CN111153982B

CN111153982B - 一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽defb1及其应用

Info

Publication number: CN111153982B
Application number: CN202010100677.8A
Authority: CN
Inventors: 姜雨; 潘香羽; 陈贤情; 王文
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2040-02-17
Also published as: CN111153982A

Abstract

本发明公开了一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1及其应用。本发明利用反刍动物比较基因组结果，对反刍动物进化的新基因进行扫描，发现了一个反刍动物特异的抗菌肽，且在瘤胃组织中高表达。本发明利用pPIC9K载体与DEFB1序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株，使反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在毕赤酵母中能够高效的分泌表达，获得的以山羊为代表的抗菌肽DEFB1具有抑制金黄色葡萄球菌的作用，可以作为极具应用潜力、安全的抗菌药物替代物。

Description

一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1(β-防御素1)在毕赤酵母中的分泌表达方法及其应用。

背景技术

抗菌肽是一类具有广谱抗菌性的宿主防御多肽，在一些生物体中其被认为是先天免疫系统的重要组成部分，可以作为一种用于对抗细菌抗生素耐药性的自然来源候选抗菌物。相比于传统的抗生素对于细菌的抑制生长的作用，在杀灭细菌的效果上抗菌肽更显著，对细菌的作用几乎是致死性的。抗菌肽作为机体有效的防御分子广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物、微生物中。抗菌肽不仅在抗菌应用中广泛使用，在抗病毒、抗真菌、抗寄生虫以及抗肿瘤等方面也表现出较高的生物活性。目前已经从不同宿主中鉴定出上千种抗菌肽，但仍有许多抗菌肽尚未被发现。而且对于已经制备的抗菌肽(例如，CN103773772A)，其作为饲料添加剂直接饲喂动物及作为抗生素的替代物的安全性是未知的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1，该抗菌肽DEFB1的编码序列包括以下DNA序列，或者所述抗菌肽DEFB1的编码序列选自与以下DNA序列具有90％以上同源性的来源于反刍动物基因组的序列：

5'-TCTGGTTTCA CTCAAGGTAT TAGATCTAGA AGATCCTGCC ATAGAAACAA GGGTGTTTGTGCTTTGACTA GATGTCCAAG AAACATGAGA CAAATCGGTA CTTGTTTTGG TCCACCAGTT AAGTGTTGTAGGAAGAAG-3'。

优选的，所述反刍动物选自山羊，山羊的抗菌肽DEFB1的氨基酸序列为：

SGFTQGIRSRRSCHRNKGVCALTRCPRNMRQIGTCFGPPVKCCRKK。

优选的，所述抗菌肽DEFB1具有体外抑制金黄色葡萄球菌的活性。

上述反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在毕赤酵母中的分泌表达方法，包括以下步骤：

1)构建毕赤酵母重组菌株

利用反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1的编码序列构建重组载体，将重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株；

2)发酵培养

将毕赤酵母重组菌株通过发酵进行重组抗菌肽DEFB1的诱导表达，得到发酵液；

3)收集发酵液上清，或将收集的发酵液上清浓缩，得到重组抗菌肽DEFB1蛋白样品。

优选的，所述重组抗菌肽DEFB1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

上述反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在制备抑制革兰氏阳性菌的抗菌药物中的应用。

上述反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌药物中的应用。

上述反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在制备饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过比较反刍动物基因组获得抗菌肽DEFB1的编码序列，并建立了抗菌肽DEFB1在毕赤酵母中的分泌表达方法，该抗菌肽DEFB1具有抑制革兰氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌)的作用，而且容易制备和分离纯化，可以作为安全的抗菌药物替代物，极具应用潜力。

附图说明

图1为实施例重组DEFB1基因表达产物SDS-PAGE电泳图。

图2为实施例重组DEFB1蛋白Western-blot检测电泳图。

图3为实施例发酵上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，以便于本领域技术人员理解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

(一)反刍动物特异抗菌肽DEFB1在毕赤酵母中的分泌表达方法

1、构建毕赤酵母GS115重组菌株

1.1本发明利用反刍动物比较基因组结果，对反刍动物进化的新基因进行扫描，发现了一个反刍动物特异的抗菌肽，且在瘤胃组织中特异高表达。根据比较反刍动物基因组鉴定得到的抗菌肽DEFB1氨基酸序列，按照赤酵母密码子偏好性，得到去除信号肽的重组山羊(Capra hircus)抗菌肽DEFB1基因序列(由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列设计完成时间为2018年12月)，如SEQ.ID.NO.1所示。山羊抗菌肽DEFB1重组蛋白的氨基酸序列如下所示(以下第一个氨基酸S为序列氨基端)：

SGFTQGIRSRRSCHRNKGVCALTRCPRNMRQIGTCFGPPVKCCRKKHHHHHH(参见SEQ.ID.NO.4)。

1.2利用设计的引物DEFB1-F、DEFB1-R(如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3所示)，通过Gibson连接方法(Gibson,D.G.et al.，2009)，将重组山羊抗菌肽DEFB1基因序列构建于pPIC9K表达载体(购自Invitrogen公司)，获得重组载体pPIC9K-DEFB1。

DEFB1-F：

5'-CGTAGAATTCAAGAGATCTGGTTTCACTCAAGGTATTAGATCTAGAAGAT-3'

DEFB1-R：

5'-GCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3'

Gibson连接体系配制

(1)准备5×ISO buffer，，5×ISO buffer组分配比如下表所示：

(2)配制Master mixture，Master mixture组分配比如下表所示：

(3)Gibson组装体系配制及反应条件，Gibson组装体系如下表所示：

其中，载体片段和插入片段的总量不能超过200ng。整体体积不能超过20μL，如果片段体积和原mix溶液体积已经达到20μL，可以不加超纯水。

Gibson组装方案：将片段加入Gibson mix中后，补水至20μL，混匀，放入50℃环境内，反应1h后经过DMT消化，纯化，然后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞内。也可不经过DMT消化，直接纯化后转化入大肠杆菌DMT感受态内。pPIC9K-DEFB1质粒提取采用天根质粒小提中量试剂盒。

1.3制备毕赤酵母GS115感受态细胞

在YPD固体平板上挑取P.pastoris GS115(西北工业大学实验室保存)单克隆，接种到5mL新鲜的YPD液体培养基中，30℃摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，转接至100mLYPD摇瓶中，30℃、200rmp摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入100mL冰水，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入50mL冰水，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入4mL冰山梨醇(1M)，重悬。在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入2mL冰山梨醇(1M)，重悬，收集备用。

1.4将待转化的pPIC9K-DEFB1质粒利用Sac I限制性内切酶进行线性化，电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞；取转化菌液均匀涂于MD平板培养基上培养，挑取阳性单克隆，即毕赤酵母GS115重组菌株，置于甘油管中冻干保存。

2、发酵培养

2.1将表达菌株(毕赤酵母GS115重组菌株)在MD固体平板上进行划线活化，待菌落长出，挑取单克隆至5mL MD液体培养基中，30℃、200rpm摇床培养。

2.2菌体生长至OD600～1.0，吸取500μL菌液转接至50mL的BMG培养基(添加100μL生物素)中进行摇瓶培养，30℃摇床孵育2天。

2.3 3000g离心5min，收集菌体，转接至150mL BMM培养基(添加300μL生物素和750μL甲醇)中进行摇瓶培养，30℃摇床孵育6天，每隔一天加入750μL甲醇作为诱导物。

2.4结束诱导后，8000g离心10min，收集发酵液上清。

以上步骤中涉及的培养基配方(相应的固体培养基均加入20g/L琼脂粉)：

1)YPD培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g、葡萄糖20g。

2)MD培养基(1L)：硫酸铵10g、YNB 3.4g、葡萄糖20g。

3)BMM培养基(1L)：YNB 13.4g、0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液100mL、硫酸铵10g、121℃灭菌15min后加入生物素2mL。

4)BMG培养基(1L)：在BMM基础上加入甘油10mL。

其中，以100mL计，500×生物素含0.02g生物素，过滤除菌，避光保存；以1L计，10×磷酸盐缓冲液(pH 6.0)含磷酸二氢钾118g、磷酸氢二钾23g。

3、对发酵液中的重组蛋白进行鉴定，具体步骤如下：

3.1收集蛋白样品

发酵液上清或其浓缩液即可为蛋白样品，利用Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot对发酵液上清或其浓缩液中的山羊抗菌肽DEFB1重组蛋白进行鉴定。

3.2Tricine-SDS-PAGE电泳

3.2.1试剂组分

尿素，甘油，四甲基乙二胺(TEMED)，β-巯基乙醇，过硫酸铵(APS)，甲醇，乙酸，乙酸铵，丙烯酰胺(AC)，双丙烯酰胺(BIS)，十二烷基磺酸钠(SDS)；

染色液(仅考染或银染)：50％甲醇，10％乙酸，100mM醋酸铵；

固定液：10％乙酸，0.025％考马斯亮蓝G-250；

显色液：0.03％甲醛，2％Na₂CO₃；

电泳液如下表所示：

3.2.2配制分离胶和浓缩胶

凝胶时间约2h。根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶：

注意：APS和TEMED需最后添加。

分离胶凝固后，在其上加入4％浓缩胶。

3.2.3蛋白制样

适量调整蛋白浓度以便蛋白可以加载在胶上，银染理想的蛋白浓度为0.1mg/mL，将蛋白样品与样品缓冲液混合，根据样品浓度加缓冲液。

3.2.4电泳条件及注意事项

安装凝胶到电泳槽上，并添加阳极和阴极电泳液。

上样：在0.7×5mm上样孔里，添加10μL样品-缓冲液混合物。

设置跑胶电压：开始以30V电压跑胶，当蛋白样品跑分离胶后可将电压调至90V，胶会因为电压原因升温，但必须控制在35～40℃，快结束时，可以适当提高电压来缩短电泳时间，一般常规时间跑的胶比过夜跑胶的结果好，尤其是使用10％分离胶。

3.2.5银染

将胶放入染色液里孵育，孵育时间取决于胶的浓度：0.7mm 10％的分离胶孵育15min；0.7mm 16％的分离胶孵育30min；1.6mm 16％的分离胶孵育60min。孵育后，用清水清洗两遍，水洗时间和孵育时间一样。用0.005％的Na₂S₂O₃将胶进行曝光，曝光时间与定影液里孵育时间一样。将胶放入0.1％硝酸银溶液中孵育，孵育时间与定影液里孵育时间一样。水洗两遍。将胶放入显色液里显色，时间为1～2min。用50mM的EDTA终止显色，时间15～60min。

3.2.6观察

在凝胶成像仪或者化学发光仪中观察条带情况。结果表明：出现目标分子量大小的明显蛋白条带(浓度较高)，大小约为6KD，同时，其他杂质条带很少，具体见图1。

3.3转膜

3.3.1试剂

TBST配方：NaCl 8.8g、Tris-HCl(ph 8.0)20mL、吐温-20 0.5mL，加水至1L。

转膜液配方：Tris 3g、glycine 14.4g、甲醇200mL，加水至1L。

封闭液配方：5％脱脂奶粉溶液(1g奶粉溶于20mL的TBST中)。

PVDF膜(固相支持物)处理：甲醇激活1min。

海绵滤纸须在转膜液中浸泡15min。

3.3.2转膜条件

100V，90min(需加冰，提前冷冻冰袋)

3.3.3BCTP/NBT显色液配制(试剂盒，按顺序加入)：

40μL 25×NBT

1mL 1×AP

40μL25×BCTP

3.3.4转膜操作

按照以下顺序夹紧转膜板：

海绵滤纸-胶-PVDF膜-海绵滤纸-胶-膜-海绵滤纸(若只有一块胶需要用海绵补足厚度)；

把转膜液倒入槽中，加入适量的冰，100V，90min；

转膜液回收，放置于4℃冰箱。用镊子夹住膜，放入培养皿中用TBST溶液洗3次，每次5min。

3.4封闭

用5％的脱脂奶粉溶液封膜1h，常温(培养皿中摇动，80rpm左右)；奶粉回收，用TBST溶液洗3次，每次5min。

3.5孵育

3.5.1加入一抗(具体是鼠源his-tag抗体，购买自索莱宝)，比例1:5000～1:50000均可(例如，100mL TSBT中加入5μL抗体，比例为1:20000)；

3.5.2一抗回收，用TBST冲洗三次，每次5min；

3.5.3加入二抗(具体是山羊抗小鼠IgG，购买自索莱宝)，比例1:1000～1:3000均可(例如，20mL TSBT中加入10μL抗体，比例为1:2000)；

3.5.4二抗回收，用TBST冲洗三次，每次5min

3.6显色

使用显色试剂盒，工作液平铺在膜上，37℃温育，20～30min。将膜浸入去离子水中，预染25min。在化学发光仪或者凝胶成像仪中观察结果。结果表明：构建的载体转入毕赤酵母之后进行诱导，确实表达了抗菌肽DEFB1蛋白，在蛋白大小位置有明显条带，且其他杂带较少，具体见图2。

(二)反刍动物特异抗菌肽DEFB1抑菌活性

利用LB琼脂糖培养基以及金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)和大肠杆菌(ATCC25922)进行抑菌测试。将LB琼脂培养基灭菌后分别混入金黄色葡萄球菌或大肠杆菌，倒平板，待培养基冷却凝固后，先在每个平板上打两个直径1cm的孔，分别在每个孔中加入100μL发酵上清液和含空载体的酵母培养液(阴性对照)，置于37℃培养箱中24h后观察抑菌圈的生长情况，并拍照。

其中，所述LB琼脂培养基配方(g/L)：氯化钠10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨10g琼脂粉15，pH 7.2±0.2，121℃高压灭菌30min。

由图3可知，本发明构建的毕赤酵母GS115重组菌株，其分泌表达产物(经鉴定确认为上述山羊抗菌肽DEFB1的重组蛋白)对金黄色葡萄球菌具有较高的抑菌活性，而对大肠杆菌不具备抑制作用(大肠杆菌中未出现抑菌圈)。

(三)反刍动物特异抗菌肽DEFB1优点

本发明利用pPIC9K载体与抗菌肽DEFB1基因序列构建出甲醇诱导性毕赤酵母表达菌株，通过优化甲醇诱导、表达条件，高效表达了具有生物活性的以山羊抗菌肽DEFB1为代表的重组蛋白。本发明的抗菌肽DEFB1蛋白序列(或对应DNA序列)与现有报道的反刍动物的其他抗菌肽序列相似度在80％～90％，在反刍动物瘤胃组织中特异高表达，由于来源于瘤胃，因此在作为饲料添加剂或抗生素替代物的安全性上具有相应的保障。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctggtttca ctcaaggtat tagatctaga agatcctgcc atagaaacaa gggtgtttgt 60

gctttgacta gatgtccaag aaacatgaga caaatcggta cttgttttgg tccaccagtt 120

aagtgttgta ggaagaagca ccaccaccac caccactaa 159

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> DEFB1-F

<400> 2

cgtagaattc aagagatctg gtttcactca aggtattaga tctagaagat 50

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> DEFB1-R

<400> 3

gcgaattaat tcgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt gc 42

<210> 4

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Gly Phe Thr Gln Gly Ile Arg Ser Arg Arg Ser Cys His Arg Asn

1 5 10 15

Lys Gly Val Cys Ala Leu Thr Arg Cys Pro Arg Asn Met Arg Gln Ile

20 25 30

Gly Thr Cys Phe Gly Pro Pro Val Lys Cys Cys Arg Lys Lys His His

35 40 45

His His His His

50

Claims

1.一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1，其特征在于：该抗菌肽DEFB1的编码序列为以下DNA序列：

5'-TCTGGTTTCA CTCAAGGTAT TAGATCTAGA AGATCCTGCC ATAGAAACAA GGGTGTTTGTGCTTTGACTAGATGTCCAAG AAACATGAGACAAATCGGTA CTTGTTTTGG TCCACCAGTT AAGTGTTGTAGGAAGAAG-3'。

2.根据权利要求1所述一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1，其特征在于：所述反刍动物选自山羊。

3.一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在毕赤酵母中的分泌表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)构建毕赤酵母重组菌株

利用如权利要求1或2所述的抗菌肽DEFB1的编码序列构建重组载体，将重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株；

2)发酵培养

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组抗菌肽DEFB1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

5.一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在制备抑制金黄色葡萄球菌的抗菌药物中的应用，其特征在于：该抗菌肽DEFB1的氨基酸序列为：

SGFTQGIRSRRSCHRNKGVCALTRCPRNMRQIGTCFGPPVKCCRKK。

6.一种反刍动物瘤胃特异抗菌肽DEFB1在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于：该抗菌肽DEFB1的氨基酸序列为：

SGFTQGIRSRRSCHRNKGVCALTRCPRNMRQIGTCFGPPVKCCRKK。