CN108348612A - 包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、与能够增加受试者的癌细胞中h2o2水平的化合物的组合 - Google Patents

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Abstract

用作药物的包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合。本发明涉及包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、特别是S‑甲基4‑(二甲氨基)‑4‑甲基戊‑2‑炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4‑(二甲氨基)‑4‑甲基‑2‑戊炔硫代酸S‑甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合，该组合特别的用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞与对照值相比不过度产生H2O2、并且对于25000个细胞具有低于5nmol的GSH水平。

Description

包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、与能够增 加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合
技术领域
本发明涉及包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合，该组合特别的用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞与对照值相比不过度产生H2O2、并且对于25000个细胞具有低于0.5nmol的GSH水平。
背景技术
细胞的氧化还原平衡对于正常细胞生理学而言是关键。它由3个系统维持：GSH/GSSG；NADPH/NADP；硫氧还蛋白(还原)/硫氧还蛋白(氧化)。在这3个系统中，GSH/GSSG因其牵涉患病状态和合理的治疗方法的研发而得到最广泛研究(Townsend,A.J.,Leone-Kabler,S.,Haynes,R.L.,Wu,Y.,Szweda,L.和Bunting,K.D.(2001).Selectiveprotection by stably transfected human ALDH3A1(but not human ALDH1A1)againsttoxicity of aliphatic aldehydes in V79 cells.130-132,261–273)。与GSH/GSSG失调相关的患病状态包括大量的病理学情况，如癌症(Estrela,J.M.,Ortega,A.和Obrador,E.(2006).Glutathione in cancer biology and therapy.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.43,143–181；O’Brien,M.L.,and Tew,K.D.(1996).Glutathione and related enzymes inmultidrug resistance.Eur.J.Cancer Oxf.Engl.1990 32A,967–978)。它们的一种常见病因学在于由ROS和/或活性氮(RNS)带来的氧化性应激，所述ROS和/或活性氮(RNS)首先导致谷胱甘肽(GSH)减少，这归因于ROS和RNS的直接解毒作用。这种初始的GSH减少后伴随GSH合成的代偿性增加，即细胞开始起作用以持续进行ROS/RNS的解毒、和因ROS攻击细胞脂质产生的新形成的亲电体产物(例如4-羟基壬烯醛(HNE)和丙二醛(MDA))的解毒(Esterbauer,H.,Schaur,R.J.和Zollner,H.(1991).Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal,malonaldehyde and related aldehydes.11,81–128)。
癌细胞中的GSH奇异现象在于并非可以预期的胞内GSH缺乏，而是在许多不同癌细胞中确切地发现相反情况(Estrela,J.M.,Ortega,A.和Obrador,E.(2006).Glutathionein cancer biology and therapy.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.43,143–181)。但这种GSH增加具有负面的治疗反响，因为它防止癌细胞受到化疗和放疗影响(Carretero,J.,Obrador,E.,Esteve,J.M.,Ortega,A.,Pellicer,J.A.,Sempere,F.V.和Estrela,J.M.(2001).Tumoricidal activity of endothelial cells.Inhibition of endothelial nitricoxide production abrogates tumor cytotoxicity induced by hepatic sinusoidalendothelium in response to B16melanoma adhesion in vitro.J.Biol.Chem.276,25775–25782)。
此外，如果在癌细胞中必须获得低水平的GSH以使化学疗法有效，正常细胞则并非这种情况，因为正常细胞不会对其诱导附带损伤。
目前用于降低细胞GSH的治疗方法在于对抗癌细胞的化学抗性、靶向GSH本身或涉及GSH合成、GSH降解和GSH流出的酶。已有10种GSH降低化合物作为抗癌剂处于临床试验的I、II和III期中(Tew,K.和Townsend D(2011)Redox platforms in cancer drugdiscovery and development.Curr.Opin.Chem.Biol.15,156-161)。它们都必须与标准的抗癌药物联合施用，例如，环磷酰胺，泰素，长春新碱，美法仑等。
此外，这些降低GSH的药物靶向的酶是参与GSH合成(γ谷氨酰基半胱氨酸连接酶)、GSH降解(γ-谷氨酰基转肽酶)和GSH流出(GSH-S-转移酶)的那些酶。然而，这些相同的酶对于保护正常细胞免受ROS攻击是必需的。因此，对正常细胞的附带损伤存在强烈的可能性，因为药物不能被选择性地递送至癌细胞和仅被递送至癌细胞。
鉴于此，需要寻找其它特异性和选择性地靶向癌细胞中的GSH的治疗性解决方案。
本发明的发明人已经令人意外地发现，包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合可用作药物并且能够治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞不过度产生H2O2。特别地，他们发现，包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合可用作药物并且能够治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞不过度产生H2O2、并且对于25000个细胞具有低于0.5nmol的GSH水平(具有低于0.5nmol GSH/25000个细胞的水平)。
不受任何理论的束缚，如果所述化合物能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平，可以诱导癌细胞中的H2O2水平增加，则氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐可以增加由H2O2攻击产生的胞内代谢产物水平，同时GSH因此会在这些亲电子代谢产物的解毒中被消耗。因此，GSH不足可以在癌细胞中被利用作为H2O2的清除剂起作用。因此，H2O2的水平应当增加并且应当触发细胞凋亡的线粒体(内在)途径中的H2O2-依赖性机制。
在最初未受H2O2攻击的正常细胞中，胞内GSH水平已经很高(由于不存在H2O2)，使得任意H2O2-诱导的亲电体水平低于在其癌症对应物中的水平。然而，如果一种化合物能够增加正常细胞和癌细胞二者中的H2O2水平，当使用这种化合物能够增加受试者癌细胞中的H2O2水平的同时，正常细胞中的H2O2水平会伴随性升高。然而，在这种后面的情况中，正常细胞中的H2O2水平仍然低于癌细胞中的水平，且由此仍然低于其在使用本发明氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐处理时的细胞凋亡阈值。
发明内容
如上所述，本发明的发明人已经令人意外地发现，氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合可用作药物并且能够治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞不过度产生H2O2。特别地，他们发现，包含氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合可用作药物并且能够治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞不过度产生H2O2、并且具有低于0.5nmol GSH/25000个细胞的水平。
这种新疗法呈现出正常细胞较少受到附带损伤的优点，因为它们的初始亲电子代谢产物如此之低(归因于不存在H2O2)，使得它们在任何情况下都低于其在使用本发明氨基硫羟酸酯化合物或其药学上可接受的盐处理时的细胞凋亡阈值。
本发明由此涉及一种组合，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，该组合用于治疗受试者的癌症。
更具体地，本发明涉及一种组合，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，该组合用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞：
-与对照值相比不过度产生H2O2，并且
-具有低于0.5nmol GSH/25000个细胞的水平。
特别地，所述受试者的癌细胞在体外用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后还具有高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μg HNE-加合物/μg总蛋白质的水平。
本发明还涉及产品，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，该组合作为组合制剂随时间的推移广泛应用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞：
-与对照值相比不过度产生H2O2，并且
-具有低于0.5nmol GSH/25000个细胞的水平。
特别地，所述受试者的癌细胞在体外用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后还具有高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μg HNE-加合物/μg总蛋白质的水平。
特别地，通过测定所述受试者的癌细胞中的H2O2水平和GSH水平鉴定所述受试者。
更具体地，通过定量荧光强度水平测定所述H2O2水平。
本发明涉及药物组合物，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
本发明还涉及用于筛选受试者的方法，所述受试者患有癌症并且极会能够得益于使用一种组合治疗，该组合包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，其中所述方法包含：
a)测定所述受试者的癌细胞样品中的H2O2水平；
b)将步骤a.得到的水平与对照值进行比较；和
c)测定所述受试者的癌细胞样品中的GSH水平；
其中：
-所述受试者的所述癌细胞样品的H2O2水平不高于对照值，和
-所述受试者的所述癌细胞样品的GSH水平低于0.5nmol/25000个细胞，
这表明该受试者能够得益于使用所述组合治疗，该组合包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
在一个实施方案中，所述方法包含：
a)测定所述受试者的癌细胞样品中的H2O2水平；
b)将步骤a.得到的水平与对照值进行比较；
c)测定所述受试者的癌细胞样品中的GSH水平；和/或
d)测定在体外用本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后所述受试者的癌细胞样品中的MDA-加合物水平和/或HNE-加合物水平；
其中：
-所述受试者的所述癌细胞样品的H2O2水平不高于对照值；
-所述受试者的所述癌细胞样品的GSH水平低于0.5nmol/25000个细胞；和/或
-高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μg HNE-加合物/μg蛋白质的水平，
这表明该受试者会能够得益于使用本发明的组合治疗。
如本文所述，“H2O2”是指“过氧化氢”并且是本领域技术人员众所周知的。它代表含有氧的化学活性分子。它作为氧的正常代谢的天然副产物而形成，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而，在环境压力期间(例如UV或热暴露)，其水平可能显著增加。这可能会导致对细胞结构的显著损害。累积地，这称作氧化性应激。过氧化氢也由外源(如电离辐射)产生。
特别地，不高于包含在2 000至400 000之间的相对荧光强度(例如10 000至100000之间的相对荧光强度、或15 000至100 000相对荧光强度、且更特别是不高于20000相对荧光强度、甚至更特别是不高于21 598相对荧光强度)的值的H2O2水平表明所述受试者会能够得益于使用本发明的组合治疗。
具体地，不高于在2 000至400 000之间的相对荧光强度(例如10 000至100 000之间的相对荧光强度、或15 000至100 000相对荧光强度的值的水平、且更特别是不高于20000相对荧光强度、甚至更特别是不高于21 598相对荧光强度)的H2O2水平使用总ROS/过氧化物检测试剂盒(Enzo life science)测定，更特别地如用Appliskan荧光微量平板读数器(Thermo Scientific)(Ex/Em＝488/520nm和Ex/Em＝550/610nm)所测定的。
如果通过测定荧光强度在本文和本说明书的其它部分给出H2O2的截断值水平，则该方法是非排他性的，并且可以通过本领域技术人员可利用的任意其它方法来测定H2O2的截断值水平，确定将截断值设置在何处的参数是本发明的产品的IC50与H2O2的水平之间的相关性。IC50是本领域技术人员公知的量度。
如本文所述，“GSH”是指“谷胱甘肽”并且是本领域技术人员众所周知的。它是在谷氨酸侧链的羧基与半胱氨酸的胺基之间具有γ肽键的三肽，并且半胱氨酸的羧基通过正常肽键与甘氨酸连接。
特别地，在本发明的范围内，对于25,000个细胞，GSH水平低于0.5nmol，特别是对于25,000个细胞低于0.45nmol，且更具体地对于25,000个细胞低于0.4nmol。
GSH的水平由本领域技术人员可利用的任意方法测定。例如，GSH的水平由发光确定，例如用Promega GSH-Glo试剂盒(Promega)测定。
如果GSH的截断值水平通过发光形式在本文和本说明书的其它部分给出，则该方法是非排他性的，并且可以通过本领域技术人员可利用的任意其它方法来测定GSH的截断值水平。
如本文所述，“MDA”用于“丙二醛”，即具有式CH2(CHO)2的有机化合物。该反应种类是本领域技术人员众所周知的且天然存在，并且是细胞中的标记脂质过氧化物。另外，本发明的“MDA-加合物”是在MDA与癌细胞的蛋白质之间以及与癌细胞的DNA之间形成的加合物。
特别地，在本发明范围内，用本发明的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐体外处理后的MDA-加合物水平高于75ng/μg总蛋白质，特别是高于90ng/μg总蛋白质，且更具体地为高于100ng/μg总蛋白质。MDA-加合物的水平通过本领域技术人员可利用的任意方法测定。例如，MDA-加合物的水平通过免疫监测测定，例如使用OxiSelectTM MDA-加合物竞争性ELISA试剂盒(CELL BIOLABS)。
如本文所述，“HNE”用于“4-羟基-2-壬烯醛”，即“式C9H16O2”的有机化合物。该反应种类是本领域技术人员众所周知的且天然存在，并且是细胞中的标记脂质过氧化物。
另外，本发明的“HNE-加合物”是HNE与癌细胞蛋白质之间形成的加合物以及与癌细胞的GSH形成的加合物。
特别地，在本发明范围内，用本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐体外处理后的HNE-加合物水平高于750ng/μg总蛋白质，特别是高于900ng/μg总蛋白质，更特别是高于1μg/μg总蛋白质。
HNE-加合物的水平通过本领域技术人员可用的任何方法确定。例如，HNE-加合物的水平通过免疫监测确定，例如用OxiSelectTM HNE-加合物竞争性ELISA试剂盒(CELLBIOLABS)。
所述“总蛋白”是指癌细胞总蛋白的含量。
所述“体外使用本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理”是指在体外对受试者的癌细胞样品的处理步骤后测定的MDA-加合物的水平和/或HNE-加合物的水平，例如，在实验部分中所述的条件下，考量了本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的剂量，可以将其施用至60μM。
所述“C1-C7烷基”是指可以为直链或支链的在链上具有1-7个碳原子的脂族-烃基，另有指定的除外。具体地，烷基在链上具有1-3个碳原子(C1-C3烷基)。支链是指一个或多个烷基例如甲基、乙基或丙基连接至直链烷基链。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、2,2-二甲基丁基、正戊基、正己基、辛基，特别是甲基。
特别地，式(I)的化合物是如上所述的化合物，其中X1和X2相同或不同，其选自甲基、苯基、苄基，X1或X2的至少一个为甲基，或其中X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成哌啶或吗啉。
更具体地，所述化合物选自：
-S-甲基4-甲基-4-(哌啶-1-基)戊-2-炔硫代酸酯；
-S-甲基4-[苄基(甲基)氨基]-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯；
-S-甲基4-甲基-4-[甲基(苯基)氨基]戊-2-炔硫代酸酯；
-S-甲基4-甲基-4-(吗啉-4-基)戊-2-炔硫代酸酯；和
-S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯。
这些化合物进一步描述在下表1中。
表1
在一个优选的实施方案中，所述化合物是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯。
可以通过本领域技术人员众所周知的方法制备这些化合物。特别地，可以由BuLi、COS和MeI依次处理的相应的炔胺制备这些化合物。详细的制备方法可以在例如G.Quash等人,European Journal of Medicinal Chemistry 43(2008)906-916中找到，其内容通过引用并入，特别是材料和方法章节的第2部分。
S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯(CAS编号350229-29-7,分子量:185.29g.mol-1,分子式:C9H15NOS)，也在DIMATE下已知的是式(II)的化合物：
该化合物及其制备方法描述在专利EP1296946中(特别是实施例1)，其内容通过引用并入。
所述式(I)的化合物的“药学上可接受的盐”是指通过形成其酸式或碱式盐修饰的化合物。药学上可接受的盐包括化合物的常规的无毒性盐或季铵盐，例如来自无毒性无机或有机酸。例如，这类常规的无毒性盐包括那些如富马酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐，盐酸盐(chlorydrate)等。式(I)的化合物的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由母体化合物合成。通常，这类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在这两者的混合物中反应来制备。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适合的盐的清单可以在Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,1985,p.1418中找到。
特别地，式(I)的化合物是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯，且其药学上可接受的盐是其富马酸盐，即4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐(分子量：301.4g.mol-1,分子式：C13H19NO5S)。这类富马酸盐可以由S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯在无水乙醚中通过添加富马酸在无水乙醇中的溶液来制备。单-富马酸盐通过过滤采集，用乙醚洗涤并干燥。
在本发明的范围内，氨基硫羟酸酯化合物、式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、特别是4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐可以与术语“本发明的化合物”互换使用。
能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平的化合物是本领域技术人员已知的。特别地，在本发明的范围内，这些化合物能够选择性地增加受试者的癌细胞中的H2O2水平，即它们为能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平，但同时无法增加该受试者的非癌细胞(即正常细胞)的H2O2水平。表现出对癌细胞的选择性作用的这些化合物的应用能够避免副作用，如对正常细胞的抑制细胞效应。能够增加H2O2水平的化合物可以选自绿脓菌素、2-甲氧雌二醇、鱼藤酮、As2O3(三氧化二砷(Arsenic Trioxyde))、多柔比星、柔红霉素、AZT、双氯芬酸、对乙酰氨基酚、顺铂、氯丙嗪、胡椒亭、依托泊苷、米托蒽醌和小白菊内酯(Deavall等人,(2012),Drug-Induced Oxidative Stress and Toxicity.,Journal of Toxicology,2012,e645460；Pelicano等人,(2003),Inhibition of Mitochondrial Respiration ANOVEL STRATEGY TO ENHANCE DRUG-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN LEUKEMIA CELLS BY AREACTIVE OXYGEN SPECIES-MEDIATED MECHANISM.,J.Biol.Chem.,278,37832–37839)。更具体地，所述化合物选自绿脓菌素、2-甲氧雌二醇、鱼藤酮、As2O3、多柔比星、柔红霉素、AZT、双氯芬酸、对乙酰氨基酚、氯丙嗪、胡椒亭、依托泊苷、米托蒽醌和小白菊内酯。优选地，所述化合物为As2O3(三氧化二砷)或柔红霉素。这些化合物是商购的或可以使用众所周知的制备方法制备。
如本文所用，作为名词或动词使用的术语“治疗”是指治疗性治疗，其目的是消除或减轻症状。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的消除，症状的减轻，病症程度的降低，病症状况的稳定(即，不恶化)，病症的延迟或减缓，疾病或障碍或其一种或多种症状的发作、复发或扩散的预防。在某些实施方案中，该术语是指在症状发作之前用本文提供的化合物治疗或施用该化合物。该术语包括抑制或减轻特定疾病的症状。在某些实施方案中，具有疾病家族史的受试者特别是治疗方案的候选者。此外，在某些实施方案中，已显示特定疾病的遗传倾向的受试者是治疗方案的候选者。此外，有复发症状史的受试者也是治疗的潜在候选者。在这方面，术语“治疗”可以与术语“预防性治疗”互换使用。
如本文所用且除非另有定义，否则"癌症"是指体内异常细胞的生长、分裂或增殖。本发明的癌症是这样的癌症，其中与对照值相比观察到H2O2过度产生，特别是这样的癌症，其中既存在与对照值相比未观察到H2O2过度产生，又存在对于25000个细胞低于0.5nmol的GSH水平。这类癌症包括、但不限于白血病、淋巴瘤、血癌、乳腺癌(特别是TNBC)、肺癌(特别是EGFR突变的)、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、脑癌、膀胱癌和胃癌。
照此，本发明还涉及用于本发明用途的包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物的组合；本发明涉及用于本发明用途的产品或本发明的方法，其中待治疗的癌症选自白血病、淋巴瘤、血癌、乳腺癌(特别是TNBC)、肺癌(特别是EGFR突变的)、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、脑癌、膀胱癌和胃癌。
仍然特别地，所述癌症是化疗抗性的和/或放疗抗性的癌症。
所述“化疗抗性”是指如本文所述的针对化疗不起作用或停止作用的癌症。
所述“放疗抗性”是指如本文所述的针对放疗不起作用或停止作用的癌症。
特别地，所述癌症是这样的癌症，其中在用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐体外处理后，观察到MDA-加合物水平高于75ng/μg总蛋白质、和/或HNE-加合物水平高于1μg/μg总蛋白质。
如本文所用，术语“受试者”是指患有或可能患有一种或多种如本文所述的疾病和病症的温血动物，例如哺乳动物、动物或人类，特别是人类，且患有一种或多种本文所述的疾病和病症或具有患所述疾病或病症的可能性，且更具体地，其中与对照值相比，癌细胞不过度产生H2O2，并且甚至更具体地，其中癌细胞与对照值相比不过度产生H2O2、并且对于25,000个细胞具有低于0.5nmol的GSH水平。仍然具体地，与对照值相比不过度产生H2O2的所述受试者的、并且对于25,000个细胞具有低于0.5nmol的GSH水平的癌细胞是化疗抗性的和/或放疗抗性的癌细胞。甚至更具体地，与对照值相比不过度产生H2O2的所述受试者的、更具体地与对照值相比不过度产生H2O2、并且对于25,000个细胞具有低于0.5nmol的GSH水平的癌细胞，还具有在体外用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐进行处理后高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μg HNE-加合物/μg总蛋白质的水平。
如本文所用，术语“不过度产生”、“未过度产生”描述一种情况，其中在患病细胞或组织中，与称作对照值的相应的对照细胞或组织相比，化合物不会以过多的形式产生。它是指在癌细胞中H2O2的产量，其不大于或等于或小于称作对照值的相应对照细胞或组织中的H2O2产量。
特别地，本发明由此涉及用于本发明用途的组合或用于本发明用途的产品，其中通过测定所述受试者的癌细胞中的H2O2水平来鉴定所述受试者。
例如，可以通过本领域技术人员已知的任意方法测定H2O2水平，例如，通过测定相对荧光强度水平，其可以例如使用总ROS/超氧化物检测试剂盒(Enzo life science)进行，特别地如使用Appliskan荧光微量平板读数器(Thermo Scientific)(Ex/Em＝488/520nm和Ex/Em＝550/610nm)所测定的。
特别地，本发明由此涉及用于本发明用途的组合物或用于本发明用途的产品，其中所述H2O2水平通过定量荧光强度水平来确定。
更具体地，本发明涉及用于本发明用途的组合或用于本发明用途的产品，其中所述H2O2水平不大于包含在2 000-400 000相对荧光强度(例如10 000-100 000相对荧光强度或15 000-100 000相对荧光强度)范围内的值，且更具体地，H2O2水平不高于20 000相对荧光强度，甚至更具体地，不高于21 598相对荧光强度。
本领域技术人员易于理解，适合于测定细胞H2O2水平的任意其它参数可以与本发明结合使用。
因此，可以在不脱离本发明范围的情况下使用本领域技术人员已知用于检测H2O2水平的任意其它方法。
特别地，本发明由此涉及用于本发明用途的组合或用于本发明用途的产品，其中通过定量荧光强度水平来测定所述H2O2水平，这归因于使用了总ROS/超氧化物检测试剂盒(Enzo life science)，更具体地，如使用Appliskan荧光微量平板读数器(ThermoScientific)(Ex/Em＝488/520nm和Ex/Em＝550/610nm)所测定的。
如果实验部分中所用的方法为根据平均荧光强度确定H2O2水平，则还认为该方法是非排他性的，并且可以通过本领域技术人员任意其它可利用的方法测定H2O2水平。
可以通过本领域技术人员可利用的任意方法测定GSH水平。例如，根据发光确定GSH水平，例如使用Promega GSH-Glo试剂盒(Promega)。
本领域技术人员易于理解，适合于测定细胞GSH水平的任意其它参数可以与本发明结合使用。
因此，可以在不脱离本发明范围的情况下使用本领域技术人员已知用于检测GSH水平的任意其它方法。
特别地，本发明由此涉及用于本发明用途的化合物，其中所述GSH水平根据发光确定，更具体地为使用Promega GSH-Glo试剂盒(Promega)。
可以通过本领域技术人员可利用的任意方法测定MDA-加合物水平。例如，通过免疫监测测定MDA-加合物水平，例如使用OxiSelectTM MDA-加合物竞争性ELISA试剂盒(CELLBIOLABS)。
本领域技术人员易于理解，适合于测定细胞MDA-加合物水平的任意其它参数可以与本发明结合使用。
因此，可以在不脱离本发明范围的情况下使用本领域技术人员已知用于检测MDA-加合物水平的任意其它方法。
因此，在一个实施方案中，在体外用本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后测定MDA-加合物水平。
可以通过本领域技术人员可利用的任意方法测定HNE-加合物水平。例如，通过免疫监测测定HNE-加合物水平，例如使用OxiSelectTM HNE-加合物竞争性ELISA试剂盒(CELLBIOLABS)。
本领域技术人员易于理解，适合于测定细胞HNE-加合物水平的任意其它参数可以与本发明结合使用。
因此，可以在不脱离本发明范围的情况下使用本领域技术人员已知用于检测HNE-加合物水平的任意其它方法。
因此，在一个实施方案中，在体外用本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后测定HNE-加合物水平。
如本文所用，术语"样品"是指生物来源的物质。生物样品的实例包括、但不限于体液样品和活检样品。体液包括血液、尿、唾液或任意其它身体分泌物或其衍生物。如本文所用，"血液"包括全血、血浆、血清、循环上皮细胞、血液成分或任意血液衍生物。本发明的生物样品可以通过本领域技术人员已知的任意适合的采样方式得自受试者。
为了测定癌细胞中的H2O2水平、GSH水平和/或MDA-加合物和/或HNE加合物水平，样品特别是肿瘤活检组织，例如白血病肿瘤、淋巴瘤、血液肿瘤、乳腺肿瘤(特别是TNBC)、肺肿瘤(特别是EGFR突变的)、黑色素瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、骨肉瘤、脑瘤、膀胱肿瘤或胃肿瘤。
在H2O2水平的比较方面，优选在与癌细胞样品或癌样品相同组织来源的样品中、且更优选在与癌细胞样品或相同受试者的癌样品相同组织来源的样品中测定对照值。
优选地，“对照值”相当于H2O2的正常水平。
如本文所预期的，H2O2的“正常水平”是指样品中H2O2的水平在H2O2的标准截断值内。该标准取决于样品类型以及用于测定样品中H2O2水平的方法。特别地，H2O2的参比值由此可以相当于正常细胞中、优选相同组织且更优选相同受试者的相同组织中不存在H2O2、或H2O2的基线水平、或相当于与NAC一起温育的癌细胞、优选相同组织且更优选相同受试者的相同组织中的H2O2值。
NAC是羟自由基的强力(avid)清除剂(速率常数：1.36x1010M-1,s-1)，但它与过氧化氢缓慢地反应(速率常数：0.38XM-1,s-1)，并且未表现出与超氧阴离子反应(Aruoma等人；Free Radic Biol Med,(1989)The antioxidant activity of N-acetyl cysteine:itsreaction with hydrogen peroxide,hydroxy radical,superoxide anion,andhypochlorous acid:,6,593-597)。
如果受试者的癌样品中的H2O2水平降低到低于H2O2的正常水平或降低到等于H2O2的正常水平，则H2O2水平被视为具有统计学较低或等同的水平。特别地，如果与对照H2O2水平值相比，患者的癌样品中的H2O2水平降低约至少5或10或15或20或25或30或35或40或45或50或60或70或80或90或100或200或300或400或500或600％，则H2O2的水平被视为统计学较低。
按照相同方式，如果受试者的癌样品中的H2O2水平等于H2O2的正常水平或降低至低于H2O2的正常水平，更具体地与H2O2水平的对照值相比降低约至少5或10或15或20或25或30或35或40或50或60或70或80或90或100或200或300或400或500或600％，则H2O2的水平被视未过度产生。
如果受试者的癌样品中的H2O2水平等于与NAC一起温育的癌细胞中的H2O2水平或降低至与NAC一起温育的癌细胞中的H2O2的水平，则H2O2水平被视为具有统计学较低或等同的水平。特别地，如果与和NAC一起温育的癌样品、优选相同组织、且更优选相同受试者的相同组织的H2O2水平值相比，患者的癌样品中的H2O2水平降低约至少5或10或15或20或25或30或35或40或50或60或70或80或90或100或200或300或400或500或600％，则H2O2的水平被视为统计学较低。
按照相同方式，如果受试者的癌样品中的H2O2水平等于H2O2的正常水平或降低至低于与NAC一起温育的癌细胞中的H2O2的水平，更具体地与H2O2水平的对照值相比降低约至少5或10或15或20或25或30或35或40或45或50或60或70或80或90或100或200或300或400或500或600％，则H2O2的水平被视为未过度产生。
可以将对照值确定为基于在对照细胞群(即正常细胞)中测定的H2O2水平确定的单一值或数值范围，特别是在作为癌细胞的相同组织来源的正常细胞群中所测定的，并且更具体地来自相同的受试者，即与NAC一起温育的癌细胞，特别是在与NAC一起温育的具有相同组织来源且更具体地是来自相同受试者的癌细胞群中。
其中对照值可以是预定值或与测量值一起确定的值。
典型地，基于测定的H2O2水平将分析的群分成分位数。可以将对照值定义为中位数，或第二个三分位数，或第二或第三个四分位数，或第三个或第四个五分位数等。
H2O2的对照值可以根据用于测定的方法的不同而改变。
在一个实施方案中，当所治疗的癌症是白血病时，使用HL60细胞中的H2O2水平测定参比值。HL60细胞系是已建立的本领域技术人员众所周知的人前髓细胞性白血病细胞系。
特别地，在所述实施方案中，如果“y”不高于2x/3，“x”为HL60细胞中的H2O2水平，且“y”为受试者的癌样品中的H2O2水平，则H2O2的水平被视为统计学等同或较低的水平或无产生过度的。
可以将对照值确定为基于在对照细胞群(即HL60细胞)中测定的H2O2水平确定的单一值或数值范围。
典型地，基于测定的H2O2水平将分析的群分成分位数。可以将对照值定义为中位数，或第二个三分位数，或第二或第三个四分位数，或第三个或第四个五分位数等。H2O2的对照值可以根据用于测定的方法的不同而改变。
当所治疗的癌症是白血病时，与对于HL60细胞描述相同的比较方法适用于下表2中提及的癌症类型，其中以下相应的细胞系作为参比值。
表2
癌症类型 参比的细胞系
膀胱 HT-1197
血液 HL-60
脑 CGL-1
乳腺 MDA-MB-231
结肠 Lovo
头颈 Fadu
本发明进一步涉及治疗受试者的癌症的方法，特别地，其中所述受试者的癌细胞与对照值相比不过度产生H2O2，特别是与对照值相比不过度产生H2O2且具有低于0.5nmol/25000个细胞的GSH水平，该方法包含施用治疗有效量的一种组合，该组合包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
在一个实施方案中，所述受试者的所述癌细胞在体外用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后还具有高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μgHNE-加合物/μg总蛋白质的水平。
在一个实施方案中，本发明还涉及药物组合物，其包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
在一个实施方案中，本发明还涉及用于筛选受试者的方法，该受试者患有癌症并且极会能够得益于使用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐治疗，其中所述方法包含：
a.测定所述受试者的癌细胞样品中的H2O2水平；
b.将步骤a.得到的水平与对照值进行比较；和
c.测定所述受试者的癌细胞样品中的GSH水平；
其中如果：
-所述受试者的癌细胞样品的H2O2水平不高于对照值；且
-所述受试者的所述癌细胞样品的GSH水平低于0.5nmol/25000个细胞，
则所述方法还包含：
d.用能够诱导高于对照值的H2O2水平的化合物治疗所述受试者；
e.检查得到的所述受试者的H2O2水平高于对照值；和
f.用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐治疗所述受试者。
在一个实施方案中，所述方法包含：
a.测定所述受试者的癌细胞样品中的H2O2水平；
b.将步骤a.得到的水平与对照值进行比较；
c.测定所述受试者的癌细胞样品中的GSH水平；和/或
c’测定体外用本发明式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后所述受试者的癌细胞样品中的MDA-加合物和/或HNE-加合物水平；
其中，如果：
-所述受试者的癌细胞样品的H2O2水平不高于对照值；
-所述受试者的所述癌细胞样品的GSH水平低于0.5nmol/25000个细胞；和/或
-MDA-加合物水平高于75ng/μg总蛋白质、和/或HNE-加合物水平高于1μg/μg蛋白质，
则所述方法还包含：
d.用能够诱导高于对照值的H2O2水平的化合物治疗所述受试者；
e.检查得到的所述受试者的H2O2水平高于对照值；和
f.用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐治疗所述受试者。
可以通过上文引述的方法检查得到的所述受试者的H2O2水平高于对照值。
特别地，分别、依次或同时施用本发明组合或产品的化合物。
更具体地，依次施用本发明组合或产品的化合物，即在施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐之前，施用能够增加癌细胞中H2O2水平的化合物。
在一个实施方案中，用于本发明用途的组合或用于本发明用途的产品由式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、特别是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐、且更具体地为4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐、与能够增加癌细胞中H2O2水平的化合物组成。
本发明的组合、产品或方法中的化合物可以通过不同的合成路径制备。试剂和原料是商购的或易于通过本领域技术人员众所周知的技术合成。
需要治疗本文所述疾病和病症的受试者的鉴定如上所述进行，并且在本领域技术人员的能力和知识范围内。本领域技术人员可以通过上述举出的技术容易地识别需要这类治疗的那些受试者。
通过使用常规技术并观察在类似情况下获得的结果，作为本领域技术人员的主治诊断医师可以容易地确定治疗有效量。在确定治疗有效量的过程中，主治诊断医师考虑许多因素，包括但不限于：受试者的种类；其身材大小、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病；疾病的牵涉程度或严重程度；个体受试者的反应；所施用的具体化合物；施用模式；所施用制剂的生物利用度特征；所选剂量方案；伴随药物的应用；以及其它相关情况。
如本文所用，“治疗有效量”是指有效减少、消除、治疗或控制本文所述疾病和病症的症状的量。术语“控制”旨在指代所有的过程，其中可以为减缓、中断、阻止或停止本文所述的疾病和病症的进展，但并不一定表示完全消除所有疾病和病症症状，并且意在包括预防性治疗和长期使用。
达到所期望的生物效应所需的本发明的组合、产品或方法中的化合物的量将根据许多因素而变化，包括待施用药物的剂量，所用化合物的化学特性(例如疏水性)，化合物的效力，疾病的类型，患者的患病状态和施用途径。
可以通过与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合将本文提供的化合物配制成药物组合物。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指当适当时对哺乳动物、尤其是人施用时不产生不良反应、过敏反应或其它不利反应的分子实体和组合物。药学上可接受的赋形剂是指任何类型的无毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
可以制备这类用于口服施用的组合物，特别是片剂或胶囊形式，特别是口腔可分散的(lyoc)片剂形式；或胃肠外施用的组合物，特别是液体溶液、混悬液或乳剂的形式。
可以通过制药领域中众所周知的任意方法制备，例如如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy,第20版；Gennaro,A.R.,Ed.；Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia,PA,2000中所述。可以包括药学上相容的粘合剂和/或助剂材料作为组合物的组成部分。口服组合物通常包括惰性稀释剂载体或可食用载体。它们可以以单位剂量形式施用，其中术语“单位剂量”是指能够施用于患者并且易于处理和包装的单一剂量，保持为物理和化学稳定的单位剂量，其包含活性化合物本身或作为药学上可接受的组合物，如下文所述。
片剂、丸剂、粉末剂、胶囊剂、锭剂等可包含任何以下组分或类似性质的化合物的一种或多种：粘合剂如微晶纤维素或黄蓍树胶；稀释剂如淀粉或乳糖；崩解剂例如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂例如硬脂酸镁；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如薄荷或甲基水杨酸甲酯。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由任选与增塑剂共混的明胶配混物以及淀粉胶囊制成。另外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其它材料，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣衣料。其它口服剂型糖浆或酏剂可包含甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。另外，可以将活性化合物掺入快速溶解、缓释或持续释放制剂中，且其中这类缓释制剂优选是双峰态的。
用于施用的液体制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳剂。液体组合物还可以包括粘合剂，缓冲剂，防腐剂，螯合剂，甜味剂，调味剂和着色剂等。非水溶剂包括醇，丙二醇，聚乙二醇，丙烯酸酯共聚物，植物油如橄榄油，和有机酯如油酸乙酯。水性载体包括醇和水的混合物，水凝胶，缓冲介质和盐水。特别地，生物相容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是有用的赋形剂以控制活性化合物的释放。静脉内载体可以包括流体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些等。
施用模式的实例包括肠胃外，例如皮下，肌内，静脉内，皮内以及口服施用。它特别地包括作为用于口服施用的片剂或作为用于静脉内施用的注射用溶液的粉剂的制剂。
在本发明范围内，应当理解，“用于用途的包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平的化合物的组合”等同于“包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平的化合物的组合的用途”，且特别是“用于治疗的包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平的化合物的组合”等同于“包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平的化合物的组合在治疗中的用途”和“包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和能够增加受试者的癌细胞中的H2O2水平的化合物的组合在制备预期用于治疗的药物中的用途”。同样适用于用于本发明用途的产品。
附图说明
通过下列附图和实施例进一步示例本发明。
图1：H2O2/S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯IC50相关性：以μM计的S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯IC50与癌细胞中内源性H2O2活性水平之间的相关性。
图2：H2O2/S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯IC50相关性：截断值的测定。
图3：H2O2/S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯IC50相关性：通过组织来源研究。
图4-6：H2O2/S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯IC50相关性：诱导对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的敏感性，通过增加对3种癌细胞系的H2O2活性(PCN＝绿脓菌素)：THP-1、HCC827和Hop62。
图7：H2O2/S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯IC50相关性：S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯和H2O2诱导物药物的协同作用：三氧化二砷(As2O3)(ATO)1μM和多柔比星(Doxo)200nM。
图8：使用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯和H2O2诱导剂顺铂(CPPD)或多柔比星(Doxo)，在其中癌细胞Colo357具有高于5nmol/25000个细胞的GSH水平的环境中的治疗作用。
图9：在敏感性和抗性细胞中观察到的以nmol/25000个细胞计的总GSH水平。
图10：24小时过程中用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯5或10μmol.L-1处理的S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯敏感细胞(HL-60,NT2/D1)(A)和S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯抗性细胞(MSC)(B)中MDA和HNE加合物的定量。
注意：在上述举出的所有附图中：对于S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯称作DIMATE。
具体实施方案
材料和方法
细胞系
已经筛选代表10种组织类型的一个52种人肿瘤细胞小组以覆盖广泛组的不同癌基因并且依据其对不同标准化疗剂的反应。细胞得自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection ofCell Cultures)(ECACC)和来源于患者肿瘤的癌细胞初级培养物(Research Institute ofVall d’Hebron(VHIR),Barcelone,Spain；Vall d’Hebron Institute of Oncology(VHIO),Barcelone,Spain；Oncotest,Freiburg,Germany；Oncodesign,Dijon,France；UniversitáDegli Studi di Palermo,Oncology and Surgical Sciences,Palermo,Italy；和Institute of Predictive and Personalized Medicine of Cancer(IMPPC),Barcelona,Spain(参见表3的肿瘤细胞组描述)。根据供应者的建议在适合的培养基中培养全部细胞。
表3
使用筛选的细胞系显示细胞系对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的敏感性增强，这归因于所筛选的细胞系对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的抗性。肺癌细胞系(HCC827，Hop62)和白血病细胞系(THP-1)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)、欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。根据供应商的建议在适合的培养基中培养细胞。
细胞存活率测定，96孔板
将细胞以确保在本实验结束时在对照(未处理的细胞)中约80％的汇合率所需的浓度接种在96-孔细胞培养板中(0.5x 104-5x 104个细胞/孔)。使用不同浓度的药物(0.01-100μM)测定对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的敏感性。48小时后，使用刃天青(Rezasurin)，根据制造商的说明分析药物的生长抑制作用。为了确保良好的数据质量和将吸移误差的影响减小到最低限度，基于来自8个单独孔的平均荧光强度评价每种特定的药物浓度。根据对每种特定细胞系的半数最大抑制浓度(IC50)定量药物响应，并且通过对数剂量/响应曲线的非线性回归分析来确定。通过统计学方式确定对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的抗性的截断值(>2S.D.高于IC50几何平均值)。将对药物的超敏反应的体外阈值定义为<IC50几何平均值。
通过增加H2O2水平增强细胞对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的敏 感性
在不同的实验中，用H2O2诱导物攻击显示对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯抗性的细胞(THP-1、HCC827和Hop62)。如上所述接种细胞，并且用单独的S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯(0.01-100μM)、或用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯与H2O2诱导物绿脓菌素(Pyocyanin，40μM)的组合温育。温育48h后，如上所述使用刃天青测定法测定细胞存活率。
结合S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯攻击已知诱导细胞中的H2O2的化疗剂以处理S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯抗性细胞(THP-1)。如上所述接种细胞，并且单独温育S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯(5、10、15、30μM)或与化疗中使用的其它药物并且被称作H2O2诱导物的(如绿脓菌素(40μM)、2-甲氧雌二醇(2-ME 100μM)、三氧化二砷(ATO 1μM)、柔红霉素(40nM)、多柔比星(20nM)、依托泊苷(500nM)、米托蒽醌(50nM)、小白菊内酯(100nM)和胡椒亭(2μM))一起温育。温育48小时后，如上所述使用刃天青测定法测定细胞存活率。
H2O2产生的测定
按照生产商的说明，使用总ROS/超氧化物检测试剂盒(Enzo life science)测定活细胞中的胞内H2O2产生量。该测定法使用特异性H2O2/RNS探针，其在与H2O2和RNS种类反应时迅速被氧化为高荧光化合物。荧光强度与样品内的总H2O2/RNS水平成正比。使用未处理的细胞或用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯(1-5uM)、赋形剂HEPES、H2O2诱导物绿脓菌素(PCN,500uM)或H2O2抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)[10mM]处理的细胞进行实验测试。进行分析的前一天，根据细胞供应商的说明，将细胞以2x 104的密度接种在96-孔黑色/透明底平板中的培养基内，该培养基中补充有FBS(10％v/v)、10个单位的青霉素/ml和100mg链霉素。将细胞保持在37℃、95％空气：5％CO2的加湿空气中过夜。在分析当天，用100μL如上所述补充的无苯酚培养基替换细胞培养基，不进行任何处理，用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯处理6小时，赋形剂HEPES处理6小时，或用不同对照试剂PCN和NAC处理20min。温育期后，将100μL含有相应处理剂或对照的H2O2检测溶液装载到孔中，并在37℃在黑暗中温育60min。为了进行背景荧光对照测定，有几个孔保持无细胞。使用Appliskan荧光微量平板读数器(Thermo Scientific)(ex＝560nm，Em＝600)读取平板。将数据表示为等量细胞产生的任意荧光单位的改变，并对照总蛋白质输入量校准。
统计学分析
将数值表示为平均值±SD或频率和比例。如果适合，组间差异通过未配对t检验、卡方检验、Fisher精确检验或ANOVA确定。P<0.05被视为具有统计学显著性。使用GraphPadprism 5.0版(GraphPad software,San Diego California USA)和JMP软件12.01版(SASInstitute Inc.North Carolina USA)进行分析。
GSH产生的测定
将细胞接种在96-孔黑色板(5×104个细胞/mL)中并温育过夜以附着。用赋形剂，DMSO，BCNU 100μM，S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯20μM处理细胞24小时。根据试剂盒(GSH-GloTM，Promega)的说明测定总谷胱甘肽，并获得25000个细胞的结果。
通过ELISA定量测定HNE-蛋白质和MDA/蛋白质加合物
用Oxiselect HNE Adduct Elisa试剂盒(Cell Biolabs,San Diego,CA)和OxiSelect MDA Adduct ELISA试剂盒(Cell Biolabs)分别定量HNE-加合物和MDA-加合物的形成。简言之，在用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯处理24小时后，通过在还原性SDS样品缓冲液中超声处理裂解细胞。将匀化物稀释至10μg蛋白质/mL，并通过在37℃温育至少2小时将其吸附于96-孔蛋白结合板中。将孔用PBS洗涤两次，并在轨道摇床上在室温下再温育2小时。在PBS中洗涤三次后，向孔中加入100μL抗-HNE抗体或抗-MDA抗体，并在室温下温育1小时。随后，加入山羊抗-家兔二次抗体-HRP缀合物(用测定稀释剂按照1/1000稀释)并继续温育1小时。将孔用PBS洗涤5次并加入HRP-底物。用酸性溶液终止反应，并在450nm处用微量平板读数器读取吸光度。通过与由制造商提供的HNE-BSA和MDA-BSA标准品制备的标准曲线比较来确定HNE-加合物和MDA-加合物的水平。
结果
得到的结果如图1-10中所示。
图1显示在H2O2活性与IC50之间观察到的相关性(如上所述通过总ROS/超氧化物检测试剂盒监测)。
此外，图2显示，通过用截断值(20 000相对荧光强度)将细胞分成两部分，揭示出S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯的H2O2高敏感性与H2O2低敏感性的差异(P值<0.05)。
在图3中，根据组织来源示例H2O2活性与IC50的相关性。
此外，图4-6和下表4显示使用绿脓菌素预处理在其中癌细胞具有低于5nmol/25000个细胞的GSH水平的环境中对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯敏感性的诱导。
表4:
DIMATE:S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯，PCN：绿脓菌素(pyocianin)
使用绿脓菌素40μM预处理显示对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯敏感性的诱导。细胞暴露于绿脓菌素导致H2O2水平2-倍增加，不影响细胞存活率。
图7显示使用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯与能够增加癌细胞中H2O2水平的化合物，甚至在对那些化合物单独使用时产生抗性的细胞中的协同作用。
此外，使用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯与已知对S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯THP-1抗性细胞诱导H2O2的化疗剂的组合处理也显示协同作用，如下表5中所示。
表5:
IC50(μM) P值
DIMATE+依托泊苷 25.22 P<0.001
DIMATE+米托蒽醌 22.67 P<0.001
DIMATE+柔红霉素 12.5 P<0.001
DIMATE+小白菊内酯 14.4 P<0.001
DIMATE+胡椒亭 27.6 P<0.001
DIMATE+多柔比星 21.83 P<0.001
DIMATE+ATO 14.9 P<0.001
DIMATE+2-ME <5 P<0.001
DIMATE 46
DIMATE:S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯
图8涉及使用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯与H2O2诱导剂顺铂(CPPD)或多柔比星(Doxo)在其中癌细胞系Colo357具有高于5nmol/25000个细胞的GSH水平的环境中的组合处理(与上述显示的相反)。
图8(A)中显示，使用CPPD 20μmol.L-1和Doxo 25μmol.L-1处理显著增加Colo357细胞系中的H2O2水平(分别为200％和10 000％)，然而，如图8(B)中所示，未观察到对存活率的作用。
图9和10示例有关GSH、MDA-加合物和HNE-加合物的阈值是如何测定的。
在图9中，在敏感和抗性细胞中观察以nmol/25000个细胞计的总GSH水平。观察到显著性差异(***，p值<0.001)。使用每25000个细胞0.5nmol的阈值区分GSH高与GSH低细胞，100％的敏感细胞是GSH低，并且100％的抗性细胞是GSH高。
图10显示了用S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯5或10μmol.L-124小时过程中处理的S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯敏感细胞(HL-60，NT2/D1)(A)和S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯抗性细胞(MSC)(B)中MDA和HNE加合物的定量。对于MDA-加合物，在敏感性S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯细胞中，阈值高于100ng/μg总蛋白质，而在抗性细胞，阈值低于该阈值。对于HNE-加合物，可以进行相同的观察，其中阈值为1μg/μg总蛋白质。

Claims (15)

1.组合，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，该组合用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞：
-与对照值相比不过度产生H2O2；并且
-具有低于0.5nmol GSH/25000个细胞的水平。
2.产品，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，该产品作为组合制剂随时间的推移广泛应用于治疗受试者的癌症，其中所述受试者的癌细胞：
-与对照值相比不过度产生H2O2；并且
-具有低于0.5nmol GSH/25000个细胞的水平。
3.根据权利要求1的用于所述用途的组合或根据权利要求2的用于所述用途的产品，其中通过测定所述受试者的癌细胞中的H2O2水平和GSH水平来鉴定所述受试者。
4.根据权利要求3的用于所述用途的组合或根据权利要求3的用于所述用途的产品，其中通过对荧光强度水平定量来确定所述H2O2水平。
5.根据权利要求1和3-4任一项的用于所述用途的组合、或根据权利要求2-4任一项的用于所述用途的产品，其中在体外用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理后，所述受试者的癌细胞还具有高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μg HNE-加合物/μg总蛋白质的水平。
6.药物组合物，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
7.用于筛选患有癌症并且极会能够得益于包含下列物质的组合治疗的患者的方法：
式(I)的化合物或其药学上可接受的盐
其中X1和X2相同或不同，其选自C1-C7烷基、苯基、苄基、或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，特别是哌啶或吗啉；
与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物，其中所述方法包含：
a.测定所述受试者的癌细胞样品中的H2O2水平；
b.将步骤a.得到的水平与对照值进行比较；和
c.测定所述受试者的癌细胞样品中的GSH水平；
其中：
-所述受试者的所述癌细胞样品的H2O2水平不高于对照值，和
-所述受试者的所述癌细胞样品的GSH水平低于5nmol/25000个细胞，
这表明该受试者会能够得益于使用所述组合治疗，该组合包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
8.根据权利要求7的方法，其中该方法包含：
a.测定所述受试者的癌细胞样品中的H2O2水平；
b.将步骤a.得到的水平与对照值进行比较；
c.测定所述受试者的癌细胞样品中的GSH水平；和
d.测定在体外用式(I)的化合物处理后所述受试者的癌细胞样品中的MDA-加合物水平、和/或HNE-加合物水平；
其中：
-所述受试者的所述癌细胞样品的H2O2水平不高于对照值；
-所述受试者的所述癌细胞样品的GSH水平低于5nmol/25000个细胞；和
-高于75ng MDA-加合物/μg总蛋白质的水平、和/或高于1μg HNE-加合物/μg蛋白质的水平，
这表明该受试者会能够得益于使用一种组合治疗，该组合包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
9.根据权利要求7或8的方法，其中不高于20000相对荧光强度的H2O2水平表明所述受试者会得益于使用一种组合治疗，该组合包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与能够增加受试者的癌细胞中H2O2水平的化合物。
10.根据权利要求3-5任一项的用于所述用途的组合、根据权利要求3-5任一项的用于所述用途的产品、或根据权利要求7-9任一项的方法，其中根据发光确定GSH水平。
11.根据权利要求5的用于所述用途的组合、根据权利要求5的用于所述用途的产品、或根据权利要求8-9任一项的方法，其中通过免疫-监测测定MDA-加合物水平和/或HNE MDA-加合物水平。
12.根据权利要求1、3、4、5、10或11任一项的用于所述用途的组合、根据权利要求2-5和10-11任一项的用于所述用途的产品、根据权利要求6的药物组合物或根据权利要求7-11任一项的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、血癌、乳腺癌(特别是TNBC)、肺癌(特别是EGFR突变的)、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、脑癌、膀胱癌和胃癌。
13.根据权利要求1、3、4、5、10、11或12任一项的用于所述用途的组合、根据权利要求2-5和10-12任一项的用于所述用途的产品、根据权利要求6或12的药物组合物、或根据权利要求7-12任一项的方法，其中在所述式(I)的化合物中，X1和X2相同或不同，其选自甲基、苯基、苄基，X1或X2的至少一个是甲基，或X1和X2与它们所连接的氮原子一起形成哌啶或吗啉。
14.根据权利要求1、3、4、5和10-13任一项的用于所述用途的组合、根据权利要求2-5和10-13任一项的用于所述用途的产品、根据权利要求6、12或13任一项的药物组合物、或根据权利要求7-13任一项的方法，其中所述式(I)的化合物是S-甲基4-(二甲氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸酯或其药学上可接受的盐。
15.根据权利要求14的用于所述用途的组合、根据权利要求14的用于所述用途的产品、根据权利要求14的药物组合物或根据权利要求1的方法，其中所述药学上可接受的盐是4-(二甲氨基)-4-甲基-2-戊炔硫代酸S-甲基酯富马酸盐。
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