CN114621331B - 一种核盘菌小肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核盘菌小肽及其应用，所述核盘菌小肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。本发明提供的核盘菌小肽能高效激发植物免疫从而防治引起的霜霉病，且本发明方案制备得到的核盘菌小肽只含有24个氨基酸，易于人工合成，获取简便易行，所需浓度低，可以有效的降低病害的防治成本，同时提高植物对病原菌的免疫能力，可以大规模的生产应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核盘菌小肽及其应用。
背景技术
卵菌是一类真核生物，包括许多植物病原菌，所致病害给许多农作物和花卉植物造成毁灭性危害。卵菌具有独特分类地位的群体，由于表现出丝状等特性传统上被划分到真菌界中，随着学科的发展，卵菌纲早已从真菌中划分到藻界或茸鞭生物界。
活体营养型卵菌(hpa)是一种专属性强的营养型卵菌病原，可以导致黄瓜霜霉病、十字花科作物霜霉病、拟南芥霜霉病、大豆霜霉病、葡萄霜霉病和莴苣霜霉病的产生，每年造成巨大经济损失。活体营养型卵菌侵染植物后，无性分生孢子在植物叶片表面萌发，形成附着胞，然后在邻近表皮细胞的壁之间长出一种穿透菌丝。在感病植物中，菌丝分支于细胞间隙，并在表皮和叶肉细胞中形成吸器。在一到两周内，分生孢子通过气孔发育，携带分生孢子开始新一轮的感染。有性孢子，称为卵孢子，是在子叶或受感染植物的叶片上产生的。
相关技术缺少可以有效的防治活体营养型卵菌带来的霜霉病的方法。由于缺乏高抗品种，化学防治仍然是重要手段。由于一些农药存在生态污染、人畜毒害、以及易使病原物产生抗药性等问题，新型绿色防治制剂亟待研发。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种核盘菌小肽，可以用于提高植物对卵菌侵染所致的疾病的抗性。
本发明还提出编码上述核盘菌小肽的核酸分子。
本发明还提出与上述核酸分子相关的生物材料。
本发明还提出上述核盘菌小肽、上述核盘菌小肽的核酸分子或上述生物材料的应用。
本发明还提出一种提高植物对卵菌的抗性的方法。
在本发明的第一方面，提出了一种核盘菌小肽，所述核盘菌小肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述核盘菌小肽可直接从经含编码所述核盘菌小肽的核酸分子的重组微生物表达后分离纯化制备，也可以根据其氨基酸序列由生物公司通过化学合成制备。
在本发明一些优选的实施方式中，所述分离纯化制备所述核盘菌小肽的方法包括但不限于高效液相色谱。
在本发明的第二方面，提出了编码上述核盘菌小肽的核酸分子，所述核酸分子具有如下核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或者其简并序列；
(2)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:2的序列编码功能相同或相似的多肽。
在本发明的第三方面，提出了与上述的核酸分子相关的生物材料，为下述1)至7)中的任一种：
1)含有上述核酸分子的表达盒；
2)含有上述核酸分子的重组载体；
3)含有1)所述表达盒的重组载体；
4)含有上述核酸分子的重组微生物；
5)含有1)所述表达盒的重组微生物；
6)含有2)所述重组载体的重组微生物；
7)含有3)所述重组载体的重组微生物。
在本发明的第四方面，提出了上述核盘菌小肽或编码上述核盘菌小肽的核酸分子在激发植物产生对卵菌抗性中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述植物为十字花科作物。
在本发明的一些实施方式中，所述十字花科作物为拟南芥、油菜或芥菜。
在本发明的一些实施方式中，所述十字花科作物为拟南芥和油菜。
在本发明的一些实施方式中，上述核盘菌小肽或编码上述核盘菌小肽的核酸分子在作为MAPK途径激活剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，上述核盘菌小肽或编码上述核盘菌小肽的核酸分子在作为AtRLP23、AtSOBIR1或AtBAK1基因表达促进剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，上述核盘菌小肽或编码上述核盘菌小肽的核酸分子在作为PR基因表达促进剂中的应用；所述PR基因为感受到病原微生物等侵染时，诱导表达的抗性基因。
在本发明的一些实施方式中，所述PR基因为AtPR1或AtPR2基因。
在本发明的第五方面，提出了一种提高植物对卵菌的抗性的方法，所述方法包括以下步骤：将上述含有核盘菌小肽的溶液浸润或喷雾处理植物叶片。
在本发明的一些实施方式中，所述植物为十字花科作物。
在本发明的一些实施方式中，所述十字花科作物为拟南芥、油菜或芥菜。
在本发明的一些实施方式中，所述十字花科作物为拟南芥和油菜。
一种防治拟南芥霜霉病的方法，所述方法包括以下步骤：将上述含有核盘菌小肽的溶液浸润或喷雾处理植物叶片。
根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供了一种核盘菌小肽，能高效激发植物免疫从而防治卵菌引起的霜霉病，且本发明方案制备得到的核盘菌小肽只含有24个氨基酸，易于人工合成，获取简便易行，所需浓度低，可以有效的降低病害的防治成本，同时提高植物对病原菌的免疫能力，可以大规模的生产应用；本发明的小肽来源于核盘菌，本发明方案的小肽序列的揭示，为日后核盘菌-油菜互作的研究也提供了宝贵的依据。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的序列对比结果图；
图2为本发明实施例2中的Western Blot检测结果图；
图3为本发明实施例2中的小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥中的AtRLP23基因表达结果图，其中“**”为P<0.01；
图4为本发明实施例2中的小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥中的AtSOBIR1基因表达结果图，其中“**”为P<0.01；
图5为本发明实施例2中的小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥中的AtBAK1基因表达结果图，其中“**”为P<0.01；
图6为本发明实施例2中的小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥中的AtPR1基因表达结果图，其中“**”为P<0.01；
图7为本发明实施例2中的小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥中的AtPR2基因表达结果图，其中“**”为P<0.01；
图8为本发明实施例3中的小肽Ssnlp24SsNEP2处理拟南芥后对核盘菌的抗性能力的检测结果图，其中“**”为P<0.01。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种小肽Ssnlp24SsNEP2，氨基酸序列为：GLMYSWYMPKDEPSPGIGHRHDWE(SEQ ID NO:1)；核苷酸序列为：GGACTGATGTATTCCTGGTACATGCCCAAAGACGAGCCCTCACCAGGCATCGGCCACCGCCACGACTGGGAA(SEQ ID NO:2)。
所述核盘菌小肽Ssnlp24SsNEP2的获取方法如下：nlp24多肽可以降低对拟南芥霜霉病的易感性，因此以Hyaloperonospora arabidopsidis NLP3家族保守的氨基酸序列nlp24为模板，在核盘菌基因组中进行序列比对，得到大量的同源序列。从同源序列中筛选得到本发明方案的核盘菌小肽Ssnlp24SsNEP2。将本发明方案筛选得到的小肽与nlp24、灰霉菌中的Bcnlp27BcNEP1和Bcnlp24BcNEP2的氨基酸序列进行序列比对，结果如图1所示，从图中可以看出，本发明方案制备的得到的核盘菌中的小肽Ssnlp24SsNEP2与其他小肽具有极高的相似性，因此将获得的小肽Ssnlp24SsNEP2用于以下研究。
nlp24的氨基酸序列为：AIMYSWYFPKDSPVTGLGHRHDWE(SEQ ID NO:3)。
实施例2
本实施例提供了对小肽Ssnlp24SsNEP2调控植物的免疫通路的研究。通过人工合成上述SEQ ID NO:1所示的小肽Ssnlp24SsNEP2，通过浸润或喷雾法处理拟南芥，以蒸馏水作为对照组，研究其调控植物的免疫通路，主要步骤包括：
1、Ssnlp24SsNEP2小肽的人工合成
本实施例提供的Ssnlp24SsNEP2小肽序列如SEQ ID NO：1所示，共由24个氨基酸组成。Ssnlp24SsNEP2小肽的合成交由上海波泰生物科技(http://www.51peptide.com/)进行合成，纯度＞85％。
2、拟南芥的种植
(1)将拟南芥消毒春化后接种至1/2MS培养基上，将培养基至于恒温培养箱中，16h光照，8h黑暗，温度22℃培养2周；
(2)将拟南芥消毒春化后接种至灭菌后的营养土上，将营养土至于培养室中，16h光照，8h黑暗，温度22℃培养4周。
3、Ssnlp24SsNEP2小肽对拟南芥的处理
将小肽Ssnlp24SsNEP2至浓度为1μM，用喷壶均匀1mL喷洒至叶片表面(1/2MS培养基上)，对照组喷洒等量清水，每组处理30株拟南芥，分别在喷洒Ssnlp24SsNEP2和清水后的0、10、15、20min、4h和24h时分别取样处理后的拟南芥的叶片，每次试验重复3次。
4、Western Blot检测小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥的免疫通路
具体步骤如下所示：
(1)植物总蛋白的提取
1)将步骤3得到的Ssnlp24SsNEP2小肽和对照组清水处理0、10、15、20min后得到的拟南芥叶片分别取样100mg，液氮研磨至粉状。
2)将植物组织转移至2mL离心管中(转移时速度要快，防止组织解冻，蛋白降解)，加入植物总蛋白提取Buffer 200μL充分混匀，金属浴100℃加热5min，放置冰上5min。
3)震荡1min，室温离心12,000rpm，10min。
4)吸取上清转移至1.5mL离心管中，即得植物总蛋白，于-20℃保存。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳
1)取50μL步骤(1)制备得到的植物总蛋白沸水变性10min，以Ponceau S蛋白作为内参；
2)取步骤1)中经变性得到的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用10％(w/v)SDS-PAGE，电压为100V，稳压电泳2.5h。
(3)转膜
1)将步骤(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶结束后得到的凝胶，置于培养皿中，用ddH2O洗2次，测量凝胶的尺寸。
2)剪PVDF膜，膜要比胶每边多出0.2cm，两边各加2片滤纸，做电转汉堡包(注意顺序和电极方向)。
3)电转仪置于电转液中80V稳流转移1.5h，将胶上的蛋白转至PVDF膜上(采用丽春红染色检测转移效果)。
(4)杂交显色
1)将步骤(3)得到的含有蛋白的PVDF膜采用TBST漂洗3次，加入封闭液(5％脱脂牛奶)，室温(25℃)缓摇(40r/min)封闭1h。
2)采用TBST清洗封闭后的PVDF膜2次，每次10min，加入1：2500稀释的第一抗体于5％脱脂牛奶中，4℃过夜或者室温(25℃)缓摇(40r/min)孵育2h。
3)采用TBST清洗步骤2)得到的PVDF膜3次，每次10min，加入1：10000稀释的第二抗体于5％脱脂牛奶中，室温(25℃)缓摇(40r/min)孵育1h。
4)采用TBST清洗步骤3)得到的PVDF膜4次，每次5min，将膜放入显色液中，进行显色反应(室温避光)。
5)观察并拍照，试验重复3次。
Western Blot实验结果如图2所示，从图中可以看出，在小肽Ssnlp24SsNEP2处理10min后，磷酸化程度最强，之后随着时间减弱，在20min时明显降低。结果表明，Ssnlp24SsNEP2通过诱导MAPK途径激活，参与调控植物免疫通路。
5、荧光定量PCR检测小肽Ssnlp24SsNEP2处理后的拟南芥的免疫相关的蛋白质的表达
(1)植物RNA的提取
将步骤3得到的Ssnlp24SsNEP2小肽和对照组清水处理4h和24h后的拟南芥叶片分别取样1g，液氮研磨至粉状，按照Promega公司的总RNA试剂盒(LS1040)进行RNA提取。
(2)反转录
将步骤(1)提取的RNA按照每个样品500ng的总量进行RNA反转录，具体步骤参照Promega公司RNA反转录试剂盒(A5001)进行cDNA反转录。
(3)荧光定量PCR反应
设计荧光定量PCR引物。荧光定量PCR检测所用到引物如表1所示，使用SYBR GreenqPCR mix(yisheng，China)进行基因表达定量检测，通过荧光定量PCR的方法测定了Ssnlp24SsNEP2小肽和水处理4h和24h后的拟南芥的抗性相关基因AtRLP23、AtSOBIR1、AtBAK1、AtPR1(NCBI：AT2G14610)和AtPR2(NCBI：AT3G57260)基因的表达水平(如图3-7所示)，内参基因为Actin。荧光定量PCR的反应程序如表2所示。
表1
表2
结果如图3-7所示，从图3-5中可以看出，在小肽Ssnlp24SsNEP2处理拟南芥4h后，AtRLP23、AtSOBIR1和AtBAK1基因的表达量相较对照组均有提高；在小肽Ssnlp24SsNEP2处理拟南芥24h后，AtRLP23和AtSOBIR1基因的表达量与对照组相比，仍然上调，但是AtBAK1基因的表达量与对照组相比并无差异；从图6-7中可以看出，Ssnlp24SsNEP2可以引起PR基因的上调，在处理4h后，AtPR1和AtPR2基因的表达量与对照组相比，均产生上调，并产生极显著差异；在处理24h后，AtPR1和AtPR2基因的表达量进一步提升，并产生极显著差异。
实施例3
本实施例提供了小肽Ssnlp24SsNEP2在提高拟南芥抗性中的应用。利用人工合成的小肽Ssnlp24SsNEP2，通过浸润或喷雾法处理拟南芥，激发其产生对核盘菌的抗性，从而提高拟南芥植物抗性。主要步骤包括：
将Ssnlp24SsNEP2稀释至1μM，用喉头喷壶将1mL小肽Ssnlp24SsNEP2均匀喷洒至生长14-20天的拟南芥叶片表面，喷洒等量清水作为对照组，对照组和实验组各30株，培养24h后，将卵菌Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2(来源于湖南农业大学生物科学技术学院夏石头实验室)的孢子用ddH2O稀释至30000spores/mL，均匀喷洒至植物表面。将处理好的植物置于育苗盆中，加盖透明盖保湿密封。在光照培养箱中，16h光照，8h黑暗，温度18℃，湿度80％，培养7天。每个处理组取3株植物置于5mL离心管中称重，加入3mL ddH2O置于冰上。计数前充分震荡，吸取30μL液体用细胞计数板进行计数。每次计数重复两次，总实验重复三次。
结果如图8所示，从图中可以看出，Ssnlp24SsNEP2可以显著提高植物对卵菌Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2的抗性，可以用于防治拟南芥霜霉病。
本领域技术人员也可以合理使用能够表达或分泌上述实施例中的小肽Ssnlp24SsNEP2的重组载体或重组细胞用于提高小肽Ssnlp24SsNEP2的产量，其使用方式可参考本领域常规方法，使用效果如实施例所示，并无显著差异性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种核盘菌小肽及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Leu Met Tyr Ser Trp Tyr Met Pro Lys Asp Glu Pro Ser Pro Gly
1 5 10 15
Ile Gly His Arg His Asp Trp Glu
20
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggactgatgt attcctggta catgcccaaa gacgagccct caccaggcat cggccaccgc 60
cacgactggg aa 72
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ile Met Tyr Ser Trp Tyr Phe Pro Lys Asp Ser Pro Val Thr Gly
1 5 10 15
Leu Gly His Arg His Asp Trp Glu
20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcactggtc ccattcctcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtccgtaaa gaggcaccat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaccaccagg tccttccata 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttagttcatc ggcgtcttta g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctaactaca actacgctgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcgttcaca taattcccac 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgttggaaat gaggtgaaa 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtggtggt gtcagtggc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttcggctt cgtggattt 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccaacgcaa tacgctgtc 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgatgaagct caatccaaac ga 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagagtcgag cacaataccg 20
Claims (5)
1.一种核盘菌小肽在激发植物产生对卵菌抗性中的应用，其特征在于，所述核盘菌小肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述植物为十字花科作物；所述十字花科作物为拟南芥。
2.编码如权利要求1中所述的核盘菌小肽的核酸分子在激发植物产生对卵菌抗性中的应用，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述植物为拟南芥。
3.与权利要求2中所述的核酸分子相关的生物材料在激发植物产生对卵菌抗性中的应用，所述生物材料为下述1)至7)中的任一种：
1)含有如权利要求2所述核酸分子的表达盒；
2)含有如权利要求2所述核酸分子的重组载体；
3)含有1)所述表达盒的重组载体；
4)含有如权利要求2所述核酸分子的重组微生物；
5)含有1)所述表达盒的重组微生物；
6)含有2)所述重组载体的重组微生物；
7)含有3)所述重组载体的重组微生物；
所述植物为拟南芥。
4.一种提高植物对卵菌抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含有如权利要求1中所述的核盘菌小肽的溶液浸润或喷雾处理植物叶片；所述植物为拟南芥。
5.一种防治拟南芥霜霉病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含有如权利要求1中所述的核盘菌小肽的溶液浸润或喷雾处理植物叶片。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110278959A (zh) * | 2019-06-16 | 2019-09-27 | 浙江大学 | 一种油菜短肽BnPEP4的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Erika Ono et al.RLP23 is required for Arabidopsis immunity against the grey mould pathogen Botrytis cinerea.Scientific Reports.2020,第10卷摘要，第1页第1段，第4页第1-2段，第6页第1段，图3，5，7. * |
| Hannah Bohm et al.A Conserved Peptide Pattern from a Widespread Microbial Virulence Factor Triggers Pattern-Induced Immunity in Arabidopsis. PLOS Pathogens.2014,第10卷(第11期),第6页右栏第1段，表2. * |
| Isabell Albert et al.An RLP23–SOBIR1–BAK1 complex mediates NLP-triggered immunity.NATURE PLANTS.2015,第1卷摘要，第3页右栏最后1段-第5页右栏第1段,第5页右栏最后1段-第6页左栏第1段. * |
| ZAFER DALLAL BASHI et al.Expression and regulation of Sclerotinia sclerotiorum necrosis and ethylene-inducing peptides (NEPs).MOLECULAR PLANT PATHOLOGY.2010,第11卷(第1期),摘要，第44页右栏第2段，图1. * |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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