ES2870031T3 - Anticuerpos anti-ANGPTL8 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-ANGPTL8 y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8) o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un par de secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 162/170.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-ANGPTL8 y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la proteína similar a la angiopoyetina (ANGPTL) 8, a composiciones que comprenden estos anticuerpos y a métodos de uso de los mismos.
Antecedentes
La ANGPTL8 (llamada de manera alternativa TD26, RIFL, lipasina, C19orf80 y betatrofina) es un miembro de la familia ANGPTL recientemente reconocido que se ha implicado en el metabolismo tanto de los triglicéridos (TG) como de la glucosa. Es una proteína circulante que se expresa principalmente en el hígado y el tejido adiposo. A diferencia de ANGPTL3 y ANGPTL4, ANGPTL8 carece de un dominio similar al fibrinógeno en el extremo C, pero contiene un dominio de superhélice en el extremo N, al igual que otros miembros de la familia ANGPTL. El análisis filogenético revela que a Ng PTL8 comparte ancestros comunes con ANGPTL3 y ANGPTL4 (Fu, Z. et al., (2013), Biochem. Biophys. Res. Commun. 430:1126-1131).
La sobreexpresión hepática de ANGPTL8 se asocia con hipertrigliceridemia, mientras que la inactivación de Angptl8 provoca una reducción de los niveles plasmáticos de TG (Quagliarini, F. et. al. (2012), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(48):19751-19756; Wang, Y. et al. (2013), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:16109-16114). A pesar del consenso de que ANGPTL8 está implicada en la regulación de lípidos, el mecanismo responsable de este proceso aún está en debate. Un mecanismo propuesto es que ANGPTL8 inhibe la actividad de la lipoproteína lipasa (LPL), dando como resultado una reducción de la hidrólisis y el aclaramiento de triglicéridos (Zhang, R. et.al., (2012), Biochem. Biophys. Res. Commun. 424:786-792).
También se ha informado que ANGPTL8 juega un papel en la proliferación de células beta y la masa de células beta en ratones, donde la resistencia a la insulina se induce mediante un antagonista del receptor de insulina, S961 (Yi, P. et. al. (2013), Cell 153:747-758). Sin embargo, estudios posteriores revelaron que ANGPTL8 no es necesaria para la función de las células beta, o para la respuesta de crecimiento de las células beta a la resistencia a la insulina. Además, la sobreexpresión de ANGPTL8 no aumenta el área de las células beta ni mejora el control glucémico (Gusarova, V. et. al. (2014) Cell 159:691-696).
Dado que la sobreexpresión hepática de ANGPTL8 se asocia con hipertrigliceridemia y la inactivación de Angptl8 da como resultado una reducción de los niveles plasmáticos de triglicéridos, un inhibidor o antagonista de ANGPTL8 puede resultar eficaz en el tratamiento de una enfermedad caracterizada en parte por niveles elevados de triglicéridos, tal como, pero sin limitación, la hipertrigliceridemia.
Zhang informó que un anticuerpo monoclonal contra la lipasina, cuando se inyecta por vía intraperitoneal a ratones de tipo silvestre, disminuye los niveles de triglicéridos en suero (Zhang, R. (2015), Endocrine Society's 97th Annual Meeting, Presentation N.° OR13-6, del 5 al 8 de marzo, San Diego, CA). Sin embargo, hasta la fecha no se han descrito anticuerpos completamente humanos específicos para ANGPTL8 que puedan usarse en un entorno clínico para tratar enfermedades o afecciones caracterizadas por niveles elevados de triglicéridos, incluyendo la hipertrigliceridemia.
En consecuencia, existe una necesidad en la materia de nuevos antagonistas de ANGPTL8, tal como los anticuerpos descritos en el presente documento, para el tratamiento de pacientes que padecen hipertrigliceridemia y otros trastornos o afecciones asociadas con niveles elevados de triglicéridos y lípidos.
Zhang et al. (Endocrine Society's 97th Annual Meeting and Expo, del 5 al 8 de marzo de 2015) se refiere a OR13-16: un anticuerpo neutralizante monoclonal contra la lipasina (ANGPTL8).
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a la proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8). Un aspecto de la divulgación proporciona anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a/interactúan con ANGPTL8, por lo que dicha unión y/o interacción da como resultado la disminución de los niveles de triglicéridos en un mamífero.
En consecuencia, en un primer aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos monoclonales (AcM) completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente, neutralizan, inhiben, bloquean, suprimen, reducen o interfieren con, al menos una actividad de ANGTPL8, en particular, ANGPTL8 humana (véanse los aminoácidos 22 a 198 del número de acceso de GenBank NP_061157.3 y los aminoácidos 1 a 177 de la SEQ ID NO: 340). La actividad de ANGPTL8 que se puede neutralizar, inhibir, bloquear, suprimir, reducir o interferir, por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento, incluye, pero sin limitación, la inhibición de la actividad de LPL o la disminución de los niveles de triglicéridos in vivo y similares.
En un aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL8 y neutraliza o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una o más de las siguientes características:
a) es un anticuerpo monoclonal completamente humano;
b) se une específicamente a un epítopo lineal en la región aminoterminal de ANGPTL8 humana como se define por la SEQ ID NO: 337;
c) no se une a un epítopo lineal en la región aminoterminal de ANGPTL8 humana como se define por la SEQ ID NO: 337;
d) no se une a la región de superhélice aminoterminal del péptido ANGPTL3 humano de SEQ ID NO: 338, ni a la región de superhélice aminoterminal del péptido ANGPTL4 humano de SEQ ID NO: 339;
e) se une a ANGPTL8 humana a 25 °C con una Kd de menos de aproximadamente 150 pM y se une a ANGPTL8 de mono a 25 °C con una Kd de menos de aproximadamente 90 pM medida mediante resonancia de plasmón superficial;
f) reduce los niveles de triglicéridos en un mamífero en aproximadamente un 68 % (máximo) cuando se administra por vía subcutánea a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg;
g) reduce los niveles de triglicéridos en un mamífero durante un período que varía de aproximadamente 7 días a 21 días, cuando se administra por vía subcutánea a dosis que varía de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg;
h) comprende una región variable de cadena pesada (HCVR, del inglés 'heavy chain variable region') que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306, 314 y 330;
i) comprende una región variable de cadena ligera (LCVR, del inglés 'light chain variable region') que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250 y 322; o
j) compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) y de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la tabla 1.
En un aspecto, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación puede neutralizar, inhibir, bloquear, suprimir, reducir o interferir con, una actividad de hANGPTL8 mediante la unión a un epítopo de hANGPTL8 que está directamente implicado en la actividad dirigida de hANGPTL8 (por ejemplo, la actividad inhibidora de LPL de ANGPTL8).
En otro aspecto, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación puede neutralizar, inhibir, bloquear, suprimir, reducir o interferir con, una actividad de hANGPTL8 mediante la unión a un epítopo de hANGPTL8 que no está directamente implicado en la actividad dirigida de hANGPTL8, pero el anticuerpo o fragmento de unión del mismo puede, ya sea por superposición estérica o por efectos alostéricos en diferentes sitios de la superficie de contacto anticuerpo-antígeno, inhibir, bloquear, suprimir, reducir o interferir con, la actividad dirigida de hANGPTL8.
En otro aspecto, un anticuerpo o fragmento del mismo de la divulgación se une a un epítopo de hANGPTL8 que no está directamente implicado en la actividad dirigida (por ejemplo, la inhibición de la actividad de LPL, y similares) de hANGPTL8 (es decir, un anticuerpo no bloqueante), pero el anticuerpo o fragmento del mismo da como resultado una disminución de los niveles de triglicéridos in vivo, en comparación con la disminución de los niveles de triglicéridos en ausencia del anticuerpo o fragmento del mismo.
En un aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo anti-hANGPTL8 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo situado dentro de la región aminoterminal en los restos 1 a 39 de la SEQ ID NO: 340 (mostrada también como SEQ ID NO: 337).
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une a un epítopo situado dentro de la región aminoterminal de ANGPTL8 humana en los restos 1 a 39 de la SEQ ID NO: 340 (mostrada también como SEQ ID NO: 337), pero no se une a la región de superhélice aminoterminal de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 338), ni a la región de superhélice aminoterminal de hANGPTL4 (SEQ ID NO: 339).
En un aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo anti-hANGPTL8 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo situado fuera de la región de ANGPTL8 humana definida por los restos de aminoácidos 1 a 39 de la SEQ ID NO: 340 (mostrada también como SEQ ID NO: 337), es decir, los restos de aminoácidos 40 a 177 de la SEQ ID NO: 340), y neutraliza, inhibe, suprime, reduce o interfiere con, al menos una actividad de hANGPTL8.
En un aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo anti-hANGPTL8 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a ANGPTL8 humana (restos de aminoácidos 1 a 177 de la SEQ ID NO: 340; Véanse también los restos de aminoácidos 22 a 198 del número de acceso de GenBank NP_061157.3), pero no reacciona de forma cruzada con una proteína relacionada, tal como ANGPTL3 humana (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 342, codificada por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO: 343), o ANGPTL4 humana (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 344, codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 345).
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para aumentar la persistencia en el hospedador o para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden ser biespecíficos.
Los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos de la presente divulgación se enumeran en las tablas 1 y 2 del presente documento. La tabla 1 establece los identificadores de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR), regiones variables de cadena ligera (LCVR), regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos. La tabla 2 establece los identificadores de secuencias de las HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos.
La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCDR y LCDR (HCDR/LCDR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR enumeradas en la tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR enumeradas en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/250, 266/250, 274/250, 282/250, 290/250, 306/250, 314/322 y 330/322.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66/74, 162/170, 194/202 y 314/322.
La invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 162/170.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDR, del inglés 'complementarity determining regions') (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de la región variable de cadena pesada (HCVR) como se establece en la tabla 1; y (b) tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de la región variable de cadena ligera (LCVR) como se establece en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:
(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 268, 276, 284, 292, 300, 308, 316 y 332;
(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 270, 278, 286, 294, 302, 310, 318, y 334;
(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320 y 336;
(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252 y 324;
(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254 y 326; y
(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256 y 328.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la tabla 1. De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos enumerados en la tabla 1. El par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 72/80 (por ejemplo, H4H15321P), 168/176 (por ejemplo, H4H15341P), 200/208 (por ejemplo, H4H15345P) y 320/328 (por ejemplo, H4H15367P2). El par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 pueden ser las SEQ ID NO: 168/176 (por ejemplo, H4H15341P).
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en cualquiera de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos enumerados en la tabla 1. El conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68-70-72-76-78-80 (por ejemplo, H4H15321P); 164-166-168-172-174-176 (por ejemplo, H4H15341P); 196-198-200-204-206-208 (por ejemplo, H4H15345P); 316-318-320-324-326-328 (por ejemplo, H4H15367P2). El conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 puede ser las SEQ ID NO: 164-166-168-172-174-176 (por ejemplo, H4H15341P).
En un aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos enumerados en la tabla 1. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66/74 (por ejemplo, H4H15321P), 162/170 (por ejemplo, H4H15341P); 194/202 (por ejemplo, H4H15345P); 314/322 (por ejemplo, H415367P2). Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales, y la definición de AbM es un término medio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La presente invención incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas realizaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés 'antibody dependent cellular cytotoxicity) (véase, Shield et al., (2002) j Bc 277:26733). En otras solicitudes, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, del inglés 'complement dependent cytotoxicity').
La presente divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten por la unión específica a ANGPTL8 con un anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR de un HCVR y las CDR de un LCVR, en donde la HCVR y la LCVR tienen cada una una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a ANGPTL8 con un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de Hc VR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/250, 266/250, 274/250, 282/250, 290/250, 306/250, 314/322 y 330/322.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo en ANGPTL8 como un anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR de una HCVR y las CDR de una LCVR, en donde la HCVR y la LCVR tienen cada una una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en ANGPTL8 como un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/250, 266/250, 274/250, 282/250, 290/250, 306/250, 314/322 y 330/322.
En un aspecto, el anticuerpo aislado que se une específicamente y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, es un anticuerpo monoclonal humano producido de forma recombinante.
En un aspecto, el anticuerpo aislado que se une específicamente y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, es un anticuerpo monoclonal humano producido de forma recombinante que tiene una secuencia de HCVR y/o LCVR seleccionada de las secuencias de aminoácidos que se encuentran en la tabla 1.
En un aspecto, el anticuerpo aislado que se une específicamente y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, es un anticuerpo monoclonal humano producido de forma recombinante que tiene un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/250, 266/250, 274/250, 282/250, 290/250, 306/250, 314/322 y 330/322.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que neutraliza la actividad de ANGPTL8, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306, 314 y 330; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, y 322; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320 y 336, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256 y 328, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tenga al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 268, 276, 284, 292, 300, 308, 316 y 332, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 270, 278, 286, 294, 302, 310, 318, y 334, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252 y 324, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tenga al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254 y 326, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tenga al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une específicamente a la región aminoterminal de ANGPTL8 humana definida por la SEQ ID NO: 337; (vi) no se une específicamente a la región aminoterminal de ANGPTL8 humana definida por la SEQ ID NO: 337; (vii) no se une a la región de superhélice amionoterminal del péptido ANGPTL3 humano de SEQ ID NO: 338, ni a la región de superhélice aminoterminal del péptido ANGPTL4 humano de SEQ ID NO: 339; (viii) se une a ANGPTL8 humana a 25 °C con una Kd de menos de aproximadamente 150 pM y se une a ANGPTL8 de mono a 25 °C con una Kd de menos de aproximadamente 90 pM medida mediante resonancia de plasmón superficial; (ix) reduce los niveles de triglicéridos en un mamífero en aproximadamente un 68 % (máximo) cuando se administra por vía subcutánea a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg; (x) reduce los niveles de triglicéridos en un mamífero durante un período que varía de aproximadamente 7 días a 21 días, cuando se administra por vía subcutánea a dosis que varía de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg; (xi) compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) y de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la tabla 1.
En un segundo aspecto, la presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-ANGPTL8 o porciones de los mismos de la invención. La presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 1. La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR1 enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR2 enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR3 enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR1 enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR2 enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la tabla 1. En determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR3 enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos enumerados en la tabla 1.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos enumerados en la tabla 1.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la tabla 1. La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma. La molécula de ácido nucleico puede codificar una HCVR y una LCVR, en donde la HCVR y la LCVR proceden las dos del mismo anticuerpo anti-ANGPTL8 enumerado en la tabla 1.
La presente invención también proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención. El vector de expresión recombinante de la divulgación puede comprender cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se exponen en la tabla 1. Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen células hospedadoras en donde se han introducido dichos vectores de la invención, así como métodos para producir los anticuerpos o porciones de los mismos de la invención mediante el cultivo de las células hospedadoras de la invención en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo así producidos.
En un aspecto, el anticuerpo aislado que se une específicamente y/o inhibe al menos una actividad asociada con ANGPTL8, es un anticuerpo monoclonal humano producido de forma recombinante que tiene una HCVR y/o una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la tabla 2.
En un aspecto, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a ANGPTL8 humana, en donde el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (a) las regiones determinantes de complementariedad (CDR, del inglés 'complementarity determining regions') de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la tabla 1; y (b) las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL8 humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos como se establece en la tabla 1 y una LCVR seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos como se establece en la tabla 1.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo específico para ANGPTL8 humana seleccionado de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de los anticuerpos anti-ANGPTL8 que se encuentran en la tabla 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo anti-ANGPTL8 de la invención y un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine de forma ventajosa con un anticuerpo anti-ANGPTL8.
En una realización, el segundo agente terapéutico puede ser un agente capaz de disminuir los triglicéridos o reducir al menos un síntoma en un paciente que padece una enfermedad o afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos, tal como la hipertrigliceridemia.
En determinadas realizaciones, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto o efectos secundarios asociados con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, si ocurriera dicho efecto o efectos.
El segundo agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña, una proteína/polipéptido, un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula antisentido, o un ARNip. El segundo agente terapéutico puede ser de origen sintético o natural.
También se apreciará que los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención puedan emplearse en otras terapias combinadas, es decir, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar simultáneamente con, antes que o después de, uno o más de los diferentes procedimientos terapéuticos o médicos deseados. La combinación particular de terapias (productos terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen combinado tendrá en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se debe lograr. Se apreciará también que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un anticuerpo puede administrarse simultáneamente con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno) o pueden lograr efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso). Como se utiliza en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad, o afección, en particular, son adecuados para la enfermedad, o afección, que se van a tratar.
En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, y un segundo agente terapéutico, tal como (1) inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, tal como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y similares; (2) inhibidores de la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares; (3) niacina, que aumenta el catabolismo de lipoproteínas; (4) fibratos o ácidos carboxílicos anfipáticos, que reducen el nivel de TG, el nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL, del inglés 'low-density lipoprotein') y mejoran los niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL, del inglés 'high-density lipoprotein'); y (5) activadores del factor de transcripción LXR que juega un papel en la eliminación del colesterol tal como 22-hidroxicolesterol, o combinaciones fijas tales como ezetimiba más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), una combinación fija de niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina); o con otros agentes reductores de lípidos, tales como los ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, omacor).
Además, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más inhibidores de ANGPTL8 diferentes, así como inhibidores de otras moléculas, tales como ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, apolipoproteína C-III (APOC3) y proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), que están implicadas en el metabolismo de lípidos, en particular, la homeostasia del colesterol y/o los triglicéridos. Los inhibidores de estas moléculas incluyen moléculas pequeñas, moléculas antisentido y anticuerpos que se unen específicamente a estas moléculas y bloquean su actividad.
En un aspecto, si los anticuerpos anti-ANGPTL8 de la invención se utilizan para tratar una enfermedad tal como la diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo 2), entonces estos anticuerpos pueden utilizarse en combinación con uno o más de los siguientes tratamientos para la diabetes que están disponibles actualmente. Estos incluyen los siguientes: insulina, un análogo de insulina (véase a continuación), una biguanida (metformina), una sulfonilurea (por ejemplo, gliburida, glipizida), un agonista de PPAR y (por ejemplo, pioglitazona, rosiglitazona), un inhibidor de la a glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, voglibosa), un agonista del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1, del inglés 'glucagon-like peptide 1') (por ejemplo, BYETTA® (exenatida), TRULICITY™ (dulaglutida), V iCt OZA® (liraglutida), Lyxumia® (lixisenatida), Tanzeum™ (albiglutida)), un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-4) (por ejemplo, saxagliptina (ONGLYZA®), sitaliptina (JANUVIA®) y vildagliptina (GALVUS®), un inhibidor del cotransportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2) (por ejemplo, INVOKANA™ (canagliflozina), FORXIGA® (dapagliflozina), empagliflozina, ipragliflozina, tofogliflozina), s Ym LIN® (pramlintida), un antagonista del receptor de glucagón (como se describe en, por ejemplo, el documento US8545847) y un antagonista del glucagón.
En determinados ejemplos relacionados, la composición puede incluir un segundo agente seleccionado del grupo que consiste en secretagogos que no son sulfonilurea, análogos de insulina, incluyendo los de acción rápida (por ejemplo, Lispro, Aspart, glulisina) y los de acción prolongada (por ejemplo, insulina Detemir, insulina Degludec o insulina Glargina, polipéptidos exendina-4, agonistas de los receptores adrenérgicos p 3, inhibidores de la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares, antagonistas del colesterol LDL, antagonistas de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (por ejemplo, torcetrapib, anacetrapib, dalcetrapib o evacetrapib), antagonistas del receptor de endotelina, antagonistas de la hormona de crecimiento, sensibilizadores a la insulina, miméticos o agonistas de amilina, antagonistas del receptor cannabinoide, agonistas del receptor del péptido-1 similar a glucagón, melanocortinas, agonistas del receptor de la hormona concentradora de melanina, IRSN, un mimético del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Véase, por ejemplo, los documentos US20110002845 y US20080261236), un agonista del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1c (FGFRIc) (Véase, por ejemplo, el documento US20110150901), un inhibidor de la formación avanzada de productos finales de glucación, tal como, pero sin limitación, aminoguanidina, e inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa.
En ejemplos relacionados, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más de otros agentes terapéuticos, tales como analgésicos, agentes antiinflamatorios, incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como inhibidores de Cox-2 y similares, para mejorar y/o reducir los síntomas que acompañan a la enfermedad subyacente, si es necesario.
La divulgación proporciona un método para neutralizar, inhibir, bloquear, suprimir, reducir o interferir con, al menos una actividad asociada con ANGPTL8 en un paciente que lo necesita, comprendiendo el método administrar uno cualquiera o más de los anticuerpos descritos en el presente documento, como se encuentra en la tabla 1, o una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera o más de estos anticuerpos para un paciente que los necesita, en donde al menos una actividad asociada con ANGPTL8 se reduce o disminuye.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método terapéutico que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-hANGPTL8 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales como se describe anteriormente.
En un quinto aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad o afección asociada en parte con una expresión y/o actividad elevada de ANGPTL8, comprendiendo el método administrar un inhibidor/antagonista de ANGPTL8, en donde el inhibidor/antagonista de ANGPTL8 es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo específico para ANGPTL8. El anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo específico para ANGPTL8 puede comprender una HCVR seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de la tabla 1 y una LCVR seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de la tabla 1.
En un aspecto, la enfermedad o trastorno que se puede tratar mediante los métodos descritos en el presente documento es cualquier enfermedad o afección que se mejora, alivia, inhibe o previene, o al menos un síntoma asociado con la enfermedad se reduce en intensidad o frecuencia de aparición, en comparación con aquella sin tratamiento con anticuerpo anti-hANGPTL8 (por ejemplo, enfermedades o trastornos mediados por ANGPTL8), mediante la eliminación, inhibición, reducción o interferencia de otra manera con, la actividad de ANGPTL8. Los ejemplos de enfermedades o trastornos tratables con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, aquellos que implican el metabolismo de lípidos, tales como hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, incluyendo dislipidemia aterogénica, dislipemia diabética, hipertrigliceridemia, incluyendo hipertrigliceridemia grave con t G >1000 mg/dl y pancreatitis aguda asociada, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mixta (obesidad, síndrome metabólico, diabetes, etc.), lipodistrofia, lipoatrofia y similares, causadas por, por ejemplo, disminución de la actividad de LPL y/o deficiencia de LPL, ApoC2 alterada, deficiencia de ApoE, aumento de ApoB, aumento de la producción y/o disminución de la eliminación de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), ciertos tratamientos farmacológicos (por ejemplo, dislipidemia inducida por el tratamiento con glucocorticoides), cualquier predisposición genética, la dieta, estilo de vida y similares.
Los métodos descritos en el presente documento también pueden prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados o resultantes de trigliceridemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y/o dislipidemia, incluyendo, pero sin limitación, enfermedades o trastornos cardiovasculares, tales como aterosclerosis, aneurisma, hipertensión, angina de pecho, ictus, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardíaca congestiva, arteriopatías coronarias, infarto de miocardio, vasculopatías periféricas y similares; pancreatitis aguda; esteatohepatitis no alcohólica (NASH); trastornos de la glucemia, tales como diabetes; obesidad, y similares.
En una realización, al menos un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede utilizarse para tratar la dislipidemia asociada al síndrome metabólico, obesidad, o para prevenir el aumento de peso, o para mantener un peso normal.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para disminuir los niveles de triglicéridos en sangre, o para tratar una afección o enfermedad asociada con, o caracterizada en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, o al menos un síntoma o complicación asociada con la afección o enfermedad, comprendiendo el método administrar una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos específicos para ANGPTL8 humana de la tabla 1, a un paciente que lo necesite, de manera que los niveles de triglicéridos en sangre disminuyen o que la afección o enfermedad está mediada, o al menos un síntoma o complicación asociado con la afección o enfermedad se alivia o reduce en intensidad.
En una realización, al menos un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede utilizarse solo o en combinación con un segundo o tercer agente terapéuti
menos un síntoma asociado con la hipertrigliceridemia, o puede utilizarse para tratar a un paciente en riesgo de adquirir hipertrigliceridemia, por ejemplo, en un paciente que tiene una predisposición genética a desarrollar hipertrigliceridemia, por ejemplo, hipertrigliceridemia familiar o disbetalipoproteinemia familiar.
Otras afecciones pueden predisponer a un paciente a niveles elevados de triglicéridos. Por ejemplo, determinados medicamentos tales como los betabloqueantes, pastillas anticonceptivas, diuréticos, esteroides, o la utilización de tamoxifeno puede conducir a niveles elevados de triglicéridos y, como tal, puede aumentar la probabilidad de que un paciente desarrolle afecciones o complicaciones asociadas con niveles elevados de triglicéridos, tales como aterosclerosis, ictus, infarto de miocardio y otras afecciones cardíacas.
Además, determinadas otras afecciones pueden conducir a niveles elevados de triglicéridos, incluyendo obesidad, diabetes mal controlada, hipotiroidismo, enfermedad renal o consumo de alcohol.
En una realización, los anticuerpos pueden utilizarse para prevenir la aparición de una enfermedad o trastorno caracterizado en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, o para prevenir la probabilidad de desarrollar dicha enfermedad o trastorno, o para aliviar la intensidad de la enfermedad o trastorno, o al menos un síntoma asociado con la enfermedad o trastorno. Se prevé que los anticuerpos de la invención se puedan utilizar solos o como terapia complementaria con otros agentes o métodos conocidos como tratamiento habitual para el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades o afecciones caracterizadas en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, tal como, pero sin limitación, la hipertrigliceridemia. Dicha terapia estándar puede incluir la administración de líquidos o la administración de cualquier otro agente farmacéutico útil para disminuir los triglicéridos o lípidos en sangre o para la reducción de peso.
La utilización de los anticuerpos descritos en el presente documento, puede ser un medio eficaz para alcanzar niveles normales de triglicéridos, mejorando de ese modo, o previniendo uno o más síntomas de, o complicaciones a largo plazo asociadas con, una enfermedad caracterizada por niveles elevados de triglicéridos.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en la preparación de un medicamento para utilizar en el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno caracterizado en parte por niveles elevados de triglicéridos.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse como terapia a corto plazo en un entorno agudo, o pueden concebirse para utilizar a largo plazo como terapia crónica.
Otros aspectos resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la media /- EEM de triglicéridos en suero y concentración de colesterol total en ratones ANGPTL8 humanizados a los que se les administró una única dosis subcutánea de H4H15341P. Las dosis administradas fueron de 1, 5, 10 o 25 mg/kg el día 0 del estudio. La comparación estadística se realizó mediante ANOVA bidireccional de las diferencias de Ac de control, *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, **p <0,0001
La figura 2 muestra los niveles de anticuerpo anti-humano circulante después de la administración de una dosis subcutánea de H4H15341P a dosis de 1, 5, 10 o 25 mg/kg.
La figura 3 muestra el efecto del AcM H4H15341P sobre la lipoproteína lipasa (LPL) sérica y la lipasa hepática en ratones ANGPTL8 en comparación con el anticuerpo de control. Las estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados; **p <0,01
La figura 4 muestra el efecto del AcM H4H15341P en una prueba de tolerancia a lípidos en ratones ANGPTL8. Se evaluó la administración del AcM H4H15341P para la disminución de los niveles de triglicéridos después de una carga de grasa aguda en comparación con el anticuerpo de control. Las estadísticas se realizaron mediante ANOVA bidireccional con prueba de Bonferroni posterior; **p <0,0001
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni condiciones experimentales particulares descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.). Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
"Proteína similar a la angiopoyetina 8", o "ANGPTL8", es un miembro de la familia de proteínas de la angiopoyetina, y a veces se lo denomina TD26, RIFL, lipasina, C19orf80 y betatrofina. "ANGPTL8", como se utiliza en el presente documento, se refiere a ANGPTL8 humana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en los restos de aminoácidos 1 a 177 de la SEQ ID NO: 340. La secuencia de aminoácidos de ANGPTL8 humana de longitud completa, incluyendo la secuencia señal, también se puede encontrar en el número de acceso de GenBank NP_061157.3, mientras que la secuencia de ácido nucleico de longitud completa que codifica ANGPTL8 humana se puede encontrar en el número de acceso de GenBank NM_018687.6. El dominio de superhélice aminoterminal de ANGPTL8 humana abarca los restos de aminoácidos 1 a 39 de la SEQ ID NO: 340 y también se representa como la SEQ ID NO: 337. Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectiva a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "ANGPTL8" significa ANGPTL8 humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana, por ejemplo, "ANGPTL8 de ratón", "ANGPTL8 de mono", etc.
La expresión "proteína similar a angiopoyetina 3 humana" o "hANGPTL3", como se utiliza en el presente documento, se refiere a ANGPTL3 que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 343 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 342, o un fragmento biológicamente activo de las mismas. El dominio de superhélice aminoterminal de ANGPTL3 humana se representa como la SEQ ID NO: 338.
La expresión "proteína similar a angiopoyetina 4 humana" o "hANGPTL4", como se utiliza en el presente documento, se refiere a ANGPTL4 que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 345 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 344, o un fragmento biológicamente activo de las mismas. El dominio de superhélice aminoterminal de ANGPTL4 humana se representa como la SEQ ID NO: 339.
En las realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados a una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un segundo antagonista de ANGPTL8, o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una enfermedad o afección causada en parte por niveles elevados de triglicéridos.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo anti-ANGPTL8" incluye tanto anticuerpos monovalentes con una sola especificidad, como anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer brazo que se une a ANGPTL8 y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (diana), en donde el brazo anti-ANGPTL8 comprende cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o CDR como se establece en tabla 1 en el presente documento.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, ANGPTL8). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo anti-ANGPTL8 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden estar modificarse de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, que está adyacente o en marco con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Las configuraciones de ejemplo no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se describe en el presente documento puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable puede unirse específicamente con un antígeno distinto o con un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico de ejemplo que se desvelan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la materia.
La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, tiene la intención de incluir anticuerpos humanos de origen no natural. La expresión incluye anticuerpos que se producen de forma recombinante en un mamífero no humano o en células de un mamífero no humano. La expresión no pretende incluir anticuerpos aislados de o generados en un sujeto humano.
Los anticuerpos de la divulgación pueden, en algunas realizaciones, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. En determinados aspectos, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque están relacionadas con las secuencias Vh y Vl de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150­ 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, la región Ch2 o Ch3, que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.
Los anticuerpos anti-ANGPTL8 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en el marco y/o regiones CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento con secuencias disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), menor inmunogenia, etc.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVr , LCVR, y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR expuestas en la tabla 1 en el presente documento.
Un "anticuerpo de bloqueo" o un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de ANGPTL8"), pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión y/o interacción con ANGPTL8 da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica de ANGPTL8. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento puede inhibir la actividad inhibidora de la lipoproteína lipasa de ANGPTL8, o puede reducir los triglicéridos plasmáticos a través de un mecanismo distinto a la inhibición de la actividad inhibidora de LPL de ANGPTL8. Esta inhibición de la actividad biológica de ANGPTL8 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de ANGPTL8 mediante uno o más de varios ensayos estándar in vitro o in vivo conocidos en la materia. Una actividad alternativa es la actividad reductora de triglicéridos asociada con un anticuerpo de la invención.
La expresión "resonancia de plasmón de superficie" o "SPR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo, utilizando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N. J.), o un sistema MASS-1 (Sierra Sensors, Hamburgo, Alemania y Greenville, RI).
El término "Kd", como se utiliza en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados ejemplos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en donde un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente citado). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389402.
Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la materia podrá determinarla usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Los términos "tratar" o "tratamiento", como se utiliza en el presente documento, se refieren a una estrategia para obtener beneficio o resultados clínicos deseados. En una realización de la invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, una mejora en los niveles de triglicéridos en sangre, o una mejora en una o más afecciones, enfermedades o síntomas asociados con, o resultantes de, niveles elevados de triglicéridos, incluyendo, pero no limitado a hipertrigliceridemia, etc.
Unión dependiente del pH
La presente invención incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 con características de unión dependientes del pH. Por ejemplo, un anticuerpo anti-ANGPTL8 de la presente invención puede presentar una unión reducida a ANGPTL8 a pH ácido en comparación con pH neutro. Como alternativa, los anticuerpos anti-ANGPTL8 de la invención pueden presentar una unión mejorada a ANGPTL8 a pH ácido en comparación con pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH inferiores a aproximadamente 6,2, por ejemplo, aproximadamente 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 o inferior. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.
En determinados ejemplos, "unión reducida a ANGPTL8 a pH ácido en comparación con pH neutro" se expresa en términos de una proporción del valor de Kd del anticuerpo que se une a ANGPTL8 a pH ácido con respecto al valor de Kd del anticuerpo que se une a ANGPTL8 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede considerarse que presenta "unión reducida a ANGPTL8 a pH ácido en comparación con pH neutro" para los fines de la presente invención si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una proporción de Kd ácida/neutra de aproximadamente 3,0 o superior. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de Kd ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención puede ser aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 o superior.
Se pueden obtener anticuerpos con características de unión dependientes del pH, por ejemplo, rastreando una población de anticuerpos para la unión reducida (o potenciada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con pH neutro. De manera adicional, las modificaciones del dominio de unión al antígeno a nivel de aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes del pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, dentro de una CDR) con un resto de histidina, puede obtenerse un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido en relación con el pH neutro.
Anticuerpos anti-ANGPTL8 que comprenden variantes de Fc
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-ANGPTL8 que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones, que potencian o disminuyen la unión de anticuerpos al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en los que la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, l/y /F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). Incluso en otra realización, la modificación comprende una modificación 265A (por ejemplo, D265A) y/o una modificación 297A (por ejemplo, N297A).
Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 257I y 3111 (por ejemplo, P257I y Q311I); 257I y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores, y otras mutaciones dentro de los dominios variables del anticuerpo divulgados en el presente documento, se contemplan.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que comprenden una región constante de cadena pesada (Ch) quimérica, en donde la región Ch quimérica comprende segmentos procedentes de las regiones Ch de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región Ch quimérica que comprende parte o la totalidad de un dominio Ch2 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio Ch3 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región Ch quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con una secuencia "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región Ch quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinadas realizaciones, presentar funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, la Sol. Provisional de EE.UU. N.° 61/759.578, presentada el 1 de febrero de 2013.
Características biológicas de los anticuerpos
La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a ANGPTL8 con alta afinidad. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que se unen a ANGPTL8 humana o de mono con una Kd de menos de aproximadamente 150 nM, medida mediante resonancia de plasmón superficial (SPR, del inglés 'surface plasmon resonance') a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, utilizando proteína ANGPTL8 recombinante con una fusión carboxiterminal de Fc de IgG2a de ratón, en un formato de ensayo como se define en los ejemplos 3 y 4 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos anti-ANGPTL8 que se unen a ANGPTL8 humana o de mono a 25 °C o 37 °C con una Kd de menos de aproximadamente 90 nM, o menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 3 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 150 pM, o menos de aproximadamente 90 pM, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en los ejemplos 3 y 4 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al péptido de SEQ ID NO: 337 procedente de la región aminoterminal de ANGPTL8 humana con una semivida disociativa (t1^ ) de más de aproximadamente 100 minutos medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos anti-ANGPTL8 que se unen a péptidos procedentes de la región aminoterminal de ANGPTL8 humana a 25 °C con una t1^ superior o igual a unos 110 minutos, superior a aproximadamente 120 minutos, superior a aproximadamente 130 minutos, superior a aproximadamente 200 minutos, superior a aproximadamente 300 minutos, superior a aproximadamente 400 minutos, superior a aproximadamente 500 minutos o más, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reducen los triglicéridos en un mamífero en aproximadamente un 20 %, o en aproximadamente un 30 %, o en aproximadamente un 40 %, o en aproximadamente un 50 %, o en aproximadamente un 60 % o más cuando se administra por vía subcutánea a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg, o aproximadamente 1 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 25 mg/kg, o aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 100 mg/kg. El efecto de un anticuerpo descrito en el presente documento sobre la reducción de los triglicéridos plasmáticos puede durar desde al menos 7 días después de la administración hasta aproximadamente 3 semanas, o 4 semanas después de la administración, o más.
Un anticuerpo de la divulgación comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306, 314 y 330; y una región variables de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, y 322; o puede competir de forma cruzada con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) y de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR de la tabla 1.
Un anticuerpo de la divulgación puede comprender un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/250, 266/250, 274/250, 282/250, 290/250, 306/250, 314/322 y 330/322.
Un anticuerpo de la divulgación puede comprender:
(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 268, 276, 284, 292, 300, 308, 316 y 332;
(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 270, 278, 286, 294, 302, 310, 318, y 334;
(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320 y 336;
(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252 y 324;
(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254 y 326; y
(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256 y 328.
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden poseer una o más de las características biológicas mencionadas anteriormente, o cualquier combinación de las mismas. La lista anterior de características biológicas de los anticuerpos descritos en el presente documento no pretende ser exhaustiva. Otras características biológicas de los anticuerpos serán evidentes para un experto en la materia a partir de una revisión de la presente divulgación que incluye los ejemplos de trabajo del presente documento.
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
El epítopo al que se unen los anticuerpos descritos en el presente documento puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína ANGPTL8. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) de ANGPTL8.
Pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas de ejemplo incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) y análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto en los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2): 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-ANGPTL8 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la tabla 1 en el presente documento). De forma análoga, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-ANGPTL8 que compiten por unirse a ANGPTL8 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la tabla 1 en el presente documento).
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia mediante el uso de métodos de rutina conocidos en la materia e ilustrados en el presente documento. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia descrito en el presente documento, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína ANGPTL8. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula de ANGPTL8. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a ANGPTL8 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia. Por otra parte, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula de ANGPTL8 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia. A continuación, puede realizarse experimentación de rutina adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia. De acuerdo con determinados aspectos, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión (o compite de forma cruzada por la unión) con un anticuerpo anti-ANGPTL8 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína ANGPTL8 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de ANGPTL8. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de ANGPTL8 en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de ANGPTL8. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula de ANGPTL8, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a ANGPTL8. Como apreciará un experto en la materia, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Preparación de anticuerpos humanos
Los anticuerpos anti-ANGPTL8 de la presente invención pueden ser anticuerpos completamente humanos (de origen no natural). Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos son conocidos en la materia. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a ANGPTL8 humana.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad a un alérgeno que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos de regiones constantes de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humana. A continuación, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.
Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® se expone al antígeno de interés y las células linfáticas (tal como linfocitos B) se recuperan de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales y dichas líneas celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.
Como se describe a continuación en la sección experimental, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad, que están aislados con una región variable humana y una región constante de ratón, se caracterizan y seleccionan por características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan después con una región constante humana deseada para generar un anticuerpo totalmente humano, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
En general, los anticuerpos descritos en el presente documento poseen afinidades muy altas, poseyendo normalmente una Kd de aproximadamente 10-12 a aproximadamente 10-9 M, cuando se miden mediante unión a antígeno inmovilizado sobre fase sólida o en fase en solución.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-ANGPTL8 y fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a ANGPTL8. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. De forma análoga, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-ANGPTL8 descritas en el presente documento abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-ANGPTL8 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-ANGPTL8 o fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas secuencias de ADN y de aminoácidos variantes.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenia, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la condición o condiciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-ANGPTL8 de la invención pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-ANGPTL8 que comprenden cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-ANGPTL8 de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
La presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une a la ANGPTL8 humana, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo antígeno. El brazo de unión a ANGPTL8 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la tabla 1 en el presente documento.
Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica la utilización de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, "botón en ojal", cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase,por ejemplo, Klein et al., 2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). También se pueden construir anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde se utilizan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Publicación electrónica: 4 de diciembre de 2012]).
Formulación terapéutica y administración
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-ANGPTL8 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, afecciones, vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. En un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la intensidad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y posologías para administrar anticuerpos anti-ANGPTL8 pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Por otra parte, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DlSETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Incluso en otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, mencionado anteriormente, vol. 2, páginas 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Las preparaciones inyectables pueden incluir pautas posológicas para inyecciones intravenosas, subcutánea, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla adecuada.
De manera ventajosa, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Inmunoconjugados
La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-ANGPTL8 humana conjugado con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un agente que es capaz de reducir los niveles de lípidos o triglicéridos en sangre. El tipo de fracción terapéutica que se puede conjugar con el anticuerpo anti-ANGPTL8 tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico deseado a lograr. Por ejemplo, para el tratamiento de la hipertrigliceridemia, o cualquier otra afección en la que sea deseable reducir los triglicéridos en sangre y/o mantener niveles normales de triglicéridos en sangre, se puede conjugar un agente con el anticuerpo anti-ANGPTL8. Como alternativa, si el efecto terapéutico deseado es tratar las secuelas o los síntomas asociados con la hipertrigliceridemia, o cualquier otra afección resultante de niveles altos o descontrolados de triglicéridos en sangre, puede ser ventajoso conjugar un agente adecuado para tratar las secuelas o los síntomas de la afección. En la materia se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados, véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los presentes anticuerpos son útiles para reducir los niveles de triglicéridos en sangre, por ejemplo, en un paciente que padece hipertrigliceridemia, y también para el tratamiento de una amplia gama de afecciones y trastornos en los que es beneficioso inhibir la actividad de ANGPTL8. Por lo tanto, los anticuerpos pueden encontrar uso, por ejemplo, para prevenir, tratar o aliviar, enfermedades o afecciones o síntomas o secuelas asociadas, del sistema endocrino, el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico, el sistema cardiovascular, el sistema pulmonar y el sistema gastrointestinal, mientras se reduce y/o elimina uno o más de los efectos secundarios no deseados asociados con los tratamientos actuales.
Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar una enfermedad o trastorno que incluye, pero sin limitación, aquellos que implican el metabolismo de lípidos, tales como hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, incluyendo dislipidemia aterogénica, dislipemia diabética, hipertrigliceridemia, incluyendo hipertrigliceridemia grave con t G >1000 mg/dl y pancreatitis aguda asociada, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mixta (obesidad, síndrome metabólico, diabetes, etc.), lipodistrofia, lipoatrofia y similares, causadas por, por ejemplo, disminución de la actividad de LPL y/o deficiencia de LPL, ApoC2 alterada, deficiencia de ApoE, aumento de ApoB, aumento de la producción y/o disminución de la eliminación de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), ciertos tratamientos farmacológicos (por ejemplo, dislipidemia inducida por el tratamiento con glucocorticoides), cualquier predisposición genética, la dieta, estilo de vida y similares.
Los anticuerpos de la invención también pueden prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados o resultantes de la trigliceridemia, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y/o dislipidemia, incluyendo, pero sin limitación, enfermedades o trastornos cardiovasculares, tales como aterosclerosis, aneurisma, hipertensión, angina de pecho, ictus, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardíaca congestiva, arteriopatías coronarias, infarto de miocardio, vasculopatías periféricas y similares; pancreatitis aguda; esteatohepatitis no alcohólica (NASH); trastornos de la glucemia, tales como diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo II); obesidad, y similares.
En una realización, al menos un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede utilizarse para tratar la dislipidemia asociada al síndrome metabólico, obesidad, o para prevenir el aumento de peso, o para mantener un peso normal.
En un aspecto, se proporciona un método para disminuir los niveles de triglicéridos en sangre, o para tratar una afección o enfermedad asociada con, o caracterizada en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, o al menos un síntoma o complicación asociada con la afección o enfermedad, comprendiendo el método administrar una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos específicos para ANGPTL8 humana de la tabla 1, a un paciente que lo necesite, de manera que los niveles de triglicéridos en sangre disminuyen o que la afección o enfermedad está mediada, o al menos un síntoma o complicación asociado con la afección o enfermedad se alivia o reduce en intensidad.
En una realización, al menos un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede utilizarse solo o en combinación con un segundo o tercer agente terapéuti
menos un síntoma asociado con la hipertrigliceridemia, o puede utilizarse para tratar a un paciente en riesgo de adquirir hipertrigliceridemia, por ejemplo, en un paciente que tiene una predisposición genética a desarrollar hipertrigliceridemia, por ejemplo, hipertrigliceridemia familiar o disbetalipoproteinemia familiar.
Otras afecciones pueden predisponer a un paciente a niveles elevados de triglicéridos. Por ejemplo, determinados medicamentos tales como los betabloqueantes, pastillas anticonceptivas, diuréticos, esteroides, o la utilización de tamoxifeno puede conducir a niveles elevados de triglicéridos y, como tal, puede aumentar la probabilidad de que un paciente desarrolle afecciones o complicaciones asociadas con niveles elevados de triglicéridos, tales como aterosclerosis, ictus, infarto de miocardio y otras afecciones cardíacas.
Además, determinadas otras afecciones pueden conducir a niveles elevados de triglicéridos, incluyendo obesidad, diabetes mal controlada, hipotiroidismo, enfermedad renal o consumo de alcohol.
En una realización, los anticuerpos pueden utilizarse para prevenir la aparición de una enfermedad o trastorno caracterizado en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, o para prevenir la probabilidad de desarrollar dicha enfermedad o trastorno, o para aliviar la intensidad de la enfermedad o trastorno, o al menos un síntoma asociado con la enfermedad o trastorno. Se prevé que los anticuerpos de la invención se puedan utilizar solos o como terapia complementaria con otros agentes o métodos conocidos como tratamiento habitual para el tratamiento de pacientes que padecen enfermedades o afecciones caracterizadas en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, tal como, pero sin limitación, la hipertrigliceridemia. Dicha terapia estándar puede incluir la administración de líquidos o la administración de cualquier otro agente farmacéutico útil para disminuir los triglicéridos o lípidos en sangre o para la reducción de peso.
En una realización, la utilización de los anticuerpos descritos en el presente documento, puede ser un medio eficaz para alcanzar niveles normales de triglicéridos, mejorando de ese modo, o previniendo uno o más síntomas de, o complicaciones a largo plazo asociadas con, una enfermedad caracterizada por niveles elevados de triglicéridos.
Se prevé que los anticuerpos de la invención puedan usarse en un entorno agudo (para uso a corto plazo) o para uso a largo plazo (crónico).
Terapias de combinación
Las terapias de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-ANGPTL8 de la invención y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse de manera ventajosa con un anticuerpo de la invención, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la invención.
Por ejemplo, cuando se contempla el uso de anticuerpos de la invención en el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada en parte por niveles elevados de triglicéridos, tal como la hipertrigliceridemia, se puede emplear un segundo agente terapéutico para ayudar a disminuir aún más los niveles de triglicéridos, o para reducir al menos un síntoma en un paciente que padece una enfermedad o afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos en sangre. Dicho segundo agente puede seleccionarse de, por ejemplo, otro antagonista de ANGPTL8 (por ejemplo, otro anticuerpo anti-ANGPTL8 diferente o inhibidor de molécula pequeña de ANGPTL8), o puede incluir otras fracciones terapéuticas útiles para tratar la trigliceridemia, u otras enfermedades o afecciones asociadas o resultantes de niveles elevados de triglicéridos en sangre, o agentes útiles para tratar cualquier complicación a largo plazo asociada con niveles elevados y/o descontrolados de triglicéridos en sangre.
En aspectos relacionados, la divulgación presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, y un segundo agente terapéutico, tal como (1) inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, tal como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y similares; (2) inhibidores de la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares; (3) niacina, que aumenta el catabolismo de lipoproteínas; (4) fibratos o ácidos carboxílicos anfipáticos, que reducen el nivel de lipoproteína de baja densidad (LDL), mejoran los niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) y TG, y reducen el número de infartos de miocardio no mortales; y (5) activadores del factor de transcripción LXR que juega un papel en la eliminación del colesterol tal como 22-hidroxicolesterol, o combinaciones fijas tales como ezetimiba más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), una combinación fija de niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina); o con otros agentes reductores de lípidos, tales como los ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, omacor).
Además, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más de otros inhibidores/antagonistas del glucagón o un inhibidor/antagonista del receptor del glucagón, así como inhibidores de otras moléculas, tales como otros inhibidores de ANGPTL8, así como inhibidores de otras moléculas, tales como ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, apolipoproteína C-III (también denominada APOC3; véase, por ejemplo, inhibidores de APOC3 descritos en los documentos US8530439, US7750141, US7598227 y volanesorsen, también conocido como ISIS-APOCIIIRx) y proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9), que participa en el metabolismo de los lípidos, en particular, la homeostasia del colesterol y/o los triglicéridos. Los inhibidores de estas moléculas incluyen moléculas pequeñas, moléculas antisentido y anticuerpos que se unen específicamente a estas moléculas y bloquean su actividad.
En un aspecto, si los anticuerpos anti-ANGPTL8 de la invención se utilizan para tratar una enfermedad tal como la diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo 2), entonces estos anticuerpos pueden utilizarse en combinación con uno o más de los siguientes tratamientos para la diabetes que están disponibles actualmente. Estos incluyen los siguientes: insulina, un análogo de insulina (véase a continuación), una biguanida (metformina), una sulfonilurea (por ejemplo, gliburida, glipizida), un agonista de PPAR y (por ejemplo, pioglitazona, rosiglitazona), un inhibidor de la a glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, voglibosa), un agonista del receptor del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) (por ejemplo, BYETTA® (exenatida), TRULICITY™ (dulaglutida), VICTOZA® (liraglutida), LYXUMlA® (lixisenatida), TANZEUM™ (albiglutida), o un análogo de cualquiera de los anteriores), un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-4) (por ejemplo, saxagliptina (ONGLYZA®), sitaliptina (JANuVlA®) y vildagliptina (GALVu S®), un inhibidor del cotransportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2) (por ejemplo, INVOKa Na ™ (canagliflozina), FORXIGA® (dapagliflozina), empagliflozina, ipragliflozina, tofogliflozina), (Sy m L iN® (pramlintida), un antagonista del receptor de glucagón (como se describe en, por ejemplo, el documento US8545847) y un antagonista del glucagón.
En determinados aspectos relacionados, la composición puede incluir un segundo agente seleccionado del grupo que consiste en secretagogos que no son sulfonilurea, análogos de insulina, incluyendo los de acción rápida (por ejemplo, Lispro, Aspart, glulisina) y los de acción prolongada (por ejemplo, insulina Detemir, insulina Degludec o insulina Glargina, polipéptidos exendina-4, agonistas de los receptores adrenérgicos p 3, inhibidores de la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares, antagonistas del colesterol LDL, antagonistas de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (por ejemplo, torcetrapib, anacetrapib, dalcetrapib o evacetrapib), antagonistas del receptor de endotelina, antagonistas de la hormona de crecimiento, sensibilizadores a la insulina, miméticos o agonistas de amilina, antagonistas del receptor cannabinoide, agonistas del receptor del péptido-1 similar a glucagón, melanocortinas, agonistas del receptor de la hormona concentradora de melanina, IRSN, un mimético del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Véase, por ejemplo, los documentos US20110002845 y US20080261236), un agonista del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1c (FGFR1c) (Véase, por ejemplo, el documento US20110150901), un inhibidor de la formación avanzada de productos finales de glucación, tal como, pero sin limitación, aminoguanidina, e inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa.
En aspectos relacionados, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más de otros agentes terapéuticos, tales como analgésicos, agentes antiinflamatorios, incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como inhibidores de Cox-2 y similares, para mejorar y/o reducir los síntomas que acompañan a la enfermedad subyacente, si es necesario.
El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de la administración del anticuerpo anti-ANGPTL8 de la presente invención. Para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-ANGPTL8 "en combinación con" un segundo componente terapéuticamente activo.
Regímenes de administración
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se pueden administrar múltiples dosis de un anticuerpo anti-ANGPTL8 (o una composición farmacéutica que comprende una combinación de un anticuerpo anti-ANGPTL8 y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto durante un transcurso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-ANGPTL8 de la invención. Como se utiliza en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo anti-ANGPTL8 se administra al sujeto en un diferente punto temporal, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un anticuerpo anti-ANGPTL8, seguida por una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-ANGPTL8, y opcionalmente seguidas por una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-ANGPTL8.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-ANGPTL8 de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también mencionada como la "dosis basal"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-ANGPTL8, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-ANGPTL8 contenida en la dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (por ejemplo, ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el curso del tratamiento. En determinadas realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
En determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 14 /, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21 ,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de anticuerpo anti-ANGPTL8, que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos de acuerdo con este aspecto pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo anti-ANGPTL8. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otras realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias se administran al paciente. De forma análoga, en determinadas realizaciones, solo se administra una dosis terciaria única al paciente. En otras realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias se administran al paciente. El régimen de administración puede llevarse a cabo indefinidamente durante la vida de un sujeto particular, o hasta que dicho tratamiento ya no sea terapéuticamente necesario o ventajoso.
En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas o de 1 a 2 meses después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 12 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. En determinadas realizaciones de la invención, La frecuencia con la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso del régimen de tratamiento. La frecuencia de la administración también puede ajustarla un médico durante el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual después de la exploración clínica.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-ANGPTL8 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir ANGPTL8 en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpos anti-ANGPTL8, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de ANGPTL8. Los ensayos de diagnóstico ilustrativos para ANGPTL8 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-ANGPTL8 de la invención, en donde el anticuerpo anti-ANGPTL8 está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente la proteína ANGPTL8 de las muestras del paciente. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-ANGPTL8 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa.
Los ensayos ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir ANGPTL8 en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que se pueden utilizar en los ensayos de diagnóstico de ANGPTL8 incluyen cualquier muestra de tejido o líquido que se pueda obtener de un paciente, que contiene cantidades detectables de proteína ANGPTL8, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, se medirán los niveles de ANGPTL8 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad de ANGPTL8 anómalos) para establecer un nivel inicial o estándar de ANGPTL8. Este nivel inicial de ANGPTL8 puede compararse, a continuación, con los niveles de ANGPTL8 medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen una enfermedad o afección relacionada con ANGPTL8 o síntomas asociados con dicha enfermedad o afección.
Ejemplos
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-ANGPTL8
Los anticuerpos anti-ANGPTL8 se obtuvieron mediante la inmunizacion de un ratón VELOCIMMUNE® (es decir, un ratón genomanipulado que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno que comprende una ANGPTL8 humana recombinante expresado con un marcador de IgG2a de ratón carboxiterminal (véase la SEQ ID NO: 340). La respuesta inmunitaria de anticuerpo se controló mediante un inmunoensayo específico de ANGPTL8. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se generaron varios anticuerpos anti-ANGPTL8 completamente humanos a partir de linfocitos B positivos al antígeno como se describe en el documento US 2007/0280945A1.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-ANGPTL8 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de región variable de cadena pesada y ligera La tabla 1 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-ANGPTL8 seleccionados de la divulgación. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se exponen en la tabla 2.
Tabla 1: Identificadores de secuencia de aminoácidos
Figure imgf000027_0001
Tabla 2: Identificadores de secuencia de ácido nucleico
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continuación
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Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H1H", "HIM", "H2M", "H4H", etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "15321", "15341", "15350", etc.), seguido de un sufijo "P" o "N", como se muestra en las tablas 1 y 2. Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H4H15321P", etc. Los prefijos H4H en las denominaciones de los anticuerpos utilizados en el presente documento indican el isotipo de la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, y un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas, como se indica con la primera "H" en la denominación del anticuerpo). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón se puede convertir en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en las tablas 1 y 2, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.
Ejemplo 3: Determinación de las constantes de velocidad de disociación (k ü ) por resonancia de plasmón de superficie (SPR) para los anticuerpos anti-ANGPTL8 que se unen a los péptidos ANGPTL8, ANGPTL3 y ANGPTL4
Previamente se demostró que los anticuerpos se unen a la región de superhélice aminoterminal de ANGPTL3 [Documento WO 2012/174178 A1; Lee et al. (2009) JBC, 284:13735-13745] y ANGPTL4 [Desai et al. (2007) PNAS, 104:11766-11771] bloqueaban la actividad inhibidora de LPL de las proteínas ANGPTL. En este experimento, se probaron anticuerpos contra ANGPTL8 para determinar su unión a un péptido de la región aminoterminal de ANGPTL8.
Las constantes de velocidad de disociación para los anticuerpos anti-ANGPTL8 que se unen al péptido ANGPTL8 humano (péptido hANGPTL8, SEQ ID NO: 337) se determinaron utilizando una plataforma de biosensores MASS-1 basada en resonancia de plasmón de superficie en tiempo real. El ensayo utilizó un formato donde se capturaron anticuerpos anti-ANGPTL8 en la superficie del sensor y se inyectaron péptidos sobre la superficie del anticuerpo. También se incluyeron como controles péptidos de la región de superhélice aminoterminal de ANGPTL3 humano (péptido hANGPTL3, SEQ ID NO: 338) y ANGPTL4 humano (péptido hANGPTL4, SEQ ID NO: 339). También se incluyó un anticuerpo de control (H4H268P del documento US2011/0159015A1) que se une al péptido ANGPTL4 y un anticuerpo de control de isotipo negativo. Todos los estudios de unión se realizaron en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 (tampón de ejecución HBS-ET) al 0,05 % v/v a 25 °C. La superficie del sensor de HCA se derivatizó mediante acoplamiento de amina a un anticuerpo anti-Fc humano monoclonal de ratón (GE, n.° BR-1008-39), y en esta superficie se capturaron aproximadamente 1000 UR de cada anticuerpo anti-ANGPTL8 o de control. Las soluciones madre de péptidos se diluyeron en tampón de ejecución HBS-ET a 500 nM y se inyectaron sobre las superficies capturadas con anticuerpos durante 4 minutos a una velocidad de flujo de 30 pl/minuto seguido de la disociación del péptido unido en tampón de ejecución HBS-ET durante 10 minutos.
La fase de asociación de los péptidos que se unen a los anticuerpos anti-ANGPTL8 capturados no pudo ajustarse a un modelo de unión 1:1; por lo tanto, solo los valores de la constante de la velocidad de disociación (kd) se calcularon mediante el ajuste de los sensogramas de unión en tiempo real utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de kd como:
Id{2 )
VA (m in ) =
6Q»lcd
Los parámetros de unión para los péptidos de la región aminoterminal de ANGPTL8, ANGPTL3 y ANGPTL4 que se unen a los anticuerpos ANGPTL8 capturados, el anticuerpo de control ANGPTL4 y el anticuerpo de control de isotipo se muestran en las tablas 3 a 5.
Resultados:
En estas condiciones experimentales, la señal de unión no específica máxima presentada por 500 nM de los péptidos hANGPTL8, hANGPTL3 o hANGPTL4 a la superficie anti-hFc en blanco fue de 3 UR. Por eso, las interacciones de unión con señales que estaban tres veces por encima del fondo no específico de 3 UR (es decir, >9 UR) se consideraron interacciones de unión específicas. Basado en este criterio, las señales de unión de péptido-anticuerpo de menos de 9 UR se consideraron no vinculantes (NV en la tabla 1).
A partir de este estudio de unión se demostró que los anticuerpos anti-ANGPTL8 H4H15321P, H4H15367P2 y H4H15345P se unen específicamente al péptido ANGPTL8 de la región aminoterminal (SEQ ID NO: 337). Ninguno de los anticuerpos anti-ANGPTL8 se unió a los péptidos de la región aminoterminal de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 338) o hANGPTL4 (SEQ ID NO: 339).
T l : ni n l ni r m n l n l ni-AN PTL l i hAN PTL 2 °
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continuación
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T l 4: ni n l ni r m n l n l ni-AN PTL l i m i hAN PTL 2 °
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T l : ni n^ l ni r m n l n l ni-AN PTL l i hAn PTL4 2 °
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continuación
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Ejemplo 4: Determinación de los parámetros de unión cinéticos para la unión de H4H15341P a proteínas ANGPTL8 humanas y de mono de longitud completa mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR)
La constante de disociación de equilibrio (Kd) para la unión del anticuerpo anti-ANGPTL8 H4H15341P a proteínas ANGPTL8 humanas y de macaco cangrejero de longitud completa se determinó utilizando una plataforma de biosensores MASS-1 basada en resonancia de plasmón de superficie en tiempo real. Para el ensayo, se inyectó H4H15341P sobre superficies de sensores en las que se inmovilizaron proteínas ANGPTL8 humanas o de mono. Todos los estudios de unión se realizaron en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 (tampón de ejecución HBS-ET) al 0,05 % v/v a 25 °C. La superficie del sensor de HCA se derivatizó primero mediante el acoplamiento con aminas de un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG2a de ratón (Southern Biotech, n.° 1080-01) en el que se capturaron, a continuación, aproximadamente 30 UR (unidades de unión) de ANGPTL8 humano expresado con el marcador Fc de IgG2a de ratón aminoterminal (hANGPTL8-mFc; SEQ ID NO: 340) o ANGPTL8 de mono expresado con el marcador Fc de IgG2a de ratón carboxiterminal (MfANGPTL8-mFc; SEQ ID NO: 341). Primero se prepararon diferentes concentraciones de AcM ANGPTL8 en tampón de ejecución HBS-ET (300 nM a 1,23 nM; dilución en serie 3 veces) y luego se inyectó sobre las superficies capturadas con ANGPTL8-mFc durante 4 minutos a un caudal de 30 pl/minuto seguido de la disociación del AcM unido en tampón de ejecución HBS-ET durante 10 minutos.
Las constantes de velocidad cinéticas de asociación (ka) y disociación (ko) se determinaron mediante el ajuste de los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas ( t / ) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como:
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Los parámetros cinéticos de unión para la unión del AcM anti-ANGPTL8 a hANGPTL8-mFc y MfANGPTL8-mFc a 25 °C se muestran en la tabla 6.
Resultados:
El anticuerpo H4H15341 se unió a proteínas ANGPTL8 tanto humanas como de mono inmovilizadas en la superficie del sensor y no presentó una disociación medible durante la fase de disociación registrada. Para obtener una estimación de la afinidad de unión, la constante de velocidad de disociación, kd, se fijó en el límite de detección superior en las condiciones experimentales, 1,0 * 10-51/s. Los valores de la constante de disociación de equilibrio (Kd) de unión de H4H15341P a hANGPTL8-mFc y MfANGPTL8- mFc se estimaron en 117 pM y 86 pM o menos, respectivamente.
Tabla 6: Parámetros cinéticos de unión de la unión de^ H4H15341P a hANGPTL8-mFc MfANGPTL8-mFc a 25 °C.
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Ejemplo 5: Determinación de la especificidad de unión de ANGPTL8 humana y de mono mediante interferometría de biocapa (BLI)
La unión de anticuerpos ANGPTL8 a proteínas ANGPTL8 humanas y de mono se investigó utilizando interferometría de biocapa con una plataforma de biosensor Octet HTX (ForteBio, una división de Pall Life Sciences). Todos los experimentos se realizaron a 25 °C en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v y BSA 1 mg/ml con la placa de reacción de pocillos múltiples agitada a 1000 rpm. Aproximadamente 1,6 nm de ANGPTL8 humana producida con un marcador Fc de IgG2a de ratón carboxiterminal (hANGPTL8-mFc; SEQ ID NO: 340) o ANGPTL8 de macaco cangrejero producida con un marcador Fc de IgG2a de ratón carboxiterminal (MfANGPTL8-mFc; SEQ ID NO: 341) se capturó en biosensores Octet anti-mFc (AMC) sumergiendo los sensores en pocillos que contenían 10 pg/ml de cada proteína durante 4 minutos. En las mismas condiciones, también se acopló al sensor AMC una proteína de control negativo con el mismo marcador mFc (hLDLR-mFc). Los cuatro sensores, tres acoplados a proteínas y uno en blanco, se sumergieron a continuación en pocillos que contenían 100 nM de diferentes anticuerpos monoclonales ANGPTL8 o un control de isotipo durante 4 minutos. Las señales de unión observadas después de la etapa de unión de 4 minutos se tabulan en la tabla 7.
Resultados:
Entre los 25 AcM ANGPTL8 probados en este estudio, 24 anticuerpos mostraron señales de unión más elevadas que las señales de unión máximas en las puntas de los sensores de control no pertinente (0,03 nm; este valor se usó para calcular las señales de unión como veces por encima del fondo). Entre los 24 aglutinantes de ANGPTL8 humana, 20 mostraron unión positiva sobre la proteína ANGPTL8 de mono. Los 4 anticuerpos que no se unieron a la proteína ANGPTL8 de mono también mostraron una señal de unión baja en la proteína a Ng p TL8 humana con valores entre 1 y 2 veces por encima de la señal de unión de fondo. Para los 24 anticuerpos que se unen a la proteína ANGPTL8 humana, 4 anticuerpos (H4H15362P2, H4H15321P, H4H15330P, H4H15367P2) mostraron señales de unión de 10 veces por encima del fondo. Otro grupo de 12 anticuerpos mostró señales de unión entre 5 y 10 veces por encima del fondo. Los anticuerpos restantes se unieron a la proteína ANGPTL8 humana con señales de unión que estaban entre 1 y 5 veces por encima del nivel de fondo.
Tabla 7: Especificidad de unión de anticuerpos monoclonales ANGPTL8 100 nM a ANGPTL8-mFc humano y de mono ca turados en biosensores Octet
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continuación
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 6: Efecto in vivo de los anticuerpos IgG4 anti-hANGPTL8 sobre los niveles de triglicéridos circulantes en ratones ANGPTL8 humanizados
El efecto de los anticuerpos anti-hANGPTL8 sobre los niveles de triglicéridos (TG) en suero se determinó en ratones ANGPTL8 humanizados. A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de cinco ratones cada uno para cada anticuerpo probado. Los anticuerpos se administraron a una dosis de 10 mg/kg (anti-hANGPTL8 y control de isotipo emparejado (hlgG4) con especificidad no pertinente) mediante inyección subcutánea el día 0 del estudio. Se extrajo sangre de los ratones (sin ayunar) en días consecutivos después de las inyecciones de anticuerpos y se determinaron los niveles de TG en suero mediante ADVIA® 1800 Serum Chemistry Analyzer (Siemens). Se calcularon los promedios para cada uno de los puntos temporales para cada anticuerpo probado. Los resultados, expresados como (media ± EEM) de la concentración de TG en suero, se muestran en las tablas 8 a 13.
Los niveles de anti-hANGPTL8 circulante (Ac en suero) también se determinaron utilizando un ensayo ELISA convencional. En resumen, las placas se revistieron con un anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Sigma-Aldrich) para capturar el Ac en suero. A continuación se añadió suero a las placas y se detectaron los anticuerpos capturados por quimioluminiscencia usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (media ± EEM) se muestran en las tablas 14 a 19. Control: Ratones que recibieron un Ac de control de isotipo emparejado
Resultados:
El efecto de 25 AcM para hANGPTL8 sobre los niveles de TG circulantes se probó en ratones ANGPTL8 humanizados. El anticuerpo H4H15341P condujo a una reducción significativa de los TG circulantes (hasta un promedio del 68 %) después de la administración (en comparación con el AcM de control).
Tabla 8. Estudio 1 tri licéridos en suero m /dl
Figure imgf000033_0002
Tabla 9. Estudio 2 tri licéridos en suero m /dl
Figure imgf000034_0001
Tabla 9 continuación
Figure imgf000034_0002
Tabla 10. Estudio 3 tri licéridos en suero m /dl
Figure imgf000034_0003
Tabla 11. Estudio 4 tri licéridos en suero m /dl
Figure imgf000034_0004
Tabla 12. Estudio 5 tri licéridos en suero m /dl
Figure imgf000034_0005
Tabla 12 continuación
Figure imgf000034_0006
Tabla 13. Estudio 6 tri licéridos en suero m /dl
Figure imgf000035_0001
Tabla 14. Estudio 1 Ac en suero /m l
Figure imgf000035_0002
Tabla 15. Estudio 2 Ac en suero /m l
Figure imgf000035_0003
Tabla 15 continuación
Figure imgf000035_0004
Tabla 16. Estudio 3 Ac en suero /m l
Figure imgf000035_0005
Tabla 17. Estudio 4 Ac en suero /m l
Figure imgf000035_0006
Tabla 18. Estudio 5 Ac en suero /m l
Figure imgf000035_0007
Tabla 18 continuación
Figure imgf000036_0001
Tabla 19. Estudio 6 Ac en suero /ml
Figure imgf000036_0002
Ejemplo 7: Respuesta a la dosis del anticuerpo H4H15341P anti-hANGPTL8 en ratones ANGPTL8 humanizados
Los efectos de diferentes dosis de AcM anti-hANGPTL8, H4H15341P, sobre triglicéridos (TG) en suero se evaluaron en ratones ANGPTL8 humanizados. A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de cinco ratones cada uno para cada dosis probada. Se administró H4H15341P a 1, 5, 10 y 25 mg/kg y control de isotipo emparejado (hlgG4) con especificidad no pertinente a 10 mg/kg mediante inyección subcutánea de dosis única el día 0 del estudio. Se extrajo sangre de los ratones (sin ayuno) los días 2, 7, 14 y 21 después de la inyección de anticuerpos y se determinaron los niveles de TG en suero mediante ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Se calcularon los promedios para cada punto temporal. Los resultados, expresados como (media ± EEM) de la concentración de TG en suero, se muestran en la figura 1.
Los niveles de anticuerpos anti-humanos circulantes (Ac en suero) se determinaron utilizando un ensayo ELISA estándar. En resumen, las placas se revistieron con un anticuerpo de cabra anti-Fc humano (Sigma-Aldrich) para capturar el Ac en suero. A continuación se añadió suero a las placas y se detectaron los anticuerpos capturados por quimioluminiscencia usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (media ± EEM) se muestran en la figura 2. El Ac de control se refiere a ratones que recibieron un Ac de control de isotipo emparejado.
Resultados:
Se probó el efecto de 4 dosis diferentes de H4H15341P (anti-hANGPTL8) sobre los niveles de colesterol y TG circulantes en ratones ANGPTL8 humanizados. H4H15341P condujo a una reducción significativa sostenida dependiente de la dosis en los TG en suero (hasta un promedio del 66 %, en comparación con el AcM de control), siendo 5 mg/kg la dosis eficaz más baja. No se observó ningún efecto sobre los niveles de colesterol total.
Ejemplo 8. Evaluación de la actividad de la lipoproteína lipasa (LPL) después del tratamiento con AcM antihANGPTL8 en ratones ANGPTL8 humanizados
Se evaluó el efecto de la administración de AcM anti-hANGPTL8 (H4H15341P) sobre la actividad de LPL en ratones ANGPTL8 humanizados. A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de cinco ratones cada uno para cada AcM probado. Se administraron Ac H4H15341P y de control a 10 mg/kg mediante inyección subcutánea de dosis única el día 0 del estudio. En el día 4 del estudio, a los ratones se les administró heparina mediante inyección intravenosa a través de la vena de la cola a 250 U/kg que libera LPL de las superficies endoteliales vasculares. Cinco minutos más tarde se extrajo sangre de los ratones del seno retrorbitario y se recogió y se fraccionó el plasma posheparina para separar la LPL de la lipasa hepática utilizando cromatografía en heparina-Sepharose. Se cargó el plasma posheparina en columnas de 1,0 ml de heparina-Sepharose HiTrap (GE Healthcare) controladas por GE Akta Prime, equilibradas con NaCl 0,25 M, glicerol al 20 %, BSA al 1 %, fosfato de sodio 10 mM, a pH 6,5. La columna se lavó con 10 ml del tampón de equilibrio y se eluyó con un gradiente de NaCl de 30 ml (0,25 a 1,5 M en glicerol al 20 %, BSA al 1 %, fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5). Las fracciones resultantes se combinaron mediante máximos de lipasa hepática y LPL y se probaron las actividades de lipasa utilizando sustrato de lipasa Invitrogen Enzchek (n.° de cat. E33955). La reacción cinética se leyó en el lector de placas Molecular Devices SpectraMax i3 a 482 nm de excitación/518 nm de emisión. Los resultados, expresados como unidades relativas de fluorescencia (URF) (media ± EEM) se muestran en la figura 3. El Ac de control se refiere a ratones que recibieron un Ac de control de isotipo emparejado negativo.
Resultados
Los resultados mostraron que la administración de H4H15341P (anti-hANGPTL8) a ratones ANGPTL8 humanizados conduce a un aumento significativo de la actividad de LPL y no tiene ningún efecto sobre la actividad de la lipasa hepática.
Ejemplo 9. Prueba de tolerancia a lípidos en ratones ANGPTL8 humanizados tratados con AcM H4H15341P anti-hANGPTL8
El efecto de la inhibición de ANGPTL8 con el AcM H4H15341P sobre el aclaramiento de triglicéridos se evaluó mediante una carga de grasa aguda. Previamente se extrajo sangre a los ratones ANGPTL8 humanizados 8 días antes del experimento y se pusieron en grupos de 6 ratones cada uno para cada AcM probado. Se administraron Ac H4H15341P y de control de isotipo emparejado a 10 mg/kg mediante inyección subcutánea de dosis única el día 0 del estudio. El día 4 del estudio, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas después de la administración intravenosa de Intralipid al 20 % (Baxter Healthcare, IL) a 2,5 pl/g de peso corporal. El nivel de TG se evaluó en sangre extraída de la vena de la cola en puntos temporales posteriores. Los resultados, expresados como (media ± EEM) de la concentración de TG se muestran en la figura 4. El Ac de control se refiere a ratones que recibieron un Ac de control de isotipo emparejado negativo.
Resultados
La administración de H4H15341P (anti-hANGPTL8) a ratones ANGPTL8 humanizados conduce a un nivel de TG significativamente más bajo después de una carga de grasa aguda en comparación con el anticuerpo de control. Estos datos sugieren que H4H15341P, mediante el bloqueo de ANGPTL8, promueve el aclaramiento acelerado de TG de la circulación.
Ejemplo 10. Mapeo de epítopos lineales HiSense para la proteína similar a la angiopoyetina 8
Se empleó el análisis de Pepscan utilizando péptidos lineales HiSense para establecer epítopos lineales para los anticuerpos H4H15341P y H4H15367P2. El estudio se realizó en Pepscan Presto BV, (Zuidersluisweg 2, 8243RC Lelystad, Países Bajos). Todos los datos de Pepscan se almacenan en el paquete del programa informático Peplab™, una aplicación de base de datos patentada desarrollada internamente y construida sobre un sistema administrativo de almacenamiento PostgreSQL.
SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
Para reconstruir epítopos de la molécula diana, se sintetizó una biblioteca de péptidos. Se obtuvo un soporte de polipropileno funcionalizado con amino mediante injerto con una formulación de polímero hidrófilo patentado, seguido de reacción con t-butiloxicarbonil-hexametilendiamina (BocHMDA) utilizando diciclohexilcarbodiimida (DCC) con Nhidroxibenzotriazol (HOBt) y posterior escisión de los grupos Boc utilizando ácido trifluoroacético (TFA). La síntesis estándar de péptidos Fmoc se utilizó para sintetizar péptidos en el soporte sólido funcionalizado con amino mediante estaciones de manipulación de líquidos JANUS modificadas a medida (Perkin Elmer).
ACOPLAMIENTO DE LA PROTEÍNA SIMILAR A LA ANGIOPOYETINA 8 EN LA MATRIZ
La proteína diana se acopló en la miniplaca como control positivo. Para acoplar la proteína similar a la angiopoyetina 8 (hANGPTL8-mFc) en las matrices, Se utilizaron dos agentes de reticulación: éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) y glutaraldehído (GDA). Para MBS, se mezclaron 40 pl de hANGPTL8-mFc con 1 pl de MBS (2 mg/ml), se incubó durante 45 min a temperatura ambiente y después se aplicó sobre la matriz en posiciones que contenían el motivo enlazador CGGCGG (SEQ ID NO: 346). Para la unión de GDA, se aplicó GDA al 0,05 % en tampón fosfato (pH 5,0) a la matriz, se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas, a continuación, se añadió a la matriz hANGPTL8-mFc a una concentración de 5 o 20 pg/ml en tampón fosfato pH 8,0 en las posiciones que contenían solo Gly para permitir el acoplamiento al extremo N libre.
SELECCIÓN MEDIANTE ELISA
La unión de anticuerpo a cada uno de los péptidos sintetizados se probó en un ELISA basado en PEPSCAN. Las matrices de péptidos se incubaron con solución de anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C). Después del lavado, las matrices de péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 de un conjugado de peroxidasa de anticuerpo adecuado (conjugado de h Rp antihumano de cabra, Southern Biotech, n.° de catálogo 2010-05) durante una hora a 25 °C. Después del lavado, se añadieron el sustrato de peroxidasa 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) y 20 pl/ml de H2O2 al 3 por ciento. Después de una hora, se midió el desarrollo del color. El desarrollo del color se cuantificó con un dispositivo de carga acoplada (CCD, del inglés 'charge coupled device') - una cámara y un sistema de procesamiento de imágenes.
DETALLES DE LA SELECCIÓN
La unión del anticuerpo depende de una combinación de factores, incluyendo la concentración del anticuerpo y las cantidades y naturaleza de las proteínas competidoras en el tampón ELISA. Además, las condiciones de prerrevestimiento (el tratamiento específico de las matrices de péptidos antes de la incubación con la muestra experimental) afectan a la unión. Estos detalles se resumen a continuación:
________ Marcador__________ Dilución Tampón de muestra Precondicionamiento H4H15341P 1 |jg/ml SQ al 100 % SQ al 100 %
H4H15367P2 1 jg/m l SQ al 100%
Figure imgf000038_0001
100 %
Control de isotipo negativo 1 jg/m l SQ al 100 %
Figure imgf000038_0002
100 %
Para el tampón Pepscan y el preacondicionamiento (SQ), los números indican la cantidad relativa de proteína competidora (una combinación de suero de caballo y ovoalbúmina).
PROCESAMIENTO DE DATOS
Los valores obtenidos de la cámara de CCD varían de 0 a 3000 mUA, similar a un lector ELISA de placa de 96 pocillos estándar. Los resultados se cuantifican y almacenan en la base de datos de Peplab. Ocasionalmente, un pocillo contiene una burbuja de aire que da como resultado un valor falso positivo, las placas se inspeccionan manualmente y cualquier valor causado por una burbuja de aire se puntúa como 0.
CONTROL DE CALIDAD DE SÍNTESIS
Para verificar la calidad de los péptidos sintetizados, se sintetizó en paralelo un conjunto separado de péptidos de control positivo y negativo. Estos se seleccionaron con el anticuerpo 57.9 (Posthumus, et al. 1990 J Virol 64:3304-3309).
Resultados
DISEÑO DE PÉPTIDOS
Los siguientes conjuntos de péptidos se sintetizaron en la secuencia diana:
ANGPTL8 humano, secuencia madura, aminoácidos 22 a 198 de NP_061157.3 1 APMGGPELAQ HEELTLLFHG TLQLGQALNG VYRTTEGRLT KARNSLGLYG 50 51 RTIELLGQEV SRGRDAAQEL RASLLETQME EDILQLQAEA TAEVLGEVAQ 100 101 AQKVLRDSVQ RLEVQLRSAW LGPAYREFEV LKAHADKQSH ILWALTGHVQ 150 151 RQRREMVAQQ HRLRQIQERL HTAALPA 177 (SEQ ID NO: 347)
Los anticuerpos se probaron para unirse a una serie de péptidos de 15 mer que cubren la secuencia completa de ANGPTL8, cada péptido compensado por un aminoácido del siguiente. También se incluyeron sustituciones de doble alanina ("AA") dentro de la serie de péptidos probados para un análisis de epítopo más fino.
CONJUNTO 1. mimético: lineal. Tipo: LIN Descripción Péptidos de longitud 15 procedentes de la secuencia diana de la proteína similar a la angiopoyetina 8 con un desplazamiento de un resto.
Secuencias (primeras 10)
APMGGPELAQHEELT (SEQ ID NO: 348)
PMGGPELAQHEELTL (SEQ ID NO: 349)
MGGPELAQHEELTLL (SEQ ID NO: 350)
GGPELAQHEELTLLF (SEQ ID NO: 351)
GPELAQHEELTLLFH (SEQ ID NO: 352)
PELAQHEELTLLFHG (SEQ ID NO: 353)
ELAQHEELTLLFHGT (SEQ ID NO: 354)
LAQHEELTLLFHGTL (SEQ ID NO: 355)
AQHEELTLLFHGTLQ (SEQ ID NO: 356)
QHEELTLLFHGTLQL (SEQ ID NO: 357)
CONJUNTO 2. mimético: lineal. Tipo: LIN.AA
Descripción Péptidos del conjunto 1, pero con restos en las posiciones 10 y 11 reemplazados por Ala. Cuando ocurriera un Ala nativo en cualquier posición, se reemplaza por Gly. El orden de los péptidos en este conjunto fue aleatorio. Se muestra el orden real en la matriz.
Secuencias (primeras 10)
TAEVLGEVAAGQKVL (SEQ ID NO: 358)
VYRTTEGRLAAARNS (SEQ ID NO: 359)
GVYRTTEGRAAKARN (SEQ ID NO: 360)
VQRLEVQLRAGWLGP (SEQ ID NO: 361)
LTGHVQRQRAAMVAQ (SEQ ID NO: 362)
VLKAHADKQAAILWA (SEQ ID NO: 363)
LRDSVQRLEAALRSA (SEQ ID NO: 364)
RREMVAQQHAARQIQ (SEQ ID NO: 365)
VSRGRDAAQAARASL (SEQ ID NO: 366)
AYREFEVLKGAADKQ (SEQ ID NO: 367)
Los resultados de ELISA sin procesar de la selección se proporcionaron y se trazaron (diagrama de caja, datos no mostrados) para representar cada conjunto de datos e indicar la señal de ELISA promedio, la distribución y los valores atípicos dentro de cada conjunto de datos. Dependiendo de las condiciones del experimento (cantidad de anticuerpo, fuerza de bloqueo, etc.), se obtuvieron diferentes distribuciones de datos de ELISA.
ANTICUERPO H4H15367P2
Cuando se probaron en condiciones de rigor alto, el anticuerpo H4H15367P2 se unió con avidez sólo a un péptido lineal compuesto por la secuencia 1APMGGPELAQHEELT15 (SEQ ID NO: 348). Esta muestra se probó dos veces en las mismas condiciones y arrojó repetidamente el mismo resultado. El anticuerpo H4H15367P2 también se unió fuertemente a la proteína similar a la angiopoyetina 8, que se acopló a la matriz como control positivo. Curiosamente, se obtuvo una unión algo más débil con la proteína diana acoplada utilizando MBS en comparación con el acoplamiento GDA.
ANTICUERPO H4H15341P
Cuando se probaron en condiciones de rigor alto, El anticuerpo H4H15341P se unió con avidez a una serie de péptidos lineales, que contenían una secuencia común 150QRQRREMVAQ159 (SEQ ID NO: 368). La comparación de los perfiles de intensidad registrados en el conjunto 1 (miméticos del epítopo lineal nativo) y en el conjunto 2 (mutantes con doble Ala) indica que los restos R154, E155 y Q159 son esenciales para la unión de anticuerpos. El anticuerpo H4H15341P también se unió fuertemente a la proteína similar a la angiopoyetina 8, que se acopló a la matriz como control positivo, independientemente de la inmovilización.
CONTROL DE ISOTIPO NEGATIVO
El control de isotipo negativo no se unió a ningún péptido presente en la matriz. Además, no se registró unión detectable con la proteína similar a la angiopoyetina 8, que se acopló a la matriz como control positivo. El control de isotipo negativo se probó adicionalmente con un conjugado secundario de cabra antihumano utilizado en ELISA de Pepscan. El anticuerpo se puede reconocer mediante este secundario.
Conclusión
Se probaron tres anticuerpos proporcionados para este estudio en matrices de péptidos HiSense. Fue posible establecer epítopos lineales tentativos para dos anticuerpos. A pesar de las repetidas incubaciones, el control de isotipo negativo del anticuerpo no se unió a la matriz. Los epítopos tentativos centrales identificados en este estudio se enumeran a continuación:

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-proteína similar a la angiopoyetina 8 (ANGPTL8) o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un par de secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 162/170.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo IgG1 o IgG4.
3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en la reivindicación 1.
4. Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 o una célula hospedadora que comprende el vector.
5. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 4 en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento y la recuperación del anticuerpo o fragmento así producido.
6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, o el anticuerpo de la reivindicación 2, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
7. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, un anticuerpo de la reivindicación 2, o la composición farmacéutica de la reivindicación 6, para utilizar en un método para tratar una afección o enfermedad asociada con, o caracterizado en parte por niveles elevados de triglicéridos en sangre, o al menos un síntoma o complicación asociada con la afección o enfermedad, comprendiendo el método administrar el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o composición farmacéutica a un paciente que lo necesite, de manera que los niveles de triglicéridos en sangre disminuyan o que la afección o enfermedad sea mediada, o que el al menos un síntoma o complicación asociada con la afección o enfermedad se alivie o reduzca en frecuencia o intensidad, en donde la afección o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia, dislipidemia tal como dislipidemia aterogénica, dislipidemia diabética o dislipidemia mixta, hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia grave con TG >1000 mg/dl y pancreatitis aguda asociada, hipercolesterolemia, quilomicronemia, obesidad, síndrome metabólico, diabetes, lipodistrofia, lipoatrofia resultante o causada por ApoC2 alterada, deficiencia de ApoE, esteatohepatitis no alcohólica o, dislipidemia inducida por el tratamiento con glucocorticoides.
8. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o composición farmacéutica para utilizar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la afección o enfermedad es una enfermedad o trastorno cardiovascular seleccionado del grupo que consiste en aterosclerosis, aneurisma, hipertensión, angina de pecho, ictus, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardíaca congestiva, arteriopatías coronarias, infarto de miocardio y enfermedades vasculares periféricas.
9. La composición farmacéutica para utilizar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la composición farmacéutica se administra al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico.
10. La composición farmacéutica para utilizar de acuerdo con la reivindicación 9, en donde:
(a) el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: niacina; fibratos; 22-hidroxicolesterol; ezetimiba más simvastatina; una estatina con colestiramina, colestipol o colesevelam; niacina más una estatina tal como niacina con lovastatina; ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3; cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina y pravastatina;
(b) el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína similar a la angiopoyetina 3 (ANGPTL3), la proteína similar a la angiopoyetina 4 (ANGPTL4), la proteína similar a la angiopoyetina 5 (ANGPTL5), la proteína similar a la angiopoyetina 6 (ANGPTL6) y la proproteína convertasa humana subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9 ); o
(c) el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en insulina, metformina, gliburida, glipizida, pioglitazona, rosiglitazona, acarbosa, voglibosa, exenatida, dulaglutida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, saxagliptina, sitaliptina, vildagliptina, canagliflozina, dapagliflozina, empagliflozina, ipragliflozina, tofogliflozina, pramlintida, Lispro, Aspart, Glulisina de acción rápida e insulina Detemir, insulina Degludec, insulina Glargina de acción prolongada, torcetrapib, anacetrapib, dalcetrapib, evacetrapib o aminoguanidina.
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