en los Ejemplos 1 y 3, las defensinas alfa y beta pueden administrarse por vía oral. Una alfa-defensina ejemplar, HD5, en particular disminuye la acumulación de lípidos ectópicos y una beta-defensina ejemplar, hBD-2, en particular mejora la ruta glucorreguladora. Por tanto, la combinación de una alfa y beta defensina puede conducir a un tratamiento en particular eficaz de la obesidad y las indicaciones endocrinas como se describe en esta invención.
La a-defensina de mamífero puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en HD5 y HD6, y la al menos una pdefensina de mamífero puede seleccionarse de entre hBD-1, hBD-2, hBD-3 y hBD-4.
Preferiblemente, la composición comprende HD5 y hBD-2.
La composición puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable y ser estéril y formularse como una disolución estéril e isotónica.
El cociente entre alfa y beta-defensina puede ser cualquier cociente. En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición comprende cantidades esencialmente iguales de al menos una a-defensina de mamífero o de ave de corral y al menos una p-defensina de mamífero o de ave de corral sobre una base de molaridad o una base de peso o una base de mg/ml.
Defensinas de acción prolongada
La vida media de una a- o p-defensina puede extenderse fusionando o conjugando la a- o p-defensina con otra molécula, es decir, construyendo una a- o p-defensina biológicamente activa de acción prolongada unida a una molécula farmacéuticamente aceptable que proporcione una semivida plasmática in vivo de la a- o p-defensina, que aumente sustancialmente en comparación con la semivida plasmática in vivo de la a- o p-defensina administrada de la misma manera que la a- o p-defensina.
Una a- o p-defensina biológicamente activa de acción prolongada que comprende una a-defensina de mamífero o un análogo de la misma o una p-defensina de mamífero o un análogo de la misma unida a una molécula farmacéuticamente aceptable seleccionada de entre una molécula que tiene unión a un receptor de Fc neonatal de mamífero, transferrina o un CH3(CH2)nCO-, donde n está comprendido entre 8 y 22 o un polímero.
El agonista de a- o p-defensina también puede ser de origen no mamífero y puede seleccionarse de entre pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y proteínas.
El agonista de a- o p-defensina puede unirse a la molécula farmacéuticamente aceptable de varias formas como se describe en la literatura de la técnica anterior, tales como, sin limitación, acoplamiento químico a través de un enlazador bifuncional, gen tecnológicamente acoplando el N-terminal o C-terminal de la defensina, tal como a-defensina o pdefensina, a la molécula farmacéuticamente aceptable, tal como albúmina o análogo de albúmina. En particular, el N-terminal de albúmina o un análogo de albúmina, por ejemplo, albúmina humana, puede acoplarse al C-terminal de una a-defensina o p-defensina, o al N-terminal de una a- o p-defensina; o el C-terminal de la albúmina, por ejemplo, la albúmina humana, se puede acoplar al C-terminal de una a-defensina o p-defensina, o al N-terminal de una a- o pdefensina. Puede insertarse una secuencia enlazadora entre la albúmina y la cadena de a o p-defensina. El agonista de a- o p-defensina puede unirse a la molécula farmacéuticamente aceptable a través de un enlazador estable o un enlazador más lábil. Se conocen varios enlazadores en la técnica, que incluyen moléculas de PEG bifuncionales (p. ej., véase Paige et.al Pharmaceutical Research, vol. 12, no. l2 , 1995), hydrolysable linkers (Shechter et al. Bioconjugate Chem. 2005,16: 913- 920 and International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 13, Nos.
1-2, June 2007 y WO2009095479), PDPH y EMCH, véase, p. ej., en WO2010092135. En el caso especial donde la conjugación química (unión de dos o más moléculas) del agonista de a- o p-defensina con la molécula farmacéuticamente aceptable, reduce fuertemente la actividad funcional de a- o p-defensina, puede ser preferible utilizar un enlazador más lábil que pueda liberar el agonista de a o p-defensina funcional.
La extensión de la vida media también se puede lograr mediante la acilación del esqueleto del péptido con un espaciador, por ejemplo, un espaciador de Y-L-glutamil y una cadena de diácido graso C-18 a lisina. La cadena del sitio de diácidos grasos y el espaciador median una unión fuerte pero reversible a la albúmina, lo que ralentiza la liberación del sitio de inyección y reduce la depuración renal.
Procedimientos y usos
Como se demostró en el ejemplo 4, la administración de liraglutida, un análogo del GLP-1, conduce a cambios en la microflora en ratones obesos alimentados con dietas altas en grasas. Los cambios son hacia una microflora más sana o normal, entre otras cosas, con un aumento de especies bacterianas que favorecen la producción de ácidos grasos de cadena corta. Por lo tanto, los inventores contemplan el tratamiento de una microflora disbiótica y otros usos como se describe en esta invención mediante la administración de GLP-1 o un análogo de GLP-1.
Preferiblemente, GLP1 o los análogos de GLP-1 se administran por vía parenteral mediante administración por vía subcutánea o intramuscular. El análogo de GLP-1 puede seleccionarse de entre exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida y dulaglutida.
Se ha descubierto que la alfa defensina 5 humana y la beta defensina 2 humana pueden mantener o estabilizar una microbiota normal en el intestino e incluso tratar o normalizar una microbiota disbiótica en el intestino; lo que muestra una potente actividad como medicamento para el tratamiento del cáncer colorrectal, la inflamación intestinal, las enfermedades endocrinas, nutricionales, metabólicas o cardiovasculares o como promotores del crecimiento magro. Por lo tanto, un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para el tratamiento de la inflamación intestinal en general o para el tratamiento del cáncer colorrectal, una enfermedad endocrina, nutricional, metabólica o cardiovascular mediante la administración de una cantidad eficaz de una a- y/o p-defensina de mamífero a un sujeto que necesite dicho tratamiento. Ejemplos de tales enfermedades son diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, inflamación sistémica de bajo grado, obesidad, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa y enfermedad cardiovascular.
En particular, se ha demostrado que HD5 y hBD-2 pueden usarse para tratar la resistencia a la insulina mejorando la sensibilidad a la insulina y la tolerancia a la glucosa, así como para tratar o prevenir la obesidad. La HD5 en particular puede disminuir la acumulación de lípidos ectópicos mientras que la hBD-2 en particular puede mejorar la eficacia glucorreguladora.
La prevención de la obesidad o la inducción de la pérdida de peso o la prevención del aumento de peso implica preferentemente una reducción o prevención de la acumulación de grasa visceral, una reducción o prevención de un aumento del porcentaje de grasa, o una reducción o prevención del aumento de la circunferencia de la cintura.
Los procedimientos proporcionados pueden tratar o prevenir la inflamación intestinal cambiando los fenotipos bacterianos mediante un cambio a nivel transcripcional, así como la estructura y composición de la flora bacteriana intestinal de un sujeto afectado por una de dichas afecciones como se describe en esta invención.
Los procedimientos proporcionados pueden tratar el cáncer colorrectal, enfermedades endocrinas, nutricionales, metabólicas o cardiovasculares cambiando la estructura y composición de la microbiota intestinal y, por tanto, el metaboloma de un sujeto afectado por una de dichas afecciones como se describe en esta invención.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para el tratamiento de la inflamación intestinal en humanos, en los que la inflamación se localiza en la boca, esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon, recto, y/o canal anal de un animal, mediante la administración de una cantidad eficaz de a-defensina de mamífero y/o p-defensina a un sujeto que necesite dicho tratamiento. Preferiblemente, la defensina es alfa defensina humana. En otras realizaciones preferidas de la presente descripción, la defensina es una beta-defensina humana, preferentemente hBD-2, y la inflamación se reduce en la boca, esófago, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, recto y/o canal anal.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para el tratamiento de la inflamación intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de una a-defensina y una p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que necesite dicho tratamiento.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para estabilizar o mantener una microbiota normal en el intestino. Otro aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para el tratamiento o normalización de una microbiota disbiótica en el intestino mediante la administración de una cantidad eficaz de a- y/o p-defensina de mamífero o ave de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento.
Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona procedimientos para aumentar la riqueza genética de la microbiota intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de una a- y/o p-defensina de mamífero o ave de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para aumentar el número de filos de la microbiota intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de a- y/o p-defensina de mamífero o ave de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para aumentar la producción de butirato y/o disminuir la producción de acetato de la microbiota intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de ay/o p-defensina de mamífero o ave de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento.
Un aspecto adicional de la presente descripción proporciona procedimientos para aumentar la producción de ácidos grasos de cadena corta de la microbiota intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de una a- y/o pdefensina de mamífero o ave de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento.
Algunos aspectos de la presente descripción proporcionan procedimientos para aumentar el número de bacterias pertenecientes a un género seleccionado de entre un grupo compuesto por Bacterioidetes, Faecalibacterium, Roseburia, Blautia, Ruminococcus, Coprococcus, Bifidobacterium, Methanobrevibacter, Lactobacillus, Clostridium, Allobaculum, Alloprevotella, Akkermansia, Eubacterium en la microbiota intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de a- y/o p-defensina de mamífero o ave de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento. Preferiblemente, las bacterias son Allobaculum, Alloprevotella, Akkermansia, o Lactobacillus.
En una realización preferida de la presente descripción, se utilizan procedimientos para aumentar el número de bacterias seleccionadas de entre un grupo compuesto por Bacteroides vulgatus, Bacteroides caccae, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia intestinalis, Blautia hansenii, Ruminococcus gnavus, Coprococcus comes, Clostridium nexile, Clostridium bolteae, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium dentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Akkermansia muciniphila, Eubacterium rectale. Los procedimientos proporcionados aumentan la cantidad de bacterias típicas de una microbiota intestinal sana.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para disminuir el número de bacterias pertenecientes a un género seleccionado de entre un grupo compuesto por Bacteroidetes fragilis, Sutturella wadsworthia, Veillonella parvula, Escherichi coli, Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corodens, Gemella moribillum en la microbiota intestinal mediante la administración de una cantidad eficaz de a- y/o p-defensina de mamífero o aves de corral y/o GLP-1 / análogo de GLP-1 a un sujeto que necesite tal tratamiento. Los procedimientos proporcionados reducen el número de bacterias que son típicas de una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite tratamiento.
Por lo tanto, la inflamación intestinal, el cáncer colorrectal, las enfermedades endocrinas, nutricionales, metabólicas o cardiovasculares descritas que pueden tratarse utilizando los procedimientos descritos en las realizaciones preferidas de la presente descripción se caracterizan por una microbiota disbiótica en el intestino de los sujetos que necesiten el tratamiento. En algunas realizaciones de la presente descripción, una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite el tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos tiene una baja riqueza genética. En otras realizaciones de la presente descripción, una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite el tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos tiene un número bajo de filos. En otras realizaciones de la presente descripción, una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite el tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos tiene una producción aumentada de acetato de la microbiota. Mediante los procedimientos descritos, la producción aumentada de acetato puede reducirse a favor de la producción de butirato.
En realizaciones preferidas de la presente descripción, una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos tiene un número bajo de bacterias pertenecientes a un género seleccionado de entre un grupo compuesto por Bacterioidetes, Faecalibacterium, Roseburia, Blautia, Ruminococcus, Coprococcus, Bifidobacterium, Methanobrevibacter, Lactobacillus, Clostridium, Allobaculum, Alloprevotella Akkermansia, y Eubacterium. En realizaciones más preferidas de la presente descripción, una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite el tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos tiene un número bajo de bacterias seleccionadas de entre un grupo compuesto por Bacteroidetes vulgatus, Bacteroides caccae, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia intestinalis, Blautia hansenii, Ruminococcus gnavus, Coprococcus comes, Clostridium nexile, Clostridium bolteae, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium dentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Akkermansia muciniphila, Eubacterium rectale. En realizaciones adicionales de la presente descripción, una microbiota disbiótica en el intestino de un sujeto que necesite tratamiento tiene un alto número de bacterias seleccionadas de entre un grupo compuesto por Bacteroides fragilis, Sutturella wadsworthia, Veillonella parvula, Escherichi coli, Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corodens, Gemella moribillum.
Los procedimientos descritos en las realizaciones preferidas de la presente descripción pueden, mediante la administración de al menos una alfa defensina de mamífero o aves de corral y/o al menos una beta defensina de mamífero o aves de corral y/o al menos un GLP-1 / análogo de GLP-1 tratar una microbiota disbiótica y un metaboloma.
Los procedimientos descritos se pueden utilizar para el tratamiento, la prevención o la normalización de una microbiota disbiótica y/o metaboloma en el intestino de un sujeto que haya emprendido y/o esté realizando un tratamiento con antibióticos o quimioterapia o inmunoterapia o terapia inmunosupresora u otro tratamiento que tenga efectos negativos sobre la microbiota intestinal.
Los procedimientos descritos también pueden usarse para el tratamiento, la prevención o la normalización de una microbiota disbiótica en la boca de un sujeto, tal como un sujeto afectado por periodontitis, incluida la gingivitis. La periodontitis pueden provocarla el tabaquismo y el estrés y también pueden inducirla fármacos, por ejemplo, por quimioterapia, inmunoterapia y terapia inmunosupresora.
El sujeto que necesite el tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos se verá afectado por inflamación intestinal o cáncer colorrectal o una enfermedad endocrina, nutricional, metabólica o cardiovascular. En una realización de la presente descripción, el sujeto que necesita el tratamiento tiene un IMC de 25 o más, como 30 o más, por ejemplo 35 o más, como 40 o más. En otra realización de la presente descripción, el sujeto que necesita el tratamiento tiene una relación cintura/cadera de al menos 0,80, por ejemplo 0,80-0,84, como al menos 0,85 (hembras) o al menos 0,90, por ejemplo 0,9-0,99, como por encima de 1,00 (machos). En una realización adicional de la presente descripción, el sujeto que necesita el tratamiento tiene una glucemia en ayunas de al menos 6,1 mmol/l, por ejemplo, al menos 7,0 mmol/l. En una realización aún más de la presente descripción, el sujeto que necesita el tratamiento tiene un nivel de hemoglobina glucosilada (HbA1C) de al menos 42 mmol/mol Hb, como entre 42 y 46 mmol/mo1Hb, como al menos 48 mmol/mol Hb.
El sujeto que necesita el tratamiento proporcionado por los procedimientos descritos puede presentar uno o más de los siguientes síntomas:
• Presión arterial elevada: >140/90 mmHg;
• Dislipidemia: triglicéridos (TG): >1,695 mmol/l y colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) <0,9 mmol/l (machos), <1,0 mmol/l (hembras);
• Obesidad central: relación cintura/cadera >0,90 (machos); >0,85 (hembras) o índice de masa corporal >30 kg/m2;
y
• Microalbuminuria: cociente de excreción urinaria de albúmina >20 pg/min o relación albúmina/creatinina >30 mg/g.
En una realización de la presente descripción, la administración de al menos una a-defensina de mamífero o aves de corral y/o al menos una p-defensina de mamífero o de aves de corral, según los procedimientos descritos, es generalmente por vía oral.
Las alfa y beta defensinas de mamíferos o aves de corral pueden emplearse terapéuticamente en composiciones formuladas para la administración por cualquier vía convencional. En una realización de la presente descripción, las alfa y/o beta defensinas de mamíferos y aves de corral se administran por vía oral. Se sabe que la beta-defensina 2 humana se puede administrar por vía oral para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal en el colon. Los inventores actuales han demostrado sorprendentemente que también una alfa defensina humana, HD5, puede administrarse por vía oral y que mantiene su bioactividad en el intestino, a pesar de pasar por el estómago ácido.
La administración por vía oral es normalmente para la administración de fármacos por vía enteral, donde el agente se administra a través de la mucosa enteral. Sin embargo, como lo demuestran los inventores actuales, la hBD-2 no se absorbe en el intestino en ningún grado detectable. Se espera que otras defensinas tampoco se absorban en el intestino.
En una realización de la presente descripción, las alfa y/o beta defensinas de mamíferos y aves de corral se administran por vía subcutánea. En particular, se contempla que hBD-2 y HD5 se puedan administrar por vía subcutánea.
En algunas realizaciones de la presente descripción, las composiciones de las realizaciones preferidas de la presente descripción pueden formularse como un liofilizado, utilizando excipientes apropiados que proporcionen estabilidad como un liofilizado y después de la rehidratación.
Composiciones farmacéuticas o de piensos que contienen una alfa defensina de mamífero y/o una beta defensina de mamífero, como una alfa defensina humana y/o una beta defensina humana, se pueden fabricar según procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante procedimientos de mezcla, granulación, recubrimiento, disolución o liofilización. En una realización preferida de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas que contienen alfa defensina de mamífero y/o una beta defensina de mamífero se formulan como una disolución estéril e isotónica.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas comprenden, en una realización de la presente descripción, al menos una alfa defensina de mamífero. Ejemplos de alfa defensinas de mamíferos son HD5 y HD6. En una realización preferida de la presente descripción, las composiciones comprenden la alfa defensina HD5 de mamífero. Las composiciones farmacéuticas comprenden, en otra realización de la presente descripción, al menos una beta defensina de mamífero. Ejemplos de beta defensinas de mamíferos son hBD1, hBD-2, hBD3 y hBD4. En una realización preferida de la presente descripción, las composiciones comprenden la beta defensina hBD-2 de mamífero. Las composiciones farmacéuticas comprenden, en una realización adicional de la presente descripción, al menos una alfa defensina de mamífero y al menos una beta defensina de mamífero. Ejemplos de alfa defensinas de mamíferos son HD5 y HD6. Ejemplos de beta defensinas de mamíferos son hBD1, hBD2, hBD3 y hBD4. En una realización preferida de la presente descripción, las composiciones comprenden la alfa defensina HD5 de mamífero y la beta defensina hBD-2 de mamífero. En otras realizaciones de la presente descripción, las composiciones o composiciones alimenticias comprenden una o más defensinas no humanas seleccionadas de entre defensinas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 1-3 y 10-17, así como variantes de secuencia y fragmentos como se definen en esta invención.
Las composiciones farmacéuticas de las realizaciones preferidas de la presente descripción comprenden una alfa defensina de mamífero y/o una beta defensina de mamífero, como una alfa defensina humana y una beta defensina humana, y un portador farmacéuticamente aceptable y/o diluyente.
Vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables y aceptables para alimentación animal son familiares para los expertos en la técnica. Para composiciones formuladas como disoluciones líquidas, vehículos y/o diluyentes aceptables incluyen solución salina y agua estéril y pueden incluir opcionalmente antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y otros aditivos habituales.
El compuesto descrito se puede formular en una amplia variedad de formulaciones para administración por vía oral. Las preparaciones en forma sólida pueden incluir polvos, comprimidos, gotas, cápsulas, obleas, pastillas para chupar y gránulos dispersables. Otras formas adecuadas para la administración por vía oral pueden incluir preparaciones en forma líquida que incluyen emulsiones, jarabes, elixires, disoluciones acuosas, suspensiones acuosas, pasta de dientes, dentífrico en gel, goma de mascar o preparaciones en forma sólida que estén destinadas a convertirse poco antes de su uso en preparaciones en forma líquida, tales como disoluciones, suspensiones y emulsiones.
El compuesto descrito se puede formular en una amplia variedad de formulaciones para administración por vía subcutánea.
La formulación puede contener (además de una alfa defensina de mamíferos y/o una beta defensina de mamífero y otros ingredientes activos opcionales) vehículos, rellenos, desintegradores, acondicionadores de flujo, azúcares y edulcorantes, fragancias, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica, tampones, diluyentes, agentes dispersantes y tensioactivos, aglutinantes, lubricantes, y/u otros excipientes farmacéuticos conocidos en la técnica.
Un experto en esta técnica puede formular además alfa defensinas de mamíferos o aves de corral y beta defensinas de mamíferos o aves de corral de una manera apropiada y según prácticas aceptadas, tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro (1990).
Una alfa defensina de mamífero y una beta defensina de mamífero, como una alfa defensina humana y una beta defensina humana, se pueden utilizar solas o en terapias de combinación con uno, dos o más de otros compuestos farmacéuticos o sustancias farmacéuticas, por ejemplo, con insulina / análogos de la insulina y/o un péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogo del GLP-1 y/o un péptido similar al glucagón 2 (GLP-2) / análogo del GLP-2 y/o un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) y/o metformina y/o un inhibidor del transportador de glucosa de sodio-2 (SGLT-2) y/o un antagonista del receptor de glucagón y/o un antagonista del miembro 1 de la subfamilia V del canal catiónico potencial del receptor transitorio (TRPV1) y/o con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, la insulina o análogos de la insulina o GLP-1 o análogos de GLP1 se administran por vía parenteral mediante administración por vía subcutánea o intramuscular. El análogo de GLP-1 puede seleccionarse de entre exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida y dulaglutida, y el análogo de insulina puede seleccionarse de entre insulina lispro, aspart, glulisina, insulina detemir, insulina degludec e insulina glargina.
Una alfa defensina de mamífero y una beta defensina de mamífero, como una alfa defensina humana y una beta defensina humana, también pueden usarse en tratamientos combinados con quimioterapia, inmunoterapia, radioterapia o una combinación de estas.
Procedimientos y usos en la ganadería
Los procedimientos descritos en esta invención se pueden usar con ganado para mejorar sus tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia. Los procedimientos podrían, por ejemplo, utilizarse como alternativa a los antibióticos.
Un aspecto de la presente descripción proporciona procedimientos para el tratamiento de la inflamación intestinal en animales no humanos mediante la administración de una cantidad eficaz de una a-defensina y/o una / p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que necesite dicho tratamiento.
Otro aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para promover el crecimiento magro en la producción de carne animal, donde dicho procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una a- y/o p-defensina de mamífero o aves de corral a un sujeto que lo necesite. Las defensinas se pueden utilizar como alternativas a las hormonas, los esteroides y los antibióticos. Como se demuestra en los Ejemplos 1 y 3, la administración de HD5 y hBD-2 a ratones alimentados con una dieta alta en grasas promueve el crecimiento magro ya que previene la acumulación de masa grasa.
Síntesis in vitro
Las alfa-defensinas de mamíferos y aves de corral y las beta-defensinas de mamíferos y aves de corral pueden prepararse mediante síntesis in vitro usando procedimientos convencionales como los conocidos en la técnica. Se encuentran disponibles varios aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automáticos de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Mediante el uso de sintetizadores, los aminoácidos naturales pueden sustituirse por aminoácidos no naturales, en particular isómeros D (o formas D), por ejemplo, D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales que tienen distintas longitudes o funcionalidades y similares. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza necesaria y similares.
Puede proporcionarse un enlace químico a varios péptidos o proteínas que comprendan funcionalidades útiles para el enlace, tales como grupos amino para la formación de amida o amina sustituida, p. ej., aminación reductora, grupos tiol para la formación de tioéter o disulfuro, grupos carboxilo para la formación de amida y similares.
Si se desea, se pueden introducir varios grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, lo que permite la unión a otras moléculas o a una superficie. Por tanto, las cisteínas se pueden usar para fabricar tioéteres, histidinas para unirse a un complejo de iones metálicos, grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, grupos amino para formar amidas y similares.
Las alfa defensinas de mamíferos y aves de corral y las beta defensinas de mamíferos y aves de corral, o sus equivalentes funcionales, también pueden aislarse y purificarse según procedimientos convencionales de síntesis recombinante. La síntesis recombinante se puede realizar usando vectores de expresión apropiados y un sistema de expresión eucariota. Por ejemplo, se puede preparar un lisado del huésped de expresión y purificar el lisado usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. Los procedimientos para la expresión recombinante de la beta defensina 2 humana en E. coli se describen en WO 2010/007166 (Novozymes).
Dosificaciones
Una alfa defensina de mamífero y una beta defensina de mamífero, como una alfa defensina humana y una beta defensina humana, se emplean preferentemente en composiciones farmacéuticas en una cantidad que sea eficaz para tratar la inflamación intestinal, el cáncer colorrectal, una enfermedad endocrina, nutricional, metabólica o cardiovascular, preferentemente con una toxicidad aceptable para el paciente. Una alfa defensina de mamífero o de aves de corral y una beta defensina de mamífero o de aves de corral se aplican preferentemente en la alimentación animal para promover el crecimiento magro. Una alfa defensina de mamífero o aves de corral y una beta defensina de mamífero o aves de corral, como una alfa defensina humana y una beta defensina humana, también se emplean preferentemente en composiciones farmacéuticas o en alimentos para animales en una cantidad que sea eficaz para mantener una composición de microbiota normal en el intestino o para tratar o normalizar una microbiota disbiótica en el intestino, preferentemente con una toxicidad aceptable para el paciente o el animal que necesite el tratamiento.
Para tales tratamientos, la dosis apropiada variará, por supuesto, en función de, por ejemplo, la naturaleza química y los datos farmacocinéticos de un compuesto utilizado, el huésped individual, el modo de administración y la naturaleza y gravedad de las afecciones que se hayan tratado. El término «equivalentes en mg de HD5», como se usa en esta invención, se refiere a la concentración equimolar de alfa y beta defensinas humanas en comparación con la concentración de HD5. El término «equivalentes en mg de hBD-2», como se usa en esta invención, se refiere a la concentración equimolar de alfa y beta defensinas humanas en comparación con la concentración de hBD-2. Como los pesos moleculares de las defensinas descritas son comparables, el término «equivalente en mg de HD5» y «equivalente en mg de hBD-2» puede significar simplemente mg de la defensina utilizada.
Sin embargo, en general, para obtener resultados satisfactorios en mamíferos o aves de corral, por ejemplo en humanos, una dosis diaria indicada de una alfa defensina humana está preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,1 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal; como entre 1 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal y 10 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 1,2 mg de HD5 equivalentes/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día.
En una realización de la presente descripción, una dosis diaria indicada de una beta defensina humana está preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,1 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal; como entre 1 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 1,2 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día.
En una realización de la presente divulgación, una dosis diaria indicada de una alfa defensina humana junto con una beta defensina humana está preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,1 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal; como entre 1 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 1,2 mg de hBD-2 equivalentes/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día.
En general, en mamíferos, por ejemplo en humanos, una dosis diaria indicada de una alfa defensina humana está preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,1 mg de HD5/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de HD5/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg de HD5/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de HD5/kg de peso corporal; como entre 1 mg de HD5/kg de peso corporal y 10 mg de HD5/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de HD5/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de HD5/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de HD5/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg de HD5/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 1,2 mg de HD5/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día. Se pueden usar dosis similares para otras alfa defensinas.
En una realización de la presente descripción una dosis diaria indicada de una beta defensina humana está preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,1 mg de hBD-2/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg de hBD-2/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2/kg de peso corporal; como entre 1 mg de hBD-2/kg de peso corporal y 10 mg de hBD-2/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de hBD-2/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de hBD-2/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de hBD-2/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg de hBD-2/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 1,2 mg de hBD-2/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día. Se pueden usar dosis similares para otras beta defensinas.
Una dosis diaria indicada de una alfa defensina humana junto con una beta defensina humana está preferentemente comprendida entre aproximadamente 0,1 mg de defensina/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de defensina/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg de defensina/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de defensina/kg de peso corporal; como entre 1 mg de defensina/kg de peso corporal y 10 mg de defensina/kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de defensina/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg de defensina/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1,2 mg de defensina/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg de defensina/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 1,2 mg de defensina/kg de peso corporal, por ejemplo, administrada en dosis divididas hasta una, dos o tres veces al día.
Cuando se administran dos defensinas distintas en una dosis, la dosis puede comprender cantidades iguales o aproximadamente iguales de las dos defensinas determinadas en base al peso o en base molar. La proporción también puede diferir de modo que el cociente entre alfa defensina y beta defensina varíe entre 10:1 y 1:10, como entre 5:1 y 1:5, por ejemplo, entre 2:1 y 1:2 determinado en base al peso o en base molar.
La dosis diaria podría corresponder a 0,6 mg de HD5/kg peso corporal más 0,6 mg hBD-2/kg peso corporal.
Los compuestos de las realizaciones preferidas de la presente descripción se pueden administrar a mamíferos o aves de corral, por ejemplo seres humanos, lechones o terneros mediante modos de administración similares en dosis similares a las utilizadas convencionalmente.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas o composiciones de piensos para animales de las realizaciones preferidas de la presente descripción pueden incluir una alfa defensina de mamífero o aves de corral y/o una beta defensina de mamífero o aves de corral, como una alfa defensina humana y/o una beta defensina humana, en una cantidad entre aproximadamente 0,5 mg o menos y aproximadamente 1500 mg o más por forma de dosificación unitaria, preferentemente entre aproximadamente 0,1, 0,3, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9 mg y aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 mg, y más preferentemente entre aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 , 20 o 25 mg y aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg. En ciertas realizaciones de la presente descripción, sin embargo, pueden preferirse dosis más bajas o más altas que las mencionadas anteriormente. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las concentraciones y dosis apropiadas. En determinadas formas de realización de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas de las formas de realización preferidas de la presente descripción incluyen una alfa defensina de mamífero, tal como una alfa defensina humana. En otras realizaciones de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas de las realizaciones preferidas de la presente descripción incluyen una beta defensina de mamífero, tal como una beta defensina humana. En realizaciones adicionales de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas de las realizaciones preferidas de la presente descripción incluyen una alfa defensina de mamífero y una beta defensina de mamífero, tal como una alfa defensina humana y una beta defensina humana, donde la alfa y la beta defensina están presentes en cantidades iguales en base a la molaridad o en base de mg/ml.
En una realización de la presente descripción, la alfa y/o beta defensina de mamífero o ave de corral se administra al menos una vez al día, como al menos dos veces al día, por ejemplo, al menos 3 veces al día.
Ejemplos
Los ejemplos que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención.
Ejemplo 1.
Modulación de la microbiota intestinal y prevención de la inflamación intestinal y el síndrome metabólico mediante tratamiento profiláctico con defensinas.
Materiales y Procedimientos
Ratones: Los ratones se alojaron en tríos, 4 jaulas por grupo. La ingesta de alimento se registró diariamente justo antes de que se apagaran las luces (6 pm). Se sometieron ratones individuales a procedimientos experimentales cambiando el orden tanto en grupo como en jaula. Los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente durante un ciclo de lu/oscuridad de 12 horas en condiciones estándar SPF.
Dietas: Para la administración, el peso promedio se estimó en 25 gramos por ratón. Consumen aproximadamente 3 gramos de alimento por ratón por día.
Régimen de tratamiento (figura 1A): Se alimentó a los ratones con una dieta alta en grasas (HFD) o una dieta de control baja en grasas (LF). La HFD contiene 4 subgrupos; 1 hBD-2, 1 HD5, 1 hBD-2/HD5 y 1 HFD estándar sin suplementación de defensinas. La concentración de defensina es de 1,2 mg de hBD-2 por kg de ratón por día. La HD5 se administra en concentración equimolar a la hBD-2. El grupo combinatorio recibe un 50 % de hBD-2 un 50 % HD5, por lo tanto, una cantidad total de defensinas equivalente a los grupos de prueba restantes.
Pruebas: prueba de tolerancia a la insulina (ITT), prueba de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS), prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral (OGTT) y prueba de insulina en ayunas de cinco horas durante dos días, con el 50 % de los ratones por grupo por día, lo que evita la variación del día a día como factor de confusión.
Se realizaron análisis microbianos para estudiar la microbiota del intestino. La caracterización longitudinal de 16S se llevó a cabo en 4 muestras pareadas de 60 ratones, 240 muestras en total. Se tomaron muestras de cada ratón antes del cambio de dieta, 1 semana después del cambio de dieta, 4 semanas después del cambio de dieta y al finalizar, lo que asegura una caracterización completa de la microbiota fecal como resultado del tratamiento con defensina. Además, el contenido del intestino delgado se analizó al finalizar, lo que proporcionó información valiosa sobre posibles alteraciones en el sitio clave de absorción de nutrientes.
Se puede realizar un perfil metabolómico completo del contenido cecal para permitir la traducción de las alteraciones microbianas en el metabolismo de todo el cuerpo. También se puede realizar un análisis histológico e inmunohistoquímico detallado de duodeno, yeyuno, íleon y colon.
Los resultados del tratamiento con hBD-2 HD5 se excluyeron del análisis.
Resultados
Cambio de peso. Si bien la ingesta de alimentos fue similar en los tres grupos de dieta experimental (figura 6C), ambos grupos de dieta alta en grasas (HFD) ganaron considerablemente más peso que el grupo de referencia de dieta baja en grasas (LFD) durante el período de estudio de 10 semanas (***p < 0,0001, análisis de la varianza bidireccional, prueba de Tukey). Sin embargo, el grupo HFD hBD-2 ganó considerablemente menos peso que el grupo de referencia HFD (*p = 0,0028) (figura 6A y B).
Desarrollo de masa magra/grasa. La masa magra/grasa se distribuyó por igual entre los tres grupos experimentales al comienzo del estudio (figura 7A y B). Al final del estudio, ambos grupos HFD habían ganado la misma cantidad de masa magra (figura 7B), que era considerablemente más alta que el grupo LFD (*p < 0,0001, análisis de la varianza unidireccional, prueba de Tukey), probablemente debido al aumento de la masa corporal. Al final del estudio, el grupo HFD hBD-2 tendió a aumentar la masa grasa en comparación con el grupo LFD (figura 7B). Sin embargo, esto no fue estadísticamente significativo (*p = 0,25). El grupo h Fd había ganado casi cuatro veces la cantidad de masa grasa en comparación con el grupo LFD y 2 veces la cantidad de masa grasa en comparación con el grupo HFD hBD-2 (*p < 0,0001 y *p = 0,005, respectivamente) (figura 7B).
Prueba de tolerancia a la insulina. Tanto el grupo LFD como el grupo HFD hBD-2 fueron significativamente más sensibles a la insulina que el grupo HFD (p < 0,05) (figura 8a).
Prueba de tolerancia a la glucosa. El grupo de HFD era intolerante a la glucosa con un aclaramiento prolongado de glucosa desde el pico a los 15 min hasta el semiaclaramiento a los 120 min. El grupo LFD tuvo un rápido aclaramiento de glucosa desde el pico a los 15 min. El grupo HFD hBD-2 tuvo un aclaramiento de glucosa ligeramente prolongado pero alcanzó niveles de glucosa considerablemente más bajos que el grupo HFD (p < 0,05) (figura 8B).
Secreción de insulina estimulada por glucosa. El grupo HFD tenía una homeostasis de glucosa alterada con una concentración de insulina considerablemente más alta y sostenida después de la administración de glucosa (p < 0,05). El grupo LFD casi no tuvo aumento en la concentración de insulina después de la estimulación con glucosa. El grupo HFD hBD-2 tenía una concentración de insulina más alta pero no considerablemente distinta a la del grupo l Fd (figura 8C).
Insulina en ayunas de cinco horas. El grupo HFD era profundamente diabético con un nivel de insulina en ayunas considerablemente más alto que el del grupo LFD (*p = 0,0004) y un límite de insulina en ayunas considerablemente más alto que el del grupo HFD hBD-2 (*p = 0,057). No hubo diferencia significativa entre los grupos LFD y HFD hBD-2 (*p = 0,17) (figura 8D).
*Prueba de Tukey, de lo contrario prueba de Dunnett.
Una vez finalizado el estudio del Ejemplo 1, los resultados se han analizado nuevamente y se presentan a continuación y en los dibujos adjuntos:
Cambio de peso. Si bien la ingesta de alimentos fue similar en los tres grupos de dieta experimental, ambos grupos de dieta alta en grasas (HFD) ganaron considerablemente más peso que el grupo de referencia de dieta baja en grasas (LFD) durante el período de estudio de 10 semanas (*p < 0,0001, análisis de la varianza bidireccional, prueba de Tukey). Sin embargo, el grupo HFD hBD-2 ganó considerablemente menos peso que el grupo de referencia HFD (*p = 0,0028) (figura 9A). La figura 9B ilustra la eficiencia de la alimentación y la figura 9C el aporte energético.
Desarrollo de masa magra/grasa. La masa magra/grasa se distribuyó por igual entre los tres grupos experimentales al comienzo del estudio. Al final del estudio, ambos grupos HFD habían ganado la misma cantidad de masa magra, que era considerablemente más alta que el grupo LFD (*p < 0,0001, análisis de la varianza unidireccional, prueba de Tukey), probablemente debido al aumento de la masa corporal. Al final del estudio, el grupo HFD hBD-2 tendió a aumentar la masa grasa en comparación con el grupo LFD. Sin embargo, esto no fue estadísticamente significativo (*p = 0,25). El grupo HFD había ganado casi tres veces la cantidad de masa grasa en porcentaje del peso corporal total en comparación con el grupo LFD y dos veces la cantidad de masa grasa en porcentaje del peso corporal total en comparación con el grupo HFD hBD-2 (*p < 0,0001 y *p = 0,005, respectivamente) (figura 10a). No hubo diferencia estadística entre los tres grupos en términos de peso del hígado (figura 10b), mientras que el grupo HFD hBD-2 tenía considerablemente menos grasa visceral (eWAT) que el grupo HFD (figura 10c).
Prueba de tolerancia a la glucosa. El grupo de HFD era intolerante a la glucosa con un aclaramiento prolongado de glucosa desde el pico a los 15 min hasta el semiaclaramiento a los 120 min. El grupo LFD tuvo un rápido aclaramiento de glucosa desde el pico a los 15 min. El grupo HFD hBD-2 tuvo un aclaramiento de glucosa ligeramente prolongado pero alcanzó niveles de glucosa considerablemente más bajos que el grupo HFD (p < 0,05) (figura 11A).
Secreción de insulina estimulada por glucosa. El grupo HFD tenía una homeostasis de glucosa alterada con una concentración de insulina considerablemente más alta y sostenida después de la administración de glucosa (p < 0,05). El grupo LFD casi no tuvo aumento en la concentración de insulina después de la estimulación con glucosa. El grupo HFD hBD-2 tenía una concentración de insulina más alta pero no considerablemente distinta a la del grupo l Fd (figura 11B).
Prueba de tolerancia a la insulina. Tanto el grupo LFD como el grupo HFD hBD-2 fueron significativamente más sensibles a la insulina que el grupo HFD (p < 0,05) (figura 12A). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de referencia LFD y el grupo HFD hBD-2.
Evaluación del modelo de homeostasis (HOMA-IR). La relación entre la resistencia a la insulina y la función de las células beta según la evaluación del índice HOMA-IR fue estadísticamente significativamente menor para el grupo HFD hBD-2 en comparación con el grupo HFD (figura 12b).
*Prueba de Tukey, de lo contrario prueba de Dunnett.
Conclusiones de hBD-2 como prevención contra el desarrollo de la diabetes y la obesidad en ratones alimentados con una dieta alta en grasas:
- Aumento de peso uniforme (con baja DE intragrupo)
- El 50 % de los ratones alimentados con HFD-hBD-2 tenían un porcentaje de grasa corporal que se parecía al de los ratones de referencia LFD, a pesar de haberlos alimentado con un 60 % de HFD. Algunos ratones tenían un porcentaje de grasa incluso más bajo que los ratones de referencia del grupo LFD con el porcentaje más bajo.
- Los ratones mejor protegidos alimentados con hBD-2 tenían la misma o menor masa de grasa visceral que los ratones de referencia LFD, lo cual es muy inusual en una HFD 60 %.
- Sensibilidad a la insulina mejorada. Los ratones alimentados con hBD-2 no fueron considerablemente distintos a los ratones de referencia LFD. Tanto la prueba de tolerancia a la insulina como la HOMA-IR indican una mejor señalización de la insulina.
- La tolerancia a la glucosa mejoró notablemente en comparación con los ratones de contro1 HFD. Es importante destacar que se mejoraron tanto la tolerancia a la glucosa como la respuesta de la insulina estimulada por glucosa durante el desafío con glucosa. Esto significa que los ratones alimentados con hBD-2 necesitaron menos insulina para manejar el bolo de glucosa mejor que los ratones de control con HFD.
Conclusiones de la HD5 como prevención contra el desarrollo de la diabetes y la obesidad en ratones alimentados con una dieta alta en grasas:
- Los ratones alimentados con HD5 ganaron menos peso que los ratones de control alimentados con HFD (figura 17A), aunque el efecto no fue estadísticamente significativo. También hubo una tendencia hacia una menor eficiencia alimenticia (figura 17B) y aporte energético (figura 17C).
- Los ratones alimentados con HD5 tenían un % de grasa inferior limítrofe (figura 18A) y casi menos grasa visceral que los ratones de control alimentados con HFD (figura 18C). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas con respecto al peso del hígado (figura 18B)
- No hubo una mejora considerable en la tolerancia a la glucosa (figura 19A), secreción de insulina estimulada por glucosa (figura 19B), tolerancia a la insulina (figura 20A) y HOMA-IR (figura 20B), aunque los ratones alimentados con HD5 respondieron mejor que los ratones de control alimentados con HFD. La diferencia entre los resultados obtenidos con hBD-2 y HD5 sugiere diferencias en el modo de acción entre hBD-2 y HD5.
Con respecto a la modulación de la microbiota, los resultados de la figura 21A de la semana 1 del estudio demuestran que ya se ha producido un cambio en la microflora durante la primera semana del estudio. Los tres grupos HFD tienen una microflora comparable distinta a la microflora del grupo LFD.
Al finalizar el estudio después de 10 semanas, la microflora del grupo HFD-HD5 había cambiado y ahora era intermedia entre el grupo LFD y el grupo HFD no tratado (figura 21B). La conclusión es que la administración por vía oral de HD5 conduce a una normalización parcial de la microflora de modo que es más similar a la microflora del grupo LFD que a la del grupo no tratado.
En los grupos de HFD, al finalizar, los ratones tratados con alfa defensina (HD5) mostraron una normalización de la microbiota con una mayor abundancia de Alobaculum y Lactobacillus y una disminución de la abundancia de Clostridium en la microbiota intestinal que los ratones que no fueron tratados (figura 21C ). Allobaculum es una especie productora de ácidos grasos de cadena corta. Lactobacillus es una bacteria con propiedades antiinflamatorias.
Los resultados pueden interpretarse en el sentido de que en los grupos HFD, al finalizar, los ratones tratados con alfa, beta y alfa y beta defensinas muestran una mayor riqueza genética y un mayor número de bacterias en la microbiota intestinal que los ratones que no fueron tratados.
En el grupo de control LFD, al finalizar, los ratones muestran una microbiota sana inalterada en el intestino.
Ejemplo 2. Modulación de la microbiota intestinal por defensinas.
Para la prueba de concepto in vivo se puede emplear el modelo de invertebrados de la polilla de la cera Gallería mellonella (G. mellonella). Las heces se pueden analizar después de la administración de alimentación forzada de ay/o p-defensinas (Giannouli et al. 2014) (Favre-Godal et al. 2014).
Ejemplo 3. Modulación de parámetros de microbiota intestinal, inflamación intestinal y síndrome metabólico mediante tratamiento intervencionista con defensinas en ratones obesos.
Ratones y dietas. El experimento aclara el efecto de hBD-2 y HD5 en el tratamiento del síndrome metabólico (MetS) en ratones obesos inducidos por la dieta. Un período de preinclusión de 13 semanas donde los ratones fueron alimentados con una HFD muy alta (60 % de energía procedente de la grasa) precedió a la intervención. En los análisis finales solo se incluyeron ratones que cumplían los criterios de un aumento de peso mínimo de 12 gramos (aproximadamente el 50 % del peso corporal inicial) durante el período de preinclusión. Los ratones que no cumplieron con estos criterios permanecieron en sus respectivas jaulas como «guardianes» de la jerarquía. Fueron expuestos a todas las pruebas experimentales, pero excluidos de los análisis.
Régimen de tratamiento (figura 1B). Antes de la intervención, todos los ratones fueron explorados por RM y se realizó una OGTT. Las jaulas de ratones se asignaron a grupos experimentales en función de su masa grasa. Todas las medidas posteriores se emparejaron con datos del mismo ratón antes de la intervención.
Un grupo de referencia de LFD (dieta baja en grasas) se desarrolló en paralelo. Como controles para la intervención se incluyeron 2 grupos adicionales: 1 HFD muy alta y 1 LFD. Los ratones experimentales permanecieron en el grupo HFD muy alta durante la intervención. Los ratones estuvieron en la dieta experimental durante 10 semanas. Se alojaron juntos durante todo el experimento, 4 ratones por jaula, 3 jaulas por grupo. Todas las pruebas se realizaron durante 3 días, 1 jaula por grupo por día.
Pruebas. Prueba de tolerancia a la insulina (ITT), prueba de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS), prueba de tolerancia a la glucosa por vía oral (OGTT) y prueba de insulina en ayunas de cinco horas durante tres días, con 1/3 de los ratones por grupo por día, lo que evita la variación del día a día como factor de confusión.
Pueden realizarse análisis microbianos para estudiar la microbiota del intestino. La caracterización longitudinal 16S se puede realizar en 7 muestras pareadas de 60 ratones, 240 muestras en total. Se pueden tomar muestras de cada ratón antes del cambio de dieta, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas después del cambio de dieta y al finalizar, lo que asegura una caracterización completa de la microbiota fecal como resultado del tratamiento con defensina.
Además, el contenido del intestino delgado puede analizarse al finalizar (mediante 16S o secuenciación profunda), lo que proporcionó información valiosa sobre posibles alteraciones en el sitio clave de absorción de nutrientes.
Por último, se puede realizar un perfil metabolómico completo del contenido cecal para permitir la traducción de las alteraciones microbianas en el metabolismo de todo el cuerpo. También se puede realizar un análisis histológico e inmunohistoquímico detallado de duodeno, yeyuno, íleon y colon.
hBD-2 como tratamiento del síndrome metabólico en ratones obesos alimentados con una dieta alta en grasas.
Resultados:
Cambio de peso. Los grupos alimentados con la dieta estándar alta en grasas (HFD) tuvieron una ingesta de alimentos igual durante todo el período de estudio y tuvieron el mismo desarrollo de peso con igual masa magra y grasa las primeras 13 semanas, por lo que tuvieron el mismo punto de partida antes de la intervención dietética. El aumento de peso fue considerablemente mayor que en el grupo alimentado con dieta baja en grasas (LFD) (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional) (figura 13A). Después de la intervención dietética, los grupos HFD continuaron aumentando de peso, sin embargo, el grupo HFD hBD-2 tendió a ganar menos peso las primeras 4 semanas después de la intervención dietética, aunque no considerablemente. (*p = 0,07 análisis de la varianza bidireccional). Desde la semana 4 hasta el final del período de estudio, el grupo HFD hBD-2 ganó un peso similar al del grupo HFD estándar (*p = 0,82, análisis de la varianza bidireccional) (figura 13B).
Porcentaje de grasa. El porcentaje de grasa del peso corporal total fue similar entre los tres grupos experimentales al inicio del período de estudio. En el momento de la intervención dietética, el porcentaje de grasa de los dos grupos alimentados con HFD era el mismo y ambos eran considerablemente más grandes que el del grupo alimentado con LFD, lo que fue constante durante las 10 semanas posteriores a la intervención dietética (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional) (figura 14A). En las 4 semanas posteriores a la intervención dietética, el 75 % del grupo HFD hBD-2 tenía un porcentaje de grasa más pequeño que antes de la intervención, lo que contrasta drásticamente con el grupo HFD estándar, donde todos los ratones tenían un mayor porcentaje de grasa. (Figura 14B) El cambio en el porcentaje de grasa fue considerablemente menor en el grupo HFD hBD-2 que en el grupo HFD estándar en este momento (*p = 0,003, análisis de la varianza bidireccional). El peso del hígado al finalizar fue considerablemente mayor en los grupos alimentados con HFD en comparación con el grupo LFD (*p < 0,05, análisis de la varianza unidireccional) (figura 15A). La cantidad de grasa visceral (eWAT) en el momento de la terminación también fue mayor en los grupos HFD en comparación con los LFD (*p < 0,05, análisis de la varianza unidireccional). No hubo una diferencia significativa en la grasa visceral (eWAT) entre los grupos alimentados con HFD (figura 15B).
Prueba de tolerancia a la glucosa. La tolerancia a la glucosa mejoró rápidamente desde el momento de la intervención dietética en el grupo HFD hBD-2, que mostró un pico más pequeño en la glucemia, así como un aclaramiento más rápido de glucosa ya después de 2 semanas (figura 16A). Se observó que el ratón más intolerante a la glucosa en el estudio mejoró drásticamente las dos primeras semanas después de cambiarlo de una HFD estándar a HFD hBD-2 (figura 16B).
Prueba de tolerancia a la insulina. El grupo LFD fue considerablemente más sensible a la insulina que ambos grupos HFD (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional). El grupo HFD hBD-2 fue simultáneamente más sensible a la insulina en comparación con el grupo de control HFD, lo que implica una mejora en la tolerancia a la insulina desde la intervención dietética (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional) (figura 16C).
Conclusiones de hBD-2 como intervención contra el desarrollo de la diabetes y la obesidad en ratones alimentados con una dieta alta en grasas:
- En general, los ratones alimentados con hBD-2 ganaron menos peso durante las primeras 4 semanas de intervención que los ratones de control alimentados con HFD (figura 143).
- 7/8 de los ratones obesos e intolerantes a la glucosa mejoraron considerablemente su tolerancia a la glucosa después de solo 2 semanas de intervención (figura 14a). Un solo ratón era el ratón más intolerante a la glucosa al inicio del estudio con aproximadamente 20 gramos de masa grasa de 50 gramos de peso corporal. A pesar de este fenotipo gravemente insalubre, el ratón fue completamente rescatado en términos de intolerancia a la glucosa a las 2 semanas de intervención (figura 16B).
- A nivel de todo el cuerpo, los ratones alimentados con hBD-2 eran menos resistentes a la insulina que los ratones de control alimentados con HFD (figura 16C). Este es un punto clave ya que la resistencia a la insulina sistémica grave es extraordinariamente difícil de revertir y una limitación principal en el tratamiento de enfermedades humanas (p. ej., diabetes, enfermedades cardiovasculares, ciertos cánceres, entre otras).
HD-5 como tratamiento del síndrome metabólico en ratones obesos alimentados con una dieta alta en grasas.
Cambio de peso. Todos los grupos alimentados con HFD tuvieron la misma ingesta de alimentos durante el período de estudio e igual aumento de peso durante el período de preinclusión de 13 semanas (figura 22A). Después de la intervención dietética, el grupo alimentado con HFD HD-5 ganó considerablemente menos peso que el grupo de control alimentado con HFD (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional) (figura 22B). Además, se observó una tendencia a la disminución del porcentaje de grasa en el grupo HFD HD-5 (figura 23A), y se midió un porcentaje de grasa considerablemente menor en el grupo HFD HD-54 semanas después del cambio de dieta en comparación con el control HFD (*p = 0,009, análisis de la varianza bidireccional) (figura 23B). El peso del hígado al finalizar tendió a disminuir en el grupo alimentado con HFD HD-5 en comparación con el control alimentado con HFD. Específicamente, -50 % de los ratones alimentados con HFD estándar recibieron una puntuación más alta que el ratón alimentado con HFD HD-5 con mayor puntuación (figura 24A). El peso de la grasa visceral fue mayor en los grupos alimentados con HFD que en el grupo alimentado con LFD. (*p < 0,05, análisis de la varianza unidireccional) (figura 24B).
Prueba de tolerancia a la glucosa. La tolerancia a la glucosa para los animales tratados con HFD HD5 en una jaula representativa, Jaula 2, mejoraron con el tiempo desde el inicio de la intervención (semana 13-0) hasta la semana 13­ 8 (figura 25A)
Prueba de tolerancia a la insulina. El grupo LFD fue considerablemente más sensible a la insulina que los grupos alimentados con HFD (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional). El grupo HFD HD-5 fue más sensible a la insulina que el control h Fd , lo que implica una mejora en la tolerancia a la insulina desde la intervención dietética (*p < 0,05, análisis de la varianza bidireccional) (figura 25B).
Conclusiones de la HD5 como intervención contra el desarrollo de la diabetes y la obesidad en ratones alimentados con una dieta alta en grasas:
- Los ratones alimentados con HD5 habían disminuido considerablemente el cambio de peso en comparación con los ratones de control alimentados con HFD (figura 22B).
- Hubo una tendencia general a disminuir la masa grasa de los ratones obesos alimentados con HFD-HD5 (figura 23A y B).
- La masa hepática tendió a disminuir en los ratones alimentados con HD5 en comparación con los ratones de control alimentados con HFD (figura 24a). Dado que los depósitos visceral y subcutáneo no fueron considerablemente distintos (figura 24b), esta observación sugiere que el % de grasa moderadamente disminuido en los ratones HD5 está restringido a la lipólisis hepática / oxidación lipídica.
- La tolerancia a la glucosa mejoró con el tiempo en los ratones alimentados con HD5 (figura 25A),
- Los ratones alimentados con HD5 fueron menos resistentes a la insulina que los ratones de control alimentados con HFD (figura 25b).
Los cambios observados son compatibles con una mayor riqueza genética y un mayor número de filos en la microbiota intestinal en los grupos HFD tratados con defensinas que en los ratones no tratados.
Ejemplo 4. Modulación de la microbiota intestinal y tratamiento de la inflamación intestinal mediante tratamiento intervencionista con un análogo del péptido 1 similar al glucagón.
Materiales y procedimientos.
Ratones: se alimentó a ratones machos C57BI/6J DIO de 4 semanas de edad con una dieta alta en grasas (HFD 60 % de grasa, SSNIFF (Diet #D12492)) o Purina Chow durante 36 semanas. El grupo alimentado con HFD había alcanzado un peso promedio de aproximadamente 55 gramos al comienzo de la intervención. Los ratones se alojaron en grupos de 10 por jaula hasta la semana -2. A partir de la semana -2, los ratones se alojaron en un solo alojamiento durante la duración del estudio. La ingesta de alimento se registró diariamente justo antes de que se apagaran las luces a las 3 pm. Se sometieron ratones individuales a procedimientos experimentales cambiando el orden tanto en grupo como en jaula. Los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente durante un ciclo de lu/oscuridad de 12 horas en condiciones estándar SPF.
Régimen de tratamiento (figura 26): Se alimentó a los ratones con una dieta alta en grasas (HFD) o una dieta de control baja en grasas (LF). El grupo HFD contenía 2 subgrupos; 1 GLP-1 y 1 HFD estándar sin suplementación de GLP-1. GLP-1 se disolvió en PBS y se añadió BSA al 0,1 %. Se administró GLP-1 a 0,2 mg/kg de BID por vía subcutánea. Análisis. El análisis del microbioma de ARN 16S se realizó los días -1 y 27 del estudio. Se tomó una muestra de ilion aproximadamente a 2 cm del ciego y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido para el análisis de la concentración de citocinas IFNy, TNF-a, IL-1 p, IL12p70, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-8 e IL-10.
Resultados
Un análisis UniFrac no ponderado, es decir, abundancia relativa de especies bacterianas. Al comienzo del estudio (día 1), los cuatro grupos tienen una microflora comparable según lo esperado. Sin embargo, después de 4 semanas de tratamiento, la microbiota de los ratones alimentados con una dieta alta en grasas y el tratamiento intervencionista con GLP-1 (liraglutida) difirió considerablemente de la microflora del grupo de control (tratado con vehículo) (figura 27A). Los cambios observados en la microbiota intestinal son impulsados principalmente por una mayor abundancia de Akkermansia y Alloprevotella. Akkermansia es una especie productora de ácidos grasos de cadena corta (figura 27B). El aumento en la cantidad de estas bacterias se considera indicativo de una microflora más sana o normalizada. Se sabe que los ácidos grasos de cadena corta tienen un efecto positivo sobre la inducción de GLP-1 endógeno.
Sorprendentemente, no se observó ningún efecto antiinflamatorio del GLP-1 (liraglutida) ya que no hubo diferencia estadística en la concentración de citocinas en el ilion para ninguna de las citocinas entre los tres grupos de estudio.
Ejemplo 5.
Estudio farmacocinético para determinar la biodisponibilidad oral y establecer el perfil farmacocinético de hBD-2 después de una administración de alimentación forzada por vía oral única de 4 mg/kg a ratones NMRI.
Materiales y procedimientos
Régimen de tratamiento: Se administró 5 ml/kg de alimentación forzada por vía oral a 21 ratones hembras NMRI utilizando una sonda para alimentación forzada y una jeringa de 1 ml según el peso corporal individual obtenido el día de la administración. Se tomaron muestras de orina en momentos aleatorios masajeando suavemente el área inguinal del abdomen. La primera muestra de sangre se tomó mediante un procedimiento de muestreo submandibular. La segunda muestra de sangre se recogió de ratones anestesiados con isoflurano. Se tomaron muestras intestinales después de la eutanasia. Se abrió el abdomen de cada ratón y se tomaron muestras de tres secciones (yeyuno, duodeno y colon) de los intestinos.
Resultados
No parece que el intestino sano absorba hBD-2 ya que no se pudo detectar mediante HPLC en ninguna de las muestras de suero u orina ya que todos los valores estaban por debajo del nivel de detección <10 pg/ml.
Esto indica que hBD-2 no está disponible a nivel sistémico después de una dosis oral de 4 mg/kg en ratones.
La hBD-2 administrada por vía oral permanece detectable en el contenido del colon hasta 360 minutos después de la administración (figura 28).
Ejemplo 6.
Investigar y comparar los perfiles farmacocinéticos de hBD-2 fusionado al C-terminal (peso molecular 71336 Da) o N-terminal (peso molecular 71666 Da) de albúmina sérica humana tras la administración subcutánea o intravenosa de un equivalente molar de 1 mg/kg de hBD-2 (peso molecular 66437 Da) a ratones hembra NMRI.
Materiales y procedimientos
Régimen de tratamiento: los animales recibieron una dosis de 10 ml/kg de concentración madre de 1,65 mg/ml según el peso corporal individual (300 pl para un ratón de 30 gramos). La primera muestra de sangre se tomó mediante un procedimiento de muestreo submandibular y la segunda después de la anestesia con isoflurano y la eutanasia. Resultados
hBD-2 mostró una vida media de 1 hora y las dos proteínas fusionadas una vida media de 12 horas. AUC cambió drásticamente. Las aclaraciones renales también se cambiaron de 10 ml/min para hBD-2 (figura 29) a 0,5-2,2 ml/min para las dos moléculas fusionadas (figuras 30, 31). El ejemplo demuestra que la vida media de hBD-2 se puede prolongar notablemente mediante la conjugación Cor N-terminal con albúmina.
Ejemplo 7.
Determinar y evaluar el efecto antiinflamatorio de la «fusión N-terminal de hBD-2-albúmina» en un modelo de colitis aguda inducida por dextrano sódico (DSS) de 10 días en ratones.
Materiales y procedimientos
Régimen de tratamiento: «N-terminal hBD-2-albúmina» se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola o por vía subcutánea con el uso de una aguja 25 G estéril en un volumen de dosificación de 10 ml/kg peso corporal. Los animales recibieron 1 dosis diaria durante 10 días ejecutivos. El control activo dexametasona (DEX) se administró por vía subcutánea a una dosis de 1 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 ml/kg de peso corporal todos los días.
Resultados
El tratamiento con «N-terminal hBD-2-albúmina» dio como resultado una inhibición considerable del índice de actividad de la enfermedad (DAI, del inglés disease activity index) cuando se administró diariamente a una dosis de 1,65 mg/kg por vía intravenosa (p < 0,05). Además, el día 10 también se observó una inhibición considerable de la puntuación DAI cuando se administró diariamente «N-terminal hBD-2-albúmina» a una dosis de 1,65 mg/kg y a una dosis de 125 mg/kg por vía subcutánea respectivamente (p < 0,05).
La administración de sulfato sódico de dextrano dio como resultado una inflamación y lesión considerables del tejido colónico como se evidencia después del examen histológico. El tratamiento con «N-terminal hBD-2-albúmina» no dio como resultado ninguna reducción estadísticamente significativa de este daño histológico, pero de manera similar, el control activo DEX no logró reducir significativamente el daño histológico.
Los resultados mostraron además un aumento considerable del peso corporal en el día 7 en los animales tratados con «N-terminal hBD-2-albúmina» a pesar de una caída transitoria del peso corporal en los días 2 y 3. En contraste, los animales tratados con DEX mostraron una disminución muy importante del peso corporal a partir del día 5 en adelante (p < 0,01). Esto indica que «N-terminal hBD-2-albúmina» mantiene una microbiota normal y por lo tanto tiene un efecto de conservación de peso.
El ejemplo demuestra que la fusión N-terminal de hBD-2-albúmina es biológicamente activa en un modelo animal de una enfermedad inflamatoria.
Ejemplo 8.
Determinar y evaluar el efecto antiinflamatorio de la «C-terminal de hBD-2-albúmina» en un modelo de colitis aguda inducida por dextrano sódico (DSS) de 10 días en ratones.
Materiales y procedimientos
Régimen de tratamiento: «C-terminal hBD-2-albúmina» se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola o por vía subcutánea con el uso de una aguja 25 G estéril en un volumen de dosificación de 10 ml/kg peso corporal. Los animales recibieron 1 dosis diaria durante 10 días ejecutivos. El control activo prednisolona (Pred) se administró por vía oral mediante alimentación forzada a una dosis de 1 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 ml/kg de peso corporal todos los días.
Resultados
El tratamiento con «C-terminal hBD-2-albúmina» dio como resultado una inhibición considerable del DAI cuando se administró diariamente a una dosis de 1,6 mg/kg por vía intravenosa (p < 0,05). Además, «C-terminal hBD-2-albúmina» dio como resultado una inhibición considerable del DAI cuando se administró en días alternos los días 0, 2, 4, 6, 8 y 10 a una dosis de 1,6 mg/kg por vía intravenosa (p < 0,05). El tratamiento diario con prednisolona resultó en una inhibición considerable del DAI el día 9 (p < 0,05).
La administración de sulfato sódico de dextrano dio como resultado una inflamación y lesión considerables del tejido colónico como se evidencia después del examen histológico. El tratamiento con «C-terminal hBD-2-albúmina» a una dosis de 1,6 mg/kg dio como resultado una reducción estadísticamente significativa de este daño histológico (p < 0,05). De manera similar, el tratamiento diario con «C-terminal hBD-2-albúmina» a una dosis de 1,6 mg/kg y de 16,5 mg/,kg en los días 0, 2, 4, 6, 8 y 10 resultó en una reducción considerable del daño histológico al colon (p < 0.01). El tratamiento con el control activo prednisolona no logró reducir considerablemente la lesión histológica en la parte proximal del colon, pero redujo la lesión en el colon distal (p < 0,01).
Los resultados mostraron además un aumento considerable del peso corporal en los animales tratados con «C-terminal hBD-2-albúmina» (p < 0,05). Esto indica que «C-terminal hBD-2-albúmina» mantiene una microbiota normal y por lo tanto tiene un efecto de conservación de peso.
El ejemplo demuestra que la fusión C-terminal de hBD-2-albúmina es biológicamente activa en un modelo animal de una enfermedad inflamatoria.
E m l . n i
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Y las patentes y solicitudes de patentes siguientes:
WO 2010/007166
WO 92/06204

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una p-defensina seleccionada de entre el grupo que consiste en hBD-1 (SEQ ID NO: 4), hBD-2 (SEQ ID NO: 5), hBD-3 (SEQ ID NO: 6), hBD-4 (SEQ ID NO: 7), hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) o una p-defensina que difiere de una de entre hBD-1, hBD-2, hBD-3, hBD-4 o hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) en menos de 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras para uso en el tratamiento de diabetes tipo 2, síndrome metabólico, inflamación sistémica de bajo grado, obesidad, resistencia a la insulina y/o intolerancia a la glucosa; donde dicha p-defensina se administra mediante administración por vía oral o subcutánea a un sujeto que lo necesite.
2. Una a-defensina seleccionada de entre el grupo que consiste en HD5 (SEQ ID NO: 8) y HD6 (SEQ ID NO: 9) para su uso en el tratamiento de diabetes tipo 2, síndrome metabólico, obesidad, resistencia a la insulina y/o intolerancia a la glucosa; donde dicha a-defensina se administra mediante administración por vía oral a un sujeto que lo necesite.
3. Una p-defensina seleccionada de entre el grupo que consiste en hBD-1 (SEQ ID NO: 4), hBD-2 (SEQ ID NO: 5), hBD-3 (SEQ ID NO: 6), hBD-4 (SEQ ID NO: 7), hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) o una defensina que difiere de una de entre hBD-1, hBD-2, hBD-3, hBD-4 o hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) en menos de 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras para uso en el tratamiento de aumentar la riqueza genética de la microbiota intestinal y/o aumentar el número de filos de la microbiota intestinal, donde la p-defensina se administra por administración por vía oral o subcutánea a un sujeto que lo necesite.
4. Una a-defensina seleccionada de entre el grupo que consiste en HD5 (SEQ ID NO: 8) y HD6 (SEQ ID NO: 9) para su uso en el tratamiento o normalización de una microbiota disbiótica del intestino, de manera que aumenta la riqueza genética de la microbiota del intestino, aumenta el número de filos de la microbiota intestinal o aumenta la producción de ácidos grasos de cadena corta de la microbiota/metaboloma intestinal, donde la a-defensina se administra por administración por vía oral a un sujeto que la necesite.
5. La a-defensina para su uso según la reivindicación 4, donde se aumenta el número de bacterias pertenecientes al género Allobaculum.
6. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende la reducción de peso o la prevención del aumento de peso, y/o la disminución de la glucemia en ayunas.
7. La a-defensina o p-defensina para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la defensina es HD5 o hBD-2.
8. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha defensina comprende además al menos una fracción adicional seleccionada de entre un grupo que consiste en un péptido penetrante celular (CPP), una fracción de unión a albúmina (ABM), una fracción detectable (Z) y un péptido que extiende la vida media, preferentemente un péptido que extiende la vida media, opcionalmente donde el péptido que extiende la vida media se selecciona de entre un grupo que consiste en una molécula capaz de unirse a un receptor de Fc neonatal (FcRn), transferrina, albúmina (HAS), XTEN® o PEG, un polímero de homoaminoácidos (HAP), un polímero de prolina-alanina-serina (PAS) o un péptido similar a la elastina (ELP), ácido hialurónico, un péptido altamente siacilado cargado negativamente tal como el péptido carboxi-terminal (CTP) de la cadena p de la gonadotropina coriónica (CG), IgG humana y CH3(CH2)nCO-, donde n está comprendida entre 8 y 22.
9. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto tiene:
I) un IMC de 25 o más, como 30 o más, por ejemplo 35 o más, como 40 o más;
II) una relación cintura/cadera de al menos 0,80, por ejemplo 0,80-0,84, como al menos 0,85 (hembras) o al menos 0,90, por ejemplo 0,9-0,99, como por encima de 1,00 (machos);
III) una glucemia en ayunas de al menos 6,1 mmol/l, por ejemplo, al menos 7,0 mmol/l;
IV) un nivel de hemoglobina glucosilada de al menos 42 mmol/mol Hb, como entre 42 y 46 mmol/mo1Hb, como al menos 48 mmol/mol Hb;
V) presión arterial elevada: >140/90 mmHg;
VI) dislipidemia: triglicéridos (TG): >1,695 mmol/l y colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) <0,9 mmol/l (machos), <1,0 mmol/l (hembras); y/o
VII) microalbuminuria: cociente de excreción urinaria de albúmina >20 pg/min o relación albúmina/creatinina >30 mg/g.
10. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la p-defensina se administra a un sujeto que la necesita en una dosis diaria de entre 0,1 mg de hBD-2/kg y 10 mg de hBD-2/kg; o
donde la a-defensina se administra a un sujeto que la necesita en una dosis diaria de entre 0,1 mg HD5/kg y 10 mg HD5/kg.
11. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha defensina se administra en combinación con insulina / análogos de insulina y/o péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) / análogos de GLP-1 y/o péptido similar al glucagón 2 (GLP-2) / análogos de g LP-2 y/o un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) y/o metformina y/o un inhibidor del transportador de glucosa de sodio 2 (SGLT-2) y/o un antagonista del receptor de glucagón y/o un antagonista del miembro 1 de la subfamilia V del canal catiónico potencial del receptor transitorio (TRPV1) o una combinación de estos, donde opcionalmente el análogo de GLP-1 se selecciona de entre exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida y dulaglutida; o
insulina lispro, aspart, glulisina, insulina detemir, insulina degludec e insulina glargina.
12. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la a-defensina o p-defensina se administra a un sujeto que lo necesita al menos una vez al día, tal como una vez al día, dos veces al día, o tres veces al día.
13. La a-defensina o p-defensina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el sujeto ha realizado y/o está realizando un tratamiento con antibióticos o quimioterapia o inmunoterapia o terapia inmunosupresora u otro tratamiento que tenga efectos negativos sobre la microbiota intestinal.
14. Un procedimiento para promover el crecimiento magro en el ganado, donde el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una a-defensina y/o p-defensina de mamífero seleccionada de entre el grupo que consiste en hBD-1 (SEQ ID NO: 4), hBD-2 (SEQ ID NO: 5), hBD-3 (SEQ ID NO: 6), hBD-4 (SEQ ID NO: 7), hBD-2 truncada (SEQ ID NO: NO: 17), una p-defensina que difiere de una de entre hBD-1, hBD-2, hBD-3, hBD-4 o hBD-2 truncada (SEQ ID NO: 17) en menos de 5 sustituciones aminoacídicas conservadoras, HD5 (SEQ ID NO: 8) y HD6 (SEQ ID NO: 9) a un sujeto que lo necesite, donde el ganado se selecciona de entre vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos, patos, gansos, palomas, pavos, codornices y pollos.
15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, donde la a-defensina y/o p-defensina de mamífero se administra mezclándola con el pienso.
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