ES2921989T3 - Terapia con inhibidores de glutaminasa - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen métodos para tratar a un sujeto que tiene una vía NRF2/KEAP1 alterada, y compuestos y composiciones útiles en dicho tratamiento. También se describen en este documento métodos para evaluar si administrar un compuesto que inhibe la producción de glutatión o un inhibidor de glutaminasa a un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia con inhibidores de glutaminasa

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de Estados Unidos 14/791.284 presentada el 3 de julio de 2015, que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 62/020.519, presentada el 3 de julio de 2014; y de la solicitud de Estados Unidos Núm. 14/791.206, presentada el 2 de julio de 2015, que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 62/020.524, presentada el 3 de julio de 2014; y de la solicitud de Estados Unidos Núm. 14/791.186, presentada el 2 de julio de 2015, que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 62/020.539, presentada el 3 de julio de 2014; y de las solicitudes provisionales de Estados Unidos Núm. 62/020.731, presentada el 3 de julio de 2014; y 62/187.160 presentada el 30 de junio de 2015.

La desregulación metabólica es un sello distintivo del cáncer, ya que los tumores exhiben una mayor demanda de nutrientes y macromoléculas para alimentar su rápida proliferación. La glutamina (Gln), el aminoácido más abundante en la circulación desempeña un papel esencial en el suministro de los intermedios biosintéticos necesarios para apoyar la proliferación y la supervivencia de las células cancerosas. Específicamente, la glutaminólisis, o la conversión enzimática de glutamina en glutamato, proporciona a las células cancerosas en proliferación una fuente de nitrógeno para la síntesis de aminoácidos y nucleótidos, y un esqueleto de carbono para impulsar la síntesis de ATP y NADPH a través del ciclo TCA.

Además de apoyar el crecimiento celular, el metabolismo de la glutamina juega un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis rédox celular, ya que el glutamato se puede convertir en glutatión, el principal antioxidante intracelular. Las células cancerosas requieren una fuente constante de biomasa y macromoléculas para apoyar la división celular y agentes reductores para mantener la homeostasis rédox. Si bien muchos de estos componentes básicos se obtienen a través de la glucólisis aeróbica, muchas células cancerosas han desarrollado una dependencia del metabolismo de la glutamina para su crecimiento y supervivencia.

El metabolismo de la glutamina, es decir, la glutaminólisis está regulada por la glutaminasa mitocondrial (GLS), la enzima limitante de la velocidad que cataliza la conversión de glutamina en glutamato y amoníaco. Las células de mamífero contienen dos genes que codifican la glutaminasa: las enzimas de tipo renal (GLS-1) y de tipo hepático (GLS-2). Cada una ha sido detectada en múltiples tipos de tejidos, estando GLS-1 ampliamente distribuida por todo el organismo. La GLS-1 es una enzima activada por fosfato que existe en seres humanos como dos variantes principales de corte y empalme, una forma larga (denominada KGA) y una forma corta (GAC), que difieren solo en sus secuencias C-terminales. Se cree que ambas formas de GLS-1 se unen a la membrana interna de la mitocondria en células de mamíferos, aunque al menos un informe sugiere que la glutaminasa puede existir en el espacio intramembrana, disociada de la membrana. La GLS se expresa de manera anormalmente alta con frecuencia en tumores humanos y se ha demostrado que está regulada positivamente por oncogenes tales como Myc. De acuerdo con la dependencia observada de las líneas celulares de cáncer en el metabolismo de la glutamina, la inhibición farmacológica de GLS ofrece el potencial para elegir como diana los tumores adictos a Gln. Sin embargo, tal tratamiento dirigido se ve obstaculizado por la falta de biomarcadores clínicos para identificar poblaciones de pacientes sensibles.

Singh et al 'Disfunctional KEAP1-NRF2 interactions en non-small cell lung cancer: PLOS Medicine, vol 3, núm. 10, octubre de 2006, páginas 1865-1876 describen que la interacción disfuncional KEAP1-NRF2 se observa con frecuencia en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. La pérdida de la función KEAP1 conduce a la activación de la expresión génica mediada por NRF2 en las células cancerosas.

Por lo tanto, existe la necesidad de un medio para identificar marcadores y mecanismos que proporcionen un método para evaluar el éxito del tratamiento de un paciente con inhibidores de glutaminasa, así como métodos para tal tratamiento.

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de biomarcadores y mecanismos que indican la respuesta positiva de un paciente con cáncer al tratamiento con inhibidores de glutaminasa y métodos para tratar a tales pacientes. Por consiguiente, en un aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende evaluar la administración de un compuesto que inhibe la producción de glutatión a un sujeto determinando la presencia de ciertos biomarcadores o mecanismos y administrar tal compuesto al paciente. En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación también comprende métodos de tratamiento de pacientes identificados por la presencia de los biomarcadores o mecanismos. En todo momento, el término 'método de tratamiento' debe interpretarse como compuestos/composiciones/medicamentos para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón en el organismo humano.

En un aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende un método de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento que comprende administrar un compuesto que inhibe la producción de glutatión a un sujeto. El método comprende opcionalmente obtener una muestra biológica de un sujeto, determinar que la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, o que la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, o determinar la presencia de una mutación de pérdida de función en KEAP1 o una mutación de ganancia de función en NRF2 de dicho sujeto, o un aumento en la concentración intracelular de glutatión en dicho sujeto y determinar que se debe administrar al sujeto el compuesto que inhibe la producción de glutatión.

En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende un método para tratar a un sujeto que necesita tratamiento. El método comprende determinar que la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, que la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, que el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de pérdida de función en KEAP1 o una mutación de ganancia de función en NRF2, o determinar un aumento en la concentración intracelular de glutatión en dicho sujeto y administrar al sujeto un inhibidor de glutaminasa. El sujeto que necesita tratamiento puede padecer cáncer de pulmón. El inhibidor de glutaminasa puede ser, por ejemplo, un inhibidor de GLS-1 o un inhibidor selectivo de GLS-1.

Según una realización de la invención, la invención comprende un inhibidor de glutaminasa según las reivindicaciones para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, en donde el sujeto tiene: una vía NRF2/KEAP1 desregulada; señalización hiperactiva de NRF2; una mutación de pérdida de función en el ácido nucleico de KEAP1; una mutación de ganancia de función en el ácido nucleico de NRF2; o un aumento en la concentración intracelular de glutatión.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras divulgan estudios con un compuesto IACS-011393; dicho compuesto es un ejemplo de referencia y queda fuera del alcance de la invención.

La Figura 1 muestra la inhibición de GLS por IACS-011393. La Figura 1A muestra la inhibición de GAC por concentraciones variables de IACS-011393. La Figura 1B muestra el acoplamiento a la diana medido después del tratamiento con IACS-011393. La Figura 1C muestra que las células A549 utilizan anaplerosis de glutamina para impulsar la respiración. La Figura 1D muestra las diferentes sensibilidades de diferentes líneas de CPCNP a IACS-011393.

La Figura 2 muestra las alteraciones metabólicas en respuesta a IACS-011393. La Figura 2A muestra los resultados del análisis metabólico de las células A549 y H727 tratadas con IACS-0113931 pM durante 24 horas. La Figura 2B muestra que la inhibición de glutaminasa por IACS-011393 evita la conversión de glutamina en glutatión. La Figura 2C muestra una representación esquemática de la incorporación de carbonos de 13C-Glutamina completamente marcada a glutatión en ausencia o presencia de GLSi, IACS-011393.

La Figura 3 muestra que las mutaciones en la vía Keap1/Nrf2, un importante regulador del equilibrio rédox, predicen la sensibilidad a GLSi en modelos preclínicos de CPCNP. La Figura 3A muestra la sensibilidad diferencial a IACS-011393 predicha por el estado de Keap1/Nrf2. La Figura 3B muestra que las mutaciones en las líneas celulares respondedoras caen dentro de importantes dominios funcionales de Keap1 y Nrf2. La Figura 3C muestra que el acoplamiento a la diana se observa tanto en las líneas celulares respondedoras como en las no respondedoras, aunque las líneas celulares respondedoras son hiperdependientes de la glutaminólisis mediada por GLS, mientras que las líneas no respondedoras dependen menos de este proceso.

La Figura 4 muestra que la dependencia de GLS está impulsada por la adicción al mantenimiento rédox mediado por glutatión en líneas celulares mutantes Keap1/Nrf2. La Figura 4A muestra que los niveles de glutatión disminuyen después del tratamiento con IACS-011393 en las líneas celulares respondedoras. La Figura 4B muestra que la pérdida de glutatión después del tratamiento con un inhibidor de glutaminasa conduce a una acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares. La Figura 4C muestra que la acumulación de daños en el ADN después del tratamiento con IACS-011393 puede recuperarse mediante la aplicación de glutatión que puede penetrar en las células. La Figura 4D muestra que la aplicación de glutatión exógeno a las líneas celulares respondedoras rescata los defectos de proliferación inducidos por IACS-011393.

La Figura 5 muestra que la resistencia adquirida a IACS-011393 se obtiene cuando las células activan mecanismos alternativos para mantener el equilibrio rédox. La Figura 5A muestra que las células tratadas crónicamente con GLSi adquieren resistencia a IACS-011393. La Figura 5B muestra que los clones resistentes a GLSi muestran activación de vías alternativas para mantener el equilibrio rédox. La Figura 5C muestra que los clones resistentes a GLSi muestran perfiles transcripcionales alterados para producir fuentes alternativas de glutamato y poder reductor. La Figura 5D muestra una descripción general de la adaptación adquirida a la inhibición de la glutaminasa.

La Figura 6 muestra que la hiperactivación de NRF2 impulsa la dependencia de la síntesis de glutatión mediada por GLS para mantener el equilibrio rédox.

Descripción detallada

La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo. La presente invención se refiere a un inhibidor de glutaminasa para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, en donde la vía NRF2/KEAP1 en las células cancerosas está desregulada y en donde el inhibidor de glutaminasa se selecciona entre:

N,N'-(5,5'-(2,2'-sulfonilbis(etano-2,1-diil))bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-(piridin-2-il)acetamida),

N-metil-1-{4-[6-(2-{4-[3-(trifluorometoxi)fenil]piridin-2-il}acetamido)piridazin-3-il]butil}-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

1-(2-fluoro-4-(5-(2-(piridin-2-il)acetamido)-1,3,4-tiadiazol-2-il)butil)-N-((4-(trifluorometil)piridin-2-il)metil)-1 H-1.2.3- triazol-4-carboxamida,

1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

N-(piridin-2-ilmetil)-5-(3-(6-(2-(3-(trifluorometoxi)fenil)acetamido)piridazin-3-il)pirrolidin-1-il)-1,3,4-tiadiazol-2-carboxamida,

(R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(3-(trifluorometoxi)fenil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(6-metil-4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4- carboxamida,

(R)-1-(4-(6-(2-(4-(ciclopropildifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1 -(2-fluoro-4-(6-(2-(1 -(3-(trifluorometoxi)fenil)-1 H-imidazol-4-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1.2.3- triazol-4-carboxamida,

1-(4-(6-(2-(4-ciclobutoxipiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

1-(4-(6-(2-(4-ciclobutoxipiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

1- (4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(4-(6-(2-(4-ciclopropilpiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

5- (3-(6-(2-(piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)pirrolidin-1 -il)-N-((4-(trifluorometil)piridin-2-il)metil)-1,3,4-tiadiazol-2- carboxamida, y

N,N'-(5,5'-(ciclohexano-1,3-diil)bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-fenilacetamida), o una de sus sales.

La invención se basa en el descubrimiento de biomarcadores y mecanismos asociados con el grado de respuesta al tratamiento con inhibidores de glutaminasa (GLS) y métodos para tratar a tales pacientes. En particular, las alteraciones en la vía NRF2/KEAP1 sensibilizan a los pacientes a la inhibición de GLS. KEAP1, una proteína adaptadora de ubiquitina ligasa, es un regulador negativo de NRF2, el factor de transcripción clave que activa la respuesta antioxidante celular. La desregulación de la vía NRF2/KEAP1, la señalización de NRF2, el aumento de la concentración intracelular de glutatión o las mutaciones en KEAP1 o NRF2 (por ejemplo, una mutación de pérdida de función en KEAP1 o una mutación de ganancia de función en NRF2) confieren una dependencia de los tumores del glutatión reducido, el principal antioxidante endógeno compuesto por glicina, cisteína y glutamato derivado de glutamina. La inhibición de GLS reduce los niveles de glutatión en estado estacionario, cambiando así el equilibrio rédox de las células tumorales.

El factor nuclear (derivado de eritroide 2) similar a 2, también conocido como NRF2, es un factor de transcripción que en seres humanos está codificado por el gen NFE2L2. NRF2 se expresa ubicuamente a niveles bajos en todos los órganos humanos. La vía de respuesta antioxidante NRF2 es la principal defensa celular contra los efectos citotóxicos del estrés oxidativo. Entre otros efectos, NRF2 aumenta la expresión de varias enzimas antioxidantes. Puesto que NRF2 regula un importante mecanismo de defensa celular, la regulación estricta es crucial para mantener la homeostasis celular. La activación de esta vía es importante en la prevención de enfermedades humanas, tales como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades cardiovasculares, la isquemia, la diabetes, la fibrosis pulmonar y las enfermedades inflamatorias. Por el contrario, se producen altos niveles constitutivos de NRF2 en muchos tumores o líneas de células cancerosas. Por otra parte, la expresión anormalmente alta de NRF2 en las células cancerosas las protege de los efectos citotóxicos de las terapias contra el cáncer, lo que da como resultado quimio y/o radiorresistencia.

En condiciones normales o sin estrés, NRF2 se mantiene en el citoplasma gracias a un agrupamiento de proteínas que lo degradan rápidamente. Bajo estrés oxidativo, NRF2 no se degrada, sino que viaja al núcleo donde se une a un promotor de ADN e inicia la transcripción de genes antioxidantes y sus proteínas. NRF2 se mantiene en el citoplasma por la proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (KEAP1) y Culina 3 que degradan NRF2 por ubiquitinación. La Culina 3 ubiquitina su sustrato, NRF2. KEAP1 es un adaptador de sustrato, que ayuda a la Culina 3 a ubiquitinar NRF2. Cuando se ubiquitina NRF2, se transporta al proteasoma, donde se degrada y sus componentes se reciclan. En condiciones normales, NRF2 tiene una semivida de solo 20 minutos. El estrés oxidativo o el estrés electrofílico interrumpen los restos de cisteína críticos en KEAP1, interrumpiendo el sistema de ubiquitinación KEAP1-Cul3. Cuando NRF2 no se ubiquitina, se acumula en el citoplasma y se traslada al núcleo. En el núcleo, se combina (forma un heterodímero) con una pequeña proteína Maf y se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) en la región promotora aguas arriba de muchos genes antioxidantes e inicia su transcripción.

La vía NRF2/KEAP1 es el principal regulador de las respuestas citoprotectoras a los estreses endógeno y exógeno causados por las especies reactivas de oxígeno (ROS) y los electrófilos. Las proteínas de señalización clave dentro de la vía son el factor de transcripción NRF2 que se une con pequeñas proteínas Maf al elemento de respuesta antioxidante (ARE) en las regiones reguladoras de los genes diana, y KEAP1, la proteína represora que se une a NRF2 y promueve su degradación por la vía del proteasoma de la ubiquitina. KEAP1 es una proteína muy rica en cisteína, la KEAP1 de ratón tiene un total de 25 restos de cisteína y la humana 27, la mayoría de los cuales pueden modificarse in vitro por diferentes oxidantes y electrófilos. Se ha demostrado que tres de estos restos, C151, C273 y C288, desempeñan un papel funcional al alterar la conformación de KEAP1 que conduce a la translocación nuclear de NRF2 y la posterior expresión del gen diana.

De acuerdo con este modelo, el tratamiento de líneas celulares de cáncer que tienen una vía NRF2/KEAP1 alterada con un potente inhibidor de GLS redujo los niveles intracelulares de glutamato y glutatión e inhibió el crecimiento celular. Sin estar ligado a ninguna teoría, los autores de la presente invención proponen que la inhibición del crecimiento celular es a través de un mecanismo que implica la acumulación de daño en el ADN inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS). Por el contrario, las líneas celulares de cáncer sin ninguna de las condiciones mencionadas anteriormente, por ejemplo, aquellas que eran de tipo salvaje para NRF2/KEAP1, no respondieron al tratamiento con inhibidores de GLS, lo que confirma la sensibilidad de este biomarcador y mecanismo para predecir la respuesta en medicina clínica.

Por consiguiente, en un aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento. El método comprende (a) determinar: (i) que la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, (ii) que la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, (iii) que el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de pérdida de función en KEAP1, (iv) que el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de ganancia de función en NRF2; o (v) un aumento en la concentración intracelular de glutatión en dicho sujeto; y (b) administrar un inhibidor de glutaminasa al sujeto.

En un aspecto que no forma parte de la presente invención, se divulga en el presenta documento un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento que comprende determinar que el sujeto tiene una vía NRF2/KEAP1 alterada y administrar un inhibidor de glutaminasa al sujeto. En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento mediante la administración de un inhibidor de glutaminasa al sujeto, en donde el sujeto tiene una vía NRF2/KEAP1 alterada.

La vía NRF2/KEAP1 puede alterarse en uno de varios mecanismos diferentes. En una realización, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada y se evita la ubiquitinación de NRF2 que finalmente conduce a su degradación. En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 puede estar desregulada debido a una mutación en NRF2 o KEAP1. La mutación puede ser cualquier mutación que interrumpa la función de KEAP1 o una mutación en KEAP1 o NRF2 que impida la unión de KEAP1 a NRF2. En una realización, la mutación es una mutación somática.

En otra realización, la vía NRF2/KEAP1 puede estar desregulada debido al silenciamiento epigenético de la expresión de KEAP1. El silenciamiento epigenético de la expresión de KEAP1 da como resultado una señalización de NRF2 activada constitutivamente. En una realización, la hipermetilación del ADN en la región promotora de KEAP1 da como resultado el silenciamiento epigenético de la expresión de KEAP1. Los sujetos con silenciamiento epigenético de la expresión de KEAP1 son buenos candidatos para el tratamiento con inhibidores de glutaminasa.

En otra realización más, la vía NRF2/KEAP1 puede estar desregulada debido a la acumulación de proteínas disruptoras que conducen a la disociación del complejo KEAP1-NRF2. Los ejemplos de proteínas disruptoras incluyen, pero no se limitan a, inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, p21, y proteína de unión a poliubiquitina, p62.

La inducción transcripcional de NRF2 es otro mecanismo por el cual se desregularía la vía NRF2/KEAP1. La inducción transcripcional de NRF2 puede, por ejemplo, ser causada por señalización oncogénica debido a elementos que incluyen, pero sin limitarse a, K-Ras, B-Raf y c-Myc.

En otra realización, la vía NRF2/KEAP1 puede estar desregulada debido a la modificación postraduccional de KEAP1 que afecta a la unión de KEAP1 a NRF2. Cualquiera de los restos de aminoácidos de KEAP1 puede sufrir una modificación postraduccional. En una realización, se modifican los restos de cisteína de KEAP1. La modificación postraduccional de KEAP1, por ejemplo, la modificación de los restos de cisteína incluye, pero no se limita a, la succinación de restos de cisteína críticos. Los restos de cisteína críticos de KEAP1 incluyen, pero sin limitarse a, los de las posiciones 151,273 y 288.

En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, se divulga en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento que comprende determinar que la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva y administrar al sujeto un inhibidor de glutaminasa. Como se describió anteriormente, la señalización de NRF2 podría ser hiperactiva debido a varios factores diferentes, tales como la interrupción de la unión de KEAP1-NRF2 o una reducción o pérdida en la función de KEAP1, causada, por ejemplo, por cualquiera de los mecanismos descritos anteriormente. La señalización de NRF2 también podría ser hiperactiva debido a factores que afectan a la expresión de NRF2, incluida la inducción de NRF2 por señalización oncogénica o mutaciones en NRF2 que aumentan su expresión o función.

En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento comprende una mutación en una de las proteínas implicadas en la vía NRF2/KEAP1. En una realización, la mutación es una mutación somática. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína KEAP1 comprende una mutación, por ejemplo, una mutación de pérdida de función o una mutación que da como resultado la reducción o la pérdida de la capacidad de la proteína KEAP1 para unirse a NRF2. En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína NRF2 comprende una mutación, por ejemplo, una mutación de ganancia de función o una mutación que da como resultado la reducción o la pérdida de la capacidad de la proteína NRF2 para unirse a KEAP1 o cualquier otra proteína involucrada en la ubiquitinación de NRF2.

En otro aspecto más que no forma parte de la presente invención, se divulga en el presente documento un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento que comprende determinar que hay un aumento en la concentración intracelular de glutatión en dicho sujeto y administrar un inhibidor de glutaminasa al sujeto. Existen varios mecanismos por los cuales puede elevarse la concentración intracelular de glutatión (GSH) en un sujeto. Los ejemplos de dichos mecanismos incluyen la actividad de NRF2 desregulada o una vía NRF2/KEAP1 desregulada como se describe anteriormente. La concentración intracelular de glutatión en un sujeto puede aumentar debido a una mayor expresión o actividad de las enzimas relacionadas con el glutatión. Los ejemplos de tales enzimas incluyen yglutamilcisteína ligasa y Y-glutamil-transpeptidasa. La concentración intracelular de glutatión puede aumentar debido a una mayor expresión o actividad de los transportadores de aminoácidos.

En otra realización de la invención, el sujeto tiene: una vía NRF2/KEAP1 desregulada; una señalización de NRF2 hiperactiva; una mutación de pérdida de función en el ácido nucleico de KEAP1; una mutación de ganancia de función en el ácido nucleico de NRF2; o un aumento en la concentración intracelular de glutatión. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una vía NRF2/KEAP1 desregulada. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una señalización de NRF2 hiperactiva. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de pérdida de función en el ácido nucleico de KEAP1. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una mutación de ganancia de función en el ácido nucleico de NRF2. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un aumento en la concentración intracelular de glutatión. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene más de uno de los anteriores.

En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que necesita tratamiento mediante la administración de un compuesto que inhibe la producción de glutatión a un sujeto. El método comprende opcionalmente obtener una muestra biológica de un sujeto, determinar que la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, o que la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, o determinar la presencia de una mutación de pérdida de función en KEAP1 o una mutación de ganancia de función en NRF2 de dicho sujeto, o más de uno de los anteriores, y administrar un compuesto que inhibe la producción de glutatión. El compuesto puede inhibir el transporte de aminoácidos o la síntesis de glutatión. El compuesto que inhibe la producción de glutatión puede ser un inhibidor de glutaminasa. El sujeto puede tener una vía NRF2/KEAP1 desregulada. El sujeto puede tener señalización NRF2 hiperactiva. El sujeto puede tener una mutación de pérdida de función en el ácido nucleico de KEAP1. El sujeto puede tener una mutación de ganancia de función en el ácido nucleico de NRF2. El sujeto puede tener un aumento en la concentración intracelular de glutatión. El sujeto puede tener más de uno de los anteriores.

En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la divulgación comprende un método para evaluar si administrar un compuesto que inhibe la producción de glutatión a un sujeto. El método comprende opcionalmente obtener una muestra biológica de un sujeto, determinar que la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, o que la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, o determinar la presencia de una mutación de pérdida de función en KEAP1 o una mutación de ganancia de función en NRF2 de dicho sujeto y determinar que se debe administrar al sujeto el compuesto que inhibe la producción de glutatión. El compuesto puede inhibir el transporte de aminoácidos o la síntesis de glutatión. El sujeto puede tener una vía NRF2/KEAP1 desregulada. El sujeto puede tener una señalización hiperactiva de NRF2. El sujeto puede tener una mutación de pérdida de función en el ácido nucleico de KEAP1. El sujeto puede tener una mutación de ganancia de función en el ácido nucleico de NRF2. El sujeto puede tener un aumento en la concentración intracelular de glutatión. El sujeto puede tener más de uno de los anteriores.

También se proporciona en el presente documento un inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión como se define en las reivindicaciones para su uso como medicamento en el tratamiento del cáncer de pulmón, en un sujeto en el que (i) la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, (ii) la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, (iii) el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de pérdida de función en KEAP1, (iv) el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de ganancia de función en NRF2; o (v) el sujeto tiene un aumento en la concentración intracelular de glutatión.

También se proporciona en el presente documento un inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón en un sujeto en el que (i) la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada, (ii) la señalización de NRF2 en dicho sujeto es hiperactiva, (iii) el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de pérdida de función en KEAP1, (iv) el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de ganancia de función en NRF2; o (v) el sujeto tiene un aumento en la concentración intracelular de glutatión.

En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a:

(a) una mutación somática presente en KEAP1 o NRF2;

(b) silenciamiento epigenético de la expresión de KEAP1;

(c) acumulación de proteínas disruptoras que conducen a la disociación del complejo KEAP1/NRF2;

(d) inducción transcripcional de NRF2 por señalización oncogénica;

(e) modificación postraduccional de KEAP1 que afecta la unión a NRF2; o

(f) expresión de un microARN que regula por disminución los niveles de KEAP1.

En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a una mutación somática en KEAP1 o el dominio de unión a KEAP1 de NRF2. En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a la hipermetilación del ADN en la región promotora de KEAP1. En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a la acumulación del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21 o la proteína de unión a poliubiquitina p62. En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a la inducción transcripcional de NRF2 por la señalización oncogénica de K-Ras, B-Raf o c-Myc. En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a la modificación postraduccional de los restos de cisteína de KEAP1. En ciertas realizaciones, la vía NRF2/KEAP1 en dicho sujeto está desregulada debido a la expresión de un microARN que regula por disminución los niveles de KEAP1.

El sujeto puede tener un aumento en la concentración intracelular de glutatión (GSH), que es causado por:

(a) actividad NRF2 desregulada;

(b) aumento de la expresión de enzimas relacionadas con GSH; o

(c) aumento de la expresión o actividad de los transportadores de aminoácidos.

El aumento de la concentración intracelular de glutatión (GSH) en dicho sujeto puede estar causado por la actividad desregulada de NRF2. El aumento de la concentración intracelular de glutatión (GSH) en dicho sujeto puede estar causado por una mayor expresión de enzimas relacionadas con GSH. El aumento de la concentración intracelular de glutatión (GSH) en dicho sujeto puede estar causado por una mayor expresión o actividad de los transportadores de aminoácidos.

En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP).

El inhibidor de glutaminasa según la invención es un inhibidor selectivo de GLS-1.

En ciertas realizaciones, el inhibidor de GLS-1 se une a un bolsillo alostérico en la región expuesta al disolvente del dímero GLS-1 en el bolsillo de unión presente en las proximidades de Leu321, Phe322, Leu323 y Tyr394 de ambos monómeros.

El inhibidor de glutaminasa se elige de la lista de compuestos proporcionada en la Tabla 1 a continuación. En ciertas realizaciones, el compuesto se elige entre cualquier combinación de los compuestos proporcionados en la Tabla 1, o una de sus sales o polimorfos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el compuesto se elige entre dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez cualesquiera de los compuestos proporcionados en la Tabla 1, o una de sus sales o polimorfos.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

En ciertas realizaciones, los tratamientos divulgados en el presente documento comprenden adicionalmente la administración de otro compuesto farmacéuticamente activo. En ciertas realizaciones, el otro compuesto farmacéuticamente activo es un agente anticanceroso. En ciertas realizaciones, el agente anticanceroso se elige entre un agente basado en platino, un agente basado en taxano, una inmunoterapia, una terapia dirigida. En ciertas realizaciones, la terapia dirigida es un inhibidor de MEK quinasa, HSP90, CDK4 o de la vía mTOR.

En ciertas realizaciones, los tratamientos divulgados en el presente documento comprenden adicionalmente la administración de métodos no químicos de tratamiento del cáncer. En ciertas realizaciones, el tratamiento comprende adicionalmente la administración de radioterapia. En ciertas realizaciones, el tratamiento comprende adicionalmente la administración de cirugía, termoablación, terapia de ultrasonido focalizado, crioterapia o cualquier combinación de las mismas.

En ciertas realizaciones, los tratamientos divulgados en el presente documento administran el agente activo (es decir, el compuesto que inhibe la producción de glutatión, el inhibidor de glutaminasa o el inhibidor selectivo de GLS-1 según las reivindicaciones) como una composición farmacéutica que comprende un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración oral. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se formula como un comprimido o una cápsula. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración parenteral.

Abreviaturas y Definiciones

Para facilitar la comprensión de la divulgación, a continuación, se definen una serie de términos y abreviaturas que se utilizan en el presente documento de la siguiente manera:

Al introducir elementos de la presente divulgación o la realización o realizaciones preferidas de la misma, se pretende que los artículos "un", "uno", "una", "el o los", "la o las", "dicho o dichos" y "dicha o dichas" signifiquen que hay uno o más de los elementos. Se pretende que los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" sean inclusivos y signifiquen que puede haber elementos adicionales además de los elementos enumerados.

El término "y/o" cuando se utiliza en una lista de dos o más elementos, significa que cualquiera de los elementos enumerados puede emplearse solo o combinado con uno o más cualesquiera de los elementos enumerados. Por ejemplo, se pretende que la expresión "A y/o B" signifique uno o ambos de A y B, es decir, A solo, B solo o A y B combinados. Se pretende que la expresión "A, B y/o C" signifique A solo, B solo, C solo, A y B combinados, A y C combinados, B y C combinados o A, B y C combinados.

Cuando se divulgan rangos de valores, y se utiliza la notación "de n1 ... a n2" o "entre n1 ... y n2", donde n1 y n2 son los números, en ese caso, a menos que se especifique lo contrario, se pretende que esta notación incluya los números mismos y el rango entre ellos. Este rango puede ser integral o continuo entre e incluyendo los valores finales. A modo de ejemplo, se pretende que el rango "de 2 a 6 carbonos" incluya dos, tres, cuatro, cinco y seis carbonos, ya que los carbonos vienen en unidades enteras. Compare, a modo de ejemplo, el rango "de 1 a 3 gM (micromolar)", que se pretende que incluya 1 gM, 3 gM y todo lo que se encuentre en el medio hasta cualquier número de cifras significativas (p. ej., 1,255 gM, 2,1 gM, 2,9999 gM, etc.).

El término "aproximadamente", como se emplea en el presente documento en relación con un valor numérico x, significa x ± 10%.

Se pretende que el término "enfermedad", como se emplea en el presente documento, sea un sinónimo general y se utiliza indistintamente con los términos "trastorno", "síndrome" y "afección" (como en una afección médica), en el sentido de que todos reflejan un estado anormal del organismo humano o animal o de una de sus partes que altera el funcionamiento normal, se manifiesta típicamente por signos y síntomas distintivos, y hace que el ser humano o animal tenga una duración o calidad de vida reducida.

El término "terapia combinada" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una afección o trastorno terapéuticos descritos en la presente divulgación. Tal administración abarca la administración conjunta de estos agentes terapéuticos de una manera sustancialmente simultánea, tal como en una sola cápsula que tiene una razón proporción fija de ingredientes activos o en múltiples cápsulas separadas para cada ingrediente activo. Además, tal administración también abarca el uso de cada tipo de agente terapéutico de manera secuencial. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos en el tratamiento de las afecciones o trastornos descritos en el presente documento.

Los términos "vía NRF2/KEAP1 alterada" o "vía NRF2/KEAP1 que está alterada" se emplean indistintamente en el presente documento y se refieren a un sujeto o una célula o una línea celular en los que está presente cualquiera de los siguientes: (i) una vía NRF2/KEAP1 desregulada; (ii) una señalización de NRF2 hiperactiva; (iii) una mutación de pérdida de función en KEAP1; (iv) una mutación de ganancia de función en NRF2; o (v) un aumento en la concentración intracelular de glutatión.

Inhibidor de GLS-1 se emplea en el presente documento para referirse a un compuesto que exhibe una CI⁵⁰ con respecto a la actividad de GLS-1 de no más de aproximadamente 100 gM y más típicamente no más de aproximadamente 50 gM, según se mide en el ensayo de la enzima GLS-1 descrito en general en el presente documento a continuación. CI⁵⁰ es la concentración de inhibidor que reduce la actividad de una enzima (p. ej., GLS1) a la mitad del nivel máximo. Se ha descubierto que ciertos compuestos divulgados en el presente documento exhiben inhibición frente a GLS-1. En ciertas realizaciones, los compuestos exhibirán una CI⁵⁰ con respecto a GLS-1 de no más de aproximadamente 10 pM; en realizaciones adicionales, los compuestos exhibirán una CI⁵⁰ con respecto a GLS-1 de no más de aproximadamente 5 pM; en otras realizaciones adicionales, los compuestos exhibirán una CI⁵⁰ con respecto a GLS-1 de no más de aproximadamente 1 pM; en otras realizaciones adicionales, los compuestos exhibirán una CI⁵⁰ con respecto a GLS-1 de no más de aproximadamente 200 nM, medida en el ensayo enzimático de GLS-1 descrito en el presente documento.

Los términos "inhibidor selectivo para GLS-1" o "inhibidor selectivo de GLS-1" se emplean indistintamente en el presente documento y se refieren a inhibidores que son aproximadamente 100 veces más selectivos para GLS-1 que para GLS-2 como se mide en cualquier ensayo conocido para un experto en la técnica que mide la actividad de la enzima. Un ejemplo de tal ensayo incluye, pero no se limita a, el ensayo de la enzima GLS-1 (Ensayo de Actividad Enzimática de GLS-1) descrito a continuación.

Se pretende que la frase "terapéuticamente eficaz" califique la cantidad de ingredientes activos utilizados en el tratamiento de una enfermedad o trastorno o en la realización de un criterio de valoración clínico.

El término "terapéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos (o sales, profármacos, tautómeros, formas zwitteriónicas, etc.) que son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin toxicidad, irritación y respuesta alérgica indebidas, tienen a una razón beneficio/riesgo razonable proporcional, y son eficaces para el uso previsto.

Como se emplea en el presente documento, se pretende que la referencia al "tratamiento" de un paciente incluya prevención, profilaxis, atenuación, mejora y terapia. El tratamiento también puede incluir la prevención de la enfermedad. La prevención de una enfermedad puede implicar la protección completa frente a la enfermedad, por ejemplo, como en el caso de la prevención de la infección con un patógeno, o puede implicar la prevención de la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, la prevención de una enfermedad puede no significar la exclusión completa de cualquier efecto relacionado con las enfermedades a cualquier nivel, sino que puede significar la prevención de los síntomas de una enfermedad a un nivel clínicamente significativo o detectable. La prevención de enfermedades también puede significar la prevención de la progresión de una enfermedad a un estadio posterior de la enfermedad.

Los términos "sujeto" o "paciente" se emplean en el presente documento indistintamente para referirse a todos los mamíferos, incluidos los seres humanos. Los ejemplos de sujetos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, monos, perros, gatos, caballos, vacas, cabras, ovejas, cerdos y conejos. En una realización, el paciente es un ser humano.

Los términos "afectado por una enfermedad o trastorno", "aquejado por una enfermedad o trastorno" o "que tiene una enfermedad o trastorno" se emplean indistintamente en el presente documento y se refieren a un sujeto o paciente con cualquier enfermedad, trastorno, síndrome o afección. El uso de uno de los términos en comparación con el otro no implica un aumento o disminución del nivel de gravedad del trastorno.

Los compuestos divulgados en el presente documento pueden existir como sales terapéuticamente aceptables. La presente divulgación incluye los compuestos enumerados anteriormente en forma de sales, incluidas las sales de adición de ácido. Las sales adecuadas incluyen las formadas con ácidos orgánicos e inorgánicos. Tales sales de adición de ácido normalmente serán farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de sales no farmacéuticamente aceptables pueden ser de utilidad en la preparación y purificación del compuesto en cuestión. También se pueden formar sales de adición alcalinas y ser farmacéuticamente aceptables. Para una discusión más completa sobre la preparación y selección de sales, remitirse a Phaemaceutical Salts: Properties, Selection and use (Stahl, P. Heinrich. Wiley-VCHA, Zúrich, Suiza, 2002).

El término "sal terapéuticamente aceptable", como se emplea en el presente documento, representa sales o formas zwitteriónicas de los compuestos divulgados en el presente documento que son solubles en agua o en aceite o dispersables y terapéuticamente aceptables como se define en el presente documento. Las sales se pueden preparar durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos o por separado haciendo reaccionar el compuesto apropiado en forma de base libre con un ácido adecuado. Las sales de adición de ácido representativas incluyen acetato, adipato, alginato, L-ascorbato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato (besilato), bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, digluconato, formiato, fumarato, gentisato, glutarato, glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hipurato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato (isetionato), lactato, maleato, malonato, DL-mandelato, mesitilensulfonato, metanosulfonato, naftilenosulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, pamoato, pentinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfonato, picrato, pivalato, propionato, piroglutamato, succinato, sulfonato, tartrato, L-tartrato, tricloroacetato, trifluoroacetato, fosfato, glutamato, bicarbonato, para-toluenosulfonato (p-tosilato) y undecanoato. Asimismo, los grupos alcalinos en los compuestos divulgados en el presente documento se pueden cuaternizar con cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo; cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; y bromuros de bencilo y fenetilo. Los ejemplos de ácidos que se pueden emplear para formar sales de adición terapéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, y ácidos orgánicos tales como oxálico, maleico, succínico y cítrico. Las sales también se pueden formar por coordinación de los compuestos con un ion de metal alcalino o alcalinotérreo. Por lo tanto, la presente divulgación contempla las sales de sodio, potasio, magnesio y calcio de los compuestos divulgados en el presente documento.

Las sales de adición alcalinas se pueden preparar durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos haciendo reaccionar un grupo carboxi con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico o con amoníaco o una amina primaria, secundaria o terciaria orgánica. Los cationes de sales terapéuticamente aceptables incluyen litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, así como cationes de aminas cuaternarias no tóxicas como amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, tributilamina, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina, 1-efenamina y N,N'-dibenciletilendiamina. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina y piperazina.

Se puede preparar una sal de un compuesto haciendo reaccionar el compuesto apropiado en forma de base libre con el ácido apropiado.

Compuestos

Los compuestos útiles en los tratamientos de la invención se proporcionan en la Tabla 1 a continuación. El compuesto es un compuesto que inhibe la producción o actividad del glutatión. El compuesto inhibe el transporte de aminoácidos o glutatión. El compuesto es un inhibidor de la glutaminasa.

El compuesto es un inhibidor de GLS-1, por ejemplo, un inhibidor selectivo de GLS-1. Se sabe que GLS-1 forma un tetrámero (PNAS 2012, 109, 7705). El inhibidor de GLS-1 ocupa un bolsillo alostérico en la región expuesta al disolvente entre dos dímeros de GLS-1. El inhibidor de GLS-1 puede, por ejemplo, unirse a GLS-1 en un bolsillo alostérico en la región expuesta al disolvente del dímero de GLS-1 en el bolsillo de unión presente en la proximidad de los aminoácidos Leu 321, Phe322, Leu323 y Tyr394 de ambos monómeros. Sin estar ligado a ninguna teoría, los autores de la presente invención proponen que las interacciones clave se realizan dentro de un agrupamiento hidrófobo que comprende Leu321, Phe322, Leu323 y Tyr394 de ambos monómeros que forman el bolsillo alostérico. La unión del inhibidor de glutaminasa, por ejemplo, un inhibidor de GLS-1, induce un cambio conformacional espectacular cerca del sitio catalítico que inactiva la enzima.

Los compuestos que inhiben GLS-1 son conocidos en la técnica y se divulgan en el presente documento. Los compuestos útiles para el tratamiento del cáncer de pulmón según la presente invención (y su masa molecular) se proporcionan en la Tabla 1 a continuación, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto se elige entre cualquier combinación de los compuestos proporcionados en la Tabla 1 a continuación, o una de sus sales o polimorfos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el compuesto se elige entre cualquiera de los dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez cualesquiera de los compuestos proporcionados en la Tabla 1 a continuación, o una de sus sales o polimorfos.

Tabla 1

En ciertas realizaciones, el compuesto es N-metil-1-{4-[6-(2-{4-[3-(trifluorometoxi)fenil]piridin-2-il}acetamido)piridazin-3-il]butil}-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 1-(2-fluoro-4-(5-(2-(piridin-2-il)acetamido)-1,3,4-tiadiazol-2-il)butil)-N-((4-(trifluorometil)piridin-2-il)metil)-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es N-(piridin-2-ilmetil)-5-(3-(6-(2-(3-(trifluorometoxi)fenil)acetamido)piridazin-3-il)pirrolidin-1-il)-1,3,4-tiadiazol-2-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(3-(trifluorometoxi)fenil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(6-metil-4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(4-(6-(2-(4-(ciclopropildifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(1-(3-(trifluorometoxi)fenil)-1H-imidazol-4-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 1 -(4-(6-(2-(4-ciclobutoxipiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 1-(4-(6-(2-(4-ciclobutoxipiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es (R)-1-(4-(6-(2-(4-ciclopropilpiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es 5-(3-(6-(2-(piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)pirrolidin-1-il)-N-((4-(trifluorometil)piridin-2-il)metil)-1,3,4-tiadiazol-2-carboxamida, o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es N,N'-(5,5'-(ciclohexano-1,3-diil)bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-fenilacetamida), o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es N,N'-(5,5'-((1S,3S)-ciclohexano-1,3-diil)bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-fenilacetamida), o una de sus sales o polimorfos. En ciertas realizaciones, el compuesto es N,N'-(5,5'-((1 R,3R)-ciclohexano-1,3-diil)bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-fenilacetamida), o una de sus sales o polimorfos.

Composiciones farmacéuticas

Si bien es posible que los compuestos divulgados en el presente documento se administren como producto químico bruto, también es posible presentarlos como una formulación farmacéutica. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden uno o más de ciertos compuestos divulgados en el presente documento, o una o más sales, ésteres, profármacos, amidas o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables de los mismos y, opcionalmente, uno o más de otros ingredientes terapéuticos. El portador o los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de la misma. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida. Cualquiera de los mecanismos, portadores y excipientes bien conocidos puede usarse según sea adecuado y como se entienda en la técnica; p. ej., en Remington’s Pharmaceutical Sciences. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden fabricarse de cualquier manera conocida en la técnica, p. ej., mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o compresión.

Las formulaciones incluyen las adecuadas para la administración oral, parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarticular e intramedular), intraperitoneal, transmucosa, transdérmica, rectal y tópica (incluyendo dérmica, bucal, sublingual e intraocular), aunque la vía más adecuada puede depender, por ejemplo, de la afección y el trastorno del receptor. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Típicamente, estos métodos incluyen la etapa de asociar un compuesto de la divulgación objeto o una sal, éster, amida, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo ("ingrediente activo") con el portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y a continuación, si fuera necesario, conformando el producto en la formulación deseada.

Vías de administración

Administración oral

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por vía oral, incluida la ingestión, de modo que el compuesto entre en el tracto gastrointestinal o se absorba en el torrente sanguíneo directamente desde la boca, incluida la administración sublingual o bucal.

Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formulaciones sólidas tales como comprimidos, píldoras, sellos, pastillas y cápsulas duras o blandas, que pueden contener líquidos, geles, polvos o gránulos.

En una forma de dosificación de comprimido o cápsula, la cantidad de fármaco presente puede ser de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 95% en peso, más típicamente de aproximadamente 2% a aproximadamente 50% en peso de la forma de dosificación.

Además, los comprimidos o cápsulas pueden contener un disgregrante, que comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 35% en peso, más típicamente de aproximadamente 2% a aproximadamente 25% de la forma de dosificación. Los ejemplos de disgregantes incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio o calcio, croscarmelosa de sodio, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa, almidón y similares.

Los aglutinantes adecuados, para su uso en un comprimido, incluyen gelatina, polietilenglicol, azúcares, gomas, almidón, hidroxipropilcelulosa y similares. Los diluyentes adecuados, para su uso en un comprimido, incluyen manitol, xilitol, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol y almidón.

Los agentes tensioactivos y deslizantes adecuados, para su uso en un comprimido o cápsula, pueden estar presentes en cantidades de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3% en peso, e incluyen polisorbato 80, dodecilsulfato de sodio, talco y dióxido de silicio.

Los lubricantes adecuados, para su uso en un comprimido o cápsula, pueden estar presentes en cantidades de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5% en peso, e incluyen estearato de calcio, zinc o magnesio, estearilfumarato de sodio y similares.

Los comprimidos se pueden fabricar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con aglutinantes, diluyentes inertes o agentes lubricantes, tensioactivos o dispersantes. Los comprimidos moldeados se pueden fabricar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las formulaciones líquidas pueden incluir emulsiones, soluciones, jarabes, elixires y suspensiones, que se pueden utilizar en cápsulas blandas o duras. Tales formulaciones pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, celulosa o un aceite. La formulación también puede incluir uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión.

Las composiciones para administración oral se pueden formular como liberación inmediata o modificada, incluida la liberación retardada o sostenida, opcionalmente con recubrimiento entérico.

En otra realización, una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Administración parenteral

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar directamente al torrente sanguíneo, músculo u órganos internos mediante inyección, p. ej., mediante inyección en bolo o infusión continua. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen la vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intracraneal y similares. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores (incluyendo inyectores con aguja y sin aguja) y métodos de infusión. Las formulaciones pueden presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados.

La mayoría de las formulaciones parenterales son soluciones acuosas que contienen excipientes, que incluyen sales, agentes tamponadores, de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes, antioxidantes, bacteriostáticos, conservantes y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto y carbohidratos.

Las formulaciones parenterales también se pueden preparar en forma deshidratada (p. ej., mediante liofilización) o como soluciones no acuosas estériles. Estas formulaciones se pueden utilizar con un vehículo adecuado, tal como agua estéril. Los agentes potenciadores de la solubilidad también se pueden utilizar en la preparación de soluciones parenterales.

Las composiciones para administración parenteral se pueden formular como liberación inmediata o modificada, incluida liberación retardada o sostenida. Los compuestos también se pueden formular como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Administración tópica

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por vía tópica (por ejemplo, en la piel, las membranas mucosas, el oído, la nariz o los ojos) o por vía transdérmica. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir, pero sin limitarse a, lociones, soluciones, cremas, geles, hidrogeles, ungüentos, espumas, implantes, parches y similares. Los portadores que son farmacéuticamente aceptables para las formulaciones de administración tópica pueden incluir agua, alcohol, aceite mineral, glicerina, polietilenglicol y similares. La administración tópica también se puede realizar, por ejemplo, mediante electroporación, iontoforesis, fonoforesis y similares.

Típicamente, el ingrediente activo para administración tópica puede comprender de 0,001% a 10% p/p (en peso) de la formulación. En ciertas realizaciones, el ingrediente activo puede comprender hasta 10% p/p; menos de 5% p/p; de 2% p/p a 5% p/p; o de 0,1% a 1% p/p de la formulación.

Las composiciones para administración tópica se pueden formular como liberación inmediata o modificada, incluida la liberación retardada o sostenida.

Administración rectal, bucal y sublingual

Los supositorios para la administración rectal de los compuestos de la presente invención se pueden preparar mezclando el agente activo con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, mono-, di- o triglicéridos sintéticos, ácidos grasos o polietilenglicoles que son sólidos a temperatura normal pero líquidos a temperatura rectal, y que por lo tanto se derretirán en el recto y liberarán el fármaco.

Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos, píldoras, pastillas o geles formulados de manera convencional. Tales composiciones pueden comprender el ingrediente activo en una base aromatizada tal como sacarosa y acacia o tragacanto.

Administración por inhalación

Para la administración por inhalación, los compuestos se pueden suministrar convenientemente desde un insuflador, paquetes presurizados con nebulizador u otros medios convenientes para suministrar una pulverización aerosol o polvo. Los paquetes presurizados pueden comprender un propelente adecuado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Alternativamente, para la administración por inhalación o insuflación, los compuestos según la divulgación pueden adoptar la forma de una composición de polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en cápsulas, cartuchos, gelatina o envases burbuja desde los que se puede administrar el polvo con la ayuda de un inhalador o insuflador.

También se pueden utilizar otros materiales portadores y modos de administración conocidos en la técnica farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar mediante cualquiera de las técnicas farmacéuticas bien conocidas, tales como procedimientos eficaces de formulación y administración. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis eficaz, como se indica en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo. La cantidad precisa de compuesto administrado a un paciente será responsabilidad del médico a cargo. El nivel de dosis específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la vía de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, el trastorno preciso que se esté tratando y la gravedad de la indicación o afección que se esté tratando. Además, la vía de administración puede variar según la afección y su gravedad. Las consideraciones anteriores relativas a formulaciones eficaces y procedimientos de administración son bien conocidas en la técnica y se describen en libros de texto de referencia. La formulación de fármacos es analizada, por ejemplo, por Hoover, John E., en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975; Liberman, et al., Eds., en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, N.Y., 1980; y Kibbe, et al., Eds., en Handbook of Pharmaceutical Excipients (3a Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999.

Métodos de tratamiento (previstos como compuestos para su uso en los métodos de tratamiento de las enfermedades reivindicadas)

Los métodos de la invención se pueden utilizar para tratar a cualquier sujeto que necesite tratamiento. Los ejemplos de sujetos o pacientes incluyen, pero sin limitarse a, seres humanos, monos, ciervos, camellos, mascotas y animales de compañía, incluidos, pero sin limitarse a, perros, gatos, caballos, conejos y cobayas; ganado, incluidos, pero sin limitarse a, vacas, búfalos, bisontes, mulas, cabras, ovejas y cerdos. En una realización, el sujeto es un ser humano.

Los métodos de la invención proporcionan la administración de un inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión como se describe anteriormente para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón en donde la vía NRF2/KEAP1 en las células cancerosas está desregulada.

En otra realización, en el presente documento se proporciona un inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión como se divulga anteriormente para su uso como medicamento en el tratamiento de un cáncer de pulmón en el que la vía NRF2/KEAP1 en las células cancerosas está desregulada, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP).

En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón ha desarrollado resistencia a fármacos quimioterapéuticos y/o radiación ionizante.

Combinaciones y terapia combinada

Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar, solos o combinados con otros compuestos farmacéuticamente activos, para tratar afecciones tales como las divulgadas anteriormente. El compuesto o los compuestos de la presente invención y otro u otros compuestos farmacéuticamente activos se pueden administrar simultáneamente (ya sea en la misma forma de dosificación o en formas de dosificación separadas) o secuencialmente.

El inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión se pueden utilizar como medicamento combinado con uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales. El inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión y uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales se pueden utilizar para la fabricación de un medicamento. Por ejemplo, el inhibidor de glutaminasa o un compuesto que inhibe la producción de glutatión y uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales se pueden utilizar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno según las reivindicaciones.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos de la presente invención, uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales y un portador farmacéuticamente aceptable.

Los uno o más compuestos farmacéuticamente activos adicionales se eligen entre fármacos anticancerosos, fármacos antiproliferativos y fármacos antiinflamatorios. En ciertas realizaciones, el agente anticanceroso se elige entre un agente basado en platino, un agente basado en taxano, una inmunoterapia y una terapia dirigida. En ciertas realizaciones, la terapia dirigida es un inhibidor de MEK quinasa, HSP90, CDK4 o de la vía mTOR.

Los inhibidores de glutaminasa, por ejemplo, los inhibidores de GLS-1, divulgados en el presente documento también se emplean opcionalmente en combinación con otros reactivos terapéuticos que se seleccionan por su valor terapéutico para la afección que se va a tratar. En general, los compuestos divulgados en el presente documento y, en las realizaciones donde se emplea la terapia combinada, otros agentes no tienen que administrarse en la misma composición farmacéutica y, debido a las diferentes características físicas y químicas, se administran opcionalmente por diferentes vías. La administración inicial generalmente se realiza de acuerdo con los protocolos establecidos y después, en función de los efectos observados, la dosificación, los modos de administración y los tiempos de administración se modifican posteriormente. En ciertos casos, es apropiado administrar un compuesto inhibidor de glutaminasa, como se divulga en el presente documento, combinado con otro agente terapéutico. Solo a modo de ejemplo, la eficacia terapéutica de un inhibidor de glutaminasa se potencia mediante la administración de otro agente terapéutico (que también incluye un régimen terapéutico) que también tiene un beneficio terapéutico. Independientemente de la enfermedad, trastorno o afección que se estén tratando, el beneficio general experimentado por el paciente es simplemente una suma de los dos agentes terapéuticos o el paciente experimenta un beneficio mejorado (es decir, sinérgico). Alternativamente, si un compuesto divulgado en el presente documento tiene un efecto secundario, puede ser apropiado administrar un agente para reducir el efecto secundario; o la eficacia terapéutica de un compuesto descrito en el presente documento se puede mejorar mediante la administración de un coadyuvante.

Las dosificaciones terapéuticamente eficaces varían cuando los fármacos se emplean en combinaciones de tratamiento. Los métodos para determinar experimentalmente las dosificaciones terapéuticamente eficaces de fármacos y otros agentes para su uso en regímenes de tratamiento combinado son metodologías documentadas. El tratamiento combinado incluye adicionalmente tratamientos periódicos que comienzan y terminan en varios momentos para ayudar con el manejo clínico del paciente. En cualquier caso, los múltiples agentes terapéuticos (uno de los cuales es un inhibidor de glutaminasa, p. ej., un inhibidor de GLS-1, como se divulga en el presente documento) pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. Si es simultáneamente, los múltiples agentes terapéuticos se proporcionan opcionalmente en una única forma unificada o en múltiples formas (solo a modo de ejemplo, ya sea como una sola píldora o como dos píldoras separadas).

En algunas realizaciones, uno de los agentes terapéuticos se administra en dosis múltiples, o ambos se administran en dosis múltiples. Si no es simultánea, el tiempo entre las dosis múltiples varía opcionalmente de más de cero semanas a menos de doce semanas.

Además, los métodos de combinación, las composiciones y las formulaciones no se limitan al uso de solo dos agentes, también se prevé el uso de múltiples combinaciones terapéuticas. Se entiende que el régimen de dosificación para tratar, prevenir o mejorar la afección o las afecciones para las que se busca el alivio, se modifica opcionalmente de acuerdo con una variedad de factores. Estos factores incluyen el trastorno que sufre el sujeto, así como la edad, el peso, el sexo, la dieta y el estado médico del sujeto. Por lo tanto, el régimen de dosificación realmente empleado varía ampliamente, en algunas realizaciones, y por lo tanto se desvía de los regímenes de dosificación establecidos en el presente documento.

Los agentes farmacéuticos que componen la terapia combinada descrita en el presente documento son opcionalmente una forma de dosificación combinada o formas de dosificación separadas destinadas a una administración sustancialmente simultánea. Los agentes farmacéuticos que componen la terapia combinada también se administran opcionalmente de forma secuencial, siendo administrado cualquiera de los agentes mediante un régimen que requiere una administración en dos etapas. El régimen de administración en dos etapas requiere opcionalmente la administración secuencial de los agentes activos o la administración espaciada de los agentes activos por separado. El tiempo entre las múltiples etapas de administración oscila entre unos pocos minutos y varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmacéutico, tales como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, semivida en plasma y perfil cinético del agente farmacéutico.

En otra realización, se utiliza opcionalmente un inhibidor de glutaminasa, p. ej., un inhibidor de GLS-1, combinado con procedimientos que proporcionan un beneficio adicional al paciente. Un inhibidor de glutaminasa y cualquier terapia adicional se administran opcionalmente antes, durante o después de la aparición de una enfermedad o afección, y el momento de administración de la composición que contiene un inhibidor de glutaminasa, p. ej., un inhibidor de GLS-1, varía en algunas realizaciones. Así, por ejemplo, un inhibidor de glutaminasa se utiliza como profiláctico y se administra continuamente a sujetos con propensión a desarrollar afecciones o enfermedades para prevenir la aparición de la enfermedad o afección. Un inhibidor de glutaminasa, p. ej., un inhibidor de GLS-1, y las composiciones se administran opcionalmente a un sujeto durante o tan pronto como sea posible después del inicio de los síntomas.

Un inhibidor de glutaminasa, p. ej., un inhibidor de GLS-1, divulgado en el presente documento se puede utilizar combinado con fármacos anticancerosos, incluidas las siguientes clases: agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides y terpenoides vegetales, inhibidores de topoisomerasa, antibióticos citotóxicos, inhibidores de angiogénesis e inhibidores de la tirosina quinasa.

Para su uso en el tratamiento o atenuación de cáncer y enfermedades neoplásicas, se puede utilizar de manera óptima un inhibidor de glutaminasa junto con uno o más de los siguientes ejemplos no limitantes de agentes anticancerosos, que incluyen: (1) agentes alquilantes, que incluyen pero no se limitan a agentes basados en platino tales como cisplatino (PLATIN), carboplatino (PARAPLATIN) y oxaliplatino (ELOXATIN), así como otros agentes alquilantes tales como estreptozocina (ZANOSAR), busulfán (MYLERAN) y ciclofosfamida (Eⁿ DOXAN); (2) antimetabolitos, incluidos mercaptopurina (PURINETHOL), tioguanina, pentostatina (NIPENT), arabinósido de citosina (ARA-C), gemcitabina (GEm Za R), fluorouracilo (Ca Ra C), leucovorina (FUSIl Ev ) y metotrexato (RHEUMATREX); (3) alcaloides y terpenoides vegetales, incluidos vincristina (ONCOVIN), vinblastina y paclitaxel (TAXOL); (4) inhibidores de la topoisomerasa, incluidos irinotecán (CAMPTOSAR), topotecán (HYC^a M^t IN) y etopósido (E^pO^s IN); (5) antibióticos citotóxicos, incluidos actinomicina D (COSMEGe N), doxorrubicina (ADRiAMy CIN), bleomicina (BLENOXANE) y mitomicina (MITOSOL); (6) inhibidores de la angiogénesis, incluidos sunitinib (SUTENT) y bevacizumab (AVASTIN); (7) inhibidores de la tirosina quinasa, incluidos imatinib (GLEEVEC), erlotinib (TARCEVA), lapatininb (TYKERB) y axitinib (INLYTA); 8) inhibidores de Hsp90, incluido Ganetesipib; 9) inhibidores de MEK, incluidos Trametinib y Salumetinib; 10) inhibidores de CDK4/6, incluido Palbociclib; 11) inhibidores de mTor, incluidos Sirolimus y Everolimus; 12) inhibidores de mTORC1/2, incluido AZD-8055; y 13) Reguladores de Puntos de Control Inmunitarios, incluidos Ipilimumab y Nivolumab

Cuando un sujeto sufre o corre el riesgo de sufrir una afección inflamatoria, se utiliza opcionalmente un inhibidor de glutaminasa, p. ej., un inhibidor de GLS-1, compuesto divulgado en el presente documento junto con uno o más agentes o métodos para tratar una afección inflamatoria en cualquier combinación. Los agentes/tratamientos terapéuticos para tratar una afección autoinmunitaria y/o inflamatoria incluyen cualquiera de los siguientes ejemplos: (1) corticosteroides, incluidos cortisona, dexametasona y metilprednisolona; (2) fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluidos ibuprofeno, naproxeno, acetaminofeno, aspirina, fenoprofeno (NALFON), flurbiprofeno (ANSAID), ketoprofeno, oxaprozina (DAYP^r O), diclofenaco sódico (VO^lT^a REN), diclofenaco potásico (CATAFLAM), etodolaco (LODINE), indometacina (iNDOCIN), ketorolaco (TORADOL), sulindac (CLINORIL), tolmetin (TOLECTIN), meclofenamato (M^eC^lOMEN), ácido mefenámico (PONS^t E^l ), nabumetona (RE^lA^f EN) y piroxicam (^f E^l DENE); (3) inmunosupresores, incluidos metotrexato (RHEUMATREX), leflunomida (ARAVA), azatioprina (IMURAN), ciclosporina (NEORAL, SANDIMMUNE), tacrolimus y ciclofosfamida (Cy TOXAN); (4) bloqueadores de CD20, incluido rituximab (RITUXAN): (5) bloqueadores del Factor de Necrosis Tumoral (TNF), incluidos etanercept (ENBREL), infliximab (REMICADE) y adalimumab (HUMIRA); (6) antagonistas del receptor de la interleucina-1, incluida anakinra (KINERET); (7) inhibidores de interleucina-6, incluido tocilizumab (ACTEMRA); (8) inhibidores de interleucina-17, incluido AIN457; (9) inhibidores de la quinasa Janus, incluido tasocitinib; y (10) inhibidores de syk, incluido fostamatinib.

Métodos sintéticos generales para preparar compuestos

Los compuestos útiles en los métodos de la presente invención se pueden preparar utilizando métodos que son conocidos por los expertos en la técnica. Los materiales de partida utilizados para preparar los compuestos de la presente invención están disponibles comercialmente o pueden prepararse empleando métodos de rutina conocidos en la técnica.

Ensayos biológicos

Los siguientes son ejemplos de ensayos biológicos útiles con los métodos de la invención. Los ensayos proporcionados en el presente documento no son limitantes y se pueden utilizar otros ensayos ahora conocidos, o descubiertos posteriormente, por un experto en la técnica para el mismo propósito que los ensayos proporcionados a continuación.

Los compuestos divulgados en el presente documento son activos como inhibidores de GLS-1. Los compuestos divulgados en la Tabla 1 se sintetizaron y probaron y tenían CI⁵⁰ de menos de 100 nM.

Los compuestos divulgados en el presente documento también son activos en la inhibición de la proliferación de células cancerosas A549. Los compuestos divulgados en la Tabla 1 se sintetizaron y probaron y tenían CI⁵⁰ de menos de 100 nM. Se espera que estos compuestos sean activos contra otros cánceres divulgados en el presente documento, tales como aquellos en los que la vía NRF2/KEAP1 en las células cancerosas está desregulada, la señalización de NRF2 en las células cancerosas es hiperactiva, el ácido nucleico de las células cancerosas comprende una mutación de pérdida de función en KEAP1, el ácido nucleico de dicho sujeto comprende una mutación de ganancia de función en NRF2, las células cancerosas tienen un aumento de la concentración intracelular de glutatión.

Receta de tampón de lisis de glicerol

Concentración final

2 ml Tris-HCl 1M pH 7,4 20 mM

3 ml de NaCl 5M 150 mM

15 ml glicerol al 100% 15%

1ml Tritón-X 100 al 100% 1%

79 ml de Agua Destilada (100 ml totales)

A cada mililitro se le añaden antes de utilizar: 100 ul de SDS al 10%, 5 gl de PMSF 200 mM, 10 ul de Proteasa HALT, 1 ul de Benzonase

Ensayo de viabilidad celular

Medios de cultivo celular: Todas las células se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco11875-119) con glutamina 2 mM FBS al 10 % (Gibco16000-044) a menos que se indique lo contrario.

Las células se cultivaron en Corning Costar 3603 de color negro de 96 pocillos a densidades para permitir el crecimiento en fase logarítmica durante todo el experimento (véase la tabla a continuación) el Día 0. Se permitió que las células se asentaran y se adhirieran durante la noche. Las células se cultivaron en placas por triplicado para cada concentración y control examinados. El Día 1, se retiró el medio de las células y se reemplazó por RPMI-1640 FBS sometido a diálisis al 10% (Gibco26400-044) con la concentración indicada de compuesto IACS (concentración inicial 1 |uM, diluida 1:3 hasta una final de 0,004 |uM), DMSO al 0,01% o estaurosporina 1 gM como se indica. Las células se incubaron con compuestos o controles relevantes durante 72 horas. El Día 4, 72 horas después del tratamiento, las células se analizaron mediante Cell Titer Glo (PromegaG7573) según las instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron en modo de luminiscencia en un lector de placas PheraStarFS. Se recopilaron datos, se promediaron las réplicas, se calcularon y analizaron las desviaciones típicas mediante análisis de regresión no lineal con cuatro (4) parámetros para generar las CI⁵⁰ para cada línea celular analizada.

Análisis de los niveles de glutatión: Las células se cultivaron en placas Corning Costar 3603 de 96 pocillos al doble de la densidad de la tabla que se muestra arriba el Día 0. Se permitió que las células se asentaran y se adhirieran durante la noche. Las células se sembraron en placas por triplicado para cada concentración y control examinados. El Día 1, se retiró el medio de las células y se reemplazó por RPMI-1640 FBS sometido a diálisis al 10% (Gibco26400-044) con la concentración indicada de IACS-011393 (concentración inicial 1 uM, diluida 1:3 hasta una final de 0,004 uM), o DMSO al 0,01% como se indica. Las células se incubaron con compuestos o controles relevantes durante 24 horas. El Día 2, 24 horas después del tratamiento, las células se analizaron mediante GSH-Glo (PromegaV6912) según las instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron en modo de luminiscencia en un lector de placas PheraStarFS. Los pocillos duplicados se colocaron en placas y a continuación, se tiñeron con cristal violeta para corregir las diferencias en el crecimiento celular como se describe a continuación.

Ensayo de actividad enzimática GLS-1

El siguiente es un ejemplo no limitante de un ensayo que puede utilizarse para evaluar la eficacia biológica de los compuestos útiles en los métodos de la invención o para determinar si un compuesto es un inhibidor selectivo de GLS-1.

La inhibición de GAC humana recombinante purificada mediante concentraciones variables de inhibidores puede evaluarse mediante un ensayo enzimático de doble acoplamiento. El glutamato producido por la reacción de la glutaminasa es utilizado por la glutamato oxidasa para producir a -cetoglutarato, amoníaco y peróxido de hidrógeno. Este peróxido de hidrógeno es posteriormente utilizado por la peroxidasa de rábano picante para producir resorufina en presencia de Amplex UltraRed. El tampón de ensayo consistía en Hepes 50 mM (pH 7,4), EDTA 0,25 mM y Triton X-1000,1 mM. La GAC se incubó con fosfato de potasio (10 minutos a temperatura ambiente) antes de la incubación con el inhibidor (10 minutos a temperatura ambiente). Las condiciones de reacción finales fueron las siguientes: GAC 2 nM, fosfato de potasio 50 mM, glutamato oxidasa 100 mU/mL (Sigma), glutamina 1 mM (Sigma), peroxidasa de rábano picante 100 mU/mL (Sigma), Amplex UltraRed 75 pM (Life Technologies) y DMSO al 1% (v/v). La producción de resorufina se controló en un lector de placas Perkin Elmer Envision (excitación 530 nm, emisión 590 nm) en modo cinético o punto final (a los 20 minutos). Los valores de CI⁵⁰ se calcularon utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros.

Ensayo de proliferación

Las células A549 se mantuvieron de forma rutinaria en medio RPMI 1640 (número de catálogo de Gibco 11875-093) complementado con suero bovino fetal sometido a diálisis al 10 % utilizando una incubadora humidificada (37°C, CO² al 5% y O² ambiental). En la preparación para el ensayo de viabilidad, las células se inocularon en CulturPlates de color negro de 384 pocillos (Perkin Elmer) a una densidad de 1.000 células/pocillo en un volumen de 40 ul. Después de una incubación de 24 horas a 37°C, CO² al 5% y O² ambiental, las células se trataron con el compuesto (10 ul) en una concentración final de DMSO de 0,5 % (v/v). A continuación, las microplacas se incubaron durante 72 horas (37°C, CO² al 5% y O² ambiental). Posteriormente se añadió Cell Titer Fluor (Promega) (10 ul de reactivo 6x) y se mezcló durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se incubaron durante 30 minutos (37°C, CO² al 5% y O² ambiental) y posteriormente se leyó la fluorescencia en el lector de placas Perkin Elmer Envision. Los valores de CI⁵⁰ se calcularon utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros.

Ensayo de acoplamiento a la diana

Las células A549 se cultivaron en placa a razón de 400.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Las células H727 se cultivaron en placas a razón de 800.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra en placas, se retiraron los medios y se reemplazaron por medios que contenían IACS-011393 1 pM o DMSO al 0,01% (control). La recolección se realizó inmediatamente en un punto de tiempo de 0 h retirando 250 pl de medio de cada pocillo a un tubo Eppendorf de 1,7 mL. Estas muestras se colocaron a -20°C para su almacenamiento. Las recolecciones subsiguientes para cada punto de tiempo se realizaron de la misma manera. Todas las muestras se almacenaron a -20°C hasta la etapa de análisis. A las 24 h, se recogieron 250 pl adicionales de medio de cada muestra. Los medios se congelaron después de la recolección. A t = 0 y t = 24, los productos lisados celulares se recolectaron mediante lisis con tampón de lisis de glicerol (véase más abajo) añadiendo 200 ul de tampón de lisis a cada pocillo, incubando a 37 grados durante 5 min y recolectando todo el producto lisado en un tubo de microcentrífuga. En cada punto de tiempo, se fijó un pocillo para cada condición y se tiñó con cristal violeta para normalizar el número de células (véase el protocolo a continuación). Todas las muestras de cristal violeta se solubilizaron después de la recolección en el punto de tiempo final y se utilizaron para normalizar los datos recopilados. Las muestras recolectadas se analizaron para determinar el contenido de glutamina y glutamato utilizando el bioanalizador YSI2950 equipado con membranas para medir las sustancias químicas relevantes.

Protocolo de tinción con cristal violeta

Se combinaron 500 mg de polvo de violeta cristal con 35 mL de EtOH del 100 % en un tubo estéril de 50 mL hasta que este se disolvió. La mezcla se transfirió a un vaso de precipitados de 1 L, el tubo se lavó con ddH²O, y se añadió ddH²O al vaso de precipitados hasta un volumen final de 500 mL. La mezcla se esterilizó por filtración utilizando un filtro de 0,45 pm. Los medios se retiraron y desecharon (incluidos los pocillos sin células como fondo). Se añadieron a los pocillos 50 pl de colorante violeta cristal EtOH del 10 % y se tiñeron durante 10 min. El tinte se eliminó de los pocillos y se desechó en un contenedor de residuos. Se hizo correr agua en un vaso de precipitados grande o cubo de hielo y la placa se enjuagó repetidamente en el agua. El líquido restante se sacudió en el fregadero. La placa se dejó boca abajo, descubierta durante al menos 5 horas para que se secara. Una vez completamente seca, se solubilizó en ácido acético al 10% añadiendo 100 pL a todos los pocillos teñidos. Después de 5 minutos, todos los pocillos se mezclaron con pipeta y, después de otros 5 minutos, se leyeron en Pherastar a una DO de 590 nm.

Tinción y cuantificación de daños en el ADN

Las células se cultivaron en placas Corning Costar 3603 de 96 pocillos y se trataron con DMSO al 0,01% o IACS-0113931 pM durante 48 horas. A continuación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Triton X100 al 0,5 %. Las células fijadas se tiñeron con Anti-Y H2AX, conejo (Bethyl IHC-00059)(1:500) durante 2 horas a 37°C. El anticuerpo secundario utilizado fue anticuerpo anti-conejo de burro marcado con Alexa Fluor 546 (Invitrogen A10040) (1:150) simultáneamente con Hoechst 33342, Trihidrocloruro, Trihidrato (Invitrogen, H3570) (1:1000) durante 1 h a 37°C. El daño del ADN se midió como una señal de yH2AX por núcleo utilizando el sistema de detección de alto contenido PerkinElmer Operetta con el soporte lógico Harmony. En primer lugar, los núcleos se seleccionaron mediante tinción de Hoechst. A continuación, las células individuales se seleccionaron en función del tamaño y la forma del núcleo. Las células apoptóticas y mitóticas se excluyeron en función de la intensidad máxima de Hoechst en el núcleo. Los focos de daño en el ADN se identificaron dentro de los núcleos seleccionados utilizando el bloque de análisis "buscar puntos en el canal Alexa 546". Finalmente, se calculó la intensidad total de Alexa 546 dentro de todos los "puntos" en el núcleo, o el número total de puntos en el núcleo, promediado por celda.

Preparación de muestras para metabolómica

Las células A549 se cultivaron en placa a 4,5x106 células por placa de 10 cm 24 h antes del tratamiento. Las células se trataron el día cero (d.0) a tiempo cero (t.0) con DMSO al 0,01%, 1 pM, 100 nM o 10 nM de IACS-011393 durante 24 h. El día 1 (d.1), 2 horas antes de la recolección, las muestras se lavaron con 5 mL de medio que contenía FBS sometido a diálisis al 10 %. Se añadieron 10 mL de medio a las placas y las placas se devolvieron a la incubadora durante 2 h. A continuación, se aspiró el medio de las placas y se añadieron inmediatamente 4 mL de MeOH enfriado al 80% (-80°C). Las placas se incubaron a -80°C durante 15 minutos. A continuación, las células se rasparon con un raspador de células para liberar las células mientras se mantenían las placas en hielo seco. La mezcla de MeOH/producto lisado celular se recogió y se transfirió a tubos cónicos sobre hielo seco. Los tubos se centrifugaron a máxima velocidad en una centrífuga refrigerada a 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a otro conjunto de tubos cónicos sobre hielo seco mediante decantación. El precipitado restante se resuspendió en 500 pl de MeOH frío y la mezcla se trasladó a un tubo de microcentrífuga. Los tubos de microcentrífuga se centrifugaron a máxima velocidad durante 5 minutos en una microcentrífuga enfriada a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo cónico con el sobrenadante recolectado previamente. Este paso se repitió 2 veces. Se transfirió 1 mL del sobrenadante recolectado a tubos de muestra/envío preetiquetados y se sometió a secado por Speedvac. A continuación, las muestras se enviaron a la instalación central Centro Médico Beth Israel Deaconess Mass Spectrometry para su análisis.

Análisis de muestras de metabolómica

El análisis de abundancia diferencial de los niveles de metabolitos se llevó a cabo utilizando una función de prueba t moderada del paquete limma de Bioconductor (Smyth 2005). Se aplicó un factor de normalización a los datos del pico de metabolitos para tener en cuenta la variación en los recuentos de células. El factor de normalización se calculó definiendo primero un vector, Nmed, como la mediana del área del pico para cada metabolito en un conjunto de muestras. A continuación, para una muestra i, se calcula un vector de multiplicidad de cambio, FCi, dividiendo las áreas de los picos de los metabolitos por Nmed. El factor de escala para la muestra i se estableció como el valor de la mediana de FCi. Los cambios significativos en los niveles de metabolitos se definieron como un cambio en la abundancia de al menos un aumento/disminución de 1,5 veces y un valor de p de la prueba t <= 0,05. Los símbolos fueron asignados de acuerdo a los valores p con los siguientes puntos de corte: = p > 0,005 y p <= 0,05, * = p > 0,00005 y p <= 0,005, ** = p <= 0,00005.

Análisis de muestras de flujo metabólico y LC/MS

Las células A549 se sembraron en placa a 4,5x105 células por placa de 6 cm 24 h antes del tratamiento. El Día del experimento, las células se trataron con DMSO al 0,01% o 1 pM de IACS-011393 durante 6 h en presencia o ausencia de 13C-Glutamina (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., CLM01822) completamente marcada. Se añadió glutamina marcada a medios regulares que no contenían glutamina sin marcar, de modo que las células solo pudieran metabolizar la forma marcada. Después del tratamiento, se aspiró el medio de las placas, se lavaron las placas 2 veces en PBS frío y se añadieron inmediatamente 500 pl de MeOH enfriado al 80% (-80 °C). Las placas se incubaron a -80°C durante 15 minutos. A continuación, las células se rasparon con un raspador de células para liberar las células mientras se mantenían las placas en hielo seco. La mezcla de MeOH/producto lisado celular se recogió y se transfirió a tubos cónicos sobre hielo seco. Los tubos se centrifugaron a máxima velocidad en una centrífuga refrigerada a 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a otro conjunto de tubos cónicos sobre hielo seco mediante decantación. El sedimento restante se resuspendió en 500 ul de MeOH frío y la mezcla se trasladó a un tubo de microcentrífuga. Los tubos de microcentrífuga se centrifugaron a máxima velocidad durante 5 minutos en una microcentrífuga enfriada a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo cónico con el sobrenadante recolectado previamente. Y este paso se repitió 2 veces. El sobrenadante recogido se secó con Speedvac. Las muestras secas se reconstituyeron con acetonitrilo/agua (1:1) y se analizaron en un sistema HPLC Agilent 1209 acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (Q-TOF) de cuadrupolo Agilent 6550. Las muestras (10 pl) se inyectaron en una columna Waters XBridge Amide para el análisis HILIC/MS. Las fases móviles A, acetato de amonio 20 mM, ácido acético 20 mM en agua/acetonitrilo al 95% y B, acetonitrilo al 100% se utilizaron con una elución en gradiente lineal desde 85% de B hasta 100% de A durante un tiempo total de muestra de 30 min. Los datos sin procesar se procesaron utilizando el análisis cualitativo Agilent Mass Hunter. Los isotopólogos de los supuestos metabolitos que incorporaban carbonos derivados de [U-13C]-glutamina se identificaron en función de sus masas precisas y tiempos de retención que se confirmaron adicionalmente con los de patrones auténticos y bibliotecas de compuestos de bases de datos públicas.

Puntuación Nrf2

Se utilizó el enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única (ssGSEA) para puntuar la actividad de NRF2 en líneas celulares de cáncer de pulmón con datos de expresión publicados como parte de la Enciclopedia de Líneas Celulares de Cáncer (CCLE). ssGSEA asigna un enriquecimiento basado en la distribución de un conjunto de genes con relación a todos los demás genes dentro de una sola muestra (Barbie et al, 2009). Las puntuaciones de enriquecimiento de ssGSEA se centraron en la mediana y se normalizaron mediante la desviación típica de las puntuaciones de enriquecimiento de todas las líneas celulares de pulmón en el panel CCLE. El conjunto de genes característicos de NRF2 se basó en un conjunto conocido de genes diana de NRF2: ABCC1, ABCC2, G6PD, GCLC, GCLM, GRK6, GSR, GSTM4, HMOX1, ME1, MGST1, NQO1, PRDX1, TXN y TXNRD1.

Análisis de la expresión génica

Se realizaron micromatrices Affymetrix U133 Plus2.0 para cada condición por triplicado. Se usó un método robusto de promedio de matriz múltiple (RMA) con opciones predeterminadas (con corrección de fondo, normalización de cuantiles y transformación log) para normalizar los datos sin procesar de lotes utilizando el paquete affy de R/Bioconductor (Irizarry et al 2003). El análisis de expresión diferencial se llevó a cabo utilizando una función de prueba t moderada del paquete limma de Bioconductor (Smyth 2005). Se dice que un gen se expresa diferencialmente si el valor de p corregido por FDR es inferior a 0,05.

Análisis de la Producción de Especies de Oxígeno Reactivo

Un día antes del experimento, se sembraron células A549 en placas de 6 pocillos (250.000 células por pocillo). El Día del experimento, las células se trataron con DMSO al 0,01% o IACS-011393 1 pM durante 24 horas. Al Día siguiente, se trató un pocillo asignado con peróxido de hidrógeno durante 20-30 minutos como control positivo para la generación de ROS. A continuación, todos los pocillos se tiñeron con CM-H2DCFDA (5 pM, Life Technologies) durante 30 minutos a 37°C, se lavaron con 1XPBS, se recogieron mediante tripsinización y se resuspendieron en 400 pl de medio RPMI sin fenol. Las células se filtraron a través de un filtro de células de 40 pm y se analizaron utilizando un citómetro de flujo (LSR Fortessa). Los valores que se muestran son las multiplicidades de cambio en comparación con DMSO para la intensidad de fluorescencia media de toda la población.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos se proporcionan varias realizaciones de la presente invención. Los siguientes ejemplos se presentan únicamente a modo de ilustración y para ayudar a los expertos en el uso de la invención. No se pretende de ninguna manera que los ejemplos limiten de otro modo el alcance de la invención.

Ejemplo 1. Las líneas celulares de CPCNP son diferencialmente sensibles a la inhibición de GLS.

Para investigar el papel de GLS en la regulación de la proliferación de células de CPCNP, los autores de la presente invención caracterizaron en primer lugar una sonda química diseñada para inhibir específicamente GLS-1. Los autores de la presente invención confirmaron que el compuesto de referencia (IACS-011393) es un potente inhibidor de GLS-1 (CI⁵⁰ 7,5nM) en un ensayo enzimático in vitro de doble acoplamiento (Figura 1A). La inhibición de GAC por concentraciones variables de IACS-011393 se evaluó mediante un ensayo enzimático de doble acoplamiento (pH 7,4) que contenía GAC 2 nM, fosfato de potasio 50 mM, glutamato oxidasa de 100 mU/mL, glutamina 1 mM, HRP 100 de mU/mL y Amplex Ultra Red 75 pM. La producción de resorufina se controló en un lector de placas Perkin Elmer Envision (excitación 530 nm, emisión 590 nm) durante 20 min.

En las células, la sonda química inhibe la conversión de glutamina en glutamato y reduce el consumo de oxígeno dependiente de glutamina, ambas medidas de actividad dependiente de GLS (Fig. 1B, 1C). La Figura 1B muestra que el acoplamiento a la diana se puede medir después del tratamiento con IACS-011393. Como medida de la actividad del compuesto sobre GLS en células, se midió la conversión de glutamina en glutamato en medios extracelulares y productos lisados celulares en muestras tratadas con DMSO (control) o IACS-011393. El tratamiento de las células durante 24 horas con IACS-011393 impidió la conversión de glutamina en glutamato (medida por la razón de glutamato a glutamina (GLU:GLN)). Esta inhibición fue evidente por una disminución en la razón GLU:GLN fuera de la célula y en los productos lisados celulares.

La Figura 1C muestra que las células diana A549 utilizan anaplerosis de glutamina para impulsar la respiración. Las células A549 se cultivaron en placa y a continuación, se privaron de nutrientes durante 60 minutos. Después de la inanición, las células se precargaron con las concentraciones indicadas de IACS-011393 para inhibir GLS. A continuación, se añadió glutamina 2 mM a los pocillos para activar el consumo de oxígeno y se cuantificó la tasa de consumo de oxígeno (OCR) mediante análisis Seahorse después de 20 minutos. IACS-011393 muestra una inhibición dependiente de la dosis del consumo de oxígeno dependiente de glutamina, lo que sugiere que las células A549 utilizan la anaplerosis de glutamina como fuente de metabolitos para el ciclo TCA. Este proceso está bloqueado por el inhibidor de glutaminasa ("GLSi").

A continuación, los autores de la presente invención buscaron determinar el beneficio terapéutico potencial de la inhibición de GLS en CPCNP. A través de una campaña de escrutinio de células, los autores de la presente invención identificaron una subpoblación de líneas celulares de CPCNP que son hipersensibles a la inhibición de GLS (CI⁵⁰2D viabilidad = 5 nM en "respondedores"; >10 pM en "no respondedores") (Fig. 1D). La Figura 1D muestra la sensibilidad diferencial a IACS-011393 en varias líneas de CPCNP. Las líneas de CPCNP A549, NCI-H2122, H1650 y H1395 se trataron con el compuesto no reivindicado IACS-011393 como en (A) anterior y se analizó la viabilidad a las 72 horas. Mientras que A549 y H2122 muestran sensibilidad nM a GLSi, las células H1395 y H1650 son resistentes al tratamiento con GLSi. Esto sugiere una sensibilidad diferencial con una posible variación genética entre estas líneas que guía la sensibilidad. Curiosamente, casi todas las líneas muestran un agotamiento de los niveles de glutamato intracelular indicativo de la inhibición de la glutaminasa. Esto sugiere que un subconjunto de líneas celulares de CPCNP tiene una dependencia específica del metabolismo de la glutamina para sobrevivir.

Ejemplo 2. La inhibición de GLS altera el equilibrio rédox en las líneas celulares respondedoras.

Para cuestionar el papel de la Glutaminasa en la regulación del metabolismo tumoral, se realizaron estudios metabolómicos específicos de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para caracterizar de manera integral las alteraciones metabólicas posteriores a la inhibición de GLS (Fig. 2). Las células A549 tratadas con 1 gM del compuesto no reivindicado IACS-011393 durante 24 horas se sometieron a elaboración de perfiles metabólicos globales después del aislamiento de los productos lisados mediante extracción con metanol. Los cambios en los niveles de metabolitos reflejaron una acumulación de glutamina en las células después de GLSi acompañada de una disminución en la actividad del ciclo TCA; probablemente debido a la disminución de la anaplerosis de glutamina.

Además, se observaron disminuciones en las reservas de nucleótidos libres. Esta disminución de actividades metabólicas estuvo acompañada de un aumento en la actividad de la ruta de las pentosas fosfato, presumiblemente para intentar mantener el equilibrio rédox en ausencia de glutatión derivado de la descomposición de glutamina a glutamato dependiente de g Ls , y la activación de una ruta de rescate de ribosa en respuesta al tratamiento con IACS-011393, lo que sugiere que las células intentan mantener las reservas de nucleótidos y tioles en respuesta a la disminución de la glutaminólisis. Cabe señalar que estos cambios metabólicos están silenciados o ausentes en las líneas no respondedoras tratadas con IACS-011393, como se muestra en los gráficos de los niveles de metabolitos en las células H727 (una línea celular no respondedora). También cabe destacar que en las líneas celulares no respondedoras, tales como las células H727, el consumo de alanina y aspartato, presumiblemente para regenerar las reservas intracelulares de glutamato, se regula por incremento en respuesta a GLSi. Esto sugiere que las células no respondedoras son menos dependientes de las reservas de glutamato derivadas de glutaminasa para sobrevivir. Los cambios significativos en los niveles de metabolitos se definieron como un cambio en la abundancia de al menos un aumento/disminución de 1,5 veces y un valor p de la prueba t <= 0,05. Los símbolos se asignaron de acuerdo con los valores p con los siguientes puntos de corte: = p > 0,005 y p <= 0,05; * = p > 0,00005 y p <= 0,005; ** = p <= 0,00005. Abreviaturas: ribonucleótido de aminoimidazol carboxamida (AICAR), inosina monofosfato (IMP), ribosa 5-fosfato (R5P), sedoheptulosa-1-7-fosfato (S7P), sedoheptulosa-1,7-bisfosfato (SBP), gliceraldehído-3-fosfato (G3P), dihidroxiacetona-fosfato (DHAP), eritrosa-4-fosfato (E4P).

El análisis del flujo de carbono marcado con isótopos estables del metabolismo de la glutamina revela una contribución a la síntesis de glutamato y glutatión en las células A549 (Fig. 2B). Se cultivaron células A549 en presencia de DMSO o IACS-011393 en medios que contenían 13C-glutamina completamente marcada como única fuente de glutamina. Después de 6 horas, los productos lisados celulares se extrajeron y analizaron mediante LC/MS para examinar la incorporación de carbonos marcados de forma estable a metabolitos dentro de las células. Como se muestra en el panel de la izquierda, el glutamato completamente marcado está presente en las células que han sido tratadas con DMSO. Sin embargo, en las células tratadas con IACS-011393, no hay carbonos marcados en las reservas de glutamato que quedan en la célula (m+5, barras de color blanco). Además, las células tratadas con DMSO contienen carbonos marcados en sus reservas de glutatión, mientras que las células tratadas con IACS-011393 no. Estos resultados sugieren que la inhibición de la glutaminasa previene la conversión de glutamina en glutamato y, posteriormente, la inclusión de glutamato en las reservas de glutatión, alterando así el equilibrio rédox dentro de las células respondedoras.

Cuando se inhibe la GLS en las células, los carbonos marcados están ausentes de las reservas de glutamato y glutatión, lo que sugiere que GLSi previene la síntesis de glutatión derivada de glutamina (Fig. 2C). La Fig. 2C muestra una representación esquemática de la incorporación de carbonos de 13C-Glutamina completamente marcada a glutatión en ausencia o presencia de GLSi - Una representación esquemática de los resultados presentados en la Fig. 2B. Los círculos oscuros representan átomos de carbono marcados en células con glutaminasa funcional (izquierda) o células tratadas con un inhibidor de glutaminasa (derecha).

Este análisis reveló que la inhibición de GLS en líneas celulares "respondedoras" indujo cambios metabólicos significativos que involucraban múltiples vías, las más significativas de las cuales son intermedias en el ciclo de TCA y alteró el equilibrio rédox. De acuerdo con el papel de la glutamina en la regulación del equilibrio rédox intracelular, la inhibición de GLS disminuyó la concentración eficaz de glutatión e indujo la actividad de las vías de recuperación de pentosa fosfato y ribosa. Curiosamente, los cambios en estas vías metabólicas se silenciaron en las líneas de CPCNP "no respondedoras", lo que confirma una adicción diferencial a la glutamina.

Ejemplo 3. La modulación de la vía NRF2/KEAP1 confiere sensibilidad a la inhibición de GLS.

Los autores de la presente invención buscaron información molecular sobre la respuesta diferencial a la inhibición de GLS. Dado el cambio metabólico observado hacia las vías involucradas en el equilibrio rédox, los autores de la presente invención centraron su atención en los modificadores genéticos de la defensa antioxidante. El análisis genético mostró que muchas líneas celulares respondedoras a GLSi albergaban alteraciones somáticas dentro de la vía NRF2/KEAP1. NRF2 es un factor de transcripción que se une al Elemento de Respuesta Antioxidante (ARE) e inicia la transcripción de varios genes implicados en la regulación del equilibrio rédox y la desintoxicación celular.

KEAP1 es un regulador negativo de NRF2, que mantiene la actividad a través de la degradación proteosomal inducida.

Se analizó un panel de líneas de CPCNP para determinar la respuesta al compuesto no reivindicado IACS-011393 como se describe en el Ejemplo 2 anterior. Las líneas celulares con mutaciones de pérdida de función en Keap1 o mutaciones de ganancia de función en Nrf2 fueron sensibles a la inhibición de GLS con IACS-011393, mientras que la mayoría de las células que carecían de mutaciones activadoras en esta vía no fueron sensibles (Fig. 3A). Las mutaciones en las líneas respondedoras caen dentro de los dominios que median la interacción entre Keap1 y Nrf2. Estas mutaciones provocan una señalización hiperactiva de Nrf2 y una mayor tolerancia al estrés rédox dentro de las células. Se enumeran los valores CI⁵⁰ promedio (n=3 a 10 para cada línea individual). La puntuación de Nrf2 es una medida de la expresión relativa de los genes diana de Nrf2.

En las líneas de CPCNP que responden a GLSi, esta vía está hiperactivada a través de mutaciones de pérdida de función en KEAP1 o mutaciones de ganancia de función en NRF2 que limitan o previenen la interacción de estas dos proteínas (Fig. 3B). Las mutaciones en las líneas celulares respondedoras se encuentran dentro de dominios funcionales importantes de Keap1 y Nrf2, como se muestra en una representación esquemática de mutaciones ilustrativas en Keap1 y Nrf2 en líneas celulares probadas en la Fig. 3A. La mayoría de las mutaciones se encuentran dentro de dominios funcionales importantes que regulan la actividad de Keap1 o la unión de Keap1 -Nrf2. La excepción en las líneas celulares probadas es la mutación D77N en las células NCI-H1568 que cae fuera de uno de los dos dominios de unión a Keap1 en Nrf2. Estos datos sugieren que la pérdida de la regulación Keap1 de Nrf2 da como resultado hipersensibilidad a GLSi.

El acoplamiento a la diana se observa tanto en líneas celulares respondedoras como no respondedoras (Fig. 3C). El tratamiento de las células con IACS-011393 da como resultado una menor conversión de glutamina en glutamato, según lo supervisado por la proporción intracelular de GLU:GLN en las líneas celulares respondedoras y no respondedoras. Los datos representativos se muestran en la Figura 3C para las células A549 (una línea respondedora) y las células H727 (una línea no respondedora), lo que sugiere que las líneas respondedoras son hiperdependientes de la glutaminólisis mediada por GLS, mientras que las líneas no respondedoras son menos dependientes de este proceso.

Las células con señalización hiperactiva de NRF2 parecen ser especialmente sensibles a GLSi debido, en parte, al hecho de que NRF2 impulsa la expresión de glutamato-cisteína ligasa (GCLC), la enzima limitante de la velocidad que cataliza la síntesis de glutatión a partir de reservas intracelulares de glutamato y cisteína. La hipótesis de los autores de la presente invención es que las células mutantes para NRF2/KEAP1 han desarrollado una dependencia del glutatión para regular el equilibrio rédox. Por lo tanto, en condiciones en las que se inhibe la síntesis de GLS y glutatión, las células son incapaces de producir suficientes captadores de radicales libres para mantener el equilibrio rédox dentro de la célula. La regulación por incremento de las vías de rescate de pentosa fosfato y ribosa observada a través de la elaboración de perfiles metabólicos sugiere un esfuerzo compensatorio inútil para restaurar el equilibrio rédox. En conjunto, estos datos sugieren que la modulación de la vía NRF2/KEAP1 sensibiliza las líneas celulares de CPCNP a la inhibición de GLS.

Ejemplo 4. La inhibición de GLS induce ROS y daño al ADN en células de CPCNP mutantes para NRF2/KEAP1.

La sensibilidad diferencial de las líneas celulares de CPCNP mutantes para NRF2/KEAP1 sugirió un papel del glutatión en la regulación del equilibrio rédox. De acuerdo con esta hipótesis, la inhibición de GLS indujo una disminución significativa en el glutatión intracelular y un aumento simultáneo en especies reactivas de oxígeno (Fig.4A, 4B). La Figura 4A muestra que los niveles de glutatión disminuyen después del tratamiento con el compuesto no reivindicado IACS-011393 en las líneas celulares respondedoras. Puesto que Nrf2 impulsa la expresión de glutamil-cisteína ligasa (GCLC) que sintetiza glutatión (GSH) a partir de glutamato (GLU), glicina y cisteína, los niveles de GSH se analizaron en líneas celulares después del tratamiento con IACS-011393. Los niveles de GSH se redujeron significativamente en las células A549, H460 y H2122 después de 24 horas de tratamiento (1 gM). Una línea no respondedora representativa, H727, no muestra una disminución significativa en los niveles de GSH después de GLSi, lo que sugiere que estas células tienen mecanismos alternativos para mantener el equilibrio rédox. Esto apoya la idea de que las células mutantes para Keap1/Nrf2 dependen especialmente de la glutaminólisis para el mantenimiento del equilibrio rédox.

La Figura 4B muestra que la pérdida de glutatión después del tratamiento con un inhibidor de glutaminasa conduce a una acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares. Se analizó la acumulación de ROS intracelular en las células después de 24 h de tratamiento con IACS-011393 mediante tinción con CM-H² DCFDA (un indicador de estrés oxidativo general) y análisis por citometría de flujo. Para cada condición, el cálculo de la intensidad de fluorescencia media permite la comparación de la acumulación de ROS entre las muestras de control y las tratadas. El tratamiento de las células respondedoras con IACS-011393 (1 gM) durante 24 horas induce una acumulación de ROS que se correlaciona con el agotamiento de la reserva de GSH de las células. Las células H727 no muestran tal aumento en la acumulación de ROS, posiblemente debido a su capacidad para mantener reservas de glutatión a través de fuentes alternativas de generación de glutamato.

Los autores de la presente invención observaron una acumulación de focos yH2AX, un marcador de daño en el ADN y la causa probable de los efectos antiproliferativos observados tras la inhibición de GLS (Fig. 4C). La Figura 4C muestra la acumulación de daños en el ADN después de que el tratamiento con el compuesto IACS-011393 no reivindicado se pueda rescatar mediante la aplicación de glutatión que puede penetrar en las células. Las células A549 tratadas con DMSO o IACS-011393 durante 48 horas se tiñeron con Tinción de Hoechst (núcleos) y un anticuerpo contra ^yH2AX (puntos de daño al ADN) y a continuación, se analizaron mediante generación de imágenes de alto contenido. Los focos de yH2AX se contaron y cuantificaron por núcleo. La cuantificación (se muestran imágenes representativas) revela que el tratamiento con IACS-011393 induce daño en el ADN en las células A549. La aplicación exógena de glutatión que puede penetrar en las células 4 mM reduce la acumulación de daño en el ADN, presumiblemente al eliminar las ROS que se han acumulado después del tratamiento con IACS-011393.

El daño en el ADN inducido por GLSi y la inhibición de la proliferación celular se rescataron con el tratamiento con glutatión exógeno, lo que fortaleció adicionalmente la asociación genética entre la actividad transcripcional de GLS y NRF2. La Figura 4D muestra los resultados de las células A549 y H2122 que se trataron con IACS-011393 a las dosis indicadas en un ensayo de crecimiento de 72 horas. Al mismo tiempo, un subconjunto de las células tratadas con IACS-011393 recibió aplicaciones de GSH que podía penetrar en las células (una vez en el momento del tratamiento con IACS-011393, una vez 24 horas después del tratamiento y una vez 48 horas después del tratamiento). La aplicación de GSH exógeno rescató una parte significativa del crecimiento celular que se había inhibido después del tratamiento con IACS-011393. Estos datos respaldan la idea de que las líneas celulares mutantes para Keap1/Nrf2 son especialmente sensibles a GLSi debido a una gran dependencia de las reservas de glutatión impulsadas por Nrf2 que permiten que estas células crezcan en condiciones de estrés oxidativo extremo.

Cabe destacar que no se observó agotamiento de glutatión, ni inducción de ROS, ni acumulación de daño en el ADN en H727, una línea celular no respondedora. Estos datos sugieren que la inhibición de GLS en líneas celulares de CPCNP mutantes para NRF2/KEAP1 inhibe el crecimiento celular al alterar el equilibrio rédox. La reducción observada en el glutatión y el aumento de ROS se observaron tras el tratamiento con varias series estructuralmente distintas de inhibidores de GLS, tales como el compuesto no reivindicado IACS-011393, el compuesto no reivindicado BPTES, el compuesto no reivindicado CB-839 y el compuesto 13.

Ejemplo 5. La resistencia adquirida a GLSi implica mecanismos adaptativos que suministran fuentes alternativas de glutamato para mantener el equilibrio rédox.

Para definir adicionalmente la contribución del glutatión como limitante de la velocidad en CPCNP mutantes para NRF2/KEAP1, los autores de la presente invención sensibilizaron las células con una dosis CI90 (100 nM) del compuesto no reivindicado IACS-11393 durante 8 semanas hasta que surgieron clones resistentes. La re­ sensibilización de la población en masa (Fig. 5A) o de los clones individuales seleccionados (Fig. 5B) confirmó un cambio >3 log en los valores de CI⁵⁰. Para determinar los mecanismos de resistencia adaptativa al tratamiento con GLSi, los autores de la presente invención realizaron análisis metabolómicos (Fig. 5C) y transriptómicos (Fig. 5D) completos. De acuerdo con el papel definido de GLS en el mantenimiento del equilibrio rédox, se confirmó que los clones resistentes (i) producen fuentes alternativas de glutamato; (ii) activan vías alternativas para generar poder reductor; (iii) y regulan por incremento las vías que aportan intermedios al ciclo de TCA (Fig. 5D).

La Fig.5A muestra que las células tratadas crónicamente con GLSi adquieren resistencia al compuesto no reivindicado IACS-011393. Se transportaron poblaciones en masa de células A549 a medios que contenían concentraciones crecientes de GLSi en el transcurso de dos meses hasta una concentración alta de 100 nM. Las células se volvieron resistentes al compuesto (A549-CT, panel izquierdo) en comparación con las células de control parental (A549). Esta población en masa se sometió a continuación a selección clonal en presencia de IACS-011393 100 nM, y se identificaron múltiples clones resistentes a fármacos con respuesta alterada a GLSi (panel derecho, clones individuales comparados con la línea parental A549).

La Fig. 5B muestra que los clones resistentes a GLSi presentan activación de vías alternativas para mantener el equilibrio rédox. Los clones se sometieron a análisis metabolómicos de referencia y se compararon con la línea celular parental A549. Se muestran multiplicidades de cambio Log2 para los metabolitos que estaban significativamente regulados por incremento o por disminución en comparación con los niveles de referencia en la cepa parental. Estos datos indican que (a) los clones han desarrollado fuentes alternativas de glutamato; (b) las células han activado vías alternativas para generar poder reductor; (c) las vías que pueden contribuir con intermedios al ciclo de TCA independientemente de la glutaminólisis se han regulado por incremento.

La Fig. 5C muestra que los clones resistentes a GLSi presentan perfiles transcripcionales alterados para producir fuentes alternativas de glutamato y poder reductor. Los mismos clones analizados en la Fig. 5B se sometieron a elaboración de perfiles de ARN y se compararon con células parentales A549. Los cambios transcripcionales (se muestran la diferencias en la multiplicidad de cambio Log2) entre los clones fueron compatibles y mostraron una regulación por incremento distinta de enzimas y proteínas involucradas en la producción de glutamato a partir de fuentes distintas a la glutaminasa.

La Fig. 5D proporciona una visión global de la adaptación adquirida a la inhibición de la glutaminasa. Una visión global de los cambios metabólicos y transcriptómicos observados en las células resistentes a GLSi crónico muestra que las células A549 pueden iniciar múltiples vías que brindan poder reductor a las células que no pueden convertir la glutamina en glutamato y glutatión a través de la actividad de la glutaminasa. Los temas principales son las fuentes alternativas de glutamato, que pueden utilizarse para la síntesis de glutatión y la anaplerosis, junto con una regulación por incremento de las vías involucradas en la generación de intermedios reductores (p. ej., NADPH a partir de enzima málica). El texto en negrita representa los metabolitos o los transcritos que aumentaron con relación a las células parentales, mientras que el texto en cursiva representa los metabolitos o los transcritos que disminuyeron con relación a las células parentales. Abreviaturas: S-adenosil-L-metionina (SAM), S-adenosil-L-homocisteína (SAH), homocisteína (hcys), S-metil-5-tioadenosina (MTA), ribonucleótido de aminoimidazol carboxamida (AICAR), monofosfato de inosina (IMP), ribosa 5-fosfato (R5P), sedoheptulosa-1-7-fosfato (S7P), sedoheptulosa-1,7-bisfosfato (SBP), gliceraldehído-3-fosfato (G3P), dihidroxiacetona-fosfato (DHAP), eritrosa-4-fosfato (E4P).

Ejemplo 6. La desregulación de NRF2/KEAP1 sensibiliza las células cancerosas a la inhibición de GLS.

La vía NRF2/KEAP1 regula el equilibrio rédox en parte a través de la regulación transcripcional de GCLC, la enzima necesaria para convertir el glutamato y la cisteína derivados de la glutamina en glutatión (Fig. 6). La Figura 6 muestra que las células con mutaciones de pérdida de función en KEAP o mutaciones de ganancia de función en NRF2 se vuelven adictas a niveles altos de glutatión para hacer frente al estrés oxidativo durante condiciones de proliferación rápida (Célula Tumoral, Fig. 6A). Cuando se inhibe GLS en estas células (Célula Tumoral Tratada, Fig. 6B), las reservas intracelulares de glutamato se reducen drásticamente y, por lo tanto, se inhibe la síntesis de glutatión. Esta respuesta cambia el equilibrio rédox de las células tumorales, lo que provoca un aumento en la acumulación de ROS y daños en el ADN que conducen a la muerte celular.

Como principal antioxidante intracelular, el glutatión proporciona un poder reductor para limitar los efectos mutagénicos y dañinos sobre el ADN de las ROS intracelulares. Los tumores que albergan mutaciones somáticas que desregulan la vía NRF2/KEAP1 desarrollan una dependencia del glutatión y una adicción a la glutamina. La inhibición de GLS reduce la conversión de glutamina en glutamato y, por lo tanto, inhibe la síntesis de glutatión. Al alterar el equilibrio rédox, las células mutantes para NRF2/KEAP1 acumulan ROS, lo que induce daño en el ADN e induce la muerte celular. Este modelo explica la exquisita sensibilidad de las líneas celulares de CPCNP mutantes para NRF2/KEAP1 a la inhibición de GLS.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de glutaminasa seleccionado entre:

N,N'-(5,5'-(2,2'-sulfonilbis(etano-2,1-diil))bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-(piridin-2-il)acetamida),

N-metil-1-{4-[6-(2-{4-[3-(trifluorometoxi)fenil]piridin-2-il}acetamido)piridazin-3-il]butil}-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

1-(2-fluoro-4-(5-(2-(piridin-2-il)acetamido)-1,3,4-tiadiazol-2-il)butil)-N-((4-(trifluorometil)piridin-2-il)metil)-1 H-1.2.3- triazol-4-carboxamida,

1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

N-(piridin-2-ilmetil)-5-(3-(6-(2-(3-(trifluorometoxi)fenil)acetamido)piridazin-3-il)pirrolidin-1-il)-1,3,4-tiadiazol-2-carboxamida,

(R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(3-(trifluorometoxi)fenil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(2-fluoro-4-(6-(2-(6-metil-4-(trifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4- carboxamida,

(R)-1-(4-(6-(2-(4-(ciclopropildifluorometil)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1 -(2-fluoro-4-(6-(2-(1 -(3-(trifluorometoxi)fenil)-1 H-imidazol-4-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1.2.3- triazol-4-carboxamida,

1-(4-(6-(2-(4-ciclobutoxipiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, 1-(4-(6-(2-(4-ciclobutoxipiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida, 1-(4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)butil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

1- (4-(6-(2-(4-(3,3-difluorociclobutoxi)piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

(R)-1-(4-(6-(2-(4-ciclopropilpiridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)-2-fluorobutil)-N-metil-1 H-1,2,3-triazol-4-carboxamida,

5- (3-(6-(2-(piridin-2-il)acetamido)piridazin-3-il)pirrolidin-1-il)-N-((4-(trifluorometil)piridin-2-il)metil)-1,3,4-tiadiazol-2- carboxamida, y

N,N'-(5,5'-(ciclohexano-1,3-diil)bis(1,3,4-tiadiazol-5,2-diil))bis(2-fenilacetamida),

o una de sus sales, para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón en donde la vía NRF2/KEAP1 en las células cancerosas está desregulada.

2. Un inhibidor de glutaminasa para su uso según la reivindicación 1, en donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas.

3. Un inhibidor de glutaminasa para su uso según la reivindicación 2, en donde el cáncer tiene una mutación en NRF2 o KEAP1.

4. Un inhibidor de glutaminasa para su uso según la reivindicación 3, en donde la mutación se elige entre KEAP1-G333C; KEAP1-D236H; KEAP1-A170_R204del; KEAP1-G364C; NFE2L2-G31A; KEAP1-G462W; KEAP1-R272L; KEAP1-V568F; KEAP1-W252C; KEAP1-R336 y NFELE2-D77N junto con NFELE2-D77_E79delDEE.

5. Un inhibidor de glutaminasa para su uso según la reivindicación 3, en donde la mutación es una mutación somática.

6. Un inhibidor de glutaminasa para su uso según la reivindicación 5, en donde la mutación somática está en KEAP1 o en el dominio de unión a KEAP1 de NRF2.

7. Un inhibidor de glutaminasa para su uso según la reivindicación 3, en donde el cáncer tiene una mutación de pérdida de función en KEAP1 o una mutación de ganancia de función en NRF2.