BR112018007480B1 - Composição farmacêutica, uso de uma combinação e método para a seleção de um indivíduo - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMBINAÇÃO, USO DE UM COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA A SELEÇÃO DE UM INDIVÍDUO. A presente invenção se refere a uma combinação que compreende um composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e mais especialmente, o fumarato de éster de S-metila de ácido 4- (dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, em especial, para o uso no tratamento de câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e possui um nível de GSH inferior a 5 nmol para 25.000 células.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a uma combinação que compreende um composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e mais especialmente, o fumarato de éster de S-metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, em especial, para o uso no tratamento de câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O equilíbrio de redox das células é fundamental para a fisiologia celular normal. É mantido por 3 sistemas: GSH/GSSG, NADPH/NADP; Tiorredoxina (reduzida) / Tiorredoxina (oxidada). Destes 3 sistemas, a GSH/GSSG é o mais amplamente estudada por sua implicação nos estados patológicos e pelo desenvolvimento de abordagens terapêuticas racionais (Townsend, A.J., Leone-Kabler, S., Haynes, R.L., Wu, Y., Szweda, L. e Bunting, K.D. (2001). A proteção seletiva por ALDH3A1 humana estavelmente transfectada (mas não por ALDH1A1 humana) contra a toxicidade de aldeídos alifáticos em células V79 (130-132, 261-273). Os estados patológicos associados a um desequilíbrio em GSH/GSSG incluem as patologias importantes, tais como os cânceres (Estrela, J.M., Ortega, A. e Obrador, E. (2006). Glutathione in cancer biology and therapy. Crit. Rev. Clin. La(b) Sci. 43, 143-181; O'Brien, M.L., e Tew, K.D. (1996). Glutathione and related enzymes in multidrug resistance. Eur. J. Cancer Oxf. Engl. 1990 32A, 967-978). Sua etiologia comum é a tensão oxidativa causada por ROS e/ou espécies reativas de nitrogênio (RNS) que em primeiro lugar causam uma redução em GSH devido à desintoxicação direta de ROS e RNS. Esta redução inicial em GSH, posteriormente, é seguida por um aumento compensatório na síntese de GSH que as células exercem para continuar a desintoxicação de ROS / RNS e de produtos eletrofílicos recém-formados, tais como o 4-hidroxinonenal (HNE) e malondialdeído (MDA)) produzido por ataque de ROS em lipídeos de células (Esterbauer, H, Schaur, RJ, e Zollner, H. (1991). Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. 11, 81-128).

[003] O paradoxo de GSH nas células de câncer é que, em vez do déficit de GSH intracelular que seria esperado, é precisamente o oposto que foi descoberto experimentalmente em muitas células de câncer diferentes (Estrela, J.M., Ortega, A. e Obrador, E. (2006) Glutathione in cancer biology and therapy Crit. Rev. Clin. La(b) Sci. 43, 143-181). Mas este aumento em GSH apresenta repercussões terapêuticas negativas, uma vez que protege as células de câncer das quimioterapias e radioterapias (Carretero, J., Obrador, E, Esteve, J.M., Ortega, A, Pellicer, J.A., Sempere, FV e Estrela, J.M. (2001) Tumoricidal activity of endothelial cells. Inhibition of endothelial nitric oxide production abrogates tumor cytotoxicity induced by hepatic sinusoidal endothelium in response to B16 melanoma adhesion in vitro (J. Biol. Chem. 276, 25.775-25.782).

[004] Além disso, se forem obtidos níveis baixos de GSH nas células de câncer para que a quimioterapia seja eficaz, não é este o caso para as células normais por não induzirem danos colaterais.

[005] As abordagens terapêuticas que atualmente estão sendo utilizadas para baixar a GSH celular, a fim de combater a quimiorresistência das células de câncer, apresentam como alvo a própria GSH ou as enzimas envolvidas na síntese de GSH, degradação de GSH e efluxo de GSH. Existem 10 compostos de redução de GSH que estão nas fases I, II e III de ensaios clínicos como agentes anticancerígenos (Tew, K. e Townsend D (2011) Redox platforms in cancer drug discovery and development. Curr.Opin. Chem.Biol 15, 156-161). Todos eles precisam ser administrados em combinação com as drogas anticancerígenas padrão, por exemplo, a ciclofosfamida, taxol, vincristina, melfalano e similares.

[006] Além disso, as enzimas alvo destas drogas de redução de GSH são aquelas envolvidas na síntese de GSH (gama glutamil cisteína ligase), degradação de GSH (gama-glutamil transpeptidase) e efluxo de GSH (GSH-S- transferase). Estas mesmas enzimas, no entanto, são essenciais para proteger as células normais do ataque de ROS. Por conseguinte, existe uma forte possibilidade de danos colaterais para as células normais, uma vez que as drogas não podem ser entregues seletivamente às células de câncer e apenas às células de câncer.

[007] Em vista disso, existe uma necessidade de encontrar outras soluções terapêuticas que especificamente e seletivamente almeje a GSH nas células de câncer.

[008] Os Depositantes da presente invenção inesperadamente descobriram que uma combinação que compreende um composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e mais especialmente, o fumarato de éster de S- metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, é útil como medicamento e é capaz de tratar o câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso. Em especial, eles descobriram que uma combinação que compreende um composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e mais especialmente, o fumarato de éster de S- metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico, e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, é útil como medicamento e é capaz de tratar o câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso e possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células.

[009] Sem estar vinculado a qualquer teoria, quando o composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo iria induzir um aumento no nível de H2O2 nas células de câncer, por conseguinte, o composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável iria aumentar os níveis de metabólitos intracelulares produzidos pelo ataque de H2O2 e, ao mesmo tempo, a GSH, por conseguinte, seria consumida na desintoxicação desses metabólitos eletrofílicos. Como resultado, a GSH insuficiente estaria disponível nas células de câncer para agir como um sequestrador de H2O2. Por conseguinte, os níveis de H2O2 devem aumentar e desencadear os mecanismos dependentes de H2O2 na via mitocondrial (intrínseca) do apoptose.

[010] Em células normais que não sofreram inicialmente um ataque de H2O2, os níveis intracelulares de GSH já são elevados (devido à ausência de H2O2), de maneira que os níveis de quaisquer eletrófilos induzidos por H2O2 são inferiores aos níveis de suas contrapartes de câncer. No entanto, os níveis de H2O2 em células normais podem aumentar concomitantemente quando um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo é utilizado, se este composto for capaz de aumentar o nível de H2O2 em células normais e de câncer. Neste último caso, os níveis de H2O2 nas células normais, no entanto, ainda no entanto inferiores serão àqueles das células de câncer e, por conseguinte, irão permanecer abaixo do seu limiar apoptótico após o tratamento com o composto de aminotioléster, de acordo com a presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[011] Conforme previamente mencionado, os Depositantes da presente invenção inesperadamente descobriram que um composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em combinação com um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, é útil como um medicamento e é capaz de tratar o câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso. Em especial, eles descobriram que uma combinação que compreende um composto de aminotioléster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e mais especialmente, o fumarato de éster de S- metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico, e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, é útil como medicamento e é capaz de tratar o câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso e possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células.

[012] Esta nova terapia apresenta a vantagem de que as células normais sofrem menos danos colaterais uma vez que seus metabólitos eletrofílicos iniciais são tão baixos (devido à ausência de H2O2) que irão permanecer abaixo de seu limiar apoptótico após o tratamento com um composto de aminotioléster, de acordo com a presente invenção, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

[013] A presente invenção, por conseguinte, se refere a uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I): - em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; - ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para o uso no tratamento de câncer em um indivíduo.

[014] Mais especialmente, se refere a uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I): - em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; - ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para o uso no tratamento de câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo: - não produzem o H2O2 em excesso em comparação a um valor de controle, e - possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células.

[015] Em especial, as células de câncer de dito indivíduo também possuem um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou níveis de adutos de HNE superiores a 1 μg por μg de proteína total, após o tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[016] A presente invenção também se refere aos produtos que compreendem um composto de Fórmula (I): - em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; - ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo como uma preparação combinada para o uso espalhada ao longo do tempo para o tratamento de câncer em um indivíduo, em que as células de câncer de dito indivíduo: - não produzem o H2O2 em excesso em comparação a um valor de controle, e - possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células.

[017] Em especial, as células de câncer de dito indivíduo também possuem um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou níveis de adutos de HNE superiores a 1 μg por μg de proteína total, após o tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[018] Em especial, dito indivíduo é identificado medindo o nível de H2O2 e o nível de GSH nas células de câncer de dito indivíduo.

[019] Mais especialmente, dito nível de H2O2 é determinado quantificando o nível de Intensidade de Fluorescência.

[020] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende um composto de Fórmula (I): - em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; - ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo.

[021] A presente invenção ainda se refere a um método para a seleção de um indivíduo que sofre de um câncer e que muito provavelmente irá se beneficiar de um tratamento com uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I): - em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; - ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, em que dito método compreende: (a) medir o nível de H2O2 em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; (b) comparar o nível resultante da etapa (a) com um valor de controle; e (c) medir o nível de GSH em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; em que: - um nível de H2O2 de dita amostra de células de câncer de dito indivíduo não superior ao valor de controle e - um nível de GSH de dita amostra de células de câncer de dito indivíduo abaixo de 0,5 nmol para 25.000 células, - indica que o indivíduo é susceptível de se beneficiar de um tratamento com uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo.

[022] Em uma realização, dito método compreende: (a) medir o nível de H2O2 em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; (b) comparar o nível resultante da etapa (a) com um valor de controle; (c) medir o nível de GSH em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; e/ou (d) medir os adutos de MDA e/ou o nível de adutos de HNE após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a presente invenção, em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; - em que: - um nível de H2O2 de dita amostra de células de câncer de dito indivíduo não superior ao valor de controle, - um nível de GSH de dita amostra de células de câncer de dito indivíduo abaixo de 0,5 nmol por 25.000 células e/ou - um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou um nível de adutos de HNE acima de 1 μg por μg de proteína, - indica que o indivíduo é susceptível de se beneficiar de um tratamento com uma combinação, de acordo com a presente invenção

[023] Conforme descrito no presente, "H2O2" significa "peróxido de hidrogênio" e é bem conhecido do técnico no assunto. Representa as moléculas quimicamente reativas contendo o oxigênio. É formado como um subproduto natural do metabolismo normal do oxigênio e apresenta papéis importantes na sinalização celular e na homeostase. No entanto, durante períodos de tensão ambiental (por exemplo, a exposição a UV ou calor), os níveis podem aumentar dramaticamente. Isso pode resultar em danos significativos às estruturas celulares. Cumulativamente, isso é conhecido como a tensão oxidativa. O peróxido de hidrogênio também é gerado por fontes exógenas, tal como a radiação ionizante.

[024] Em especial, um nível de H2O2 não superior a um valor compreendido entre 2.000 e 400.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, por exemplo, entre 10.000 e 100.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa ou 15.000 e 100.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa e, mais especialmente, um nível de H2O2 superior a 20.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, ainda mais especialmente não superior a 21.598 de Intensidade de Fluorescência Relativa, indica que o indivíduo é suscetível de se beneficiar de um tratamento com uma combinação, de acordo com a presente invenção.

[025] Em especial, o nível não superior a um valor compreendido entre 2.000 e 400.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, por exemplo, entre 10.000 e 100.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa ou 15.000 e 100.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa e mais especialmente, um nível de H2O2 não superior a 20.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, ainda mais especialmente não superior a 21.598 de Intensidade de Fluorescência Relativa, é medida com o conjunto de detecção Total ROS / superóxido (Enzo life science), mais especialmente, conforme medido em um leitor de microplacas de fluorescência Appliskan (Thermo Scientific) (Ex / Em = 488/520 nm e Ex / Em = 550/610 nm).

[026] Se o nível de cisalhamento de H2O2 é fornecido no presente e em outros locais na descrição medindo a intensidade de fluorescência, este método não é exclusivo e o nível de cisalhamento de H2O2 pode ser determinado através de qualquer outro método disponível para o técnico no assunto, o parâmetro que determina em qual local colocar o ponto de cisalhamento é a correlação entre o IC50 do produto, de acordo com a presente invenção, e o nível de H2O2. O IC50 é uma medida bem conhecida do técnico no assunto.

[027] Conforme descrito no presente, a abreviação "GSH" significa "Glutationa" e é bem conhecida do técnico no assunto. É um tripeptídeo com uma ligação gama de peptídeo entre o grupo carboxila da cadeia secundária do glutamato e do grupo amina da cisteína, e o grupo carboxila da cisteína é ligado por ligação de peptídeo normal a uma glicina.

[028] Em especial, no âmbito da presente invenção, o nível de GSH é inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, em especial, inferior a 0,45 nmol para 25.000 células e mais especialmente, inferior a 0,4 nmol para 25.000 células.

[029] O nível de GSH é determinado através de qualquer método disponível para o técnico no assunto. Por exemplo, o nível de GSH é determinado através de luminescência, por exemplo, com o conjunto Promega GSH-Glo (Promega).

[030] Se o nível de cisalhamento de GSH é fornecido no presente e em outros locais na descrição através de luminescência, este método não é exclusivo e o nível de cisalhamento de GSH pode ser determinado através de qualquer outro método disponível para o técnico no assunto.

[031] Conforme descrito no presente, a abreviação “MDA” é utilizada para “Malondialdeído”, um composto orgânico de Fórmula CH2(CHO)2. Esta espécie reativa é bem conhecida pelo técnico no assunto e ocorre naturalmente e é uma peroxidação de lipídeos marcadora em células. Além disso, um "aduto de MDA", de acordo com a presente invenção, é um aduto formado entre MDA e as proteínas das células de câncer, bem como com o DNA das células de câncer.

[032] Em especial, no âmbito da presente invenção, o nível de adutos de MDA após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, de um seu sal farmaceuticamente aceitável é superior a 75 ng por μg de proteína total, em especial, superior a 90 ng por μg de proteína total e mais especialmente, superior a 100 ng por μg de proteína total. O nível de adutos de MDA é determinado através de qualquer método disponível para o técnico no assunto. Por exemplo, o nível de adutos de MDA é determinado através da imuno-monitoração, por exemplo, com o conjunto ELISA competitivo de aduto de MDA OxiSelect™ MDA (CELL BIOLABS).

[033] Conforme descrito no presente, a abreviação “HNE” é utilizada para “4-hidroxi-2-nonenal”, um composto orgânico de Fórmula C9H16O2. Esta espécie reativa é bem conhecida pelo técnico no assunto e ocorre naturalmente e é uma peroxidação de lipídeos marcadora em células.

[034] Além disso, um "aduto de HNE", de acordo com a presente invenção, é um aduto formado entre HNE e as proteínas das células de câncer, bem como um aduto formado com a GSH das células de câncer.

[035] Em especial, no âmbito da presente invenção, o nível de adutos de HNE após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável é superior a 750 ng por μg de proteína total, em especial, superior a 900 ng por μg de proteína total e mais especialmente, superior a 1 μg por μg de proteína total.

[036] O nível de adutos de HNE é determinado através de qualquer método disponível para o técnico no assunto. Por exemplo, o nível de adutos de HNE é determinado através da imuno-monitoração, por exemplo, com o conjunto ELISA competitivo de aduto de HNE OxiSelect™ (CELL BIOLABS).

[037] O termo "proteína total" é entendido como o teor da proteína total da célula de câncer.

[038] O termo "tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável" é entendido como que o nível de adutos de MDA e/ou de adutos de HNE medido após uma etapa do tratamento, in vitro em uma amostra de células de câncer do indivíduo, por exemplo, nas condições descritas na seção experimental, tendo em conta que as doses de um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, de um seu sal farmaceuticamente aceitável que pode ser administrado são de até 60 μM.

[039] O termo "um grupo alquila C1-C7" é entendido como um grupo hidrocarboneto alifático que pode ser linear ou ramificado contendo de 1 a 7 átomos de carbono na cadeia, a menos que especificado de outra maneira. Em especial, os grupos alquila contendo de 1 a 3 átomos de carbono na cadeia (alquila C1-C3). O termo “ramificado” significa que um ou mais grupos alquila tais como a metila, etila ou propila estão ligados a uma cadeia alquila linear. Os grupos alquila exemplares incluem a metila, etila, n-propila, i-propila, n-butila, t- butila, 2,2-dimetilbutila, n-pentila, n-hexila, octila, em especial, a metila.

[040] Em especial, o composto de Fórmula (I) é um composto conforme mencionado acima em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de uma metila, uma fenila, uma benzila, pelo menos, um de X1 ou X2 sendo uma metila ou em que X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam uma piperidina ou uma morfolina.

[041] Mais especialmente, dito composto é selecionado a partir de: - 4-metil-4-(piperidin-1-il)pent-2-inetioato de S-metila; - 4-[benzil(metil)amino]-4-metilpent-2-inetioato de S-metila; - 4-metil-4-[metil(fenil)amino]pent-2-inetioato de S-metila; - 4-metil-4-(morfolin-4-il)pent-2-inetioato de S-metila; e - 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila.

[042] Estes compostos ainda estão descritos na Tabela 1 abaixo.

[043] Em uma realização de preferência, dito composto é o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila.

[044] Estes compostos podem ser preparados de acordo com métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Em especial, estes compostos podem ser preparados a partir da correspondente amina acetilênica tratada sucessivamente por BuLi, COS e MeI. Um processo detalhado de preparação pode ser encontrado, por exemplo, em G.Quash et al., European Journal of Medicinal Chemistry 43 (2008) 906-916, a partir do qual o conteúdo é incorporado como referência, em especial na parte 2 da seção Material e Métodos.

[045] O 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (Número CAS 350229-29-7, peso molecular: 185,29 g.mol-1, Fórmula: C9H15NOS), também conhecido como DIMATE, é um composto de Fórmula (II):

[046] Este composto e o seu processo de preparação estão descritos na patente EP 1.296.946 (em especial, no Exemplo 1), a partir da qual o conteúdo é incorporado como referência.

[047] O termo um "sal farmaceuticamente aceitável" de um composto de Fórmula (I), é entendido como o composto modificado formando os seus sais de ácido ou base. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles tais como o fumarato, fosfato, citrato, cloridrato e similares. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de um composto de Fórmula (I) podem ser sintetizados a partir do composto parental através dos métodos químicos convencionais. Em geral, esses sais podem ser preparados reagindo as formas de ácido ou base livres destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido adequado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois. Em geral, de preferência, são os meios não aquosos tal como o éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila. As listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418

[048] Em especial, o composto de Fórmula (I) é o 4-(dimetilamino)- 4-metilpent-2-inetioato de S-metila e o seu sal farmaceuticamente aceitável é o seu sal de fumarato, isto é, o fumarato de éster de S-metila de ácido 4- (dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico (peso de Fórmula : 301,4 g.mol-1, Fórmula: C13H19NO5S). Este sal de fumarato pode ser preparado a partir de 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila em éter anidro com a adição de uma solução de ácido fumárico em etanol anidro. O sal de mono-fumarato é coletado através da filtração, lavado com o éter e secado.

[049] No âmbito da presente invenção, um composto de aminotioléster, um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o fumarato de éster de S-metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico, será utilizado de maneira intercambiável com o termo “composto, de acordo com a presente invenção”.

[050] Os compostos capazes de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo são conhecidos do técnico no assunto. Em especial, no âmbito da presente invenção, estes compostos são capazes de seletivamente aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, isto é, são os compostos que são capazes de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, mas que, ao mesmo tempo, não aumentam o nível de H2O2 de células não de câncer (isto é, as células normais) desse indivíduo. O uso destes compostos que mostra uma ação seletiva nas células de câncer possibilita evitar os efeitos colaterais, tal como o efeito citostático em células normais. Os compostos capazes de aumentar o nível de H2O2 podem ser selecionados a partir de piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (trióxido de arsênio), doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, cisplatina, clorpromazina, piperlongumina, etoposido, mitoxantrona e partenolida (Deavall et al., (2012), Drug-Induced Oxidative Stress and Toxicity, Journal of Toxicology, 2012, e645460; Pelicano et al., (2003), Inhibition of Mitochondrial Respiration A NOVEL STRATEGY TO ENHANCE DRUG-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN LEUKEMIA CELLS BY A REACTIVE OXYGEN SPECIES-MEDIATED MECHANISM, J. Biol. Chem, 278, 37.832-37.839). Mais especialmente, dito composto é selecionado a partir de pirocianina, 2- metoxiestradiol, rotenona, As2O3, doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, etoposido, mitoxantrona e partenolida. De preferência, dito composto é o As2O3 (trióxido de arsênio) ou a daunorrubicina. Estes compostos estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparados utilizando os métodos bem conhecidos de preparação.

[051] Os termos "tratar", "tratando", "tratado" ou "tratamento", conforme utilizados no presente, se referem ao tratamento terapêutico em que o objetivo é eliminar ou diminuir os sintomas. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados à eliminação de sintomas, alívio de sintomas, redução da extensão da condição, estado de condição estabilizado (isto é, não piora), atraso ou retardamento da progressão da doença, para a prevenção do aparecimento, recorrência ou disseminação de uma doença ou distúrbio, ou de um ou mais de seus sintomas. Em determinadas realizações, os termos se referem ao tratamento com ou administração de compostos fornecidos no presente antes do início dos sintomas. Os termos abrangem a inibição ou redução de um sintoma da doença especial. Os indivíduos com histórico familiar de uma doença em especial são candidatos a regimes de tratamento em determinadas realizações. Além disso, os indivíduos em quem foi demonstrada uma disposição genética para a doença em especial são candidatos a regimes de tratamento em determinadas realizações. Além disso, os indivíduos com histórico de sintomas recorrentes também são candidatos potenciais ao tratamento. A esse respeito, o termo “tratamento” pode ser utilizado de maneira intercambiável com o termo “tratamento profilático”.

[052] Conforme utilizado no presente e a menos que definido de outra maneira, o termo "câncer" se refere ao crescimento, divisão ou proliferação de células anormais no corpo. Os cânceres, de acordo com a presente invenção, são os cânceres nos quais não se observa uma produção de H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle, em especial, os cânceres nos quais não se verifica uma produção de H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e um nível de GSH inferior a 0 5 nmol para 25.000 células. Tais cânceres incluem, mas não estão limitados à leucemia, linfomas, câncer do sangue, câncer da mama (em especial, o TNBC), câncer do pulmão (em especial, o EGFR mutado), melanomas, câncer do cólon, câncer do pâncreas, câncer do ovário, osteossarcoma, câncer do cérebro, câncer da bexiga e câncer gástrico.

[053] Como tal, a presente invenção também se refere a uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila ou um sal farmaceuticamente aceitável e, mais especialmente, o fumarato de éster de S-metila de ácido 4-(dimetilamino)-4- metil-2-pentinetióico, e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para o uso, de acordo com a presente invenção, produtos para o uso de acordo com a presente invenção ou aos métodos, de acordo com a presente invenção, em que o câncer a tratar selecionado a partir de leucemia, linfomas, câncer do sangue, câncer da mama (em especial, o TNBC), câncer do pulmão (em especial, o EGFR mutado), melanomas, câncer do cólon, câncer de pâncreas, câncer de ovário, osteossarcoma, câncer de cérebro, câncer de bexiga e câncer gástrico.

[054] Ainda especialmente, dito câncer é um câncer quimiorresistente e/ou radiorresistente.

[055] O termo "quimiorresistente" é entendido como um câncer, conforme descrito no presente, contra o qual a quimioterapia não funciona ou deixa de funcionar.

[056] O termo "radiorresistente" é entendido como um câncer, conforme descrito no presente, contra o qual a radioterapia não funciona ou para de funcionar.

[057] Em especial, dito câncer é um câncer em que um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou um nível de adutos de HNE superior a 1 μg por μg de proteína total, após o tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) de um seu sal farmaceuticamente aceitável é observado.

[058] Conforme utilizado no presente, o termo "indivíduo" se refere a um animal de sangue quente tal como um mamífero, animal ou humano, em especial, um humano, que é afetado com, ou apresenta o potencial para ser afetado por uma ou mais doenças e condições descritas no presente, e mais especialmente, em quem as células de câncer não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle, e ainda mais especialmente em quem as células de câncer não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e possuem um nível de GSH inferior a 0, 5 nmol para 25.000 células. Ainda especialmente, as células de câncer de dito indivíduo que não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células são as células de câncer quimiorresistentes e/ou radiorresistentes. Ainda mais especialmente, as células de câncer de dito indivíduo que não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle, mais especialmente que ambas não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, também possuem um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou um nível de adutos de HNE superior a 1 μg por μg de proteína total após o tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[059] Os termos “não produzir em excesso”, “sem produção em excesso”, conforme utilizados no presente, descrevem uma situação, em que em uma célula ou tecido paciente, um composto não é produzido em superabundância comparado a uma célula ou tecido de controle correspondente denominado valor de controle. Se refere a uma produção de H2O2 nas células de câncer que não é superior, isto é, inferior ou igual à produção de H2O2 em uma célula ou tecido de controle correspondente denominado valor de controle.

[060] Em especial, a presente invenção, por conseguinte, se refere a uma combinação para o uso, de acordo com a presente invenção, ou aos produtos para o uso, de acordo com a presente invenção, em que dito indivíduo é identificado medindo o nível de H2O2 nas células de câncer de dito indivíduo.

[061] O nível de H2O2, por exemplo, pode ser medido através de qualquer método conhecido pelo técnico no assunto, tal como, por exemplo, determinando o nível de Intensidade de Fluorescência Relativa, o que pode ser realizado, por exemplo, graças ao conjunto de detecção Total de ROS / superóxido (Enzo life science), em especial, conforme medido no leitor de microplacas de fluorescência Appliskan (Thermo Scientific) (Ex / Em = 488/520 nm e Ex / Em = 550/610 nm).

[062] Em especial, a presente invenção, por conseguinte, se refere a uma combinação para o uso, de acordo com a presente invenção, ou aos produtos para o uso, de acordo com a presente invenção, em que dito nível de H2O2 é determinado quantificando o nível de Intensidade de Fluorescência.

[063] Mais especialmente, se refere a uma combinação para o uso, de acordo com a presente invenção, ou aos produtos para o uso, de acordo com a presente invenção, em que dito nível de H2O2 não é superior a um valor compreendido entre 2.000 e 400.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, por exemplo, entre 10.000 e 100.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa ou 15.000 e 100.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, e mais especialmente, um nível de H2O2 não superior a 20.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa, ainda mais especialmente não superior a 21.598 de Intensidade de Fluorescência Relativa.

[064] O técnico no assunto facilmente irá considerar que qualquer outro parâmetro adequado para determinar o nível de H2O2 de células pode ser utilizado em conjunto com a presente invenção.

[065] Consequentemente, quaisquer outros métodos conhecidos pelo técnico no assunto para detectar o nível de H2O2 podem ser utilizados sem se afastarem do âmbito da presente invenção.

[066] Em especial, a presente invenção, por conseguinte, se refere a uma combinação para o uso, de acordo com a presente invenção, ou aos produtos para o uso, de acordo com a presente invenção, em que dito nível de H2O2 é determinado quantificando o nível de Intensidade de Fluorescência graças ao conjunto de detecção de ROS / superóxido total (Enzo Life Science), mais especialmente, conforme medido no leitor de microplacas de fluorescência Appliskan (Thermo Scientific) (Ex / Em = 488/520 nm e Ex / Em = 550/610 nm).

[067] Se o método utilizado na parte experimental for uma determinação do nível de H2O2 pela intensidade média da fluorescência, é novamente declarado que este método não é exclusivo e que o nível de H2O2 pode ser determinado através de qualquer outro método disponível para o técnico no assunto.

[068] O nível de GSH é determinado através de qualquer método disponível para o técnico no assunto. Por exemplo, o nível de GSH é determinado através de luminescência, por exemplo, com o conjunto Promega GSH-Glo (Promega).

[069] O técnico no assunto facilmente irá considerar que qualquer outro parâmetro adequado para determinar o nível de células GSH pode ser utilizado em conjunto com a presente invenção.

[070] Consequentemente, quaisquer outros métodos conhecidos pelo técnico no assunto para detectar o nível de GSH podem ser utilizados sem se afastarem do âmbito da presente invenção.

[071] Em especial, a presente invenção, por conseguinte, se refere ao composto para o uso, de acordo com a presente invenção, em que dito nível de GSH é determinado através de luminescência, mais especialmente, com o conjunto Promega GSH-Glo (Promega).

[072] O nível de adutos de MDA é determinado através de qualquer método disponível para o técnico no assunto. Por exemplo, o nível de adutos de MDA é determinado através da imuno-monitoração, por exemplo, com o conjunto ELISA competitivo de aduto de MDA OxiSelect™ (CELL BIOLABS).

[073] O técnico no assunto facilmente irá considerar que qualquer outro parâmetro adequado para determinar o nível de adutos de MDA de células pode ser utilizado em conjunto com a presente invenção.

[074] Consequentemente, quaisquer outros métodos conhecidos pelos técnicos no assunto para detectar o nível de adutos de MDA podem ser utilizados sem se afastarem do âmbito da presente invenção.

[075] Em uma realização, o nível de adutos de MDA, por conseguinte, é medido após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[076] O nível de adutos de HNE é determinado através de qualquer método disponível para o técnico no assunto. Por exemplo, o nível de adutos de HNE é determinado através da imuno-monitoração, por exemplo, com o conjunto ELISA competitivo de aduto de HNE OxiSelect™ (CELL BIOLABS).

[077] O técnico no assunto facilmente irá considerar que qualquer outro parâmetro adequado para determinar o nível de células de adutos de HNE pode ser utilizado em conjunto com a presente invenção.

[078] Consequentemente, quaisquer outros métodos conhecidos pelo técnico no assunto para detectar o nível de adutos de HNE podem ser utilizados sem se afastarem do âmbito da presente invenção.

[079] Em uma realização, o nível de adutos de HNE, por conseguinte, é medido após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[080] Conforme utilizado no presente, o termo "amostra" significa uma substância de origem biológica. Os exemplos de amostras biológicas incluem, mas não estão limitados às amostras de fluidos corporais e biópsia. Os fluidos corporais incluem o sangue, urina, saliva ou qualquer outra secreção corporal ou seus derivados. Conforme utilizado no presente, o termo "sangue" inclui o sangue total, plasma, soro, células epiteliais circulantes, constituintes ou qualquer derivado de sangue. A amostra biológica, de acordo com a presente invenção, pode ser obtida a partir do indivíduo por qualquer meio adequado de amostragem conhecido do técnico no assunto.

[081] Para determinar o nível de H2O2, o nível de GSH e/ou o nível de adutos de MDA e/ou adutos de HNE nas células de câncer, a amostra em especial, uma biopsia de tumor, por exemplo, de um tumor de leucemia, tumor de linfoma, tumor de sangue, tumor de mama (em especial, o TNBC), tumor de pulmão (em especial, o EGFR mutado), tumor de melanoma, tumor de cólon, tumor de pâncreas, tumor de ovário, tumor de osteossarcoma, tumor cerebral, tumor de bexiga ou tumor gástrico.

[082] Em relação à comparação do nível de H2O2, de preferência, o valor de controle é medido em uma amostra com a mesma origem de tecido que a amostra das células de câncer ou da amostra de câncer e, de maior preferência, em uma amostra da mesma origem de tecido que a amostra. das células de câncer ou a amostra de câncer do mesmo indivíduo.

[083] De preferência, o “valor de controle” corresponde ao nível normal de H2O2.

[084] Como pretendido no presente, um “nível normal” de H2O2 significa que o nível de H2O2 na amostra está dentro dos valores limite de norma de cisalhamento para H2O2. A norma depende do tipo de amostra e do método utilizado para medir o nível de H2O2 na amostra. Em especial, o valor de referência de H2O2, por conseguinte, pode corresponder à ausência ou a um nível basal de H2O2 em células normais, de preferência, do mesmo tecido, e, de maior preferência, do mesmo tecido do mesmo indivíduo ou ao valor de H2O2 nas células de câncer incubadas com o NAC, de preferência, do mesmo tecido e, de maior preferência, do mesmo tecido do mesmo indivíduo.

[085] O NAC é um sequestrador ávido de radicais hidróxi (taxa constante: 1,36X1010M-1, s-1), mas que reage lentamente com o peróxido de hidrogênio (taxa constante: 0,38XM-1, s-1) e não mostra nenhuma reação com o ânion superóxido (Aruoma et al.; Radi Biol Med Livre, (1989). A atividade antioxidante de cisteína de N-acetila: sua reação com o peróxido de hidrogênio, radical hidróxi, ânion superóxido, e ácido hipocloroso: 6, 593-597).

[086] É considerado como um nível estatisticamente inferior ou igual se o nível de H2O2 na amostra de câncer do indivíduo for reduzido para inferior ao nível normal de H2O2 ou for igual ao nível normal de H2O2. Em especial, o nível de H2O2 é considerado estatisticamente inferior se o nível de H2O2 na amostra de câncer do paciente for reduzido por ordem de, pelo menos, 5 ou 10 ou 15 ou 20 ou 25 ou 30 ou 35 ou 40 ou 45 ou 50 ou 60 ou 70 ou 80 ou 90 ou 100 ou 200 ou 300 ou 400 ou 500 ou 600% comparado com o valor de controle do nível de H2O2.

[087] De maneira similar, é considerado que um nível não é produzido em excesso se o nível de H2O2 na amostra de câncer do indivíduo for igual ao nível normal de H2O2 ou for reduzido para inferior ao nível normal de H2O2, mais especialmente, reduzido por ordem de, pelo menos, 5 ou 10 ou 15 ou 20 ou 25 ou 30 ou 35 ou 40 ou 50 ou 60 ou 70 ou 80 ou 90 ou 100 ou 200 ou 300 ou 400 ou 500 ou 600% em comparação com o valor de controle do nível de H2O2.

[088] Um nível é considerado estatisticamente inferior ou igual se o nível de H2O2 na amostra de câncer do indivíduo for igual ao nível de H2O2 nas células de câncer incubadas com o NAC ou reduzido para inferior ao nível de H2O2 nas células de câncer incubadas com o NAC. Em especial, o nível de H2O2 é considerado estatisticamente inferior se o nível de H2O2 na amostra de câncer do paciente for reduzido por ordem de, pelo menos, 5 ou 10 ou 15 ou 20 ou 25 ou 30 ou 35 ou 40 ou 50 ou 60 ou 70 ou 80 ou 90 ou 100 ou 200 ou 300 ou 400 ou 500 ou 600% em comparação com o valor de nível de H2O2 da amostra de câncer incubada com o NAC, de preferência, do mesmo tecido e, de maior preferência, do mesmo tecido do mesmo indivíduo.

[089] De maneira similar, é considerado que um nível não é produzido em excesso se o nível de H2O2 na amostra de câncer do indivíduo for igual ao nível normal de H2O2 ou se for reduzido para inferior ao nível de H2O2 nas células de câncer incubadas com o NAC, mais especialmente, reduzido por ordem de, pelo menos, 5 ou 10 ou 15 ou 20 ou 25 ou 30 ou 35 ou 40 ou 45 ou 50 ou 60 ou 70 ou 80 ou 90 ou 100 ou 200 ou 300 ou 400 ou 500 ou 600% em comparação com o valor de controle de nível de H2O2.

[090] O(s) valor(es) de controle pode(m) ser determinado(s) como um valor único ou um intervalo de valores determinado com base no nível de H2O2 medido em uma população de células de controle, isto é, as células normais, em especial, em uma população de células normais da mesma origem de tecido, tais como as células de câncer e, mais especialmente, do mesmo indivíduo, isto é, de células de câncer incubadas com o NAC, em especial, em uma população de células de câncer incubadas com o NAC, do mesmo tecido, e mais especialmente do mesmo indivíduo.

[091] O valor de controle pode ser um valor predeterminado ou um valor que é determinado em conjunto com o valor de medição.

[092] Normalmente, a população analisada poderia ser dividida em quantis com base no nível medido de H2O2. O valor de controle poderia ser definido como a mediana, ou o segundo tercil, ou o segundo ou terceiro quartil, ou o terceiro ou quarto quintil, e assim por diante.

[093] O valor de controle de H2O2 pode variar dependendo do método utilizado para a medição.

[094] Em uma realização, quando o câncer a tratar é uma leucemia, o valor de referência é determinado utilizando o nível de H2O2 em células HL60. A linhagem de células HL60 é uma linhagem de células de leucemia promielocítica humana bem conhecida do técnico no assunto.

[095] Em especial, em dita realização, o nível de H2O2 é considerado estatisticamente igual ou inferior ou não ser produzido em excesso se “y” não for superior a 2x / 3, “x” é o nível de H2O2 nas células HL60 e "y" é o nível de H2O2 na amostra de câncer do indivíduo.

[096] O(s) valor(es) de controle pode(m) ser determinado(s) como um valor único ou um intervalo de valores que é determinado com base no nível de H2O2 medido em uma população de células de controle, isto é, as células HL60.

[097] Normalmente, a população analisada poderia ser dividida em quantis com base no nível medido de H2O2. O valor de controle pode ser definido como a mediana, ou o segundo tercil, ou o segundo ou terceiro quartil, ou o terceiro ou quarto quintil, e similares. O valor de controle de H2O2 pode variar dependendo do método utilizado para a medição.

[098] O mesmo método de comparação conforme aquele descrito para as células HL60 quando o câncer a tratar é uma leucemia se aplica ao tipo de cânceres mencionados na Tabela 2 abaixo com as seguintes linhagens de células correspondentes como valores referenciados.

[099] A presente invenção ainda se refere a um método para o tratamento de câncer em um indivíduo, em especial, em que as células de câncer de dito indivíduo não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e, em especial, não produzem o H2O2 em excesso em comparação com um valor de controle e possuem um nível de GSH inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, dito método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e, mais especialmente, o fumarato de éster de S- metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico, e um composto capaz de aumentar a Nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo.

[100] Em uma realização, ditas células de câncer de dito indivíduo também é um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou um nível de adutos de HNE superior a 1 μg por μg de proteína total, após o tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[101] Em uma realização, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e, mais especialmente, o fumarato de éster de S-metila do ácido 4-(dimetilamino)- 4-metil-2-pentainióico e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo.

[102] Em uma realização, a presente invenção também se refere a um método para a seleção de um indivíduo que sofre de um câncer e que muito provavelmente irá se beneficiar de um tratamento com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)- 4-metilpent-2-inetioato de S-metila, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que dito método compreende: (a) medir o nível de H2O2 em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; (b) comparar o nível resultante da etapa (a) com um valor de controle; e (c) medir o nível de GSH em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; - em que se: - o nível de H2O2 da amostra de células de câncer de dito indivíduo não é superior ao valor de controle e - o nível de GSH de dita amostra de células de câncer de dito indivíduo é inferior a 0,5 nmol para 25.000 células, - dito método ainda compreende: (d) tratar dito indivíduo com um composto capaz de induzir um nível de H2O2 superior ao valor de controle; (e) verificar se o nível de H2O2 resultante do dito indivíduo é superior ao valor de controle; e (f) tratar dito indivíduo com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[103] Em uma realização, dito método compreende: (a) medir o nível de H2O2 em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; (b) comparar o nível resultante da etapa (a) com um valor de controle; (c) medir o nível de GSH em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; e/ou (c’) medir os adutos de MDA e/ou o nível de adutos de HNE após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I), de acordo com a presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em uma amostra de células de câncer de dito indivíduo; - em que se: - o nível de H2O2 da amostra de células de câncer de dito indivíduo não é superior ao valor de controle, - o nível de GSH de dita amostra de células de câncer de dito indivíduo é inferior a 0,5 nmol para 25.000 células e/ou - o nível de adutos de MDA é superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou o nível de adutos de HNE é superior a 1 μg por μg de proteína, - dito método ainda compreende: (d) tratar dito indivíduo com um composto capaz de induzir um nível de H2O2 superior ao valor de controle; (e) verificar se o nível de H2O2 resultante do dito indivíduo é superior ao valor de controle; e (f) tratar dito indivíduo com um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[104] A verificação se o nível de H2O2 resultante do dito indivíduo é superior ao valor de controle pode ser realizada através dos métodos acima citados anteriormente.

[105] Em especial, os compostos da combinação ou produtos, de acordo com a presente invenção, são administrados separadamente, sequencialmente ou simultaneamente.

[106] Mais especialmente, os compostos da combinação ou produtos de acordo com a presente invenção são administrados sequencialmente, o composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, sendo administrado antes da administração do composto de Fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e, mais especialmente, o fumarato de éster de S- metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2-pentinetióico.

[107] Em uma realização, a combinação para o uso, de acordo com a presente invenção, ou produtos para o uso, de acordo com a presente invenção, consiste em um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em especial, o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e, mais especialmente, o fumarato de éster de S-metila de ácido 4-(dimetilamino)-4- metil-2-pentinetióico, e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo.

[108] Os compostos das combinações, produtos e métodos da presente invenção podem ser preparados por uma variedade de vias sintéticas. Os reagentes e materiais de partida estão comercialmente disponíveis, ou são facilmente sintetizados através das técnicas bem conhecidas por um técnico no assunto.

[109] A identificação dos indivíduos que necessitam de tratamento das doenças e condições descritas no presente é conduzida conforme mencionado acima e está bem dentro da capacidade e conhecimento de um técnico no assunto. Um técnico no assunto médico facilmente pode identificar, através das técnicas mencionadas acima, os indivíduos que necessitam de tal tratamento.

[110] Uma quantidade terapeuticamente eficaz facilmente pode ser determinada pelo diagnosticador assistente, tal como um técnico no assunto, através do uso de técnicas convencionais e através da observação de resultados obtidos em circunstâncias análogas. Na determinação da quantidade terapeuticamente eficaz, uma série de fatores é considerada pelo diagnosticador assistente, incluindo, mas não limitado: às espécies de indivíduo; seu tamanho, idade e estado geral de saúde; a doença específica envolvida; o grau de envolvimento ou a gravidade da doença; a resposta do indivíduo individual; o composto especial administrado; o modo de administração; a característica de biodisponibilidade da preparação administrada; o regime de dose selecionado; o uso de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes.

[111] Conforme utilizado no presente, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade que é eficaz na redução, eliminação, tratamento ou controle dos sintomas das doenças e condições descritas no presente. O termo "controle" pretende se referir a todos os processos em que pode existir um melhoramento, interrupção, detenção ou paragem da progressão das doenças e estados descritos no presente, mas não indica necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas de doença e condição e pretende incluir o tratamento profilático e uso crônico.

[112] A quantidade dos compostos da combinação, produtos ou métodos, de acordo com a presente invenção, que é necessário para alcançar o efeito biológico desejado, irá variar dependendo de uma série determinada de fatores, incluindo a dosagem da droga a administrar, as características químicas (por exemplo, a hidrofobicidade) dos compostos utilizados, a potência dos compostos, o tipo de doença, o estado patológico do paciente e a via de administração.

[113] Os compostos fornecidos no presente podem ser formulados em composições farmacêuticas, conforme mencionado acima, através da mistura com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[114] Conforme utilizado no presente, um "excipiente farmaceuticamente aceitável" se refere às entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um mamífero, especialmente, um humano, conforme adequado. Um excipiente farmaceuticamente aceitável se refere a um material sólido, semissólido ou líquido não tóxico, diluente, material de encapsulação ou formulação auxiliar de qualquer tipo.

[115] Tais composições podem ser preparadas para o uso em administração oral, especialmente na forma de comprimidos ou cápsulas, em especial, os comprimidos orodispersíveis (lyoc); ou administração parenteral, especialmente na forma de soluções, suspensões ou emulsões líquidas.

[116] Pode ser preparada através de qualquer um dos métodos bem conhecidos no estado da técnica farmacêutica, por exemplo, conforme descrito em Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 20a ed; Gennaro, A. R, Ed; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. Os agentes aglutinantes e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis podem ser incluídos como parte da composição. As composições orais, em geral, irão incluir um veículo de diluente inerte ou um veículo comestível. Podem ser administrados em formas de dosagem unitária, em que o termo “dose unitária” significa uma dose única que é capaz de ser administrada a um paciente, e que pode ser facilmente manipulada e embalada, permanecendo como uma dose unitária fisicamente e quimicamente estável que compreende o próprio composto ativo, ou como uma composição farmaceuticamente aceitável, conforme descrito a seguir.

[117] Os comprimidos, pílulas, pós, cápsulas, trociscos e similares podem conter um ou mais de qualquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de natureza similar: um aglutinante tal como a celulose microcristalina ou goma de tragacanto; um diluente tal como o amido ou lactose; um desintegrante, tais como os derivados de amido e celulose; um lubrificante tal como o estearato de magnésio; um deslizante, tal como o dióxido de silicone coloidal; um agente edulcorante, tal como a sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante tal como a hortelã-pimenta ou salicilato de metila. As cápsulas podem estar na forma de uma cápsula dura ou cápsula macia, que em geral, são produzidas a partir de misturas de gelatina, opcionalmente misturadas com os plastificantes, bem como uma cápsula de amido. Além disso, as formas de dosagem unitária podem conter diversos outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, os revestimentos de açúcar, goma laca ou agentes entéricos. Outras dosagens orais formam o xarope ou elixir que podem conter os agentes edulcorantes, conservantes, corantes, colorantes e aromatizantes. Além disso, os compostos ativos podem ser incorporados em preparações e formulações rapidamente dissolvidas, de liberação modificada ou de liberação prolongada, e em que tais formulações de liberação sustentada, de preferência, são bimodais.

[118] As preparações líquidas para administração incluem as soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. As composições líquidas também podem incluir os aglutinantes, tampões, conservantes, agentes quelantes, agentes edulcorantes, aromatizantes e colorantes e similares. Os solventes não aquosos incluem os álcoois, propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tal como óleo de oliva e ésteres orgânicos tais como o oleato de etila. Os veículos aquosos incluem as misturas de álcoois e água, meio tamponado e soro fisiológico. Em especial, o polímero de láctido biodegradável, biocompatível, copolímero de láctido biodegradável / glicólido ou copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno podem ser excipientes úteis para controlar a liberação do composto ativo. Os veículos intravenosos podem incluir os reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, tais como aqueles à base de dextrose de Ringer e similares.

[119] Os exemplos de modos de administração incluem a parentérica, por exemplo, a administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, bem como a oral. Em especial, inclui uma formulação como um comprimido para a administração oral ou como um pó para a solução injetável para a administração intravenosa.

[120] No âmbito da presente invenção, deve ser entendido que “uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para “o uso” é equivalente ao “uso de uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo” e em especial que “uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para o uso no tratamento” é equivalente ao “uso de uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para o tratamento de” e ao “uso de uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo, para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento”. O mesmo se aplica aos produtos para o uso, de acordo com a presente invenção.

[121] A presente invenção ainda será ilustrada pelas Figuras e Exemplos seguintes. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[122] Figura 1: Correlação de IC50 de H2O2 / 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila: relação entre IC50 e 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila em uM e os níveis de atividade de H2O2 endegênio nas células de câncer.

[123] Figura 2: Correlação IC50 de H2O2 / 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila: Determinação de um cisalhamento.

[124] Figura 3: Correlação IC50 de H2O2 / 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila: Estudos por origem em tecidos.

[125] Figuras de 4 a 6: Correlação IC50 de H2O2 / 4-(dimetilamino)- 4-metilpent-2-inetioato de S-metila: indução de sensibilidade de 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila aumentando a atividade de H2O2 (PCN = piocianina) em três linhagens de células de câncer: THP-1, HCC827 e Hop62.

[126] Figura 7: Correlação IC50 de H2O2 / 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila: efeito sinérgico de 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila e as drogas indutores de H2O2: trióxido de arsênio (AS2O3) (ATO) a 1 μM e Doxorubicina (Doxo) a 200 nM.

[127] Figura 8: Tratamento de combinação utilizando o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila e agente indutor de H2O2, Cisplatina (CPPD) ou Doxorubicina (Doxo), em um contexto em que as células de câncer Colo357 possuem um nível de GSH superior de 5 nmol para 25.000 células.

[128] Figura 9: Nível total de GSH em nmol por 25.000 células observadas em células sensíveis e resistentes.

[129] Figura 10: Quantificação dos adutos de MDA e HNE em células sensíveis de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (HL-60, NT2 / D1) (A) e células resistentes 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S- metila (MSC) tratadas com o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila de 5 ou 10 μmol.L-1 durante 24 horas (B).

[130] Nota: em todas as Figuras mencionadas acima: o DIMATE é fornecido para 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila.

EXEMPLOS MATERIAL E MÉTODOS LINHAGENS DE CÉLULAS

[131] Um painel de 52 células tumorais humanas representando 10 tipos de tecido foi selecionado para abranger um amplo conjunto de oncogenes diferentes e de acordo com a sua resposta a diferentes quimioterapêuticos padrão. As células foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC), da Coleção Europeia de Culturas Celulares (ECACC) e da cultura primária de células de câncer derivadas de tumores de pacientes (Instituto de Pesquisa de Vall d'Hebron (VHIR), Barcelone, Espanha; Instituto de Oncologia de Vall d'Hebron (VHIO), Barcelone, Espanha; Oncotest, Friburgo, Alemanha; Oncodesign, Dijon, França; Universitá Degli Studi di Palermo, Oncologia e Ciências Cirúrgicas, Palermo, Itália e Instituto de Medicina Preditiva e Personalizada de Câncer (IMPPC), Barcelona, Espanha (Vlde Tabela 3 para descrição do painel de células tumorais) Todas as células foram cultivadas em meios adequados, de acordo com as recomendações do fornecedor.

[132] A intensificação da sensibilidade da linhagem de células ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila foi realizada utilizando uma linhagem de células selecionada devido à sua resistência ao 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila. As linhagens de células de câncer do pulmão (HCC827, Hop62) e as linhagens de células de leucemia (THP-1) foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC), Coleção Europeia de Culturas Celulares (ECACC). As células foram cultivadas em meios adequados de acordo com as recomendações do fornecedor.

ANÁLISE DE VIABILIDADEDE CÉLULAS, FORMATO DE 96 CAVIDADES

[133] As células foram semeadas em placas de cultura de células de 96 cavidades nas concentrações necessárias para assegurar cerca de 80% de confluência no controle (células não tratadas) no término da experiência (0,5x 104 - 5x 104 células / cavidades). A sensibilidade para o 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila foi determinada utilizando concentrações diferentes da droga (de 0,01 a 100 μM). Após 48 horas, o efeito inibidor do crescimento da droga foi analisado utilizando a Rezasurina, de acordo com a instrução do fabricante. Para garantir uma boa qualidade dos dados e minimizar o impacto dos erros de pipetagem, cada concentração específica da droga foi avaliada com base na intensidade média de fluorescência de 8 cavidades separadas. A resposta da droga foi quantificada pela metade da concentração inibidora mínima (IC50) para cada linhagem de células especial e determinada através da análise de regressão não linear de curvas log-dose / resposta. O valor de cisalhamento para a resistência ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila foi determinado estatisticamente (> 2 S.D. acima da média geométrica de IC50). O valor limiar in vitro para a hipersensibilidade à droga foi definido como < média geométrica de IC50.

INTENSIFICAÇÃO DA SENSIBILIDADE DAS CÉLULAS AO 4-(DIMETILAMINO)-4- METILPENT-2-INETIOATO DE S-METILA, AUMENTANDO O NÍVEL DE H2O2

[134] Em uma experiência diferente, as células que mostraram resistência ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (THP-1, HCC827 e Hop62) foram induzidas com o indutor de H2O2. As células foram semeadas conforme descrito acima e incubadas com o 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila (a partir de 0,01 a 100 μM) isoladamente ou 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila em combinação com o indutor de H2O2, Pyocyanin (40). Após 48 h de incubação, a viabilidade celular foi medida utilizando a análise de Rezasurina, conforme descrito acima.

[135] Os agentes quimioterapêuticos que são conhecidos por induzir o H2O2 nas células foram induzidos em associação com o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila para tratar as células resistentes ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (THP-1). As células foram semeadas conforme descrito acima e incubadas com o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (5, 10, 15, 30 μM) isoladamente ou com outras drogas utilizadas em quimioterapia e conhecido como indutor de H2O2 tal como 2-metoxiestradiol (2-ME 100 μM), trióxido de arsênio (ATO 1 μM), daunorrubicina (40 nM), doxorrubicina (20 nM), etoposido (500 nM), mitoxantrona (50 nM), partenolídeo (100 nM) e piperlongumina (2 μM). Após 48 horas de incubação, a viabilidade celular foi medida utilizando a análise de Rezasurina, conforme descrito acima.

MEDIÇÃO DA PRODUÇÃO DE H2O2

[136] A produção intracelular de H2O2 em células vivas foi medida utilizando o conjunto de detecção Total ROS / superóxido (Enzo life science), seguindo as instruções do fabricante. A análise utiliza sondas específicas de H2O2 / RNS que, após a reação com o H2O2 e espécies de RNS, são oxidadas rapidamente para os compostos altamente fluorescentes. A intensidade de fluorescência é proporcional aos níveis totais de H2O2 / RNS dentro da amostra. Os testes experimentais foram realizados utilizando as células não tratadas, ou células tratadas com o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (de 1 a 5 uM), veículo HEPES, pirocianina indutora de H2O2, (PCN, 500 uM) ou N- acetil-L-cisteína inibidora de H2O2. (NAC) [10mM]. No dia anterior à análise, as células foram semeadas em placas de fundo preto / claro de 96 cavidades a uma densidade de 2 x 104 em meio de cultura de acordo com as instruções dos fornecedores de células, suplementadas com o FBS (10% v/v), 10 unidades de penicilina / mL e 100 mg de estreptomicina. As células foram mantidas a 37° C em uma atmosfera úmida de 95% de ar: 5% de CO2 durante a noite. No dia da análise, o meio de células foi substituído por 100 de meio livre de fenol suplementado como acima, sem nenhum tratamento, com o 4-(dimetilamino)-4- metilpent-2-inetioato de S-metila durante 6 horas, veículo HEPES durante 6 horas, ou com os diferentes agentes de controle de PCN e NAC durante 20 min. Após o período de incubação, as cavidades foram carregadas com 100 μL de Solução de Detecção de H2O2, contendo o respectivo agente de tratamento ou controlos e incubadas durante 60 min a 37° C no escuro. Diversas cavidades ficaram sem células para as medições de controle de fluorescência de fundo. As placas foram lidas utilizando um leitor de microplacas de fluorescência Appliskan (Thermo Scientific) (ex = 560 nm, Em = 600). Os dados são expressos como a mudança nas unidades de fluorescência arbitrárias produzidas a partir da quantidade igual de células e normalizadas para a entrada total de proteína.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[137] Os valores são expressos como média ± SD ou frequências e proporções. As diferenças entre os grupos foram determinadas pelo teste t não pareado, teste do qui-quadrado, teste exato de Fisher ou ANOVA, quando adequado. O P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise foi realizada utilizando a versão 5.0 do GraphPad prism (software GraphPad, San Diego, Califórnia, EUA) e a versão 12.01 do software JMP (SAS Institute Inc, Carolina do Norte, EUA).

MEDIÇÃO DA PRODUÇÃO DE GSH

[138] As células foram semeadas em placas de fundo preto de 96 cavidades (5 x 104 células / mL) e incubadas durante a noite para a fixação. As células foram tratadas com o veículo, DMSO, BCNU 100, 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila a 20 μM, durante 24 horas. A glutationa total foi medida de acordo com as instruções do conjunto (GSH-Glo™, Promega) e os resultados foram obtidos para 25.000 células.

DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE ADUTOS DE PROTEÍNA HNE E PROTEÍNA / MDA /POR ELISA

[139] A formação de adutos de HNE e adutos de MDA foi quantificada com o conjunto Elisa Oxiselect de aduto de HNE (Cell Biolabs, San Diego, CA) e o conjunto Elisa OxiSelect de aduto MDA (Cell Biolabs), respectivamente. Resumidamente, após um tratamento com o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila durante 24 horas, as células foram lisadas através de sonicação em tampão de amostra de redutor de SDS. Os homogenatos foram diluídos para 10 μg de proteína / mL e adsorvidos em placas de ligação de proteínas de 96 cavidades através da incubação a 37° C durante, pelo menos, 2 horas. As cavidades foram lavadas duas vezes com o PBS e incubadas durante mais 2 horas à temperatura ambiente em um agitador orbital. Após três lavagens em PBS, 100 μl de anticorpo de anti-HNE ou anticorpo de anti-MDA foram adicionados às cavidades e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. Posteriormente, foi adicionado o conjugado de anticorpo secundário de cabra anti-coelho-HRP (diluído 1/1000 com o diluente da análise) e a incubação continuou durante 1 hora. As cavidades foram lavadas cinco vezes em PBS e foi adicionado o substrato de HRP. A reação foi interrompida com uma solução ácida e a absorbância foi lida em um leitor de microplacas a 450 nm. O nível de adutos de HNE e de adutos de MDA foi determinado através da comparação com uma curva padrão preparada a partir de padrões de HNE-BSA e MDA-BSA fornecidos pelo fabricante.

RESULTADOS

[140] Os resultados obtidos são mostrados nas Figuras de 1 a 10.

[141] A Figura 1 mostra que é observada uma correlação entre a atividade de H2O2 e o IC50 (monitoração por conjunto de detecção de ROS Total / superóxido, conforme mencionado acima).

[142] Além disso, a Figura 2 mostra que ao separar as células em duas partes com um cisalhamento (20.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa), uma distinção de sensibilidade de 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila de H2O2 elevada de H2O2 baixo é ilustrada (valor P <0.05).

[143] Na Figura 3, a correlação entre a atividade de H2O2 e IC50 é ilustrada por origem no tecido.

[144] Além disso, as Figuras de 4 a 6 e a Tabela 4 abaixo mostram a indução de sensibilidade ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S- metila utilizando o pré-tratamento com a piocianina em um contexto em que as células de câncer possuem um nível de GSH inferior a 5 nmol para 25.000 células. - DIMATO: 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila PCN: piocianina

[145] A indução de sensibilidade ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent- 2-inetioato de S-metila foi demonstrada utilizando o pré-tratamento com a piocianina 40 uM. A exposição celular à piocianina causa um aumento de duas vezes nos níveis de H2O2 sem afetar a viabilidade celular.

[146] A Figura 7 mostra um efeito sinérgico com o 4- (dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer, mesmo em células resistentes a esses compostos separadamente.

[147] Além disso, os resultados sinérgicos também foram mostrados com o tratamento combinado com o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila e os agentes quimioterápicos conhecidos por induzir o H2O2 em células resistentes THP-1 ao4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S- metila, conforme mostrado na Tabela 5 abaixo. - DIMATO: 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila

[148] A Figura 8 se refere ao tratamento de combinação utilizando o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila e agente indutor de H2O2, Cisplatina (CPPD) ou Doxorrubicina (Doxo), em um contexto em que as células de câncer Colo357 possuem um nível de GSH superior a 5 nmol para 25.000 células (ao contrário do que foi mostrado anteriormente).

[149] Mostra na Figura 8 (A) que o tratamento utilizando o CPPD a 20 μmol.L-1 e Doxo a 25 μmol.L-1 aumenta significativamente o nível de H2O2 na linhagem celular Colo357 (respectivamente 200% e 10.000%), mas que, conforme mostrado na Figura 8 (B) nenhum efeito foi observado na viabilidade.

[150] As Figuras 9 e 10 ilustram como os limiares relativos aos adutos de GSH, MDA e adutos de HNE foram determinados.

[151] Na Figura 9, o nível total de GSH em nmol por 25.000 células é observado em células sensíveis e resistentes. Uma diferença significativa (***, p-valor <0,001) foi observada. Utilizando um limiar de 0,5 nmol por 25.000 células para a distinção de GSH elevado das células baixas de GSH, 100% das células sensíveis são GSH baixas e 100% das células resistentes são GSH elevadas.

[152] A Figura 10 mostra a quantificação do aduto de MDA e HNE em células sensíveis ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S-metila (HL- 60, NT2 / D1) (A) e células resistentes ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila (MSC) tratadas com o 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2- inetioato de S-metila de 5 ou 10 μmol.L-1 durante 24 horas (B). Para os adutos de MDA, em células sensíveis ao 4-(dimetilamino)-4-metilpent-2-inetioato de S- metila, o limiar é superior a 100 ng por μg de proteína total e, em células resistentes, o limiar é inferior a este limiar. Para os adutos de HNE, a mesma observação pode ser realizada com um limiar de 1 μg por μg de proteína total.

Claims (11)

1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um composto de Fórmula (I): em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila, ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo selecionado a partir de piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (trióxido de arsênio), doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, mitoxantrona e partenolida.

2. USO DE UMA COMBINAÇÃO, que compreende um composto de Fórmula (I): em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila, ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo selecionado a partir de piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (trióxido de arsênio), doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, mitoxantrona e partenolida, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

3. MÉTODO PARA A SELEÇÃO DE UM INDIVÍDUO, que sofre de um câncer e que provavelmente irá se beneficiar de um tratamento com uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I): em que X1 e X2, idênticos ou diferentes, são selecionados a partir de um grupo alquila C1-C7, uma fenila, uma benzila, ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um heterociclo, em especial, uma piperidina ou uma morfolina; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo selecionado a partir de piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (trióxido de arsênio), doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, mitoxantrona e partenolida, caracterizado pelo dito método compreender: (a) medir o nível de H2O2 em uma biópsia de células de câncer de dito indivíduo; (b) comparar o nível resultante da etapa (a) com o nível de H2O2 em células normais originadas a partir do mesmo tecido do mesmo indivíduo que as células de câncer; e (c) medir o nível de GSH em uma biópsia de células de câncer de dito indivíduo; em que: - um nível de H2O2 de dita biópsia de células de câncer de dito indivíduo não superior ao nível de H2O2 em células normais originadas a partir do mesmo tecido do mesmo indivíduo que as células de câncer, e - um nível de GSH de dita biópsia de células de câncer de dito indivíduo inferior a 5 nmol para 25.000 células, indica que o indivíduo é susceptível de se beneficiar de um tratamento com uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo selecionado a partir de piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (trióxido de arsênio), doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, mitoxantrona e partenolida.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender: (a) medir o nível de H2O2 em uma biópsia de células de câncer de dito indivíduo; (b) comparar o nível resultante da etapa (a) com o nível de H2O2 em células normais originadas a partir do mesmo tecido do mesmo indivíduo que as células de câncer; (c) medir o nível de GSH em uma biópsia de células de câncer de dito indivíduo; e (d) medir o nível de adutos de MDA e/ou de adutos de HNE após um tratamento in vitro com um composto de Fórmula (I) em uma biópsia de células de câncer de dito indivíduo; em que: (e) um nível de H2O2 de dita biópsia de células de câncer de dito indivíduo não superior ao nível de H2O2 em células normais originadas a partir do mesmo tecido do mesmo indivíduo que as células de câncer, (f) um nível de GSH de dita biópsia de células de câncer de dito indivíduo inferior a 5 nmol para 25.000 células, e (g) um nível de adutos de MDA superior a 75 ng por μg de proteína total e/ou um nível de adutos de HNE superior a 1 μg por μg de proteína, indica que o indivíduo é susceptível de se beneficiar de um tratamento com uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo selecionado a partir de piocianina, 2-metoxiestradiol, rotenona, As2O3 (trióxido de arsênio), doxorrubicina, daunorrubicina, AZT, diclofenaco, paracetamol, clorpromazina, piperlongumina, mitoxantrona e partenolida.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado por um nível de H2O2 não superior a 20.000 de Intensidade de Fluorescência Relativa indicar que o indivíduo é susceptível de se beneficiar de um tratamento com uma combinação que compreende um composto de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um composto capaz de aumentar o nível de H2O2 nas células de câncer de um indivíduo.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo nível de GSH ser determinado através de luminescência.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pelo nível de adutos de MDA e/ou nível de adutos HNE MDA ser determinado através da imuno-monitoração.

8. USO, de acordo com a reivindicação 2, ou MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir de leucemia, linfomas, câncer do sangue, câncer da mama (em especial, TNBC), câncer do pulmão (em especial, EGFR mutado), melanomas, câncer do cólon, câncer do pâncreas, câncer do ovário, osteossarcoma, câncer do cérebro, câncer de bexiga e câncer gástrico.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 8, ou MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado por no dito composto de Fórmula (I), X1 e X2, idênticos ou diferentes, serem selecionados a partir de uma metila, uma fenila, uma benzila, em que pelo menos um de X1 ou X2 é uma metila ou X1 e X2 em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam uma piperidina ou uma morfolina.

10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 8 ou 9, ou MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo dito composto de Fórmula (I) ser 4-(dimetilamino)-4-metilpent- 2-inetioato de S-metila ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. USO, de acordo com a reivindicação 10, ou MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo dito sal farmaceuticamente aceitável ser fumarato de éster de S-metila de ácido 4-(dimetilamino)-4-metil-2- pentinetióico.