ES2857080T3 - Nuevo filtro de cigarrillos que contiene alginita - Google Patents

Abstract

El uso de alginita para la filtración del humo del cigarrillo.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo filtro de cigarrillos que contiene alginita

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un filtro de cigarrillos. En particular, la presente invención se refiere a un nuevo filtro de cigarrillos, en el que se usan materiales de origen natural que no se han aplicado antes en este campo especial. Más particularmente, la presente invención se refiere a un filtro del cigarrillo, que se puede usar para adsorber los componentes tóxicos del humo del cigarrillo, y reducir el daño del tejido que se desencadena por el humo del cigarrillo en los órganos respiratorios, el sistema cardiovascular y la mucosa. Especialmente la presente invención se refiere a un filtro del cigarrillo que contiene alginita.

Antecedentes técnicos

El tabaquismo es un hábito humano nocivo, generalizado, que es conocido por causar daños graves y con frecuencia irreversibles a la salud. Actualmente, fumar es uno de los factores etiológicos más altamente documentados que contribuyen al desarrollo del cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). El daño a la salud que causa fumar genera graves problemas sociales y financieros a nivel mundial. Por ejemplo, solo en los países de la UE la muerte prematura de más de 500000 personas es causada por los efectos nocivos de fumar.

Hace aproximadamente 50 años, la Oficina del Cirujano General de EE.UU. publicó su primer reporte sobre fumar y la salud (Departamento de Salud, Educación y Bienestar de EE.UU., 1964). Este reporte estimó que el fumador promedio tenía una probabilidad de 9-10 veces de desarrollar cáncer de pulmón en comparación con un no fumador, mientras que los fumadores empedernidos tenían un aumento del riesgo de aproximadamente 20 veces. Además, el reporte señaló que fumar era la causa principal de bronquitis crónica y que existía una asociación entre fumar y el enfisema así como también con las enfermedades cardiovasculares. Se debe señalar que la bronquitis crónica y el enfisema se consideran actualmente como dos aspectos de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En los últimos 50 años, la Oficina del Cirujano General de EE.UU. ha publicado numerosos reportes sobre fumar y la salud, algunos tratan temas especializados, tales como dejar de fumar, fumar durante el embarazo, y el humo de tabaco ambiental. El reporte más reciente se publicó en 2014 - exactamente 50 años después del primer reporte (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., 2014).

En los últimos 50 años, la lista de enfermedades que se asocian con fumar se ha ampliado considerablemente. Centrándonos solo en el cáncer, existen actualmente numerosos tipos de cánceres que se asocian con fumar además del cáncer de pulmón, lo que incluye los cánceres del tracto respiratorio superior (orofaringe, faringe, tráquea y bronquios), cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal y leucemia mieloide aguda. Además, el Cirujano General de EE.UU. indica que quizás hasta 20 millones de estadounidenses han muerto prematuramente durante los últimos 50 años debido al efecto de fumar. Dados los obvios efectos deletéreos de fumar, la mitigación de estos efectos es un enorme problema de salud, y cualquier medida que se pueda tomar para reducir el problema claramente vale la pena investigar. Sin duda, la mejor acción es dejar de fumar. Los beneficios de dejar de fumar son bien conocidos (ver, por ejemplo, Fagerstrom, 2002). Sin embargo, existen muchos fumadores quienes ya sea eligen no dejar de fumar o quienes encuentran muy difícil renunciar. Aunque renunciar a fumar sería la medida más efectiva, el uso de nueva tecnología, tal como filtros novedosos que eliminan efectivamente los constituyentes nocivos del humo, podría reducir significativamente las enfermedades que se relacionan con el tabaco. Como consecuencia, cualquier medida que se pueda tomar para reducir los efectos de fumar en la salud tendrá un beneficio significativo. Sin duda, el intento más obvio de mitigar los efectos de fumar en la salud a través de la modificación del cigarrillo es a través de la adición de un filtro de cigarrillo. Sin embargo, el uso de filtros no ha sido particularmente exitoso.

Una de las primeras propuestas para añadir un filtro a los cigarrillos fue indudablemente hecha por Ernst Wynder, un epidemiólogo que fue uno de los primeros científicos en demostrar la asociación del humo del cigarrillo con el cáncer de pulmón. Un primer estudio en coautoría de Wynder que se publicó en 1988 evaluó la diferencia en el riesgo de cáncer de pulmón entre los fumadores de cigarrillos con filtro y los fumadores de cigarrillos sin filtro (Wynder y Kabat, 1988). Este estudio buscó la diferencia entre estos dos tipos de fumadores con respecto a los cánceres Kreyberg I (KI) y Kreyberg II (KII). (La nomenclatura de Kreyberg estaba vigente en ese tiempo, con cánceres de pulmón KI que incluían carcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer de pulmón de células grandes, y cáncer de pulmón de células pequeñas, mientras que los cánceres de pulmón KII comprenden solo adenocarcinoma de pulmón.) Se encontró una reducción de aproximadamente 45-50 % tanto para hombres como para mujeres con respecto a los tumores KI, aunque ninguno fue estadísticamente significativo, mientras que solo se observó una diferencia más débil en los hombres y ninguna diferencia en las mujeres para los tumores KII. Los filtros de cigarrillos se hicieron extremadamente populares durante la segunda mitad del siglo 20, con aproximadamente el 0,5 % de los cigarrillos con filtros que se vendieron en 1950 aumentó al 88,5 % en 1976 en los EE.UU. (Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas, 1977). Actualmente cerca del 100 % de los cigarrillos que se venden en todo el mundo son cigarrillos con filtro. Durante el mismo período de tiempo cuando el uso de filtros aumentaba a una rápida velocidad en los EE.UU. (1950-1976), los suministros de alquitrán de cigarrillos ponderadas por ventas que se miden por máquina disminuyeron de 37 mg a 16 mg (Hoffmann D y otros, 1996). La disminución del suministro de alquitrán a lo largo de este período fue una consecuencia de dos tendencias. La primera, como se indicó anteriormente, fue simplemente un rápido aumento en el uso de cigarrillos con filtro. La segunda, sin embargo, fue una consecuencia del aumento de la eficiencia de los filtros a lo largo del tiempo. Un filtro de cigarrillo es conceptualmente bastante simple, que consiste en un tapón poroso de un material dado que puede absorber tanto el alquitrán del cigarrillo como la fase gaseosa. Aunque algunos de los primeros filtros usaban fibras de papel como material absorbente, actualmente la gran mayoría de los filtros usan fibras de acetato de celulosa. El filtro, por lo tanto, es simplemente un tubo de papel relleno con acetato de celulosa que se une al cigarrillo mediante el uso de una envoltura. Se puede lograr un aumento en la eficiencia tanto mediante el aumento de la masa de acetato de celulosa en el filtro como mediante la disminución del diámetro del filamento. Ambos enfoques solo se pueden tomar hasta ahora, sin embargo, debido a que eventualmente la resistencia a la aspiración del cigarrillo se vuelve lo suficientemente grande como para que el producto sea inaceptable para el consumidor. El enfoque que se adoptó por prácticamente todas las empresas tabacaleras para resolver este problema fue introducir perforaciones en la envoltura del filtro. Por tanto el fumador inhala una mezcla de aire y humo. Los orificios de ventilación reducen la resistencia a la aspiración, y al tomar el aire así como también el humo, el humo se diluye y se reduce el suministro de los constituyentes del humo. Cuanto mayor es el alcance de la ventilación, mayor será la cantidad de aire y menor será la cantidad de humo que se inhala por el fumador. Aunque la mayoría de los expertos concuerdan que un cigarrillo con filtro reduce el riesgo de fumar al menos hasta un alcance en comparación con un cigarrillo sin filtro, los cigarrillos con bajo contenido de alquitrán, como se les llama, que reducen el suministro de alquitrán incluso menos de lo que se podría alcanzar con un filtro de cigarrillo normal no pareció conducir a un beneficio para la salud. Esta conclusión se basó tanto en los datos poblacionales como en los estudios epidemiológicos. Se presentaron datos considerables que documentan el hecho de que los fumadores compensan significativamente cuando fuman un "cigarrillo con bajo contenido de alquitrán" ya sea para mantener el nivel de nicotina o el nivel de sabor, lo que aumenta por tanto el suministro real de humo por encima del rendimiento que se mide por la máquina. Además, un número de científicos expresaron su preocupación de que el fumador pudiera bloquear deliberada o inadvertidamente los orificios de ventilación, lo que por tanto también aumenta significativamente el suministro de humo (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., 2001). Un resultado tangible de estas preocupaciones es que ya no se permite que los paquetes de cigarrillos indiquen los rendimientos de alquitrán y nicotina que se miden a máquina en al menos los EE.UU. y la UE. A pesar de estos problemas, todavía es posible desarrollar filtros novedosos que puedan reducir los efectos de fumar en la salud, particularmente si tales filtros se pueden desarrollar sin la necesidad de ventilación del filtro. Tales filtros se podrían diseñar para eliminar selectivamente los componentes específicos de la fase gaseosa y de humo semivolátiles de interés. Es importante tener en cuenta que el humo se compone de la fase gaseosa, semivolátiles y la fase de partícula. Los componentes de los que existe evidencia con respecto a los efectos en la salud se pueden encontrar en las tres fases. No existe tecnología actual que permita la filtración selectiva de componentes en la fase de partícula; sin embargo, tanto los componentes en la fase gaseosa como los semivolátiles se pueden filtrar selectivamente. Un excelente ejemplo de tal filtro actualmente en uso comercial es el filtro de carbón. Prácticamente todo el mercado japonés consiste en cigarrillos con filtro de carbón, mientras que aproximadamente el 50 % de los fumadores surcoreanos usan estos productos. Se han realizado otros avances tecnológicos en el desarrollo de filtros, pero ninguno de ellos tiene actualmente un uso comercial significativo. Actualmente el filtro es un segmento que se integra directamente en el cigarrillo en el extremo del lado de la boca, para que el humo del cigarrillo debe pasar a través del filtro antes de entrar en las vías respiratorias y los pulmones. Actualmente solo el 3 % de todos los cigarrillos del mundo se venden sin filtro. Aunque la cantidad de sustancias nocivas que llegan al fumador se puede reducir mediante filtros de cigarrillos, esto generalmente se logra simplemente mediante la reducción de la cantidad de humo que alcanza al extremo del lado de la boca del cigarrillo. En la mayoría de los casos existe poca o ninguna filtración selectiva. Por tanto, los investigadores están altamente interesados en construir un filtro de cigarrillos, que puede eliminar selectivamente determinados constituyentes peligrosos del humo para reducir las consecuencias de fumar para la salud.

El humo del cigarrillo contiene muchas partículas reactivas, tales como compuestos carbonílicos de bajo peso molecular, radicales libres, quinonas, cianuro de hidrógeno, óxidos de nitrógeno, y aminas aromáticas, que son altamente tóxicas, mutagénicas y cancerígenas. Por lo tanto, la reducción selectiva de la cantidad de estas sustancias en el humo del cigarrillo puede reducir los riesgos para la salud que causa fumar.

Cada vez más, las regulaciones gubernamentales requieren una mayor eficiencia de filtración para reducir la cantidad de humo de tabaco que se suministra al fumador. Mediante el uso de los filtros de acetato de celulosa actualmente disponibles, se puede alcanzar cierta selectividad mediante el dopado del filtro con concentraciones crecientes de partículas como carbón activado u otras sustancias naturales. Sin embargo, el aumento en la concentración de partículas cambia las características de aspiración para los fumadores. Además, las partículas de carbón activado en el filtro contribuyen a reducir la cantidad de sustancias volátiles nocivas en el humo del cigarrillo, pero debido a la falta de electrones no apareados, no pueden proporcionar el electrón más necesario para complementar los electrones no apareados de los radicales libres. Por lo tanto, el carbón no es adecuado para contrarrestar el impacto de los radicales libres en varios tejidos, que contribuyen a la inflamación y otros procesos nocivos en el cuerpo que se desencadenan por el humo del cigarrillo.

Una propiedad importante de un cigarrillo es la caída de presión encapsulada. El término "caída de presión encapsulada" o "EPD" se refiere a la diferencia de presión estática entre los dos extremos de un cigarrillo cuando se atraviesa por un flujo de aire bajo condiciones estables. Los valores de EPD más altos se traducen en que el fumador tiene que aspirar en un dispositivo para fumar con mayor fuerza.

Debido a que el aumento de la eficiencia de los filtros convencionales aumenta la EPD de los filtros, el público y, en consecuencia, los fabricantes, han tardado en adoptar estos productos. Por lo tanto, sigue habiendo interés en desarrollar filtros mejorados y más efectivos que afecten mínimamente las características de aspiración de los cigarrillos al tiempo que retiran los niveles más altos de determinados constituyentes en el humo del tabaco convencional, tal como los constituyentes que se mencionan anteriormente así como también el monóxido de carbono y los fenoles.

La relleno que se usa más comúnmente en la fabricación de filtros de cigarrillos es el acetato de celulosa que tiene un grado de sustitución de aproximadamente 2,5 grupos acetato por unidad de anhidroglucosa. Durante la fabricación, el polímero de acetato se extruye típicamente como una estopa de fibra y se mezcla con uno o más plastificantes (por ejemplo, triacetina, polietilenglicol, glicerina). Los procesos de estopa de acetato de celulosa se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos. Número 2,953,838 de Crawford y otros y la Patente de Estados Unidos. Número 2,794,239 de Crawford y otros. Se pueden inyectar varios fluidos en la estopa de fibra multifilamento que se usa en la fabricación de filtros de humo de tabaco. Estos fluidos, que se pueden usar en la estopa solos o en combinación con portadores líquidos o gaseosos, pueden ser aromatizantes, agentes de expansión de la estopa, lubricantes, soluciones de encolado, composiciones de acabado, plastificantes o similares. Tales fluidos pretenden impartir las características físicas o de sabor que se desean al humo del cigarrillo mediante la estopa que se trata con fluido. Los procesos de inyección de fluidos se establecen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos. Número 5,387,285 de Rivers.

Las fibras de acetato de celulosa que forman típicamente el elemento de filtro se recubren con una composición de acabado de fibra. Tales composiciones son generalmente emulsiones a base de agua compuestas por múltiples componentes. Cada componente puede cumplir una función específica ya sea durante el procesamiento de las fibras o durante el uso posterior de un filtro que se forma a partir de las fibras. Los componentes típicos de una composición de acabado de fibra incluyen aceites lubricantes para reducir la fricción para que las fibras se puedan procesar sin romperse, agentes antiestáticos para reducir la acumulación de electricidad estática en las fibras y emulsionantes para inhibir la separación de fases en una formulación de fibra durante el procesamiento. Otros componentes auxiliares pueden incluir agentes antimicrobianos, agentes hidrófilos, u otros compuestos reactivos. Después del ensamblaje de la estopa fibrosa en el material listo para filtrar, se pueden aplicar plastificantes para ablandar la fibra y permitir que se formen uniones entre fibras para endurecer el filtro a una dureza/consistencia que se desea. La química de la superficie del acetato de celulosa y el plastificante puede proporcionar un sabor ahumado que se desea y acepta ampliamente por los fumadores. Otros diseños/formulaciones determinados de filtros pueden proporcionar un sabor ahumado diferente. Hasta la fecha, los filtros de estopa de acetato sin celulosa no han sido generalmente aceptados ni han tenido éxito comercial.

El estado de la técnica contiene varias publicaciones que se relacionan con filtros de cigarrillos y varias mejoras que se aplican aquí.

El documento WO2013/1869838 describe un filtro de cigarrillo que comprende un tapón de filtro que contiene una fibra cortada de éster de celulosa, una pulpa y una sal metálica alcalina de un polímero aniónico soluble en agua. El tapón de filtro tiene un contenido de metal alcalino de 2 a 100 |_imol por gramo del tapón de filtro. El polímero aniónico soluble en agua puede comprender al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un ácido poliacrílico y un polisacárido que tiene un grupo carboxilo.

La Patente japonesa Número 3677309 describe un material de filtro de cigarrillos en forma de una lámina que tiene una estructura de papel y que comprende una fibra cortada de éster de celulosa sin rizar y una pulpa batida, en donde la pulpa batida tiene un grado de batido de libertad de Schopper-Riegler de 20 a 90 °SR, y la fibra cortada de éster de celulosa sin rizar es una fibra cortada que tiene una longitud promedio de fibra de 1 a 10 mm y una finura de 1 a 10 deniers. Este documento describe que en la preparación del material de lámina se puede emplear un aglutinante (por ejemplo, un adhesivo soluble en agua), un aglutinante siempre y cuando no tenga efectos negativos para la salud, ni disminuya el sabor y la palatabilidad del humo del tabaco, ni puede conducir a la desintegración del material de filtro. En general, la cantidad de aglutinante es preferentemente lo más pequeña posible (por ejemplo, no más del 10 % en peso del peso total del material). Un ejemplo en este documento describe un material de lámina que se forma de una fibra cortada de acetato de celulosa sin rizar y una pulpa batida mediante un proceso de producción de papel húmedo, que después se pulverizó con una solución acuosa de carboximetilcelulosa (3 % en peso en base al peso en seco).

La Solicitud de Patente Japonesa con Publicación Número 7-75542 describe un filtro de cigarrillo que comprende una estopa de una fibra de éster de celulosa y un polímero soluble en agua que está contenido en la estopa y une la fibra, la estopa ha sido procesada en una varilla de filtro mediante el uso de no más de 25 partes en peso de agua con respecto a 100 partes en peso de la estopa. Los ejemplos en este documento incluyen una punta de filtro de cigarrillo que se obtiene mediante la adición de un 5 % en peso de una sal de sodio de carboximetilcelulosa como un polímero soluble en agua a una estopa de fibra rizada de acetato de celulosa abierta y mediante la alimentación de la estopa que se abre a una máquina envolvedora para envolver la estopa que se abre con una envoltura de filtro. La Solicitud de Patente Japonesa con Publicación Número 8-322539 (Documento de patente 3, JP-8-322539A) describe un filtro para cigarrillos que comprende una tela no tejida que consiste de una composición de éster de celulosa y un aglutinante que tiene una buena dispersión en agua, la tela no tejida se envuelve en forma de varilla. Los ejemplos en este documento incluyen un tapón de filtro que se produce soplando un alambre de malla con una fibra cortada de acetato de celulosa mediante flujo de aire para laminación o deposición, y mediante la pulverización del material laminado sobre el alambre con 10 % en peso de una solución acuosa al 5 % de una carboximetilcelulosa, mediante presión y secado del laminado húmedo, que se somete la tela no tejida resultante a un tratamiento de rollo de crepé y después se envuelve la tela.

La Publicación Internacional Número WO 2014/164492 se refiere a filtros de humo que reducen la concentración de monóxido de carbono y fenoles en una corriente de humo. Dichos filtros incluyen una sección de masa porosa que comprende una pluralidad de partículas activas, una pluralidad de partículas aglutinantes y un recubrimiento activo dispuesto sobre al menos una porción de las partículas activas y las partículas aglutinantes, en donde las partículas activas y las partículas aglutinantes se unen entre sí en una pluralidad de puntos de contacto; y una sección de filtro. En algunos casos, un filtro puede incluir una sección de masa porosa que comprende una pluralidad de partículas activas y una pluralidad de partículas aglutinantes, en donde las partículas activas y las partículas aglutinantes se unen entre sí en una pluralidad de puntos de contacto sin un adhesivo; y una sección de filtro que comprende un dopante activo. Aunque este filtro de humo puede suministrar mejores resultados, su preparación es bastante complicada y los materiales usados para lograr el efecto de filtrado que se desea son costosos.

Un filtro de cigarrillos de alta eficiencia se describe en el documento WO 2010/125412. El filtro de cigarrillos comprende, además de los componentes comunes de los filtros de cigarrillos, pseudoboehmita (AlOOH.H2O), y componentes de la uva, astaxantina y arándano como antioxidante. El efecto ventajoso del filtro de cigarrillos también se debe al uso de los componentes de la uva en forma de pepitas de uva y de piel. El documento US2003168071 describe los minerales absorbentes zeolita y/o carbón en un filtro de cigarrillo para filtrar el humo del tabaco.

El documento HU189383 describen un proceso para separar los gases que emanan de la descomposición de la materia orgánica.

Como se mencionó anteriormente, es bien sabido que fumar es un problema importante de salud pública y un factor etiológico importante que contribuye al desarrollo del cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Por tanto, la identificación de nuevas técnicas para reducir la enfermedad pulmonar inducida por el cigarrillo sería de considerable beneficio.

En consecuencia, el objetivo de la presente invención es para proporcionar un filtro de cigarrillos, que tiene las ventajas de las soluciones que ya pertenecen al estado de la técnica, pero al mismo tiempo elimina sus inconvenientes al mayor alcance posible. Un objetivo adicional de la presente invención es para proporcionar un filtro de cigarrillo que reduzca aún más el contenido nocivo del humo del cigarrillo en comparación con los filtros de cigarrillo conocidos.

Sorprendentemente, se encontró que los objetivos de la invención se pueden alcanzar con éxito, si se aplica en el filtro del cigarrillo una sustancia natural, alginita, no usada antes para este propósito.

Nuestros experimentos demostraron que se puede lograr una reducción significativa de la cantidad de sustancias nocivas en el humo del cigarrillo, en comparación con los filtros actuales, si se usa alginita en los filtros.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un filtro de cigarrillos, que reduce aún más el contenido nocivo del humo del cigarrillo en comparación con los filtros de cigarrillos conocidos. Dichas propiedades ventajosas se deben al uso de alginita en los filtros de cigarrillos. La alginita puede usarse sola o en combinación con otras sustancias, ya utilizadas en filtros de cigarrillos.

La alginita es una roca precipitada que consta de biomasa de algas y toba, polvo volcánico desagregado en arcilla. En los lagos de la cuenca de los Cárpatos, se produjo una intensa actividad volcánica en el Plioceno hace unos 3-5 millones de años. Esta actividad creó las conocidas montañas de basalto, al mismo tiempo que formaba anillos especiales de toba. Después de la extinción de la actividad volcánica, los anillos de toba se inundaron de agua de esta manera se formaron los lagos de explosión (maars). El agua de los lagos de explosión se calentó por fuentes termales, y las soluciones calientes que contenían enriquecieron el agua con microelementos, sales minerales y otros nutrientes. Los elementos en los coloides minerales que resultaron de la degradación del material de vidrio de la toba volcánica enriquecieron aún más el contenido nutritivo de los lagos de explosión. En las tranquilas aguas de los lagos de explosión se acumularon grandes cantidades de algas (especialmente el alga verde Botriococcus braunii) y otros organismos animales o vegetales flotantes. Los organismos vegetales y animales que se acumularon murieron y se mezclaron con los residuos de las hojas y el polvo de anteras que se lavó de la densa vegetación de la orilla y se depositó en la parte inferior de los lagos de explosión. En el ambiente anóxico, junto con la toba que se desintegra y otros organismos planctónicos muertos, se acumularon como lodo en descomposición (sapropel). En la fase de sedimentación de los lagos de explosión, los cuerpos de animales más grandes se introdujeron en el lodo tibio y, como resultado, el lodo se enriqueció con materiales de fósforo. Esta biomasa empobrecida y endurecida sufrió cambios físicos y químicos específicos durante varios millones de años y tomó su forma actual: la roca alginita.

La alginita es una roca terrosa que tiene una estructura de arcilla que consiste de laminillas que se desprenden ocasionalmente en forma de hojas. La alginita no tiene ningún efecto tóxico (ver Dr. Solti Gabor: Az Alginit. Ismerteto tanulmány. Az Alginit a Mezogazdaságért es Kornyezetvédelemért Alapitvány tevékenysége (1993-2013) 2014). Su color es reseda (verde) o gris que a veces se torna ocre. Su estructura de laminilla se puede ver mejor tras la desecación y, con frecuencia, se pueden encontrar huellas de plantas o residuos de plantas entre las laminillas.

Su propiedad física más importante es que puede unir 0,5-1,01 agua por kilogramo. La alginita consiste en un 80-90 % de arcilla y fracciones de limo, y la deposición que contiene las partículas más gruesas cerca de la orilla. En la última fase de los cráteres de sedimentación (lagunas) el contenido de materia orgánico disminuyó y el contenido de bentonita aumentó. La composición de la alginita muestra una gran desviación en muestras tomadas de los mismos lugares. El contenido promedio de humus es del 30 %, llegando ocasionalmente al 45 %. El contenido promedio de cal (en forma de CaCO3) es del 33 %, llegando ocasionalmente al 40 %. Se ha demostrado que la biomasa fósil contiene 64 elementos. Esto significa que la alginita es especialmente rica en macro y microelementos, siendo los elementos más importantes los siguientes: nitrógeno (N): 0,5 %, fósforo (en forma de P2O5): 0,6 %, potasio (en forma de K2 O): 0,9 %, magnesio (Mg): 1,0 %. Los componentes minerales típicos son montmorillonita, illita, dolomita, calcita, aragonita, yeso de cuarzo, plagio-clase, siderita, magnesita, pirita y ortoclasa. Además de los anteriores, los microelementos más importantes son hierro (Fe), manganeso (Mn), cobre (Cu), zinc (Zn), cobalto (Co), níquel (Ni), litio (Li), titanio (Ti), cromo (Cr) y cadmio (Cd). Una de las características especiales de los ingredientes del humus es su efecto bioquímico de mejora del crecimiento de las plantas. Cuando la alginita se usa en la agricultura, los ácidos húmicos ejercen un efecto mejorador similar a una enzima y también un efecto hormonal y, a través de la regulación de la capacidad de absorción de agua de las raíces, también un efecto mejorador indirecto sobre el crecimiento de las plantas.

La alginita encuentra un uso generalizado para varios propósitos. En el cultivo de plantas y frutas, se puede usar alginita para el mejoramiento. Su uso multiplicado aumenta la fertilidad del suelo en un 20-30 % en el primer año. Debido a sus minerales arcillosos, los fertilizantes artificiales deben usarse en un nivel más alto, de esta manera se aumenta la transferencia de fósforo, nitrógeno y potasio del suelo a las aguas subterráneas, ríos y lagos. Su efecto dura de 4-6 años. La alginita es un material natural, conserva su calidad indefinidamente, no se puede abusar y niveles de uso incluso más altos no tienen efectos adversos. La alginita también se puede usar como suelo de jardín en forma de mezclas. Mezclado con otros materiales naturales como zeolita, perlita, turba o basalto, se han preparado mezclas de suelo altamente eficientes y libres de agentes. El uso de alginita da como resultado un aumento de la cantidad y calidad de rendimiento en el cultivo de olivos y ornamentales ya sea en el jardín o en politúneles al momento de la cosecha. La alginita también se puede usar como iniciador en la plantación de huecos de especies de árboles forestales. El uso de alginita da como resultado un aumento cuantitativo del 6-13 % y un crecimiento de un 20 % más rápido. La pulverización en suspensión con alginita en otoño tiene un efecto protector de las plantas y ayuda a la hibernación de los árboles, mientras que la pulverización en primavera proporciona protección contra las plagas. Como resultado de la pulverización de alginita, aumenta el contenido de manganeso, hierro, zinc y cobre de las plantas, mientras que el contenido de calcio en las frutas proporciona más sabor y una vida útil más prolongada. En ganadería, la alginita combinada con estiércol líquido proporciona un producto altamente efectivo para su uso como tratamiento complementario de fertilizantes orgánicos, o para sustitución de los mismos. La alginita reduce el período de degradación del fertilizante y se puede combinar con otros nutrientes. La mezcla de alginita con basura da como resultado un fertilizante más sustancial y mejora el crecimiento de animales domésticos y aves de corral. La alginita también ejerce efectos protectores ambientales. Debido a su alta afinidad de adsorción, une efectivamente los olores de los establos de animales y reduce la concentración de SO2 y NH3 en el espacio aéreo (ver, por ejemplo, la patente Húngara Número 189.383: "Process for binding of gases with unpleasant smell produced by dissolving organic materials and for production of organic manure with high efficiency").

Los usos para los humanos de la alginita incluyen su uso como lodo para problemas articulares, reumáticos y deportivos, y también tiene la ventaja de convertirlo en una pomada contra el reumatismo. La alginita también es útil contra las varices y la psoriasis y también puede usarse para la regeneración de la piel y la mejora general del estado de la piel. Además, la alginita también puede usarse como una base para ambientadores médicos.

La alginita se puede encontrar en Hungría y está disponible comercialmente en numerosas empresas húngaras, por ejemplo en Gérce-Alginit Kft, (Gérce, Hungría).

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la alginita es efectiva en un nuevo campo técnico. Nuestros estudios demuestran que la alginita es especialmente efectiva cuando se utiliza en filtros de cigarrillos sola o en combinación con otros componentes conocidos, como se analiza más abajo. Inesperadamente, se encontró que el uso de alginita en los filtros de los cigarrillos resultó en una cantidad significativamente menor de especies reactivas de oxígeno (ROS) de la saliva, una formación significativamente menor de ROS del suero sanguíneo, menos daño endotelial, menos daño del epitelio pulmonar, nivel de glutatión significativamente más alto, menos daño en los tejidos pulmonares y menos inflamación en los tejidos pulmonares, dichas propiedades ventajosas se describen en detalle más abajo.

El uso de alginita causa una cantidad significativamente menor de especies reactivas de oxígeno (ROS) de la saliva. Aunque la saliva en sí misma tiene una determinada concentración de radicales libres, el humo del cigarrillo provoca un aumento en el nivel de radicales libres. Se estima que hay más de 1014 radicales libres por bocanada de humo del cigarrillo (Church y Pryor, 1985; Church DF, Pryor WA, "Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications,", Environ Health Perspect, 1985, 64: 111-26). Dado que los radicales libres pueden interactuar con numerosos sustratos orgánicos para producir ROS, no es sorprendente que el humo del cigarrillo aumente el nivel de ROS de la saliva. Sin embargo, además de los radicales contenidos en el humo del cigarrillo, la formación significativa de radicales, así como también la producción directa de ROS, puede surgir de la respuesta inflamatoria provocada por el humo del cigarrillo, lo que conduce a un aumento en los niveles de neutrófilos y macrófagos. (Messner y Bernhard, 2014; Messner B, Bernhard D, "Smoking and cardiovascular disease. Mechanisms of endothelial dysfunction and early atherogenesis," Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2014, 34:509-15). Se midió la capacidad antioxidante de la saliva no tratada de nuestros voluntarios, que después fumaron un cigarrillo, tras lo cual se recogió su saliva nuevamente. Se midió el cambio en el nivel de capacidad antioxidante de la saliva mediante el uso del humo de un cigarrillo control. Se repitió el mismo ejercicio con diferentes filtros que contienen tanto solo monoalginita y en cuatro combinaciones diferentes de alginita con - piel y semilla de uva (GSS), alginita - óxido de Al especial, alginita - zeolita alginita - carbón de los mismos filtros en una mezcla 50-50 %. Todas las combinaciones de filtros con alginita produjeron una disminución significativamente menor de la capacidad antioxidante de la saliva en comparación con el filtro control. La alginita sola produce una diferencia significativa de la capacidad antioxidante en comparación con el control, pero a todos los cigarrillos combinados les fue significativamente mejor que a la alginita sola, una prueba clara de que la alginita y las combinaciones que se asocian actúan sinérgicamente.

El uso de un filtro de alginita causó una formación de ROS significativamente menor del suero sanguíneo. El experimento que demuestra esto fue similar al experimento de la saliva, pero se realizó con suero sanguíneo. El suero en sí mismo tiene una determinada concentración de radicales libres. Aunque el suero en sí mismo tiene una determinada concentración de radicales libres, el humo del cigarrillo provoca un aumento en el nivel de radicales libres. Se estima que hay más de 1014 radicales libres por bocanada de humo del cigarrillo (Church y Pryor, 1985). Dado que los radicales libres pueden interactuar con numerosos sustratos orgánicos para producir ROS, no es sorprendente que el humo del cigarrillo disminuya la capacidad antioxidante del suero. Sin embargo, además de los radicales contenidos en el humo del cigarrillo, la formación significativa de radicales, así como también la producción directa de ROS, puede surgir de la respuesta inflamatoria provocada por el humo del cigarrillo que conduce a aumento en los niveles de neutrófilos y macrófagos. (Messner y Bernhard, 2013). Se midió la capacidad antioxidante del suero no tratado. Después se usó nuestra máquina de fumar para canalizar todo el humo del cigarrillo a través de un tubo de suero. Se midió el cambio de la capacidad antioxidante del suero mediante el uso del humo de un cigarrillo control. Se repitió el mismo ejercicio con diferentes filtros que contienen tanto monoalginita sola y una combinación de alginita con cuatro materiales de filtración diferentes, es decir, alginita - piel y semilla de uva (GSS), alginita - óxido de Al especial, alginita - zeolita, alginita - carbón de los mismos filtros. Todos los filtros que contienen alginita produjeron una disminución significativamente menor de la capacidad antioxidante del suero en comparación con el filtro control.

El uso de alginita produjo humo que provocó menos daño endotelial. Las células que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos se denominan células endoteliales. Estas células tienen un papel importante en la protección de estos vasos. Una vez que se daña el endotelio, lo que a menudo se denomina disfunción endotelial, aumentan los riesgos de enfermedad cardiovascular. Dado que el humo, cuando sale del pulmón a través de los alvéolos, ingresa al torrente sanguíneo, se produce la exposición del endotelio al humo y conduce inicialmente a una disfunción endotelial, bien conocida por ser una primera etapa crucial en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares que se relacionan con fumar (Ambose y Barua, 2004; Ambrose JA, Barua RS, "The pathophysiology of cigarette and cardiovascular disease. An update," J Am Coll Cardiol, 2004, 43:1731-7; Messner y Bernhard, 2014). Se midió el daño de las células endoteliales que se produce cuando las células endoteliales expuestas a humo total se comparan con las células no tratadas. Se produce un daño celular significativamente menor cuando la misma línea celular se expone al humo filtrado con alginita o a un humo filtrado con una combinación que contiene alginita.

El uso de alginita también resultó en humo que causó menos daño en el epitelio pulmonar. El epitelio pulmonar es la primera línea de defensa con respecto a los tóxicos inhalados. Se sabe que las células epiteliales alveolares del pulmón se dañan por la exposición al humo e incluso hasta la muerte celular (Kosmider y otros, 2011; Kosmider B, Messier EM, Chu HW, Mason RJ, "Human alveolar epithelial cell injury induced by cigarette smoke," PLoS One, 2011, 6:e26059), que se evidencia por una disminución del número de células sanas en comparación con las células no tratadas. El humo filtrado que contenía alginita causó una disminución significativamente menor en el recuento de células sanas en comparación con un cigarrillo control. Dado que las células epiteliales necróticas secretan proteínas en el pulmón que desencadenan la inflamación, que eventualmente puede conducir a cáncer de pulmón o EPOC, protegen el epitelio por los filtros que contienen alginita y una combinación de cuatro materiales de filtración diferentes que se emparejan con, es decir, alginita con - piel y semilla de uva), alginita - óxido de Al especial, alginita - carbón de los mismos filtros es claramente un beneficio para la salud de los fumadores.

Los niveles de glutatión también fueron significativamente más altos con el humo del cigarrillo filtrado con alginita en comparación con el cigarrillo control. Ambas líneas de células epiteliales y endoteliales se expusieron a cigarrillos control y alginita y a una combinación de alginita con - piel y semilla de uva (GSS), alginita - óxido de Al especial, alginita - carbón de los mismos filtros, como alginita que contiene humo de cigarrillo filtrado. La determinación de los niveles de glutatión indicó niveles significativamente mayores de glutatión en las células expuestas al humo de los cigarrillos con filtro de alginita en comparación con el cigarrillo control. Dado que es bien sabido que el glutatión protege contra el estrés oxidativo (Rahman y MacNee, 2000; Rahman I, MacNee W, "Oxidative stress and regulation of glutathione in lung inflammation," Eur Respir J, 2000, 16: 534-54), esto significa que los filtros que contienen alginita protegen mejor el mecanismo de defensa autóctono del pulmón contra el daño del tejido pulmonar inducido por el estrés oxidativo que el cigarrillo control.

El humo filtrado con alginita causó menos daño en los tejidos pulmonares y causó menos inflamación en comparación con el humo del cigarrillo control. Se ha construido un tejido pulmonar tridimensional, designado como esferoides, a partir de células humanas con un perfil conocido, específicamente, células epiteliales pulmonares, fibroblastos, células endoteliales y macrófagos. La construcción tridimensional permite que las células desarrollen una organización funcional, similar a la que se encuentra en sus contrapartes in vivo. Los modelos 3D ofrecen un modelo experimental mucho mejor para simular el entorno in vivo que los sistemas convencionales de monocultivomonocapa (2D). El perfil bioquímico de un cultivo de tejidos en 3D es sorprendentemente similar al del organismo vivo. Los esferoides 3D reaccionan a los estímulos externos de manera similar al tejido pulmonar periférico vivo. Su respuesta inflamatoria es casi idéntica y también producen surfactante. Cuando estos esferoides 3D se expusieron al humo filtrado del cigarrillo a través de nuevos filtros de cigarrillos de alginita, el nivel de las citocinas IL-8 e IL-6, que se conocen como mediadores inflamatorios, se expresó en un grado significativamente menor en comparación con los cigarrillos control.

Como se mencionó anteriormente, la alginita se puede usar en los filtros de la invención sola o en combinación con otras sustancias que se usan en los filtros de cigarrillos antes de la fecha de presentación de la presente invención. Tales materiales, así como también su preparación y uso, son conocidos por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, cuando con respecto a los filtros de cigarrillos se mencionan "carbón" o "uva" o "componentes de la uva", se refieren al carbón activado y la semilla de uva y la ralladura de piel, aunque, a partir de la técnica anterior, es evidente para un experto en la técnica que los componentes de la uva también pueden estar presentes en otras formas. Estos componentes, así como también su disponibilidad, también son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La presente invención se describe en la presente con más detalle a través de los siguientes ejemplos. Los Ejemplos son solo para propósitos ilustrativos. A partir de los Ejemplos, una persona experta en la técnica comprenderá fácilmente que la alginita incluso sola tiene características de filtrado significativamente mejoradas con respecto a los materiales de filtración conocidos. Además, los ejemplos que contienen datos sobre combinaciones que contienen alginita y determinados materiales de filtración que pertenecen al estado de la técnica dejarán claro para un experto en la técnica que la alginita actúa sinérgicamente con otros materiales de filtrado. Con respecto a tales materiales nos referimos, por ejemplo, también a los captadores de radicales libres que se describen en el documento WO 2010/125412 que se menciona anteriormente.

Ejemplo 1.: El uso de alginita causa un aumento significativamente menor en el estado antioxidante de la saliva y el suero - Experimentos de la Universidad Tecnológica de Budapest (BUT)

El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de diferentes filtros sobre la capacidad del humo del cigarrillo para alterar el estado antioxidante de las muestras (suero y saliva). Las mediciones de las muestras de suero se llevaron a cabo con el ensayo RANDOX® TAS. Las muestras de suero se prepararon mediante la reconstitución del suero liofilizado, que se midió después de la reconstitución (blanco) o después de que el humo del cigarrillo que se filtró se burbujeara a través de él. Se midió el estado antioxidante total de la saliva antes y después de fumar cigarrillos convencionales o experimentales equipados con filtros de acuerdo con la invención. Los datos adquiridos mediante nuestras mediciones podrían reflejar la capacidad de unión de los radicales libres y ROS de los filtros. Materiales y procedimientos

Mediciones del estado antioxidante con ensayo de bencidina y el Kit Randox® de estado antioxidante total (TAS) Las mediciones del estado antioxidante se llevaron a cabo mediante el ensayo de bencidina ampliamente aceptado y el kit Randox® de estado antioxidante total (TAS) disponible comercialmente. El ensayo de bencidina utiliza un sistema de generación de peróxido (peróxido de hidrógeno y peroxidasa) y un cromógeno sensible al peróxido (bencidina). Los peróxidos generados in situ reaccionan con el cromógeno para dar un compuesto intermedio con un pico de absorbancia a 620 nm detectable con un espectrofotómetro. Los antioxidantes presentes en la muestra compiten con el cromógeno en sus reacciones con los peróxidos y dificultan la generación de la señal detectable. Al comparar la formación de cromógeno detectable de las muestras con un control negativo sin antioxidantes presentes y con un control positivo con una concentración de antioxidante conocida, se puede estimar el estado antioxidante de las muestras.

Reactivos e instrumentos usados

Reactivo A (disuelto en agua purificada Tipo II)

- Cloruro de sodio 155 mM (Reanal, cat. No.24640-1-08-38)

- 25 mU/ml de peroxidasa de rábano picante (Sigma®, cat. No. 77332)

- 233 |^jM de diclorhidrato de bencidina (Sigma®, cat. No. B3383)

Reactivo B (disuelto en agua purificada Tipo II)

- 250 ^j M de urea-peróxido de hidrógeno (Sigma®, cat. No. 289132)

Muestras

Se tomaron muestras de saliva de 17 sujetos antes y después de fumar cigarrillos. Los voluntarios se reclutaron por los Laboratorios OF en la Universidad de Tecnología y Economía de Budapest. Cada voluntario se reportó entre las 8-9 am para recolectar saliva, fumar cigarrillos y recolectar saliva nuevamente. Cada mañana se fumaba un cigarrillo de prueba y se recogía saliva. Cada voluntario fumaba 4 cigarrillos diferentes (distinguidos por el filtro); dos entre el 4-7 de diciembre de 2015 y dos entre el 5-8 de enero de 2016. Se solicitó a los fumadores reportarse para fumar sin haber ingerido ningún alimento o líquido esa mañana y no haberse cepillado los dientes. La saliva se enfrió y se llevó para su evaluación dentro de las instalaciones, de los laboratorios BUT.

Las muestras de suero se reconstituyeron del suero liofilizado (Analyticon Contronorm® PLUS), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en agua purificada Tipo II. Las muestras de suero se midieron directamente (en blanco) o después de que el humo del cigarrillo que se filtró se burbujeara a través del suero por OptiFilter. Los cigarrillos se fumaron mediante el uso de la máquina de fumar lineal Filtrona SM302 de 8 puertos. Los cigarrillos se fumaron de acuerdo con la norma ISO 3308 con el 100 % de los orificios de ventilación del filtro bloqueados. El humo pasó a través de un filtro Cambridge (filtro de fibra de vidrio de 44 mm, número de art.: 80202851, Borgwaldt KC), y la fase gaseosa resultante se canalizó a través de un tubo de silicona y se burbujeó en un recipiente flexible (impactante) que contenía 1,5 ml de solución de suero. Después de cada cigarrillo, la almohadilla del filtro Cambridge se reemplazó por una nueva, después de cada cigarrillo, el tubo de silicona se reemplazó por uno nuevo. Los filtros se etiquetaron del 1-3.

Controles y herramientas de medición

- control negativo (agua purificada tipo II)

- control positivo (estándar de calibrador del kit Randox® de estado antioxidante total, no de cat. NX 2332)

- Kit Randox® de estado antioxidante total

- Espectrofotómetro (espectrofotómetro de microplacas Thermo Scientific ™ Multiskan ™ GO)

Procedimiento de ensayo de bencidina

Las mediciones se llevaron a cabo con el espectrofotómetro de microplacas que se describe anteriormente, las células se incubaron a 37 °C en una placa de 96 pocillos. La mezcla de reacción en la microplaca se preparó como sigue: Se pipetearon 5 |_il de muestra o control y 250 |_il de reactivo A en los pocillos. Después la mezcla se homogeneizó y después se leyó mediante el lector de microplacas. Se determinó una lectura de absorbancia inicial a A = 620 nm antes de la adición de 50 |_il de Reactivo B para iniciar la generación de peróxido, después de lo cual se determinaron las lecturas de absorbancia a A = 620 nm de 0 a 3 minutos. Los resultados de absorbancia se consideraron los valores de absorbancia que se miden a los 2,5 minutos. Todas las muestras y controles se almacenaron en hielo y cada muestra se midió en 3 pocillos paralelos para el análisis estadístico.

Procedimiento del kit Randox® de estado antioxidante total (TAS)

Las mediciones se llevaron a cabo de acuerdo con el manual suministrado mediante el uso de un espectrofotómetro de microplacas que se describe anteriormente. Mediante el uso de una microplaca en lugar de una cubeta, todos los volúmenes de reactivos que se requieren se redujeron en un factor de 4. Esto resultó en un volumen de reacción final de 305 |_il que resultó de la adición de 5 |_il de muestra o control, 250 |_il de Reactivo A y 50 |_il de Reactivo B como se describe en el manual.

Material de los cigarrillos

Los cigarrillos que se usaron en el experimento se proporcionaron por OptiFilter Zrt. Las especificaciones y la fabricación de los cigarrillos fueron las siguientes. Los Cigarrillos de Referencia Kentucky 3R4F se fabricaron y se ensamblaron por la Universidad de Kentucky, KY, EE.UU. Los cigarrillos de referencia se proporcionaron a OptiFilter Zrt de Hungría por Celanese Corporation, Narrows, VA, EE.UU. Los filtros de los cigarrillos se ensamblaron, y los cigarrillos de prueba se produjeron por OptiFilter Zrt. Las varillas de filtración CellFx se prepararon y se proporcionaron por Celanese Corporation. Estos contenían diferentes materiales de filtración, a veces mezclados. Celanese Corporation fabricó y proporcionó materiales de filtración de acetato adicionales con diferentes características de textura, que produce de esta manera diferentes valores de caída de presión. Las partes de acetato de 27 mm del filtro del Cigarrillo de Referencia Kentucky (KRC) 3R4F (2,9/41 000) se eliminaron y se desecharon. Las varillas de filtración, que se fabrican mediante la tecnología CellFx de Celanese, contenían diferentes materiales de relleno. Se introdujo una varilla de filtro seleccionada que encara la superficie de combustión del cigarrillo, y se seleccionó una parte de acetato adicional y se introdujo en el filtro, lo que asegura que el valor de caída de presión (resistencia a la aspiración total) del cigarrillo (ventilación del filtro cerrada) fue el mismo del valor de caída de presión del KRC (resistencia a la aspiración 170 mm H2O /- 2 %). Las varillas Celanese tenían 12 mm de largo. Las partes de acetato tenían 15 mm de largo. La longitud total del filtro fue de 27 mm.

Resumen de los filtros que se usaron en el experimento

Resultados

Durante la prueba que se llevó a cabo en saliva y suero se obtuvieron los siguientes resultados de prueba.

Experimento con suero

Muestra Estado de las Capacidad Alteración del estado

ERO antioxidante antioxidante

Suero 1 En blanco 33 % 67 %

Filtro 1 44 % 56 % -16 %

Filtro 2 47 % 53 % -21 %

Suero 2 En blanco 21 % 79 %

Filtro 3 30 % 70 % -11 %

La alteración en el estado antioxidante es mostrada en la Figura 1.

Las mediciones se llevaron a cabo en cinco repeticiones. Los resultados indican que el filtro 3 es superior al cigarrillo control (filtro 1).

Resultados de las mediciones de muestras de saliva con el ensayo de bencidina

La medición se llevó a cabo con 17 sujetos. Cada muestra que se recolectó de los sujetos se midió 3 veces.

Promedio de la disminución del estado antioxidante

Filtro 1 Disminución del estado antioxidante 29 %

Filtro 2 Disminución del estado antioxidante 33 %

Filtro 3 Disminución del estado antioxidante 12 %

Análisis estadístico del experimento con saliva.

- La evaluación del significado estadístico de los cambios del estado antioxidante antes y después de fumar los cigarrillos se realizó mediante el uso de la prueba de pares combinados de Wilcoxon (StatSoft-STATISTICA10). Los resultados se consideraron significativos para p<0,05.

El cambio del estado antioxidante del Filtro 1 antes y después de fumar es significativo. Los resultados que se obtienen de la prueba indican una fuerte diferencia estadística.

El cambio del estado antioxidante del Filtro 2 antes y después de fumar es significativo. Los resultados que se obtienen de la prueba indican una fuerte diferencia estadística.

No existe ningún cambio estadísticamente significativo del estado antioxidante del Filtro 3 antes y después de fumar; aunque existe una diferencia observable (p=0,065), no alcanza el umbral de significación estadística.

- La evaluación de la significación estadística de los cambios del estado antioxidante causados por fumar diferentes cigarrillos se realizó mediante el uso de la prueba de pares combinados de Wilcoxon (StatSoft -STATISTICA10). Los resultados se consideraron significativos para p<0,05.

El cambio del estado antioxidante entre el filtro 1 y el 2 no es significativo.

El cambio del estado antioxidante entre el filtro 1 y el 3 es significativo.

Representación de los resultados de la disminución del estado antioxidante mediante el uso de un diagrama de gráfico de caja

El diagrama de gráfico de caja relacionado de múltiples variables es mostrado en la Figura 2. Los puntos de datos periféricos son mostrados por separado (StatSoft - STATISTICA10).

Conclusiones

Nuestros resultados muestran que el humo del cigarrillo que pasó a través ya sea del Filtro 1 o el 2 redujo el estado antioxidante del suero de 15-20 %. El Filtro 3 resultó en una disminución significativamente menor de la capacidad antioxidante, en comparación con el control.

Las lecturas de absorbancia de las muestras de saliva se compararon con controles positivos y negativos para evaluar el estado antioxidante. Nuestros resultados indican que el humo del cigarrillo que pasó a través del Filtro 1 y el 2 redujo el estado antioxidante de la saliva en aproximadamente 30 %, lo que resultó ser estadísticamente significativo, mientras que el Filtro 3 mostró una disminución del 12 %, estadísticamente significativa en comparación con el cigarrillo control. Estos resultados son consistentes con aquellos de las mediciones de suero. Nuestros resultados muestran que los componentes de los filtros de la invención tienen un efecto significativo sobre la capacidad del humo del cigarrillo para cambiar el estado antioxidante de las muestras bajo las condiciones de ensayo que se describen.

Ejemplo 2.: El uso de alginita causa un aumento significativamente menor del estado antioxidante de la saliva y el suero - experimentos del Prof. Tibor Szarvas

El efecto sobre la saliva y el suero del humo del cigarrillo que se filtra por los filtros de la invención también se probó en el experimento adicional siguiente.

Materiales y métodos

Los cigarrillos que se usaron en el experimento fueron los Cigarrillos de Referencia Kentucky 3R4F, que se fabricaron y se ensamblaron por la Universidad de Kentucky, KY, EE.UU. Los cigarrillos de prueba se proporcionaron a OptiFilter Zrt de Hungría por Celanese Corporation, Narrows, VA, EE.UU. Los filtros de los cigarrillos se ensamblaron, y los cigarrillos de prueba se produjeron por OptiFilter Zrt. Las varillas de filtración CellFx se prepararon y se proporcionaron por Celanese Corporation. Estos contenían diferentes materiales de filtración, a veces mezclados. Celanese Corporation fabricó y proporcionó materiales de filtración de acetato adicionales con diferentes características de textura, que produce de esta manera diferentes valores de caída de presión. Las partes de acetato de 27 mm del filtro del Cigarrillo de Referencia Kentucky (KRC) 3R4F (2,9/41 000) se eliminaron y se desecharon. Las varillas de filtración, que se fabrican mediante la tecnología CellFx de Celanese, contenían diferentes materiales de relleno. Se introdujo, una varilla de filtro seleccionada que encara la superficie de combustión del cigarrillo, y se seleccionó una parte de acetato adicional y se introdujo en el filtro, lo que asegura que el valor de caída de presión (resistencia a la aspiración total) del cigarrillo (ventilación del filtro cerrada) fue el mismo del valor de caída de presión del KRC (resistencia a la aspiración 170 mm H2O /- 2 %). Las varillas Celanese tenían ya sea 10 mm o 12 mm o 15 mm de largo. Las partes de acetato tenían ya sea 17 mm o 15 mm o 12 mm de largo. La longitud total del filtro fue de 27 mm. Los cigarrillos que se equiparon con varillas de filtración CellFx que contienen diferentes materiales de relleno se midieron y se compararon con el control en esta evaluación biológica. Se usaron los siguientes filtros en los experimentos:

Configuración experimental

Los cigarrillos se fumaron en el laboratorio OF de la Universidad de Tecnología y Economía, Budapest, en una máquina de fumar lineal, Filtrona SM302 de 8 puertos de acuerdo con el protocolo ISO 3308. Los cigarrillos se fumaron con los orificios de ventilación del filtro bloqueados. El humo del cigarrillo pasó a través de un filtro Cambridge (filtro de fibra de vidrio de 44 mm, número de art.: 80202851, Borgwaldt KC), y la fase gaseosa resultante se canalizó a través de un tubo de silicona y se burbujeó en un recipiente de vidrio (impactante) que contenía 1,5 ml de solución de suero. Después de cada cigarrillo, la almohadilla del filtro Cambridge se reemplazó con una nueva, y después de cada cigarrillo, el tubo de silicona se reemplazó por uno nuevo.

Medición de la capacidad antioxidante del suero

Para la evaluación de la capacidad de unión a radicales libres de los nuevos filtros de cigarrillos experimentales se emplearon dos métodos:

1. ) Randox - kit de antioxidantes totales (que se obtiene de Randox Lab. Ltd., Crumlin, Reino Unido)

2. ) Ensayo de peróxido de HRP-bencidina

El suero control Contronorm Plus se suministró por Analyticon Biotechnologies AG, Alemania. Fumar cigarrillos y tratar el suero con humo se realizó en los laboratorios OF en la Universidad de Tecnología y Economía, Budapest, y el Dr. Szarvas realizó los ensayos de lectura en el Campus del Instituto Central de Investigación para la Física, en el Centro de Energía de la Academia de Ciencias de Hungría, Budapest. Se usaron reactivos recién preparados. El suero control se disolvió en 5 ml de agua bidestilada. Después que el humo del cigarrillo (1 cigarrillo) pasó a través de un filtro Cambridge, la fase gaseosa resultante se burbujeó en 1,5 ml de suero disuelto de acuerdo con el protocolo ISO 3308 con los orificios de ventilación del filtro bloqueados. A continuación, se mezclaron 20 |_il de suero tratado con 1 ml de Reactivo 1 (composición que se proporciona más abajo), se homogeneizó y la reacción inició con 200 |_il de Reactivo 2 (composición que se proporciona más abajo). El cambio de absorbancia se midió después de 3 minutos. La absorbancia del suero que burbujea se comparó con la absorbancia del suero control sin reaccionar. Se determinó un valor en blanco sin suero control mediante el uso de 20 |_il de agua bidestilada. También se llevaron a cabo mediciones en un lector de placas (parámetros: 5 |_il de suero, 250 |_il de reactivo R1, 50 |_il de reactivo R2).

Ensayo Randox para determinar el estado antioxidante total en suero

Principio del ensayo: El ABTS (2,2,'-Azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfonato) se incuba con una peroxidasa (metamioglobina) y H2O2 para producir el catión radical ABTS+. Este tiene un color azul verdoso relativamente estable, que se mide a 600 nm. Los antioxidantes en la muestra que se añade causan la supresión de este color, en un grado proporcional a su concentración.

Muestra: Suero control Contronorm.

Procedimiento

Longitud de onda: 600 nm

Cubeta: Camino de luz de 1 cm

Temperatura: 37 °C

Medición: contra el aire

Se mezcla agua bidestilada con 1 ml de reactivo R2. El estándar se mezcla con 1 ml de reactivo R2. La muestra se mezcla con 1 ml de reactivo R2. Cada solución se mezcla bien, se incuba para alcanzar la temperatura necesaria, y se lee la absorbancia inicial (A1). A cada solución se añaden 200 |_il de R3. La mezcla y el temporizador se inician simultáneamente. La absorbancia se lee después de exactamente 3 minutos (A2). El estado antioxidante total que se expresa en % se establece por la comparación del reactivo-valor del suero.

Ensayo de peróxido de HRP-bencidina

Reactivo 1: HRP (peroxidasa de rábano picante) 9000 U/L, clorhidrato de bencidina 233 pmol/L, cloruro de sodio 155 mmol/L,

Reactivo 2: Peróxido de carbamida 0,36 mmol/L

Solvente: Agua bidestilada

Instrumento: Espectrofotómetro UV-VIS, temperatura 25 °C

Se usaron reactivos recién preparados. El suero control se disolvió en 5 ml de agua bidestilada. Después de filtrar el humo del cigarrillo mediante el uso de un filtro Cambridge (1 cigarrillo), la fase gaseosa resultante se burbujeó en una cantidad de 1,5 ml de solución de suero de acuerdo con el protocolo ISO 3308. Los orificios de ventilación del filtro se bloquearon. A continuación se mezclaron 20 |_il de solución de suero tratado con 1 ml de Reactivo 1 y se homogeneizaron, y la reacción se inició con 200 |_il de Reactivo 2. El cambio de absorbancia a 620 nm se midió inmediatamente después de 3 minutos. La absorbancia del suero que burbujea se comparó con la absorbancia del suero control sin reaccionar. El resultado del blanco se obtuvo sin suero control mediante el uso de 20 |_il de agua bidestilada. Los resultados de los experimentos se resumen en las Tablas. También se llevaron a cabo mediciones en un lector de placas (parámetros: 5 |_il de suero, 250 |_il de reactivo R1, 50 |_il de reactivo R2).

Resultados

1. Ensayo de peróxido de HRP-bencidina

Abreviaturas Producción de Capacidad Mejora en Tipo radicales O antioxidante del comparación con reactivos ^{(% )} reactivo ^{(% )} el control ^{(% )} Cigarrillos de Referencia de Kentucky *RC 64,7 35.3

Varilla Celartse mono carbono (longitud 10 rtvn) Ce ríod-'O-C Sfc r <A ¿’j

Varilla Celanse Alginita-Carbono (longitud 10 mm) Ce Ron-' 0-AC. 37.3 62,7 73 Cavidad: 200 mg, Alginita-Uva (120 - 80 mg) Cuv 200- AG 33.2 61,8

Cavidad: AJ-O - Uva (33 - 66 mg) Cav-fOO-AIOG 59.1 40.9 16

Varilla Celanse Alginita-Uva (longitud 15 mm) tí» R o d -'5 -A ó j 64.3 34 Cavidad: Alginita-Uva

_{(75-75 mg)} Cav-1bO-AG> 44.7 55.3 ¿7

La capacidad antioxidante y la mejora en comparación con el control son mostradas en la Figura 3 y en la Figura 4 respectivamente.

2, comparación de los filtros de cavidad y CelFx de la invención en suero

Ensayo de peróxido de HRP-bencidina

Tipo Abreviaturas Producción de Capacidad Mejora en radicales O antioxidante del comparación con reactivos (%) reactivo (%) el contro) (%) Cigarrillos de Referencia de Kentucky KRC 76 24

^{Cavidad: 160 mg, AI-0 UVA ALGINITA Cav-160-}

_{+ ZEOLITA CARBONO AIOGAZC} 00 40 64

Cavidad: 160 mg, 50 % AJ-0 y 50 % Uva Cav-160-AIOG 65 36 47 Cavidad: 150 mg, 50 % Zeolita y 50 % Uva Cav-150-ZG 7-1 26 7 Cavidad: 150 mg, 50 % Alginita y 50 % Uva Cav-150-AG 45 55 129 Varilla Celanse de 15 mm: 50 % Alginita y 50 % Uva CelRod-15-AG ₆₉ 31 27 Varilla Celanse de 15 mm: 50 % Alginita y 50 % CelRod-15-AC 45 55 126 Carbono

La capacidad antioxidante y la mejora en comparación con el control son mostradas en la Figura 5 y en la Figura 6 respectivamente.

3, ensayo Randox

El experimento con suero se repitió con la metodología del kit de antioxidantes Randox. Los resultados son mostrados más abajo.

Muestras Abrevia­ _Absor- ^{Producción de} Capacidad ^{Disminución de Mejora en} turas ^{bancia radicales O} antioxidante ^{la capacidad comparación con reactivos (%)} del reactivo antioxidante el control (%) del suero (%)

(%)

Reactivo (Randox) 0,256 100

Estándar de Calibración 0.005 1,9 ^98.1

Suero Suero 0,136 53.1 46.9

Cigarrillos de Referencia de Kentucky KRC 0.151 58,9 _{41,1 12}

Varilla Celanse de 12 mm: 50 % CelRod- _{0.123 48,04 51.96 -11 187} Alginita y 50 % Uva 12-AG

Varilla Celanse de 12 mm: Carbono ^CelRod- _12-C 0,154 60.1 39.9 15 -21 Cavidad 200 mg: Alginita-Uva (120- Cav-200- _{80 mg) 0.145 53.9 46.1 2 86}

_AG

La capacidad antioxidante, el cambio de capacidad antioxidante para controlar el suero y el cambio de capacidad antioxidante para el Cigarrillo Kentucky son mostrados en la Figura 7, la Figura 8 y la Figura 9 respectivamente. Los resultados del suero con la metodología Randox confirmaron que los filtros de la invención, tanto en estructuras CellFx como en la cavidad, mejoran significativamente el estado antioxidante que se desencadena por el humo del cigarrillo en fase gaseosa. Teniendo en cuenta que el humo del cigarrillo entra en la corriente sanguínea segundos después de la inhalación, el uso del filtro de la invención puede resultar en un estado del endotelio más saludable en los fumadores.

Medición de la capacidad antioxidante de la saliva

Para evaluar el cambio de estado de radicales libres de la saliva después de fumar y comparar diferentes cigarrillos con filtro se midieron y compararon los cambios que se desencadenan de la saliva del fumador.

Materiales y métodos

Los cigarrillos que se usaron en el experimento fueron los Cigarrillos de Referencia Kentucky 3R4F, que se fabricaron y se ensamblaron por la Universidad de Kentucky, KY, EE.UU. Los cigarrillos de prueba se proporcionaron a OptiFilter Zrt de Hungría por Celanese Corporation, Narrows, VA, EE.UU. Los filtros de los cigarrillos se ensamblaron, y los cigarrillos de prueba se produjeron por OptiFilter Zrt. Las varillas de filtración CellFx se prepararon y se proporcionaron por Celanese Corporation. Estos contenían diferentes materiales de filtración, a veces mezclados. Celanese Corporation fabricó y proporcionó materiales de filtración de acetato adicionales con diferentes características de textura, que produce de esta manera diferentes valores de caída de presión. Las partes de acetato de 27 mm del filtro del cigarrillo de referencia Kentucky (KRC) 3R4F (2,9/41 000) se eliminaron y se desecharon. Las varillas de filtración, que se fabrican mediante la tecnología CellFx de Celanese, contenían diferentes materiales de relleno. Se introdujo, una varilla de filtro seleccionada que encara la superficie de combustión del cigarrillo, y se seleccionó una parte de acetato adicional y se introdujo en el filtro, lo que asegura que el valor de caída de presión (resistencia a la aspiración total) del cigarrillo (ventilación del filtro cerrada) fue el mismo del valor de caída de presión del KRC (resistencia a la aspiración 170 mm H2O /- 2 %). Las varillas Celanese tenían ya sea 10 mm o 12 mm o 15 mm de largo. Las partes de acetato tenían ya sea 17 mm o 15 mm o 12 mm de largo. La longitud total del filtro fue de 27 mm. Los cigarrillos que se equiparon con varillas de filtración CellFx que contienen diferentes materiales de relleno se midieron y se compararon con el control en esta evaluación biológica. Configuración experimental

Se tomaron muestras de saliva de 38 sujetos antes y después de fumar cigarrillos. Los voluntarios se reclutaron por los laboratorios OF en la Universidad de Tecnología y Economía de Budapest. Cada voluntario se reportó entre las 8 y las 9 de la mañana para recolectar saliva, fumar cigarrillos y recolectar saliva nuevamente. Cada mañana se fumaba un cigarrillo de prueba y se recolectaba saliva de él. Cada voluntario fumó 6 cigarrillos diferentes (que se diferencian por el filtro) entre el 19 de octubre - 20 de noviembre de 2015. Se solicitó a los fumadores reportarse para fumar sin ingerir ningún alimento o líquido esa mañana y sin cepillarse los dientes. La saliva se enfrió y se llevó para su evaluación a los laboratorios de ^k F^k I.

Ensayo de peróxido de HRP-bencidina

Reactivo 1: HRP (peroxidasa de rábano picante) 9000 U/L, clorhidrato de bencidina 233 |_imol/L, cloruro de sodio 155 mmol/L,

Reactivo 2: Peróxido de carbamida 0,36 mmol/L

Solvente: Agua bidestilada

Instrumento: Espectrofotómetro UV-VIS, temperatura 25 °C

Se usaron reactivos recién preparados. El control se disolvió en 5 ml de agua bidestilada. Se recolectó la saliva que se recolectó de los voluntarios. A continuación se mezclaron 20 |_il de solución de saliva tratada con 1 ml de Reactivo 1 y se homogeneizaron, y la reacción se inició con 200 |_il de Reactivo 2. El cambio de absorbancia a 620 nm se midió inmediatamente después de 3 minutos. La absorbancia de la saliva que se recolectó después de fumar se comparó con la absorbancia de la saliva control sin reaccionar. El resultado del blanco se obtuvo sin saliva control mediante el uso de 20 |_il de agua bidestilada. Los resultados de los experimentos se resumen en las Tablas.

El estudio implicó a 38 voluntarios de acuerdo con lo siguiente:

Resultados

Los resultados del ensayo son mostrados en la Figura 10 y en la Figura 11 en donde en la Figura 11. Cigarrillo 1 = Kentucky Ref, Cigarrillo 2 = Varilla de carbón, Cigarrillo 3 = Varilla Alg-Uva, y Cigarrillo 4 = Cavidad Alg-Uva Resumen de los filtros que se usaron en el experimento

Saliva Descripción del filtro Abreviatura

Cigarrillo de Referencia Control

Filtro 1 Kent. Reí.

de Kentucky

Filtro 2 Varilla Celanse de 12 mm: Carbono CelRod-12-C

Filtro 3 Varilla Celanse de 12 mm: 50 %

CelRod-12-AG

Alginita y 50 % Uva

Filtro 4 Cavidad Alginita Uva 200 mg 50- Cav-200-AG

50%

Resultados

Cambio en la capacidad antioxidante

CELROD- CELROD- CAV-200-

KRC

12-C 12-AG AG

41,7 42,2 16,9 11,9

Conclusión

Nuestros experimentos con suero confirmaron que los filtros de la invención, tanto en estructuras CelIFx como en la cavidad, mejoran significativamente la capacidad antioxidante que se desencadena por el humo del cigarrillo. Teniendo en cuenta que el humo del cigarrillo entra en la corriente sanguínea segundos después de su inhalación, creemos que estos datos sugieren que los filtros de la presente invención pueden contribuir a un estado del endotelio más saludable en los fumadores. Nuestros experimentos con saliva confirmaron que los filtros de la invención, tanto en estructuras CellFx como en la cavidad, mejoran significativamente la capacidad antioxidante en la boca. Creemos que esto puede contribuir a una mucosa más saludable en los fumadores.

Ejemplo 3.: Efecto de la composición del filtro del cigarrillo sobre la muerte inducida por humo de células endoteliales y epiteliales.

El humo del cigarrillo es una combinación compleja químicos que se caracterizan por altos niveles de oxidantes. Números crecientes de artículos muestran que el humo del cigarrillo induce la activación de las células endoteliales vasculares pulmonares, lo que se asocia con la pérdida de la función de barrera endotelial. Esta pérdida es un sello distintivo de la disfunción endotelial. En este proceso el estrés oxidativo inducido por el humo del cigarrillo conduce al daño de las células endoteliales, lo que permite la penetración de monocitos y macrófagos activados. El daño a la barrera endotelial puede incluso constituir un elemento temprano de lesión pulmonar en respuesta a la exposición al humo del cigarrillo.

También se ha demostrado que el humo del cigarrillo induce la apoptosis del tejido alveolar pulmonar mediante la apoptosis de sus células epiteliales, lo que contribuye al desarrollo de enfermedades pulmonares crónicas tal como el enfisema. Aunque todos los tipos de células dentro del pulmón se pueden dañar por el daño oxidativo, las células epiteliales son el principal objetivo de la lesión oxidativa ya que constituyen la primera línea de defensa en el pulmón. Por lo tanto, no es sorprendente que la lesión del epitelio por el humo del cigarrillo sea un proceso importante en la patogénesis de las enfermedades pulmonares que se asocian con fumar.

Numerosos estudios han demostrado que los componentes del humo altamente reactivos, los carcinógenos volátiles, y las especies reactivas del oxígeno (ROS) que se derivan del humo del cigarrillo y las células que se dañan por el humo del cigarrillo contribuyen a la lesión pulmonar que implica una lesión epitelial mediante la muerte celular y una producción adicional de ROS en las células epiteliales activadas. Por lo tanto, la protección del epitelio de lesiones por el humo del cigarrillo se considera fundamental para el tratamiento de numerosas enfermedades pulmonares que se asocian con fumar cigarrillos. Nuestras investigaciones demostraron que la composición de los filtros de cigarrillos puede ser importante para modificar el efecto del humo del cigarrillo en la muerte inducida de las células epiteliales, que representan el primer encuentro de la línea celular con el humo del cigarrillo, así como también el daño a las células endoteliales. Los filtros que podrían eliminar de forma más efectiva los componentes del humo del cigarrillo que tienen el potencial de daño más alto en las células epiteliales, así como también en las células endoteliales, podrían reducir el daño pulmonar inducido por el humo del cigarrillo.

Materiales, Sujetos y Métodos

Los cigarrillos que se usaron en el experimento fueron los Cigarrillos de Referencia Kentucky 3R4F, que se fabricaron y se ensamblaron por la Universidad de Kentucky, KY, EE.UU. Los cigarrillos se proporcionaron a OptiFilter Zrt de Hungría por Celanese Corporation, Narrows, VA, EE.UU. Los filtros de los cigarrillos se ensamblaron y los cigarrillos de prueba se produjeron por OptiFilter Zrt., las varillas de filtración CellFx se prepararon y se proporcionaron por Celanese Corporation. Estos contenían diferentes materiales de filtración, a veces mezclados. Celanese Corporation fabricó y proporcionó materiales de filtración de acetato adicionales con diferentes características de textura, que produce de esta manera diferentes valores de caída de presión. Las partes de acetato de 27 mm del filtro del Cigarrillo de Referencia Kentucky (KRC) 3R4F (2,9/41 000) se eliminaron y se desecharon. Las varillas de filtración, que se fabrican mediante la tecnología CellFx de Celanese, contenían diferentes materiales de relleno. Se introdujo una varilla de filtro seleccionada que encara la superficie de combustión del cigarrillo, y se seleccionó una parte de acetato adicional y se introdujo en el filtro, lo que asegura que el valor de caída de presión (resistencia a la aspiración total) del cigarrillo (ventilación del filtro cerrada) fue el mismo del valor de caída de presión del KRC (resistencia a la aspiración 170 mm H2O /- 2 %). Las varillas Celanese tenían ya sea 10 mm o 12 mm o 15 mm de largo. Las partes de acetato tenían ya sea 17 mm o 15 mm o 12 mm de largo. La longitud total del filtro fue de 27 mm. Los cigarrillos que se equiparon con varillas de filtración CellFx que contienen diferentes materiales de relleno se midieron y se compararon con un control en esta evaluación biológica.

Las células endoteliales desempeñan un rol fundamental en el desarrollo de la EPOC, debido a que la función de barrera de las células endoteliales es esencial para una función pulmonar saludable; por lo tanto, la pérdida de la función de la barrera endotelial puede contribuir a la infiltración de leucocitos, signo característico de enfermedades pulmonares que incluyen a la EPOC. La muerte celular inducida por el humo y la inflamación en las células endoteliales contribuyen al desarrollo de la EPOC. Aquí mostramos que mediante el uso de diferentes composiciones de filtros de cigarrillos podemos modificar la composición del humo y podemos atenuar los efectos biológicos dañinos. La Figura 2 muestra que el humo de los filtros que contienen la mezcla de Alginita/Zeolita/Carbón/Uva es menos dañino para las células endoteliales.

Las células epiteliales son componentes importantes del tejido pulmonar y tienen un rol significativo en el desarrollo del cáncer de pulmón y la EPOC. Mediante el uso de la línea celular epitelial pulmonar A549 demostramos que los filtros que contienen la mezcla de Alginita/Zeolita/Carbón/Uva reducen significativamente la muerte de las células epiteliales lo que posiblemente conduce por tanto a una disminución del riesgo de la EPOC. Los resultados mostraron que los filtros de la invención que contienen la mezcla de Alginita/Zeolita/Carbón y Uva restan algunos componentes del humo y, por eso causan menos daño en las células epiteliales y endoteliales del pulmón.

La protección de las células epiteliales y endoteliales puede contribuir a la atenuación de la EPOC inducida por el humo del cigarrillo y al desarrollo de otras enfermedades respiratorias.

Preparación del extracto de humo del cigarrillo.

La preparación del extracto de humo del cigarrillo se realizó como se describió anteriormente (Chen y otros; Chen ZH, Lam HC, Jin Y, Kim HP, Cao J, Lee SJ, Ifedigbo E, Parameswaran H, Ryter SW, Choi AM. Autophagy protein microtubule-associated protein 1 light chain-3B (LC3B) activates extrinsic apoptosis during cigarette smoke-induced emphysema. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2 de noviembre de 2010; 107 (44): 18880-5). Para la preparación del extracto de humo del cigarrillo, se fumaron cigarrillos con filtro de referencia de investigación Kentucky 3R4F (Instituto de Investigación del Tabaco, Universidad de Kentucky, Lexington, KY) mediante el uso de una bomba peristáltica (VWR International) mediante el uso de los diferentes tipos de filtros. Se recolectó todo el humo. Cada cigarrillo se fumó en 4 minutos con una colilla de 15 mm restante y se burbujeó a través de 7,5 ml de medio de crecimiento celular mediante un tubo de silicona. Esta solución, que se considera como extracto de humo del cigarrillo de 100 % de fuerza, se ajustó a un pH de 7,45 y se usó dentro de los 15 minutos después de la preparación. Después de fumar cada cigarrillo el tubo de silicona se reemplazó por uno nuevo.

Cultivos celulares HUVEC y A549 y tratamientos.

Las células HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) se obtuvieron de Lonza (Anaheim, CA, EE.UU.) número de cat.: C2519A, y se cultivaron en un medio de crecimiento endotelial (Lonza, Anaheim, CA, EE.UU.) en una atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5 %. Para los análisis de muerte celular, se sembraron por pocillo 5 x 103/pocillo de HUVEC en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento endotelial que contiene factores de crecimiento y suero al 2 %. Antes de cada experimento, el medio se reemplazó por medio fresco que no contenía factor de crecimiento y que contenía suero al 1 % y se incubaron con extracto de humo al 10 % por 24 horas.

Las células epiteliales basales de adenocarcinoma alveolar humano A549 se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (ECACC) (línea celular: A549, número de cat.: 86012804). Las células A549 se cultivaron en medio DMEM que contenía FCS al 10 % en una atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5 %. Para los análisis de muerte celular, se sembraron células A5495 x 103/ pocillo en placas de 96 pocillos en medio DMEM que contenía FCS al 10% y se trataron con extracto de CS al 10 % durante 24 horas.

Ensayos de Viabilidad Celular

Ensayo de MTT

Las células se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad inicial como se proporciona en las Figuras y se cultivaron durante la noche antes del tratamiento con humo. Después del período de incubación, se eliminaron los medios y se reemplazaron por 4 h con RPMI que contenía una cantidad adecuada de la solución de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Chemicon Inc., El Segundo, CA) (14). La reacción de MTT se terminó mediante la adición de HCl al medio a una concentración final de 10 mM. La cantidad de colorante azul formazán insoluble en agua que se forma de MTT fue proporcional al número de células vivas y se determinó con un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Anthos Labtech 200 a una longitud de onda de 550 nm después de disolver el precipitado azul formazán en SDS al 10 %. Todos los experimentos se realizaron en al menos 6 réplicas y se repitieron tres veces.

Ensayo de sulforrodamina B (SRB).

Las células se incubaron en placas de 96 pocillos por 24 horas como se describió anteriormente. El medio de cultivo se desechó después y las células se fijaron in situ mediante la adición de 100 |_il de ácido tricloroacético al 10 % (p/v) frío y se incubaron por 30 min a 4 °C. El sobrenadante se desechó, y las placas se lavaron cinco veces con agua del grifo y se secaron al aire por 24 horas. Se añadió una solución de SRB (100 |_il) al 0,4 % (p/v) en ácido acético al 1 %, y las placas se incubaron por 20 min a temperatura ambiente. Después de teñir, se eliminó el tinte que no se unió lavando cinco veces con ácido acético al 1 %, y las placas se secaron al aire. El tinte que se unió se solubilizó posteriormente con (200 |_il) Tris 10 mM (pH 10,5), y se leyó la absorbancia en un lector de placas de 96 pocillos a 560 nm restando la medición del fondo a 600 nm mediante el uso de un sistema de detección multimodo Promega Glomax.

Resultados: efecto del humo sobre el epitelio pulmonar y las células endoteliales humanas

Como se indicó, las células epiteliales pulmonares desempeñan un rol fundamental en el desarrollo de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Los cambios en la composición del filtro del cigarrillo podrían producir potencialmente humo que reduciría la muerte de las células epiteliales en comparación con el humo de un cigarrillo convencional. Por lo tanto, analizamos el rol de diferentes composiciones de filtros en la muerte de células epiteliales inducida por humo. La Figura 1 muestra los efectos de diferentes composiciones de filtro sobre la muerte celular en células a 549. Los resultados mostrados en la Figura 1 se obtuvieron mediante el uso de extracto de humo al 10 % que se aplica a los cultivos celulares. Sin embargo, es probable que los resultados mediante el uso de una concentración de humo al 10 % sean más razonables debido a que el aumento de la concentración de humo mostró el efecto proliferativo del humo del cigarrillo. Los datos de la Figura 12 indican que tres filtros de la invención que contienen filtros de alginita/zeolita/piel de uva y molienda de semillas (GSSG), alginita/GSSG y alginita/carbón reducen significativamente la muerte inducida por humo de las células epiteliales A549.

La Figura 13 muestra los efectos de diferentes composiciones de filtro sobre la muerte celular inducida por humo de células endoteliales de la vena umbilical humana principal (HUVEC). Aquí usamos 4 cigarrillos para cada medición para cada filtro y realizamos 6 réplicas, y estos datos muestran que los filtros de la invención que contienen varios materiales de filtración en el filtro reducen significativamente la muerte de células endoteliales inducida por humo. Estos experimentos mostraron que los filtros de cigarrillos de la invención cambian significativamente el patrón de supervivencia de los tejidos tanto del epitelio como del endotelio que se exponen al humo del cigarrillo. Esto puede ser útil para combatir las enfermedades respiratorias y cardiovasculares que se desencadenan por el humo del cigarrillo.

Ejemplo 4.: Producción de citocinas inflamatorias que sigue a la exposición al humo del cigarrillo en un modelo de tejido pulmonar 3D humano

El humo del cigarro es un factor principal que se asocia con muchas enfermedades complejas del pulmón. La exposición al humo puede inducir respuestas inflamatorias a través de la liberación de citocinas inflamatorias. Los macrófagos desempeñan un rol importante en la respuesta inflamatoria y son fuentes particulares de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-6 (IL-6). La IL-8 es una citocina multifuncional, que actúa principalmente como un quimioatrayente de neutrófilos, mientras que la IL-6 se asocia con un metabolismo deficiente en pacientes con EPOC. Dado que ambas citocinas desempeñan un rol importante en muchas enfermedades pulmonares, tales como la EPOC, la fibrosis pulmonar o el asma; parece razonable investigar el efecto de los filtros de cigarrillos novedosos sobre los niveles de estas citocinas en nuestro sistema de modelo pulmonar complejo que se desarrolló recientemente. Los procesos inflamatorios en el pulmón se asocian con la producción de varias citocinas y el reclutamiento de neutrófilos en las vías respiratorias. Las IL-6 e IL-8 desempeñan roles cruciales en el inicio y extensión de reacciones inflamatorias. La exposición al humo del cigarrillo puede activar la inflamación mediante la potenciación de la secreción de citocinas proinflamatorias, lo que conduce a una inflamación crónica. El humo del cigarrillo también puede causar alteraciones a nivel de los órganos, tales como destrucción de las vías respiratorias y pérdida de las superficies de intercambio de gases, lo que puede conducir a la deficiencia de las funciones pulmonares. Todos estos efectos negativos pueden contribuir a la aparición de enfermedades graves, que incluyen la EPOC o el cáncer. Mediante el uso de cultivos de tejidos en 3D como método de prueba, se puede evaluar una combinación de células que actúan como una unidad de tejido funcional en comparación con células individuales. El tejido pulmonar comprende células epiteliales que tienen una arquitectura celular distinguida. Estas células tienen contactos célula-célula especializados, una morfología polarizada y se unen a una membrana basal subyacente. El mantenimiento de estas características es esencial para el funcionamiento normal del tejido, que incluye la proliferación, diferenciación, supervivencia y secreción. Las células crecen naturalmente en un ambiente 3D. La disposición espacial de las células dentro de este ambiente afecta como interactúan entre sí y su microambiente. A su vez, estas señales intracelulares afectan la morfología y un intervalo de funciones celulares. Por lo tanto, cuando se prueban candidatos a fármacos o agentes tóxicos mediante el uso de ensayos que se basan en células, los métodos de cultivo que se usan deben simular la forma representativa in vivo más natural posible. El método de crecimiento celular más natural que simula los tejidos para las aplicaciones de descubrimiento de fármacos es, posiblemente, el 3D. Las pruebas in vitro del humo del cigarrillo son complicadas. Se ha evaluado un gran número de líneas celulares, pero todas tienen sus propias limitaciones. La IL-8 y la IL-6 se pueden ser producir por varias células inflamatorias y pulmonares, pero la investigación de un tipo de célula en particular puede tergiversar el impacto general de la exposición al humo. Las células que crecen en cultivos celulares bidimensionales se usan habitualmente en varios tipos de pruebas farmacológicas, pero estas circunstancias in vitro son menos relevantes para la situación in vivo que en el caso de un sistema modelo tridimensional. Los cultivos de células pulmonares tridimensionales son más representativos de lo que ocurre in vivo, ya que tienen una arquitectura y un patrón de expresión que coinciden estrechamente con el pulmón humano. Como el pulmón es un órgano complejo, es necesario investigar los procesos biológicos en un sistema modelo complejo, dado que la disposición de las células pueda afectar la respuesta dada a un estímulo particular. El tejido pulmonar 3D de Humeltis combina múltiples tipos de células, que representan las células principales del tracto de las vías respiratorias.

Métodos

Las células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas humanas principales normales (SAEC) y los fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF) se obtuvieron de Lonza. Estas células se aislaron de donantes anónimos de diferentes sexos y edades. Se aislaron monocitos periféricos humanos mediante el kit de aislamiento MicroBead positivo para CD14 (Miltenyi Biotec). Para el cultivo en 3D las células SAEC y NHLF se mezclaron en una relación 1:1 (esferoides SN), y también se mezclaron monocitos humanos con estas células principales humanas (esferoides SNM). Las células se sembraron en una placa de fondo en U de 96 pocillos de baja unión. Los esferoides se trataron con extractos de humo del cigarrillo (CSE) por 48 horas antes de la medición. Los cigarrillos que se usaron en el experimento fueron los Cigarrillos de Referencia Kentucky 3R4F se fabricaron y se ensamblaron por la Universidad de Kentucky, KY, EE.UU. Los cigarrillos se proporcionaron a OptiFilter Zrt de Hungría por Celanese Corporation, Narrows, VA, EE.UU. Los filtros de los cigarrillos se ensamblaron, y los cigarrillos de prueba se produjeron por OptiFilter Zrt. Las varillas de filtración CellFx se prepararon y se proporcionaron por Celanese Corporation. Celanese Corporation fabricó y proporcionó materiales de filtración de acetato adicionales con diferentes características de textura, que produce de esta manera diferentes valores de caída de presión. Las partes de acetato de 27 mm del filtro del Cigarrillo de Referencia Kentucky (KRC) 3R4F (2,9/41 000) se eliminaron y se desecharon. Las varillas de filtración, que se fabrican mediante la tecnología CellFx de Celanese y que contenían diferentes materiales de relleno se introdujeron de forma que encara la superficie de combustión del cigarrillo. Se seleccionó una parte de acetato adicional y se introdujo en el filtro, lo que asegura que el valor de caída de presión (resistencia a la aspiración total) del cigarrillo (ventilación del filtro cerrada) fue el mismo del valor de caída de presión del KRC (resistencia a la aspiración 170 mm H2O /- 2 %). Las varillas Celanese tenían 12 mm de largo. Las partes de acetato tenían 15 mm de largo. La longitud total del filtro fue de 27 mm. Se fabricaron un total de dos filtros diferentes, y los KRC se equiparon con ellos. Se midió el humo de los cigarrillos que se equiparon con filtros de la presente invención, filtros CellFx que contienen diferentes materiales de relleno, y se comparó con un control en la evaluación biológica. La categorización de los cigarrillos fue la siguiente:

Cigarrillo 1: Cigarrillos de Referencia Kentucky KRC

Cigarrillo 2: Filtro con mono varilla de Carbón CelRod-12-C

Cigarrillo 3: Filtro Alginita/Varilla de uva CelRod-12-AG

El CSE se preparó mediante el burbujeo del humo de 2 cigarrillos a través de 10 ml de medio de cultivo celular a un flujo de aire constante que suministra una bomba de vacío Hydrotech (BioRad) por un período total de dos minutos. El medio que se expuso se filtró bajo condiciones estériles con un filtro de jeringa de 0,22 |_im. La dispersión de la luz de las partículas que se disolvieron no mostró diferencias significativas dentro de los intervalos de 320-350 nm. Se consideró que esta solución era 100 % E. El CSE se preparó dentro de 30 minutos para cada experimento. Se aplicó el CSE (0,5 %) a los cultivos de tejidos tridimensionales por 48 horas. Después de 48 horas las citocinas inflamatorias que se producen por los micro tejidos 3D se midieron en el medio sobrenadante mediante el kit de citocinas inflamatorias humanas BD Cytometric Bead Array (BD Biosciences). Este kit proporciona una medición cuantitativa del nivel de proteína IL-8 e IL-6 en el sobrenadante de cultivo de tejidos. El método se basa en microperlas fluorescentes que se conjugan de tamaño conocido y un reactivo de detección, que proporciona una señal proporcional a la cantidad de citocina que se une. Durante 3 horas de incubación, las microperlas de captura forman un complejo con la citocina del sobrenadante junto con el reactivo de detección. La intensidad de la fluorescencia se analizó con un citómetro de flujo FACS Canto II (BD Immunocytometry Systems, Erembodegem, Bélgica) con el programa BD FACS DIVA V6, y los datos se analizaron con el programa FCS Express V3. Los resultados representan la intensidad de fluorescencia media de las microperlas que se conjugan seguidas de la unión de IL-6 e IL-8.

Resultados

Para investigar la producción de citocinas inflamatorias en función del tipo de filtro, los esferoides se trataron con CSE de cigarrillos estándar y dos cigarrillos que contienen filtros diferentes por 48 horas. Los datos muestran que tanto la IL-8 como la IL-6 se redujeron en agregados que contienen macrófagos seguida del tratamiento con CSE de los cigarrillos con filtro número 3, lo que indica una capacidad reducida para iniciar una reacción inflamatoria. Las diferencias demostraron ser estadísticamente significativas para ambas citocinas.

La Figura 14 muestra la proteína IL-8 humana en sobrenadantes de macrófagos que contienen esferoides pulmonares después de 48 horas en 3 agregados de tipo de celular (SAEC, fibroblastos y macrófagos).

La Figura 15 muestra la proteína IL-6 humana en sobrenadantes de macrófagos que contienen esferoides pulmonares después de 48 horas.

La disminución de los niveles de citocinas fue estadísticamente significativa solo en los agregados que contienen macrófagos y solo después de 48 horas. En los agregados que se forman solo por fibroblastos y células epiteliales principales (sin macrófagos) la reducción de los niveles de citocinas no fue significativa ni a las 24 ni a las 48 horas. El cigarrillo número 3 disminuyó los niveles de ambas citocinas al nivel que se determinó en el medio control.

Conclusiones

La IL-6 e IL-8 desempeñan roles cruciales en el inicio y en la propagación de reacciones inflamatorias. La exposición al humo del cigarrillo puede activar la inflamación mediante la causar del daño del tejido, lo que potencia la secreción de citocinas proinflamatorias, lo que puede provocar una inflamación crónica. Posiblemente, los cultivos de tejidos humanos en 3D muestren un gran parecido con los procesos bioquímicos y patológicos de los tejidos humanos in vivo. Con respecto a esto, puede ser razonable suponer que la reducción estadísticamente significativa de las citocinas que se investigaron en los agregados inmunológicamente activos (que contienen macrófagos), cuando el humo se filtra por el filtro número 3 también podría ser beneficioso en el entorno in vivo. Los datos se resumen en lo siguiente (SN significa agregados que contienen células epiteliales principales y fibroblastos, mientras que SNM significa agregados que contienen células epiteliales, fibroblastos y macrófagos):

Resumen

Los ejemplos anteriores demuestran claramente que la alginita es especialmente efectiva cuando se usa en filtros de cigarrillos sola o en combinación con otros componentes conocidos como se discutió anteriormente. Como características inesperadas y novedosas de la invención, el uso de alginita en los filtros de cigarrillos resultó en una cantidad significativamente menor de especies reactivas del oxígeno (ROS) de la saliva, una formación significativamente menor de ROS del suero sanguíneo, menos daño endotelial, menos daño en el epitelio pulmonar, nivel de glutatión significativamente más alto, menos daño en los tejidos pulmonares y menos inflamación en los tejidos pulmonares.

Las pruebas biológicas in vitro Las pruebas biológicas que se seleccionaron fueron bien elegidas porque tienen un vínculo claro y bien establecido con las vías biológicas in vivo que se han documentado como causantes de las principales enfermedades que se relacionan con fumar. Adicionalmente, en todos los casos se demostró que los filtros de la invención producían humo en fase gaseosa que era mucho menos dañino en las células in vitro pruebas que el humo que se produce por el filtro de referencia Kentucky. Estos son los resultados proporcionan pruebas convincentes de que los cigarrillos que se equiparon con estos filtros pueden disminuir los efectos actuales sobre la salud del tabaquismo.

Los ejemplos ilustraron adicionalmente que la alginita, incluso sola, tiene características de filtración significativamente mejores con respecto a los materiales de filtración conocidos, y que la alginita y los materiales de filtración que pertenecen a la técnica anterior actúan de forma sinérgica. Por lo tanto, aunque no todas las combinaciones que contienen se mencionan en los ejemplos, son evidentes para un experto en la técnica que cualquier combinación de alginita y materiales de filtración conocidos en el campo técnico particular tendrá las mismas propiedades.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. El uso de alginita para la filtración del humo del cigarrillo.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la alginita se usa en filtros de cigarrillos

3. El uso de alginita para la preparación de filtros de cigarrillos

4. El uso de la reivindicación 2 en donde la alginita se usa sola o en combinación con otras sustancias que se usan en los filtros de cigarrillos para reducir los efectos nocivos del humo del cigarrillo.

5. El uso de la reivindicación 4 en donde las otras sustancias se seleccionan del grupo que consiste en carbón activado o componentes de uva.

6. El uso de la reivindicación 5 en donde la otra sustancia es carbón activado.

7. El uso de la reivindicación 5 donde la otra sustancia es un componente o son componentes de la uva.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 en donde los componentes de la uva están en forma de pepita de uva y molienda de piel.

9. La alginita para el uso en la reducción del riesgo de daños por el humo del cigarrillo en humanos.

10. La alginita para el uso de la reivindicación 9 en donde la alginita se usa en forma de filtros de cigarrillos que contienen alginita.

11. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa menos ROS de la saliva.

12. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa menos ROS del suero.

13. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa menos daño a las células epiteliales.

14. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa menos daño a las células endoteliales.

15. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa un nivel de glutatión más alto.

16. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa menos daño en los tejidos pulmonares.

17. La alginita para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 en donde reducir el riesgo de daños significa menos inflamación en los tejidos pulmonares.