ES2865285T3 - Activador de autofagia de algas - Google Patents

Abstract

Extracto de Gladieria sulphuraria, que comprende un activador de autofagia y/o un agente ligante del hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes del hierro, en el que el extracto contiene residuos celulares.

Description

DESCRIPCIÓN

Activador de autofagia de algas

La presente invención se refiere a extractos de microalgas, particularmente a extractos de Galdieria sp., a su preparación y a su utilización en cosméticos, particularmente para el uso tópico en el cuidado de la piel y el cabello. La invención se refiere además a un activador de autofagia y a una actividad de ligado de hierro de Galdieria sp. En particular, la invención se refiere a usos de dichos extractos, el activador de autofagia y/o la actividad de ligado de hierro para la mejora de la apariencia de la piel relacionada con la edad, o para el tratamiento cosmético y la prevención del envejecimiento de la piel, tal como el fotoenvejecimiento de la piel.

Antecedentes de la invención

La edad media de la población está creciendo constantemente, por lo que los síntomas del envejecimiento influirán sobre nuestra vida diaria cada vez más. Actualmente se está debatiendo si el término envejecimiento podría considerarse una enfermedad (Bulterijs et al., 2015). Se han propuesto diferentes rutas biológicas moleculares relacionadas con el envejecimiento y teorías sobre el mismo. López-Otin et al. (2003) resumen las características típicas del envejecimiento comúnmente aceptadas: inestabilidad genómica, desgaste de los telómeros, alteraciones epigenéticas, pérdida de la proteostasis, detección desregulada de los nutrientes, disfunción mitocondrial, senescencia celular, agotamiento de las células madre y alteraciones en la comunicación intercelular.

Envejecimiento lisosómico

La teoría del envejecimiento lisosómico se basa en la idea de una renovación constante, que resulta alterada por el mal funcionamiento de la unidad de regeneración endosómica/lisosómica (Brunk y Terman, 2002; Cuervo y Dice, 2000). Durante el envejecimiento celular, se incrementa constantemente la cantidad total de hierro. El incremento del hierro total también depende de la actividad metabólica de la célula debido a que se proporciona oxígeno mediante la hemoglobina, que contiene hierro como el aceptor de oxígeno. A mayor actividad metabólica, se requieren más conductos de salida y, en consecuencia, se suministra más hierro a la célula. Sólo un número limitado de células son capaces de transportar el hierro al exterior de la célula activamente con ayuda de la ferroportina. Son ejemplos de dichas células, los hepatocitos, los macrófagos, los enterocitos y los adipocitos.

El lisosoma es un orgánulo que se origina en el aparato de Golgi y que fue encontrado por primera vez de manera casual por Christian de Duve a principios de los años 1950. En un estado prematuro se denominan endosomas tempranos. En este estado, el pH interno ya se ha reducido a 6. Durante la maduración, los enzimas de la degradación, p.ej., lipasas e hidrolasas, se vuelven más activas y el pH finalmente se reduce a 4,5-5, debido a la bomba de H+ controlada por el ATP. Determinadas publicaciones indican que existen diferentes tipos de lisosoma. La especialización se caracteriza por el tamaño y la función. Además de la renovación y reciclado celulares, la función de los lisosomas también está asociada al estado energético y la longevidad relativa de la célula, la comunicación entre células y la reparación de los daños membranales (Settembre et al., 2013; Xu yd Ren, 2015). Rupar et al. (1992) encontraron que el contenido específico de alfa-tocoferol en lisosomas hepáticos de rata es 37 veces más elevado que en otras membranas celulares.

Por lo tanto, el mantenimiento y protección de la actividad lisosómica se considera que presta soporte a las funciones correctas de estos procesos y podría retrasar sustancialmente el envejecimiento celular mediante la mejora de la cantidad o la calidad de moléculas básicas, p.ej., colágeno, elastina, colesterol, ceramidas y esfingolípidos.

Basándose en investigación anterior, se cree que el incremento de las especies de oxígeno reactivo (EOR) en los lisosomas conduce a autofagosomas defectuosos (Brunk yTerman, 2002; Kurz et al., 2011). Este proceso depende de la reacción de Fenton y, por lo tanto, es dependiente del hierro. A mayor concentración de hierro por lisosoma, mayor probabilidad de que se produzca una reacción de Fenton, que resulta en una permeabilización de la membrana circundante (Kurz et al., 2011). Sobre esta base, puede concluirse que resulta favorable para la célula individual regular su cantidad total de hierro en relación a su actividad metabólica. Sólo un número limitado de células son capaces de una exportación activa de hierro (Baird et al., 2006). Por lo tanto, la utilización de quelantes de hierro, p.ej., la desferrioxamina (DFO), bloquearán o reducirán la peroxidación de los lípidos y la permeabilización resultante, en el caso de que se hallen presentes durante la degradación lisosómica de las moléculas que contienen hierro como la ferritina (De Domenico et al., 2009; Kurz et al., 2011). Desafortunadamente, la DFO resulta retenida en los lisosomas y finalmente conduce a la muerte celular (Kurz et al., 2008).

La generación de lisosomas adicionales representa otra posibilidad para reducir el contenido de hierro por lisosoma. Finalmente, la quelación temporal y, por lo tanto, más leve, en el interior de los lisosomas reduce los daños asociados a EOR, mientras que no reduce la cantidad de H2O2 (Baird et al., 2006; De Domenico et al., 2009).

Fransen et al. (2012) afirman que no existe evidencia experimental que apoye la teoría planteada de que las mitocondrias son la fuente principal de EOR. Durante la diferenciación de los queratinocitos, se estima sustancial la contribución de los EOR generados en las mitocondrias únicamente en las células madre de la capa basal (Rinnerthaler et al., 2015). Por lo tanto, el proceso de la diferenciación, que requiere mucha energía, debe estar apoyado por otras fuentes. Los peroxisomas y los lisosomas podrían suministrar la energía necesaria y los bloques de construcción para el anabolismo de las macromoléculas, p.ej., involucrina, queratina, loricrina y profilagrina. Ferroptosis

La ferroptosis es una forma no apoptótica de muerte celular que es dependiente del hierro (Dixon et al., 2012). Recientemente, se ha mostrado que, durante la ferroptosis, la peroxidación de los lípidos se ve acompañada de producción letal de EOR, que podría evitarse mediante la utilización de quelantes del hierro, p.ej., deferoxamina (Xie et al., 2016). Adicionalmente, se ha encontrado una relación entre la autofagia y la ferroptosis (Hou et al., 2016). Autofagia

La autofagia desempeña una función importante en muchos procesos fisiológicos y patológicos. En ausencia de estrés, la autofagia sirve como una función de mantenimiento, que elimina orgánulos y componentes celulares dañados, evitando de esta manera efectos citotóxicos. Las reducciones y defectos de la autofagia se han implicado en múltiples enfermedades, por ejemplo enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Por otra parte, la relevancia de la autofagia como un mecanismo destoxificante, que puede estimular la salud y la longevidad, ha sido demostrada (Pernodet et al., 2014; Rubinsztein et al., 2011).

La proteína asociada a los microtúbulos 1A/1B-cadena ligera B (LC3B) es un marcador ampliamente aceptado de la autofagia. Pernodet et al. (2016) han encontrado una diferencia de 77,9% entre el nivel de LC3B en fibroblastos de donantes jóvenes y maduros, sugiriendo que LC3B también es un marcador de pérdidas funcionales relacionadas con la edad de la célula. Akinduro et al. (2016) han encontrado una fuerte relación entre WIPI-1 unido a autofagia y la expresión de LC3B en la epidermis durante la diferenciación.

El documento n° WO 2014/092859 da a conocer composiciones para la aplicación tópica en la piel que comprende un agonista de WIPI-1 y la utilización de dichas composiciones para proporcionar beneficios en la piel, en particular una mejora de la actividad de autofagia dentro de las células de la piel y, de esta manera, la mejora de la condición y la apariencia de piel cronológicamente envejecida o fotoenvejecida. Dicho agonista de WIPI-1 está contenido en, por ejemplo, extractos de Wacom triandra, una especie de planta con flor.

El documento n° WO 2010/063977 da a conocer la utilización cosmética de activadores de autofagia en células de la piel.

Actividad lisosómica en diferentes compartimientos de la piel

Estrato basal

El estrato basal hereda las células madre epidérmicas que proliferan permitiendo la regeneración de los queratinocitos en diferenciación. La función principal de los lisosomas en esta parte de la epidermis es la eliminación de residuos celulares tóxicos, p.ej., proteínas incorrectamente plegadas.

Estrato espinoso

En esta parte de la epidermis, se inicia la degradación de los orgánulos celulares, p.ej., el núcleo o las mitocondrias. Existen diferentes posibles efectos positivos. Debido a que, en primer lugar, la diferenciación adicional es un proceso de consumo de la energía, se requiere un suministro alternativo con la actividad mitocondrial decreciente. La degradación lisosómica es capaz de proporcionar acetil-CoA y glicerol-3-fosfato. A este nivel, las células todavía se están comunicando intercelularmente y sí que requieren endocitosis y exocitosis como mecanismo portador para las moléculas de señal, tal como la endocitosis de los melanosomas.

Estrato granuloso

Se ha subestimado el papel de los lisosomas en esta parte de la epidermis y no se encuentra bien descrita. Los presentes inventores han propuesto que, especialmente durante la diferenciación de los queratinocitos en corneocitos, los lisosomas desempeñan un papel importante. La función de barrera lipofílica, el pH epidérmico y el gradiente de Ca2+ resultan cruciales para una función física correcta y podrían verse influidos por la estabilidad de la membrana lisosómica (Raymond et al., 2008). Los lisosomas pueden acumular un gradiente de hasta 5.000 veces de Ca2+ entre la luz lisosómica y el citosol (Xu y Ren, 2015). La acumulación y el estado del gradiente de calcio sólo es explicable por un mecanismo de reciclado o de retención (Elias et al., 2002).

Estrato lúcido

El queratinocito diferenciado prácticamente por completo pasa el estrato lúcido, secretando simultáneamente las necesarias sustancias lipofílicas para mantener la barrera hidrofóbica. Las vesículas en las que se incorporan las sustancias lipofílicas se denominan cuerpos de Odland o lamelares. Recientemente se han considerado "orgánulos relacionados con lisosomas" debido a que se han encontrado proteínas luminales y relacionadas con la membrana, tales como LAMP1, dentro de estos orgánulos (Raymond et al., 2008).

Objeto de la invención

El documento n° WO 2013/023873 da a conocer extractos acuosos de Cyanidium caldarium (Rhodophyta, Cyanidales) que contienen ácido 4-aminobutírico (GABA) para aplicaciones cosméticas. Se ha informado de que Cyanidium caldarium sintetiza espermina y espermidina, que son capaces de incrementar la autofagia (Pietrocola et al., 2015). El documento n° WO 2014/043009 da a conocer una composición de cuidado de la piel para mejorar la catabolisis selectiva en células de superficies de queratina que comprenden un activador de autofagia celular y un activador del proteasoma celular. El documento n° WO2016/030643 da a conocer extractos de Arthrospira platensis enriquecidos en ficobiliproteínas, tales como ficocianina, y su utilización en composiciones cosméticas antiarrugas.

Bimonte et al. (2016) han encontrado que un extracto soluble en agua de Galdieria sulphuraria es capaz de inhibir la 5-a reductasa, induciendo la expresión de las p-defensinas, que representan el mecanismo de primera respuesta de defensa inducido por las células de la piel contra microbios no deseados, y estimulando el proceso de cicatrización de heridas en cultivos de células de la piel. Según los autores, sus resultados sugieren que el extracto de Galdieria presenta potencialidades interesantes como ingrediente activo en fórmulas cosméticas y dermatológicas, en particular las referidas a pieles aceitosas y seborreicas. Galdieria sp. también expresa espermidina (Seckbach, 1994).

Sin embargo, existe una necesidad de fuentes naturales adicionales de activadores de la defensa celular contra el daño en la piel, las fuentes de las cuales se encuentran fácilmente disponibles, que puedan procesarse a gran escala y resulten apropiados para fines cosméticos.

Descripción resumida de la invención

El objeto de la invención se consigue proporcionando Galdieria sp. y extractos de la misma que contienen actividades capaces de estimular la renovación lisosómica y la autofagia en queratinocitos.

En un aspecto, la invención proporciona un extracto de Galdieria sulphuraria, que comprende un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presentan propiedades ligantes de hierro.

En un aspecto, se proporciona una composición cosmética y/o no farmacéutica que comprende o que consiste en un extracto según la invención.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de preparación de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presentan propiedades ligantes de hierro, o un extracto o una composición, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo celular de Galdieria sp., preferentemente de Galdieria sulphuraria,

(b) recolectar las células cultivadas que se han proporcionado en la etapa (a),

(c) romper las células en cultivo recolectadas en la etapa (b), y

(d) obtener un extracto que comprende las células rotas en la etapa (c).

En un aspecto, se proporciona un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes de hierro, o un extracto o una composición obtenida en el procedimiento de preparación según la invención.

En un aspecto, se proporciona un uso cosmético y/o no farmacéutico de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes del hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención para la aplicación tópica, extradérmica o exógena en la piel o cabello de un sujeto.

En un aspecto, se proporciona un cosmético y/o no farmacéutico, la utilización de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes de hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención para estimular o incrementar la renovación y/o actividad lisosómica en células de la piel, preferentemente queratinocitos, en un sujeto.

En un aspecto, se proporciona un uso cosmético y/o no farmacéutico de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes de hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención para estimular o incrementar la autofagia en células de la piel, preferentemente queratinocitos, en un sujeto.

En un aspecto, se proporciona un uso cosmético y/o no farmacéutico, o un uso farmacéutico o terapéutico de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes del hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención en un sujeto que se supone se beneficia de una renovación y/o actividad lisosómica incrementada, y/o autofagia.

En un aspecto, se proporciona un uso cosmético y/o no farmacéutico de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes del hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención para retrasar el desarrollo, preferentemente el desarrollo acelerado, o la manifestación, preferentemente una manifestación prematura de piel envejecida.

En un aspecto, se proporciona un uso cosmético y/o no farmacéutico de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes de hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención para tratar o prevenir signos de piel alterada o envejecida, o para tratar o prevenir el fotoenvejecimiento en un sujeto.

En un aspecto, se proporciona un uso cosmético y/o no farmacéutico de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes de hierro, o un extracto o una preparación celular o una composición según la invención para mejorar la apariencia de la piel relacionada con la edad en un sujeto.

En aspectos todavía adicionales, la invención proporciona métodos de utilización o métodos de tratamiento referidos o relacionados con cualesquiera otros aspectos o realizaciones de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona extractos del microalga Galdieria sp., es decir una especie de las algas unicelulares rojas (Rhodophyta, Cyanidales, Galdieriaceae). El organismo poliextremofílico, por ejemplo crece a temperaturas de hasta 56°C y tolera valores de pH inferiores a 2 (Gross et al., 1998; Jain et al., 2014). Son parientes cercanos, por ejemplo, Cyanidioschyzon merolae y Cyanidium caldarium.

La invención se basa en los resultados de que un extracto de Galdieria incrementa la actividad lisosómica y la proteína LC3B en queratinocitos en cultivo. Estos resultados indican que el extracto de Galdieria estimula la autofagia en células de la piel y de esta manera contiene uno o más activadores de autofagia. El extracto de Galdieria además muestras propiedades ligantes del hierro que se cree ayudan en la autofagia.

El extracto de Galdieria o composiciones cosméticas que lo contienen resultan útiles para el cuidado personal de la piel y el cabello. Una ventaja del extracto o las composiciones es la utilización de la destoxificación celular. Con ello, el extracto o las composiciones protegen a la piel humana frente a diversos tipos de daños, tanto del interior como del exterior (p.ej., por la luz solar) o ayudan a aliviar los signos de dichos daños. De esta manera, el extracto o las composiciones mejoran la apariencia estética global de la piel, en particular de la piel envejecida.

Otra ventaja del extracto de Galdieria es su fuente biológica. Lo anterior habitualmente potencia la aceptación del consumidor y podría ser una condición para la utilización en composiciones cosméticas naturales u orgánicas.

Todavía otras ventajas son que los cultivos madre de Galdieria sp. se encuentran disponibles comercialmente; pueden producirse grandes cantidades de biomasa de Galdieria utilizando procedimientos ordinarios a gran escala; el procesamiento de la biomasa raramente está asociado a riesgos particulares, p.ej., tóxicos, para el personal, y los extractos resultan fáciles de almacenar, p.ej. después de la liofilización.

Explicaciones y definiciones

Generalmente, "autofagia" o "autofagocitosis" describe un proceso homeostático de eliminación respecto de la célula de, por ejemplo, componentes celulares disfuncionales, proteínas más plegadas, orgánulos daños o patógenos microbianos intracelulares. De esta manera, la autofagia sirve las funciones de destoxificación celular y de defensa frente al daño celular. Existen tres rutas de autofagia: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperón. La ruta principal, la macroautofagia, implica la formación de una doble membrana conocida como un autofagosoma en torno al componente marcado para la destrucción. A continuación, el autofagosoma es transportado a través del citoplasma de la célula a un lisosoma y se fusionan los dos orgánulos. Dentro del lisosoma, el contenido del autofagosoma es degradado medainte hidrolasas lisosómicas acidas.

Un "lisosoma" es una vesícula unida a una membrana, que contiene enzimas hidrolíticos en la producción de los cuales participan los ribosomas, el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi.

Un "endosoma" es un compartimiento unido a una membrana, que contiene, por ejemplo, material celular que será degradado, que finalmente se fusiona con un lisosoma.

La descripción "Galdieria sp." significa Galdieria sulphuraria.

Se conocen de la técnica varios "activadores de autofagia". Debido a que participan diferentes tipos de ruta de señalización, los activadores de autofagia pueden intervenir en el proceso en diferentes etapas. Por ejemplo, la rapamicina, el everolimus, el resveratrol y el tamoxifeno actúan como inhibidores de mTOR.

Un "agente quelante de hierro" o quelante de hierro liga el hierro mediante la formación de complejos quelatos, es decir, de una manera no covalente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente ligante de hierro" también significa "actividad ligante de hierro".

El término "extracto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de células algales después se haber sido sometida a por lo menos un tratamiento de disrupción celular. Un extracto puede contener por lo menos 60% a 80%, 90%, 95% o más células rotas. Un extracto se prepara mediante ultrasonicación, homogeneización a alta presión o congelación/descongelación de una suspensión celular y contiene residuos celulares. El término de esta manera incluye preparaciones de homogenados en bruto o lisados hasta obtener fracciones altamente purificadas de los mismos. El término incluye además filtrados obtenidos a partir de homogenados o lisados o fracciones de los mismos. El término incluye además reconstituidos, p.ej., resuspensiones o resoluciones, de extractos previamente liofilizados o de otro modo secos.

La expresión "suspensión celular" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de células algales que no ha sido sometida a ningún tratamiento de disrupción celular. Por ejemplo, una suspensión celular contiene por lo menos 50% a 80%, 90%, 95% o más células intactas. El término intenta centrarse en células no rotas deliberadamente, con independencia del hecho de que, por ejemplo, una suspensión celular tratadas mediante ultrasonicación contiene residuos celulares y, de esta manera, desde una perspectiva puramente física, puede considerarse una suspensión.

La expresión "ingrediente activo" o "agente activo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un ingrediente o agente que muestra autofagia y/o actividad ligante de hierro.

El término "envejecimiento" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a alteraciones que se producen natural e irreversiblemente en procesos biológicos de células y organismos durante el tiempo (envejecimiento cronológico).

La expresión "piel envejecida" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a alteraciones identificables ópticamente o de otro modo de la piel, incluyendo, por ejemplo, líneas, arrugas, manchas pigmentadas, manchas hepáticas, lentigos solares, manchas de la edad, arañas vasculares, verrugas seniles y piel apergaminada. El término incluye la apariencia de la piel debido al envejecimiento cronológico, es decir, envejecimiento "fisiológico" o "normal" o "adecuado". El término incluye además el envejecimiento acelerado o prematuro, es decir, la apariencia de piel envejecida debido a, por ejemplo, la exposición prolongada a la luz solar (p.ej., la exposición crónica a UVA y UVB), el tabaquismo, el consumo de alcohol, el abuso de fármacos o la alimentación o cuidado de la piel inadecuados. La expresión "piel alterada" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la apariencia de la piel de un sujeto, que se aparta de la apariencia anterior de la piel, por ejemplo en un tiempo en que el sujeto era más joven o todavía no sufría de un trastorno o enfermedad de la piel.

La expresión "piel fotoenvejecida" se refiere a piel que muestra signos de fotoenvejecimiento (también denominado dermatoheliosis), tal como arrugas, lentiginos solares, manchas de la edad o apariencia coriácea de la piel.

La expresión "piel envejecida relacionada con los lisosomas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a actividad o renovación lisosómica reducida o de otro modo afectada en las células de la piel, por ejemplo en contraste con una función deteriorada de la elastina o del colágeno.

La expresión "actividad lisosómica" tal como se utiliza en la presente memoria incluye la renovación lisosómica. Realizaciones preferentes de la invención

En una realización, Galdieria sulphuraria es o incluye una subespecie de Galdieria sulphuraria (es decir, Galdieria sulphuraria ssp.). En una realización, el activador de autofagia y/o el agente ligante de hierro es una molécula o compuesto orgánico. En otra realización, el activador de autofagia y/o el agente ligante de hierro es una molécula o compuesto inorgánico.

En una realización, el activador de autofagia es una proteína o un complejo de proteínas, o un complejo proteico. Por ejemplo, el activador de autofagia se une a receptores de reconocimiento de patrón (RRP), tales como los receptores de tipo Toll (TLR) o receptores de tipo Nod. Por ejemplo, la transducción de señales inducida por el activador de autofagia implica chaperones o proteínas de choque térmico como Hsp70.

En una realización, el activador de autofagia no es, o excluye, la espermina o la espermidina. En otra realización, el activador de autofagia no es dependiente, o no está relacionado con la espermina o la espermidina. Por ejemplo, el activador de autofagia y la espermina o espermidina no comparten un receptor celular común o no comparten todas las etapas de la ruta de señalización.

En una realización, el agente ligante de hierro es un agente quelante de hierro. Alternativamente, el agente ligante de hierro es una proteína o complejo de proteínas.

En una realización, la actividad de autofagia y la actividad ligante de hierro están localizados en diferentes moléculas, compuestos, complejos, unidades o componentes o compartimientos celulares. En otra realización, la actividad activadora de autofagia y la actividad ligante de hierro están localizadas en la misma molécula, compuesto, complejo, unidad o componente o compartimiento celular.

En una realización, el activador de autofagia y/o el agente ligante de hierro se aíslan o se purificaron, o se purifican gruesamente o semipurifican a partir de extracto de Galdieria.

En una realización, el activador de autofagia y/o el agente quelante de hierro es el ingrediente activo, p.ej., el único ingrediente activo, en una composición cosmética y/o no farmacéutica, o en una composición farmacéutica o terapéutica.

En una realización, el extracto se prepara a partir de células en cultivo de Galdieria sulphuraria.

En una realización, la preparación celular es una suspensión celular de las células en cultivo. La preparación celular contiene predominantemente células intactas o células completas, o células que no han sido sometidas a una etapa de disrupción o desintegración, tal como la ultrasonicación. Por ejemplo, la preparación celular contiene medio de cultivo en el que se han propagado las células, es decir, representa un cultivo celular líquido en el que las células no han sido sometidas a una etapa de separación o lavado. En un ejemplo alternativo, las células se han recolectado mediante una etapa de separación, p.ej., mediante centrifugación, y resuspendido en, p.ej., medio de cultivo fresco, solución salina fisiológica, una solución salina tamponada o agua. Preferentemente, la preparación celular es una alícuota de un cultivo celular líquido.

En una realización, el extracto resulta preferente a la preparación celular.

En una realización, las células en cultivo son preferentemente células en cultivo líquido, es decir, han sido propagadas en cultivo líquido.

En una realización, las células en cultivo son células en cultivo autotróficas o fototróficas, preferentemente células en cultivo autotróficas.

En una realización, las células en cultivo han sido recolectadas mediante separación a partir de medio de cultivo líquido utilizando la centrifugación, la filtración, p.ej., la ultrafiltración, la sedimentación o la flotación. Preferentemente, la separación se lleva a cabo mediante centrifugación de la suspensión de cultivo celular, p.ej., a 4.000 rpm, 2.800 x g, durante 10 minutos. Opcionalmente, las células han sido lavadas con solución salina fisiológica o una solución salina tamponada, p.ej., una vez, dos veces, tres veces o varias veces.

En una realización, el extracto es o se prepara a partir de un homogenado celular, p.ej., un homogenado en bruto, o un lisado celular, p.ej., un lisado en bruto. El homogenado o lisado se prepara mediante desintegración o disrupción de células intactas, p.ej., por medios mecánicos, químicos o térmicos. Por ejemplo, el homogenado o lisado se prepara mediante congelación y descongelación, o ciclos repetidos de congelación/descongelación, mediante choque osmolítico, mediante exposición a presión incrementada o reducida, p.ej., homogeneización a alta presión, mediante mezcla, p.ej., utilizando un molino de perlas, un molino de bolas, un homogeneizador o extrusor, mediante ultrasonicación o mediante surfactantes, detergentes, sales caotrópicas o enzimas citolíticos. Preferentemente, el extracto es un lisado celular en bruto preparado mediante congelación y descongelación de células, más preferentemente mediante tres ciclos de congelación/descongelación. Preferentemente, el extracto es un homogenado celular en bruto preparado mediante ultrasonicacion de células, más preferentemente mediante tratamiento de células con ultrasonidos durante 30 segundos, seguido de 10 segundos de enfriamiento (seis ciclos) a 200 W.

En una realización, el extracto es una fracción de un homogenado celular o lisado, p.ej., una fracción particulada, un pellet, un pellet resuspendido o un extracto de un pellet. Por ejemplo, la fracción particulada comprende membranas externas, membranas intracelulares u orgánulos de células.

En una realización, el extracto es un filtrado obtenido de un homogenado celular o lisado.

En una realización, el extracto es un extracto de Galdieria purificado o gruesamente purificado o semipurificado.

En una realización, el extracto se prepara utilizando protocolos de extracción orgánica o medios de purificación sólidos, p.ej., una columna de fase sólida.

En una realización, el extracto es un extracto acuoso o no acuoso. En otra realización, el extracto es una mezcla de extracto acuoso y no acuoso. Por ejemplo, el extracto no acuoso es un extracto orgánico, y es miscible o inmiscible con agua.

En una realización, el extracto o preparación celular contiene además un aditivo que, por ejemplo, estabiliza la actividad del activador de autofagia y/o el agente ligante de hierro. Por ejemplo, el aditivo es un conservante.

En una realización, el extracto o preparación celular se ha sometido a congelación, secado o secado por congelación (liofilización). Por ejemplo, el secado o liofilización se lleva a cabo mediante secado por pulverización o utilizando un secador de banda. Por ejemplo, el extracto o preparación celular se aplica en un soporte o portador para el secado. En una realización, el extracto o preparación celular es un reconstituido, p.ej., una resuspensión o resolución, de un extracto seco o liofilizado.

En otra realización, el extracto o preparación celular se prepara en fresco, es decir, no se somete a congelación, secado o liofilización.

En una realización, la composición es para la aplicación exógena, extradérmica y/o cutánea. Por ejemplo, la composición es para la aplicación tópica en la piel y/o cabello.

En una realización, la composición es de fluida a viscosa, cremosa, aceitosa, pulverulenta, similar a un gel, o sólida. En una realización, la composición está adaptada a la administración por medios tópicos cutáneos, p.ej., una espátula, una ampolla, un vial, un aplicador, una jeringa, un tubo, un frasco o un matraz.

En una realización, la composición es una composición para el cuidado de la piel y/o para el cuidado del cabello. En una realización, la composición es una emulsión, por ejemplo una emulsión de aceite en agua (o/w) o de agua en aceite (w/o), una emulsión múltiple (agua/aceite/agua o aceite/agua/aceite), una microemulsión, una nanoemulsión, una emulsión Pickering (es decir, estabilizada por partículas sólidas, tal como el sílice coloidal). Por ejemplo, la emulsión es una emulsión no iónica, una emulsión catiónica o una emulsión aniónica.

En una realización, la composición es una solución, una suspensión, una hidrodispersión, un gel acuoso, un gel emulsionado, un aerosol o unos polvos sueltos o prensados.

En una realización, la composición se selecciona del grupo que consiste en una crema, una loción, una leche, una pasta, una pomada, un fluido, un líquido, un suero, una espuma, una espuma, un gel, un aceite, unos polvos y un spray.

En una realización, la composición se selecciona del grupo que consiste en una crema para la piel, una loción corporal, una leche corporal, un gel para la piel, un spray corporal, una base, un gel refrescante para después del sol hidratante, una máscara limpiadora facial, un gel crema protectora facial, una crema para el cuidado de las manos, una crema protectora para el cuidado de los pies, una crema para la dermatitis del pañal, una base antienvejecimiento, una crema antienvejecimiento, una composición de barra de labios, una composición de máscara, una composición de sombra de ojos, unos polvos de cuidado de la piel, un spray corporal protector de la piel, un spray de protección solar, un champú, una acondicionador, una laca para el pelo y un producto de tinte de cabello o colorante.

En una realización, la composición contiene entre aproximadamente 0,01% y 20% (en peso), preferentemente entre aproximadamente 0,05% y 10%, más preferentemente entre aproximadamente 0,08% y 8%, o entre 0,1% y 5%, o entre 0,1% y 1,0%, o entre 0,1% y 0,5%, lo más preferentemente de 0,3% del extracto o preparación celular.

En una realización, la composición contiene, además del extracto, preparación celular o ingrediente activo, un componente, aditivo, adyuvante o vehículo cosmética y/o farmacéuticamente aceptable. Dichos componentes no causan una sensación de incomodidad para el usuario, tal como enrojecimiento, hormigueo o cosquilleo. Por ejemplo, la composición contiene una base cosmética y/o farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición comprende un componente seleccionado del grupo que consiste en aceites (opcionalmente seleccionados de entre aceites vegetales, triglicéridos, ésteres y aceites de silicona; aceites lineales y cíclicos; aceites no volátiles y aceites volátiles), ceras (tales como ozokerita, cera de polietileno, cera de abejas, cera de Candelilla o cera carnauba), elastómeros de silicona, surfactantes, preferentemente un surfactante emulsionante (no iónico, aniónico, catiónico o anfotérico), cosurfactantes (tales como alcoholes grasos lineales), espesantes, solidificantes, hidratantes (tales como los polioles, tales como glicerina), filtros orgánicos, filtros inorgánicos, pigmentos, conservantes, cargas de alimentación, agentes tensores, agentes secuestrantes, perfumes y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, se citan aditivos o adyuvantes útiles en el Diccionario CTFA (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, publicado por Personal Care Product Council).

En una realización, la composición farmacológica o terapéutica es una composición dermatológica.

En una realización, el procedimiento de preparación es un procedimiento de preparación de un activador de autofagia y/o un agente ligante de hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes del hierro, o un extracto o una composición según la invención.

En una realización del procedimiento de preparación, el cultivo celular proporcionado en la etapa (a) es un cultivo celular líquido, preferentemente que crece en la fase logarítmica. Por ejemplo, la etapa (a) comprende incubar las células a una temperatura de entre aproximadamente 30°C y 55°C, preferentemente durante la noche, y/o a un pH de aproximadamente 2 a 3.

En una realización del procedimiento de preparación, el cultivo celular proporcionado en la etapa (a) es un cultivo celular fototrófico o autotrófico, preferentemente un cultivo celular autotrófico.

En una realización del procedimiento de preparación, la etapa (b) comprende separar las células en cultivo respecto del medio de cultivo líquido. Por ejemplo, la etapa (b) comprende centrifugación, filtración, p.ej., ultrafiltración, sedimentación o flotación. Preferentemente, la separación se lleva a cabo mediante centrifugación de la suspensión de cultivo celular, p.ej., a 4.000 rpm, 2,800 x g, durante 10 minutos.

En una realización del procedimiento de preparación, la etapa (b) comprende lavar las células en cultivo, preferentemente las células separadas, por ejemplo el pellet celular que resulta de la centrifugación. Por ejemplo, las células se lavan con solución salina fisiológica o una solución salina tamponada, p.ej., una vez, dos veces, tres veces, o varias veces. Por ejemplo, el procedimiento de lavado de las células comprende separar las células respecto de la solución de lavado, p.ej., mediante centrifugación, y la resuspensión del pellet celular resultante en medio de cultivo fresco, solución salina fisiológica, una solución salina tamponada o agua.

En una realización del procedimiento de preparación, la etapa (c) comprende romper las células en cultivo por medios mecanismos, químicos o térmicos, p.ej., mediante congelación y descongelación, o ciclos repetidos de congelación/descongelación, mediante choque osmolítico, mediante exposición a una presión incrementada o reducida, p.ej., homogeneización a alta presión, mediante la mezcla, p.ej., utilizando un molino de perlas, un molino de bolas, homogeneizador o extrusor, mediante ultrasonicación, o mediante surfactantes, detergentes, sales caotrópicas o enzimas citolíticos. Preferentemente, la rotura de las células se lleva a cabo mediante congelación y descongelación de células, más preferentemente tres ciclos de congelación/descongelación o mediante ultrasonicación de células, lo más preferentemente mediante tratamiento de las células con ultrasonidos durante 30 segundos, seguido de 10 segundos de enfriamiento (seis ciclos) a 200 W.

En una realización del procedimiento de preparación, el extracto obtenido en la etapa (d) es un homogenador celular en bruto o lisado, una fracción de un homogenado celular o lisado, p.ej., un sobrenadante, una fracción soluble, una fracción particulada, un pellet, un pellet resuspendido o un extracto de un pellet. Por ejemplo, el sobrenadante o fracción soluble comprende el compartimiento citosólico de células; la fracción particulada comprende membranas externas, membranas intracelulares u orgánulos de células. Por ejemplo, el sobrenadante o fracción soluble se obtiene mediante eliminación de la fracción particulada mediante centrifugación, sedimentación o separación mediante filtración.

En una realización, el extracto obtenido en la etapa (d) es un filtrado obtenido de un homogenado celular o lisado. En una realización, el procedimiento de preparación comprende una etapa adicional (e) de congelación, secado o liofilización del extracto obtenido en la etapa (d), p.ej., el secado mediante spray o mediante la utilización se un secador de banda. Por ejemplo, el secado o liofilización comprende aplicar el extracto en un soporte o portador. Preferentemente, la etapa (e) comprende la liofilización del extracto obtenido en la etapa (d).

En una realización, el procedimiento de preparación comprende una etapa adicional (f) de reconstitución, p.ej., resuspensión o resolución del extracto seco o liofilizado obtenido en la etapa (e).

En una realización, el procedimiento de preparación comprende etapas adicionales, por ejemplo, una o más etapas de purificación del extracto, o la etapa de adición al extracto de un aditivo, p.ej., un estabilizador o un conservante. En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel es piel humana. En otra realización, la piel es piel animal no humana, por ejemplo de un animal con pelaje, por ejemplo de un mamífero.

En una realización, p.ej., de las composiciones o usos, la piel es la piel de un sujeto envejecido, p.ej., a la edad de aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 años.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel es piel alterada o envejecida.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel es piel envejecida cronológicamente adecuada o piel envejecida prematuramente.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel es piel fotoenvejecida.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, los signos de piel alterada o envejecida son líneas, arrugas, manchas de pigmentación, manchas hepáticas, lentiginos solares, verrugas seniles o piel coriácea. En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la apariencia de la piel relacionada con la edad se caracteriza por líneas, arrugas, manchas pigmentadas, manchas hepáticas, lentiginos solares, verrugas seniles o piel coriácea.

En una realización, p.ej., de las composiciones o usos, la mejora de la apariencia de la piel relacionada con la edad comprende revertir, por lo menos parcialmente, los signos de la edad envejecida.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel es piel facial o piel corporal. Por ejemplo, la piel es piel de la boca, cuello, pecho, parte posterior de los brazos y piernas.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel es piel del cuero cabelludo que comprende folículos pilosos. Por ejemplo, los folículos pilosos presentan una actividad reducida o incrementada con respecto a la producción de pelo. Por ejemplo, la piel del cuero cabelludo comprende piel del cuero cabelludo y/o pelo corporal. Por ejemplo, la piel del cuero cabelludo comprende adicionalmente pelo que consiste en pelo del cuero cabelludo o pelo corporal.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel alterada o envejecida es piel alterada o envejecida relacionada con los lisosomas o está relacionada o se debe a una reducción de la actividad lisosómica y/o de la autofagia en células de la piel, preferentemente queratinocitos.

En una realización, p.ej. de las composiciones o usos, la piel alterada o envejecida está relacionada o se debe a un contenido celular potenciado de hierro, p.ej. de hierro libre, en las células de la piel, preferentemente en los queratinocitos.

En una realización de los usos, el sujeto es un ser humano. Por ejemplo, el ser humano es un hombre o una mujer. Por ejemplo, el ser humano es un bebé, un niño, un adulto, p.ej., a la edad de aproximadamente 20, 30, 40 o 50 años, o es una persona de edad avanzada, p.ej., a la edad de aproximadamente 50, 60, 70, 80 o 90 años. En otra realización, el sujeto es un animal no humano, por ejemplo un animal con pelaje, por ejemplo un mamífero.

En otras realizaciones, los usos son los siguientes:

(a) tratamiento, reducción y/o prevención de líneas finas o arrugas,

(b) reducción del tamaño de los poros de la piel,

(c) mejora del grosor, firmeza y/o tersura,

(d) mejora de la elasticidad y/o suavidad de la piel,

(e) mejora del tono, brillo y/o claridad de la piel,

(f) mejora de la producción de procolágeno y/o colágeno,

(g) mejora del mantenimiento y remodelado de la elastina,

(h) mejora de la textura de la piel y/o estimulación de la retexturización,

(i) mejora de la reparación y/o función de barrera de la piel,

(j) mejora de la apariencia de los contornos de la piel,

(k) restauración del lustre y/o brillo de la piel,

(l) reabastecimiento de nutrientes esenciales y/o constituyentes de la piel,

(m) mejora de la apariencia de la piel, reducida por el envejecimiento y/o la menopausia,

(n) mejora de la humectación y/o hidratación de la piel,

(o) incremento y/o prevención de la pérdida de elasticidad y/o resiliencia de la piel,

(p) tratamiento, reducción y/o prevención de la flaccidez de la piel,

(q) tratamiento, reducción y/o prevención de la descoloración de la piel,

(r) destoxificación de la piel,

y cualquier combinación de los mismos.

En una realización particular, la invención proporciona un método para mejorar la apariencia estética de la piel de un ser humano afectado por el envejecimiento que resulta de una actividad de autofagia reducida dentro de las células de la piel del ser humano, que comprende aplicar tópicamente en la misma una cantidad terapéuticamente eficaz del extracto de Galdieria en un vehículo cosméticamente aceptable durante un tiempo suficiente para conseguir una mejora de la apariencia de dicha piel de dicho ser humano.

A continuación, se describe la invención en mayor detalle en referencia a las figuras adjuntas y mediante ejemplos que se proporcionan con fines exclusivamente ilustrativos y que no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada.

Figuras

La fig. 1 muestra el efecto de células completas de Galdieria sp. y extractos de Galdieria (homogenado ultrasonicado, homogenado concentrado u homogenado liofilizado y resuspendido) a diferentes concentraciones (0,5%, 1% o 2% en volumen) sobre células HaCaT, según medición en un ensayo de rojo neutro ([%]; control: células no tratadas, 100%). La fig. 2 muestra el efecto de células completas de Galdieria sp. y extractos de Galdieria a diferentes concentraciones sobre la cantidad de proteína LC3B en células HaCaT.

La fig. 3 muestra el efecto del extracto de Galdieria (lisado de congelación/descongelación; 0,5%, 1,0% o 2% en volumen) y de extractos (lisados de congelación/descongelación) de Gloeocystis sp. (0,5%, 1,0% o 2% en volumen) o de Chlamydomonas reinhardtii (1,0%, 2,0% o 5% en volumen) sobre células HaCaT, medido en un ensayo de rojo neutro y en términos de proteína LC3B.

La fig. 4 muestra el efecto de células completas de Galdieria sp. y extractos de Galdieria a diferentes concentraciones sobre el nivel de ATP intracelular de las células HaCaT.

La fig. 5 muestra el efecto de extracto de Galdieria (lisado de congelación/descongelación; 0,1%, 0,5%, 1% o 2% en volumen) sobre células HaCaT, según medición en un ensayo de violeta cristal.

La fig. 6 muestra el efecto de la espermidina (100 o 250 j M) sobre células HaCaT en términos de proteína LC3B y el nivel de ATP intracelular, y según medición en un ensayo de rojo neutro, ensayo de MTT o ensayo de LDH.

Ejemplos

EJEMPLO 1: cultivo de Galdieria sp.

Los cultivos madre de Galdieria sulphuraria pueden obtenerse de colecciones comerciales de cultivos, p.ej., de la Colección de cultivos de algas de la Universidad de Gottingen, Alemania (SAG) o la Colección Algal de la Universidad Federico II - Nápoles, Italia (ACUF). El cultivo de Galdieria sulphuraria utilizado se aisló originalmente a partir de un Onsen en Japón.

El medio de cultivo básico era uno utilizado típicamente para el cultivo de algas fototróficas.

4,5 g de (NH⁴)²SO⁴ , 0,6 g de MgSO⁴ x 7H²O, 0,6 g de KH²PO⁴ , 0,03 g de CaC^h x 2H²O, 0,01 g de FeSO⁴ , 0,018 g de dihidrato disódico de ácido etilendiaminotetracético (EDTA), 0,005 g de H³BO³, 0,004 g de MnC^h , 0,00068 g de ZnSO⁴ x 7H²O, 0,00052 g de Na²MoO⁴ x 2H²O, 0,00008 g de CuSO⁴ x 5H²O, 0,00008 g de NaVO³ x 4H²O, 0,00064 g de CoCl² x 6H²O, por litro de agua destilada.

Un medio de cultivo alternativo era uno propuesto por Allen (1959).

El pH del medio se llevó a 2-3 mediante la adición de H²SO⁴1 N y/o mediante ajuste del CO².

Se cultivó Galdieria bajo condiciones heterotróficas. Para el cultivo heterotrófico, el medio de cultivo básico se modificó mediante la adición de hasta 10% de una fuente de carbono orgánico, p.ej., glicerol, glucosa, vinazas, melaza, galactosa o fructosa.

La temperatura del cultivo era de entre 30°C y 55°C.

EJEMPLO 2: preparación de extracto de Galdieria

Se recolectó la biomasa de Galdieria sp. a partir del medio de cultivo líquido mediante centrifugación (4.000 rpm, 2.800 x g, 10 minutos) y se lavó con una solución salina tamponada.

Los pellets celulares se resuspendieron en solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%, solución acuosa) y las células se lisaron mediante tres ciclos de congelación/descongelación. Como resultado, se obtuvo extracto de Galdieria en forma de un lisado.

Alternativamente, las células resuspendidas se trataron con ultrasonidos durante 30 segundos, seguido de 10 segundos de enfriamiento (seis ciclos) a 200 W. Como resultado, se obtuvo extracto de Galdieria en forma de un homogenado u homogenado ultrasonicado.

Para algunas aplicaciones, se preparó un extracto concentrado tres veces a partir de una suspensión de cultivo celular concentrada (mediante sedimentación o ultrafiltración) utilizando la homogeneización a alta presión (>800 bar). Como resultado, se obtuvo extracto de Galdieria en forma de un homogenado concentrado.

Además, se prepararon extractos solubles y particulados a partir de los homogenados mediante centrifugación y separación del sobrenadante (soluble) a partir del pellet (particulado). Se encontró actividad de autofagia tanto en la fracción soluble como en la particulada.

Con fines de almacenamiento, los lisados u homogenados se liofilizaron. En caso necesario, el liofilizado se resuspendió en solución salina fisiológica y se utilizó la resuspensión como extracto de Galdieria. Dichos liofilizados reconstituidos se concentraron de manera similar a los lisados u homogenados a partir de los que se originaron.

EJEMPLO 3: extractos de clorófitas

Para la comparación con el extracto de Galdieria, se cultivaron dos especies de alga verde (Clorófita): Gloeocystis sp.

y Chlamydomonas reinhardtii (obtenidas de la Colección de cultivos de algas y protozoos, CCAP, Reino Unido) y se prepararon los extractos de los mismos.

El medio de cultivo fue el siguiente (Krienitz y Wirth, 2006): KNO³200 mg/l, K²HPO³40 mg/l, MgSO⁴ ■ 7H²O 30 mg/l, Ca(NO³)²30 mg/l, NaHCO³168 mg/l; solución de Fe/EDTA: FeSO⁴ ■ 7H²O 3,5 mg/l; EDTA (Titriplex III) 4,5 mg/l; vitaminas: biotina 0,33 mg/l, vitamina B12 0,05 mg/l, tiamina 0,05 mg/l; elementos traza: MnC^h ■ 4H²O 4,95 mg/l, CoSO⁴ ■ 7H²O 0,14 mg/l, CuSO⁴ ■ 5H²O 0,025 mg/l, ZnSO⁴ ■ 7H²O 0,36 mg/l, H³BO³ 0,155 mg/l, (N 0,09 mg/l, NiSO⁴ ■ 6H²O 0,1315 mg/l, NH⁴VO³0,075 mg/l.

Eran medios de cultivos alternativos, el medio TAP (Gorman y Levine, 1965) y el medio basal de Bold (Bischoff y Bold, 1963).

Se ajustó y controló según resultase apropiado el régimen de luz para el cultivo de algas verdes.

Se prepararon extractos de Gloeocystis sp. o Chlamydomonas reinhardtii, es decir, extractos de clorófitas, de manera similar al extracto de Galdieria mediante tres ciclos de congelación/descongelación (ver el Ejemplo 2).

EJEMPLO 4: ensayo in vitro de células de la piel

Se cultivaron queratinocitos humanos (HaCaT) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con FCS al 5%. Las células se recolectaron en la etapa estacionaria. Antes de la tripsinización, las células fueron pretratadas con solución de EDTA.

Se preparó una suspensión celular en DMEM; las células se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano (1,8x10⁴ células/pocillo) y los cultivos celulares se incubaron a 37°C, 5% de CO². Veinticuatro horas después de la siembra, se añadió a los cultivos celulares extracto de Galdieria o de clorófita, o espermidina. Las células no tratadas sirvieron de controles.

Tras 48 horas adicionales de incubación, se extrajo el sobrenadante del cultivo y la placa de microtitulación se secó suavemente sobre una toalla de papel. La placa de microtitulación se lavó dos veces con 200 pl/pocillo de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

En esta etapa, se llevaron a cabo tratamientos adicionales tal como se indica en los Ejemplos 5, 6, 8, 11 y 14 a 17.

EJEMPLO 5: tinción celular DAPI

La tinción celular con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) es una medida de recuento celular y sirvió para la corrección de los recuentos celulares.

DAPI es un pigmento fluorescente que se utiliza en microscopía de fluorescencia para marcar el ADN. El compuesto se acumula preferentemente en regiones ricas en AT en el surco menor del ADN. Al excitarlo con luz ultravioleta, DAPI emite fluorescencia de color entre azul y cian. En relación al ADN de doble cadena, el máximo de absorción se encuentra a una longitud de onda de 358 nm; el máximo de emisión se encuentra a 461 nm.

Se cultivaron células HaCaT y se trataron tal como se indica en el Ejemplo 4. Se aplicó una solución de metanol con

DAPI al 0,0005% en la capa celular durante 15 minutos a 37°C. Después, las células se lavaron con agua doblemente destilada y se dejó que se secase la placa de microtitulación durante 30 minutos a 37°C.

Se midió la fluorescencia a 355 nm (excitación y a 600 nm (emisión9 en un lector de fluorescencia (Fluoroscan Ascent

FL; Labsystems).

Todos los datos en las figs. 1 a 6 y en la Tabla 1, posteriormente, están corregidos con DAPI.

EJEMPLO 6: ensayo de rojo neutro

Se midió la actividad lisosómica en los queratinocitos utilizando un ensayo de rojo neutro tal como se describe en Al-Quenaei et al. (2014) para determinar la integridad de los lisosomas.

El rojo neutro es un pigmento catiónico, que se difunde hacia el interior de las células y se une a la matriz lisosómica. Dentro del lisosoma, el rojo neutro cambia de carga y color debido al pH ácido. El pigmento se acumula siguiendo el principio de la trampa iónica. El pigmento unido puede redisolverse y la solución coloreada se mide a 570 nm en un lector de microplacas. La DO a 570 nm corresponde a la actividad lisosómica.

Las células HaCaT cultivadas y tratadas tal como se ha indicado en el Ejemplo 4 se tiñeron mediante la adición a cada pocillo de una solución de rojo neutro al 0,005% en DMEM. Tras 4 horas a 37°C, con 5% de CO² , la placa de microtitulación se lavó cuidadosamente tres veces con 200 pl/pocillo de PBS y la tinción se redisolvió con etanol ácido al 50% en H²O doblemente destilada. Se leyó la absorbancia en un lector de microplacas a 570 nm.

EJEMPLO 7: efecto del extracto de Galdieria sobre la actividad lisosómica

Tal como se muestra en la fig. 1, Galdieria sp. (células completas) y los extractos de Galdieria indujeron un incremento de la tinción de rojo neutro de las células HaCaT.

El efecto fue menos pronunciado con células completas que con homogenados celulares. Notablemente, se mantuvo el efecto con homogenados resuspendidos tras la liofilización y este efecto era dependiente de la dosis.

Estos resultados indican que el extracto de Galdieria estimula la actividad lisosómica y, de esta manera, la autofagia en queratinocitos.

EJEMPLO 8: ensayo de LC3B

Se sometió a ensayo la autofagia en queratinocitos en un ensayo ELISA basado en la proteína de autofagia de mamíferos LC3B, un marcador de autofagosomas celulares. Los orgánulos que debían digerirse se encuentran incluidos en membranas que forman el autofagosoma. Dicho autofagosoma que contiene LC3B se fusiona con el lisosoma formando el autolisosoma para degradar los componentes incluidos. Tras la fusión del autofagosoma y el lisosoma, la proteína membranal LC3B ya no es detectable. Por lo tanto, debe evitarse la fusión con el inhibidor cloroquina, que sirve de interruptor del flujo de autofagia y, en consecuencia, de colector de autofagosomas que contienen proteína LC3B.

Se cultivaron células HaCaT y se trataron tal como se indica en el Ejemplo 4. Simultáneamente con extracto de Galdieria o clorófita, o espermidina, se añadió sal difosfato de cloroquina 2 pM (Sigma) a los cultivos celulares. Tal como se ha indicado en el Ejemplo 4, los cultivos celulares se incubaron a 37°C, con 5% de CO² , durante 48 horas, se eliminó el sobrenadante del cultivo y la placa de microtitulación se lavó con PBS. A continuación, se añadió una solución de fijación (formaldehído al 4%) a las células (200 pl/pocillo) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado repetido con PBS, las células se permeabilizaron mediante la adición de 150 pl/pocillo de metanol durante 10 minutos a -20°C.

Tras el lavado repetido con PBS, se bloqueó la proteína mediante la adición de 300 pl/pocillo de solución de bloqueo (suero de cabra al 5%, Triton X-100 al 0,3% en PBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, se añadió una solución de anticuerpo (mAb de conejo LC3B (D11) XP®, NEb) (100 pl/pocillo) y la placa de microtitulación se incubó a 4°C durante 18 horas.

Para el marcaje con anticuerpo secundario, la placa de microtitulación se lavó nuevamente y se añadieron 100 pl/pocillo de una solución de anticuerpo secundario (anti-IgG (H+L) de conejo, fragmento F(ab')² (Alexa®488)). Tras el lavado repetido, se midió la fluorescencia a 485 nm (excitación) y 535 nm (emisión) en un lector de fluorescencia (Spectramax Paradigm).

EJEMPLO 9: efecto del extracto de Galdieria sobre la autofagia

Tal como se muestra en la fig. 2, Galdieria sp. (células completas) y los extractos de Galdieria indujeron un incremento de la proteína LC3B en las células HaCaT.

El efecto fue menos pronunciado con células completas que con homogenados celulares. El efecto fue particularmente pronunciado con concentrados de homogenado al 1% y 2% y máximo con homogenados resuspendidos tras la liofilización al 2%.

Estos resultados indican que el extracto de Galdieria estimula la autofagia en queratinocitos.

EJEMPLO 10: comparación del extracto de Galdieria y de clorófita

Tal como se muestra en las figs. 1 y 2, el extracto de Galdieria era capaz de incrementar la actividad lisosómica y la proteína LC3B en queratinocitos.

Sin respaldo teórico, los presentes inventores plantean que los efectos observados podrían deberse a la glucosilación, que, sin embargo, no se correspondencia con la distancia evolutiva entre Galdieria y las células de mamífero. Para la evaluación de esta hipótesis, los presentes inventores sometieron a ensayo clorófitas, es decir, predecesores de las plantas terrestres, que son más similares a las células de mamífero en términos de glucosilación.

Tal como se muestra en la Tabla 1, a continuación, y en la fig. 3, los extractos de clorófitas hasta 5% no presentaron virtualmente ningún efecto sobre la actividad lisosómica y la proteína LC3B en células HaCaT.

Tabla 1: actividad de rojo neutro de extractos de Galdieria y clorófitas respecto a un control no tratado (normalizado respecto a DAPI)

Estos resultados indican que el extracto de Galdieria es notable en su capacidad de estimular la actividad lisosómica y la autofagia en queratinocitos.

EJEMPLO 11: ensayo de ATP

La destoxificación de la célula implica actividad catabólica y consumo de ATP. Se ha observado que una reducción del nivel intracelular de ATP está asociado a una célula envejecida o senescente (Brunk y Terman, 2002).

El nivel intracelular de ATP de los queratinocitos en respuesta la extracto de Galdieria se midió utilizando ATPLite-M, un ensayo de detección quimioluminiscente (ensayo de detección luminiscente de adenosina trifosfato, Packard, n° de cat. 6016541). El sistema de monitorización ATP Lite-M está basado en la luciferasa de luciérnaga y la producción de luz causada por la reacción catalizada por enzima del ATP y la D-luciferina.

Se cultivaron células HaCaT y se trataron tal como se indica en el Ejemplo 4. Tras la lisis celular, se añadió la solución de sustrato. A continuación, la placa se adaptó a la oscuridad durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un lector de luminiscencia (Fluoroscan Ascent FL; Labsystems).

EJEMPLO 12: efecto del extracto de Galdieria sobre el ATP intracelular

Tal como se muestra en la fig. 4, Galdieria sp. (células completas) y el extracto de Galdieria indujeron un incremento del nivel intracelular de ATP de las células HaCaT. El efecto se mantuvo en homogenados resuspendidos tras la liofilización.

Estos resultados confirman que el extracto de Galdieria estimula la renovación lisosómica en queratinocitos.

EJEMPLO 13: propiedades de ligación del hierro del extracto de Galdieria

Inesperadamente, se mostró que el extracto de Galdieria presenta la capacidad de retrasar la reacción de Fenton en 32% en un diseño experimental con Fe2+ y H2O2. Debido al bajo resultado del poder antioxidante (AP=0), puede concluirse que este efecto no se basa en un secuestro antioxidante directo de H2O2. Por lo tanto, la reacción de Fenton decelerada muy probablemente está relacionada con una reducción de la disponibilidad del catalizador.

Este resultado indica que el extracto de Galdieria podría contener un componente que se une y, de esta manera, reduce el hierro libre.

EJEMPLO 14: ensayo de violeta cristal

El pigmento cloruro de hexametilpararosanilida (violeta cristal) se une inespecíficamente a las proteínas. Al redisolverse, la solución coloreada es medible en un lector ELISA. De esta manera, pueden visualizarse los cambios en la cantidad de proteínas celulares a partir de los cambios de DO a 570 nm. Debido a que la proliferación celular implica un incremento de proteínas, el ensayo de violeta cristal indica los efectos de inhibición de la proliferación celular o los efectos citotóxicos.

Se cultivaron células HaCaT y se trataron tal como se indica en el Ejemplo 4. Tras la etapa de lavado con PBS, la placa de microtitulación se dejó secar a 37°C durante 30 minutos. A continuación, las células se tiñeron con 75 pl/pocillo de solución de violeta cristal (al 5%) a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución de pigmento se eliminó mediante golpes suaves y el exceso de pigmento se eliminó mediante lavado con agua bidestilada. Nuevamente, se dejó que la placa se secase a 37°C durante 30 minutos. El pigmento unido se redisolvió mediante la adición de 25 pl/pocillo de ácido fosfórico (0,2 M) y 75 pl/pocillo de etanol. Tras someter a agitación durante 5 minutos, se midió la DO utilizando un lector de microplacas (Spectramax Paradigm) a 570nm, referencia: 630 nm.

Tal como se muestra en la fig. 5, el extracto de Galdieria no ejerció efectos inhibidores o citotóxicos sobre las células HaCaT.

EJEMPLO 15: ensayo de MTT

Se utilizó el ensayo de MTT para determinar la actividad metabólica de las células HaCaT y la viabilidad en presencia de espermidina.

En las mitocondrias, donde se localizan las deshidrogenasas, tiene lugar el proceso metabólico oxidativo de la célula (ciclo del ácido cítrico). Este proceso tiene como objetivo convertir la energía de oxidación en ATP rico en energía (adenosina trifosfato) mediante fosforilación oxidativa. Debido a que lo anterior requiere la participación de deshidrogenasas, existe una relación directa entre la actividad de deshidrogenasa incrementada, un metabolismo incrementado y un otencial de energía celular incrementado.

La sal amarillenta tetrazoliio, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), se reduce a formazán de color azul oscuro mediante corte de anillo por las succinato deshidrogenasas mitocondriales. La intensidad de dicho cambio de color es medible a 570 nm.

Se cultivaron células HaCaT y se trataron tal como se indica en el Ejemplo 4. A continuación, se añadieron 10 pl/pocillo de una solución de MTT (5 mg/ml de PBS) a las células durante 4 horas adicionales. Se separaron los sobrenadantes celulares y el formazán unido a las células se disolvió mediante la adición de 100 pl/pocillo de una solución de parada que contenía 99,4 ml de DMSO (dimetilsulfóxido, Sigma), 10 g de SDS (dodecilsulfato sódico, Sigma) y 0,6 ml de ácido acético. Se leyó la absorbancia en un lector de microplacas (Spetramax Paradigm) a 570 nm, referencia: 630 nm. EJEMPLO 16: ensayo de LDH

Se utilizó el ensayo de LDH para determinar la integridad y viabilidad de las células HaCaT y en presencia de espermidina.

La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima citoplasmático estable que resulta rápidamente liberado al medio de cultivo celular al resultar dañada la membrana plasmática. La actividad de LDH se determina utilizando una sal de tetrazolio (INT), que se reduce enzimáticamente a formazán. El pigmento formazán es soluble en agua y presenta un máximo de absorción amplio en aproximadamente 500 nm.

Se cultivaron células HaCaT y se trataron tal como se indica en la descripción en el Ejemplo 4. Tras 48 horas de incubación con espermidina, se recogió el sobrenadante celular. Con este fin, la placa de microtitulación se centrifugó a 250xg durante 10 minutos. El sobrenadante sin células (100 pl/pocillo) se transfirió a una nueva placa de microtitulación de fondo plano ópticamente transparente. A continuación, se añadieron 100 pl de mezcla de reacción a los 100 pl de sobrenadante en cada pocillo. La placa se incubó en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 490 nm, referencia: 600 nm, en un lector de microplacas (Spectramax Paradigm). EJEMPLO 17: efecto de la espermidina sobre la actividad lisosómica y la autofagia

Se ha informado de que la espermidina induce autofagia y la espermidina se expresa en Galieria sp. De esta manera, se planteó la cuestión de si el efecto observado con el extracto de Galdieria estaba relacionado con la presencia de espermidina algal.

Se cultivaron células HaCaT (1,3x104 células/pocillo) y se trataron con espermidina (100 o 250 pM) tal como se ha indicado en el Ejemplo 4.

Tal como se muestra en la fig. 6, la espermidina indujo un incremento de la proteína L3CB en las células HaCaT, mientras que la actividad lisosómica (medida utilizando el ensayo de rojo neutro) permaneció sin cambios. La actividad metabólica de las células HaCaT (medida utilizando el ensayo de MTT) tampoco resultó afectada y la integridad celular (liberación de LDH) sólo se deterioró ligeramente.

Sin embargo, notablemente, el incremento de proteína LC3B sólo supuso aproximadamente 1,5 veces y no se observó diferencia entre 100 pM y 250 pM de espermidina. En contraste, el extracto de Galdieria indujo un incremento dependiente de la dosis de la proteína L3CB de hasta aproximadamente 4,5 veces (ver, p.ej., la fig. 3). Esta diferencia entre los resultados con espermidina pura y extracto de Galdieria es todavía más notable al considerar que 100 pM o 250 pM de espermidina son concentraciones que son bastante altas y ciertamente no esperables endógenamente en los extractos.

Por lo tanto, se concluyó que el extracto de Galdieria contenía actividades de autofagia que no se debían a la presencia de espermidina.

EJEMPLO 18: composiciones cosméticas

A continuación, se presentan a título de ejemplo diversas composiciones cosméticas que contienen extracto de Galdieria. Todos los ingredientes (proporcionados en % en peso) se nombran de acuerdo con la Nomenclatura internacional de ingredientes cosméticos (INCI, por sus siglas en inglés).

Ejemplo 18.1: gel para la piel ("gel refrescante hidratante para después del sol")

Ejemplo 18.2: suero o líquido ("máscara limpiadora facial")

Ejemplo 18.3: gel emulsionado ("gel crema protector facial")

Ejemplo 18.4: emulsión no iónica ("loción corporal")

| Agua desmin._______________________________________| a 100 Ejemplo 18.5: emulsión catiónica ("crema para el cuidado de las manos")

Ejemplo 18.6: emulsión aniónica ("crema protectora para el cuidado de los pies")

Ejemplo 18.7: emulsión w/o ("crema para la dermatitis del pañal")

Ejemplo 18.8: emulsión w/o ("base antienvejecimiento")

Ejemplo 18.9: emulsión w/o ("crema antienvejecimiento")

Ejemplo 18.10: emulsión Pickering ("rojo de barra de labios mate")

Ejemplo 18.11: polvos prensados ("polvos para el cuidado de la piel SPF")

Ejemplo 18.12: aerosol de polvos ("spray corporal protector de la piel")

Ejemplo 18.13: spray no aerosol ("spray protector solar SPF 30")

Referencias

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   i. Extracto de Gladieria sulphuraria, que comprende un activador de autofagia y/o un agente ligante del hierro, o un activador de autofagia que presenta propiedades ligantes del hierro, en el que el extracto contiene residuos celulares.
2. 2. Extracto según la reivindicación 1, que es un homogenado celular acuoso o lisado, o una fracción particulada del mismo, o un filtrado del mismo.
3. 3. Extracto según la reivindicación 1 o 2, que se ha sometido a secado, preferentemente a liofilización.
4. 4. Composición cosmética que comprende un extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Composición cosmética según la reivindicación 4, que ha sido adaptada para la aplicación tópica en la piel de un sujeto.
6. 6. Utilización no terapéutica de un extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composición cosmética según cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5 para incrementar la actividad lisosómica en las células de la piel, preferentemente queratinocitos, en un sujeto, para el tratamiento cosmético y la prevención de la piel envejecida.
7. 7. Utilización no terapéutica de un extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composición cosmética según cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5 para incrementar la autofagia en células de la piel, preferentemente queratinocitos, en un sujeto, para el tratamiento cosmético y la prevención de la piel envejecida.
8. 8. Utilización no terapéutica de un extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composición cosmética según cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5 para retrasar el desarrollo o la manifestación de piel envejecida, preferentemente piel fotoenvejecida, en un sujeto.
9. 9. Utilización no terapéutica según las reivindicaciones 6 a 8, en la que la piel envejecida se debe a una reducción de la actividad lisosómica y/o autofagia en células de la piel, preferentemente queratinocitos.
10. 10. Utilización no terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que la piel es piel facial o corporal, preferentemente piel envejecida, más preferentemente piel fotoenvejecida o es piel del cuero cabelludo.