ES2870508T3 - Combinación que comprende un compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto - Google Patents

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Abstract

Combinación que comprende un compuesto de fórmula (I): **(Ver fórmula)** en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que las células cancerosas de dicho sujeto: - tienen un nivel de H2O2 inferior o igual al nivel de H2O2 en las células normales que se originan en el mismo tejido que las células cancerosas, y - tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación que comprende un compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto
La presente invención se refiere a una combinación que comprende un compuesto de aminotioléster, tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, en particular para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto, donde las células cancerosas de dicho sujeto no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control y tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.
Antecedentes
El equilibrio redox de las células es clave para la fisiología celular normal. Es mantenido por 3 sistemas: GSH/GSSG, NADPH/NADP; Tiorredoxina (red)/Tiorredoxina (oxd). De estos 3 sistemas, GSH/GSSG es el más ampliamente estudiado por su implicación en estados patológicos y para el desarrollo de enfoques terapéuticos racionales (Townsend, AJ, Leone-Kabler, S., Hainos, r L, Wu, Y., Szweda, L., y Bunting, KD (2001). Selective protection by stably transfected human ALDH3A1 (but not human ALDH1A1) against toxicity of aliphatic aldehydes in V79 cells. 130-132, 261-273). Los estados patológicos asociados con un desequilibrio en GSH/GSSG incluyen patologías importantes como cánceres (Estrela, J.M., Ortega, A. y Obrador, E. (2006). Glutathione in cancer biology and therapy. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 43, 143-181; O'Brien, M.L., y Tew, K.D. (1996). Glutathione and related enzymes in multidrug resistance. Eur. J. Cancer Oxf. Engl. 199032A, 967-978). Su única etiología común es el estrés oxidativo provocado por ROS y/o especies de nitrógeno reactivo (RNS) que primero causan una disminución del GSH debido a la desintoxicación directa de ROS y RNS. Esta disminución inicial de GSH es seguida posteriormente por un aumento compensatorio en la síntesis de GSH que las células ponen en juego para continuar la desintoxicación de ROS/RNS y de productos electrofílicos recién formados, tales como 4-hidroxinonenal (HNE) y malondialdehído (MDA)) producidos por el ataque de ROS sobre lípidos celulares (Esterbauer, H., Schaur, RJ y Zollner, H. (1991). Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. 11, 81-128).
La paradoja del GSH paradoja en células cancerosas es que en lugar del déficit de GSH intracelular que se habría esperado, es precisamente lo opuesto que se encontró experimentalmente en muchas células cancerosas diferentes (Estrela, JM, Ortega, A., y Obrador, E. (2006). Glutathione in canceer biology and therapy. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 43, 143-181). Pero este aumento de GSH tiene repercusiones terapéuticas negativas ya que protege a las células cancerosas de las quimioterapias y radioterapias (Carretero, J., Obrador, E., Esteve, JM, Ortega, A., Pellicer, JA, Sempere, FV y Estrela, JM (2001). Tumoricidal activity of endothelial cells. Inhibition of endothelial nitric oxide production abrogates tumor cytotoxicity induced by hepatic sinusoidal endothelium in response to B16 melanoma adhesion in vitro. J. Biol. Chem. 276, 25775-25782).
Además, si se deben obtener bajos niveles de GSH en las células cancerosas para que la quimioterapia sea eficaz, este no es el caso para las células normales para no inducir daños colaterales a las mismas.
Los enfoques terapéuticos que en la actualidad están siendo utilizados para disminuir el GSH celular con el fin de combatir la quimiorresistencia de las células cancerosas, reconocen el propio GSH o las enzimas implicadas en la síntesis de GSH, la degradación de GSH y el eflujo de GSH. Ya existen 10 compuestos que disminuyen GSH que se encuentran en las fases I, II y III de ensayos clínicos como agentes anticancerosos (Tew, K. y Townsend D (2011) Redox platforms in cancer drug discovery and development. Curr.Opin. Chem.Biol. 15, 156-161). Todos ellos tienen que ser administrados en combinación con fármacos contra el cáncer estándar, por ejemplo, ciclofosfamida, taxol, vincristina, melfalán, etc.
Además, las enzimas reconocidas por estos fármacos reductores de GSH son las que participan en la síntesis de GSH (gamma glutamil cisteína ligasa), la degradación de GSH (gamma - glutamil transpeptidasa) y eflujo de GSH (GSH-S-transferasa). Sin embargo, estas mismas enzimas son esenciales para proteger a las células normales del ataque de ROS. Por lo tanto, existe una gran posibilidad de daño colateral a las células normales, ya que los medicamentos no pueden administrarse selectivamente a las células cancerosas y solo a las células cancerosas.
En vista de esto, hay una necesidad de encontrar otras soluciones terapéuticas que reconozcan específicamente y selectivamente GSH en células cancerosas.
Los inventores de la presente invención han descubierto inesperadamente que una combinación que comprende un compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, es útil como un medicamento y es capaz de tratar cáncer en un sujeto, donde las células cancerosas de dicho sujeto no sobreproducen H2O2. Particularmente, han descubierto que una combinación que comprende un compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(Dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, es útil como un medicamento y es capaz de tratar el cáncer en un sujeto, donde las células cancerosas de dicho sujeto no sobreproducen H2O2 y tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.
Sin estar ligado a ninguna teoría, cuando el compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto habría inducido un aumento del nivel de H2O2 en las células cancerosas, entonces, el compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo habría aumentado los niveles de metabolitos intracelulares producidos por ataques de H2O2, y, por lo tanto, al mismo tiempo, se consumiría el GSH en la desintoxificación de dichos metabolitos electrofílicos. Como resultado, el GSH insuficiente estaría disponible en células cancerosas para actuar como un atrapador de H2O2. Por lo tanto, los niveles de H2O2 deberían incrementarse y deberían desencadenar los mecanismos dependientes de H2O2 en el mecanismo mitocondrial (intrínseco) de apoptosis.
En células normales que no han experimentado inicialmente un ataque por H2O2, los niveles de GSH intracelular son ya altos (debido a la ausencia de H2O2), de manera que que los niveles de cualquier electrófilo inducido por H2O2 están por debajo de aquellos de sus homólogos cancerígenos. Sin embargo, los niveles de H2O2en células normales pueden aumentar simultáneamente cuando se utiliza un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, si este compuesto es capaz de incrementar el nivel de H2O2 en células normales y de cáncer. En este último caso, aunque, los niveles de H2O2 en células normales serán, sin embargo, más bajos que aquellos en células cancerosas y, por lo tanto, permanecerán por debajo de su umbral apoptótico tras el tratamiento con el compuesto de aminotioléster de acuerdo con la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. US20070032476 y Zhou at al, Blood, volumen 101, páginas 4098-4104 pueden ser relevantes para el entendimiento de la presente invención.
Descripción de la invención
Tal como se ha mencionado previamente, los inventores de la presente invención han descubierto inesperadamente que un compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, es útil como un medicamento y es capaz de tratar cáncer en un sujeto, donde las células cancerosas de dicho sujeto no sobreproducen H2O2. En particular, han descubierto que una combinación que comprende un compuesto de aminotioléster o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(Dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, es útil como un medicamento y es capaz de tratar el cáncer en un sujeto, donde las células cancerosas de dicho sujeto no sobreproducen H2O2 y tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.
Esta nueva terapia presenta la ventaja de que las células normales sufren menos daños colaterales debido a que sus metabolitos electrofílicos iniciales son tan bajos (debido a la ausencia de H2O2) que, en cualquier caso, permanecerán por debajo de su umbral apoptótico tras el tratamiento con un compuesto de aminotioléster de acuerdo con la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención se refiere por tanto a una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000003_0001
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
Más particularmente, se refiere a una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000004_0001
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que las células cancerosas de dicho sujeto:
- no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control, y
- tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.
En particular, las células cancerosas de dicho sujeto tienen también un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |ig de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 |ig por |ig de proteína total, después de tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Figure imgf000004_0002
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto como una combinación preparada para utilizar para extenderse con el tiempo para el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que las células cancerosas de dicho sujeto:
- no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control, y
- tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.
En particular, las células cancerosas de dicho sujeto tienen también un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |ig de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 |ig por |ig de proteína total, después de tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En particular, dicho sujeto se identifica midiendo el nivel de H2O2 y el nivel de GSH en células cancerosas de dicho sujeto.
Más particularmente, dicho nivel de H2O2 se determina cuantificando el nivel de intensidad de fluorescencia.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000004_0003
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para la selección de un sujeto que sufre de un cáncer y que probablemente se beneficiará de un tratamiento con una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000005_0001
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende:
a) medir el nivel de H2O2 en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
b) comparar el nivel resultante de la etapa a. con un valor de control; y
c) medir el nivel de GSH en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
en el que:
- un nivel de H2O2 de dicha muestra de cánceles cancerosas de dicho sujeto no es superior al valor de control, y - un nivel de GSH de dicha muestra de células cancerosas de dicho sujeto por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células, indica que es probable que el sujeto se beneficie de un tratamiento con una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto.
En una realización, dicho procedimiento comprende:
a) medir el nivel de H2O2 en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
b) comparar el nivel resultante de la etapa a. con un valor de control;
c) medir el nivel de GSH en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto; y/o
d) medir el nivel de aductos de MDA y/o aductos de HNE después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la invención en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
en el que:
- un nivel de H2O2 de dicha muestra de cánceles cancerosas de dicho sujeto no es superior al valor de control, - un nivel de GSH de dicha muestra de células cancerosas de dicho sujeto por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células, y/o
- un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |jg de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 jg por jg de proteína,
indica que es probable que el sujeto se beneficie de un tratamiento con una combinación según la presente invención.
Tal como se describe en el presente documento, "H2O2" significa "peróxido de hidrógeno" y es un bien conocido por el experto en la materia. Representa moléculas químicamente reactivas que contienen oxígeno. Se forma como un subproducto natural del metabolismo normal del oxígeno y tiene funciones importantes en la señalización celular y la homeostasis. Sin embargo, durante los momentos de estrés ambiental (por ejemplo, exposición a los rayos UV o al calor), los niveles pueden aumentar drásticamente. Esto puede dar lugar a un daño significativo a las estructuras celulares. En conjunto, esto se conoce como estrés oxidativo. El peróxido de hidrógeno también es generado por fuentes exógenas, tal como la radiación ionizante.
En particular, un nivel de H2O2 no más alto que un valor comprendido entre 2.000 y 400.000 de intensidad de fluorescencia relativa, por ejemplo, entre 10.000 y 100.000 de intensidad de fluorescencia relativa o 15.000 y 100.000 de intensidad de fluorescencia relativa, y más particularmente un nivel de H2O2 no superior a 20.000 de Intensidad de fluorescencia relativa, incluso más particularmente no superior a 21.598 de intensidad de fluorescencia relativa, indica que es probable que el sujeto se beneficie de un tratamiento con una combinación según la invención.
En particular, el nivel no más alto que un valor comprendido entre 2.000 y 400.000 de intensidad de fluorescencia relativa, por ejemplo, entre 10.000 y 100.000 de Intensidad de fluorescencia relativa o 15.000 y 100.000 de intensidad de fluorescencia relativa, y más particularmente un nivel de H2O2 no superior a 20.000 de intensidad de fluorescencia relativa, incluso más particularmente no superior a 21.598 de intensidad de fluorescencia relativa, se mide con el kit de detección de ROS total/superóxido (Enzo life science), más particularmente en un lector de microplacas de fluorescencia Appliskan (Thermo Scientific) (Ex/Em = 488/520 nm y Ex/Em = 550/610 nm).
Si el nivel de corte de H2O2 se proporciona aquí y en otros lugares en la descripción mediante la medición de la intensidad de fluorescencia, este procedimiento es no exclusivo y el nivel de corte de H2O2 se puede determinar mediante cualquier otro procedimiento disponible para el experto en la materia, siendo el parámetro de determinación de dónde colocar el corte la correlación entre la IC50 del producto de acuerdo con la invención y el nivel de H2O2. La IC50 es una medida bien conocido para el experto en la materia.
Tal como se describe en el presente documento, "GSH" significa "glutatión" y es bien conocido por el experto en la materia. Es un tripéptido con un enlace peptídico gamma entre el grupo carboxilo de la cadena lateral del glutamato y el grupo amina de la cisteína, y el grupo carboxilo de la cisteína está unido por un enlace peptídico normal a una glicina.
En particular, en el alcance de la presente invención, el nivel de GSH es inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, en particular por debajo de 0,45 nmol para 25.000 células y más particularmente por debajo de 0,4 nmol para 25.000 células.
El nivel de GSH se determina mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la materia. Por ejemplo, el nivel de GSH se determina mediante luminiscencia, por ejemplo, con el kit Promega GSH-Glo (Promega).
Si se proporciona el nivel de corte de GSH aquí y en otros lugares en la descripción mediante luminiscencia, este procedimiento es no exclusivo y el nivel de corte de GSH se puede determinar mediante cualquier otro procedimiento disponible para el experto en la materia
Tal como se describe en el presente documento, "MDA" se utiliza para "malondialdehído", un compuesto orgánico con la fórmula CH2(CHO)2. Esta especie reactiva es bien conocida por el experto en la materia y se produce de forma natural y es un marcador de peroxidación de lípidos en las células. Además, un "aducto de MDA" según la invención es un aducto formado entre MDA y las proteínas de las células cancerosas, así como con el ADN de las células cancerosas.
En particular, en el alcance de la presente invención, el nivel de aductos de MDA después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) según la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo está por encima de 75 ng por |ig de proteína total, en particular por encima de 90 ng por |jg de proteína total y más particularmente por encima de 100 ng por jg de proteína total. El nivel de aductos de MDA se determina mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la materia. Por ejemplo, el nivel de aductos de MDA se determina mediante inmunomonitorización, por ejemplo con el kit de ELISA competitivo de aductos de MDA OxiSelect ™ (CELL BIOLABS).
Tal como se describe en el presente documento, "HNE" se utiliza para "4-hidroxi-2-nonenal", un compuesto orgánico de fórmula C9H16O2. Esta especie reactiva es bien conocida por el experto en la materia y se produce de forma natural y es un marcador de peroxidación de lípidos en las células.
Además, un "aducto de HNE", de acuerdo con la invención, es un aducto formado entre HNE y las proteínas de las células cancerosas, así como un aducto formado con el GSH de las células cancerosas.
En particular, en el alcance de la presente invención, el nivel de aductos de HNE después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) según la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo está por encima de 750 ng por |ig de proteína total, en particular por encima de 900 ng por jg de proteína total y más particularmente por encima de 1 jg por jg de proteína total.
El nivel de aductos de HNE se determina mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la materia. Por ejemplo, el nivel de aductos de HNE se determina mediante inmunomonitorización, por ejemplo con el kit de ELISA competitivo de aductos de HNE OxiSelect ™ (CELL BIOLABS).
Por "proteína total" se entiende el contenido de proteína total de la célula cancerosa.
Por "tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) según la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo" se entiende que el nivel de aductos de MDA y/o aductos de HNE se mide después de una etapa de tratamiento , in vitro, en una muestra de células cancerosas del sujeto, por ejemplo en las condiciones descritas en la sección experimental, teniendo en cuenta que las dosis de un compuesto de fórmula (I) según la invención o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que pueden administrarse son de hasta 60 jM .
Por un "grupo alquilo C1-C7" se entiende un grupo hidrocarburo alifático que puede ser lineal o ramificado que tiene de 1 a 7 átomos de carbono en la cadena, a menos que se especifique lo contrario. En particular, los grupos alquilo tienen de 1 a 3 átomos de carbono en la cadena (alquilo C1-C3). Ramificado significa que uno o más grupos alquilo, tales como metilo, etilo o propilo están unidos a una cadena de alquilo lineal. Los grupos alquilo de ejemplo incluyen metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, 2,2-dimetilbutilo, n-pentilo, n-hexilo, octilo, en particular metilo.
En particular, el compuesto de fórmula (I) es un compuesto como se ha mencionado anteriormente en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo metilo, un grupo fenilo, un grupo bencilo, al menos uno de X1 o X2 es un metilo, o en el que X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman una piperidina o una morfolina.
Más en particular, dicho compuesto se elige entre:
- 4-metil-4-(piperidin-1-il)pent-2-inotioato de S-metilo;
- 4-[bencil(metil)amino]-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo;
- 4-metil-4-[metil(fenil)amino]pent-2-inotioato de S-metilo;
- 4-metil-4-(morfolin-4-il)pent-2-inotioato de S-metilo; y
- 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo.
Estos compuestos se describen a continuación en la Tabla 1 a continuación:
Tabla 41
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En una realización preferida, dicho compuesto es el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo.
Estos compuestos pueden prepararse de acuerdo con procedimientos bien conocidos por el experto en la materia. En particular, estos compuestos se pueden preparar a partir de la correspondiente amina acetilénica tratada sucesivamente por BuLi, COS y Mel. Un proceso detallado de preparación se puede encontrar, por ejemplo, en G. Quash et al., European Journal of Medicinal Chemistry 43 (2008) 906-916, en particular en la parte 2 de la sección de Material y procedimientos.
El 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (número CAS 350229-29-7, peso de la fórmula: 185,29 g.mol' 1, fórmula: C9H15NOS), también conocido como DIMATE es un compuesto de fórmula (II):
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Este compuesto y su proceso de preparación se describen por ejemplo en la patente EP1296946 (en particular en el ejemplo 1), de la cual el contenido se incorpora por referencia.
Por una "sal farmacéuticamente aceptable" de un compuesto de fórmula (I), se entiende que el compuesto se modifica produciendo sales ácidas o básicas del mismo. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto, por ejemplo, de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen aquellas, tales como fumarato, fosfato, citrato, cloridrato y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto de fórmula (I) se pueden sintetizar a partir del compuesto original mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se encuentran listas de sales adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, pág. 1418.
En particular, el compuesto de fórmula (I) es el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo y su sal farmacéuticamente aceptable es su sal de fumarato es decir, el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico (peso de fórmula: 301,4 g.mol-1, fórmula: C13H19NO5S). Tal sal de fumarato se puede preparar a partir de 4-(dimetilamino) -4-metilpent-2-inotioato de S-metilo en éter anhidro con la adición de una solución de ácido fumárico en etanol anhidro. La sal monofumarato se recoge por filtración, se lava con éter y se seca.
En el alcance de la invención, un compuesto de aminotioléster, un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéutica aceptable del mismo, en particular éster fumarato metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, se usarán indistintamente con el término "compuesto según la invención".
Los compuestos capaces de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto son conocidos por un experto en la materia. Particularmente, en el alcance de la invención, estos compuestos son capaces de aumentar de manera selectiva el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, es decir, son compuestos que son capaces de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, pero que, al mismo tiempo, no aumentan el nivel de H2O2 de células no cancerosas (es decir, células normales) del sujeto. El uso de estos compuestos que muestran una acción selectiva sobre células cancerosas permite evitar efectos secundarios, tales como un efecto citostático sobre células normales. Los compuestos capaces de aumentar el nivel de H2O2 se pueden escoger entre piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (Trióxido de arsénico), doxorubicina, daunorubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, cisplatino, clorpromazina, piperlongumina, etopósido, mitoxantrona y partenolida (Deavall et al., (2012), Drug-Induced Oxidative Stress and Tox- icity., Journal of Toxicology, 2012, e645460; Pelicanoet al., (2003), Inhibition of Mitochondrial Respiration A NOVEL STRATEGY TO ENHANCE DRUG-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN LEUKEMIA CELLS BY A REACTIVE OXYGEN SPECIES-MEDIATED MECHANISM., J. Biol. Chem., 278, 37832-37839). Más particularmente, dicho compuesto se puede escoger entre piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3, doxorubicina, daunorubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, etopósido, mitoxantrona y partenolida. Preferiblemente, dicho compuesto es el As2O3 (Trióxido de arsénico) o la daunorubicina. Estos compuestos están disponibles comercialmente o se pueden preparar utilizando procedimientos de preparación bien conocidos.
Los términos "tratar", "que trata", "tratado" o "tratamiento", tal como se usan en este documento, se refieren a un tratamiento terapéutico en el que el objetivo es eliminar o disminuir los síntomas. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, la eliminación de los síntomas, el alivio de los síntomas, la disminución del alcance de la afección, el estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la afección, el retraso o la desaceleración de la progresión de la afección, hasta la prevención de la aparición, recurrencia o propagación de una enfermedad o trastorno, o de uno o más de sus síntomas. En determinadas realizaciones, los términos se refieren al tratamiento con o la administración de un compuesto proporcionado en el presente documento antes de la aparición de los síntomas. Los términos abarcan la inhibición o reducción de un síntoma de la enfermedad en particular. Los sujetos con antecedentes familiares de una enfermedad en particular son candidatos para regímenes de tratamiento en determinadas realizaciones. Además, los sujetos en los que se ha mostrado una predisposición genética para la enfermedad particular son candidatos para regímenes de tratamiento en determinadas realizaciones. Además, los sujetos que tienen un historial de síntomas recurrentes también son candidatos potenciales para el tratamiento. A este respecto, el término "tratamiento" se puede usar de manera intercambiable con el término "tratamiento profiláctico".
Tal como se usa en el presente documento y a menos que se defina lo contrario, "cáncer" se refiere al crecimiento, la división o la proliferación de células anormales en el cuerpo. Los cánceres según la invención son cánceres en los que no se observa una sobreproducción de H2O2 en comparación con un valor de control, en particular cánceres en los que no hay una sobreproducción de H2O2 observada en comparación con un valor de control ni un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células. Dichos cánceres incluyen, pero sin limitación, leucemias, linfomas, cáncer de sangre, cáncer de mama (en particular TNBC), cáncer de pulmón (en particular EGFR mutado), melanomas, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga y cáncer gástrico.
Por tanto, la presente invención también se refiere a una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente, el éster fumarato metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, para su uso de acuerdo con la invención, a productos para su uso según la presente invención o a procedimientos de acuerdo con la invención, en el que el cáncer a tratar se elige entre leucemia, linfomas, cáncer de sangre, cáncer de mama (en particular TNBC), cáncer de pulmón (en particular EGFR mutado), melanomas, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga y cáncer gástrico.
Todavía en particular, dicho cáncer es un cáncer quimiorresistente y/o radioresistente.
Por "quimiorresistente" se entiende un cáncer, tal como se describe en el presente documento, contra el cual la quimioterapia no funciona o deja de funcionar.
Por "radioresistente" se entiende un cáncer, tal como se describe en el presente documento, contra el cual la radioterapia no funciona o deja de funcionar.
En particular, dicho cáncer es un cáncer en el que se observa un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |ig de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 |ig por |ig de proteína total, después del tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal de sangre caliente, tal como un mamífero, animal o humano, en particular, un ser humano que está afectado con, o tiene el potencial de ser afectado con una o más enfermedades y afecciones descritas en el presente documento, y más particularmente, en los que las células cancerosas no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control, e incluso más particularmente, en aquellos en los que las células cancerosas no sobreproducen el H2O2 en comparación con un valor de control y tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células. Más particularmente, las células cancerosas de dicho sujeto que no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control ni tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células son células cancerosas quimiorresistentes y/o radiorresistentes. Aún más particularmente, las células cancerosas de dicho sujeto que no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control, más particularmente que no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control ni tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células, tienen también un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |jg de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 |jg por |jg de proteína total después del tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéutica aceptable del mismo.
Los términos "no sobreproducen", "no sobreproducción", tal como se usan en el presente documento, describen una situación, donde en una célula o tejido enfermo, no se produce un compuesto en exceso en comparación con una célula o tejido de control correspondiente llamado valor de control. Se refiere a una producción de H2O2 en células cancerosas que no es superior a, es decir, en inferior o ingual a la producción de H2O2 en una célula o tejido de control correspondiente llamado valor de control
En particular, la presente invención se refiere así a la combinación para usar según la presente invención o a productos para usar según la presente invención, en la que dicho sujeto es identificado mediante la medición del nivel de H2O2 en células cancerosas de dicho sujeto.
El nivel de H2O2 se puede medir, por ejemplo, mediante cualquier procedimiento conocido por la persona experta, tal como, por ejemplo, determinando el nivel de intensidad de fluorescencia relativa, que puede realizarse, por ejemplo gracias al Kit de detección de ROS Total/superóxido (Enzo life science), en particular medido en un lector de microplacas de fluorescencia Appliskan (Thermo Scientific) (Ex/Em = 488/520 nm y Ex/Em = 550/610 nm).
En particular, la presente invención se refiere por tanto a una combinación para su uso, según la presente invención, o a productos para su uso, según la presente invención, en la que dicho nivel de H2O2 se determina mediante la cuantificación del nivel de intensidad de fluorescencia.
Más particularmente, se refiere a una combinación para su uso según la invención, o a productos para su uso, según la presente invención, en el que dicho nivel de H2O2 no es más alto que un valor comprendido entre 2.000 y 400.000 de intensidad de fluorescencia relativa, por ejemplo, entre 10.000 y 100.000 de intensidad de fluorescencia relativa o 15.000 y 100.000 de Intensidad de fluorescencia relativa, y más particularmente un nivel de H2O2 no superior a 20.000 de Intensidad de fluorescencia relativa, incluso más particularmente no superior a 21.598 de Intensidad de fluorescencia relativa.
El experto en la materia entenderá fácilmente que cualquier otro parámetro adecuado para determinar el nivel de H2O2 de las células puede usarse junto con la presente invención.
Por consiguiente, cualquier otro procedimiento conocido por la persona experta en la materia para detectar el nivel de H2O2 se puede utilizar sin apartarse del alcance de la invención.
En particular, la presente invención se refiere así a una combinación para su uso según la invención o a productos para su uso según la invención, en la que dicho nivel de H2O2 se determina mediante la cuantificación del nivel de intensidad de fluorescencia gracias al kit de detección de ROS Total/superóxido (Enzo life science), más particularmente medido en un lector de microplacas de fluorescencia Appliskan (Thermo Scientific) (Ex/Em = 488/520 nm y Ex/Em = 550/610 nm).
Si el procedimiento utilizado en la parte experimental es una determinación del nivel de H2O2 mediante la intensidad media de fluorescencia, se indica de nuevo que este procedimiento es no exclusivo y que el nivel de H2O2 se puede determinar mediante cualquier otro procedimiento disponible para el experto en la materia.
El nivel de GSH se determina mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la materia. Por ejemplo, el nivel de GSH se determina mediante luminiscencia, por ejemplo, con el kit Promega GSH-Glo (Promega).
El experto en la materia entenderá fácilmente que cualquier otro parámetro adecuado para determinar el nivel de GSH de las células puede ser utilizado conjuntamente con la presente invención.
Por consiguiente, se puede utilizar cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la materia para detectar el nivel de GSH sin apartarse del alcance de la invención.
En particular, la presente invención se refiere así al compuesto para su uso según la invención, en el que dicho nivel de GSH se determina mediante luminiscencia, más particularmente con el kit Promega GSH-Glo (Promega).
El nivel de aductos de MDA se determina mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la materia. Por ejemplo, el nivel de aductos de MDA se determina mediante inmunomonitorización, por ejemplo con el kit de ELISA competitivo de aductos de MDA OxiSelect ™ (CELL BIOLABS).
El experto en la materia entenderá fácilmente que se puede utilizar cualquier otro parámetro adecuado para determinar el nivel de aductos de MDA de las células conjuntamente con la presente invención.
Por consiguiente, se puede utilizar cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la materia para detectar el nivel de aductos de MDA sin apartarse del alcance de la invención.
En una realización, el nivel de aductos de MDA de este modo se mide después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) según la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El nivel de aductos de HNE se determina mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la materia. Por ejemplo, el nivel de aductos de HNE se determina mediante inmunomonitorización, por ejemplo con el kit de ELISA competitivo de aductos de HNE OxiSelect ™ (CELL BIOLABS).
El experto en la materia entenderá fácilmente que se puede utilizar cualquier otro parámetro adecuado para determinar el nivel de aductos de HNE de las células conjuntamente con la presente invención.
Por consiguiente, se puede utilizar cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la materia para detectar el nivel de aductos de HNE sin apartarse del alcance de la invención.
En una realización, el nivel de aductos de HNE de este modo se mide después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) según la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término "muestra" significa una sustancia de origen biológico. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, muestras de fluidos corporales y biopsia. Los fluidos corporales incluyen sangre, orina, saliva o cualquier otra secreción corporal o derivado de la misma. Tal como se usa en este documento, "sangre" incluye sangre completa, plasma, suero, células epiteliales circulantes, constituyentes o cualquier derivado de la sangre. La muestra biológica según la invención puede obtenerse del sujeto mediante cualquier medio apropiado de muestreo conocido por el experto en la materia.
Para determinar el nivel de H2O2, el nivel de GSH y/o el nivel de aductos de MDA y/o aductos de HNE en células cancerosas, la muestra está en, en particular, una biopsia de tumor, por ejemplo, un tumor de leucemia, un tumor de linfoma, un tumor de la sangre, un tumor de mama (en particular, TNBC), un tumor de pulmón (en particular, EFGR mutado), un tumor de melanoma, un tumor de colon, un tumor pancreático, un tumor de ovario, un tumor de osteosarcoma, un tumor de cerebro, un tumor de vejiga o tumor gástrico.
Por lo que respecta a la comparación del nivel de H2O2, preferiblemente el valor de control se mide en una muestra del mismo origen de tejido que la muestra de las células cancerosas o la muestra de cáncer, y más preferiblemente, en una muestra del mismo origen de tejido que la muestra de células cancerosas o la muestra de cáncer del mismo sujeto.
Preferiblemente, el "valor de control" corresponde al nivel normal de H2O2.
Tal como se pretende en el presente documento un "nivel normal" de H2O2 significa que el nivel de H2O2 en la muestra está dentro de los valores de corte de norma para H2O2. La norma depende del tipo de muestra y del procedimiento utilizado para medir el nivel de H2O2 en la muestra. En particular, el valor de referencia de H2O2 puede corresponder así a la ausencia o al nivel basal de H2O2 en células normales, preferiblemente del mismo tejido, y más preferiblemente del mismo tejido del mismo sujeto o al valor de H2O2 en células cancerosas incubadas con NAC, preferiblemente del mismo tejido, y más preferiblemente, del mismo tejido del mismo sujeto.
El NAC es un atrapador ávido de radicales hidroxilo (constante de velocidad: 1,36x1010 M-1 s-1) pero que reacciona lentamente con el peróxido de hidrógeno (constante de velocidad: 0,38 M-1 s-1) y no muestra reacción con anión superóxido (Aruoma et al; Free Radic Biol Med, (1989). The antioxidant activity of N-acetyl cysteine: its reaction with hydrogen peroxide, hydroxy radical, superoxide anion, and hypochlorous acid: 6, 593-597).
Un nivel se considera que es estadísticamente inferior o igual si el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del sujeto disminuye hasta por debajo del nivel normal de H2O2 o es igual al nivel normal de H2O2. Particularmente, el nivel de H2O2 se considera que es estadísticamente inferior si el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del paciente disminuye del orden de al menos 5 o 10 o 15 o 20 o 25 o 30 o 35 o 40 o 45 o 50 o 60 o 70 o 80 o 90 o 100 o 200 o 300 o 400 o 500 o 600% en comparación con el valor de control del nivel de H2O2.
De la misma manera, un nivel se considera no sobreproducido si el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del sujeto es igual al nivel normal de H2O2 o disminuye hasta por debajo del nivel normal de H2O2, más particularmente, disminuye del orden de al menos 5 o 10 o 15 o 20 o 25 o 30 o 35 o 40 o 50 o 60 o 70 o 80 o 90 o 100 o 200 o 300 o 400 o 500 o 600% en comparación con el valor de control de nivel de H2O2.
Un nivel se considera estadísticamente inferior o igual si el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del sujeto es igual al nivel de H2O2 en células cancerosas incubadas con NAC o disminuye hasta por debajo del nivel de H2O2 en células cancerosas incubadas con NAC. Particularmente, el nivel de H2O se considera estadísticamente inferior si el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del paciente disminuye del orden de al menos 5 o 10 o 15 o 20 o 25 o 30 o 35 o 40 o 50 o 60 o 70 o 80 o 90 o 100 o 200 o 300 o 400 o 500 o 600% en comparación con el valor de de nivel de H2O2 de la muestra de cáncer incubada con NAC, preferiblemente, del mismo tejido y, más preferiblemente, del mismo tejido del mismo sujeto.
De la misma manera, un nivel se considera no sobreproducido si el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del sujeto es igual al nivel normal de H2O2 o disminuye hasta por debajo del nivel de H2O2 en las células cancerosas incubadas con NAC, más particularmente, disminuye del orden de al menos 5 o 10 o 15 o 20 o 25 o 30 o 35 o 40 o 45 o 50 o 60 o 70 o 80 o 90 o 100 o 200 o 300 o 400 o 500 o 600% en comparación con el valor de control de nivel de H2O2.
El valor o valores de control se pueden determinar como un único valor o un rango de valores que se determina basándose en el nivel de H2O2 medido en una población de células de control, es decir, células normales, en particular en una población de células normales del mismo origen tisular que las células cancerosas, y más particularmente del mismo sujeto, o es decir, de células cancerosas incubadas con NAC, en particular en una población de células cancerosas incubadas con NAC, del mismo origen tisular, y más particularmente del mismo sujeto.
El valor de control puede ser un valor predeterminado o un valor que se determina junto con el valor de medición.
Típicamente, la población analizada podría dividirse en cuantiles basados en el nivel medido de H2O2. El valor de control podría definirse como la mediana, o el segundo tercil, o el segundo o tercer cuartil, o el tercer o cuarto quintil, etc.
El valor de control de H2O2 puede variar en función del procedimiento utilizado para la medición.
En una realización, cuando el cáncer a tratar es una leucemia, el valor de referencia se determina usando el nivel de H2O2 en las células HL60. La línea celular HL60 es una línea celular de leucemia promielocítica humana establecida bien conocida por los expertos en la materia.
En particular, en dicha realización, el nivel de H2O2 se considera que es estadísticamente igual o inferior o no es producido en exceso si "y" no es mayor que 2x/3, siendo "x" el nivel de H2O2 en las células HL60, y siendo "y" el nivel de H2O2 en la muestra de cáncer del sujeto.
El valor o valores de control se pueden determinar como un único valor o un rango de valores que se determina basándose en el nivel de H2O2 medido en una población de células de control, es decir, las células HL60.
Típicamente, la población analizada podría dividirse en cuantiles basados en el nivel medido de H2O2. El valor de control podría definirse como la mediana, o el segundo tercil, o el segundo o tercer cuartil, o el tercer o cuarto quintil, etc. El valor de control de H2O2 puede variar dependiendo del procedimiento utilizado para la medición.
El mismo procedimiento de comparación que el descrito para las células HL60 cuando el cáncer para tratar es una leucemia se aplica para el tipo de los cánceres mencionados en la tabla 2 a continuación con las siguientes líneas celulares correspondientes como valores de referencia.
Tabla 2
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La presente invención se refiere además a un procedimiento de tratamiento del cáncer en un sujeto, en particular, en el que las células cancerosas de dicho sujeto no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor de control, y en particular no sobreproducen H2O2 en comparación con un valor control ni tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células, comprendiendo dicho procedimiento la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico del ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico, y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto.
En una realización, dichas células cancerosas de dicho sujeto también tienen un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |ig de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 |ig por |ig de proteína total, después del tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización, la presente invención también hace referencia a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, particularmente, el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto.
En una realización, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la selección de un sujeto que sufre de un cáncer y que probablemente se beneficiará de un tratamiento con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, particularmente, el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que dicho procedimiento comprende:
a. medir el nivel de H2O2 en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
b. comparar el nivel resultante de la etapa a. con un valor de control; y
c. medir el nivel de GSH en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
en el que, si:
- el nivel de H2O2 de la muestra de células cancerosas de dicho sujeto no es mayor que el valor de control, y - el nivel de GSH de dicha muestra células cancerosas de dicho sujeto es inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, dicho procedimiento comprende además:
d. tratar dicho sujeto con un compuesto capaz de inducir un nivel de H2O2 más alto que el valor de control;
e. verificar que el nivel resultante de H2O2 de dicho sujeto es más alto que el valor de control; y
f. tratar dicho sujeto con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular, el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización, dicho procedimiento comprende:
a. medir el nivel de H2O2 en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
b. comparar el nivel resultante de la etapa a. con un valor de control;
c. medir el nivel de GSH en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto; y/o
c'. medir el nivel de aductos de MDA y/o aductos de HNE después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) según la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una muestra de células cancerosas de dicho sujeto;
en el que, si:
- el nivel de H2O2 de la muestra de células cancerosas de dicho sujeto es mayor que el valor de control,
- el nivel de GSH de dicha muestra de células cancerosas de dicho sujeto es inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, y/o
- el nivel de aductos de MDA está por encima de 75 ng por |jg de proteína total y/o el nivel de aductos de HNE está por encima de 1 jg por jg de proteína
dicho procedimiento comprende además:
d. tratar dicho sujeto con un compuesto capaz de inducir un nivel de H2O2 más alto que el valor de control;
e. verificar que el nivel resultante de H2O2 de dicho sujeto es más alto que el valor de control; y
f. tratar dicho sujeto con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular, el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La verificación de que el nivel resultante de H2O2 de dicho sujeto es más alto que el valor de control se puede realizar utilizando los procedimientos citados previamente antes.
En particular, los compuestos de la combinación o los productos de acuerdo con la invención se administran por separado, secuencialmente o simultáneamente.
Más particularmente, los compuestos de la combinación o los productos según la invención se administran secuencialmente, el compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, que se administra antes de la administración del compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular, el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente, el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico.
En una realización, la combinación para su uso según la invención o los productos para su uso según la invención consisten en un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, particularmente, el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y más particularmente el éster fumarato S-metílico de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto.
Los compuestos de las combinaciones, productos y procedimientos según la invención se pueden preparar mediante una variedad de rutas sintéticas. Los reactivos y materiales de partida están disponibles comercialmente o se sintetizan fácilmente mediante técnicas bien conocidas por un experto en la materia.
La identificación de los sujetos que están en necesidad de tratamiento de enfermedades y afecciones descritas en el presente documento se lleva a cabo como se mencionó anteriormente y está dentro de la capacidad y conocimiento de un experto en la materia. Un médico experto en la materia puede identificar fácilmente, mediante las técnicas mencionadas anteriormente, aquellos sujetos que necesitan dicho tratamiento.
Una cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar fácilmente por el médico que realiza el diagnóstico, como experto en la materia, mediante el uso de técnicas convencionales y observando los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Al determinar la cantidad terapéuticamente eficaz, el médico que realiza el diagnóstico considera una serie de factores, que incluyen, pero no se limitan a: la especie del sujeto; su tamaño, edad y salud general; la enfermedad específica involucrada; el grado de afectación o la gravedad de la enfermedad; la respuesta del sujeto individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; la biodisponibilidad característica del preparado administrado; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicación concomitante; y otras circunstancias relevantes.
Tal como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es efectiva en reducir, eliminar, tratar o controlar los síntomas de las enfermedades y afecciones descritas en este documento. El término "control" pretende referirse a todos los procesos en los que puede haber una ralentización, interrupción, detención o parada de la progresión de las enfermedades y afecciones descritas en este documento, pero no necesariamente indica una eliminación total de todas las enfermedades y síntomas de afecciones y pretende incluir el tratamiento profiláctico y el uso crónico.
La cantidad de los compuestos de la combinación, productos o procedimientos según la invención, que se requiere para conseguir el efecto biológico deseado, variará dependiendo de un número de factores, incluyendo la dosificación del fármaco a administrar, las características químicas (por ejemplo hidrofobicidad) de los compuestos empleados, la potencia de los compuestos, el tipo de enfermedad, el estado de enfermedad del paciente y la vía de administración.
Los compuestos proporcionados en el presente documento se pueden formular en composiciones farmacéuticas, como se ha mencionado anteriormente, mediante mezcla con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Tal como se usa en este documento, un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administra a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido no tóxico de cualquier tipo.
Tales composiciones pueden prepararse para su uso en la administración oral, particularmente en forma de comprimidos o cápsulas, en particular comprimidos bucodispersables (lyoc); o administración parenteral, particularmente en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones líquidas.
Se puede preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed.; Gennaro, A.R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. Pueden incluirse agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Las composiciones orales generalmente incluirán un portador diluyente inerte o un portador comestible. Se pueden administrar en formas de dosis unitarias, en las que el término "dosis unitaria" significa una dosis única que se puede administrar a un paciente y que se puede manipular y envasar fácilmente, permaneciendo como una dosis unitaria física y químicamente estable que comprende el propio compuesto activo o como una composición farmacéuticamente aceptable, tal como se describe a continuación.
Los comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas, trociscos y similares pueden contener uno o más de cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina o goma de tragacanto; un diluyente, tal como almidón o lactosa; un disgregante, tal como almidón y derivados de celulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta o salicilato de metilo. Las cápsulas pueden tener la forma de una cápsula dura o una cápsula blanda, que generalmente están hechas de mezclas de gelatina opcionalmente mezcladas con plastificantes, así como una cápsula de almidón. Además, las formas unitarias de dosificación pueden contener varios otros materiales que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca o agentes entéricos. Otras formas de dosificación oral, jarabe o elixir, pueden contener agentes edulcorantes, conservantes, tintes, colorantes y aromatizantes. Además, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de disolución rápida, liberación modificada o liberación sostenida, y en las que dichas formulaciones de liberación sostenida son preferiblemente bimodales.
Las preparaciones líquidas para la administración incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Las composiciones líquidas también pueden incluir aglutinantes, tampones, conservantes, agentes quelantes, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes, y similares. Los disolventes no acuosos incluyen alcoholes, propilenglicol, polietilenglicol, copolímeros de acrilato, aceites vegetales, tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos, tales como el oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen mezclas de alcoholes y agua, hidrogeles, medios tamponados y solución salina. En particular, el polímero de lactida, el copolímero de lactida/glicólido o los copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de los compuestos activos. Los vehículos intravenosos pueden incluir reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares.
Los ejemplos de modos de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, así como administración oral. Incluye en particular una formulación como comprimido para administración oral o como polvo para solución inyectable para administración intravenosa.
En el alcance de la presente invención, debe entenderse que “una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, para su uso” es equivalente a “el uso de una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto” y, en particular, que “una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente acep­ table del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, para su uso en el tratamiento de” es equivalente a “el uso de una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, para el tratamiento de” y a “el uso de una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas de un sujeto, para la producción de un medicamento dirigido al tratamiento». Lo mismo se aplica a los productos para uso según la invención.
La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.
Figuras
Figura 1: Correlación de H2O2/IC50 de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo: relación entre la IC50 de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo en |iM y los niveles de actividad de H2O2 endógeno en células cancerosas
Figura 2 : Correlación de H2O2/IC50de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo: Determinación de un punto de corte
Figura 3: Correlación de H2O2/IC50 de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo: estudios mediante origen tisular
Figuras 4 a 6 : Correlación de IC50 de H2O2/4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo: inducción de sensibilidad a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metilo aumentando actividad de H2O2 (PCN=piocianina) en tres líneas celulares de cáncer: THP-1, HCC827 y Hop62
Figura 7: Correlación de IC50 de H2O2/4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo: efecto sinergético de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo y fármacos inductores de H2O2: trióxido de arsénico (As2O3) (ATO) 1 |iM y Doxorubicina (Doxo) 200nM
Figura 8: Tratamiento combinado utilizando 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo y agente inductor de H2O2, Cisplatino (CPPD) o Doxorubicina (Doxo), en un contexto donde las células cancerosas Colo357 tienen un nivel de GSH más alto que 5 nmol para 25.000 células
Figura 9: Nivel total de GSH en nmol para 25.000 células observadas en células sensibles y resistentes
Figura 10: Cuantificación de aductos de MDA y HNE en células sensibles al 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (HL-60, NT2/D1) (A) y células resistentes al 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (MSC) tratadas con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo 5 o 10 |jmol. L'1 durante 24 horas (B)
Nota: En todas las figuras que se han mencionado anteriormente: se indica DIMATE para 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo.
Ejemplos
Material y procedimientos
Líneas celulares
Se ha seleccionado un panel de 52 células tumorales humanas que representan 10 tipos de tejidos para cubrir un amplio conjunto de diferentes oncogenes y de acuerdo con su respuesta a diferentes agentes quimioterapéuticos estándar. Las células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), la European Collection of Cell Cultures (ECACC) y de cultivos primarios de células cancerosas derivadas de tumores de pacientes (Instituto de Investigación de Vall d'Hebron (VHIR), Barcelona, España; Instituto de Oncología Vall d'Hebron (VHIO), Barcelona, España; Oncotest, Friburgo, Alemania; Oncodesign, Dijon, Francia; Universitá Degli Studi di Palermo, Oncología y Ciencias Quirúrgicas, Palermo, Italia; e Instituto de Medicina Predictiva y Personalizada de Cancer (IMPPC), Barcelona, España (ver la descripción del panel de células tumorales en la Tabla 3). Todas las células se cultivaron en medios apropiados según las recomendaciones del proveedor.
Tabla 2
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El aumento de la sensibilidad de la línea celular al 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo se ha realizado utilizando una línea celular seleccionada debido a su resistencia al 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo. Las líneas celulares de cáncer de pulmón (HCC827, Hop62) y las líneas celulares de leucemia (THP-1) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), la European Collection of Cell Cultures (ECACC). Las células se cultivaron en medios apropiados de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Ensayo de viabilidad celular, formato de 96 pocillos
Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos a concentraciones requeridas para asegurar aproximadamente el 80% de confluencia en el control (células sin tratar) al final del experimento (0,5 x 104 - 5 x 104 células/pocillo). La sensibilidad hacia el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo se determinó usando diferentes concentraciones del fármaco (de 0,01 a 100 |jM). Después de 48 horas, se analizó el efecto inhibidor del crecimiento del fármaco utilizando Rezasurin, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para garantizar una buena calidad de los datos y minimizar el impacto de los errores de pipeteo, se evaluó cada concentración de fármaco particular en función de la intensidad de fluorescencia media de 8 pocillos separados. La respuesta al fármaco se cuantificó por la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50) para cada línea celular particular, y se determinó mediante un análisis de regresión no lineal de las curvas logarítmicas de dosis/respuesta. El valor de corte para la resistencia a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo se determinó estadísticamente (> 2 SD por encima de la IC50 media geométrica). El valor umbral in vitro de hipersensibilidad al fármaco se ha definido como < media geométrica de IC50.
Aumento de la sensibilidad de las células al 4-(d¡metilam¡no)-4-met¡lpent-2-¡not¡oato de S-metilo aumentando el nivel de H2O2
En un experimento diferente, las células que muestran resistencia al 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (THP-1, HCC827, y Hop62) se estimularon con un inductor de H2O2. Las células se sembraron como se ha descrito anteriormente y se incubaron con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (de 0,01 a 100 |jM) solo o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo en combinación con el inductor de H2O2 piocianina (40 |i M). Después de 48 h de incubación, se midió la viabilidad celular usando el ensayo de Rezasurina como se describió anteriormente.
Los agentes quimioterapéuticos que son conocidos para inducir H2O2 en células se estimularon en asociación con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo para tratar células resistentes a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (THP-1). Se sembraron células como se describió anteriormente y se incubó 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (5, 10, 15, 30 |i M) solo o con otros fármacos utilizados en la quimioterapia y conocidos como inductor de H2O2 como 2-metoxiestradiol (2-ME 100 j M), trióxido de arsénico (ATO 1 j M), daunorrubicina (40 nM), doxorrubicina (20 nM), etopósido (500 nM), mitoxantrona (50 nM), partenolida (100 nM) y Piperlongumina (2 j M). Después de 48 horas de incubación, se midió la viabilidad celular usando el ensayo de rezasurina como se describió anteriormente.
Medición de la producción de H2O2
La producción de H2O2 intracelular en células vivas se midió usando el kit de detección de ROS total/superóxido (Enzo life sciences), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo utiliza sondas específicas de H2O2/RNS que tras la reacción con H2O2 y especies de RNS se oxidaron rápidamente a compuestos altamente fluorescentes. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a los niveles totales de H2O2/RNS dentro de la muestra. Las pruebas experimentales se realizaron utilizando células no tratadas o células tratadas con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (1-5 uM), vehículo HEPES, inductor de H2O2 piocianina (PCN, 500 um) o inhibidor de H2O2 N-acetil-L-cisteína (NAC) (10 mM). El día antes del análisis, las células se sembraron en placas de base negra/clara de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 en medios de cultivo de acuerdo con instrucciones de los proveedores de células, suplementados con FBS (10% v/v), 10 unidades de penicilina/ml y 100 mg de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera húmeda de 95% de aire:5% de CO2 durante la noche. El día del análisis, el medio celular se reemplazó por 100 j L de medio libre de fenol suplementado como antes, sin ningún tratamiento, con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo durante 6 horas, vehículo HEPES durante 6 horas o con los diferentes agentes de control PCN y NAC durante 20 min. Después del período de incubación, los pocillos se cargaron con 100 |il de solución de detección de H2O2, que contiene el agente de tratamiento respectivo o los controles y se incubaron durante 60 min a 37 °C en la oscuridad. Se dejaron varios pocillos sin células para las medidas de control de la fluorescencia de base. Las placas se leyeron usando un lector de microplacas de fluorescencia Appliskan (Thermo Scientific) (ex = 560 nm, Em = 600). Los datos se expresan como el cambio en unidades de fluorescencia arbitrarias producidas a partir de cantidades iguales de células y normalizadas a la entrada total de proteínas.
Análisis estadístico
Los valores se expresan como media ± SD o frecuencias y proporciones. Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante la prueba t para datos no apareados, Chi-cuadrado, prueba exacta de Fisher o ANOVA, en su caso. Se consideró P <0,05 estadísticamente significativo. El análisis se realizó utilizando GraphPad prism versión 5.0 (software GraphPad, San Diego California EE.UU.) y el software JMP versión 12.01 (SAS Institute Inc. Carolina del Norte EE.UU.).
Medición de la producción de GSH
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de paredes negras (5 * 104 células/ml) y se incubaron durante la noche para la fijación. Las células se trataron con vehículo, DMSO, BCNU 100 j M, 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo 20 j M, durante 24 horas. El glutatión total se midió de acuerdo con las instrucciones del kit (GSH-Glo™, Promega) y se obtuvieron resultados para 25.000 células.
Determinación cuantitativa de aductos de proteína-HNE y proteína-MDA mediante ELISA
La formación de aductos de HNE y aductos de MDA se cuantificó con el kit de ELISA de aductos de HNE Oxiselect (Cell Biolabs, San Diego, CA) y el kit de ELISA de aductos de MDA OxiSelect (Cell Biolabs), respectivamente. Brevemente, después de un tratamiento con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo durante 24 horas, las células se lisaron mediante sonicación en tampón de muestra de SDS reductor. Los homogeneizados se diluyeron hasta 10 |jg de proteína/ml y se adsorbieron en placas de unión a proteínas de 96 pocillos mediante incubación a 37°C durante al menos 2 horas. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 2 horas más a temperatura ambiente en un agitador orbital. Después de tres lavados en PBS, se añadieron 100 j l de anticuerpo anti-HNE o anticuerpo anti-MDA a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió conjugado de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra-HRP (diluido 1/1000 con el diluyente de ensayo) y se continuó la incubación durante 1 hora. Los pocillos se lavaron cinco veces en PBS y se añadió sustrato de HRP. La reacción se detuvo con una solución ácida y se leyó la absorbancia en un lector de microplacas a 450 nm. El nivel de aductos de HNE y de aductos de MDA se determinó por comparación con una curva estándar preparada a partir de patrones de HNE-BSA y MDA-BSA suministrados por el fabricante.
Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 1 a 10.
La Figura 1 muestra que se observa una correlación entre la actividad de H2O2 y laIC50 (monitorización mediante el kit de detección de ROS Total/superóxido, tal como se mencionó anteriormente).
Además, la Figura 2 muestra que mediante la separación de las células en dos partes con un corte (20.000 de intensidad de fluorescencia relativa), se revela una distinción de la senbilidad de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo a H2O2 elevada y a H2O2 baja (valor de P < 0,05).
En la figura 3, la correlación entre la actividad de H2O2 y la IC50 se ilustra por origen de tejido.
Además, las figuras 4 a 6 y la tabla 4 a continuación muestran la inducción de sensibilidad a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo utilizando pretratamiento con piocianina en un contexto en el que las células cancerosas tienen una nivel de GSH por debajo de 5 nmol para 25.000 células.
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Se demostró la inducción de la sensibilidad al 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo usando un pretratamiento con piocianina 40 jM . La exposición de la célula a piocianina provoca un aumento de dos veces en los niveles de H2O2 sin afectar la viabilidad celular.
La Figura 7 muestra un efecto sinérgico con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en las células cancerosas, incluso en las células resistentes a los compuestos por separado.
Además, también se observaron resultados sinérgicos con el tratamiento combinado de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo y los agentes quimioterapéuticos conocidos para inducir H2O2 en células resistentes a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo THP-1, tal como se muestra en la Tabla 5 a continuación.
T l :
Figure imgf000020_0002
La figura 8 se refiere al tratamiento de combinación usando 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo y el agente inductor de H2O2, cisplatino (CPPD) o doxorrubicina (Doxo), en un contexto en el que las células cancerosas Colo357 tienen un nivel de GSH superior a 5 nmol para 25.000 células (al contrario de lo que se ha observado antes).
En la figura 8 (A) se muestra que el tratamiento usando CPPD a 20 |jmol.L-1 y Doxo a 25 |jmol.L-1 aumentan significativamente el nivel de H2O2 en la línea celular Colo357 (respectivamente, 200% y 10.000% pero que, tal como se muestra en la Figura 8 (B), no se observó ningún efecto sobre la viabilidad.
Las figuras 9 y 10 ilustran cómo se han determinado los umbrales con respecto a GSH, adcutos de MDA y aductos de hNE.
En la Figura 9, el nivel total de GSH en nmol para 25.000 células se observa en las células sensibles y resistentes. Se observó una diferencia significativa (***, valor de p < 0,001). Utilizando un umbral de 0,5 nmol para 25.000 células para distinguir entre las células altas en GSH de bajas en GSH, el 100% de las células sensibles tienen GSH bajo y el 100% de las células resistentes tienen GSH alto.
La Figura 10 muestra la cuantificación de aductos de MDA y HNE en células sensibles a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-itioato de S-metilo (HL-60, NT2/D1) (A) y células resistentes a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo (MSC) tratadas con 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo 5 o 10 jm o l. L'1 durante 24 horas (B). Para los aductos de MDA, en células sensibles a 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo, el umbral está por encima de 100 ng por |jg de proteína total, y en las células resistentes, el umbral está por debajo de este umbral. Para los aductos de HNE, se puede hacer la misma observación con un umbral de 1 jg por jg de proteína total.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Combinación que comprende un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000022_0001
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en el que las células cancerosas de dicho sujeto:
- tienen un nivel de H2O2 inferior o igual al nivel de H2O2 en las células normales que se originan en el mismo tejido que las células cancerosas, y
- tienen un nivel de GSH por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células.
2. Combinación para su uso, según la reivindicación 1, en la que dicho sujeto se identifica midiendo el nivel de H2O2y el nivel de GSH en células cancerosas de dicho sujeto.
3. Combinación para su uso, según la reivindicación 2, en el que dicho nivel de H2O2 se determina mediante la cuantificación del nivel de intensidad de fluorescencia.
4. Combinación para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las células cancerosas de dicho sujeto también tienen un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |jg de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 jg por jg de proteína total, después del tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. Procedimiento para seleccionar un sujeto que padece cáncer y que probablemente se beneficiará de un tratamiento con una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000022_0002
en el que X1 y X2, idénticos o diferentes, son seleccionados entre un grupo alquilo C1-C7, un fenilo, un bencilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo, en particular una piperidina o una morfolina; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende:
a. medir el nivel de H2O2 en una biopsia de células cancerosas de dicho sujeto;
b. comparar el nivel resultante de la etapa a. con el nivel de H2O2 en células normales que se originan en el mismo tejido del mismo sujeto que las células cancerosas, y
c. medir el nivel de GSH en una biopsia de células cancerosas de dicho sujeto;
en el que:
- un nivel de H2O2 de dicha biopsia de células cancerosas de dicho sujeto no superior al nivel de H2O2 en células normales que se originan en el mismo tejido del mismo sujeto que las células cancerosas, y
- un nivel de GSH de dicha biopsia de células cancerosas de dicho sujeto por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células, indica que es probable que el sujeto se beneficie de un tratamiento con una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que dicho procedimiento comprende:
a. medir el nivel de H2O2 en una biopsia de células cancerosas de dicho sujeto;
b. comparar el nivel resultante de la etapa a. con el nivel de H2O2 en células normales que se originan en el mismo tejido del mismo sujeto que las células cancerosas;
c. medir el nivel de GSH en una biopsia de células cancerosas de dicho sujeto; y
d. medir el nivel de aductos de MDA y/o aductos de HNE después de un tratamiento in vitro con un compuesto de fórmula (I) en una biopsia de células cancerosas de dicho sujeto;
en el que:
- un nivel de H2O2 de dicha biopsia de células cancerosas de dicho sujeto no superior al nivel de H2O2 en células normales que se originan en el mismo tejido del mismo sujeto que las células cancerosas, y,
- un nivel de GSH de dicha biopsia de células cancerosas de dicho sujeto por debajo de 0,5 nmol para 25.000 células, y
- un nivel de aductos de MDA por encima de 75 ng por |jg de proteína total y/o un nivel de aductos de HNE por encima de 1 jg por jg de proteína,
indica que es probable que el sujeto se beneficie de un tratamiento con una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto.
7. Procedimiento, según las reivindicaciones 5 o 6, en el que un nivel de H2O2 no superior a 20.000 de intensidad de fluorescencia relativa, indica que es probable que el sujeto se beneficie de un tratamiento con una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto capaz de aumentar el nivel de H2O2 en células cancerosas de un sujeto.
8. Combinación para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el nivel de GSH se determina mediante luminiscencia.
9. Combinación para su uso, según la reivindicación 4, o un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el nivel de aductos de MDA y/o el nivel de aductos de HNE se determina mediante inmunomonitorización.
10. Combinación para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 8 o 9, o un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el cáncer se elige leucemia, linfomas, cáncer de sangre, cáncer de mama (en particular TNBC), cáncer de pulmón (en particular EGFR mutado), melanomas, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, osteosarcoma, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga y cáncer gástrico.
11. Combinación para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3, 4, 8, 9 o 10, o un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en la que en dicho compuesto de fórmula (I), X1 y X2, idénticos o diferentes, se eligen entre un metilo, un fenilo, un bencilo, siendo al menos uno de X1 o X2 un metilo, o X1 y X2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman una piperidina o una morfolina.
12. Combinación para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y 8 a 11, o un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que dicho compuesto de fórmula (I) es el 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inotioato de S-metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Combinación para su uso, según la reivindicación 12, o un procedimiento, según la reivindicación 12, en el que dicha sal farmacéuticamente aceptable es éster fumarato S-metílico del ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinotioico.
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