CN109310146A

CN109310146A - 含有藻类体的新型香烟过滤嘴

Info

Publication number: CN109310146A
Application number: CN201680086980.9A
Authority: CN
Inventors: T.萨瓦斯
Original assignee: High Quality Filter Research Co Ltd
Current assignee: High Quality Filter Research Co Ltd
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2036-04-25
Also published as: PL3448181T4; UA124235C2; CY1123924T1; WO2017187210A3; ES2857080T3; SI3448181T1; EP3448181A2; PL3448181T3; CO2018012685A2; BR112018071882B1; WO2017187210A2; HUE053012T2; BR112018071882A2; RS61542B1; PT3448181T; PH12018502265A1; KR20190021214A; CN109310146B; US20190281888A1; IL262614B

Abstract

本发明涉及香烟过滤嘴。本发明特别涉及新型香烟过滤嘴，其中使用之前未曾用于这一特殊领域的天然来源的材料。本发明更特别涉及可用于吸附香烟烟雾的有毒成分并降低在呼吸器官、心血管系统和粘膜上由香烟烟雾引发的组织损伤的香烟过滤嘴。本发明尤其涉及含藻类体的香烟过滤嘴。

Description

含有藻类体的新型香烟过滤嘴

发明领域

技术背景

吸烟是普遍的不良人类习惯，其已知造成严重和通常不可逆的健康损害。目前，吸烟是促进肺癌和慢性阻塞性肺病（COPD）发生的最有据可查的致病因素之一。由吸烟造成的健康损害在全世界产生严重的社会和经济问题。例如，仅在欧盟国家，吸烟的有害效应造成超过500.000人过早死亡。

大约50年前，U.S. Surgeon General办公室发表其关于吸烟和健康的首次报告（U.S. Department of Health, Education and Welfare, 1964）。这一报告估计普通吸烟者发生肺癌的几率是不吸烟者的9-10倍，而重度吸烟者的风险提高到大约20倍。此外，该报告指出吸烟是慢性支气管炎的主要原因并且在吸烟和肺气肿以及心血管疾病之间存在相关性。应该指出，慢性支气管炎和肺气肿现在被视为慢性阻塞性肺病（COPD）的两个方面。在过去50年间，U.S. Surgeon General办公室已经发表了许多关于吸烟和健康的报告，一些针对专门的课题，如戒烟、孕期吸烟和环境烟草烟雾。最新的报告在2014年发表 - 在首次报告后正好50年（U.S. Department of Health and Human Services, 2014）。在过去50年间，与吸烟有关的疾病列表已明显扩大。仅集中于癌症，除肺癌外现在存在与吸烟有关的许多类型的癌症，包括上呼吸道癌症（口咽、咽、气管和支气管）、胃癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠直肠癌和急性髓性白血病。此外，U.S. Surgeon General指出在过去50年间可能多达2千万美国人由于吸烟效应过早死亡。考虑到吸烟的明显有害效应，这些效应的减轻是巨大的健康问题，并且可用于减轻该问题的任何措施都显然值得研究。毫无疑问，最佳行动是停止吸烟。戒烟的益处众所周知（参见例如Fagerström, 2002）。但是，许多吸烟者选择不戒烟或发现太难戒烟。尽管戒烟是最有效的措施，但新技术的使用，如有效除去有害烟雾成分的新型过滤嘴可显著减轻烟草相关疾病。因此，可用于减轻吸烟的健康影响的任何措施都具有显著益处。毫无疑问，通过改良香烟减轻吸烟的健康影响的最明显尝试是通过添加香烟过滤嘴。但是，过滤嘴的使用还没有特别成功。

在香烟上添加过滤嘴的最早提议之一毫无疑问由Ernst Wynder作出，其是作为证实香烟烟雾与肺癌的相关性的最早科学家之一的流行病学家。在1988年发表的Wynder合著的早期研究评估过滤香烟吸烟者和非过滤香烟吸烟者之间的肺癌风险差异（Wynder和Kabat，1988）。这一研究考察在Kreyberg I (KI)和Kreyberg II (KII)癌症方面这两种类型的吸烟者之间的差异（Kreyberg命名法是当时实行的，KI肺癌包括鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌和小细胞肺癌，而KII肺癌仅包括肺腺癌）。对男性和女性都在KI肿瘤方面发现大约45-50%的降低，尽管都不是统计上显著的，对于KII肿瘤，在男性中仅观察到较弱差异，在女性中没有观察到差异。香烟过滤嘴在20世纪下半叶变得极受欢迎，美国在1950年有大约0.5%的香烟带过滤嘴出售，在1976年增加到88.5%（National Institute on Drug Abuse,1977）。目前全球出售的香烟接近100%是过滤嘴香烟。在过滤嘴的使用在美国快速增长的同一时期（1950-1976），机器测得的销售加权（sales-weighted）香烟焦油释放量从37 mg降至16 mg（Hoffmann D等人, 1996）。在这一时期焦油释放量的降低是两个趋势的结果。首先，如上所述，简单地为过滤嘴香烟用量的快速增长。其次是随时间经过递增的过滤嘴效率的结果。香烟过滤嘴在概念上相当简单，由可吸收香烟焦油和气相的给定材料的多孔柱塞构成。尽管一些早期过滤嘴使用纸纤维作为吸收材料，但目前绝大多数过滤嘴使用醋酸纤维素纤维。因此，过滤嘴简单地为使用外包装纸（overwrap）接合到香烟上的填充醋酸纤维素的纸管。可以通过提高过滤嘴中的醋酸纤维素质量和通过降低长丝直径实现提高的效率。但是，这两种方法都只能到此为止，因为香烟的吸阻最终变得足够大以致该产品对消费者而言不可接受。为解决这一问题几乎所有烟草公司采用的方法都是在过滤嘴外包装纸中引入穿孔。因此吸烟者吸入空气和烟雾的混合物。通气孔降低吸阻，并且通过吸入空气及烟雾，烟雾被稀释并降低烟雾成分的递送。通气程度越高，吸烟者吸入的空气量越大且烟雾量越小。尽管许多专家同意与无过滤嘴香烟相比过滤嘴香烟至少在一定程度上降低吸烟的风险，但降低焦油释放量（甚至低于正常香烟过滤嘴可实现的程度）的所谓低焦油香烟看起来没有带来健康益处。这一结论基于人口数据和流行病学研究。提出大量的数据，其记载了以下事实：吸烟者在抽吸“低焦油香烟”时显著补偿（compensate）以维持尼古丁水平或味道水平因此实际烟雾递送量高于机器测量值。此外，许多科学家表达了吸烟者会有意或无意堵塞通气孔，因此也显著增加烟雾递送的担忧（U.S. Department of Health and HumanServices, 2001）。这些担忧的一个切实结果在于至少在美国和欧盟不再允许烟盒标示机器测量的焦油和尼古丁量。尽管有这些问题，但仍然可以开发可减轻吸烟的健康影响的新型过滤嘴，特别是如果可开发不需要过滤嘴通气的此类过滤嘴。这样的过滤嘴可被设计为选择性除去令人担忧的特定气相和半挥发性烟雾组分。重要的是指出，烟雾由气相、半挥发物和微粒相构成。在所有三个相中都可发现在健康影响方面有据可查的成分。不存在能够选择性过滤微粒相成分的现有技术；但是，可以选择性过滤气相和半挥发组分。目前在商业应用中此类过滤嘴的一个优秀的实例是碳过滤嘴。几乎整个日本市场都由碳过滤嘴香烟构成，而大约50%的韩国吸烟者使用这些产品。在过滤嘴开发中已取得许多其它技术进步，但这些目前无一获得重大的商业应用。目前过滤嘴是在嘴端直接集成到香烟中的片段，以使香烟烟雾在进入气道和肺之前必须经过过滤嘴。目前全世界所有香烟中只有3%不带过滤嘴出售。尽管香烟过滤嘴可减少达到吸烟者的有害物质的量，这通常通过简单减少到达香烟嘴端的烟雾量实现。在多数情况下极少或没有选择性过滤。因此，研究人员对构建可选择性除去某些有害烟雾成分以减轻吸烟的健康后果的香烟过滤嘴非常感兴趣。

香烟烟雾含有许多反应性粒子，如低分子量羰基化合物、自由基、醌类、氰化氢、氮氧化物和芳胺，它们高度毒性、致突变和致癌。因此，选择性降低香烟烟雾中的这些物质的量可降低由吸烟造成的健康风险。

政府法规越来越要求更高的过滤效率以减少递送至吸烟者的烟草烟雾的量。使用目前可得的醋酸纤维素过滤嘴，可通过在过滤嘴中掺入更高浓度的粒子如活性炭或其它天然物质来实现一些选择性。但是，提高的微粒浓度改变吸烟者的抽吸特征。此外，过滤嘴中的活性炭粒子有助于降低香烟烟雾中的有害挥发性物质的量，但由于缺乏不成对电子，它们不能提供与自由基的不成对电子互补的所需附加电子。因此，碳不适合对抗自由基对各种组织的影响（其促成由香烟烟雾引发的炎症和体内的其它有害过程）。

香烟的一个重要性质是封闭压降（encapsulated pressure drop）。术语“封闭压降”或“EPD”是指在稳态条件下被气流穿过时香烟两端之间的静压差。较高EPD值意味着吸烟者必须在吸烟装置上用较大的力抽吸。

由于提高的传统过滤嘴效率提高过滤嘴的EPD，公众和因此制造商已缓慢地采用这些产品。因此，仍然有兴趣开发在除去主流烟草烟雾中的更高量的某些成分，如上文指出的成分以及一氧化碳和酚类的同时最低限度影响香烟的抽吸特征的改进的和更有效的过滤嘴。

在香烟过滤嘴制造中最常用的填料是具有每脱水葡萄糖单元大约2.5个醋酸基团的取代度的醋酸纤维素。在制造过程中，乙酸酯聚合物通常作为纤维丝束挤出并与一种或多种增塑剂（例如三乙酸甘油酯、聚乙二醇、甘油）混合。醋酸纤维素丝束法例如描述在授予Crawford等人的美国专利2,953,838和授予Crawford等人的美国专利2,794,239中。可将各种流体注入用于制造烟草烟雾过滤嘴的复丝纤维丝束。可以独自或与液体或气体载体组合用于丝束的这些流体可以是香料、丝束开松剂（tow blooming agents）、润滑剂、施胶溶液、整理（finish）组合物、增塑剂等。此类流体意在通过流体处理过的丝束赋予香烟烟雾所需的物理或风味特征。例如在授予Rivers的美国专利5,387,285中阐述了流体注入法。

形成过滤嘴元件的醋酸纤维素纤维通常用纤维整理组合物涂布。这样的组合物通常是由多种组分构成的水基乳状液。各组分可在纤维加工过程中或在由纤维形成的过滤嘴的随后使用过程中发挥特定作用。纤维整理组合物的典型组分包括润滑油以降低摩擦以使纤维可以无断裂地加工、抗静电剂以降低纤维上的静电积聚和乳化剂以抑制在加工过程中纤维制剂中的相分离。其它辅助组分可包括抗微生物剂、亲水剂或其它反应性化合物。在将纤维丝束组装成即用过滤嘴（filter-ready）材料后，可以施加增塑剂以软化纤维和形成纤维间粘结以使过滤嘴硬化到所需硬度/稠度。醋酸纤维素的表面化学和增塑剂可提供吸烟者广泛期望和接受的烟雾风味。某些其它过滤嘴设计/配方可提供不同的烟雾风味。迄今，非醋酸纤维素丝束过滤嘴尚未得到普遍认可，也没有获得商业上的成功。

现有技术状况具有涉及香烟过滤嘴和对其作出的各种改进的若干公开。

WO2013/1869838公开了包含含有纤维素酯短纤维、纸浆和水溶性阴离子聚合物的碱金属盐的滤棒的香烟过滤嘴。该滤棒具有2至100 µmol/克滤棒的碱金属含量。该水溶性阴离子聚合物可包含选自聚丙烯酸和具有羧基的多糖的至少一员。

日本专利3677309公开了具有纸结构并包含非卷曲纤维素酯短纤维和叩解纸浆（beaten pulp）的片材形式的香烟过滤嘴材料，其中叩解纸浆具有20至90°SR的Schopper-Riegler游离度的打浆度，并且非卷曲纤维素酯短纤维是具有1至10 mm的平均纤维长度和1至10旦的细度的短纤维。这一文献公开了在该片材的制备中，可以使用粘合剂（例如水溶性胶粘剂），只要其没有负面健康影响，也不降低烟草烟雾的味道和适口性，也不造成过滤嘴材料的分解。一般而言，粘合剂的量优选尽可能小（例如在材料总重量中不大于10重量%）。这一文献中的一个实施例描述了由非卷曲醋酸纤维素短纤维和叩解纸浆通过湿纸生产法形成的片材，其随后用羧甲基纤维素的水溶液（在干重基础上3重量%）喷涂。

日本专利申请公开7-75542公开了包含纤维素酯纤维的丝束和包含在该丝束中并粘合纤维的水溶性聚合物的香烟过滤嘴，该丝束已使用相对于100重量份丝束计不大于25重量份的水加工成滤棒。这一文献中的实施例包括通过将5重量%的羧甲基纤维素钠盐作为水溶性聚合物添加到打开的醋酸纤维素卷曲纤维丝束中并将打开的丝束进给到包装机中以用过滤嘴成形纸（filter wrap）包裹打开的丝束来获得香烟过滤嘴。

日本专利申请公开8-322539（专利文献3，JP-8-322539A）公开了包含由纤维素酯组合物和具有良好水分散性的粘合剂构成的非织造物的香烟过滤嘴，将该非织造物包成棒形式。这一文献中的实施例包括通过用空气流鼓吹带有醋酸纤维素短纤维的丝网以层压或沉积和用10重量%的羧甲基纤维素的5%水溶液喷涂丝网上的层压物、压制和干燥该湿层压物、对所得非织造物施以起皱辊（crepe roll）处理、然后包装该织物而制成的滤棒。

国际公开WO 2014/164492涉及降低烟雾物流中的一氧化碳和酚类浓度的烟雾过滤嘴。所述过滤嘴包括包含许多活性粒子、许多粘合剂粒子和布置在至少一部分活性粒子和粘合剂粒子上的活性涂层的多孔物质段，其中在多个接触点将活性粒子和粘合剂粒子粘合在一起；和过滤段。在一些情况下，过滤嘴可包括包含许多活性粒子和许多粘合剂粒子的多孔物质段，其中在多个接触点将活性粒子和粘合剂粒子粘合在一起而不用胶粘剂；和包含活性掺杂剂的过滤段。尽管这一烟雾过滤嘴可提供增强的结果，但其制备相当复杂并且用于实现所需过滤效果的材料昂贵。

在WO 2010/125412中描述了高效香烟过滤嘴。该香烟过滤嘴除香烟过滤嘴的常见组分外还包含拟薄水铝石（AlOOH.H₂O），和葡萄组分、虾青素和蔓越莓作为抗氧化剂。香烟过滤嘴的有利作用也归因于使用葡萄籽和皮碎粉（grist）形式的葡萄组分。WO 2010/125412的整个内容经此引用并入本文。

如上文提到，公知的是吸烟是重大的公众健康问题和促进肺癌和慢性阻塞性肺病发生的重要致病因素。因此，找出减轻香烟诱发的肺病的新技术具有相当大的益处。

因此，本发明的目标是提供具有属于现有技术状况的解决方案的优点但同时在尽可能最好的程度上消除它们的缺点的香烟过滤嘴。本发明的另一目标是提供与已知香烟过滤嘴相比进一步减少香烟烟雾的有害内容物的香烟过滤嘴。

令人惊讶地发现，如果在香烟过滤嘴中施加以前没有用于此目的的天然物质藻类体，可以成功地实现本发明的目标。

我们的实验表明，如果在过滤嘴中使用藻类体，可以实现与现有过滤嘴相比香烟烟雾中的有害物质量的显著降低。

发明详述

本发明涉及与已知香烟过滤嘴相比进一步减少香烟烟雾的有害内容物的香烟过滤嘴。所述有利性质归因于在香烟过滤嘴中使用藻类体。藻类体可独自或与已用于香烟过滤嘴的其它物质组合使用。

藻类体是由藻类生物质和石灰华（分解成粘土的火山灰）构成的沉积岩。在喀尔巴阡盆地的湖泊中，在大约3-5百万年前的上新世发生密集的火山活动。这一活动形成众所周知的玄武岩山，同时也形成特殊的石灰华环（tufa rings）。在火山活动消亡后，石灰华环被水淹没，由此形成爆炸湖（低平火山口）。爆炸湖的水被温泉加热，其中所含的热溶液使水富含微量元素、矿物盐和其它营养物。由火山石灰华的玻璃材料的降解产生的矿物胶体中的元素进一步丰富爆炸湖的营养含量。在爆炸湖的静水中，积聚大量藻类（尤其是绿藻Botriococcus braunii）和其它漂浮动物或植物生物体。积聚的植物和动物生物体死亡并与从茂密海岸植被中冲走并沉积在爆炸湖底的叶子和花粉残留物混合。在与解体的石灰华和其它死亡浮游生物一起的缺氧环境中，它们积聚为腐烂的泥浆（腐泥）。在爆炸湖的淤积阶段，较大动物的尸体被带入温暖的泥浆，因此泥浆富含磷材料。这种枯竭和硬化的生物质在几百万年间发生特定物理和化学变化并形成其当前形式：岩石藻类体。

藻类体是具有由偶尔叶状分离的片层构成的粘土结构的土岩（earthy rock）。藻类体没有毒性作用（参见Dr. Solti Gabor: Az Alginit. Ismertető tanulmány. AzAlginit a Mezőgazdaságért és Környezetvédelemért Alapitvány tevékenysége(1993-2013) 2014）。其颜色是浅绿色（绿色）或灰色，有时变成赭色。在干燥后可以更好地看到其片层结构，并且在片层之间经常可发现植物印迹或植物残留物。

其最重要的物理性质在于其可结合0,5-1,0升水/千克。藻类体由80-90%粘土和沉泥成分构成，该沉积物在海岸附近含有较粗粒子。在淤积坑（siltation craters）（泻湖）的末期（last phase），有机材料含量降低且膨润土含量增加。在取自相同地点的样品中，藻类体的组成表现出高偏差。平均腐殖质含量为30%，有时达到45%。平均石灰含量（CaCO₃形式）为33%，有时达到40%。已证实化石生物质含有64种元素。这意味着藻类体尤其富含大量元素和微量元素，最重要的元素如下：氮(N): 0,5%、磷（以P₂O₅形式）: 0,6%、钾（以K₂O形式）: 0,9%、镁(Mg): 1,0%。典型矿物组分是蒙脱石、伊利石、白云石、方解石、霰石、石英石膏、斜长石、菱铁矿、菱镁矿、黄铁矿和正长石。除上述这些外，更重要的微量元素是铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、钴(Co)、镍(Ni)、锂(Li)、钛(Ti)、铬(Cr)和镉(Cd)。腐殖质成分的特殊特征之一是其生化植物生长增强作用。当藻类体用于农业时，腐殖酸发挥类似酶以及类似激素的增强作用，并通过调节根的吸水能力，也对植物生长发挥间接增强作用。

藻类体广泛用于各种用途。在植物和水果栽培中，藻类体可用于改良。其一次性使用在第一年将土壤肥力提高20-30%。由于其粘土矿物，人造肥料必须以较高量使用，因此增加磷、氮和钾从土壤转移到地下水、河流和湖泊中。其效应持续4-6年。藻类体是天然材料，无限期保持其品质，不会过度使用并且甚至较高用量也没有任何负面影响。藻类体也可以混合物形式用作园艺土。与其它天然材料如沸石、珍珠岩、泥炭或玄武岩混合，已经制成agent-free的高效土壤混合物。藻类体的使用导致在花园或塑料大棚中的蔬菜和观赏植物栽培中在收获时的产量和品质的提高。藻类体也可用作森林树种的栽植穴中的starter。藻类体的使用使得数量增长6-13%和生长增快20%。在秋天用藻类体混悬剂喷施具有植物保护作用并有助于树木越冬，而春天喷施提供防害虫保护。由于藻类体喷施，植物的锰、铁、锌和铜含量提高，而果实中的钙含量提供更多的味道和更长的贮藏寿命。在畜牧业中，藻类体与液肥组合提供用作有机肥料的补充处理或用于取代有机肥料的高效产品。藻类体减少肥料的降解期并可与其它营养素组合。将藻类体与落叶层（litter）混合产生更重要的（substantial）肥料并增强家畜和家禽的生长。藻类体也发挥环境保护作用。由于其高吸附亲合力，其有效结合动物畜栏的气味并降低空气空间中的SO₂和NH₃浓度（参见例如匈牙利专利189.383: "Process for binding of gases with unpleasant smell produced bydissolving organic materials and for production of organic manure with highefficiency"）。

藻类体的人类用途包括其用作用于关节、风湿病和运动问题的药膏（sludge），并且也具有将其形成抗风湿病软膏的优点。藻类体也可用于对抗静脉曲张和牛皮癣并且也可用于皮肤再生和皮肤状态的一般增强。此外，藻类体也可用作医用清新剂的基料。

藻类体可在匈牙利找到并由许多匈牙利公司商业供应，例如来自Gérce-AlginitKft（Gérce，Hungary）。

令人惊讶地，现在已经发现藻类体在新的技术领域中有效。我们的研究证实藻类体在独自或与如下论述的其它已知组分组合用于香烟过滤嘴时尤其有效。意外地发现，藻类体在香烟过滤嘴中的使用导致唾液中明显更少的活性氧物质（ROS）、血清中明显更少的ROS形成、更低的内皮损伤、更低的肺上皮损伤、明显更高的谷胱甘肽水平、肺组织中的更低损伤和肺组织中的更低炎症，下面详细公开所述有利性质。

藻类体的使用导致唾液中明显更少的活性氧物质（ROS）。尽管唾液本身具有一定的自由基浓度，但香烟烟雾造成自由基水平提高。估计每口香烟烟雾有超过10¹⁴个自由基（Church和Pryor, 1985；Church DF, Pryor WA, “Free-radical chemistry ofcigarette smoke and its toxicological implications,” Environ Health Perspect,1985, 64:111-26）。考虑到自由基可与许多有机底物相互作用产生ROS，香烟烟雾提高唾液中的ROS水平并不令人意外。但是，除香烟烟雾中所含的自由基外，香烟烟雾造成的炎性反应可引起显著的自由基形成以及ROS的直接产生，造成中性粒细胞和巨噬细胞的水平提高（Messner和Bernhard, 2014；Messner B, Bernhard D, “Smoking and cardiovasculardisease. Mechanisms of endothelial dysfunction and early atherogenesis,”Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2014, 34:509-15）。我们测量志愿者的未处理唾液的抗氧化能力，然后他们吸一支香烟，接着再收集他们的唾液。我们使用来自对照香烟的烟雾测量唾液中的抗氧化能力水平的变化。我们用仅含单一藻类体和四种不同组合：藻类体 -葡萄皮籽（GSS）、藻类体 - 特殊Al氧化物、藻类体 - 沸石、藻类体 – 碳（相同过滤嘴，50-50%混合物）的不同过滤嘴重复相同操作。所有含藻类体的组合过滤嘴与对照过滤嘴相比产生明显更低的唾液中的抗氧化能力下降。单独的藻类体与对照物相比产生抗氧化能力的明显差异，但所有组合香烟表现得明显优于单独的藻类体——藻类体和组合搭档协同作用的明证。

藻类体过滤嘴的使用造成血清中明显更低的ROS形成。证实这一点的实验与唾液实验类似，但其用血清进行。血清本身具有一定的自由基浓度。尽管血清本身具有一定的自由基浓度，但香烟烟雾造成自由基水平提高。估计每口香烟烟雾有超过10¹⁴个自由基（Church和Pryor, 1985）。考虑到自由基可与许多有机底物相互作用产生ROS，香烟烟雾降低血清的抗氧化能力并不令人意外。但是，除香烟烟雾中所含的自由基外，香烟烟雾造成的炎性反应可引起显著的自由基形成以及ROS的直接产生，造成中性粒细胞和巨噬细胞的水平提高（Messner和Bernhard, 2013）。我们测量未处理血清的抗氧化能力。然后使用我们的吸烟机使整个香烟烟雾通过一管血清。我们使用来自对照香烟的烟雾测量血清中的抗氧化能力的变化。我们用仅含单一藻类体和藻类体与四种不同过滤材料的组合，即藻类体 - 葡萄皮籽（GSS）、藻类体 - 特殊Al氧化物、藻类体 - 沸石、藻类体 – 碳（相同过滤嘴）的不同过滤嘴重复相同操作。所有含藻类体的过滤嘴与对照过滤嘴相比产生明显更低的血清中的抗氧化能力下降。

藻类体的使用产生造成更低内皮损伤的烟雾。血管内表面上所衬的细胞被称作内皮细胞。这些细胞对保护这些血管具有重要作用。一旦内皮受损，常被称作内皮功能障碍，心血管疾病的风险提高。由于经肺泡离开肺的烟雾进入血流，内皮暴露于烟雾并最初造成内皮功能障碍，这众所周知是与吸烟相关的心血管疾病发展中关键的第一步骤（Ambose和Barua, 2004；Ambrose JA, Barua RS, “The pathophysiology of cigarette andcardiovascular disease. An update,” J Am Coll Cardiol, 2004, 43:1731-7；Messner和Bernhard, 2014）。我们测量在将暴露于全部烟雾的内皮细胞与未处理的细胞比较时发生的内皮细胞损伤。在相同细胞系暴露于藻类体过滤烟雾或用含藻类体的组合过滤的烟雾时，发生明显更低的细胞损伤。

藻类体的使用也产生造成更低肺上皮损伤的烟雾。肺上皮是对吸入的毒物的第一道防线。肺中的肺泡上皮细胞已知受到烟雾暴露的损伤直到并且包括细胞死亡（Kosmider等人, 2011；Kosmider B, Messier EM, Chu HW, Mason RJ, “Human alveolarepithelial cell injury induced by cigarette smoke,” PLoS One, 2011, 6:e26059），其通过与未处理的细胞相比健康细胞数量的下降证实。与对照香烟相比，含藻类体的过滤烟雾造成健康细胞计数的明显更低下降。由于坏死的上皮细胞向肺中分泌引发最终可能造成肺癌或COPD的炎症的蛋白质，用含藻类体和与四种不同过滤材料的组合（即藻类体 - 葡萄皮籽（GSS）、藻类体 - 特殊Al氧化物、藻类体 – 碳，相同过滤嘴）的过滤嘴保护上皮对吸烟者而言明显具有健康益处。

对于藻类体过滤的香烟烟雾，谷胱甘肽水平也明显高于对照香烟。使上皮和内皮细胞系暴露于对照香烟和藻类体和藻类体 - 葡萄皮籽（GSS）、藻类体 - 特殊Al氧化物、藻类体 – 碳的组合（相同过滤嘴），这样的含藻类体的香烟过滤全部烟雾。谷胱甘肽水平的测定表明与对照香烟相比，在暴露于来自藻类体过滤香烟的烟雾的细胞中明显更高的谷胱甘肽水平。考虑到众所周知谷胱甘肽抵御氧化应激（Rahman和MacNee, 2000；Rahman I,MacNee W, “Oxidative stress and regulation of glutathione in lunginflammation,” Eur Respir J, 2000, 16:534-54），这意味着与对照香烟相比含藻类体的过滤嘴更好地保护肺对氧化应激诱发的肺组织损伤的固有防御机制。

藻类体过滤的烟雾与对照香烟烟雾相比造成肺组织的较低损伤和造成较低炎症。已由具有已知概况（profile）的人类细胞，即肺上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞构建三维肺组织 - 被称作球状体。三维构造能使细胞形成类似于在它们的体内对应物中发现的功能组织。3D模型提供比传统单一培养-单层（2D）系统好得多的实验模型以模拟体内环境。3D组织培养的生物化学概况惊人地类似于活生物体。3D球状体与活体周围肺组织类似地对外部刺激作出反应。它们的炎性反应几乎相同，并且它们也产生表面活性剂。当这些3D球状体暴露于经新型藻类体香烟过滤嘴过滤的香烟烟雾时，在明显低于对照香烟的程度上表达细胞因子IL-8和IL-6（已知的炎症介质）的水平。

如上文提到，藻类体可以独自或与在本发明的提交日之前用于香烟过滤嘴的其它物质组合用于本发明的过滤嘴。这样的材料以及它们的制备和用途是本领域技术人员已知的。

例如，当关于香烟过滤嘴提到“碳”或“葡萄”或“葡萄组分”时，它们是指活性炭和葡萄籽和皮碎粉，尽管本领域技术人员从现有技术中显而易见，葡萄组分也可以其它形式存在。这些组分以及它们的可得性也是本领域技术人员公知的。

通过下列实施例更详细公开本发明。实施例仅用于举例说明。根据实施例，本领域技术人员容易理解，藻类体甚至独自也具有比已知的过滤材料显著改进的过滤特性。此外，含有关于含有藻类体和属于现有技术的某些过滤材料的组合的数据的实施例使本领域技术人员清楚看出，藻类体与其它过滤材料协同作用。关于所述材料，我们也参考例如上文提到并经此引用并入本文的WO 2010/125412中公开的自由基清除剂。因此，尽管在实施例中没有列出所有含藻类体的组合，但本领域技术人员会理解，藻类体的组合搭档可与其它合适的过滤材料任意互换，并且本发明包括所有这样的组合。

实施例1: 藻类体的使用造成唾液和血清中的抗氧化状态的明显更低的提高– Budapest University of Technology (BUT)实验

这一研究的目标是研究不同过滤嘴对香烟烟雾改变样品（血清和唾液）的抗氧化状态的能力的影响。用RANDOX® TAS检测进行血清样品的测量。通过重构冻干血清制备血清样品，其在重构之后（空白）或在将过滤的香烟烟雾鼓泡通过其中之后测量。在抽吸传统香烟或配有根据本发明的过滤嘴的实验香烟之前和之后测量唾液的总抗氧化状态。通过我们的测量获得的数据可反映过滤嘴的自由基和ROS结合能力。

材料和方法

用联苯胺检测和Randox®总抗氧化状态(TAS)试剂盒测量抗氧化状态

通过普遍认可的联苯胺检测和市售Randox®总抗氧化状态(TAS)试剂盒进行抗氧化状态的测量。联苯胺检测采用过氧化物生成系统（过氧化氢和过氧化物酶）和过氧化物灵敏色原（联苯胺）。原位生成的过氧化物与色原反应产生具有可用分光光度计检出的在620 nm的峰值吸光度的中间化合物。样品中存在的抗氧化剂与色原竞争与过氧化物反应并阻碍可检测信号的生成。通过比较样品的可检出色原形成与不存在抗氧化剂的阴性对照和具有已知抗氧化剂浓度的阳性对照，可以评估样品的抗氧化状态。

所用试剂和仪器

试剂A（溶解在II型纯净水中）

- 155 mM氯化钠（Reanal, cat. no. 24640-1-08-38）

- 25 mU/ml辣根过氧化物酶（Sigma®，cat. no. 77332）

- 233 μM联苯胺二盐酸盐（Sigma®，cat. no. B3383）

试剂B（溶解在II型纯净水中）

- 250 μM脲-过氧化氢（Sigma®，cat. no. 289132）。

样品

在吸烟前和后从17位对象中提取唾液样品。志愿者由Budapest University ofTechnology and Economics的OF Laboratories招募。每个志愿者在上午8–9点报到以收取唾液、吸烟并再收取唾液。每天早上抽吸一根试验香烟并收集唾液。每个志愿者抽吸4种不同香烟（区别在于过滤嘴）；两种在2015年12月4-7日之间，两种在2016年1月5-8日之间。要求吸烟者在报到吸烟的早晨没有进食任何食物或液体并且没有刷牙。冷冻唾液并送往BUT实验室所在地进行评估。

血清样品由冻干血清（Analyticon Contronorm® PLUS）根据制造商的说明在II型纯净水中重构。直接（空白）或在通过OptiFilter将过滤的香烟烟雾鼓泡通过血清之后测量血清样品。使用Filtrona SM302 8-port，线性吸烟机吸烟。根据ISO 3308在100%封闭过滤嘴通气孔的情况下吸烟。烟雾经过Cambridge Filter（玻璃纤维过滤嘴44mm，art. no:80202851，Borgwaldt KC），并使所得气相经过硅酮管并鼓入含有1.5毫升血清溶液的玻璃容器（impinger）。在每根香烟之后将Cambridge过滤垫换成新的，在每根香烟之后将硅酮管换成新的。过滤嘴标作1-3。

对照和测量工具

- 阴性对照（II型纯净水）

- 阳性对照（来自Randox®总抗氧化状态试剂盒cat. no. NX 2332的Calibrator标准）

- Randox®总抗氧化状态试剂盒

- 分光光度计（Thermo Scientific™ Multiskan™ GO微孔板分光光度计）。

联苯胺检测方法

用上述微孔板分光光度计进行测量，将细胞在96孔板上在37℃下培养。微孔板上的反应混合物如下制备: 将5 μl样品或对照物和250 μl试剂A吸移到孔中。然后均化该混合物，然后通过酶标仪读数。在加入50 μl试剂B以引发过氧化物生成之前测定在λ=620 nm的初始吸光度读数，此后从0至3分钟测定在λ=620 nm的吸光度读数。吸光度结果被认为是在2,5分钟的测得吸光度值。将所有样品和对照物储存在冰上，并在3个平行孔中测量各样品以供统计分析。

Randox®总抗氧化状态(TAS)试剂盒法

使用上述微孔板分光光度计根据提供的手册进行测量。通过使用微孔板代替比色皿，将所有所需试剂体积降低4倍。这导致最终反应体积为305 μl，其由如手册中所述添加5 μl样品或对照物、250 μl试剂A和50 μl试剂B得出。

香烟材料

用于该实验的香烟由OptiFilter Zrt提供。香烟的规格和制造如下。Kentucky参考香烟3R4F由University of Kentucky, KY US制造和装配。该参考香烟由CelaneseCorporation, Narrows, VA, US向OptiFilter Zrt of Hungary提供。由OptiFilter Zrt装配香烟过滤嘴并制造试验香烟。CellFx滤棒由Celanese Corporation制备和供应。这些含有不同过滤材料，有时是混合的。由Celanese Corporation制造和供应具有不同编织特征的附加醋酸酯过滤材料，由此产生不同的压降值。移除并弃置Kentucky参考香烟(KRC)3R4F过滤嘴的27 mm醋酸酯部分（2.9/41,000）。由Celanese’s CellFx technology制造的滤棒含有不同填充材料。面向香烟的燃烧表面引入一个所选滤棒，选择附加醋酸酯部分并将其引入过滤嘴，确保香烟（封闭过滤嘴通气孔）的压降值（总吸阻）与KRC的压降值（吸阻170 mm H₂O +/- 2%）相同。Celanese滤棒为12 mm长。醋酸酯部分为15 mm长。总过滤嘴长度为27mm。

用于实验的过滤嘴概要

<i>唾液</i>	过滤嘴描述	缩写
			过滤嘴1	Kentucky对照参考香烟	Kent. Ref.
过滤嘴2	Celanese Rod 12 mm: 碳	CelRod-12-C
			过滤嘴3	Celanese Rod 12 mm: 50%藻类体 & 50%葡萄	CelRod-12-AG

<i>血清</i>	过滤嘴描述	缩写
			过滤嘴1	Kentucky对照参考香烟	Kent. Ref.
过滤嘴2	Celanese Rod 12 mm: 碳	CelRod-12-C
			过滤嘴3	Celanese Rod 12 mm: 50%藻类体 & 50%葡萄	CelRod-12-AG

结果

在对唾液和血清进行的试验期间，获得下列试验结果。

血清实验

抗氧化状态的改变显示在图1中。

在五个重复试验中进行测量。结果表明过滤嘴3优于对照香烟（过滤嘴1）。

采用联苯胺检测唾液样品的测量结果

对17位对象进行测量。将收集自对象的各样品测量3次。

唾液实验的统计分析

- 使用Wilcoxon Matched配对试验（StatSoft–STATISTICA10）进行吸烟之前和之后的抗氧化状态变化的统计显著性的评估。在p<0,05下结果被认为显著。

过滤嘴1在吸烟之前和之后的抗氧化状态变化显著。获自该试验的结果显示强统计差异。

过滤嘴2在吸烟之前和之后的抗氧化状态变化显著。获自该试验的结果显示强统计差异。

过滤嘴3在吸烟之前和之后没有统计显著的抗氧化状态变化；尽管存在可观察到的差异（p=0,065），其没有达到统计显著性的阈值。

- 使用Wilcoxon Matched配对试验（StatSoft–STATISTICA10）进行由抽吸不同香烟造成的抗氧化状态变化的统计显著性的评估。在p<0,05下结果被认为显著。

过滤嘴1和2之间的抗氧化状态变化不显著。

过滤嘴1和3之间的抗氧化状态变化显著。

使用箱形图表示抗氧化状态降低结果

多个变量的相关箱形图显示在图2中。单独显示异常（outlying）数据点（StatSoft -STATISTICA10 ）。

结论

我们的结果表明，经过过滤嘴1或2的香烟烟雾使血清抗氧化状态降低15-20%。过滤嘴3导致与对照物相比明显更低的抗氧化能力下降。

将唾液样品的吸光度读数与阳性和阴性对照比较以评估抗氧化状态。我们的结果表明经过过滤嘴1和2的香烟烟雾使唾液抗氧化状态降低大约30%，这被认为统计显著，而过滤嘴3表现出12%下降，与对照香烟相比统计显著。这些结果与血清测量结果一致。我们的结果表明，本发明的过滤嘴的组分在所述检测条件下对香烟烟雾改变样品抗氧化状态的能力具有显著影响。

实施例2: 藻类体的使用造成唾液和血清中的抗氧化状态的明显更低的提高– Prof. Tibor Szarvas的实验

也在如下的附加实验中测试通过本发明的过滤嘴过滤的香烟烟雾对唾液和血清的影响。

材料和方法

用于该实验的香烟是由University of Kentucky, KY, US制造和装配的Kentucky参考香烟3R4F。试验香烟由Celanese Corporation, Narrows, VA, US向OptiFilter Zrt ofHungary提供。由OptiFilter Zrt装配香烟过滤嘴并制造试验香烟。CellFx滤棒由CelaneseCorporation制备和供应。这些含有不同过滤材料，有时是混合的。由CelaneseCorporation制造和供应具有不同编织特征的附加醋酸酯过滤材料，由此产生不同的压降值。移除并弃置Kentucky参考香烟3R4F过滤嘴的27 mm醋酸酯部分（2.9/41,000）。由Celanese’s CellFx technology制造的滤棒含有不同填充材料。面向香烟的燃烧表面引入一个所选滤棒，选择附加醋酸酯部分并将其引入过滤嘴，确保香烟（封闭过滤嘴通气孔）的压降值（总吸阻）与KRC的压降值（吸阻170 mm H₂O +/- 2%）相同。Celanese滤棒为10mm或12mm或15mm长。醋酸酯部分为17mm或15 mm或12mm长。总过滤嘴长度为27mm。测量配有含不同填充材料的CellFx滤棒的香烟并在这一生物评估中与对照物比较。

在实验中使用下列过滤嘴:

过滤嘴描述	缩写
		Cavity: 100 mg，(33-67) Al-O-葡萄	Cav-100-AlOG
Cavity: 150 mg，50-50%，藻类体 & 葡萄	Cav-150-AG
		Cavity: 150 mg，50-50%，沸石& 葡萄	Cav-150-ZG
Cavity: 160 mg，50-50%，Al-O & 葡萄	Cav-160-AlOG
		Cavity: 160 mg，(各20%)，Al-O + Grap + Alg + Zeol +Carb	Cav-160-AlOGAZC
Cavity: 200 mg: (120-80mg)，藻类体-葡萄	Cav-200-AG
		Celanese Rod 10 mm，50-50%，藻类体-碳棒	CelRod-10-AC
Celanese Rod 10 mm: Carbon Mono Rod	CelRod-10-C
		Celanese Rod 12 mm: 50-50%，藻类体 & 葡萄	CelRod-12-AG
Celanese Rod 12 mm: 碳	CelRod-12-C
		Celanese Rod 15 mm: 50-50%，藻类体 & 碳	CelRod-15-AC
Celanese Rod 15 mm: 50-50%，藻类体 & 葡萄	CelRod-15-AG
		Kentucky对照参考香烟	KRC.

实验设置

在University of Technology and Economics, Budapest的OF实验室中在FiltronaSM302 8-port，线性吸烟机中根据ISO 3308程序吸烟。在封闭过滤嘴通气孔的情况下吸烟。香烟烟雾经过Cambridge Filter（玻璃纤维过滤嘴44mm，art. no: 80202851，BorgwaldtKC），并使所得气相经过硅酮管并鼓入含有1.5毫升血清溶液的玻璃容器（impinger）。在每根香烟之后将Cambridge过滤垫换成新的，在每根香烟之后将硅酮管换成新的。

测量血清抗氧化能力

为了评估新型实验香烟过滤嘴的自由基结合能力，使用两种方法：

1.) Randox – 总抗氧化试剂盒（购自Randox Lab. Ltd., Crumlin, UK）

2.) HRP – 过氧化物 – 联苯胺检测

Contronorm Plus对照血清由Analyticon Biotechnologies AG, Germany供应。在University of technology and Economics, Budapest的OF实验室进行吸烟和用烟雾处理血清，并由Dr. Szarvas在位于Energy Center of the Hungarian Academy ofSciences, Budapest的Central Research Institute for Physics Campus进行读出分析。使用新鲜制备的试剂。将对照血清溶解在5毫升双蒸馏水中。根据ISO 3308程序在封闭过滤嘴通气孔的情况下，在使香烟烟雾（1根香烟）经过Cambridge过滤嘴后，将所得气相鼓入1,5毫升溶解的血清。此后，将20微升处理过的血清与1毫升试剂1（下面提供组成）混合，均化并用200微升试剂2（下面提供组成）引发反应。在3分钟后测量吸光度的变化。将鼓泡的血清的吸光度与未反应的对照血清的吸光度比较。在不存在对照血清的情况下使用20微升双蒸馏水测定空白值。也在酶标仪上进行测量（参数: 5 μl血清、250 μl R1、50 μl R2试剂）。

用于测定血清中的总抗氧化状态的Randox检测

检测原理: 将ABTS（2,2,’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)用过氧化物酶（正铁肌红蛋白）和H₂O₂培养以产生自由基阳离子ABTS+。其具有相对稳定的蓝绿色，其在600nm下测量。添加的样品中的抗氧化剂在与其浓度成比例的程度上抑制这种颜色。

样品: Contronorm对照血清

程序

波长: 600 nm

比色皿: 1 cm光程

温度: +37℃

测量: 对着空气

将双蒸馏水与1mL R2试剂混合。将标样与1mL R2试剂混合。将样品与1mL R2试剂混合。充分混合各溶液，培养以达到必要的温度，并读取初始吸光度（A1）。向各溶液中加入200 μlR3。同时启动混合和计时器。在正好3分钟后读取吸光度（A2）。比较试剂 - 血清值，建立以%表示的总抗氧化状态。

HRP过氧化物-联苯胺检测

试剂1: HRP (辣根过氧化物酶) 9000 U/L、联苯胺盐酸盐233 μmol/L、氯化钠155mmol/L，

试剂2: 过氧化脲0.36mmol/L

溶剂: 双蒸馏水

仪器: UV-VIS分光光度计，温度25℃

使用新鲜制备的试剂。将对照血清溶解在5毫升双蒸馏水中。根据ISO 3308程序，在使用Cambridge过滤嘴过滤香烟烟雾（1根香烟）后，将所得气相鼓入1.5毫升量的血清溶液。封闭过滤嘴通气孔。此后将20微升处理过的血清溶液与1毫升试剂1混合并均化，并用200微升试剂2引发反应。在3分钟后立即测量在620 nm的吸光度的变化。将鼓泡的血清的吸光度与未反应的对照血清的吸光度比较。在不存在对照血清的情况下使用20微升双蒸馏水获得空白结果。实验结果概括在表中。也在酶标仪上进行测量（参数: 5 μl血清、250 μl R1、50 μlR2试剂）。

结果

1. HRP过氧化物-联苯胺检测

抗氧化能力和与对照物相比的改进分别显示在图3和图4中。

2. 在血清中比较本发明的cavity和CelFx过滤嘴

HRP过氧化物-联苯胺检测

抗氧化能力和与对照物相比的改进分别显示在图5和图6中。

3. Randox检测

用Randox抗氧化试剂盒方法重复血清实验。下面显示结果。

抗氧化能力、与对照血清相比的抗氧化能力变化和与Kentucky Cigarette相比的抗氧化能力变化分别显示在图7、图8和图9中。

使用Randox方法的血清结果证实，本发明的过滤嘴，在CellFx结构中和在cavity中都显著改善由气相香烟烟雾引发的抗氧化状态。考虑到香烟烟雾在吸入几秒后进入血流，本发明的过滤嘴的使用可使吸烟者的内皮状态更健康。

测量唾液抗氧化能力

为了评估吸烟后的唾液自由基状态变化和比较不同的过滤香烟，测量和比较在吸烟者的唾液中引发的变化。

材料和方法

实验设置

在吸烟前和后从38位对象中提取唾液样品。志愿者由Budapest University ofTechnology and Economics的OF Laboratories招募。每个志愿者在上午8–9点报到以收取唾液、吸烟并再收取唾液。每天早上抽吸一根试验香烟并收集唾液。每个志愿者在2015年10月19日-11月20日之间抽吸6种不同香烟（区别在于过滤嘴）。要求吸烟者在报到吸烟的早晨没有进食任何食物或液体并且没有刷牙。冷冻唾液并送往KFKI实验室评估。

HRP过氧化物-联苯胺检测

试剂1: HRP (辣根过氧化物酶) 9000 U/L、联苯胺盐酸盐233 μmol/L、氯化钠 155毫摩尔/L，

试剂2: 过氧化脲0.36mmol/L

溶剂: 双蒸馏水

仪器: UV-VIS分光光度计，温度25℃

使用新鲜制备的试剂。将对照物溶解在5毫升双蒸馏水中。收集志愿者的唾液。此后将20微升处理过的唾液溶液与1毫升试剂1混合并均化，并用200微升试剂2引发反应。在3分钟后立即测量在620 nm的吸光度的变化。将吸烟后收集的唾液的吸光度与未反应的对照唾液的吸光度比较。在不存在对照唾液的情况下使用20微升双蒸馏水获得空白结果。实验结果概括在表中。

该研究如下涉及38名志愿者：

结果

检测结果显示在图10和图11中，其中在图11中，香烟1 = Kentucky Ref.，香烟2 =Carbon Rod，香烟3 = Alg-Grape Rod，且香烟4 = Alg-Grape Cavity

用于该实验的过滤嘴的概要

结果

结论

我们的血清实验证实，本发明的过滤嘴，在CellFx结构中和在cavity中都显著改善由香烟烟雾引发的抗氧化能力。考虑到香烟烟雾在吸入几秒后进入血流，我们认为这些数据表明本发明的过滤嘴可有助于吸烟者的更健康内皮状态。我们的唾液实验证实，本发明的过滤嘴，在CellFx结构中和在cavity中都显著改善口腔中的抗氧化能力。我们认为这可有助于吸烟者的更健康粘膜。

实施例3: 香烟过滤嘴组成对烟雾诱发的内皮和上皮细胞死亡的影响

香烟烟雾是以高量氧化剂为特征的化学品的复杂组合。越来越多的论文表明香烟烟雾诱发肺血管内皮细胞的活化，这与内皮屏障功能的损失相关。这种损失是内皮功能障碍的标志。在这一过程中，香烟烟雾诱发的氧化应激造成内皮细胞损伤，以使单核细胞和活化的巨噬细胞能够渗透。内皮屏障的损伤甚至构成响应香烟烟雾暴露的肺损伤的早期要素。

香烟烟雾也已表明经由它们的上皮细胞的凋亡诱发肺泡组织的凋亡，这有助于慢性肺病，如肺气肿的发展。尽管氧化损伤可损伤肺内的所有细胞类型，但上皮细胞是氧化损伤的主要目标，因为它们构成肺中的第一道防线。因此，并不奇怪的是，香烟烟雾造成的上皮损伤是与吸烟相关的肺病的发病机理中的重要过程。

许多研究已经表明，源自香烟烟雾的高反应性烟雾成分、挥发性致癌物和活性氧物质（ROS）和香烟烟雾损伤的细胞经由细胞死亡和在活化的上皮细胞中的进一步ROS生成促成涉及上皮损伤的肺损伤。因此，保护上皮免受香烟烟雾损伤被认为对与抽烟相关的许多肺病的管理至关重要。我们的研究表明，香烟过滤嘴的组成在改变香烟烟雾对诱发上皮细胞（其代表最先遇到香烟烟雾的细胞系）死亡以及内皮细胞损伤的作用中是重要的。可以更有效除去对上皮细胞以及对内皮细胞具有最高损伤潜力的香烟烟雾组分的过滤嘴可减轻香烟烟雾诱发的肺损伤。

材料、课题和方法

用于该实验的香烟是由University of Kentucky, KY, US制造和装配的Kentucky参考香烟3R4F。香烟由Celanese Corporation, Narrows, VA, US向OptiFilter Zrt ofHungary提供。由OptiFilter Zrt装配香烟过滤嘴并制造试验香烟。CellFx滤棒由CelaneseCorporation制备和供应。这些含有不同过滤材料，有时是混合的。由CelaneseCorporation制造和供应具有不同编织特征的附加醋酸酯过滤材料，由此产生不同的压降值。移除并弃置Kentucky参考香烟3R4F过滤嘴的27 mm醋酸酯部分（2.9/41,000）。由Celanese’s CellFx technology制造的滤棒含有不同填充材料。面向香烟的燃烧端面引入一个所选滤棒，选择附加醋酸酯部分并将其引入过滤嘴，确保香烟（封闭过滤嘴通气孔）的压降（总吸阻）与KRC的压降值（吸阻170 mm H₂O +/- 2%）相同。Celanese滤棒为10mm或12mm或15mm长。醋酸酯部分为17mm或15 mm或12mm长。总过滤嘴长度为27mm。测量配有含不同填充材料的CellFx滤棒的香烟并在这一生物评估中与对照物比较。

内皮细胞在COPD的发展中起到关键作用，因为内皮细胞的屏障功能对健康的肺功能至关重要；因此，内皮屏障功能损失可促成白细胞浸润，包括COPD在内的肺病的特征标志。烟雾诱发的内皮细胞中的细胞死亡和炎症促进COPD的发展。在此我们表明，使用不同的香烟过滤嘴组成，我们可以改变烟雾组成并可减弱破坏性的生物效应。图2显示，来自含有藻类体 / 沸石/ 碳 / 葡萄混合物的过滤嘴的烟雾对内皮细胞的损伤较低。

上皮细胞是肺组织的重要组成部分并在肺癌和COPD发展中具有重要作用。使用A549肺上皮细胞系，我们表明，含有藻类体 / 沸石/ 碳 / 葡萄混合物的过滤嘴显著减轻上皮细胞死亡，因此有可能降低COPD风险。结果表明，含有藻类体 / 沸石/ 碳 / 葡萄混合物的本发明的过滤嘴减少烟雾的一些组分，因此在肺上皮和内皮细胞中造成较少损伤。保护上皮和内皮细胞有助于减弱香烟烟雾诱发的COPD和其它呼吸系统疾病发展。

香烟烟雾提取物的制备

如上所述进行香烟烟雾提取物制备（Chen等人；Chen ZH, Lam HC, Jin Y, Kim HP,Cao J, Lee SJ, Ifedigbo E, Parameswaran H, Ryter SW, Choi AM. Autophagyprotein microtubule-associated protein 1 light chain-3B (LC3B) activatesextrinsic apoptosis during cigarette smoke-induced emphysema. Proc Natl AcadSci USA. 2010年11月2日；107(44):18880-5）。为了制备香烟烟雾提取物，使用蠕动泵（VWRInternational）使用不同类型的过滤嘴抽吸Kentucky 3R4F研究参考过滤嘴香烟（TobaccoResearch Institute, University of Kentucky, Lexington, KY）。收取完整烟雾。每根香烟在4分钟内抽吸，留下15-mm烟头并经由硅酮管鼓过7.5毫升细胞生长培养基。将这一溶液（被视为100%强度香烟烟雾提取物）调节至pH 7.45并在制备后15分钟内使用。在抽吸每根香烟之后将硅酮管换成新的。

HUVEC和A549细胞培养和处理

HUVEC细胞（人脐静脉内皮细胞）获自Lonza（Anaheim, CA, USA）Cat. no.: C2519A，并在含有5% CO2的加湿气氛中在内皮生长培养基（Lonza, Anaheim, CA, USA）中培养。为了分析细胞死亡，在含有生长因子和2%血清的内皮生长培养基中将每孔5 × 10³/孔HUVEC接种到96孔板中。在各实验之前，将培养基换成不含生长因子并含有1%血清的新鲜培养基并培养10%烟雾提取物24小时。

A549 -人腺泡性腺癌基底上皮细胞获自European Collection ofAuthenticated Cell Cultures（ECACC）（细胞系: A549 Cat. no.: 86012804）。将A549细胞在含有5% CO₂的加湿气氛中在含有10% FCS的DMEM培养基中培养。为了分析细胞死亡，在含有10% FCS的DMEM培养基中将5 × 10³ /孔A549细胞接种到96孔板中并用10% CS提取物处理24小时。

细胞活力检测

MTT检测

将细胞以如附图中给出的起始密度接种到96孔板中并在用烟雾处理之前培养过夜。在培养期后，除去培养基并用含适量MTT溶液（溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓）（Chemicon Inc., El Segundo, CA）(14)的RPMI替换4小时。通过以10 mM的最终浓度将HCl添加到该培养基中，终止MTT反应。由MTT形成的水不溶性蓝色formasan染料的量与活细胞的量成比例并在将蓝色formasan沉淀物溶解在10% SDS中后用Anthos Labtech 200酶联免疫吸附测定读取器在550 nm波长下测定。所有实验至少一式六份运行并重复三次。

磺酰罗丹明B（SRB）检测

将细胞如上所述在96孔板中培养24小时。然后弃置培养基并通过添加100微升冷10%(w/v)三氯乙酸原位固定细胞并在4℃下培养30分钟。弃置上清液，将板用自来水洗涤五次并风干24小时。加入在1%乙酸中的0.4% (w/v)SRB溶液（100 μl），将板在室温下培养20分钟。在染色后，通过用1%乙酸洗涤五次，除去未结合的染料，并将板风干。结合的染料随后用(200 μl) 10 mM Tris (pH 10.5)溶解，并96孔板读数器中在560 nm下读取吸光度，使用Promega Glomax多模式检测系统减去在600 nm下的背景测量。

结果: 烟雾对肺上皮细胞和人内皮细胞的影响

如所述，肺上皮细胞在慢性阻塞性肺病（COPD）的发展中起到关键作用。香烟过滤嘴组成的改变有可能产生与来自传统香烟的烟雾相比减少上皮细胞死亡的烟雾。因此，我们分析不同过滤嘴组成对烟雾诱发的上皮细胞死亡的影响。图1显示不同过滤嘴组成对A549细胞中的细胞死亡的影响。图1中显示的结果使用施加于细胞培养物的10%烟雾提取物获得。但是，使用10%烟雾浓度的结果很可能更合理，因为提高的烟雾浓度表现出香烟烟雾的增殖作用。图12中的数据表明含有藻类体/沸石/葡萄皮和籽碎粉（GSSG）、藻类体/GSSG和藻类体/碳过滤嘴的三种本发明的过滤嘴显著减轻烟雾诱发的A549上皮细胞死亡。

图13显示不同过滤嘴组成对烟雾诱发的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的细胞死亡的影响。在此我们对每一过滤嘴的每次测量使用4根香烟并且一式六份运行，这些数据表明在过滤嘴中含有各种过滤材料的本发明的过滤嘴显著减轻烟雾诱发的内皮细胞死亡。

这些实验表明本发明的香烟过滤嘴显著改变暴露于香烟烟雾的上皮和内皮组织的存活模式。这有助于对抗香烟烟雾引发的呼吸系统和心血管疾病。

实施例4: 在人3D肺组织模型中在香烟烟雾暴露后的炎性细胞因子生成

香烟烟雾是与肺部的许多复杂疾病相关的主要因素。烟雾暴露可通过炎性细胞因子释放诱发炎症反应。巨噬细胞在炎症反应中起到重要作用并且是白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-6（IL-6）的特定来源。IL-8是多功能细胞因子，主要充当中性粒细胞趋化因子，而IL-6与COPD患者的受损代谢相关联。由于这两种细胞因子在许多肺病，如COPD、肺纤维化或哮喘中都起到重要作用，在我们最近开发的复杂肺模型系统中研究新型香烟过滤嘴对这些细胞因子水平的影响似乎是合理的。肺中的炎性过程与几种细胞因子的生成和中性粒细胞募集到气道中相关联。IL-6和IL-8在炎性反应的萌发和扩展中起到关键作用。香烟烟雾暴露可通过增强促炎细胞因子分泌激活炎症，造成慢性炎症。香烟烟雾也可造成器官层面的改变，如气道破坏和气体交换表面的损失，这会造成肺功能受损。所有这些负面影响都可促成严重疾病的发生，包括COPD或癌症。通过使用3D组织培养作为测试方法，可以与单个细胞比较评估充当功能组织单元的细胞组合。肺组织包含具有可识别的细胞构造的上皮细胞。这些细胞具有专门的细胞-细胞接触、极化形态并附着在下方的基底膜上。这些特征的维持对该组织的正常功能，包括增殖、分化、存活和分泌至关重要。细胞在3D环境中自然生长。细胞在这一环境内的空间排列影响它们如何与彼此和它们的微环境相互作用。这些细胞内信号又影响形态和一系列细胞功能。因此，当使用细胞基检测法测试候选药物或毒剂时，所用培养方法应该模拟尽可能最天然的体内代表形式。用于药物发现用途的最天然的组织模拟细胞生长方法可能是3D。香烟烟雾的体外测试是复杂的。已经评估大量细胞系，但都有它们自己的局限性。IL-8和IL-6可由若干炎性细胞和肺细胞产生，但一种特定细胞类型的研究可能歪曲烟雾暴露的整体影响。在二维细胞培养基中生长的细胞常用于几种类型的药理学试验，但这些体外环境与体内状况的相关性低于三维模型系统的情况。三维肺细胞培养更能代表在体内发生的情况，具有密切匹配人肺的构造和表达模式。由于肺是复杂的器官，考虑到细胞排列可影响特定刺激的给定响应，必须在复杂模型系统中研究生物过程。Humeltis的3D肺组织组合了代表气道的主要细胞的多种细胞类型。

方法

正常原代人小气道上皮细胞（SAEC）和正常人肺成纤维细胞（NHLF）购自Lonza。这些细胞分离自不同性别和年龄的匿名捐献者。通过CD14阳性MicroBead分离试剂盒（MiltenyiBiotec）分离人外周单核细胞。对于3D培养，1:1混合SAEC和NHLF细胞（SN球状体），也将人单核细胞与这些人原代细胞混合（SNM球状体）。将细胞接种到低吸附96孔U底板上。在测量前用香烟烟雾提取物（CSE）处理这些球状体48小时。用于该实验的香烟是由University ofKentucky, KY, US制造和装配的Kentucky参考香烟3R4F。香烟由Celanese Corporation,Narrows, VA, US向OptiFilter Zrt of Hungary提供。由OptiFilter Zrt装配香烟过滤嘴并制造试验香烟。CellFx滤棒由Celanese Corporation制备和供应。由CelaneseCorporation制造和供应具有不同编织特征的附加醋酸酯过滤材料，由此产生不同的压降值。移除并弃置Kentucky参考香烟(KRC) 3R4F过滤嘴的27 mm醋酸酯部分（2.9/41,000）。面向香烟的燃烧表面引入由Celanese’s CellFx technology制造并含有不同填充材料的滤棒。选择附加醋酸酯部分并将其引入过滤嘴，确保香烟（封闭过滤嘴通气孔）的压降（总吸阻）值与KRC的压降值（吸阻170 mm H₂O +/- 2%）相同。Celanese滤棒为12mm长。醋酸酯部分为15mm长。总过滤嘴长度为27mm。制造总共两种不同的过滤嘴，并用它们装配KRC。测量来自配有本发明的过滤嘴，含不同填充材料的CellFx过滤嘴的香烟的烟雾并在生物评估中与对照物比较。香烟分类如下：

香烟1: Kentucky参考香烟KRC

香烟2: Filter Carbon mono rod CelRod-12-C

香烟3: Filter Alginite / Grape rod CelRod-12-AG。

通过在由Hydrotech真空泵(BioRad)供应的恒定气流下将来自2种香烟的烟雾鼓过10毫升细胞培养基总共2分钟，制备CSE。在无菌条件下用0.22 um注射过滤器过滤暴露的培养基。溶解微粒的光散射表明在320-350 nm的范围内没有显著差异。这一溶液被视为100% E。对于各实验在30分钟内制备CSE。向三维组织培养物施加CSE（0.5%）48小时。在48小时后通过BD Cytometric Bead Array Human Inflammatory Cytokine Kit (BDBiosciences)在上清液介质中测量由3D微组织产生的炎性细胞因子。这一试剂盒提供组织培养上清液中的IL-8和IL-6蛋白质水平的定量测量。该方法基于已知尺寸的荧光共轭微珠和检测试剂，其提供与结合的细胞因子的量成比例的信号。在3小时培养过程中，capture微珠与来自上清液的细胞因子连同检测试剂一起形成复合物。用FACS Canto II流式细胞仪（BD Immunocytometry Systems, Erembodegem, Belgium）用BD FACS DIVA软件V6分析荧光强度，并用FCS Express V3软件分析数据。结果代表在结合IL-6和IL-8后共轭微珠的平均荧光强度。

结果

为了研究取决于过滤嘴类型的炎性细胞因子生成，用来自标准香烟和含有两种不同过滤嘴的香烟的CSE处理球状体48小时。数据表明在来自3号过滤香烟的CSE处理后含巨噬细胞的团块中的IL-8和IL-6都减少，表明降低的引发炎性反应的能力。该差异证实对这两种细胞因子都统计显著。

图14显示在3种细胞类型团块（SAEC、成纤维细胞和巨噬细胞）中在48小时后在含巨噬细胞的肺球状体的上清液中的人IL-8蛋白质。

图15显示在48小时后在含巨噬细胞的肺球状体的上清液中的人IL-6蛋白质。

细胞因子水平的降低仅在含巨噬细胞的团块中并且仅在48小时后统计显著。在仅由成纤维细胞和原代上皮细胞形成的团块中（无巨噬细胞），细胞因子水平的降低在24或48小时后不显著。3号香烟将这两种细胞因子的水平都降至在对照培养基中测得的水平。

结论

IL-6和IL-8在炎性反应的萌发和蔓延中起到关键作用。香烟烟雾暴露可通过造成组织损伤激活炎症，由此增强促炎细胞因子分泌，这可造成慢性炎症。3D人类组织培养可能表现出与体内人类组织的生物化学和病理学过程的极相似性。在这方面，合理的是假设在通过过滤嘴#3过滤烟雾时免疫活性团块（含有巨噬细胞）中被研究的细胞因子的统计显著降低在体内环境中可能也有益。如下概括数据（SN代表含有原代上皮细胞和成纤维细胞的团块，而SNM代表含有上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的团块）：

概要

上述实施例清楚证实藻类体在独自或与如上论述的其它已知组分组合用于香烟过滤嘴时尤其有效。本发明的出乎意料和新颖的特征在于藻类体在香烟过滤嘴中的使用导致唾液中明显更少的活性氧物质（ROS）、血清中明显更少的ROS形成、更低的内皮损伤、更低的肺上皮损伤、明显更高的谷胱甘肽水平、肺组织中的更低损伤和肺组织中的更低炎症。

所选的体外生物试验是精心选择的，因为它们与已证实与主要的吸烟相关疾病具有因果关系的体内生物途径具有清楚和确定的联系。此外，在每种情况下显示，本发明的过滤嘴产生的气相烟雾在体外试验中的损伤远低于由Kentucky参考过滤嘴产生的烟雾。这些结果因此提供配有这些过滤嘴的香烟可充分降低吸烟的当前健康影响的令人信服的证据。

实施例进一步举例说明，藻类体甚至独自也具有比已知的过滤材料显著改进的过滤特性，并且藻类体与属于现有技术的过滤材料协同作用。因此，尽管在实施例中没有提到所有组合，但本领域技术人员显而易见，藻类体和特定技术领域中的已知过滤材料的任何组合具有相同性质。因此，本申请明确包括所有这样的组合。

Claims

1.藻类体用于过滤香烟烟雾的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述藻类体用于香烟过滤嘴。

3.藻类体用于制备香烟过滤嘴的用途。

4.根据权利要求2的用途，其中所述藻类体独自或与在香烟过滤嘴中用于降低香烟烟雾的有害影响的其它物质组合使用。

5.根据权利要求4的用途，其中所述其它物质选自活性炭或葡萄组分。

6.根据权利要求5的用途，其中所述其它物质是活性炭。

7.根据权利要求5的用途，其中所述其它物质是一种或多种葡萄组分。

8.根据权利要求7的用途，其中所述葡萄组分为葡萄籽和皮碎粉的形式。

9.用于降低香烟烟雾对人类的损伤风险的藻类体。

10.根据权利要求9使用的藻类体，其中所述藻类体以含有藻类体的香烟过滤嘴的形式使用。

11.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着唾液中的更少ROS。

12.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着血清中的更少ROS。

13.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着对上皮细胞的更低损伤。

14.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着对内皮细胞的更低损伤。

15.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着更高的谷胱甘肽水平。

16.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着肺组织中的更低损伤。

17.根据权利要求9使用的藻类体，其中降低损伤风险意味着肺组织中的更低炎症。