ES2871032T3 - Imán anular de núcleo macizo - Google Patents
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Abstract
Utilización de un imán (20) para aislar macromoléculas de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en el que el imán (20) comprende: a. Un núcleo macizo que tiene una masa interior del imán (20), una superficie superior (4) y una superficie inferior (6); b. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10); y c. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6).
Description
DESCRIPCIÓN
Imán anular de núcleo macizo
Antecedentes de la invención
El aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos, tales como el ADN o el ARN, y proteínas, tales como los anticuerpos) es necesario antes de poder utilizarlas en muchas aplicaciones. Por ejemplo, la secuenciación de ácidos nucleicos y la digestión de restricción de ácidos nucleicos requiere o al menos se beneficia de su purificación. Los ácidos nucleicos se pueden purificar mediante diversos métodos, incluida la extracción tradicional con fenolcloroformo. Un método relativamente moderno de purificación de ácidos nucleicos hace uso de microesferas magnéticas. En este enfoque, las microesferas magnéticas se recubren con una sustancia por la que los ácidos nucleicos tienen afinidad en determinadas condiciones, y de la que los ácidos nucleicos se pueden separar en condiciones diferentes. El empleo de microesferas magnéticas de esta manera puede eliminar la necesidad de etapas de centrifugación o de filtración al vacío, puede acelerar el proceso, puede aumentar los rendimientos de la recuperación y puede permitir la recuperación de ácidos nucleicos directamente a partir de una muestra inicial. La centrifugación y la filtración al vacío tradicionalmente han sido difíciles de automatizar. Las microesferas magnéticas también se pueden utilizar para macromoléculas distintas de los ácidos nucleicos; se pueden utilizar para proteínas y complejos de dos o más macromoléculas.
La utilización de microesferas magnéticas, por ejemplo, mientras la preparación de muestras para la secuenciación de ADN, se ve afectada por el hecho de que requiere la recogida de ADN de un volumen relativamente grande, por el hecho de que el ADN recuperado se diluya en la solución y por la forma del recipiente de recuperación que se restringe en función de la configuración de purificación utilizada. Existe la necesidad de mejorar las implementaciones sensibles al tiempo y de alto rendimiento con la utilización de microesferas magnéticas. Por consiguiente, se necesitan aparatos y métodos mejorados que permitan la purificación de macromoléculas en soluciones más concentradas y en una variedad de recipientes más amplia.
Las siguientes solicitudes describen imanes para la purificación de muestras: DE202014102945 U1, EP2565260 A2, WO00/23807 A1, EP0589636 A1, WO03/044537 A1 y US5705062 A.
Resumen de la invención
Las macromoléculas, tales como los ácidos nucleicos, especialmente las de alta calidad y pureza, se pueden obtener mediante diversos métodos. En un método, se forman complejos entre macromoléculas y microesferas magnéticas, y las microesferas magnéticas se separan a partir de una mezcla, purificando en esencia las macromoléculas tras su "descomplejización" a partir de las microesferas mediante cambios en las condiciones. En una forma de realización, el complejo entre las macromoléculas y las microesferas magnéticas permanece en el recipiente con la forma de un anillo y se elimina la mayor parte de la solución, dejando una alta concentración de complejo en el recipiente.
La presente invención proporciona la utilización de un imán para aislar/purificar macromoléculas a partir de una mezcla.
En concreto, la presente invención proporciona la utilización de un imán (20) para aislar macromoléculas a partir de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en donde el imán (20) comprende:
a. un núcleo macizo que tiene una masa interior del imán (20), una superficie superior (4) y una superficie inferior (6);
b. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10); y
c. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6).
La mezcla, según se define en la presente memoria, es cualquier solución acuosa que tenga al menos la macromolécula además del disolvente. Como ejemplo, puede ser matriz extracelular. Las macromoléculas, tal como se definen en este documento, abarcan los ácidos nucleicos, tales como el ADN o el ARN, o las proteínas, tales como los anticuerpos. La utilización del imán, en particular, puede consistir en aislar las macromoléculas haciendo que se adhieran a las microesferas magnéticas, después de lo cual se pueden separar de la mezcla. En particular, mediante cambios en el entorno químico se consigue que las macromoléculas se adhieran a las microesferas magnéticas para
formar un complejo. El imán se utiliza entonces para atraer el complejo y sacarlo de la solución. En particular, la utilización del imán de acuerdo con la presente invención hace que el complejo forme un anillo de los complejos de microesferas dentro del recipiente. A continuación, la solución se puede retirar dejando atrás las microesferas magnéticas con las macromoléculas adheridas a las mismas.
El imán incluido en la presente invención tiene una superficie superior, una superficie inferior, un núcleo macizo y una o más cavidades. Cada cavidad comienza en una superficie y va hacia el centro del imán, pero no llega al otro lado dejando de este modo un núcleo macizo intacto. En otras palabras, no se forma ningún túnel desde la superficie superior a la inferior y el imán conserva un núcleo macizo. El imán está rodeado por una pared lateral en sus lados no cubiertos por las superficies (las superficies superior e inferior). En una forma de realización, el imán tiene una forma general cilíndrica. En otra forma de realización, el imán tiene forma de prisma rectangular. En cada una de estas, se forman las cavidades. En las formas de realización, las cavidades pueden tener forma de "U", forma de "V" u otra forma irregular, siempre y cuando puedan recibir el recipiente y al menos una parte de la pared de la cavidad tenga una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente cuando se utiliza el recipiente y se coloca en la una o más cavidades, según se describe en la presente memoria. En una forma de realización particular, la pared de la cavidad del imán incluido en la presente invención tiene al menos una parte superior que tiene forma anular, y otras partes pueden tener, por ejemplo, forma cónica. Las cavidades se definen por sus paredes de la cavidad. La pared de la cavidad puede incluir una superficie de base, que es la parte más interna de la pared de la cavidad que termina la cavidad. Las paredes de la cavidad pueden tener un diámetro constante, o pueden tener diámetros variables. En una forma de realización, la superficie de la base puede tener forma cónica; por lo tanto, podría tener radios progresivamente decrecientes hacia el extremo de la cavidad. Las cavidades reciben recipientes (por ejemplo, tubos Eppendorf, pocillos de una microplaca) que contienen una solución. Cuando el recipiente se coloca en la cavidad del imán incluido en la presente invención, el volumen de la parte de la solución que cae dentro o en el interior de la cavidad y hasta el anillo de macromoléculas/microesferas, en una forma de realización, está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 microlitros (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 25, 20, 15 y 10 microlitros). En otra forma de realización, el volumen de la cavidad en sí está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 45 microlitros (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40, 35, 30, 25, 20, 15 microlitros.
Además, se proporciona un sistema para aislar macromoléculas de acuerdo con la invención. Además del imán, el sistema incluye un recipiente para contener una mezcla que incluye una macromolécula (por ejemplo, ADN). Los mismos tipos de imanes que abarcan otras formas de realización se pueden incluir también como parte del sistema.
En concreto, la invención proporciona un sistema para su utilización en el aislamiento de macromoléculas a partir de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en donde el sistema comprende:
a. un imán (20) que comprende:
i. un núcleo macizo que forma una masa interior del imán (20), una superficie superior (4), una superficie inferior (6)
ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10);
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6); y
b. un recipiente (60) para contener la mezcla que tiene el complejo, en donde el recipiente (60) tiene la forma necesaria para encajar dentro de una o más cavidades (8, 10).
Además, se proporcionan de acuerdo con la invención métodos de purificación de macromoléculas a partir de una muestra líquida que contiene una mezcla.
En concreto, la invención proporciona un método para purificar una macromolécula a partir de una muestra líquida que tiene una mezcla, comprendiendo el método:
a. recoger la muestra líquida en un recipiente (60);
b. añadir microesferas magnéticas a la muestra líquida, en donde las etapas "a" y "b" se pueden realizar en cualquier orden en condiciones de formar un complejo macromolécula-microesfera magnética entre la macromolécula y la microesfera magnética;
c. separar el complejo de la muestra colocando el recipiente (60) en una cavidad (8, 10) de un imán (20), en donde el imán (20) comprende:
i. un núcleo macizo que forma una masa interior del imán (20), una superficie superior (4), una superficie inferior (6) ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en la una o más cavidades (8, 10); y
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6); y opcionalmente
d. eluir el material de ácido nucleico de las microesferas magnéticas.
Además, se proporciona un kit de acuerdo con la presente invención.
En concreto, la invención proporciona un kit para su utilización en el aislamiento de macromoléculas de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a las microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en donde el kit comprende:
a. un imán (20) que comprende:
i. un núcleo macizo que forma una masa interior del imán (20), una superficie superior (4), una superficie inferior (6) ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10), opcionalmente en donde una parte de la pared de la cavidad tiene una forma de anillo; y
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), la superficie inferior (6); y
b. el recipiente (60) para contener la mezcla que tiene la macromolécula, en donde el recipiente (60) tiene una forma que se ajusta a las una o más cavidades (8, 10),
y opcionalmente comprende además microesferas magnéticas y/o una o más composiciones tampón.
En una forma de realización, el recipiente se puede colocar en la cavidad de un imán, y un volumen de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 microlitros (por ejemplo, entre 5 y 35, 5 y 30, 5 y 25, 5 y 20, 5 y 15, 5 y 10 microlitros) de muestra permanecería en la parte del recipiente que está dentro del imán y hasta la banda. Las microesferas magnéticas también se pueden añadir como parte del kit en algunas formas de realización.
Además, se proporcionan de acuerdo con la invención sistemas de placa magnética para aislar macromoléculas. En concreto, la invención proporciona un sistema de placa magnética (90) para su utilización en el aislamiento de una macromolécula de una mezcla en un recipiente (60), en donde la placa magnética (90) comprende:
a. al menos un imán (20), en donde el imán (20) comprende:
i. un núcleo macizo que tiene una masa interior del imán (20), una superficie superior (4) y una superficie inferior (6); ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), la superficie inferior (6), o de ambas; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10), opcionalmente en donde una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma de anillo; y
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6); y
b. una placa superior (92) adaptada para recibir varios imanes (20), en donde la placa superior (92) tiene una o más aberturas de poste para recibir un extremo superior de un poste y un muelle, y opcionalmente comprende además varias aberturas de imán para recibir los imanes (20);
c. un poste con un extremo superior y un extremo inferior;
d. un muelle para colocar en la abertura de la placa superior y rodear el poste;
e. una placa de soporte para soportar el imán (20), en donde existe una afinidad entre la placa de soporte y el imán (20);
f. una placa base (96) recibe el extremo inferior del poste y el muelle y se coloca debajo de la placa base (96) cuando se utiliza.
También, se pueden incluir uno o más muelles enrollados alrededor de uno o más postes con hombros como parte de los sistemas de placa magnética. La placa superior puede incluir varios receptores de imanes, y puede alojar imanes tanto con forma cilíndrica como imanes con forma de bloque.
Los sistemas descritos ofrecen muchas ventajas. Se pueden obtener mejores rendimientos de macromoléculas recuperadas, recuperaciones más rápidas, mayores concentraciones y mayores purezas de las macromoléculas recuperadas en comparación con los imanes y sistemas disponibles anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
Los anteriores y otros objetivos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más particular de las formas de realización preferidas de la invención, según se ilustra en los dibujos adjuntos, en los que partes similares se denominan con los mismos símbolos de referencia en las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en la ilustración de los principios de la invención.
La Fig. 1A es un esquema de una vista en perspectiva de un imán anular de núcleo macizo que tiene una forma cilíndrica y cavidades de forma cilíndrica/cónica.
La Fig. 1B es un esquema de una vista en perspectiva de un imán anular de núcleo macizo que tiene múltiples cavidades de forma cilíndrica/cónica y una forma general de prisma rectangular.
La Fig. 2A es un esquema de una vista en planta de un imán anular de núcleo macizo que tiene forma cilíndrica. La Fig. 2B es un esquema de una vista en planta de un imán anular de núcleo macizo que tiene múltiples cavidades de forma cilíndrica/cónica y una forma general de prisma rectangular.
La Fig. 3A es un esquema de una vista de perfil en corte, según se define en la Fig. 2A, de un imán anular de núcleo macizo que tiene forma cilíndrica.
La Fig. 3B es un esquema de una vista del perfil alargado de un imán anular de núcleo macizo que tiene múltiples cavidades de forma cilíndrica/cónica y una forma general de prisma rectangular.
La Fig. 3C es un esquema de una vista del perfil corto de un imán anular de núcleo macizo que tiene múltiples cavidades de forma cilíndrica/cónica y una forma general de prisma rectangular.
La Fig. 4A es un esquema de una vista de perfil de un imán anular de núcleo macizo que tiene forma cilíndrica, que muestra además dos cavidades y un recipiente en forma de V para contener una mezcla de reacción de microesferas magnéticas y macromoléculas. Se muestra el anillo del complejo entre las microesferas magnéticas y las macromoléculas justo por encima de la parte superior del imán.
La Fig. 4B es un esquema de una vista de perfil de un imán anular estándar que tiene un canal de longitud completa, y un recipiente en forma de V para la mezcla de reacción de microesferas magnéticas y macromoléculas. Se muestra el anillo del complejo entre las microesferas magnéticas y las macromoléculas justo por encima de la parte superior del imán.
La Fig. 4C es un esquema de una vista de perfil de un imán anular de núcleo macizo que tiene forma cilíndrica, que muestra además dos cavidades y un recipiente en forma de U para contener una mezcla de reacción de microesferas
magnéticas y macromoléculas. Se muestra el anillo del complejo entre las microesferas magnéticas y las macromoléculas justo por encima de la parte superior del imán.
La Fig. 4D es un esquema de una vista de perfil de un imán anular estándar que tiene un canal de longitud completa, y un recipiente en forma de U para la mezcla de reacción de microesferas magnéticas y macromoléculas. Se muestra el anillo del complejo entre las microesferas magnéticas y las macromoléculas justo por encima de la parte superior del imán.
La Fig. 4E es un esquema de una vista en perspectiva de un imán anular de núcleo macizo que tiene una forma cilíndrica, que muestra además dos cavidades y un recipiente en forma de U para contener una mezcla de reacción de microesferas magnéticas y macromoléculas mostrado en la Fig. 4A. Se muestra el anillo o banda del complejo macromoléculas/microesferas justo por encima de la parte superior del imán.
La Fig. 4F es un esquema de una vista en perspectiva de un imán anular de núcleo macizo que tiene una forma cilíndrica, que muestra además dos cavidades y un recipiente en forma de V para contener una mezcla de reacción de microesferas magnéticas y macromoléculas mostrado en la Fig. 4B. Se muestra el anillo o banda del complejo macromoléculas/microesferas justo por encima de la parte superior del imán y también se muestra una pipeta.
La Fig. 5A es un esquema de una vista en perspectiva de una placa magnética que tiene múltiples imanes anulares de núcleo macizo que tienen cada uno una forma cilíndrica.
La Fig. 5B es un esquema de una vista en perspectiva de una placa magnética que tiene múltiples imanes anulares de núcleo macizo que tienen cada uno múltiples cavidades de forma cilíndrica/cónica y una forma general de prisma rectangular.
La Fig. 6 es un gráfico de líneas de las diferencias en las fuerzas de atracción medidas entre un dispositivo magnético y el imán anular de núcleo macizo (cuadrados) o el imán anular (triángulos). La medición se realizó utilizando un medidor de fuerza digital.
La Fig. 7A es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3 minutos) a partir de 50 microlitros de solución en una placa PCR, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7B es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3 minutos) a partir de 100 microlitros de solución en una placa PCR, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7C es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 5 minutos) a partir de 150 microlitros de solución en una placa PCR, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7D es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 5 minutos) a partir de 200 microlitros de solución en una placa PCR, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7E es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 5 minutos) a partir de 250 microlitros de solución en una placa PCR, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7F es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 5 minutos) a partir de 300 microlitros de solución en una placa PCR, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7G es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 5 minutos) a partir de 500 microlitros de solución en una placa de microtitulación, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7H es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (0,5 (30 segundos), 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 5 minutos) a partir de 750 microlitros de solución en una placa de microtitulación, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7I es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25 minutos) a partir de 1.000 microlitros de solución en una placa de microtitulación, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
La Fig. 7J es un gráfico de líneas del porcentaje de recuperación de microesferas a lo largo del tiempo (2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25 minutos) a partir de 2.000 microlitros de solución en una placa de microtitulación, que muestra la diferencia entre un imán anular estándar (triángulos) y un imán anular de núcleo macizo ("X"), ambos con las mismas dimensiones exteriores y grado magnético.
Descripción detallada de la invención
A continuación, se describen las formas de realización preferidas de la invención.
En muchos procedimientos de biología molecular se necesitan macromoléculas en forma purificada. Por ejemplo, para preparar una muestra de ADN o ARN para su secuenciación, es necesario extraerla de cualquiera de los diversos tipos de muestras clínicas, tales como tejidos, sangre, frotis de mejilla, esputo, material forense, muestras FFPE, etc. La extracción inicial de la muestra primaria va seguida de una multitud de reacciones enzimáticas denominada construcción de bibliotecas. A cada reacción enzimática le sigue otra etapa de extracción para aislar el ácido nucleico condicionado de la mezcla de reacción. Las reacciones enzimáticas suelen ir seguidas de amplificación (mediante PCR) y/o selección de tamaño (para limitar la distribución de los tamaños de los fragmentos a una banda estrecha de unos pocos cientos de pares de bases (por ejemplo, 500 - 700 pb)). El flujo de trabajo desde la muestra primaria hasta el ADN o ARN listo para la secuenciación puede implicar entre 5 y 10 etapas de extracción distintas. A lo largo del flujo de trabajo, el volumen total de la mezcla que contiene la muestra, así como el contenedor de la misma, puede variar significativamente; los volúmenes típicos oscilan entre aproximadamente 2000 pl hasta 35 pl. Estos flujos de trabajo suelen estar totalmente automatizados para lograr la precisión y el rendimiento requeridos. El alto grado de automatización de los flujos de trabajo relacionados con la secuenciación ha llevado a la adopción generalizada de la tecnología de microesferas magnéticas para los propósitos de extracción, ya que los protocolos alternativos requieren o bien centrifugación o bien filtración al vacío, que no son fáciles de automatizar.
Dependiendo de la naturaleza de la macromolécula a extraer, así como de la matriz en la que está presente, las microesferas magnéticas (con más precisión: las microesferas paramagnéticas) se recubren con fracciones (por ejemplo, grupos funcionales, otros compuestos) con los que las macromoléculas tengan afinidad. Por ejemplo, las microesferas se podrían recubrir con un ácido carboxílico que tenga una fracción, tal como el ácido succínico. El acoplamiento entre las microesferas y las macromoléculas también se podría basar en la química de la estreptavidinabiotina o la carbo diimida. Los recubrimientos de ejemplo incluyen proteína A, proteína B, anticuerpos específicos, fragmentos particulares de anticuerpos específicos, estreptavidina, níquel y glutatión. Las propias microesferas pueden variar de tamaño, pero tendrán un diámetro medio (por ejemplo, 1 micrometro). En algunas formas de realización, las propiedades paramagnéticas de las microesferas serán el resultado de la integración del hierro en una sustancia que de otro modo no sería magnética (por ejemplo, un gel de agarosa al 4 %). Las microesferas magnéticas, así como las que ya están recubiertas con varios grupos de afinidad, se pueden adquirir en las empresas Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO, EE.UU.), Life Technologies (Grand Island, NY, Ee .UU.), Thermo Scientific (Rockford, IL, EE.UU.), EMD-Millipore (Billerica, MA, EE.UU.) y New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.).
En una aplicación de los métodos de la presente invención, las macromoléculas se pueden purificar utilizando microesferas magnéticas realizando las siguientes etapas:
a. mezclar las microesferas magnéticas que tienen un recubrimiento particular que confiere afinidad con la macromolécula de interés en un contenedor (por ejemplo, un recipiente, un tubo Eppendorf, un pocillo de microplaca, un pocillo profundo, un pocillo de PCR, un recipiente de fondo redondo);
b. después de la mezcla, permitir la unión específica entre las microesferas y las macromoléculas, creando por lo tanto complejos microesfera-macromolécula;
c. colocar la parte inferior del recipiente dentro de la cavidad de un imán anular de núcleo macizo;
d. permitir que los complejos de microesfera-macromolécula se agreguen (por ejemplo, se segreguen) en forma anular alrededor del perímetro de la parte inferior del recipiente (o de cada recipiente si se utilizan varios); y
e. eliminar el sobrenadante, que tendría moléculas no ligadas y no deseadas;
f. realizar una o más etapas de lavado mediante la adición de un disolvente adecuado, por ejemplo, etanol, seguido de la eliminación del mismo.
Otras etapas pueden incluir la resuspensión de los complejos microesfera-macromolécula en un disolvente, con el fin de obtener una solución con un volumen y una concentración deseados. Se puede elegir el disolvente adecuado de modo que la afinidad de unión entre las microesferas y las macromoléculas disminuya, permitiendo que se disocien entre sí. También se pueden repetir las etapas anteriores para agregar las microesferas magnéticas de nuevo y permitir separaciones adicionales, dependiendo del tampón elegido.
Además, las microesferas se pueden utilizar tanto para unir el componente de interés, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico, como para durante el método descartar el sobrenadante y eluir el componente de interés de las microesferas. De forma alternativa, se puede dejar que las microesferas se unan al componente que se quiere descartar, dejando sólo el componente de interés en el sobrenadante. En este caso, el sobrenadante se transfiere a un nuevo recipiente limpio para su utilización o experimentación posterior y se descartan las microesferas magnéticas con sus moléculas no deseadas.
Los métodos anteriores se automatizan generalmente utilizando sistemas robóticos (por ejemplo, estaciones de trabajo de manipulación de líquidos automatizadas) o colectores de aspiración/dispensación. Entre las estaciones de trabajo que se pueden utilizar para la automatización se incluyen Agilent Bravo, Apricot Designs TPS-384, Beckman Biomek FX, Tecan Freedom EVO. Las etapas de la presente invención se pueden realizar de forma manual, por ejemplo, utilizando el pipeteo para retirar/recoger el sobrenadante.
Una vez que se ha formado un complejo entre una macromolécula de interés y una microesfera magnética (que se podría formar por medio de enlaces covalentes y no covalentes), se puede emplear un campo magnético creado por un imán para concentrar los complejos microesfera-macromolécula en una parte de la mezcla (por ejemplo, en una banda de una solución). Después de eso, se puede aspirar el sobrenadante (por ejemplo, por medio de pipeteo) y se separan los complejos de la mezcla. Posteriormente, las macromoléculas se pueden separar de las microesferas, por ejemplo, eluyéndolas por medio de cambios en la solución (por ejemplo, características de la composición del tampón, tales como el pH y la concentración salina). Con los métodos actualmente conocidos, esta etapa da lugar a grandes volúmenes de macromoléculas eluidas. La presente invención permite de forma sorprendente la recuperación de un eluido que es de menor volumen, de mayor rendimiento y de mayor concentración. El proceso de recuperación también se acelera con el imán incluido en la presente invención.
El imán incluido en la presente invención, en una forma de realización se fabrica a partir de un metal de las tierras raras tal como el neodimio. Un imán de neodimio puede tener la composición química Nd2 FeuB, donde Nd es neodimio, Fe es hierro y B es boro. En algunas formas de realización alternativas, el imán también se puede fabricar a partir de samario (por ejemplo, SmCO5 sinterizado). El imán se puede cubrir con una capa protectora, por ejemplo, una capa de níquel. Los recubrimientos alternativos incluyen una o varias capas, tales como níquel, cobre, zinc, estaño, plata, oro, resina epoxi o cualquier otro material adecuado. Dichos recubrimientos ayudan, entre otras cosas, a impedir la oxidación del componente de hierro. En cada una de estas formas de realización, el objeto completo se denomina como el "imán". El imán puede tener un grado de resistencia que, en diferentes formas de realización, puede ser aproximadamente N35, n 38, N40, N42, N45, N48, N50 o N52. Entre las formas de realización de la presente invención también se incluyen imanes adicionales con diferentes grados, tales como los que tienen números N más altos (aquellos que se puedan fabricar en el futuro) o diferentes rangos de temperatura (grados H). Los imanes (por ejemplo, los imanes de neodimio) se pueden sinterizar o adherir. Los imanes se pueden adquirirse en la empresa K&J Magnetics, Jamison, PA. Por ejemplo, las cavidades se pueden perforar en el imán con una broca de taladro.
La presente invención comprende un imán 20 que, en una forma de realización, mostrada en la Fig. 1A, tiene dos cavidades, la cavidad superior 8 y la cavidad inferior 10. La cavidad superior 8 desciende desde el centro de la superficie superior 4, mientras que la cavidad inferior 10 se eleva desde la superficie inferior 6. Los lados del imán 20 se rodean por la pared lateral 2. En la forma de realización mostrada en la Fig. 1A, tanto el imán es cilíndrico como una parte de la pared de la cavidad tiene forma cilíndrica. Las cavidades tienen paredes que son en parte de forma cilíndrica y en parte de forma cónica. En una forma de realización, la pared de la cavidad puede tener cualquier forma siempre que una parte de la pared de la cavidad tenga una forma cilíndrica para formar un campo magnético que atraiga las microesferas en una formación en forma anular dentro del recipiente. El término "con forma cilíndrica", en este documento, se utiliza para referirse a las estructuras tridimensionales que tienen secciones con límites exteriores en forma anular (circular). El término "de forma cilíndrica/cónica", se refiere a una cavidad que tiene ambas características y en particular, tiene estructuras tridimensionales que tienen secciones que tienen límites exteriores en forma anular (circulares) y una sección de la base que es cónica. Los ejes de las secciones cilíndricas, según se definen, son paralelos al eje del espesor (es decir, entre los planos de la superficie superior y la superficie inferior) de la estructura. Además, las secciones que son elípticas en un grado leve (por ejemplo, los dos radios que difieren en menos del 5 %) también están comprendidas en la forma de la cavidad. La cavidad puede tener cualquier forma,
siempre que pueda recibir un recipiente de tal manera que, durante la utilización, el campo magnético haga que las microesferas magnéticas formen un anillo dentro del recipiente.
La estructura general, para el imán 20, es cilíndrica cuando se ignora la presencia de cavidades. En otras palabras, el volumen encerrado en el interior de la pared exterior, limitado por arriba por el plano de la superficie superior (por ejemplo, el plano superior), y limitado por abajo por el plano de la superficie inferior (por ejemplo, el plano inferior) tiene forma cilíndrica. Al referirse a los volúmenes, los términos superficie superior y superficie inferior se utilizan para referirse al plano de la superficie superior y al plano de la superficie inferior, respectivamente.
A modo de aclaración, hay dos volúmenes pertinentes con respecto a las cavidades del imán incluidas en la presente invención. El volumen de la cavidad en sí, y el volumen de solución en el recipiente que, cuando se coloca en el imán, reside generalmente dentro de la cavidad (es decir, entre el plano superior y el punto más bajo de la pared de la cavidad), o dicho de otro modo, desde el punto más bajo de la pared de la cavidad hasta el anillo de microesferas. En una forma de realización, el volumen de la cavidad en sí está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 45 microlitros (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40, 35, 30, 25, 20, 15 microlitros). En otra forma de realización, la cavidad tiene un tamaño de tal manera que el volumen de la solución en el recipiente y el que se encuentra dentro de la cavidad hasta el anillo de microesferas, en una forma de realización, está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 35 microlitros (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 34, 33, 32, 31,30, 25, 20, 15, 10 microlitros). Esto último también se refiere al volumen necesario en el recipiente para cubrir el anillo de macromoléculas-microesferas con el fin de eluir las microesferas de las macromoléculas o para realizar algún otro experimento. Obsérvese que existe un espacio entre la pared de la cavidad y el recipiente colocado dentro de la cavidad, por lo que existe una diferencia de volumen entre el tamaño de la cavidad y el volumen de solución en el recipiente y dentro del plano superior. En la forma de realización mostrada en la Fig. 1A, se muestran dos cavidades. Sin embargo, se puede utilizar una cavidad, en una forma de realización, ya que crea un lugar para la recepción del recipiente. Sin embargo, se desean dos cavidades, en otra forma de realización, de modo que los imanes se puedan insertar durante el montaje con cualquier orientación, es decir, polaridad. Por consiguiente, la presente invención consiste en un imán con una o más cavidades (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez, etc.).
En otras formas de realización, si bien la pared de la cavidad tiene una parte de forma cilíndrica, la totalidad del imán puede tener forma de bloque, de barra o de prisma (por ejemplo, forma de prisma rectangular). Una forma de realización de este tipo se muestra en la Fig. 1b . Se muestran la pared lateral 22, la superficie superior 24 y las cavidades superiores (28A, 28B, ..., 28H) del imán 40. El imán 40 es generalmente un imán de barra con extremos curvos y varias cavidades, mientras que el imán 20 es un imán cilíndrico con dos cavidades. Con respecto a las aplicaciones de los imanes, la atención se centra en la cavidad en contraposición al imán completo. Por consiguiente, tanto el imán cilíndrico (por ejemplo, el imán 20) como el imán en bloque (por ejemplo, el imán 40) se consideran y se denominan como imanes de núcleo macizo porque, independientemente de la forma del imán que tiene cavidades, el núcleo es un imán macizo relleno. "Imán de núcleo macizo" y "imán anular de núcleo macizo" se utilizan indistintamente en la presente memoria. La palabra "anular" de la frase "imán anular de núcleo macizo" connota la forma de la parte superior de la pared de la cavidad o el anillo del complejo de microesferas paramagnéticas/macromoléculas que forma. En otras palabras, el término "imán de núcleo macizo" en este documento se refiere a los imanes que tienen un núcleo macizo y una pared de la cavidad con al menos una parte en forma anular, independientemente de si los imanes tienen forma cilíndrica o de prisma rectangular.
La Fig. 2A muestra una vista en planta del imán mostrado en la Fig. 1A. Son visibles la superficie superior 4, la cavidad superior 8, así como la superficie de base 16 de la cavidad superior. A partir de esta figura es evidente que la pared de la cavidad tiene forma anular/cónica. En la Fig. 3A se muestra una vista en corte tal como se genera a través de las marcas "3A".
La Fig. 2B muestra una vista en planta del imán mostrado en la Fig. 1B. El imán 40 mostrado es un imán en bloque, y tiene ocho cavidades. En esta figura se muestra la superficie superior 24, las cavidades superiores (28A, 28B, ..., 28H), y las superficies de base (36A, 36B, ..., 36H) de las cavidades superiores. Aunque el límite exterior de este imán en bloque tiene la forma de un prisma rectangular, este imán también se clasifica en la presente memoria como un imán anular porque las paredes de la cavidad tienen forma de anillo/cónica.
En la Fig.3A se muestra una sección transversal del imán presentado anteriormente en la Fig. 2A. El imán 20 mostrado en esta figura tiene una cavidad superior 8 y una cavidad inferior 10. La parte de la cavidad superior 8 que desciende desde la superficie superior 4 hacia el centro de la cavidad superior tiene una pared superior en forma anular 12 y una pared superior de superficie cónica 16. La pared de superficie cónica 16 es la parte de la pared de la cavidad que tiene radios que disminuyen desde las partes superiores de la pared de la cavidad a valores más bajos hasta los extremos de la cavidad. Del mismo modo, se muestra la cavidad inferior con la pared inferior en forma anular 14 y la superficie cónica de la cavidad inferior 18. La forma de la cavidad no necesita incluir una forma cónica, y puede tener cualquier forma (en forma de "V", en forma de "U" o en forma irregular) siempre que pueda recibir el recipiente, según se describe en la presente memoria. No es necesario que las cavidades superior e inferior, o sus partes, tales como las paredes y las superficies, sean iguales entre sí. Sin embargo, el hecho de que sean iguales facilita el montaje en una placa
guía, así como la sustitución de un imán por otro. Para las formas de realización que tienen cavidades superiores e inferiores de forma idéntica, durante el montaje de los imanes en una placa guía se puede decidir si tienen la misma polaridad o la opuesta simplemente sosteniendo un extremo aleatorio de cada uno de los dos imanes uno contra otro. Si se atraen, están polarizados de forma opuesta. Si se repelen, comparten la misma polarización.
En la Fig. 3B se muestra una vista de perfil del lado largo del bloque magnético 40. Esta figura muestra la pared lateral 22, las cavidades superiores (28A, 28B, ..., 28H), y las paredes de la cavidad superior (32A, 32B, ..., 32H). La Fig. 3C muestra el mismo imán, pero desde el punto de vista del lado corto.
En las Fig. 4A a la Fig. 4D se muestra una comparación entre un imán disponible anteriormente (denominado como "imán anular estándar") y los imanes anulares de núcleo macizo incluidos en la presente invención. Como debería ser inmediatamente evidente, el imán anular estándar tiene un canal que recorre todo el espesor entre los extremos superior e inferior del imán (Fig. 4B y Fig. 4D). Por el contrario, el imán anular de núcleo macizo incluido en la presente invención, como su nombre indica, tiene un núcleo macizo y una o más cavidades que no crean un canal/túnel a través de todo el espesor del imán (Fig. 4A y Fig. 4C). Cada una de las cavidades mostradas en la Fig. 4A y la Fig. 4C termina con una superficie cónica. En esta forma de realización, una superficie cónica permite alojar un recipiente que tenga una punta inferior en forma de V, mientras que el diámetro de la cavidad por encima de la superficie cónica permite alojar un recipiente que tenga una punta inferior en forma de U. En contraste sorprendentemente, mientras que un imán estándar llevaría a que un alto volumen de muestra estuviera por debajo del nivel alineado de la macromolécula, un imán anular de núcleo macizo permitiría que un bajo volumen de muestra estuviera por debajo del nivel alineado del complejo macromoléculas/microesferas. La banda de ácido nucleico/microesfera 62 se agrega en una posición más baja en el recipiente 60 cuando se utiliza el imán anular de núcleo macizo incluido en la presente invención (véase la Fig. 4A), en comparación con la posición de la banda de ácido nucleico/microesfera 66 en los recipientes 64 que utilizan el imán anular estándar (véase la Fig. 4B). Una posición más baja en el pocillo es deseable ya que generalmente se necesita menos tampón de elución para eluir el ADN, lo que conduce a una mayor concentración de ADN.
Los términos recipiente en forma de U, recipiente con punta inferior en forma de U y pocillo con fondo redondo se utilizan indistintamente. Los términos recipiente en forma de V, recipiente con una punta inferior en forma de V y pocillo con forma cónica también se utilizan indistintamente.
En general, las Fig. 4A y 4C muestran el recipiente de forma cónica 60 que tiene una punta inferior en forma de V, la banda del complejo de ácido nucleico/microesferas 62, el recipiente de forma redonda 70, la solución de ácido nucleico 72 y la banda de ácido nucleico 74. A modo de comparación, las Fig. 4B y 4D muestran el imán anular estándar 50 que tiene un canal/túnel estándar 52, que se utiliza para el recipiente en forma de V 64 para aislar el ácido nucleico 66, y el imán anular estándar 54 que tiene un canal estándar 56, que se utiliza para el recipiente en forma de U 76 para aislar el ácido nucleico 80 de la solución 78. Como se puede observar en las figuras, el imán anular estándar de la Fig. 4B hace que el complejo ácido nucleico/microesferas se sitúe más alto en el recipiente, en comparación con el complejo ácido nucleico/microesferas mostrado en la Fig. 4A. Por consiguiente, se necesita menos tampón de elución cuando se utiliza el imán anular de núcleo macizo incluido en la presente invención.
Además, las Figs.4A y 4C muestran que el imán anular de núcleo macizo incluido en la presente invención es universal con respecto al tipo de recipiente que se utiliza. Se puede utilizar con recipientes en forma de "V", tales como una placa PCR, o con un recipiente en forma de "U", tal como una placa de microtitulación. Dado que se puede utilizar cualquier forma de recipiente, la placa magnética de núcleo macizo se puede utilizar para realizar varios experimentos o etapas de purificación sin tener que cambiar a otra placa magnética que tenga un imán de tamaño/forma diferente.
Aunque la macromolécula es en concreto un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, APN) en estas figuras, también se incluyen en otras formas de realización otras macromoléculas tales como las proteínas (por ejemplo, anticuerpos, péptidos). Esencialmente, cualquier macromolécula que se pueda adherir, de forma reversible o no, a las microesferas magnéticas se puede someter a los métodos descritos en la presente memoria.
Pasando ahora a las Fig. 4E y 4F, se puede ver la formación del complejo ácido nucleico/microesferas. La Fig. 4E es una vista en sección transversal de la Fig. 4A y la Fig. 4F es una vista en sección transversal de la Fig. 4C. La Fig. 4E muestra la agregación de la banda de ácido nucleico/microesferas 62 y la Fig. 4F muestra la agregación de la banda de ácido nucleico/microesferas 74. Como se puede observar a partir de estos dibujos, la banda forma un anillo a lo largo de la pared interior de los recipientes 60 o 70. La formación de la banda de ácido nucleico/microesferas en forma anular es una función de los campos magnéticos emitidos por el imán anular de núcleo macizo, que se describen adicionalmente en la presente memoria. Dado que se forma un anillo a lo largo de la pared interior del recipiente, el pipeteo del sobrenadante (por ejemplo, utilizando la pipeta 73), ya sea de forma automatizada o manual, se realiza fácilmente y permite dejar la banda de microesferas en el recipiente.
La ubicación de la banda anular de macromoléculas influye en las etapas de la metodología para separar las macromoléculas de la mezcla. Cuando el recipiente se coloca sobre el imán, las microesferas magnéticas de la solución se agregan cerca del imán en el lugar de mayor concentración de las líneas de campo magnético; es aquí
donde el campo magnético es generalmente el más fuerte. Dado que la parte superior de la pared de la cavidad tiene forma anular, las microesferas forman un anillo en la parte inferior del recipiente, cerca de la parte superior del imán. Después de desechar el sobrenadante y lavar las microesferas inmovilizadas con una solución de lavado, la siguiente etapa tiene por objetivo recuperar las macromoléculas de las microesferas. Esto se consigue exponiendo las microesferas al tampón de elución, que invertirá la adherencia entre las macromoléculas y las microesferas. Las macromoléculas purificadas se encuentran entonces en el tampón de elución, que posteriormente se puede retirar del recipiente por aspiración. Para eluir de forma eficaz las macromoléculas de las microesferas, hay que añadir suficiente tampón de elución para cubrir por completo las microesferas con tampón, de modo que se pueda producir una elución eficaz. Al mismo tiempo, hay que mantener el volumen de tampón de elución lo más pequeño posible de forma que las macromoléculas no se diluyan innecesariamente. El volumen necesario se mantiene bajo porque el imán incluido en la presente invención se diseña de tal manera que el anillo de microesferas se formará lo más bajo posible dentro del recipiente, independientemente de la forma del recipiente.
Las líneas de campo magnético se crean por los imanes. Las líneas emanan de un lado del imán y terminan en el otro. La dirección de la magnetización generalmente es perpendicular a la(s) superficie(s) con las cavidades, en otras palabras, a lo largo del eje de las cavidades. En particular, los imanes descritos en la presente memoria se magnetizan a través del espesor (es decir, a lo largo del eje central que discurre entre el plano de la superficie superior y el plano de la superficie inferior). Cada cavidad está rodeada por una superficie superior y una superficie inferior, y cada uno de dichos lados (superficie superior y superficie inferior) tiene una determinada polaridad, que se puede designar como norte (N) o sur (S). Cuando los imanes que tienen una forma cilíndrica general se ensamblan en una placa guía (un ejemplo de la cual se muestra en la Fig. 5A), se pueden disponer en cualquier número de disposiciones, incluyendo filas alternas, columnas alternas, disposición de tablero de ajedrez u otro patrón. Las disposiciones de las polaridades se realizan para cualesquiera placas superiores que podrían tener un número diferente de receptores magnéticos para alojar placas de diversos tamaños (por ejemplo, 6, 24, 96, 384 o incluso 1536 pocillos de muestra dispuestos en una matriz rectangular con relación 2:3).
Dado que la forma del imán anular de núcleo macizo es diferente a la de un iman anular estándar con un canal/túnel que atraviesa todo el espesor del imán, las líneas de campo magnético que se crean son diferentes. En el imán anular de núcleo macizo, las líneas pasan más cerca del cuerpo del imán y dan lugar a fuerzas de atracción más fuertes debido a la mayor cantidad de material magnético. En la sección de demostración, en el Experimento 1 y en la Fig. 6, se ofrece soporte experimental para esto. Las fuerzas de atracción más fuertes facilitan una recuperación más rápida del material, y también facilitan la recuperación de mayores fluencias del material. Véase el Experimento 2, Fig. 7.
La Fig. 5A muestra la placa magnética 90, dentro de la cual hay una placa superior 92 (también denominada placa guía) que tiene 96 receptores magnéticos (es decir, los orificios no mostrados en la figura, que reciben los imanes). Los receptores magnéticos se disponen en 8 filas y 12 columnas. Cada receptor magnético recibe un imán (por ejemplo, 20A, 20B). Los muelles (98A, 98B, etc.) se colocan alrededor de los postes con hombros (99B, etc.) en las esquinas de la placa superior. Los postes con hombros, y los muelles, pasan a través de la placa superior 92 y la placa base 96. Los muelles permiten la flexibilidad en la nivelación de los imanes y, por tanto, de cualesquiera recipientes colocados en sus cavidades. Con los muelles, el pipeteo de los recipientes se puede realizar de forma más eficiente. En una forma de realización, la placa de soporte 94 es un metal, y existe una afinidad entre la placa de soporte y los imanes. Más abajo, por debajo tanto de la placa superior como de la placa de soporte, se encuentra la placa base 96. La placa superior se puede fijar a la placa base insertando postes con hombros (por ejemplo, pernos) a través de los receptores de pernos con hombro que se encuentran en las esquinas de las dos placas. En algunas formas de realización, los pernos con hombro y los muelles pueden estar en cada una de las cuatro esquinas de las placas, mientras que en otras formas de realización pueden estar en ubicaciones alternativas (por ejemplo, a lo largo de partes de los bordes o en algunas de las esquinas solamente). La placa de soporte se fabrica a partir de un material que tenga afinidad con los imanes. Puede ser a partir de un metal tal como el hierro, el níquel, el cobalto o una aleación de diferentes materiales.
De forma similar a la Fig. 5A, la Fig. 5B muestra una placa magnética. En esta forma de realización, los imanes tienen forma de bloque. Elementos similares, tales como las tres placas (superior, soporte, base), los muelles y los postes con hombros se pueden utilizar con esta forma de realización. Aunque no es necesario, en la forma de realización mostrada, todos los componentes excepto los imanes y la placa superior son los mismos que en la Fig. 5A.
Los componentes muelle integrados permiten la eliminación completa del líquido sin oclusión de la punta. Los muelles amortiguan eficazmente los pocillos y permiten que las placas (por ejemplo, la placa superior, la placa de soporte) cedan cuando las puntas (por ejemplo, las puntas de pipeta) entran en contacto con la parte inferior de un pocillo. Esto compensa las tolerancias físicas entre el material de laboratorio y los pipeteadores, que de otro modo pueden comprometer la precisión de la eliminación del sobrenadante (por ejemplo, la aspiración). Además, en algunas formas de realización las placas magnéticas se diseñan para la automatización; tienen una huella estandarizada para encajar en nidos de placas, hoteles de placas y apiladores de manipuladores de líquidos estándar. Las ranuras de agarre en los lados largos proporcionan espacio para los brazos robóticos o las pinzas al mover las microplacas dentro y fuera de las placas magnéticas.
El imán anular de núcleo macizo utilizado para aislar macromoléculas permite una recuperación más rápida de las macromoléculas, la recuperación de porcentajes más altos y la recuperación de las macromoléculas en volúmenes de elución más pequeños. El imán anular de núcleo macizo, según se describe en el ejemplo, permite una mejor separación de las microesferas de la mezcla. Esto se consigue porque el imán de núcleo macizo proporciona una fuerza adicional que se aplica a las microesferas magnéticas. En una forma de realización, el núcleo macizo proporciona entre aproximadamente el 1 % y el 25 % (por ejemplo, aproximadamente el 20 %, el 15 %, el 10 % y el 5 %) de fuerza magnética adicional, en comparación con el imán anular estándar. Véase la Fig. 6. La fuerza adicional facilita una separación mejor y más eficiente. Por consiguiente, el imán incluido en la presente invención tiene una recuperación de macromoléculas entre aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 99 % (por ejemplo, aproximadamente el 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 %) de recuperación. En comparación con un imán de núcleo no macizo (por ejemplo, un imán anular estándar), el imán incluido en la presente invención mejora la recuperación entre aproximadamente un 1 % hasta aproximadamente un 60 % (por ejemplo, aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % y 55 %).
En concreto, el imán incluido en la presente invención es capaz de separar más material de ácido nucleico y es capaz de hacerlo más rápido y en menos ciclos, en comparación con el imán anular estándar. En una forma de realización, el imán incluido en la presente invención es capaz de separar macromoléculas que se pueden adherir a microesferas magnéticas en una cantidad que es aproximadamente 1X más rápida y hasta 4,5 X más rápida (1X, 1,5X, 2X, 2,5X, 3X, 3,5X, 4X, 4,5X), en comparación con un imán de núcleo no macizo (por ejemplo, un imán anular estándar según se muestra en las Figs. 4B y 4D). En la sección de demostración y en las Figs. 7A a 7J se proporciona apoyo experimental para estas propiedades mejoradas.
En una forma de realización, el imán incluido en la presente invención puede obtener un porcentaje de recuperación de al menos aproximadamente el 10 % de aumento (por ejemplo, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 120 %, 150 %, or 200 %) sobre la cantidad recuperada utilizando un imán anular estándar. El porcentaje de recuperación se puede medir en diversos momentos entre aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 25 minutos (por ejemplo, aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25 minutos) y en varios volúmenes que oscilan entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2000 pl (por ejemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 2000 pl).
Las condiciones estándar para formar el complejo macromolécula-microesfera son conocidas en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Rohland, et al., Cost-Effective High-Throughput DNA Sequencing Libraries For Multiplexed Target Capture, Genome Research 22:939-946 and Supplemental Notes (cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente memoria por referencia). Por ejemplo, los kits de reactivos que se pueden utilizar para formar el complejo macromolécula-microesfera están disponibles en el mercado, tales como la composición AMPURE de Beckman Coulter, o dichos reactivos se pueden fabricar. Un ejemplo de un reactivo de inmovilización reversible en fase sólida que se puede fabricar y utilizar con la presente invención es una composición de MagNA, que está hecha de:
Partículas magnéticas Sera-Mag SpeedBead modificadas con carboxilato (hidrofílicas), 100 mL (GE Healthcare, producto n° 45152105050350; anteriormente conocido como microesferas Sera-Mag Speed Magnetic modificadas con carboxilo al 0,1 % (FisherSci, cat.#: 09-981-123) 18 % PEG-8000 (p/v) (por ejemplo, Sigma Aldrich, cat: 89510).
1M NaCl
10mM Tris-HCl, ph 8,0
1 mM EDTA, pH 8,0
Opcional: 0,05 % Tween 20
Para formar el complejo macromolécula-microesfera, en una forma de realización, se pueden añadir a la mezcla 0,5X-3X MagNA en una cantidad que oscila entre 10 microlitros y 400 microlitros.
Demostración
Introducción:
La purificación de ácidos nucleicos mediante microesferas magnéticas es una técnica estándar en la secuenciación de alto rendimiento. Las etapas de purificación se producen en varios puntos del flujo de trabajo de preparación de la muestra, desde la extracción original del ADN de una muestra biológica, hasta las etapas de acondicionamiento enzimático, la limpieza de la PCR y la selección del tamaño. Para permitir el procesamiento
automatizado, las muestras se suelen transferir desde un contenedor primario, como un tubo de recogida, un vial Eppendorf o similar, a una microplaca. Existen microplacas en muchos formatos especializados diferentes, desde 6 pocillos (2x3) hasta varios miles de pocillos. El formato más habitual es la placa de 96 pocillos, en donde los pocillos, es decir, las cavidades individuales que contienen las muestras, se disponen en una matriz de 8x12. Aparte del número de pocillos, las microplacas pueden variar mucho en cuanto al volumen por pocillo, la forma de los pocillos, los materiales utilizados y otros parámetros en función de la aplicación prevista. A pesar de todas sus diferencias, los grupos de la industria han acordado un conjunto de parámetros que definen determinadas dimensiones de las microplacas con el objetivo de mantener su idoneidad para el procesamiento automatizado en instrumentos de laboratorio robóticos estándar. Estas normas son mantenidas por la Sociedad para la investigación y automatización del laboratorio (SLAS) y se pueden descargar de su sitio web en www.slas.org/resources/information/industry-standards. El principio básico de las separaciones con microesferas magnéticas incluye el secuestro de las microesferas magnéticas de la matriz de reacción exponiéndolas a un campo magnético. La fuerza magnética inmoviliza entonces las microesferas, lo que permite eliminar el sobrenadante al mismo tiempo que las microesferas, con su carga útil adherida, quedan retenidas.
La forma más común de aplicar un campo magnético se consigue colocando la microplaca sobre la parte superior de una placa magnética que complemente la microplaca. Las placas magnéticas son disposiciones de imanes permanentes en una matriz similar a la matriz de pocillos de los tipos de microplacas para los que se fabrican. Al igual que hay diversos tipos de microplacas -con 24 pocillos, 96, 384, etc., también hay diferentes placas magnéticas. Algunas placas magnéticas utilizan imanes de poste, donde un imán de poste se sitúa en el centro de 4 pocillos; también están disponibles placas con imanes de barra, donde cada imán de barra actúa para toda una fila o columna de pocillos de una microplaca. Un tipo de placa magnética es una placa de imanes anulares con 96 imanes permanentes con forma anular. La cavidad con forma anular es particularmente útil porque produce un campo magnético con forma anular, haciendo que las microesferas magnéticas se agreguen en la misma forma anular en el fondo del pocillo de la microplaca. En este proceso, un área en el centro del anillo permanece libre de microesferas, lo que permite que una punta de pipeta alcance el fondo del pocillo y aspire todo el líquido sin perturbar a las microesferas magnéticas.
Con la microplaca todavía en el imán, se dejan secar las microesferas antes de añadir el tampón de elución para liberar el ADN de las microesferas. Es importante tener en cuenta que el volumen de tampón de elución necesario para lograr una elución completa debe ser suficiente para cubrir las microesferas por completo; si una microesfera no entra en contacto con el tampón de elución, el ADN permanecerá en la microesfera. Al mismo tiempo, es conveniente mantener el volumen de elución lo más bajo posible de forma que no se diluya innecesariamente el producto (por ejemplo, el ADN purificado y eluido).
El volumen mínimo de elución es una función de la ubicación del anillo de microesferas dentro del pocillo. Los anillos de microesferas más bajos permiten volúmenes de elución más pequeños. Las Fig.4A y 4B muestran cómo la posición del anillo de microesferas depende de la geometría del pocillo y del imán. El pocillo PCR de la Fig. 4B entra en el imán anular significativamente más abajo que el pocillo PCR en la Fig. 4A. En una forma de realización, según se muestra en la Fig.4B, el volumen de elución para cubrir las microesferas es de aproximadamente 35 gl. Esto es especialmente problemático porque las placas PCR, que tienen un volumen de pocillos de sólo aproximadamente 150 - 200 gl, se utilizan a veces para reacciones de bajo volumen con bajas cantidades de ADN. La elución de pequeñas cantidades de ADN en volúmenes mayores de tampón de elución puede dar lugar a concentraciones de ADN inaceptablemente bajas.
Otros enfoques posibles utilizan adaptadores entre la placa magnética (con imanes anulares dimensionados para pocillos de fondo redondo como en 4D) para soportar una placa PCR. Si bien es viable en casos individuales, la desventaja significativa es que el adaptador se basa geometrías de placa PCR específicas; en otras palabras, no es una solución universal, sino que sólo funciona con determinados tipos de placas PCR.
Por el contrario, el imán anular de núcleo macizo es universal y consigue bajos volúmenes de elución. El imán anular de núcleo macizo incluido en la presente invención también separa las microesferas magnéticas/macromoléculas más rápidamente y con mayor recuperación, en comparación con los imanes anulares estándar. Los siguientes experimentos fueron diseñados para demostrar la aplicación del imán anular de núcleo macizo.
Para verificar la ganancia de rendimiento esperada, se realizaron dos experimentos.
Experimento 1: Comparación de la fuerza de atracción entre un imán anular de núcleo macizo y un imán anular estándar
Se fabricaron un imán anular de núcleo macizo y un imán anular estándar con las propiedades mostradas en la Tabla 1.
Tabla 1: Propiedades magnéticas
El imán anular de núcleo macizo contiene aproximadamente un 22,45 % más de material magnético que el imán anular normal con las mismas dimensiones exteriores. En una forma de realización, el imán anular de núcleo macizo incluido en la presente invención tiene entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 30 % más de material magnético, en comparación con un imán anular estándar.
Después de esto, se realizó un experimento para determinar las diferencias en las fuerzas de atracción entre los dos imanes a través de diferentes distancias. Los datos se generaron utilizando un banco de pruebas modelo ES30 equipado con un medidor de fuerza modelo M5-20 y un medidor de recorrido Mitutoyo, modelo ESM001 (todos ellos de la empresa Mark-10, 11 Dixon Avenue, Copiague, NY 11726, US).
La Fig. 6 muestra los resultados de la comparación de las fuerzas de atracción entre un dispositivo magnético por un lado y un imán anular de núcleo macizo o un imán anular estándar por el otro. Los dos imanes utilizados eran de grado N50, NdFeB, de 8,6 mm de diámetro y 11,5 mm de espesor. El imán anular tenía un diámetro interior de 4,3 mm. El imán anular de núcleo macizo tenía dos cavidades, una en cada lado, con un diámetro de 4,3 mm y una profundidad de 2,5 mm. Ambos imanes fueron magnetizados a través del espesor (es decir, a lo largo del eje central). Según se observa, para un determinado valor de la distancia, especialmente para los valores más bajos de las distancias, el imán anular de núcleo macizo tiene una fuerza de atracción más fuerte. Dado que ambos imanes son equivalentes (mismas dimensiones exteriores y grado magnético), excepto que el imán estándar está perforado hasta el final, las fuerzas de atracción más fuertes en el imán de núcleo macizo son el resultado de la forma del imán, en concreto del material magnético adicional presente en el núcleo del imán anular de núcleo macizo.
La Fig. 6 muestra la fuerza de atracción entre el imán de prueba y el dispositivo magnético. El dispositivo magnético fue el mismo en ambas pruebas.
Resultado:
La tabla 2 muestra los puntos de datos seleccionados con la diferencia en la fuerza de atracción como % de cambio.
Tabla 2: Comparación de la fuerza de atracción; puntos de datos seleccionados Imán anular estándar Imán anular de núcleo macizo
Recorrido [mm] Carga [gF] Recorrido [mm] Carga [gF] % Diferencia
35 2 35,05 2 0,0 %
33,5 2 33,5 2 0,0 %
32,08 2 32,08 2 0,0 %
28,46 2 28,44 2 0,0 %
22,18 6 22,19 6 0,0 %
22 6 21,97 6 0,0 %
21,52 6 21,56 8 33,3 %
21,34 8 21,38 8 0,0 %
15,04 20 15,06 22 10,0 %
13,52 26 13,52 30 15,4 %
12,71 30 12,71 34 13,3 %
11,5 38 11,53 42 10,5 %
10,57 46 10,54 52 13,0 %
9,49 60 9,52 66 10,0 %
8,08 80 8,05 94 17,5 %
6,99 108 6,96 124 14,8 %
5,58 154 5,55 180 16,9 %
5,33 168 5,36 190 13,1 %
5,03 182 5,06 206 13,2 %
3,84 264 3,86 300 13,6 %
3,2 326 3,24 370 13,5 %
1,99 520 1,97 614 18,1 %
1,85 548 1,84 656 19,7 %
1,51 660 1,52 788 19,4 %
Imán anular estándar Imán anular de núcleo macizo
Recorrido [mm] Carga [gF] Recorrido [mm] Carga [gF] % Diferencia
1,11 814 1,12 944 16,0 %
1,03 846 1,03 1028 21,5 %
0,86 930 0,87 1138 22,4 %
0,59 1102 0,58 1376 24,9 %
0,43 1240 0,44 1536 23,9 %
0,3 1390 0,31 1642 18,1 %
0,21 1510 0,22 1768 17,1 %
0,14 1634 0,15 1870 14,4 %
Resultado:
Una comparación de la fuerza de atracción generada entre un imán anular normal D = 8,6 mm, d = 4,3 mm, y H = 11,5 mm, y un imán anular de núcleo macizo de dimensiones y grado equivalentes muestra diferencias significativas en el rango de 0 a aproximadamente 15 mm de distancia. La mayor diferencia se midió a 0,58 mm de distancia con un 24,9 %. (Una lectura de diferencia del 33 % mostrada cerca de la parte superior de la tabla, a aproximadamente 21,5 mm de distancia, se considera ruido. La señal, es decir, la fuerza de atracción medida, es baja en este punto, y la lectura está rodeada a ambos lados por valores del 0 %).
Experimento 2: Comparación del tiempo de separación de las microesferas
Se realizaron experimentos adicionales para investigar los tiempos de separación de las microesferas para los diferentes imanes.
Según se describe en la presente memoria, el método de detección mediante el cual la presente invención se comparó con los actuales dispositivos de separación magnética basados en placas mediante espectrofotometría. En los flujos de trabajo estándar de secuenciación de ADN NGS de alto rendimiento, cada etapa del proceso enzimático va seguida de una etapa de limpieza en la que el ADN se une de forma selectiva a microesferas con núcleo de hierro mediante la adición de 0,1 % de microesferas Sera-Mag Speed modificadas con carboxilo, 20 % de polietilenglicol (PEG) y tampón NaCl 2,5 M en una proporción de mezcla de 1,8X de microesferas y tampón por 1X de muestra. La mezcla se coloca en un campo magnético, que arrastra las microesferas y el ADN ligado hacia los lados del pocillo, de modo que los reactivos, los lavados y/o los fragmentos no deseados se pueden eliminar como sobrenadante. El porcentaje de material ligado capturado y el tiempo que tarda en producirse esta captura es de suma importancia para mantener los niveles de calidad y rendimiento. En este documento, intentamos cuantificar esta métrica de recuperación sin necesidad de probar la eficiencia de la química de captura. Esto se logra simulando un volumen de reacción determinado en un punto final establecido, sustituyendo los componentes enzimáticos por agua y manteniendo el volumen total de reacción en 1,8x de mezcla de microesferas/PEG/NaCl: 1X de muestra. No esperamos que las microesferas ligadas al ADN se muevan de forma significativamente diferente a través de la matriz PEG/NaCl que las no ligadas al ADN.
Un procedimiento detallado para la detección de microesferas:
Una gran cantidad de 1,8X de microesferas Sera-Mag Speed modificadas con carboxilo al 0,1 % (Thermo-Fisher Scientific, Pittsburg PA, USA, número de catálogo 09-981-123), 20 % de polietilenglicol (PEG) (Sigma-Aldrich, St. Louis m O, USA, número de catálogo 89510-250G-F), NaCl 2,5 M (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA, número de catálogo S6546-1L), 0,05 % Tween-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA, número de catálogo P9416-50ML) and 1X de agua fueron premezclados y puestos aparte. Se dispuso una cantidad predeterminada de mezcla de microesferas/agua en grupos de tres por punto temporal bien en una placa PCR semirrebajada Eppendorf twin.tec
(Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania, número de catálogo 951020362) o bien en una placa de microtitulación RK Ripíate (BioExpress, Kaysville UT, EE.UU., número de catálogo 850356). Los volúmenes de reacción entre 50-300 pl se utilizaron en la placa Eppendorf twin.tec y 500-2000 pl en la RK Riplate. Las muestras se dispusieron en columnas de modo que se utilizaron tres muestras para cada punto final y todas las muestras tenían un punto temporal cero utilizado como control. Los puntos finales para los ensayos de 50-100 pl fueron de 30 segundos a 3 minutos en intervalos de 30 segundos, para los ensayos de 150-200 pl de 30 segundos a 5 minutos en intervalos de 30 segundos, para los ensayos de 200-750 pl de 1 minuto a 5 minutos en intervalos de 30 segundos y para los ensayos de 1000 2000 pl de 2,5 a 25 minutos en intervalos de 2,5 minutos. Las muestras se dispusieron utilizando una pipeta multicanal LTS de 20-200 pl (Rainin Instruments LLC, Oakland CA, EE.UU., número de catálogo L12-20XLS) o una pipeta monocanal de 1000 pl (Gilson Inc., Middleton WI, EE.UU., número de catálogo P1000). Después de la colocación, las muestras se dejaron en el banco durante exactamente 5 minutos para simular el tiempo de enlace del ADN. A continuación, se colocó la placa de microtitulación de 96 pocillos en la placa separadora magnética y se puso en marcha un temporizador. En el punto final establecido, se retiró todo el líquido de los pocillos del punto final utilizando una pipeta multicanal con un movimiento de pipeteo suave y constante con el fin de causar la menor perturbación posible al anillo de microesferas formado. El líquido se transfirió por completo a los pocillos correspondientes de una segunda placa de microtitulación de 96 pocillos. Todos los puntos temporales restantes del mismo volumen se procesaron de una manera similar. Las muestras transferidas se mezclaron a continuación 10 veces con una pipeta multicanal para asegurarse de que cualesquiera microesferas que se puedan haber asentado se hayan resuspendido por completo. A continuación, se alicuotaron 50 pl, tomados de la mitad de la muestra transferida, en el pocillo correspondiente de una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Thermo-Fisher Scientific, Pittsburg PA, USA, número de catálogo 12-565-501) para su análisis.
Métodos de detección y análisis:
Las muestras y los blancos se analizaron para determinar la absorbancia en base a las especificaciones publicadas utilizando un lector de multiplacas Tecan Infinite 200 Pro con el software de análisis del lector de microplacas i-control (Tecan Group, Ltd, Mannedorf, Suiza) que mide la absorbencia a 560 nm. Las muestras se agitaron en modo orbital a una amplitud de 3,5 durante 3 segundos y a continuación se leyeron a 25 destellos por pocillo. Todas las placas se leyeron por duplicado y se promedió la absorbancia resultante. Los datos de absorbancia se analizaron además utilizando el software JMP 11.2 (SAS, Cary NC, EE.UU.) para comprobar la coherencia entre los puntos de datos. Las lecturas de absorbancia obtenidas para los pocillos de blancos se promediaron juntas y se utilizaron como un control de normalización para todos los pocillos que contenían muestra. El porcentaje total de microesferas capturadas se calculó como una función inversa de la absorbancia normalizada de las microesferas que permanecían en la solución dividida por la absorbancia total de las microesferas presentes en el punto temporal de control, o cero. A continuación, los resultados se trazaron en Excel (Microsoft Corp, Redmond WA, EE.UU.) frente a los resultados de puntos de volúmenes similares obtenidos con otros dispositivos de separación magnética.
La Fig. 7A muestra los resultados para una placa PCR de 50 gl, la Fig. 7B para una placa PCR de 100 gl, la Fig. 7C para una placa PCR de 150 gl, la Fig. 7D para una placa PCR de 200 gl, la Fig. 7E para una placa PCR de 250 gl, la Fig. 7F para una placa PCR de 300 gl, la Fig. 7G para una placa de microtitulación de 500 gl, la Fig. 7H para una placa de microtitulación de 750 gl, la Fig. 7I para una placa de microtitulación de 1000 gl y la Fig. 7J para una placa de microtitulación de 2000 gl. En cada uno de estos resultados, especialmente para los intentos de recuperación más cortos, está claro que el porcentaje de rendimiento de las microesferas recuperadas es mayor para un imán anular de núcleo macizo en comparación con un imán anular equivalente. Del mismo modo, al comparar cantidades similares de recuperación, está claro que el imán anular de núcleo macizo permite recuperar un porcentaje similar en un periodo de tiempo más corto.
Si bien esta invención se ha descrito y mostrado en particular con referencias a las formas de realización preferidas de la misma, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer diversos cambios en la forma y los detalles en la misma sin apartarse del alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones adjuntas.
Claims (17)
1. Utilización de un imán (20) para aislar macromoléculas de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en el que el imán (20) comprende:
a. Un núcleo macizo que tiene una masa interior del imán (20), una superficie superior (4) y una superficie inferior (6); b. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10); y
c. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6).
2. La utilización de la reivindicación 1, en donde la parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma de anillo.
3. La utilización de la reivindicación 1 o 2, en donde un volumen de imán encerrado entre la superficie superior (4), la superficie inferior (6) y la pared lateral (2) forma un cilindro.
4. La utilización de la reivindicación 1 o 2, en donde un volumen de imán encerrado entre la superficie superior (4), la superficie inferior (6), y que comprende además paredes laterales (2) que forman un prisma rectangular.
5. La utilización de la reivindicación 1 o 2, en donde la pared de la cavidad (12) rodea la cavidad (8, 10) entre la superficie superior (4) y al menos una parte del núcleo interior, o entre la superficie inferior (6) y al menos una parte del núcleo interior.
6. La utilización de la reivindicación 1 o 2, en donde la pared de la cavidad (12) comprende una superficie de base (16, 18), en donde la superficie de base (16, 18) cubre partes de la cavidad no cubiertas por la parte de la pared que tiene forma anular, opcionalmente en donde la superficie de base (16, 18) tiene una forma cónica, una forma de "U" o una forma irregular.
7. Un sistema para su utilización en el aislamiento de macromoléculas de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en donde el sistema comprende:
a. un imán (20) que comprende:
i. un núcleo macizo que forma una masa interior del imán (20), una superficie superior (4), una superficie inferior (6) ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10);
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6); y
b. un recipiente (60) para contener la mezcla que tiene el complejo, en donde el recipiente (60) tiene la forma necesaria para encajar dentro de una o más cavidades (8, 10).
8. El sistema de la reivindicación 7, en donde la parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma de anillo.
9. El sistema de la reivindicación 7 u 8, en donde un volumen de imán encerrado entre la superficie superior (4), la superficie inferior (6) y la pared lateral (2) del imán (20) forma un cilindro.
10. El sistema de la reivindicación 7 u 8, en donde un volumen de imán encerrado entre la superficie superior (4), la superficie inferior (6), y que comprende además paredes laterales (2) que forman un prisma rectangular.
11. El sistema de la reivindicación 7 u 8, en donde las una o más cavidades (8, 10) comprenden cada una, una parte de la pared de la cavidad (12) que tiene forma cónica, forma de "U" o forma irregular.
12. Un método para purificar una macromolécula a partir de una muestra líquida que tiene una mezcla, comprendiendo el método:
a. recoger la muestra líquida en un recipiente (60);
b. añadir microesferas magnéticas a la muestra líquida, en donde las etapas "a" y "b" se pueden realizar en cualquier orden en condiciones de formar un complejo macromolécula-microesfera magnética entre la macromolécula y la microesfera magnética;
c. separar el complejo de la muestra colocando el recipiente (60) en una cavidad (8, 10) de un imán (20), en donde el imán (20) comprende:
i. un núcleo macizo que forma una masa interior del imán (20), una superficie superior (4), una superficie inferior (6) ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), de la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10); y
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6);
y opcionalmente
d. eluir el material de ácido nucleico de las microesferas magnéticas.
13. El método de la reivindicación 12, en donde la parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma de anillo.
14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde la muestra comprende una matriz extracelular.
15. El método de la reivindicación 12 o 13, que comprende además una etapa de lisado de la muestra antes de añadir las microesferas magnéticas a la muestra.
16. Un kit para su utilización en el aislamiento de macromoléculas de una mezcla en un recipiente (60) cuando las macromoléculas se adhieren a las microesferas paramagnéticas para formar un complejo, en donde el kit comprende: a. un imán (20) que comprende:
i. un núcleo macizo que forma una masa interior del imán (20), una superficie superior (4), una superficie inferior (6) ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), la superficie inferior (6), o de ambas, para recibir un recipiente (60) con macromoléculas en una mezcla; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10), opcionalmente en donde una parte de la pared de la cavidad tiene una forma de anillo; y
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), la superficie inferior (6); y
b. el recipiente (60) para contener la mezcla que tiene la macromolécula, en donde el recipiente (60) tiene una forma que se ajusta a las una o más cavidades (8, 10),
y opcionalmente comprende además microesferas magnéticas y/o una o más composiciones tampón.
17. Un sistema de placa magnética (90) para su utilización en el aislamiento de una macromolécula de una mezcla en un recipiente (60), en donde la placa magnética (90) comprende:
a. al menos un imán (20), en donde el imán (20) comprende:
i. un núcleo macizo que tiene una masa interior del imán (20), una superficie superior (4) y una superficie inferior (6); ii. una o más cavidades (8, 10) que se extienden dentro del núcleo macizo en o cerca de la superficie superior (4), la superficie inferior (6), o de ambas; en donde las una o más cavidades (8, 10) tienen cada una, una pared de la cavidad (12) y al menos una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma configurada para formar un campo magnético dentro de un recipiente (60) cuando el recipiente (60) se utiliza y se coloca en las una o más cavidades (8, 10), opcionalmente en donde una parte de la pared de la cavidad (12) tiene una forma de anillo; y
iii. al menos una pared lateral (2), en donde la pared lateral (2) está en comunicación con la superficie superior (4), y la superficie inferior (6); y
b. una placa superior (92) adaptada para recibir varios imanes (20), en donde la placa superior (92) tiene una o más aberturas de poste para recibir un extremo superior de un poste y un muelle, y opcionalmente comprende además varias aberturas de imán para recibir los imanes (20);
c. un poste con un extremo superior y un extremo inferior;
d. un muelle para colocar en la abertura de la placa superior y rodear el poste;
e. una placa de soporte para soportar el imán (20), en donde existe una afinidad entre la placa de soporte y el imán (20);
f. una placa base (96) recibe el extremo inferior del poste y el muelle y se coloca debajo de la placa base (96) cuando se utiliza.
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